CA2004935A1 - Anticorps monoclonaux anti-interleukines-1.alpha. et 1.beta., leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines-1.alpha. et 1.beta. et en therapeutique - Google Patents

Abstract

PRECIS DE DIVULGATION Les anticorps concernés sont des anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et anti-IL-1.beta.. L'invention concerne également des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-l.alpha./AChE et des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1.beta./AChE, ainsi que des conjugués AChE-fragments des anticorps. Lesdits anticorps monoclonaux et conjugués présentent de nombreuses applications : tests enzymo-immunométriques, agents de diagnostic, agents à visées thérapeutiques.

Description

~ 93 5 La pr~sente lnvention est relative ~ de.q ant~-corps monoclonaux anti-inte.rleukines, et notam~en~ anti-inte~leukines 1~ et 1~, ~ leur procéd~ ~ productlon, des con~ugu~s anticorps monoclonaux anti-interleuklnes l~
et 1~/acétylcholinest~rase~ ~ des tests enzymo immuno~-tri~ues ~EIA) ~e d~tection et de quantific~tion des in~erleukines 1~ e~ 1~ utili~ant lesdits anticorps e~/o~
conjugués et ~ diverses autre~ appl~cations ~esdlts antl-corps e~/ou conjugu~s, no~amment ~ des appl~catlons th~-~apeut~ques.
Les lymphokines ~ont de puissants agents phar-macologiques qui résultent de l'in~era~tion entre les lymphocy~es e~ l'antig~ne sp~ciflque qui les sensibi-lis~ ; elles peu~ent modifier, ~nduire ou supprimer le~
fonctions de nombreux types c~llulaires t ellc~ jo~en~
~0 aussi un r~le essentlel au cours des téactions in~mma-to~res et dans les ph~nom~n~s de rbsorption osseuse, d~
fibrose et de chimiotactisms~ De pl~s, elles intervien-nent dans le contr~le de I'h~matopoi~s3 et la r~qulation des x~pon~es immunitaires. Le~ lympho~ines sont produites pa~ les lymphocytes ~, étan~ ~pendan~ ~onnu que ~er-~aines d'entre elles telles l'interleukine-1 peuvent ~tre produites par des cellule~ non-leu~ocy~ire~.
L'lnterl~uk~n~ . IMMUNO~OGIE, Jean-~ran¢ois BACH, ~h. %~II, pages 425-4~/ 3~me ~ition 19~6) est un médiat~u~ qul ~onsti~ue un signal b~olo~ique de la pr~sentation de l'antl~ne assocl~ ~ l'hi8to~0pe, qui marque la coop~ra~ion monocyt~s~lymphocytes T, L'ac~i~it~ de l'IL-l est traditionnellem~nt ~es~rée dans un tes~ de prol~f~ration de thymoc~tes de souris C3H/HeJ
~r~sistantes au LPS) en prb~ence de PHA ~ /ml). En l'absence d'~-1, les thymocytes ~imul~ par la PHA sont bloqu~s en p~ase Go/G1. ~ls peu~ent cepend~nt se di~i~er . -.. . .. . ..
~o~
si l'on ajoute de l'interl~ukine-2, ce q~i sugg~re que l'ac~ion prlncipale de l'IL-1 e~t l'in~tion de 1~ syn-~h~se de l~lnterleukine-~, L'IL-1 humaine est une glycoprat~ine de poida S mol~culaire es~m~ ~ 18 kDa, av~e ~n con~amin~nt majeur 15 kDa. ~n outre, d~ux ~rAc~iong pep~idiqu~ de poid~
mol~culalres ~ et 4 kDa qui pr~sentent l~ctl~lt~ b~olo-gique de l'IL 1 on~ ét~ isol~e6 de l'urine normal~, L'Ih-1 semble ~tre produi~e par une granda va-10 ri~t~ ~e types ~ellulaires ~ lusion ~es lymphocyt~sT, tels que les monooy~es, les ma¢rophag~, les k~ra~ino-cytes, les astrocytes, les m~lanocyt~, les ~ellules m~s~ngiales, les lymphoblastes B, Les effets biolo~iques de l'IL-1 ne se limi-ten~ pa6 ~ l'ln~uction ~e la synth~e de l'IL-2. L~IL-I
par~i~ipe ~ l'ac~i~ation d~8 cellule~ a, ~timule 1~
prolifb~ation des ~ibroblaste~ ~t des ~yno~locy~s, ~l~ve la temp~rature corporelle p~r a~tion sur le~ oen~rqs thermor~gulateur~ et induit la product~on d~ prot~lnes de l'in~la~nation par les h~p~tocytes, Un ~ne ~e l'IL~l codant pou~ un pr~curs~ur de 270 ~mino-acidQs ~ réeemment ~t~ clon~. Le~ pla~mides contenant c~ g~n~ lnduisent là
produ~on d'un pept~de ~rboxy-terminal de 156 amino-acide~, ayan~ Les a~ ités de l'IL-l. Alors ~ue dan~ la r~i~rence pr~ci~e, l'hypoth~e ~une famille de mol~-cules de stru~ture voi~ine ~tait ~vanc~e, DINA~LO ~J.
CLIN. ~UNOL. (19B5), $, pa~e~ 285-2971 e~ OPP~NHEIM e~
~ MMUNOL. TODAY ~1986), ~, pages 45-46~ ont montr~
que 1' ~-1 r~p~sente une ~amill~ impoxt~nte da prot~lnes biol~giquement ~c~ive8 d~riv~a~ de cellule~ ~ononu-clbalxe~, qul sont impllqu~es d~ns ~e~ r~ac~ions i~flam-mat~i~es et dans des r~ponse~ immunes. ~eux esp~es dis-t~nctes d~IL-l humaines ont ~t~ identifi~es : 1' IL~
l'IL-1~ [MARCH et al., NATURE ~1~85), 315, pa~s 541~
6473 ; ces ~eux esp~ces ont 1~ m~me polds mol~culaire, des e~fetg biologiques similaires et les m~mes r~epteur~
~::
sur les cellules-c~bles [W~O~ et al., ~ MUNOL, ~ 9B5), 134, pages ~5-903 et KILIAN, J. IMMVNOL. ~198~), 13~, pp. 450g). Jusqu'~ prb~ent, la pr~ence ~e l'IL-1 ~ans des milieux d~ culture et dans ~es ~lulde~ biolo~iques est essentiellement mesUr~e, comme indi~u0 plus haut, ~
l'aide d~ bio-as~als ~el~ que le te~t de co-~timula~ion de thymo~yte$ murins ou la lign~e cell~l~ir~ EL4 de thy-mome ~e ~ouriS. ~es méthed~, qui utili8ent les proprik-t~s d'ae~ivatlon des lymphocy~ e l'IL-1, ont cepen~ant leurs li~ites ~ ell~s ne permet~ent pa~ d'~t~lir la ~ls-tinctlon entre l'IL-l~ et l~IL-1~ et la pr~Sence d'autres subst~nces actives telles que l' IL-2, les lec~ines et les faoteurs de croissance, peut in~rf~rer ~ec le bio-e~sai.
15~E~R~A et al, ~J. OF IMMUNOL. METH. ~1~88) ;~, pages 41-481 signalent que l~ exi~once d' IL-~
recombin~nte e~ le d~veloppem0nt de la te~hnolo~ie ~es hybr~dbm~ ont pe~mis ~ plusletlr~ ~quipe~ de Chercheurs lGAFFNEY et al ., 1987 ~ K~S~H~RA et al., L987 J ~ENNEY ~t 20 al., 1987 J KOIC~IRO e~ al., l987~ ~e mettre ~u point ~les immuno essais 6andwich n~util~sant pa~: d'iso~vpe~, pour la d~e~tion d'IL-l0c et d~IL-l~B ave~ ~ne limit~ de cl~te~-tion compa~able ~ ~elle de la plupart des te8t6 blO10- ~ .
giques, e~ proposent ~ leur tour une m~thode d~ d~ec~on 2s de l~ IL-a et de l' II.-l~ S c~tte m~tho~e utili~e deux lmmuno-essa~ s enzymatiques ~an~wich par ~ol~rimétrie, s~-par~s, qui permet~nt un~ ~ét~ction de l' I~-la et ~le lp à des taux ln~rleurs ~ la pic~omole. ~ependan~, les anticorps mis en oeuvr~ son~ des antioo~p~ polyclv-30 naux de lapin ou de Inou~on.
Il est cependant cla~r qu' il ~r~sit pr~rablede pouvoir tirer parti des propxi~t~s de~ anticorp~ mono ~1OI1aUX e~ notamment de leur~; plu~ grand~s 5p~Ci ~iCit;~ et sensibill~ pour d~cerminer ~p~r~m~ l' IL~ c e~ 1' IL-35 1,~.
, , . ;.,:,,, ~
L93~5 TANA~A et al. [EUR, J. IMMUNO~ 87~, l7,pages 1527-1530~ ont propos~ ~e dose~ lJ~L-l~ et l'IL-l~
produites ln vltro par ~eS c~llule~ mononucl~aire~ ~e sang p~r~ph~rique ~ l'aide d~un immuno~ ai enzyma~i~ue sandwich qul utilise un anti~orps polyclonal ~t un anti-corps monoclonal s des bille~ de polystyr~n~ rev~tue~
~'IgGl monoclonaux anti~IL-l~ hu~ine ou d~ l antl~
1~ humaine de lapin sont incub~e~ av~c de lJI~-l~ recom-binante ~u~aine, de l'I~ recombinante humaine ou des surna~eants de culture de c~llules mononucl~aires puls~
apr~s le lavage~ avee des conjugu~s ~a~' anti-X~-la humaine/peroxydase ou du conjugu~ Fab~ ant~-IL-l~ humAi-ne/peroxydase purifi~, par affini~b, le second anticorpQ
mis en oeuvre ~tant un anticorp~ polyclonal antl-~L-la ou anti-lL-l~ de lapin.
~ 'autres Demandes de Breve~s ~xivent ~gale-ment des anti~orps anti-IL-l~ et/ou anti-IL-l~.
~ a ~mande de ~vet eUrop~en OTSUXA PHA ~ -C~UTICA~ 267 611 d~crit des anticorpS monoclonaux anti-

2~ IL-la et ~es antic~rp5 ~onoclonau~ antl-I~ . L~
constante d'af~inlt~ de Ces antl~orp~ est ~e l'or~re de

