JPH07274949A - 新規なラクトバチルス属菌株、たんぱく質及びそのシークエンスならびにこれらの菌株、たんぱく質及びシークエンスの利用法 - Google Patents

新規なラクトバチルス属菌株、たんぱく質及びそのシークエンスならびにこれらの菌株、たんぱく質及びシークエンスの利用法

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JPH07274949A
JPH07274949A JP6235912A JP23591294A JPH07274949A JP H07274949 A JPH07274949 A JP H07274949A JP 6235912 A JP6235912 A JP 6235912A JP 23591294 A JP23591294 A JP 23591294A JP H07274949 A JPH07274949 A JP H07274949A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 醗酵乳から得られたラクトバチルス ヘルベ
ティカス（Lactobacillus helveticus)SBT 2171 (CBS
404.93)及びそれから産生されるたんぱく質分解酵素 【効果】 たんぱく質分解活性が強く、苦味や臭気の原
因となるペプチドを分解し、チーズの熟成工程やたんぱ
く分解物製造のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高たんぱく質分解力お
よび苦味除去能を有し、ラクトバチルス ヘルベティカ
ス(Lactobacillus helveticus) に属する新規な乳酸
菌、特にSBT 2171株及びその培養物に関する。さらに、
本発明は、この乳酸菌より得られるたんぱく質分解酵素
及びその利用法に関する。本発明の乳酸菌、培養物ある
いはこれから得られるたんぱく質分解酵素を、食品、飼
料および医薬品のたんぱく質の分解過程で利用すること
により、これらの製品を、人および動物に対して苦みお
よび臭気がなく、安全で、しかも低コストで製造するこ
とが可能となる。従って本発明は、食品、飼料および医
薬の分野で利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】従来、たんぱく質を分解する方法は様々
な方法がある。酸による分解、酵素による分解、微生物
による分解などである。酸による分解は、製造コストを
低く抑えることができるが、酸を使用するので利用でき
る製品は制限される。また、食品への応用には、人およ
び動物に対する安全性が問題であり、たとえ、その安全
性が科学的に証明されたとしても、消費者は、心理的に
拒否反応を示すことが多い。トリプシン、ペプシンなど
の消化酵素を用いた場合は、高たんぱく質分解力をもつ
ために比較的製造コストを低く抑えることができる。し
かも、安全性の問題は回避できるが、これら消化酵素
は、苦味のもととなるペプチドを生じさせるため、風味
を劣化させ、良質な風味をもつ製品を製造できない。ま
た、微生物を利用する方法は、微生物の種類によって、
その安全性に問題を残す。安全な微生物とは、伝統的発
酵食品に含まれているもので、古来より人類が食し、こ
れまでに何ら問題のないものとされている。その代表的
なものに、酪農乳酸菌がある。しかし、チーズに広く用
いられている乳酸球菌は、たんぱく質分解活性が低いた
め、製造コストが高くなる欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】チーズに広く用いられ
ている乳酸球菌は、人および動物に対する安全性は高い
が、たんぱく質分解力が低いために、製造コストが高く
なり、産業上適用範囲が制限される。また、一部の酪農
乳酸菌は、たんぱく質分解力は高いが、苦味を生じさ
せ、製品の風味を損なわせるものが存在する。従って、
本発明の目的は、安全性の高い酪農乳酸菌のなかから、
たんぱく質分解力が高く、しかも苦味および臭気除去能
を有する酪農乳酸菌及びたんぱく質分解酵素を提供する
ことにある。
【０００４】
【問題を解決するための手段】本発明者らは、乳および
乳製品より分離した乳酸桿菌のたんぱく質分解力および
苦味除去能を詳細に比較研究した結果、高いたんぱく質
分解力および苦味除去能を有するラクトバチルス ヘル
ベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT2171株を
獲得し、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、発酵乳を滅菌した生
理食塩水に懸濁し、さらに滅菌した生理食塩水で菌株10
6 〜107 となるように希釈した懸濁液を調製する。この
懸濁液を市販のMRS 培地に寒天を1.5 ％になるように加
えたMRS 寒天培地に塗沫し、37℃で２日以上培養する。
こゝで出現するコロニーを採取してMRS 培地に接種し、
37℃で１日間培養し、後記するようなスクリーニングを
行い、その活性の最も高い菌株を採取し、継代培養を行
った。こゝで得られた株の菌学的特徴は次のとおりであ
った。
【０００６】
【表１】 ─────────────────────────────── 一般的性質： グラム陽性桿菌 通性嫌気性 偏性糖分解 グルコースの醗酵最終生産物：乳酸 運動性 − 胞子形成 − カタラーゼ − グルコースからガス生成 − グルコン酸からガス生成 − 15℃での生育 − 45℃での生育 ＋ 次の化合物から酸の生成： リボース − グルコース ＋ アラビノース − ラクトース ＋ キシロース − マルトース − ラムノース − シュクロース − マンニトール − トレハロース − ソルビトール − セロビオース − リビトール − ラフィノース − グリセロール − メリビオース − フラクトース − メシジトース − マンノース ＋Ｗ サリシン − ガラクトース ＋ グルコン酸 − 乳酸の構造はDL体である 菌体加水分解物中にメソージアミノピメリン酸は存在しない ───────────────────────────────── [注] 1)＋W は弱反応性あるいは遅反応性を示す 2)＋は生育 (あるいは生成) するを示し、−は生育（あ