3,6.10-8 ~/1.
La D~mande ~e ~revet europ~en ~MUN~X 245 052 décrit plu~ par~iculib~ement une m~thod~ de ~tection ~e l'inflammation au cours de la~uelle l'IL-l intervi~nt, comprenant ~a) la r~action d'un ~hantillon de fluide biologiq~e conten~nt ~ventuellement de lrIL-l avec un premier antlcorps sp~ ique d'un premier site anti-g~nique cara~tb~istique de l'IL-1 e~ ~b) la ~te~ion de la réac~ion entre le premier ~nticorps et l'IL-1. Les an~ rps plus pa~ti~uli~rem~n~ d~crits dans ~tt~
Demande I~MVNEX ~ont un antic~p~ monoclonal ~ul r~ay~~
sp~cifiquemen~ avec l'IL-la (anticorps monoclonal ~bnomm~
15A4~ et un anticorps monoclonal ~ul r~a~ p~
3S fique~en~ avec l'IL~ nti~orp~ monoclonal d~nomm~
7B4).
;
Z0~3~35 ~ ep~ndant, les anticorps décri~s ~an~ cette Deman~e ne permettent pas de doser de~ concentration~ en interleuk~ne~ inf~rieures au n~no~rammeJml.
L~ ~emande de Breve~ europ~en DAINXPPON
220 063, pour Sa part, d~crit un anti~orp~ dlrig~ oontre ~ l, ledi~ an~lcorpg ~ant notamment utili~ ~ans le ¢adre dlune méthode par comp~ition oU ~une m~thode i~munom~trique. Cet antlco~p~ n~ permet d~obtenir, dans le c~dre de ces dosages ~ue des ~ensibilit~s ~e l~ordre de 0~1 ng/ml pour la m~thod~ par comp~ition et de l'ordre de 0,2 ng~ml pou~ la m~hode immunom~t~i~ue.
De mani~re gén~rale~ tous le~ ~n~icorps ~e l~Art ant~r~eur ne pr~sentent p~s une af~init~ ~u~~1-san~e, pour leur application dans des dosages tr~C~ sen-sibles d'IL-1 (de l~ordre du p~cogr~mme)~
Le Brevet françaix N' a3 13389~ au nom de la D~manderesse~ a propos~ pour la r~alis~t~on d~ d~sa~es en~ymoimmunolo~iques~ des ~onjugu~ ~ans lesquels un ant~corps, u~ ~n~ig~ne ou ~n h~p~ne eSt li~ par cOv~~
lence ~ c~tylcholines~rase, ~e noU~eau conju~u~ per-mettant, gr~ce aux propri~k~ de l'enzyme~ la r~lisa-tion de dosag~s e~zymoimmunolog~ques de quant~t~s tr~s faibles, de l'ordr~ du nano~ramme, ~RASSI et ~l. ont d~arit tANALV BIOCHEM.
~5 ~1988), 1~. pages 436-450] une application de ~onjugu~
con~orm~s ~ ~e ~reve~, ¢on~ti~u~ p~r ~e~ an~ig~nes mar-qu~s par l'ac~tylc~olin~st~a~e, au ~ri41~e d'anticorp~
monoclon~ux diriges aon~re les prot~ine~ p~riph~riquaa ~u photos~$~m~ 1 ~PSl), qui e~t un complex~ ~e membrane~
Les Au~eurs ont ~gal~ment testb cette ~thode dans d~$
immunoessa~ par comp~tition, ce qul le~r a p~rmis d~
qu~nti~ier de ~a~on tr~ prbcise deg polypeptid~ de PSl dans dif~rents ex~ralts blologiqu~. Le test immunoen~-mat~ue comprend, pour le criblag~ ~'u~e ~rie ~anti~orp~ monoclonaux apt~ ~ reconna~tr~ le~ d~ff~
rent~ polyp~pt~des ~ui composen~ l~s ~ux classes d~
, 93~3 polypeptldes ~on~ est constitu~ le PS1, les trois ~tap~s suivan~es :
- les anticorps monoGlonaux an~ Sl pr~sen~s dans les surnageants des cul~ures d'hybridomes ~e fixen~
~ la phase solide, ce q~i ent~a~ne l'lmmobilis~tion in~l-re~te du composant biotinyl~ co~respond~nt du P~1 5 - cet anti~ne bio~inyl~ flxe fo~tement l'a~idine, ~ui flxe elle-meme l'AChE marqu~e ~ ~a biotine ) - l'ac~ivit~ de l'A~h~ i~xke e6t mesur~e par la m~thode colori~trlq~e 1~ d'EL~MAN. Les Auteurs ont montr~ que l~e ~ys~me ~ l'A~hE
am~liore de façon trbs sen~ible les limites da d~ection des anticorps monoclonaux. Cs~te m~hode ~e criblage s'applique parfaitement a 1~ db~e~mination quan~itative de dl~~~ren~s polypepti~es du PS1 par competition.
1~ ~a pr~sente in~ention 6'est en ~on~c~u~nce donné pour ~ut de pourvo~r à de~ moyens propres ~ per-mettre la r~allsation dte~a~s en2y~0-immunom~trlques ~laut~ment spéclfiques et sen~ibl~, d~ d~ection e~ de quanLificatlon d~IL-l~ et d'IL-~ ces moyens ~tant en outre suscepti~les d'appllcations ~rapeutlqu~s e~
d'applications diagnostiques in vivo.
La pr~sente ~nvention a pour objet des anti-corps monoclonaux ~pécif~ques de~ IL-l~ et 1~ qui r~sul-tent de l'~mmun~sation de mammi~res, no~amment de r~n-geurs, et plus particuli~rement ~e ~ouri~, par des I~ou -1~ selon le ~as, qui reconn~issen~ sp~ciPiquemen~ les IL-1~ na~urelles ou ~ecomblnant~ Ou les I~ n~turclles Ou ~ecombinante~ qu~ ne pr~gent~nt pr~tiquement pAS de r~action ~ro~s~e entre les deux IL-l, c~ctk~s~ en ce ~ue lesdits antlcorps m~noclonaux on~ une ~onstan~e ~e dissociation infbrieure ~ 5.10-1~, en ce qu~ils ~e compo-sent de plusieurs groupes qui xeconnaissent de~ r~ons distinctes de~ IL-l~ ou 1~ en Ce que les anti~orps ~e cer~ains groupes s~nt ~ptas ~ se lier de f~on ~o~p~tible ~5 avec t~u~ les antiCorps ~es autre~ groupes, ~ ~voir :
, . - ~ - . .
~ ~ q.~ 3 - les anticorps Dnti-IL~lct s~ composent de trois groUp~s ~A, B e~ C) ~ui r~cc~nnaiss~nt trols r~ions distinc~e~ de 1' ~n~erleukine-loc, tous le~ an~icorps d'un groupe é~ant apteS ~ se liar de fa~n compatible avec 5 tous Ceux de~ deux autre~ groupe~ n~ ~tant pas cor~lp~t ible~ aveC ~n autre ant: lcorp8 ~u n~me groupe s - les an~icorps an'~1-IL-l~ se compo~ent de quatre groupeS (A~ B~ et D) dont l~s ~eux premiers l~
et B) on~ ~n Comportement sim~l~lre ~ celui c~es anticorp~3 10 anti-IL-la, dont les antic:orpS ~u groupe C sont compa~
tibles avec un seul anticorps ~e chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du qua~ri~me groupe ~D~
sonl; incompati~les av~ l'un quelconque de~ anticorps des trois pren~lers group~8, ~t ne se lient pas ~ 1' IL~
native re~ombinan~, reconnaig~ent une interl~ukine-l~
modifiée, ~t r~agissent a~sc un ~onjugu~ ~L~ hE s et en ce qu~ lesdit~ antico~p~ anti~L~ t anti-IL-l~
rec~nn~issent les con~ugu~s lL-la ou l~ac~tyl-cholinest~rase ~AChE).
~U Ces an~icorps ne pr~Sentent pratiquemen~ pas de r~a~ion cr~is~e (<O~Ol %) entre l~s deux IL~
Les ~nticorps monoclonaux spécl~iques ~s in-Serleukine~-l~ et 1~, con~orme~ n~ention, sont obte-nus ~ p~t~r de ma~ml~res tels ~u~, no~amment, des ron-geurs, et plus parti~uli~rement des souris, qui sontimmunis~s par des injections approp~i~es d'~nterleukine-la ou -1~, puls ~es cellules de rates ~es mammif~res immunis~S ont ~usionn~es~ n une technique appro-pri~e, avec des cellules ~e my~lome de mammi~re~ de la m~me esp~ce, les hybridome~ r~ultants sont mi~ en ~
ture et ceux dans les surnage~nts ~e~quel~ on~ ~t~ ~te~-t~s des ~ntic~rps anti-interleukine-l~ ou 1~ selon le cas, ~ont sous-clon~s pour obtenir des li~n~es cellu-l~ires se~ ant de~ anti~orp~ monoclonRux ~nti-lL-la ou ,~ :
.. , ~
2~ t3~5 B
an~i-IL-1~, selon l'interleukine contrb ta~uelle ils ont ~t~ dirigé~
L' int;erleuklne-la ou ~ e ~n oeuvre pour imnuniser les mammifères su~dits, peut ~tr~ auss~ ~len 5 une interleukine naturelle puri~iée, qu/ une interleuklne recombinante .
Les hybr~do~nes mi~ en oeuvr~ pour l' o~tention cles anticorps monoclonaux anti~L-la e~ ~nti IL~
con~orme~ ~ l'invention ont ~a~t l'obje~ d'un d~p~t en 10 date du 8 D~cemb~e 1988 auprè~ d~ la CO~ECTION NATIONALE
D~ CU~TURES ~E; MICROO~GANISMeS ~CNCM) tenue par 1' INSTITUT PAS~EUR. Le~ hybr~domes d~pos~ ~;ont identi~
~i~s pax l~s N' suiv~nts: I-e23l I-824, I-825, I-B~6, l-B%7~ I-828, I-82~, La pr~sente invention a é~alement pour objet des con~ugu~s d' ac~ylcholinest~rase e~ d' anticorps mono-clonaux anti IL-1~ ou -1~ ou de ~ragments de ce~ ~nti-corps, not~m~ent de ~ragments ~ab'.
La pr~sente ln~ention a, de plus, pour objet 20 un procéd~ de product~on ~e ~ra~ments ~ab~ ~es ~ntlcorp monoclonaux anti-interleukine la ou 1~ conformes ~ 1~
prbsente invention. ~on~orm~men~ ~ ce procbd~, le~d~ts antico~ps monoclonaux sont trait~s par de la pepslne en milieu aclde, po~r obtenir ~es fragments F~ab~)2 qu~ sont isolbs p~r chromatographie ~ur tamis mol~culaire, puis ces ~ragments E~(ab')~ sont sDuml~ ~ un proce~us de ~duction m~n~e, par un ag~nt r~duc~eur appropr~ tel, notamment, que la ~-mercapto~thylamine (~M~A), pour fo~r-nir un ~ragment ~ab' qul est purifi~ p~ pAssage sur une ~olonlle de chroma~ographie sur ~amis molé~ulair~.
La p~ésen~e invention a ~galement pou~ o~et un pro~d~ de produc~ion de con~ugu~ d'AChE e~
d'anticorp~ monoclonaux an~ la ou sntl-IL-~ et d~
con jugu~s d'ACh~ et ~e ~agment~ desdits anticorps m~no-clonaux, notam~ent de fragmenta Fa~ ui e~t caract~ren ce qu'au moins un ~roupe thiol incorporb ou ~aturelle-~ , . :. - ~ .
,:
.3~ ~
.
ment prbsent dans ~'antlcorps ou l'un de ses fr~gments, est coupl~ ~ au moins un groupe mal~ o in~orpor~ ~ans l'AChAE, par 1' intermédiaire d'un a~ent de ~oupl~e ap~:o-pri~ ~el ~ue, notamm~nt, un ester de N-succinimide com~e le N-~uccinimidyl-4-~N-mal~imido-m&thyl~ cy~lohe~ne~
carboxylat~ ~SMCC).
La pr~sente inYention a, en outre, po~r ob~e~
des tests ~mmunoen~ymatlq~ par comp~ition de d~tec-tion de l'Il-la et de l'IL-~ dans des surn~geants de cul~res cellula~res et dan~ des flu~des biologiques, car~ct~ri8~s ~n ce qu'un anticDrps ~onoclonal an~i-IL~
ou anti~ con~orme ~ l'invention, util~ om~ pre-mier anticorps, e~ des Ig~, port~es par un suppbrt ~lide appropri~, utilisées comme ~econd ~nticorp~, 60nt ~i~ en contact a~ec des c~njugué~ d'I~ AChA~, qui ~ouen~ le role de ~r~ceur~ e l~nterleuklne-l-la ou ~ apr~s ~uoi l'ac~ivit~ AChE est r~v~l~e par tou~ ~oy~n~ ~PP~~~
pri k~ .
~a pr~ente lnvention ~ ~galem~nt po~r ~
des tests en2ymo-immunom~riqu~s hautement sp~cifiques et sen~ible~, de d~tectlon de l~ la et de l'I~ ns des ~urnageants de cultures cellula~res ek des ~luides biolog~que~, ca~act~r~6és en ce que ~e8 antico~ps mon~-clonaux ~cm) anti-~L-la e~/o~ anti-I~ conformes 2S l'in~ention et port~s par ~n support approp~ on~ n~i~
en contact avec de llIL-la ou ~1~ et ave~onju~u~
Acm-ACh~, ~pr~ quoi l'activit~ E ~st ~e par ~OU6 moyens appropribs.
$elon un mod~ de mise en oeu~e d~ est~
30 enzymo~immuno~étriques, l'I~ ou -1~ est ~ jout~
1~ antiGorps simul~an~men~ ave~ le ¢onj~g~ Aom-ACh~ et le~ deux ~nticorps ~onoclon2~x r~gi~sent ~imult~n~mant a~ec 1'~ ou Selon un autre mode de mi~e en o~u~e de ce~
35 tests enzy~o lmmunom~tri~ue~, l'IL-~a ou ~ Rt tout 5 ~'abo~d int~oduite at r~agi~ ave~ 1~anticorp~, puis le :. ' ~ , . ' . ".' ," ,.: ' '; :
, ' ' ,,:
3~
, . .
lQ
conjugu~ ~cm-AChE e~t ensu~te introduit et l'a~tivit~
A~hE e~t r~ e par tous moyen~ appropri~.
~ ,es &upport~ approprl~s ~ont notamment des plaques de ~crot1tration ou de~ supports sou~ ~orme de partieu1es perme~tant la fixation de~di~ anticorp~
~ a pr~sente in~ention ~, d~ plus, pour objet un k~t pour la r~allsation ~es tests immuno-enzymatique~
par co~p~ti~ion conformes ~ l~invention, cara~ris~ en ce qu'il eomprend :
, une s~rie de p1aques de microt~tration rev~-tues d'un Rnticorps con6titu~ pAr des I~G ~e lapin anti~
souris , . ~u moins un f1ac~n contenant des doses appropri~es d'anticorps monoclonal ~nti-IL-1~ et/ou ~'anti~orp~ monoclon~1 antl-IL-1~ ~
. au moln~ un ~lacon contenan~ d~ coniu~u~s ~'T~ et d'AChB et/ou au moins un ~1acon contonant de~
con-~ugu~s d'IL~ d'AChE t . . de~ quantit~s ou doses appropri~e6 ~'un sub-strat ~e r~la~ion ~e 1i~ChE
. de~ qu~ntit~s ou do~es ~pproprl~e8 ~'IL-l~
et/ou ~'~L~
~ a pr~sente in~ention ~ ~g~lement pour objet un ki~ pou~ la r~alisatlon d~s ~s~t~ enz~mo-i~muno-m~triques con~ormes ~ 1~invention, ~aract~ris~ en ce ~u'il comprend :
. une ~rie de plaqu4s de microtitration rev~-tues d'an~l~orps monoclonaux an~i-IL-la et/ou d'antieorps monoclonaux as~ti~ lp;
. au molns un flacon contenant ~es con~ugu~s d'AChE et d~anticorps monoclonaux anki-IL-la 2~/OU ~
~ des quantit~s ou ~os~s appropri~es d'un ~ub-Strat ~e r~v~la~ion de l'ACh~ ~
. ~es quan~it~s ou doses appropri~es d'IL-la et/ou d'IL-1~
.
' 2~935 -La pr~sente invention a, de pl~s~ pour o~jet des agents ~ vis~eS th~apeutiques~ caraCt~ri~s en ce qu'lls sont constitu~s par, ou comp~ennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-lL-la S et/ou ~es anticorps anti IL-l~ e~/ou leurs fra~men~s, ~o ~ l'invent~on, seuls ou con juyuhs ou hybxidés Ou as oCi~s aveC d'autres subs~ances, Conform~ment ~ l'invention, une application th~rapeutique partlculièremen~ int~ressante de~dlts anti-corps monoclonaux anti-IL-l~ et anti~ e~t leur acti-vit~ d'inhi~ition de l'IL-l.
La pr~sente inYent~on ~ ~galement pour obje~
~es agents de d~agno~tic apteB ~ ~tre mL8 en oeuvre pour le diagnostic in vivo, Caract~ri~5 en ce qu' il5 compren~
nent de~ anti~orps antl~IL-l~ et/oU des anticorpS anti-IL-l~ Ou leur fragmen~ a~oclé~ ~ un antig~n~ et/ou ~
~n hapt~ne et/oU ~ un autre anticorp~ oU fragment ~'anticoxps, etfou marquks pax de~ marqueurs ~t~bles ou radioa~tifs.
Rcl~tivemcnt ~ux dessins quiillu~rcn~l~ rc~lisa~ion dc .
l'invention, - La ~igure 1 : l~e~fet non-~pecifique d~
pl~sma sux des ~ourbes stand~rd d~un immunoessai d'~
dans le Ca~re ~une comparaiSon entre deux ~ouple~ ~lff~-rents d' ant~Corps monoclonaux.
- La Figure 2 : l'~uolution ~e la courbe ~ta lon de 1~L-1~ en fonction du temps de~ol~ ~ la r~a~tion enzymatiqUe ~tape de ~év~lation).
'' . ~ :, 2~ 335 - La ~igure 3 . l'~volu~on des "pro~ils d'lmpr~cision" ~ans le test relatif ~ l'IL-1~ en fonction du temp~ d~volu ~ la r~actlon enzymat~que ~tape ~e r~v~lation).
- La ~igure 4 : la libéra~ion in vitro ~'II,-~ ) et d'IL~ , 0~ ~tabli~ par le~ EIA ~p~
fiques dan les surnageants ~e monocyte~, lymphocy~es et neutrophiles humain~ non st~mul~ ) et 6timul~s par le LPS (O, 0~, p~ri~i~s par ~lutri~tion cen~ri~uye.
- La Fig~re 5 : la r~partition de l~immunorbactiv~t~ de l'X~ la suit~ d'une chromotagraphie 5ur tamis mol~cul~ire "~UP~ROS~ 1~" de sux~ageant de ~ulture oU de plasma.
~ La ~igure 6 : la limite de d~tection d' un lS kit de l'Art antbrieur, util~an~ une m~hode ~e dosa~e de l'IL-la par ~omp~tition.
- ~a Figur~ 7 : la llmite de d~tection d'un k~t d~ l'Ar~ antérieur, ut~ ant une m~tho~e immuno-radiom~trlque de do~age de lt I~-lp~
~1 dolt ~trQ bien en~endu, to~tefoi~, que ces exemple~ et dcs~ins sont donn~ Uniquement ~ t~t~e d' lllustration da 1~ obje~ de 1' ~nv~ntion, dont il~ ne constituent en auc~ne mani~re une l~mi~atlon.
EXE~L~ 8e e~ oeuv~ do~ t~ o~or~as l'~n~nt~on ; pxbparatlon d~ r~aotl~s ~nt~co~p~ mo~o-olonaux ~t conjugu~) et para~ e~ de ~le~on ~e~
r~t~
_~S~LJ;~ S~L~ D~ E.T~ OL~N~ S~ :
~ é~ylcho~lnes~ra~e ~AChE) o~t~nue ~ partir de l'~nguill~ ~lectrique Electrophoru~ ~lectri~us, a ~t~
purifi~e par chromatographie d~af~init~ par la m~thoda d~cr~te par MASSOU~E et BON ~ur. J. ~IO~EM ~1976),~8, pages 53}-5391. La ~orme t~t~m~r~ d~ l'en~yme, ou ~orme G4, a ~t~ u~ili8~e pour marquer le~ ~ntsrleukines et l~s 3$ anticorps. L'aetivit~ ACh~ a ~t~ ~esu~e ~ e de ~a m~hod~ colorimbtri~ue d' ELLMAN e~ al. [BIO~HEM. PHARM.
.
. .
.. ~ .
' O ~ 3~J

(1961), 7, pa~es ~8-95~. Un~ uni~ EL~MAN e~t d~inle comme ~tant la quantit~ d'enzyme produi~an~ un~ augmenta-~ion de l'a~sorbanc~ de 1 DO à ~5'C, pen~nt 1 ~inut~, dans 1 ml de m~lieu ~t pour ~ne longueur ~e pas optique d'l c~ ; elle corxespond ~ environ 8 ng d'enzyme et 7,3~ uni~s enzymatiques (un~ unit~ enzym~tique corre~-pond ~ l~ quantlt~ d'enzyme qui hydroly~e 1 ~mole d'ac~tylcholln~ ~ ~5-C pendant 1 minute). Les concentra-~ions d'AChE ont ~ termin~es p~r voie ~nxyma~iq~e en ut~ ant une const~nte cat~}yti~ue de 4~4 x 107 moles h-l par sit~ et une masse mol~Gulaire de 80 k~a pO~F la sous-unit~ ~atalytique. A pa~tir de ces ~leurs, une limite ~e d~tection de 1,8 a~tomole tlO-18 mole~ d'enzyme peut ~tre cal~ul~e pour la ~o~me ~4 (~'e~t-~-dlre la lS quantit~ d'AChE q~i produit une a~gmentation d'a~orban~c ~e 0,01 ~0 pendant î heure~ dans 20 ~1 de milieu de EL~MAN, pour une longu~ux ~e pa~ de 0,S ~m.
~TIQN U'HYBR~D~E~ :
Des antic~rps anti-interl~ukln~-la et 1-~ ont ~té pro~ui~s che2 des ~ouxls de ra~e Bio~zi High ~espon-der ~H~) en u~ an~ le proces~us d'~mmunisation sui-vant : au ~our 0, 15 ~9 d'~nterleuklne re~ombinante 1~ ou 1~ ~mulslfi~e dan~ de l'ad~uvant complet de ~eund ont ~t~ inject~s dans 1~ ¢ouss~ne~ d'un~ patte. Les souris ont et~ trai~es par de l'a6pirine (0,1 mg/jour) pour ~viter le~ effets secondaires tel~ que l'hyperthermie.
Une premi~re injection de xappel (~ns le cou~sinet ~'une patte) a ~t~ adm~nistr~e au ~our ~1 e~ souris ont ~t~
saignbes une semaine plus tar~. La pr~ence d'anti aorp~
anti-interleuklne murins dan~ les s~rum~ ~orr~8pondant9 a ~t~ ~ontr~l~e en testant l~ur capacl~ de fixer ~es con~ugu~s lntaFleukine-l- A~hE. Ces te~ts ont ~ r~ali-s~s dans des pl~qu~s de mi~roti~rat~on rev~ues d'un second antl~o~ps IgG an~ ou~i~, en ~et~ant ~n oeuvre le 35 mkme processus qu~ celui qui ~er~ utili~ ul~r~euremexlt pour ~rible~ l~s ~urnagsan~ de cult~res d'hy~rl~ome~. On ., , . . . . ........................ ~ , ,~ ; ' a choi~i pour chaque interleukine-1, la ~ouris pr~sentan~
le titre le pl~ blev~ dan~ l'immunoess~i-enzymati~ue, pour la pr~paration d'~nticorps monoclonaux. A ee s~ade, des titres comprl~ entre l~100~ et l/1~00 ont ~ obser-vés. Les souris ~lectionn~es on~ reçu une injectionintra~ein~usé de rappel ~7~g d'inkerleukine) 3 et 2 jours avant la fusion. ~es cellule~ de rate de~ ~ouri~ corres pondantes ont ~t~ ~usionn~es ~vec ~es cell~le~ de myklome de souris NS1, comme d~crit ~ans l~Article de GRASSI e~
al. cit~ dans le preambule.
3 MARO~ P'~NT~ KINES P~ ~'a~hE :
L~s interleukines la et 1~ ont ~t~ coupl~e~
par covalence a l'AChE par l'~ntermédial~e d'un r~ac~if h~téroblfonc~ionnel, ~ ~avolr le N-~uccinimidyl-4~
maléim~do-m~thyl) cyclohexane-l-carboxylat~ ~SMCC~, en me~a~lt en oeuvre une te~hnique connue pour le marquage du facteur de croissance acide bovin ~aFGF~ et de la pro-lactine de rat. ~e~e méthode comprend la r~aetion d'un c~roupe thiol (pr~ala~lement introduit ~ans le~ lnter~u-kin~s) aveC un group~ mal~imido inaorpor~ dans l'er)zyme apr~s la r~c~ion a~ec le SMCC. Les interleukines ont ~t~
th~olées par r~action de leuxs groupe~ amine primair~
avec du ~-succinim~dyl-S-a~tyl-thi~ac~ate ~SATA~ dan~
un milieu alcalin.
2~ - Inco~por~ti~n de $roUpe~ ~hlo~s d~n~ 1~$ ~ntorl~u-~ne4 :
10 ~1 d'une solution ~ 2,7 mg/ml de SA~A d~ns du di~thyl~ormamide (DM~) anhy~re sont ~jout~s ~ 100 ~g d'interleukines 1~ Ou 1~ di6sout~s dans ~00~1 de tampon bora~e 0,1 M, p~ 8. L~ m~lange r~git pen~ant 30 mlnutes ~ 25'~ ~vant que lui soient ajout~8 200~1 ~'une solution d'hydroxylamine 1 M, p~ 7. Au bou~ d'une nouve11e dur~e de r~action de 30 minutes ~ 25'~, les r~actifs en ~x~
~SA~A ~t hydroxylamine~ ~ont ~l~min~s par ~hroma~o~raphie sur tamls mol~cula~re sur une ~olonne Sephadex ~5 ~15 x 1 c~ quilibr~e par un tampo~ phosph~te lO-1 M, pH ~, contenas~t 5.10-3 M d'EDT~. Avant et pen~ant la chrom~to-graphie, l'~luat est maintenu ~u~ u~ coux~nt con~inu d'a~ote pour bliminer l'oxyg~ne di~o~s e~ ~ite~ une bv~ntuelle oxydation des group~s thiolR. Ves fractions contenan~ des interleukine~ thiol~s ~ont r~unles. La concentrat~on des interleu~ines est ~alu~e par spectro-m~tri~ ~.V. en supposant qu~ le coeffi.cient d'extlnction ~ 280 nm e~t de lg-lL cm~1 et que le poi~s mol~ulaire est de 17000 . Leur teneur en groupe~ ~h~ols a ~t~ d~ter-min~e par ~olo~im~trie (~ 412 nm~ apr~6 r~action avec del'acide 3-5' dithiobis ni~robenzo~qu~ ~DTM~ ~15 mM. C~
mesur~s ont fait appar~ttr4 qu'~nviron un groupe ~hiol ~t~ ineorpor~ par molécule d'interleukine.
- Incorpo~atlon de groupe~ ~al~imldo ~n~ Ch~ e~
couplage ~ e~l~uk~n~ ~hlo~6~8 :
~ es groUpes mal~imi~o ont ~té introdui~s dans l'A~hE ~forme G4) par r~ction avce ~u SM~ ~ si elle n'est paS utllis~ imm~iatQment, la pr~par~tion dlA~hE-SMCC peut ~tre congel~e ~ -80-C e~ ~tre conserv~ s~ns perdre ~es proprlétés r~ctive8, pend~nt au moins plu-sieuxs sem~ines. L~s int~rleukine~ ~hiol~es ont ~t~ cou~
~l~es ~ 1~ pr~paration d'AChE-SMC~ ~orms ~4) ~n ~lan~
geant les deux r~act~fs ~mm~di~ement apr~ qu'~l$ on~
~t~ i~ol~s par chromatograph~e sur ~amis mol~culaire ou d~s qu'il~ ont ~t~ d~congel~s. A ~e stade, on a ut~lls~
un ~apport mol~culai~e ~SH-interleu~ine/~4 SM~C) de 50ll.
Après réa~tion pen~nt 3 heures ~ 30-C, l'in~e~leukine ~u.i n'a pas ~a~i est ~lim~n~ par chro~atographle sur une ~olonna (~0 x 1.5 cm) de B~ogel A 0,5 M. Le~ conju-gu~s sont conse~és à l'btat ¢ongel~ 0'~. Aucun~per~e d'actlYité enzymatique n~a ~t~ ob~o~v~e pendant 1 totalit~ ~u procei~su~ de couplage. Il ne ~'e~t pai~ pro-~uit ~e modification signi~icati~8 des propri~t~s immuno-logiques ou enzymatiques des con j~U~8, dans ce~ ~ondi-tion~ de conservatio~l en l'espace ~'une ann~e.
, , ~ . . .
-, .
.