るいは生成）しないを示す
【０００７】この菌学的性質から、Bergy's manual of
systematic bacteriology Vol. 2,pp. 1222-1224(198
6) の記載を参酌して検索すると、この菌株は、ラクト
バチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s) と同定された。そして得られた菌株をラクトバチル
ス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT 2
171 としてオランダCeutraalbureau voor Schimmelcult
ures(CBS) に受託番号CBS404.93として寄託した。な
お、この菌株は、工学技術院生命工学技術研究所にラク
トバチルスヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s)SBT 2171(FERM P-14381) として寄託されている。以
下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】材料と方法 この乳酸菌を取得するためのスクリーニングは以下のよ
うに行った。微 生 物 乳および乳製品から分離された乳酸桿菌１２菌種168 株
及び乳酸球菌９株のたんぱく質分解力および苦味除去能
を比較した。比較した菌種名および菌株数は以下のもの
である。 菌 種 名 菌株数 Lactobacillus acidophilus (24) Lb. brevis (6) Lb. buchneri (5) Lb. casei (35) Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (18) Lb. delbrueckii ssp. delbrueckii (5) Lb. delbrueckii ssp. lactis (8) Lb. fermentum (5) Lb. helveticus (28) Lb. paracasei ssp. paracasei (8) Lb. plantarum (22) Lb. rhamnosus (5) Lactococcus lactis (9)
【０００９】これらの標準菌株は、ナショナル コレク
ション オブ フード バクテリア(National Collecti
on of Food Bacteria, NCFR)、アグリカルチュラル ア
ンドフード リサーチ カウンセル(Agricultural and
Food Research Council)及び英国のイスティチュート
オブ フード リサーチ(Institute of Food Research)
より取得したものである。また、後のＳＢＴ番号を付し
た菌株は、雪印乳業(株) 標準菌株コレクション(Snow B
rand Type Culture Collection)より得たものである。
【００１０】Lactococcus lactis ssp. cremoris AM1、
E8、HP、SK112 並びにWg2 、及びLactococcus lactis s
sp. lactis ML3はオランダ、Ede にあるネザーランド
インスティチュート フォー デアリー リサーチ(NIZ
O)(Netherland Institute forDairy Research) より入
手した。微生物は常法で3 世代に亘りMRS 培地（Merck
、Darmstadt 、ドイツ）を用い30または37℃で継代培
養し、10％(v/v) グリセリン含有MRS 培地中、-55 ℃で
保存した。
【００１１】成長曲線 各菌株から、成長曲線は保存菌株（stock-culture ）か
らMRS 培地またはMRX培地10 ml 中に第1 世代を1%種培
養（seed-culture）して得て、第2 世代の前培養（prec
ulture）に継代した。次いでMRS 培地 10 mlを含有する
ねじ込み栓付13x 150mm試験管にその1%を接種した。菌
の成長は波長650 nmで吸光度（OD）を測定して観察し
た。
【００１２】無菌体抽出液の調製 MRS 液体培地400 ml中で成長した細胞菌体は、対数増殖
期の後期に、4 ℃、7,500 x G で10分間遠心分離して回
収し、10 mM 塩化カルシウムを含有する50mM4-(2- ヒド
ロキシエチル)-1-ピペラジン- エタンスルホン酸〔4-(2
-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (H
EPES) 〕100ml 、pH 7、で洗浄し、この緩衝液10 ml 中
に懸濁させた。２次スクリーニングの為に、菌株は塩化
カルシウム 15 mMを含有するDe Man et al.(7)のHugenh
oltz etal. (15) 変法培地であるMRX 培地で成長させ
た。菌体抽出物は菌体を超音波破砕器（Vibra Cell: So
nics & Materials Inc. 、米国、コネチカット州、Danb
ury ）で、出力50% 、パルス20% 、0 ℃、10分間間隔、
10分間超音波処理で破壊して得た。無菌体抽出液は破壊
した菌体を30,000 xG、4 ℃、10分間遠心分離で得た。
【００１３】酵素アッセイ たんぱく質分解活性は、Lactococcus 菌種について記載
されている種々のたんぱく質分解酵素に対応する広範な
合成した色素産生(chromogenic) 基質を用いて測定した
（表２参照）。p-ニトロアニリド(Nitroanilide)を含有
する基質の加水分解は、Exterkate(12) の方法で測定し
た。酵素混合物は菌体抽出物20μl 及び100 mM HEPES 2
00μl、pH 7とした。反応は2 mM p- ニトロアニリド(ni
troanilide)基質溶液 200μlを添加して開始し、30℃に
数分間保持した。反応は52%(v/v)酢酸100 μl を添加し
て終了させた。反応混合物は14,000 rpmで5 分間遠心分
離し、上清中のp-ニトロアニリド(nitroanilide)の量は
410 nmで測定した(U-2000 spectrophotometer.日立製作
所、日本）。p-ニトロアニリド (Nitroanilide) の濃度
はモル吸収係数(molar absorption coefficient) (ε=
8,800 M-1 m-1) より算出した。
【００１４】β- ナフチルアミド(Naphthylamide) 基質
の加水分解はElleman(11) の変法で測定した。酵素混合
物は菌体抽出物20μl 及び100 mM HEPES 200μl 、pH 7
とした。反応は 2 mM β- ナフチルアミド(Naphthylami
de) 基質水溶液 200μl を添加して開始し、30℃で数分
間インキュベートした。反応はFast Garnet GBC 1 mg/m
l 及び5%(w/v)Brij 35を含有する1M 酢酸塩 200μl 、
pH 4.0、を添加して終了させた。反応混合物は最適な発
色を示す迄10分間保持し、次いで14,000 rpmで5 分間遠
心分離した。上清中のβ- ナフチルアミド(Naphthylami
de) の量は550nmで測定した（U-2000 spectrophotomete
r, 日立製作所、日本）。β- ナフチルアミド(Naphthyl
amide) の濃度はモル吸収係数（ε = 20,000 M-1 m-1)
より算出した。
【００１５】非色素非産生性(non-chromogenic) 合成ペ
プチドの加水分解はDoi et al.(8）のcadmium-ninhydri
n 法の変法に依る遊離アミノ酸の放出で測定した。酵素
混合物は100 mM HEPES(pH 7)中、希釈菌体抽出物100 μ
l を含有させて調製した。反応は2 mMペプチド溶液100
μl を添加して開始させ、30℃で数分間反応させた。反
応はCd Ninhydrin試薬 1.5 ml を添加して終了させ、次
いで84℃で5 分間加熱した。冷却後、反応混合物は14,0
00 rpmで5 分間遠心分離し、吸光度はVitalab10 spectr
ophotometer（Vital Scientific、Dieren、オランダ）
を用いて515 nmで測定した。ペプチダーゼの比活性は、
測定条件下の1 分間当り基質からのL-ロイシン(leucin
e)1μモルに相当するアミノ酸を生成するに要する酵素
量と定めた（26）。
【００１６】Resorufin 標識カゼイン（Boehringer Man
nheim GmbH、ドイツ）の加水分解は、50 mM HEPES 中、
37℃で、製造者によって示されたプロトコールに従って
測定した。すべての試験混合物は反応開始前に30℃に調
整した。
【００１７】
【表２】
【００１８】APIZYM試験方法 APIZYMキット（LAR ZYM AP 1〜6 ）はAPI SYSTEM（La B
alme Les Grottes、フランス）から得た。たんぱく質65
または125 mg/ml を含有し、菌体抽出液または無菌体抽
出液70μl を、脱水した色素産生酵素基質を含有する各
ウエルに添加し、混合物を37℃で 2または4 時間反応さ
せた。反応はZYM A 試薬50μl の添加で終了させ、ZYM
B 試薬50μl の添加で発色させた。酵素活性は５分間の
発色を製造者から提供されたカラーチャートと比較して
測定した。
【００１９】SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム- ポリアクリルアミド ゲル
（SDS-PAGE）及びプレパラティブスラブ ゲル電気泳動
は、それぞれMini-Protean II 及び Protean IIXi（Bio
-Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア州）を
用いて、製造者の提供したインストラクションマニュア
ルに記載の通り実施した。酵素分子の大きさは予め染色
した14,400〜97,400 Da の標準SDS-PAGE（Bio-Rad Labo
ratories、Richmond、カリフォルニア州）を用いて測定
した。
【００２０】イムノブロット法（Immunoblotting） ゲル上に分離したたんぱく質は、Mini Trans-Blot Cell
（Bio-Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア
州）を用いて、製造者のマニュアルに記載の通りポリビ
ニリデン ジフルオライド（polyvinylidene difluorid
e 、PVDF）シートに転写した。PVDF膜は1%スキムミルク
で飽和し、種々のたんぱく質分解酵素に対する抗体、即
ちポリクローナル及びモノクローナル抗体を、それぞれ
1/4,000 〜1/8,000 及び1/10希釈液と共に反応させた。
反応物は150 mM塩化ナトリウム及び0.05% Tween-20を含