4l_MAR~VAGE D'ANTICQ~PS ~QNQC~ONAUX par ~AChE :
Des anticorps monoclonaux (Acm) ont ~té puri-fi~s ~ partlx de ~lu~des a~citlques par pr~cipitat~on pa de l'acicle caprylique et du sulfa~e d'ammonium~ selon une technique ~écrite dans l'Art ~n~ri~Ur. La puret~ de la pr~para~ion a ~t~ v~rlfi~e par ~le~rophor~se ~n g~l de polyacrylami~e dans des conditions dbnaturantes et rédue-~rlces. Deux m~khodes de marq~age di~ren~ unt e~
utilis~es pour ~oupler des ~cm puri~i~s ~ de l'AChE.

4.a) ~rqua~e d'A~M p~r la b~otlno La ~otine a bt~ liée par cclvalence ~ des Acm tels ~ue ~~inis ci-dessus par réaction d'un N-hyclroxy-s~ccinimide es~er de biotine activ~ ~IBF, France) avec les groUpes amine pri~aire des ~nticorp~. L'es~er activ~
a ~t~ dissous dans du diméthylforma~ide ~nhydre e~ ~out~
à une solution alcaline ~e l'anticorps ~ marquer : on a aiout~ 40~1 d~une solution ~ 5mg/ml d'ester ~e biotine dans du PMF, ~ 1 mg d' an~icorps clissous dans 2 ml d~ tam-pon borat~ 0,1~ pH 8~5. Au bout de 30 minutes ~ la tom-p~rature am~iante~ on a a~out~ 2 ~1 ~e tampon ~IA ~qui sera d~fini plu~ loin). Ce~te pr~paration a ~t~ u~llis~
pour d~terminer la "compa~ibilit~ ~e fixg~ion" des diff~-ren~s Acm sans subir d'au~es puri~ic~tions. Elle a ~t~
conserv~e ~ l'état congelé ~ -20'C.
2~ 4. b) ~rquagc ac~len~ ds ~rag~e~a ~b~ pax l~ChE
~ es fragments F~b' ~'~cm ont ~té couplés par covalence ~ l'ACh~ par l'interm~iaire du SM~C ~n ~ttant en oèuvre une technique d~iv~e dc ~elle ~éari~e par ~SHIKAWA et al. 1~. IMMUNOASSAY (1~3) q, page~ 20g-327]
pour le marquage de fra~ment8 d'anticorps par ~'autres enzymes. Le principe de la m~thode mi~e en oeu~re est très semblable ~ cel~i utilis~ pour marq~er les interl~u-kine~ qui ~ ~t~ ~crit plus haut, ~ ~eci pr~ queO dans le cas pr~sent, les ~roupes ~h~ols impliqu~s dans la r~-action de couplaye Son~ naturellement pr~sents d~ns les 17fragments Fab' obtenus par r~duetion ~u fr~gment F~ab')2 correspondant.
. Pr~paration de fragments F(ab')2 :
Des fragments ~(a~'~2 ont ét~ obtenus p~r ~rai~emen~ ~'Acm par de la pepsine en milleu aci~e ~tam-pon acétate pH ~,3). ILs ont ét~ isol~s de ~a pr~par~t~on bru~e trait~e par la pepsine, par chrom~tographie sur tamis mol~culaire sur une colonne ~30 x 1,5 cm) de Bio~el A 0,5 m équili~r~e dans du tampon phosphate 0,lM, pH 6, con~enant 5.10-3M d'EDTA. La pureté de la f~act~o~
F(ab')2 a ~té ~ifi~e par ~lectrop~or~s~e en gel ~e poly-acryl3mide dans ~es condl~ion~ d~naturantes nQn r~duc-trices. Ces mesures ont montr~ que plus de 80 ~ ~e la teneur totale en proteines é~alent composés de fragments de ~ab')2.
. Pr~paratlon de fragments Fab' Des ~ragments F~a~')2 ont ~e r~duits en pré-sence ~e ~-mercaptobt~ylamine 0,lM (~MEA) ~ 37'C p~ndan~
1 heure. ~a ~M~A en exc~s a 6~ eliminée par ohrom~toqra-phle sur tamis mol~culaire sur une colonne t30 x ~,5 cm)de S~phadex G25, comme dé~ri~ pr~c~demment pour les interleu~ine~ thiolées. La concentration en fr~men~s Fab' a é~ mesur~e par spectrom~trie U.~. ~n pren~nt p~ur coeffic~ent d'extinc~lon ~ 2B0 nm, 1,48 g-l~ L cm~~ et comme poids m~l~culaire 46000. La teneur en groupes thiols de la préparation de ~ab' a ~tb d~ermin~8 par réaction a~e~ le DTN~, Comme pour les interleukines thio-lbes. Selon l'Acm ~tilis~, on a ~rouv~ des valeurs ~om-pr~ses entre 1 et 4 groupe8 SH p~ molécule de Fab'.
. ~ncorporation ~e groupes mal~imido d~ns l'A~hE et ~ouplage avec des ~agments Fa~
Des groupes ~al~i~ido ont ~t~ in~o~uits ~ans l'AChE ~forme G4) par r~action a~e~ le SM~f suivie de puriflca~ion. Le couplage de l'enzyme a~e~ des fragmen~s ~ab' a ~t~ r~alis~ par m~lange d~ 1~ pr~p~ra~lon AChS-SMCC ~.mm~diatemen~ ~pr~s qu'elle a ~t~ i~ol~e par ' .3 1~
Ghromatographie sur tamis moleculaire ou d~congel~e) avec un exc~s d~ ~ragments Fab'. On utilise h~ituellement un rapport molaire de 50 ~ ce stade ~c'e~t-~-dir~ gro~pes thiols de ~ab'/~4-SM~C~. Apr~ r~action pendant 3 heures ~ 3~ C, le6 con~ugu~s G4-Fab' ont ~t~ i~olés par chroma-tographie 6ur tamis mol~culalre ~r une ~olonne do ~io~el A 0,5 m. Le con~ugué a ~ lu~ sous la forme d'un se~l pic ho~ogène, la fraction corre~pondante a ~ recueill~e et conservée ~ ta~ congel~ ~ -20-C. Aucune perte significative d~ l'acti~it~ en~y~a~ique n'a ~t~ o~erv~e pen~ant la to~alit~ du prOceSsUS de couplage. La ~tabi-lité des conjugu~ s'est ~ver~e ex~ellente car il~ ont pu ~tre con~erv~s ~oit ~ a~ ~ongel~ ~ -20-C, soit ~
l'état lyophllis~ , ~oit ~ l'é~a~ uide ~ +4 ~, sans lS perdre leurs proprl~tés enzymatiques o~ immunologiqu~s.
S. C~IBLA~ DE5 ~U~NAGE~NTS DE ~ULT~R~ : :
La pr~sence d'ant~corp~ anti-interleukine-1 dans des ~urnageants d~ ~ul~ur~s d'hybridomes a ~t~
d~¢~e en mettant en o~vxe un test immunoenzyma~ique analogue ~ ~elu~ dbcri~ plU8 hau~. ~es ~urna~eants de ~ultu~e ont ~té incub~s dans des plaques d~ microtitra~
tion rev~tue~ d'un second anti~orps IgG anti-souris, conjoin~ement avec des conjugu~s d'in~erleukine l-A~h~.
Pendant ce~te ~tape, les Acm anti-interleukine 1 ~ven-tuellement pr~&ents dans les g~rn~gean~ 8e lien~ simul-tan~ment au conjugu~ IL-1-~ChE et à la phase ~olide, ce ~ui entraln~ l'immobilisation indireete ~e l'ac~ivit~
AChE sur le~ pla~ueg~ La p~ésenc~ de l~AGhE sur la phase solide a en ~utre ~té r~él~e ~apr~ une étape de l~vage) par ad~tion du ~ubstrat et mesl~re par color~m~trie. La pr~para~io~ et les caract~xistiques ~u second antlcorps en phase ~olide sont ~ien ~onnuos ; ~0 ~1 de ~haque sur- :
na~ean~ pr~s~nt s~r les pla~ue~ de ml~rotitration ~ompor-tant 96 pults, ont ~ tran3f~r~s ~ns des conditions st~riles dans des plaques ~e mierotitration de m~mes dimensions, rev~tueQ ~u second ~nticorps. 50~1 de ~onju-.
~ .
~o~
19gu~ interleukine l-AChE tl ur~ BLI.MAN~ml~ dissou6 dans du tampon EIA ont alors ~t~ a joutb~ et on ~ laiss~ gir le m~lange pend~nt une nu~t ~ ~4'C. A la ~n cle cetl:e prem~ ~re p~rlode de réac~ion, les plaques ont ~t~ soi~