有する10 mM トリス塩酸(pH 8.0)(TBST)、で洗浄後、膜
は1/3,000 に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤ
ギ抗ウサギ イムノグロブリン血清またはヤギ抗マウス
（Bio-Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア
州）と反応させた。
【００２１】PVDF膜はTBSTで洗浄し、酵素抗体複合体
は、0.1 M NaHCO3及び1.0 mM MgCl2から成るpH 9.8のカ
ーボネート緩衝液中70% ジメチルフォルムアミド中の30
mg/mlの1%(v/v) ニトロブルーテトラゾリウム(Nitrobl
ue tetrazolium) 及び100%ジメチルフォルムアミド中の
15 mg/mlの1%(v/v) 5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリル
フォスフェート ジソジウム塩(5-bromo-4-chloro-3-in
dolylphosphate disodium salt) と反応させて発色させ
た。抗体はGroningen 大学、微生物学部（オランダ）よ
り得た（14,18,27）。
【００２２】ポリアクリルアミド ゲル上のペプチダー
ゼ活性の検出 無菌体抽出液中のたんぱく質は7.5%プレパラティヴ ス
ラブ ゲル電気泳動で分離した。ゲルは垂直に7 mmのゲ
ル片に切断し0.1 mM HEPES、(pH 7)、で10分間2 回洗浄
した。ゲル片は1mM β- ナフチルアミド(Naphthylamid
e) 基質を含有する100 mM HEPES 10 ml中、37℃で2 〜6
0分反応させた。ペプチダーゼ活性は、Fast Gamet GBC
2mg/ml 水溶液10mlの添加後 5分以内に発色測定した（S
arah et al.）。もしくは、ペプチダーゼ活性は、ゲル
片中に、o-ジアニシジン(dianisidine) を酸化して赤褐
色に発色する複合酵素反応でロイシンを検出することで
測定した。ゲル片は100 mM HEPES (pH 7.5)8 ml 、50 m
M Leu-Leu またはLeu-Leu-Leu 溶液 160μl 、0.1N HCl
中23.3 mM o-ジアニシジン(dianisidine)80 μl 、3.2
M (NH4)2SO4 中5,000 U/mlパーオキシダーゼ(peroxidas
e)80μl 及び3.2 M (NH4)2SO4 中 1 mg/ml L- アミノ酸
オキシダーゼ80μl を含有する溶液8.4 ml中で、37℃、
10分間反応させた。
【００２３】官能テスト トリプシン消化カゼインを含有する25 mM 燐酸カリウム
(pH 7)、及び菌体抽出たんぱく質 0.5 mg の混合物2ml
を、30℃で６時間反応させた。カゼイン消化物の苦味
は、６名のパネルに依る官能試験で評価した。苦味に変
化がなければ「苦い」、苦味が残れば「僅かに苦い」、
また苦味が感じられなければ「完全に苦味を除去した」
として表わした。
【００２４】種々のペプチダーゼの部分精製 FPLCに依るMono-Qイオン交換クロマトグラフィーの精製
条件は、以下の様に設定した：無菌体抽出物４mgを含む
溶液 100μl を、Mono-Q HR 5/5 カラム（Pharmacia LK
B 、Uppsala 、スウェーデン）に吸着させた。酵素活性
は20 mM Tris塩酸緩衝液(pH 8.0)の0.15〜0.5M塩化ナト
リウムの直線的濃度勾配(linear gradient) で、流速1
ml/ 分に依り溶出し、溶出液は1 ml毎に採取し、種々の
(色素産生) ペプチドを用いてペプチダーゼ活性を検定
した。
【００２５】たんぱく質測定 たんぱく質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードと
してBio-Rad ProteinAssay (Bio-Rad Laboratories 、R
ichmond、カリフォルニア州、米国）により測定した。
【００２６】化学薬品及び試薬 本発明で使用した全てのアミノ酸及びペプチド誘導体
は、特に規定のある外は、L-体のアミノ酸である。全て
の化学薬品は試薬規格で、市販品を用いた。
【００２７】結 果Lactobacillus 及びLactococcus の178 菌株のスクリー
ニングLactobacillus 及びLactococcus の178 菌株の無菌体抽
出液は、更に13の亜種に分類し、以下の基質を用いてそ
のたんぱく質分解活性をテストした：ジェネラルアミノ
ペプチダーゼ活性にはLys-pNA 及びArg-pNA 、グルタミ
ル アミノペプチダーゼ活性にはGlu-pNA 、プロリダー
ゼ活性にはPro-pNA 、X-プロリル- ジペプチジル アミ
ノペプチダーゼ活性にはAla-Pro-pNA 、エンドペプチダ
ーゼまたはプロティナーゼ活性にはSuc-Phe-pNA 及びMe
O-Suc-Arg-Tyr-pNA を用いた。
【００２８】図1 は基質、Lys-pNA 、図2 は基質、Ala-
Pro-pNA 、及び図3 は基質、MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
に対する、各菌別のたんぱく質分解活性の平均を示し、
最大及び最小値も示した。結果は各菌種に非常に多様な
たんぱく質分解活性を明瞭に示した。高い活性も見出さ
れたが、非常に低い活性も見出された。この結果はその
他の基質に就いても同様であった（結果は表示せず）。
この結果はLb. helveticusが、全3 種の色素産生ペプチ
ドに対する最高の平均活性を有することを示した。その
他のペプチドに就いても、Suc-Phe-pNA を例外とする外
は同様である（結果は表示せず）。
【００２９】Lactobacillus 類の苦味除去能を測定する
為に、カゼインのトリプシン消化物の苦味除去試験を実
施した（材料と方法の項参照）。図4 は6 時間以内にカ
ゼインのトリプシン消化物の苦味を除去することのでき
る菌株数を示す（完全苦味除去：黒、一部除去：縦線、
除去できない：白をそれぞれ示す）。特にLb. helvetic
usの20菌株及びLactococcus の2 菌株、Lb. casei の5
菌株は顕著な苦味除去能を示した。
【００３０】Lb. helveticus SBT 2171 及びその他の乳
酸菌のたんぱく分解活性の比較Lb. helveticus SBT 2171、その他高いたんぱく質分解
活性を示したLactobacillus の８菌株及びLactococcus
の２菌株に就いて、そのペプチダーゼ(Peptidase) 及び
プロティナーゼ(Proteinase)活性を検討した。基質21種
に就いての加水分解活性テストの結果は、表３に要約し
た。Lb. helveticus SBT 2171 は、カルボキシペプチダ
ーゼ基質を含む、21種の基質中12種に最高活性を示し
た。更に、同菌株はその他大部分の基質に就いても最高
の活性を有していた。特に主要ペプチダーゼの活性は L
b. helveticus SBT 2171株が最高であった。つまり、Le
u-Leu-Leu(トリペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活
性を示す) 、Lys-pNA(アミノペプチダーゼ活性を示す)
、Leu-Leu(ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活
性を示す) およびMeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(エンドペプ
チダーゼ活性を示す) の分解活性が他の菌株と比較して
最大であった。さらに、X-プロリルジペプチジルアミノ
ペプチダーゼ活性に対応るすAla-Pro-pNA 分解活性及び
プロティナーゼ活性に対応するresorufin-casein分解活
性に関しても二番目に高い値を示した。さらに、Lb. he
lveticus SBT 2171 は、Gly-Phe-βNA、Lys-Ser-4MβN
A、Phe-Pro-Ala-βNA、Phe-Pro-βNA及びSer-Met-βNA
を最も加水分解した（結果は表示せず）。
【００３１】
【表３】
【００３２】Lb. helveticus SBT 2171 のたんぱく質分
解酵素活性を、L. lactis ssp. cremoris Wg2 及びL. l
actis ssp. lactis SK112 の乳酸球菌と比較すると、最
も顕著な相違が認められた。例えば、Lb. helveticus S
BT 2171 はLys-pNA に対して5 〜7 倍の活性を示し、Pr
o-pNA に対しては90倍以上の活性を、またMeO-Suc-Arg-
Pro-Tyr-pNA に対しては、ほぼ10倍の活性を示した。更
に、Glu-Glu を除くその他すべての基質に対してもSBT
2171菌株のほうが分解活性が高かった。これらの結果は
Lb. helveticus SBT 2171 が、数種の乳酸球菌を含めて
テストしたすべての菌株で、最も強力なたんぱく質分解
能を有する菌株であることを明瞭に示す。
【００３３】苦味除去活性試験は、種々の高いたんぱく
質分解能を有する菌株に就いて実施した。その結果はす
べての菌株が多少なりとも苦味除去活性を有することを
示し、中でも Lb.helveticus SBT 2171 の活性が高かっ
た（図5)。
【００３４】更にAPIZYM試験を若干の乳酸桿菌及乳酸球
菌に実施した。この試験にはAPI からVIに至る59種の基
質を用いた。大部分の菌株は広範な基質に対して加水分
解作用を示した。APIZYM試験もLb. helveticus SBT 217
1 が広範な基質に対して加水分解活性を有することを明
瞭に示した (表4)。
【００３５】
【表４】
【００３６】Lb. helveticus SBT 2171 のザイモグラム
染色法に依るペプチダーゼ活性の検出ザイモグラム法
は、Lb. helveticus SBT 2171 中に存するエキソ型ペプ
チダーゼ(exopeptidase)を定量する為に実施した。Lc.
lactis ssp. lactis Wg2を対照菌株として用いた。表５
は両菌株の無菌体抽出物の、7.5% PAGE に依る種々の基
質に就いて検出された加水分解活性のRf- 値を示す。こ
の結果はLb. helveticusSBT 2171 が、少なくとも４種
の異なったペプチダーゼを有することを示した：即ち広
範な基質特異性を有するアミノペプチダーゼ(aminopept
idase)、Gly-Pro-βNAに対するX-プロリル ジペプチジ
ル アミノペプチダーゼ(X-prolyl dipeptidyl aminope
ptidase)及びLeu-Leu に対する2 種の異なったジペプチ
ダーゼ(dipeptidase) である。トリペプチダーゼ(Tripe
ptidase)を含む同型のペプチダーゼが Lc. lactis ss
p. lactis Wg2に検出されている。しかしながら、Rf-
値はLb. helveticus SBT 2171 の酵素とは非常に異なっ
ている。更に、L. lactis ssp.cremoris Wg2 は11種の
基質中の6 種のみを加水分解し、一方、Lb. helveticus
SBT 2171 はゲル中の全ての基質が加水分解可能であ
る。これらの結果は異なったたんぱく質分解酵素がLb.