5 gneusement lav~es avant d~ a~outer 200~11 de r~ac:~lf d~ ELLMAN dans chaque puits . A ~Q ~t~de les p~lts conte-nant ~e l' aGtivité ACh~ la pha~e ~olide ont d~ve-lopp~ une forte coloration jaUne qui indique la pr~sence d' anticorps ~nti-IL-l c~ans le ~urnageant corre~pon~ant .
10 L' absorbance ~ 414 nm de chaque pui~ a ~t~ me~ur~e 30 minutes ou une heure plus ~a~d en utilisant un lecteur automa~iqUe de pl~ques ~TIT~TEK, Fin~nde). ~e processus de ~riblage perme~ une sblection ts~ rapide et e~fic:ace des hybridomes attendu C3~UQ cle~ quantl~ d'Acm de 1' o~dre 15 du nanograme son~ ~aci lement d~tect~ e crlblaqe de 2 000 surn~geants ne requ~rant p~s ~lus ~e 4 heures de travail pOU~ une personne.
~a~ FI~A~ION POUR
OU~. PAIRE ~'~c~
~0 La compatlbilitb de fixa~ion cle deux A~m diff~ren~s Sur une seul~ mol~ule d~Interleukine-1 a ~t~
db~ermin~e dan~ un test immunom~trique dans l~quel l'un ~es Acm ~ ét~ immobilis~ sur une pha~e solide ~and~s que l'autre ~talt marqu~ par des ~ol~cula~ de biotine~ ~es te~t~ ont ~ ef~ectué~ comm~ ~uit : ~oute~ les dilu-tions ont b~ r~ali~es dan~ du tampon ~IA et 100 ~1 d'une solution ~ 100 ng/ml d'in~erleukine-la ou 1~ recom-binante ont ~t~ ajout~ ~ de~ puit~ ~e plaque~ ~e ~icro-titr~tion re~tus de l'un de~ ~m. ~u bout d'un~ heure d~
r~a~tlon ~ }a temp~rature ambiante ~ou8 aglta~ion, 100 ~1 d'une solution 10 ~g/ml d'un au~re Acm marqu~ bio-tine, ont ~t~ ajout~s. Apr~ une nouv~lle p~riode de 3 heures de r~a~tion ~ la temp~ra~u~e ambian~e QOu~ agita-tion, les plaques on~ ~k~ goigneusement l~r~es~ L~ pr~-35 ~ence ~ven~elle d~ ant~Coxps marqu~S ~ la biotine ~ux laphase 50~ a ~t~ en5uite r~v~l~e p~r addition d~ un m~lange d'avidine ~ d'~ChE biotinyl~. Une fixation non sp~cifique d'AChE sur la pha~e solid~ a bt~ ~valu~e dans de~ exp~rienees t~moins au cour~ de~quelles 100 ~l de tampon ont remplac~ l'interleukine-l. Lorsque l'on obtenu une flxation slmultanée des Acm ~mo~ s~s sur la phase solide et d~s ACM m~rqu~s ~ la biotine, il s~s~
d~ve10ppb Une for~e cou~ eur jaune aprbs ad~ition du r~ac-tif d'ELLMAN, 7 E5SAI~ IMMUNOENZY~ATIQuES ~ DET~T~N DE L~IL-l~ ST
DE L'IL~1~
Deux ~ypes dif$~rents d'~I~ pour les interleu-kines-1a et 1~ ont ~t~ d~velopp~s.
Des anticorps mono~lonaux provenant ~e s~rna-geants ~e culture ou de fluides ascitiqu~s ont to~t d'abord ~té test~s dans un lmmuno-essai par ~omp~ition en utili~ant des coniugu~s IL-l-AChE comme traceurs. ~ans une ~euxi~me ~tape, ont ~t~ d~velopp~s ~e~ essais immunombtrlque.s impllquant l'utilisation s~multan~e d'Aem anti-interleuklnes, soit rev~tant une phas~ ~olide, soit ma~qu~s par do l~AChE. Tou~ le~ r~ac~ifs ~tilis~s dans l'immuno-e~sai on~ ét~ dilu~s dan~ le tampon EIA ~on~
a ~té question plus haut, dont la composition est ~a sui~
vante : phosphate 0,1 M, p~ 7,6, contenant 0,4 M NaCl, 10-3 M ~DTA, ~,1 % BS~ et 0~01 ~ azide ~e sodium. Toutes les con~entrations mentionn~es dang le~ immuno-essais se r~f~rent ~ la concentration des r~actifs dans le "volume initial~ (S0 ~1 pour l'es~i par comp~tition, 100 ~1 pour 1' e8S~i immunombtrique) avant m~lan~e ave~ les autres r~acti~.
- Immuno-e~3al4 par compbt~lon utili~ant des conjugu~
AChE.
~ es immuno-essais par compbt~tion cl~siques util~sant des Acm comme premier8 anticorps ~t des conju-gu~s IL~ Ch~ comme traceur~, ant ~t~ r~alis~s comm~
d~rit dans la Littérature en relation avec les hapt~nes ou les anti~nes. Ces essa~s ont ~t~ r~lis~s dans des ~4'~3.35 plaques de microtitration ~omport~nt 96 puits, re~tues d'un second anticorps const1tub par des IgG de lapi~
anti-souris. Ce second anticorp3 en phase solide a~ure une sbpara~ion entre le~ fr~ction~ liée~ et le~ ~rac~io~
libres du traceur pendant le cours de l'immunorbac~ion ~p~cifique. Le volume total de la réac~ion ~tait ~e 15~ ~1, chaque composant ttraceur, Acm et IL-l recom}~l-nante) a ~t~ ajouté en un volume de 50 ~1. Les conjugu~s II,-l-AChE ont ~t~ utilisés à une concenl~rat~ on tie 1 unit~
~LLMAN/ml. Les dilu~ions de travail dQs Acm ont ét~
d~termin~es au prbalable en r~ali~ant de~ courbes de dilution d~ anticorps ~ partir ~e ~urnageants de culture ou de fluides ascltiques. La ~en~ibilit~ ~as test~ a ~t~
caract~ris~e par la dose d'IL-l soit qui induit une dimi-1~ nution de 50 ~ de la fixation observ~e en l'absence decompétiteur ~B/Bo - 50 ~), soit qui indui~ une diminution statistlquement si~nificative de la ~ixation ob~ervbe en l'absence de comp~t~t~ur (~oJ, ~oit Bo-~ dé~iatlon~ s~an-d~rd ~taux de confian~e 99 ~.
- ~8~ uno~tr1quos utll~ant d~ ~onju~u~ ~am-A~h~.
Pes es~ais immunom~tri~ue~ ont bt~ r~alis~s dan~ des plaques de micro~1tration comportant 96 puit~, rev~tues de l'un des anticorp~ monoclonaux. Le x~v8te~ent a bt~ rbalis~ exactement comme d~cxi~ plus haut pour le second anticorps en phase solide. En bref, les pui~s des plaques ds microtitxation ont ~tb rempli~ de 200 ~1 d'une solution ~ 10 ~g/ml d'Acm dissou~ ~ans du tampon phosphate 5 x 10-~M, p~ 7,4. Apr~s avoir laiss~ la r~ae-t~on se produira pen~an~ une nuit ~ la ~emp~rature am-biante, les plaques ont ~t~ Boigneuse~ent lav~s 2~ec ~u tampon phosphate 1o-2, p~ 7,q contenant ~u TWEEN 20, 0,05 ~. La phase solide a alors ~t~ ~a~ur~e en aioutant dan~ chaque puits 300 ~1 de tampon EIA pendant a~ moins 4 heures ~ la te~pérature ambiante. Les plaqu~s ont ~t~
conserv~s ~ 4- C dan~ ce tampon de ~akuxa~ion ju8qu' ~ ee :
~0~ 33~r~,~
~u'elles soient utilis~es, L~r~qu'elles ont &t~ conser-v~es dan~ ces condi~ions, il n'a pas ~ obs~rv~ de mo~
ficatlvns de leurs propri~t~s ~e fix~tion pendant ~u moins une p~riode ~e quatre mois. ~es essais immunom~-~r~ques ont ~t~ r~alis~s en utili~nt deux proce~qus d~f-~&rents.
Le premier pro~ocole ~d~nomm~ "Protocole slmultan~") a eonsist~ ~ a~ou~er 100 ~1 d'ln~er~eukine-l en ~olution (introduite ~ous la ~orme ~'un stan~r~
recombin~nt ou d'un ~chantillon) d~ns des pui-ts ~e plaques de ml~rotitration, eon~oint0ment avec 100 ~1 de conjugu~s Acm-AChE ~ha~ituellem~nt ~ une ~oncen~ratlon de 10 uni~s ~LLMAN/ml). ~ans cette m~thode~ les de~x ~nti-corps ~l'antlcorps en phase solide e~ nticorp~ m~rqu~
par l'AChE) r~agissent simultanbment ~veo l'in~erl~ukine-1, Selon la n~tur~ ~e l~chan~illon ~ tester, on ~ out l~interleu~no-l recombinan~ tandar~ dan~ le ~iluan~
correspond~nt, ~'est-~-dire du milieu de cu.lture, du plasma ou du S~Xum. Dàns toute la mesure du posslble, ~ous les diluants u~ s~s doivent ~tre d~pourvus d'in~erleukine-la ou 1~. Pour le plas~a ou le ~ruml ceci est possible en s~lectionnant le~ fluides in~ividuel~
pour lesquels les test~ im~unom~triq~es ne pour~a~en~ pas détecter de quan~itbs signifi~ati~ss ~' IL-la ou d'~L~
~orsque le~ EI~ ~ont r~al~3 dan~ ces milie~x, on ut~-lis~ de l~im~unoglobuline d~ 80uris (introduito ~ ~ne dilution d~ 1/20 dans de l'as~ite d'ERLICH) ajou~e pen-dant l~immuno r~aotion poUr neutraliser les anticorps humains anti-~ouri~ pr~sen~s dan~ ce~ ~luld~. Une flxa-tion no~ sp~cif.ique a ~té évalu~e ~ans des pults s~par~da~s lesquels 100 ~1 de tampon ou d'un diluant approprié
avaient ~t~ ajoutbs ~ la pla~e de ~interleukin~-l re¢om-binante. ~ réaction a alor~ eu lieu pend~nt des p~rio~es de temps variables ~ dif~rente~ temp~ratures, ~ous ~gl-tation ou san~ ~gitation. A la ~in de cet~e ~pe~'immuno-r~a~tion, lex plaques on~ soigneus~m~nt '~
.: , ': ~
3 ~
~ 3 lav~es en utilisant un tampon }:hosphat~ Tween. Lf act:iv~té
AChE flx~e ~ la pha~3e soli~e a é~ terminée par addi.-tion de 200 ~L- de réactif d'ELL~N.
Un second protocole ~dénommé "Pr otocole s~uentiel") con~iste ~ fair~ r~agir l'in~erleukine-l et le conjugu~ Acm-AChE s~par~ment. Au cours d'une pre~i~re p~riode d'incubation, 200 ~l d'in~erleukine-l tintrodulte sous forme d'~talon ou d'~hantillon) di~ous dans d~
~mpon EIA ou tou~ autre dlluant E~ppropri~ (milieu de culture, pl~sma,etc...) réagi~sent avec la phase solide.