helveticus SBT 2171 とLb. lactis ssp. lactis Wg2中
に存することを示す。
【００３７】
【表５】
【００３８】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物
のイムノブロット法Lb. helveticus SBT 2171 及びLc. lactis ssp. lactis
Wg2の無菌体抽出物中のたんぱく質はSDS-PAGEで分離さ
れ、PVDF膜上にブロットし、次いで種々の乳酸球菌のた
んぱく質分解酵素に対して得たモノクローナル及びポリ
クローナル抗体と共に反応させた。結果を表6 に要約す
る。全8 種のたんぱく質分解酵素がLc.lactis ssp. lac
tis Wg2に存することを示した。PrtP、PepN、TRP 及び
DIPに対するモノクローナル抗体及びLb. helveticus SB
T 2171 との免疫反応は認められなかった。PepO及びPep
Cに対して生じさせたポリクローナル抗体は、Lb. helve
ticus SBT 2171 の無菌体抽出物中の数種のたんぱく質
を認識した。しかしながら、分子量はLactococcus lact
isから得た対応する酵素とは異なっているが、PepCに対
する抗体は例外で、Lactococcus lactisから得たものと
同様に50 kDaのたんぱく質バンドを認識した。PepX及び
TRP に対するポリクローナル抗体は免疫反応を全く示さ
なかった。これらの結果に基づいて、Lb. helveticus S
BT 2171 に由来する大部分のたんぱく質分解酵素は、少
なくともLactococcus lactisに由来するたんぱく質分解
酵素とは免疫学的に異なっているといえる。さらにその
他の菌株のたんぱく質分解酵素とも免疫学的に異なって
いる (表7 参照) 。
【００３９】
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】Lb. helveticus SBT 2171 の種々のペプチ
ダーゼの部分精製 図6 はLb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物のイオ
ン交換クロマトグラフィー後の溶出状態を示す。分画を
採取し、種々の基質と反応させた。各基質に就いての結
果は図の下に示した。図中の縦縞はペプチダーゼ活性を
示し、黒は活性のピークを示す。6 種の異なったペプチ
ダーゼ活性が分離された。即ち、1.第19分画中のLeu-Le
u 加水分解ジ- またはアミノペプチダーゼ活性、2.第20
分画中のPro-Ala 加水分解活性、3.第24分画中のPro-Al
a 及びPro-pNA 加水分解活性、4.第26分画中のLys-pNA
、Glu-pNA 、Leu-Leu 、Leu-Leu-Leu 及びPro-pNA を
加水分解可能な一般的アミノペプチダーゼ活性、5.第28
及び29分画中のAla-Pro-pNAを加水分解可能なX-プロリ
ル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性、6.第32及
び33分画中のLeu-Leu-Leu 加水分解可能なトリまたはア
ミノペプチダーゼ活性である。また少なくとも3 種の異
なったプロティナーゼ(Proteinase)及びエンドペプチダ
ーゼ活性を分離した。即ち、1.第1 、23及び35分画中の
resorufin-casein加水分解プロティナーゼ活性、2.第23
分画中のMeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA 加水分解活性、及び
第26分画中のCbz-Cys-pNA 加水分解活性である。この精
製に依ってザイモグラム法の５種を超える少なくとも９
種の異なったたんぱく質分解酵素が区別された。
【００４２】本発明では種々のLactobacillus 属から得
られたたんぱく質分解活性を述べた。ペプチダーゼ類の
比較研究はLactobacillus casei の亜種に就いて先に実
施されている（1,2,9 ）。この報告ではLactobacillus
casei の僅か数種の菌株及び酵素活性が述べられていた
が、一方、本発明ではLactobacillus の12菌種の178菌
株のたんぱく質分解活性を比較検討した。更に、約13種
の異なったペプチダーゼ及びプロテイナーゼ活性を、20
を超える異なった基質を用いて各菌株に就いて測定し、
またさらに59種の基質を微量酵素APIZYMシステムを用い
て測定した。本発明の結果は試験したLactobacillus 属
菌株中のたんぱく質分解活性の多様な違いを明瞭に示し
た。たんぱく質分解性の高い菌株が存していたが、殆ど
活性のない菌株も検出された。更に同一菌種の菌株のた
んぱく質分解活性は大きく異なり、例えば、大部分のL
b. helveticus菌株のたんぱく質分解活性は高かった
が、一方Lb. helveticus SBT 0351 のたんぱく質分解活
性はほとんど検出されなかった（結果は表示せず）。そ
の他のテストした乳酸桿菌及び乳酸球菌の中では Lb. h
elveticus が、広範囲な基質に対して最もたんぱく質分
解活性の高い菌種であった。しかも、Lb. helveticusの
細胞含有抽出物を用いたトリプシンに依るβ- カゼイン
消化物の反応で認められた苦味の減少は、その他の乳酸
菌種より有意に高度であった。ペプチダーゼの比活性と
苦味除去活性との間には明瞭な相関は認められなかった
が、この現象は混合物中の苦味ペプチドの減少によるも
のであると説明できるだろう。
【００４３】種々の高度にたんぱく質分解性のLactobac
illus 属菌株を選出した検討の結果、Lb. helveticus S
BT 2171 が最もたんぱく質分解活性の高い菌株であるこ
とが見出された。この菌株はLys-pNA 、Arg-pNA 、Glu-
pNA 、His-βNA（対応する酵素としてジェネラルアミノ
ペプチダーゼ）、Leu-Leu （対応する酵素としてジェネ
ラルアミノペプチダーゼ及びジペプチダーゼ) 、Leu-le
u-Leu （対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダ
ーゼ及びトリペプチダーゼ) 、Pro-pNA 及びPro-Ala
（対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及
びプロリン イミノペプチダーゼ) 、MeO-Suc-Arg-Pro-
Tyr-pNA 、Bzl-Cys-pNA （対応する酵素としてエンドペ
プチダーゼまたはプロティナーゼ) 、Z-Phe-Ala 、Z-Al
a-Ile 及びHyp-Lys(対応する酵素としてカルボキシペプ
チダーゼまたはエンドペプチダーゼ) に対して最高のた
んぱく質分解活性を有していた。しかし、同様に非常に
高い活性がその他の基質、例えばAla-Pro-pNA (X- プロ
リル pジペプチジル アミノペプチダーゼ活性) 及びRe
sorufin-casein (プロティナーゼ) に対して認められ
た。Lb. helveticus SBT 2171 のジェネラルアミノペプ
チダーゼは、Pro-pNA も加水分解する。この点はLb. he
lveticusに就いてはこれまで報告されていなかったので
興味深い。
【００４４】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物
のザイモグラム試験により、本発明の菌株が少なくとも
4 種のエキソペプチダーゼを利用することを示した、即
ちジェネラルアミノペプチダーゼ、X-プロリル ジペプ
チジル アミノペプチダーゼ及び2 種のジペプチダーゼ
である。同一のRf- 値を有する単一または複数の酵素が
含まれる可能性があるので、これらの基質に対する加水
分解作用が、単一のPepNまたは複数のPIP もしくはGAP
ペプチダーゼに依るのかは不明である。もし単一のジェ
ネラルアミノペプチダーゼのみが関与するなら、この酵
素は非常に重要と見なさねばならない。数種の基質、例
えばHyp-Lys 、Suc-Phe-pNA 、Moo-Suc-Arg-Pro-Tyr-pN
A 及びCbz-Gly-Gly-Arg-βNA、に対するLb. helveticus
SBT 2171 の無菌体抽出物に依る加水分解作用に反し
て、ザイモグラム染色に依ってはこれらの基質に対する
活性は認められなかった。恐らく、現在ではゲルで分離
される2 種以上の酵素の相乗作用が、発色群の放出に必
要、またはその関与する酵素の特異的活性が、本発明に
おける方法で検出されるには不十分であったのであろ
う。
【００４５】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物
が、イオン交換クロマトグラフィーで分離された際に
は、少なくとも９種の異なったたんぱく質分解活性が判
別される。ザイモグラム試験との比較では、種々のプロ
ティナーゼ及びエンドペプチダーゼを含む5 種を超える
たんぱく質分解酵素が検出された。イムノブロット試験
はLactococcus lactisから得た種々のたんぱく質分解酵
素に対する抗体の大部分は、Lb. helveticus SBT 2171
の無菌体抽出物中のたんぱく質と反応しないことを示
す。この点はLb. helveticusに由来する大部分のたんぱ
く質分解酵素は、少なくともLactococcus lactisに由来
する酵素とは免疫学的に異なっていることを示す。
【００４６】Lb. helveticus SBT 2171 は、テストした
Lactococcus 属の菌株より高いたんぱく質分解活性を示
すと結論出来る。この結論は、エメンタール及びグリエ
ールチーズ以外の大部分のチーズの熟成（19）に、主と
して、菌株のたんぱく質分解への主たる寄与を意味する
Lactococcus 属スターター培養が利用されていることを
考慮すると興味深い。Lb. helveticusの様な優れたたん
ぱく質分解作用を有する菌株の発育がチーズの熟成に大
きく影響することが明かである。従って、Lb. helvetic
us SBT 2171 のチーズ熟成の促進に関する適用が最も有
用である。Lb. helveticus SBT 2171 の高いたんぱく質
分解活性はその固有の酵素に依るのであろうが、発現及
び制御因子が関与しているかは不明である。Lb. helvet
icus SBT 0621 が全くたんぱく質分解活性を示さない事
実は、この菌株がたんぱく質分解酵素の発現及び制御に
欠けているといえるだろう。もしそうであるなら、これ
らの制御システムの一層の研究は非常に興味深い。
【００４７】チーズの熟成及びたんぱく質加水分解生成
物 チーズの熟成期間は、その種類に依り数週間から2 年間
に及び、長期間の冷蔵保存、資本の固定化に依る高価格
及び好ましからざる苦味- 臭の生成等の異常発酵に依る
損失が生じる。これらの経費を低減させるために熟成工
程の研究が重要性となる。この発明の一部は熟成工程に
含まれる酵素系に主として寄与する乳酸菌に利用可能で
ある。種々の起源から加水分解されたたんぱく質は、食
品産業に多く使用されるが、これらは種々の疾患及び代
謝異常に苦しむ患者の栄養補給にも使用できる。しかし
ながら、酸または酵素に依る加水分解は、目的とする栄
養分の損失及び好ましからざる苦味や臭の発生の様な欠
陥を多く生じる。乳酸菌からのたんぱく質分解酵素の使
用は、欠陥なしに理想的な加水分解生成物を生じ得るる
ので、非常に重要となるであろう。
【００４８】Lb. helveticus SBT 2171 の乳製品発酵へ
の意義Lb. helveticus は、発酵乳製品から1980年に分離され
た。Bergey's manual ofSystemic Bacteriologyに依る
と、Lb. helveticus (Thermobacterium helveticum、Or
la-Jensen 、1919）は、桿状、グラム陽性で、Lactobac
illus 属の偏性ホモ型発酵性菌である。この乳酸菌は至
適生育が45℃で、最高生育温度50〜52℃、また90% 以上
の菌株はガラクトース、グルコース、ラクトース及びソ
ルビトールの炭水化物を資化出来る（表b 参照）。Lb.