A la fln de ce~te premi~re in~ub~tion, les p~a~ues sont lav~es avant d'ajouter Z00 ~1 de conjugu~ AGm-A~hE ~habi-tuellement ~ 10 unit~s ~LLMANN~mll disso~s dans du ~ampon EIA. Apr~s une seconde p~rio~e de r~action, les plaques sont la~es ~ nouveau et l'activi~ ~ChE est r~v~l~e comme d~crlt plus haut.
~ es "proflls d'impr~cision" ds cour~es stan-clard ont ~t~ ~tablis en r~ali~nt toutes le~ mesure9 ~flxatlon non sp~cifique au~si b~en que mesures stan~
dards) ~ huit reprise~. Pour ~haque dose, la pr~aision a et~ exprlmee en 'cermes de coef~icient de ~rariation ~C:V 96~
et a ~t~ mise sous forme de courbe en fonction ~u lo~a-rithme de la dose.
La s~nsibili~ des e~3~i~ immunom~ri~ues a ét~ caractéris~e pa~ leur "con~entration d&te~table mini-~um" (M~C) ~ui correspond ~ la ~oncentra~ion ~ pro-duisant une augmentation statlst~quemen~ sign~ a~lve de la ~ixation observ~e en l~a~en~e dlIL-l r~mbinant~
standard. L~ MDC a ~t~ calcul~e comme ~tant l~ ~ose d'IL-1 qui correspond ~ la ~ixatlon non spéci~iqu~ + 3 dévia-tions ~tandard ~a~ec un taux ~e ~onfiance de 8 . TESTS . E'PI,~
Une substan~e immuno-r~ctive d~t0ct~e p~r des ess~is immunom~triques dans ~es milieux biologiquas Isurn~geant de ~ulture, pl~sma) a b~ ra~e~i~~e en Z~ 3 5 .
~ 4 fractionnant les ~chantillon~ par chromatoyraphie sur tamis mol~culaire ~ l'alde ~'un ~quipement FP~C et d'une colonne de Supe~ose 12 ~quilibr~e par du tampon ~A. On a inject~ de l'IL-l rec~mbinant~ b~lon et des ~chantillon~
sous un volume de ~00 ~1 et ~ un d~blt ~e 24 ml/heure puis on a collect~ des fr~ctions de O~ ml. A la fin ~e la chromatographie, on a test~ 100 ~Ll de chacune d~s frac~ions en met~an~ en oeuvre le test IL-1~ e~lou IL-1 comme d~crit plus haut.
9. PREP~ ON D'ECHANTILLONS ~ESTI~ES A ~TRE $~UMIS A
D~S EIA PQ~R LA DETECTIQ~ D/I~ T D'IL-l~
- Surnageant~ de cellules elutri~es.
De~ leucocy~es mononucl~aires (lymphocytes et monocytes) et polymorphonucl~airefi ~neutrophiles3 de sang p~riph~xique ont et~ obtenus par centrl~ugation sur du FICOLLPAQ~ ~P~ARMACIA ~NE CHEMI~ALS) Q~ ont ~t~ e~uite soumis ~ ~ne ~lutriatlon ~entrifug~ ~ con~re-courant pour p~rme~tFe l'ob~en~lon ~e lymphocytes, de monocyte~ et de neu~rop~lles purs. Pou~ ~e fair~, on a ~nject~ ~es ~el-lule~ monon~lba~res ou polymorphonucl~ires dans unechambre de s~paratlon d~un rotor ~lutriateur de BE~KMAN
~J~-6), ~ un d~bit da 8 ou 20 ml/minu~e respectivemen~, ~
une vites~e cons~an~e du rotor de 2 500 tour~Jminute. Le tampon d'~lutriation ~tait Co~stitué p~r une solution satur~e de PBS de Dulbecco suppl~mentée par 0,25 ~ de BSA
et 2mM d'EDTA. Les plaquettes ont ~t~ lav~es apr~s une demi-h~ure ~'~lutriation, a~ d~it d'lnjec~on. Le frac-tionn~ment de leuco~y~e8 ~ononu~l~aires a ét~ r~alis~
comme ~U1~ : des lymphocyt~g purS ont ~t~ obtenus en aug-mentant le déb~ de ~ ~ ~0 ml~min. ~0 ml de milieu ontbt~ colle~s ~ chaque ~tape, centri~ug~s ~350 x ~, 10 min,) ~t 1~ culo~ de cellules a ~t~ la~ une fo~ ns une ~o}ution iso~on~ue et finalement remi~ en ~u~pen~ion dans le ~ilieu d'lncubation ~PMI 1~40 avec de la ~-~lu-3S tamine, 7,5 ~ de s~rum bo~in foe~al et pen~r~p). ~esfractions de lymphocytes pur~ ~monoc~teS, < 0,~ ~) ou des ~ [)0~ ~93~ :~
.
. 25 fractions de monoeytes e~richis ~lymphocytes, c ~0%) on~
~t~ collect~es et ajust~es ~ 10 x 1o6 ou 1 x 1o6 cellules~ml, respectivement. Les neutrophiles ont ~ dé-barrass~s de monocytes contaminants en augmen~ant le d~bit de 20 ~ 25 mllmin en utilisant des paliers d¢
0,25 ml/~in et en collectant des fractions de 5 ml. Des neutrophiles purs ont alors ~t~ collectks en une fraction unique en arr~tant ~e rotor. La ~raction de neutrop~ s a ~t~ lavée une fois dans une solu~;ion isoton~que et finalement remise en suspension dans le mi~ieu d'incubation ~ 20 x 1o6 ~ellules/ml. Des incubations on~
été t~alis~es dans des tubes de culture en propyl~ne ~e 1~ x 75 m~ ~ 37- C, dans une atmosph~re humi~ifl~e c~nte~
nant 5 % de C02. Des comp~ages de ~ellules ~iff~rentiels de leueocytes ont ~té r~alises par ~
1~ cytom~tr~e en flux en utilisant des caract~ris~iques de dispersion de lumi~re ~ angle aigu et à angle drolt, 2) par coloration non spéci~lque ~ l'estéras~-~0 et au colorant de W~IG~T, 3~ par immunofluorescence a~ec des anticorpsmonoclonaux conjugu~s ~ la fluo~escéine et 4) p~r analyse au microscope en con~ras~e de phases, pour la contamin~tion des plaquettes.
~ a ~iabilité des ~ellules a ét~ ~tablie en routine ~ l'aide du ~est d'exclusion au ~leu trypan dans chaque exp~rience e~ a ~t~ sup~rieure ~ 95 ~. Des cel-lules ont ~b cultivée.s auSSi bien en l'absen~e ~u'en pr~ence de 5 ~g/ml de l~popolysa~eharlde tLPS) t les cultures cellula~res ont ét~ réalisées en présen~e de 0,1 ~m d'indom~thacine. A différen~s ln~ervalles de temps, le~ milieux de cu~ure ont ~té c:entrifugés (600 x g, 10 ", 4 ~ C~ e~ immédiatement congel~s ~ - 20 ~ C jusqu' à
1~ mesure de 1~ IL-l~X e~ ~e 1' IL-1,8 en utilisan~ ~es E~A
35 sélectif~.
~(3~ 33'3 EX$M2~ 2 ~ t~r~ ion d/a~t~co~p~ monoclo~ux anti-I~-l et r~al~t~on ~'e~al~ ~muno~4trlqu~s Pour chaque interleukine, la ~ouris ~Ont le s~rum pr~sentait le titre le plu~ ~lev~ ~ans les essais immunoenzymatiques, a ~t~ ~lectionn~e pour 1~ fusion.
Les cellules de rate correspond~n~es ont ~t~ ~usionn~es avec des cellules de myélom~ de NSl comme d~crit plu$
hau~. Une semaine aprbs la fuslon~ en~i~on 500 pui.t~ pr~-sentaient des hybridomes qui ~e multipliaient ~ctivement pour les deux interleukines. La p~SenCQ ~nticorps de souris anti-lnterleukine a ~té ~riflee d~llg tous l~s surnageants de culture en te~t~nt leur c~pacl~ ~ fixer le conjugue correspondant IL-l-ACh~. D~n~ un cr:iblag~
primaire, 90 et 116 surnagean~s de cul~u~e ~ortement po-sitifs ont ~té d~tect~s respec~ ent pour l'IL-l~ et l'IL-l~. Le~ hybrldomes coxre~pond~nts ont ~té ~ous-clo-nés par des dilution~ limitan~ pour obtenir une llgn~e cellulaire secr~tant des anti~orps, stable, unique pour chaque cul~ure. ~lnalement~ 36 Ct 11 llgnees cellulaire~
Z0 ont ~t~ s~abilis~s respe~tivement pour 1' X~-la et 1~ IL-1~. Tous les clones ont ~t~ c~ract~ri~s par un nombre préc~d~ par la lettre a ou ~ selon l'interleukine contre laquelle il6 avaient ~t~ dirig~s. Il~ ont ~t~ ~ultivés en t~nt que tumeurs ascitique~ et leR anticorp3 monoclonaux ont ~t~ purifi~s ~ pa~tir de flulde a~itique par pr~ci-pitation par de l'acide ~prylique et du sulfate d'ammonium. Les isotypes ont ~ d~ermin~ ~ partir du flu~de a~citique par 1~ technique de double di~~u~ion d'O~CHTER~ONY~ Tous le~ Acm btalent des I~G poss~dant une cha~ne l~g~re ~, la sou~-clas~e IgG1 ~ant de loin la plus commune ~Cf, Tableaux ~ et II ~i-apr~s).
_ ~ ~ . . , _ , , 4~3~;
~7 TABLEAU I: RESULTATS I)~ TESTS DE COMPATIE~I-~ITE D~ F~XATION POUR LES ANTIt~ORPS MONOCLONAUX ANTI IL~
lce,.
ACM MA~QU~S ~ :
Z~1 ~S7 2~5 ~ 3 1~3 1~8 1?5 177 1~S 0Q8 ~i 137 )~7 1~ 23~ 268 48 ~0 7~ 82 1~7 1;!4 :
~ ~9 ~5 73 10~ 18 zz 30 3~ 34 ~ 1~1 _~ , ~ . ~ _ ~ ,~, ' .
37 5 ~ O O e~ ~
~7 2~ . .. _ _ ~ O ~ O ~ ~ ~ O 3~ ~
~4 35 _ _ _ _ ~ ~ ~ A ~ :
lS ~30 ?3 _ _ _ ~ _ ~ ~ ._ .
~e ~o ~ o ~ ~ ~
~!31 153 1 O ~ ~ 3:
2C7 1 S!l 5B 22 ~ O ~ ~ ~ ~ ~ :~
2'rs 176 71 30 ~ . _ _ _ _ _ ~ B- c~ ~
177 0Z 3~ ~ O
31~ t~S 117 ~ O ~ ~ O 9 _ _ , _ _ _ O
251~6 12~ 44 ~ O _ _ _ _ _ _._ _ ~_ _ ~ ~ ~ ~ ~ O ~ ~ ........... C
_ ~.~ ~__ ~: ~ : .i ~es ~cest~ de compat~bllité de ~ix~Sion ont été
3~r~alisés comme cl~crit plus haut dans 1' exen~ple 1. Les cercles plein~ indi.quent de~ ~ouples pour le~quels on a observé une fixation simult~nbe des Acm immobillg~s en ~-phase solide et des ~cm marqu~s. ~our clarifier la pr~3-sent~tion, las ~cm pr~sentant la m~me ~finition ont ~té
35group~s en trois cat~orles ~A ~ C). . :
.
, ,:
: , :
, ~o~
Tous les Acm sont de la sous-classe X~G1 Sau~
l'~cm lOO (groupe ~) et les Acm 50 e~ 176 (~roupe B) qui sont des IgG2.
TABLEAU II: E~SULTATS D~S TES1~S D~ COMP~1~IBI-5 LI~E D~ ~IXATION POUR LES ANTICOE~PS MONO~LONAUX ANTI JT,-1 ,~, i~
ACM ~RQUES
1 Q 29 20 ~4 79 ~6 6 l 7~ ~? ~ 26 ~
~ ~ _ _ ~ __~__ _ L ~
2~ _ _ ~ O ~ .. ~o6J
2~ ~ ~ ~ ~ ~ _ _) ~ _ l~
,~4 ~ ~ ~ . .
~g ~ ~ ~ ~ ~ _ _ l~
__ __~___ _--~ r ~6 ~ ~ ~ r.

6~ ~ ~ O ~ ~ ~ ..
7D ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~PB1 !~
2 0 ~ .- . __ _.__ __ ___

7 _ ~ ~ - _ _ _ 1 Z? ~ * _ _ ~ ~ _ _ IgBZ~
__ ____ .-_ _~ _ __ O
~ ~ _ _ . _ ~ _ _ _ _ 1~ D ~, S~ , ~ ~ ~ ~ 1~61 r~
2~ _ ___ _ __ _ _ __ A B C D
Les 'cest6 de compat~llt~ de fixation ont été
r~al~s~ comme décrit: plu5 hau~ dan~ l' ex~mple 1 ~ Les 3~ cercles pleins lndiquent d~s couples pour lesquels on ~
observ~ une ~ixat~ on simultan~e des Acm iTnmobilis~s ~n phase solide et des Acm mar~. Pour clarifier la pré-sentation, le5 Acm pr~sentan~ le m~me type de fi xat:ion ont ~té S~roup~s en qu~tre c~bgorles ~A ~ D). L~ 50~
35 classe ~' ~g~ de chaque Acm est mentionn~e dans ~a der-ni~re colonn~, . ~ , :
.. . . .
. . :
.
, . . ~. ~ ; , . ..
2~935 . .
2~ .
Des surnageants de cultur~ aussi bien que cle~fluides asci'ciques ont ~t~ utllis~s dans des e~is immu noenzymatiques par c:omp~tl~ion impliquant de~ cc)niugu~s IL-1-AChE comme traceur~;. Dans la pllupar~, de~ cas (~auf 5 en ee qul con~erne le~ clones ~26 ~t ,~54), ~es courbes stan~ard ont pu ~tre établie~ en lltilisant 1' IL~ et 1' IL-l,B recom~inantes c:omme étalons. Lor~u'elle est définie en termes de s~s0 w 50 ~6, la ~en~ibllité de ces e~sais est comprise entre 4 et 10~ tml. I:)ans l~e~ meil-10 leurs cas, la ::oncentration minimal~ détec~able de1 ngtml a pu &tre c~lcul~e. ~ou~ le~ A~m ~e 60nt ~vérés ~tre très spéc~fiques de ltinterleukina contre laquelle ils avaient ~t~ f~iris~s car on n' a pu mesurer qu'une re-activit~ croisée ~nexlstan~e ou très fal~le entre 1 ' IL
15 et l' IL~ On trouvera ~ 'citre indi~atif dans le tableau I~I qui ~a suiv~e, les ca~act~rl~tlqubs de quelcIues-uns d~ ce9 es8a~9 par comp~titlon pour 1~IL-la~ aln~i que les rés~ltats obtenus avee des ant:l~orps pol~lonaux de mou-ton o~ de lapln.
_23~ .
, . ~ ., '.,"".
-'''':
. . . .
' ' .
I,-, , ' ,,'~ ~~ ..
.
:' ,. . .
.
2~ 3~35 TABLEAU III : PRINCIPAL~S ~ARA~T~RISTI~U~S DES
ESSAIS IMM~NOENZYM~TIQ~ES PA~ ~OMP~ITION POUR k'IL~ N
U1'~LISANT SOIT ~S ANTICORPS POLYCLONAVX SOIT DES ANTI- :
CORPS MONO~LONAUX ET DES CONJ~U~S D'IL la-AChE, _r~ . . ~ ~ .
Antlcorps ~ilution de Sensibilitb*
sp~cifique l'anticorps ~p~ci- (~/Bo-50~,ng~ml) .. ~ . ., _ _ _ . _ Antlsérum polyclonal 1/5.105 15 de mo~ton :
. . . _ . _ . . , Antis~rum poly~lonal 1/10$ 90 de lapin . . ~ _ _ _ . _ ..
15Acm 29 (surnageant) 1/4000 . ................... _ __ _. . .
Acm 260 (surnageant) ~/1000 10 , . . -- - _ . --Acm 29 20tgu~nagean~) 1/500 20 .,. . ~
Acm 185 ~ se~ 1/1000 I 0~
* B/Bo : 50 % correspond ~ la dose qui induit une diminution de 50 ~ de la f~xat;on d~ traceur o~serv~e en l'a~sence ~e comp~titeur, La pr~sente in~entlon ~ pour l'un de ses buts essentiels de dév210pper des e8~ais i~munom~triqu~s en deux ~i~es aussi bien pour l' ~L-la que pour l'~ , en sorte q~ onvient de déterminer quelLes son~ les paires d~Acm ~u~ pourr~ient ~ fix~r 3imultan~ment à
c~aque lnterleukine. Ces é~udes ~e ~ompl~en~r~t~ de fixatlon ont é~ realisées ~ l'aide de tests i~munom~-triqu~s dan~ lesquels l'un des Acm ~tait immobilisb ~ur la p~ase g~lide tandls que l~autra ~t~it mar~u~ p~r d~
mol~cules ~e biotine. A ce sta~e, le mar~uage par la bio-tine A ~t~ ~hoisi car il s'a~i~ d'une methode tout ~ falt ~ 3~
simpl~ qui permet le ma~quage d'un ~r~n~ nombre d'Acm (plus de ~0) en quelques minutes. En outre, l~util~sation subs~quente d'un m~lange d'avidln~ et d'ACh~. m~rquée par la ~iotlne permet une d~tec~lon sen~ible d'anticorps bio-tinyl~s immo~ilis~s sur la p~ase solide"
Les tableaux I et II ci~d~sus pr~enten~ les r~ultats de ces tests compl~mentaire3 pour l'~-la et l'IL-l~ respectiYement. ~ans le cas de l~ la, on voit qu~il exl~te trois groupes d'Ac~ qui reconn~i95ent des ~pitopes qui ~e trouvent dan~ troi~ r~gions di~~~rentes des ~ol~cule~ d'I~-la. Ces groupes, ~i on~ d~slgnés par ~, B et C, contiennent re~pectivement lO, 25 ~ l an-~icorps ~onoclonaux. Tous les Acm d'un gro~pe pr~senten~
une ~ixation compat~ble avec ~ous le~ Acm des deux ~utr~s groupe~, tandis ~u'ils ne ~a ~ixent pa~ ~imultan~ent entre ~ux ou avec des Acm du m~me gro~pe. Dans l~ cas de l'IL-l~, la sltuatlon e~t moin~ claira. En fa~t~ on ob-se~v~ quatre groupe~s différen~s. D~n~ les deux premiers gro~pes ~d~nomm~s ~ ~t B, contenant respec~ivemen~ 4 et 3 Acm) on observ~ un compor~emen~ logique, ~nalo~u~ ~ e~lul observ~ pour l'~L-la ~G~. Tableau II). ~e troisi~me group~ IC) con~ent deux ~cm qui sont compatibles ~nique ~ent avec un Acm des groupes A e~ B ~ 2~ et ~ 36 respec-tivemen~). Enfin, le yroupe D contien~ 2 Acm ~i ne per-metten~ l'immob~l~sation d'aucun des a~tres ~cm en ph~sesolide. Apr~s avoir d~ermlné tous le~ couples pos~ibles d'Acm pr~entant uns fixation ~ompati~le, ~l s'~git présent de s~lectionner pour chaque interleukine l~
coupl~ pr~S~ntant les proprlé~s optimales en vue de d~elopper un eSsai lmmunom~rique ~ensible, 9p~C~ ~que ~t ~iabl~ ~ett~ s~ection doit ~t~e r~lis~e en utill-sant des conjugu~s covalents ~am-AChE (e~ non de~ Acm marqu~s ~ l~ blotine) car ils permettent une d~tec~ion plus ~enslb~e de~ interleukines. ~an~ le cas de l'IL~
comme ~l n'existait que 29 pos~ibili~s diff~rentes, cekte s~lec~lon a ~t~ ~acile ~ r~ ser ~t ll a ~tb pro-32pos~ de choisir de pr~parer les 9 conjugu~s ~cm-AChE cor~
respondants, Ceci s'est av~ré ~ependan~ pl~8 di~ficile dans le cas de l'I~-la car la pr~par~tion de 36 conju~u~s Acm-AChE ~ussl ~ien que la v~ri~ication des 570 pos~sibi-lités di~f~rentes ex~t~ntes repr~sente un tr~vail consi~d~rable. C'est la raison pour laquelle il a ~t~ pro~d~
diff~remment : au cours d'une première ~t~pe, quelques con~ugués Acm-AChE ont ~ pr~par~s e~ ont ~t~ en~uite tes~s ~ontre toute8 les phases solides pertinentes. Au vu des résultats correspondants, les Acm qui ont procur~
les r~sulta~s les meilleurs ~'est ~-dire la ~ixation la plus importante ~e conjugu~s Acm-AChe pour uns dose don-n~e d'interleukine) ont ~t~ margués et on a poursuivi les tests avec eux en utilisant l~s A~m immobilis~s cor~es-pondant8. Ains~, les ~nticorps ~5, a29, al~O, al47~groupe ~ 176, a3g ~groupe B), et alOl ~groupe C) ont bt~ sucesslve~ent marqu~ et tes~és.
~e processus a Permis de m~t~re en évidence un petit nombre de coupl~s qui permetten~ un~ ~termination plus sen~ible de chaq~ 1. Pour l' IL-la, les résu1tats le~ meille~rs ont bt~ ob~enus en utilisant soit alOl ~en tan~ que phase solide ou traceur) ou ~es traceurs du ~roupe A a~e~ des phases solide3 du group~ B. Dans le cas de l'IL-l~, un couple comPo8~ de ~79 comme phase soli~e e~ de ~70-AChE comme traceur s'est avér~ ~igni~icative-ment sup~rieu~ ~ tous Les autre~ ~ouples. Une s~lec~ion finale du couple optimal a ~t~ r~lisée en tenant compt~
non seuLement de l'in~ensit~ du signal mai~ ~galoment d'au~s crit~res incluan~ l'absenc~ de réac~i~it~ croi-s~e ~vec ~'Autres in~rleukines ou des subs~ances appa~ren~es, un taux de fixati~n non spéci~ique, une in-~luen~e non sp~cifique exer~e par les milieux biolo-giques ~plasma ou s~rum~. Les ~rit~res ~e sp~cificit~ ne sont pas ess~ntiels car tou~ 1Q~ couples test~s pr~sen-tent une r~activ~t~ crois~e trbs ga~le avec le~ autre~interleukine~ ~IL-l~ ou I~ et IL-2~. Toutefois, la 9~-2~;)04~35 lection de couples pr~sentant une faible fixation nonsp~ciflque est impo~tante cax ceci ~ une influence cri-tique sur la senslbilit~ du test. De ~me, il est n~ces-saire de m~nlmi3er les effet~ non ~p~cifiques ~s aux ml-S lleux biolo~i~ues afin de renfo~cer la validit~ ~esmesures r~alis~e~ ~ans ces milleux. Enfln, les couples ~ul~n~s on~ ~t~ ~lectlonn~ 185 en pha~e solide a29-AChE po~r IL-l~ et ~79 en phase ~oli~e ~ ~70-A~hE
pour IL-l~, Dan~ le cas de l'~L-l~, ce ch~ix a ~t~ r~a-~lsb essentiellement parce qu~ ce couple est caract~rlsepar une flxation non spéci~i~u~ tr~s ~aible et est tr~s peu senslble aux e~fets non ~p~lfiques. Cette derni~re carac~bristi~ue e~t represent~e ~ la figure 1 annex~e et le ta~leau IV r~sume les prln~ipales ~aract~ris~f~ues de~
tests ~e d~tection d'I~ t d'IL~ ans le cas d'une incubation d'une nuit ~ 4- C et d'un p~o~e~su~ s~multan~.
L~s deux es~ais semblent tx~8 sensibl~s ca~ de~ con~en-t~ations mlnimal~s d~ctables in~rieures ~ 4 p~ml ont pu ~tre calcul~es pour chaque lnterleukina ~n utili~ant une p~riode de 30 minutes pou~ la mesure enzymatlque. Un~
sensibilit~ accrue est obse~v~e lorsque la r~actlQn enzy-matlque ~tape de r~v~lation) dure pl~s longtemps. En p~reil cas, de~ concentration~ minimala~ d~tectables ~ rieureS ~ 2 pg/ml pe~vent ~t~e obtenue~ . tablaau , ~ .~.3L~.~U 1~ C~CT~ STiQU~S PRI~ICI?~L~ S D~S
.~S~IS ~ UN0~~TRIQUGS POt~R L' IL-1~ ET 1.' IL~ AL~:S~S
~'~J~C DGS C0~IPLES SEL~CTr0NNFS D~ACrn, - I
SZ~SI~ILII~ S~CI~ICIm3 ~
~ . -Frac ion .~.D.C..~.D.C. .
.est non s~écifi~ue nq~m1pq/~l IL-l~ IL-l~ IL2 ~ motale ~ctivité) 30 m~ 2 h~u-es~nq/ml) rng/ml1 tng/mli _ . _ _ _ r~ C 0 . 03 3 L.5 - 2000 2000 ._ _ _ _ I~ 0.02 2 l lO0 - 5000 _ _ _ _ Les x~sultats présent~s dans C8 Table~u ont eté obtenus en utlllsant leprocessu~ ~l~ul~an~ et une reac~on d'une nult a ~ ~
.~.DC concentratlon ~lnlmale d~tect~ble ~x ~ose d'intexleuk'ne pxodulsant une ~lxation par traceur ~lgnlrlcatlve~ent dl~f~rento do la ~lxatlon non specl~l~ue.
? ~
~0~4~
.
L~volution des eourbe~ ~t~lons en fonetion du temps d~volue ~ la mesure ~nzymat~que e~t repr~nt~e la figure Z annex~e.
Cette augmentatlon de sensib11i~ est aceomp~-gn~e d'une augmentation de la pr~cision de la mesure ~ansla par~ie inf~rieure de la courbe ~talon, comme le montre la fi~ure 4 qui pr~en~e l'~volution des "pro~ils d'impr~cision" en ~onction du ~emps. Le~ meilleurs r~sul-t~ts (en termes ~e sensibil~t~) ont ~t~ obtenus en utili-sant une immuno-réaction pendant une nuit ~ ~ 4- C ; tou-tef~is, des COUr~Q8 ~talon excellentes ont ~t~ obtenu~
en utilisant des p~riodes de r~action de pluS ~ou~t~
duree ~de 3 ~ 5 heures ~ + 4-C), Dans tous les ca~, on a observ~ de~ concentrations minimales d~t~ctables inf~-rieures ~ 10 pg/ml. La r~ali~a~ion des essai~ à la temp~-L~UL~ nte ou ~ n~ a e~ ~u~una incidence sur }eurs r~sultats.
EXEMPLE 3 : Me~ure d~ t de l~ b d~n~ do~
ml~ieux de culture.
La d~term~nat~on des ~eux in~rleuklnes dans les surnageants de cultures xt~mul~es a ~ r~alis~e l'aide de courbes ~alons. Il y a lieu d'observ~r que la pr~sence de s~rum de veau foet~l 10 96 dan~ le mil'eu de ~ulture a induit une dim~nution signi~ica~ive ~e la fixa-tion non sp~ci~ique sans alt~rer la pente des ~ourbes ~alons.
Ce~ ~est~ ont r~v~l~ que les es~ais perm~tent ef~ectlvem~nt de ~k~ec~er d~s ~ub8tances immuno-r~ctives IL-1-like dans le~ surnageants de cul~ures, ll~pp~rition de cette ~mmuno-r~a~tivit~ ~tant en relation avec 1 st~mulation deg cellules. ~n exempl~ typique ast pr~sent~
la f~gure 4 annex~e dans laquelle on a ~essin~, en fonction du ~emp$, les va~iations des concentrations d'IL-la et d'IL-1~ dan~ les s~pernageants d~ leu~o~ytes elutri~s humain~ (monocyte~, lymphocytes ou nsutrophlles) stimul~s ~ar 5 ~g/ml de lipopolysaccharide.
,,~
33~
~6 . .
Pour confirmer 1~ validit~ des me~ures e~ee-tu~es, les ~mes ~chantillo~ ont ~t~ te~C~s ~ l'aide ~ .
d'un bio-essai bas~ sur 12 ~esure de la libbration de P~E~ par des fibro~lastes stlmul~s aussi bien par l'IL-l~
que par 1'IL-l~. Les courbes ~talons correspondantes son~
pr~sentbes à Ia fiqure 5 annex~e. ~es r~sult~s obtenus, repr~sent~s ~ la ~igure 6, ~onfirmen~ qualitativement les r~sultats des mesures immuno~tr~ques, ce qui d~mon~re la sp~ci~icik~ ~es immun~-essals.
~01'identité entre ~a substance d~tect~ dans les surna~eants de culture (ou les extraits intracellu-laires de ~ellules) et l'IL-l recombinan~e utills~e pour ~tablir les courbes-~talons est confirm~e par troiS ~ypes d' expérimentat ions de contrble, L~ premier es~ repr~sen~
p~r les dilutions d'~chantillons dans du milleu de cul-turel le8quelles ont donn~ ~es courbes de dilution paral-l~les aux ~ourbes-~t~lons . C' est ce que montre le ~ableau V ~i-après, qui pr~sente le~ r~sultats de deux ~if~éren~s tests rela~i~s ~ L-la et ~ 1' IL-l~, r~ali~b~ ~ diff~-20 rentes dil~tions, Des résultats ~imilaires ~nt été obte-nus avec t~us les b~-h~n'cillons testés.
TAB~EAU V : DEMONST~TION PU PARALLELISME
~NTRE LA COURBE ETALON ET ~A COURBE D~ DILU~IO~ DES
~ ECHA~SILLONS.
:
l _ ~ . ~
E;CE~ANTILLON DILU'rION ~L-l~ (pg/~nl) IL~ p~/ml) I . ~ - . ~
1/1 1~00 3 A 1/4 1760 3~4 ~0 1 J B 17 82 _ . .,_ .. _,~. ~
1~2 g40 532 1/4 892 56~
B lJB 960 S76 . _ 1/l6 99~ ~
35Les échantillons A et B on~ ~t~ dilués comrne indiqu~ dans 1~ tableau ~ ~t test~s pour y d~tecter l' II,-~O~S~35 la et l'IL-1~ par EIA. ~es dil~tions au~3i b~en que la courbe ~talon ont bt~ r~alisée~ ~an~ du milleu de ~ulture ~RPMI t 10 ~ de sérum de veau ~o~tal). ;Le~ ~onn~e~ ~r~tes ont ~té multipli~es par le ~actaur de dilution a~n~
S d'~tre ~num~r~es ~ans le Tableau, a~in ~e ~air~ appa-ra~tre clairement le parall~lisme entre la courbe-~t~len et les ~ourbes ~e dilution das ~chanti~lons.
Echantillon A: 8urna~eant de macrop~ages al-v~olaires dans une culture s~imul~e par ~NFa.
E~hantillon B : extrait intracellulaire de macrophages ~lv~olaires en cultur~.
CoO x~c~ult~ltn oo~ ~yJ~ tb~ ,v~rlLII~
exp~riences de r~cup~ration qui démontrent que des quan~ltks connues ~'IL-l recombinante in~roduites dans des ~chan~illon~ peuvent ~t~e eff~ctivement mesur~e~.
Pendant la totalit~ de~ exp~rimentations r~ali&ées dans des milieux de culture, l~ taux de récup~ratio.n ~ta~t compris entre 8~ ~ et 93 ~.
La trolsième exp~rimentation ~ oonsist~ en ltana~y~ ~P .s~lrna~an~ de o~lturo ~prbD fr~c~lon~ n~
par ~hrom~tographie 8Ur tamis mol~culaire J cet~e analyse montre que la ~ubstance immuno-~éaotivQ est ~lu~ ~ous la ~orme d'~n pic unique homog~ne, comme d~j~ indiqu~ plus haut, qul ~orrespond exa~tement au pi~ ob~erv~ ave~ les interleukines recombinantes. C'est ce que montre la figure 7 o~ sont p~sent~s di~ren~s p~ofil~ chromato-graphlqu~s obtenus pour des ~urna~eants de ma~ropha~es ul~ol~ L~S 6~ tU~ #U~ len d~ns le ~est ~e ~tec-t~on ~e l'IL-la qu~ dans le test de d~tect~on de l/IL~
Des ~sultats similaires ont bt~ ob~Qrv~ avec d'au~res ~urnagea~ts de cultur~ ou a~ec ~es extraits in~racellu-l~ires. Pxises dans leur ensemble, ~outes ces ~onn~es indiquent nettement que les ~eux te~t~ permettent effec-tivement une d~t~rmination quantita~ive de~ interleukines 1 dans ees milieux~
20~3S