helveticusは酸乳、チーズ スターター培養物及びチー
ズ、特にエンメンタール及びグリエールチーズから分離
された（19）。Lb. helveticusは i) 食品製造に酸味を
与え、従って製品の悪化を予防し、ii）たんぱく質を分
解し、iii)製品に風味と味覚を生じさせ、iv）若干のL
b. helveticusに依る細胞外多糖類の生成に依って製品
のレオロジー特性を変える。
【００４９】Lb. helveticus SBT 2171 の様なlactobac
illus 類のたんぱく質分解系の優れた性質は、スタータ
ーカルチャー及び熟成工程のより良いコントロールの改
善に寄与出来る。Lb. helveticus SBT 2171 、その菌体
抽出物及び精製たんぱく質分解酵素は、チーズの熟成促
進またはいわゆる酵素調製チーズ（Enzyme ModifiedChe
ese、EMC ）の生産改善に用いられる。乳酸菌及びその
（部分的）精製酵素の種々の適用に就いては、先に述べ
られている（10,19,20）。更に、Lb. helveticus SBT 2
171 、その酵素抽出物または精製酵素は、酵素によるた
んぱく質加水分解及び／またはポリペプチド材料の工程
に用いられ、実質的に苦味のない加水分解生成物を生じ
る。Lb. helveticus SBT 2171は、種々の食品生産物の
増粘剤として多糖類の生産に用いられる。更に、たんぱ
く質分解系または多糖類及びその他の産生に関連する遺
伝子及びプラスミドの様なすべての遺伝子組情報は、理
想的な発酵の特徴を現わす遺伝子組換え菌株を得る為に
用いられる。一方、たんぱく質、ペプチド及び糖鎖に対
して生じた抗体は、食品製造中の菌体または菌体構成物
の検出に適用可能である。Lb. helveticus SBT 2171 の
基礎的研究がもたらす、保健効果、抗菌剤、ファージ抵
抗性、及びその他の制御並びに代謝系の研究に重要とな
り、一層の適用を実行すべきである。
【００５０】
【発明の効果】異なったLactobacillus 属菌種及び菌株
は、顕著な苦味除去能と同様に、多様で特異的なエキソ
ペプチダーゼ（exopeptidase）及びエンドペプチダーゼ
（endopeptidase)活性を示した。大部分のLb. helvetic
us菌株は、カルボキシペプチダーゼ基質を含む殆どの基
質に対して非常に高い加水分解活性を示した。中でもL
b. helveticus SBT 2171 は最も強力なたんぱく質分解
菌株であることが見出された。ザイモグラム法及び部分
精製試験を根拠として、本菌株は少なくとも9 種の異な
ったたんぱく質分解酵素を利用していた。Lactococcus
lactis（乳酸球菌）から得た種々のたんぱく質分解酵素
に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体で、L
b. helveticus SBT 2171 から得た酵素と反応するもの
はなかった。このことは、Lb. helveticus SBT 2171 の
たんぱく質分解系の酵素が、Lactococcus lactisから得
られた酵素とは、少なくとも免疫学的に異なることを示
す。本発明によると苦味、臭気等を発生することなく、
高いたんぱく質分解活性をもつ乳酸桿菌及びその乳酸桿
菌由来のたんぱく質分解酵素を得ることができる。得ら
れた乳酸桿菌及びたんぱく質分解酵素は、チーズ等の乳
製品あるいはたんぱく質加水分解物製造のさいに用いら
れ、製品の苦味、悪臭の生成を防止することができる。
【００５１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の
乳酸菌の基質、Lys-pNA に対するたんぱく質分解活性の
平均を示す。
【図２】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の
乳酸菌の基質、Ala-pNA に対するたんぱく質分解活性の
平均を示す。
【図３】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の
乳酸菌の基質、Meo-Suc-Arg-Prp-Tyr-pNA に対するたん
ぱく質分解活性の平均を示す。
【図４】種々の乳酸菌によるカゼイン消化物の苦味度の
低減を示す。
【図５】種々のLactobacillus 属菌株の菌体抽出物によ
る加水分解に基づく、カゼインのトリプシン消化物の苦
味度を示す。
【図６】本発明のラクトバチルス ヘルベティカス(Lac
tobacillus helveticus) SBT2171のモノQ イオン交換
カラム分画物のペプチダーゼ活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/335 8318−4Ｈ 16/40 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 9/52 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の性質を示すラクトバチルス ヘルベ
    ティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171または
    その変異株；高たんぱく質分解活性及び６時間以内にカ
    ゼイントリプシン加水分解物の苦味を除去する活性を有
    する。
  2. 【請求項２】 受託番号 CBS 404.93 であるラクトバチ
    ルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SB
    T 2171。
  3. 【請求項３】 醗酵工程において請求項１または２の微
    生物を利用する方法。
  4. 【請求項４】 醗酵工程がチーズの熟成工程である請求
    項３による方法。
  5. 【請求項５】 請求項１または２の微生物の少なくとも
    一部をコードする組換えＤＮＡ分子であって組換えＤＮ
    Ａのうち、受託番号ＣＢＳ 404.93 として寄託されてい
    る微生物のＤＮＡと厳密な条件下でハイブリッドを形成
    するＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 請求項１または２の微生物を生理活性ペ
    プチドの分解に利用する方法。
  7. 【請求項７】 請求項１または２の微生物を含む薬剤組
    成物。
  8. 【請求項８】 請求項１または２の微生物から得られる
    たんぱく質分解酵素。
  9. 【請求項９】 生理活性ペプチドのたんぱく分解に少な
    くとも請求項８の酵素を利用する方法。
  10. 【請求項１０】 請求項８の酵素を少なくとも1 種含む
    薬剤組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１または２の微生物が、乳酸桿
    菌が通常生育する条件下で乳から得られた調製物の存在
    下で生育する、乳から得られた調製物の醗酵方法。
  12. 【請求項１２】 乳調製物が新鮮なチーズカードである
    請求項１１による方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１または２の微生物の１種また
    はそれ以上の成分に対する抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１または２の微生物に特異的で
    ある請求項１３による抗体。
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