EX~MP~E 4 : Me~ur~ d~ l'IL-la et dQ l'IL~ le plasma et le s~rum.
En utilisant ce~ ~IA sp~cifiques, d~ test~ de d~termination des taux d~ a et d'I~ dans le plasma S ou le s~ru~ de donneurs ~ain~ ou de pa~ient~ ~ou~fr~nt de troubles rhumatoides, ont ~te r~lis~s. Ces mesures ont u~e~, comme ln~lque plu~ ~aut, en pr~sencs d'IgG de souris afin de neutr~liser les anticorps IgG
humains anti-souris ~ventuellement pr~sen~s dans ees 1~ fluides. Cette pr~caution est tout ~ falt n~cessaire ~ar d'autre~ exp~rimentations ont mon~r~ que les me~res r~a-lis~es en l~ab~ence d'IgG murine3 pourrai~nt conduire une surestimation impor~anto des taux d~IL~ p~ciale-ment dans les fluides de pa~ient~ atteints de ~roubles rhumatoïdes.
Pes ~es~.s réalisés dans le plaqma ou le sérum de volontalres sains ont rev~l~ qu'il est pos~ble ~e s~lectionner dcs flui~es ne con~enan~ pas de quantités d~tectables d'IL-1~ ou d'IL-l~. Ces plasmas ou ~es s~rums r~unis peuvent ~tre utilis~s comme diluants pour ~tablir des courbe~-~talon~ appr~pri~es. L'~tablissement de cès courbes a permis ~e me~urer les taux d'~L-1 ~ans ces fluldes et da d~tecter des concsntration~ d'interleukines comprises entre 5 pg/ml et quelques ng~ml aus~1 bien che~
des donneurs appare~ment sains que ch~ d~s patient~.
Bien que les résultat8 repré~entés A la figure 6 qui don-nent un pro~il typique obtenu avec un plasma ne soient pas satisf~isants puisque la sub~ance immuno-réactive est ~lu~e ~ un poids mo~culair~ ~e beaucoup supérieur à
30 celui qui correspond ~ 1' IL-l recombinante (~ 500 000) néanmoln~, ces tests de d~t~rmin~tion ~es IL-l convien-nent éqalement ~ux dosages dan~ la plasma e~ 1~3 s~rum.
:
.
~3 5 ~ MoeLE 5 : Act~vl~ ~nhi~it~e exe~c~e ~ar le~
anticorp~ con~or~es ~ v~nt~o~ gard d~ l~a~tivit6 ~iolo~ique de ltI~-1 (ac~ t~ n~t~alisant~).
L'acti~lt~ inh~bitric~ exercée par l~s anti~
S eorps monoclonaux anti-lL-1 conformes ~ l'invention, l'~gard~de l'activit~ biolog~que ~e l'IL~1, a ~t~ mise en e~idence ~ l'aide de deux série~ de tests .
1. Les tests d'inhibition ~e l'induction du r~cepte~r de l'~L-2.
De tels tests ont ~té d~rits notamment par KAYE et al., JOU~NAL OF IM~uNOLo~y ~1984) ~ L~, N- 3, pages 133~-1345.
- Principe :
~ es cellules de JURXAT, p~r exemple, ~Li~n~e cellulaire issue d'un lymphome T humain) s~r~tent de l'IL-2 ~uand elles sont stimuléées par de l'~L-l~ ou de l'IL-l~ en pr~sence de phytoh~magglutine ~PHA) ~ Cer~ains ~ntlcorps anti-IL-la ou anti-IL-l,B .~ont capable~
d'inhiber l'e~et des lL-1 soit p~rce q~
2~ reconnaissent le ~ite impliqu~ dans la liaison a~ec le r~c~pteur ~oit parce que la formation ~u complexe IL-l-~nticorps perturbe le processus biologique.
- Proc~dure exp~rimentale :
Les anticorps anti-IL-l~ ou ~ confornles ~
l'invention ~10 ~gj~l) sont in~u~ en pr~sence d'IL-la ou ~'IL-lp ~10 ng/ml) pendant lB heures ~ 4'C. Un contrôle est ~ffectué en lncubant dans les même~
con~itions de l'IL-la ou de l'IL-1~ llO n~/ml) s~ns antlcorp$.
on stimule ensuite les cellu~es JUR~AT
(5.105 cel~ules/ml) en présence ~e PHA (0,8 ~g/ml), pa~
les di~f~rentes pr~para~ons ci-dess~s pendant 24 h 37 ~ sous 5 % C0~. Dans l~s condi~ions des exp~r.iences, l~ concentration des IL-1 au moment de la stimulation est de 1 ng/ml~ ~a concentrat~on de l'IL-~ d~ns les surn~eants de culture cellulaire es~ mesur~e ~ ide.
.
:: :
. ~ , . ~ , .. ,.... ~ , .
93~
~ o d' un dosage immunom~trique mis au point ~ la SPI don~ le principe e~t identlque ~. ceux :levelopp~s po~r les IL-1.
Les ré~ultats ~ont exprim~ en pour~enta~e d' inhibltion par rappor~c à de~lx t~moin~, l' un est réalis~ ;
5 en absence d' IL-1 (PHA s~-ll) et repr~erlte le 100 9 d'inhibition, l'autre est r~ali~ en ~sence d'~n~icorp~ ':
et repr~sente le ~ ~ d'inhibition.
- Résul'cat:
ANTIcORPS MONOCLONAUX INHIBITION
~NT~-IL-1~ ~
.. _ _ ..
29 100 ::

2~ 31 ~67 . 1~~
~__ ,, .._ _.
AN'rI~ORPS MONOCLONAUlX I~IIBITION
ANTI - IL-l~ ~6 P) 60 15 2Z ~

_ _ .~ . _ 2. Les tests ~'inhibition de la liai~on ~es IL-l aux r~cepteur~ cellul~ires~ notamment aux cellules T.
Des teS~s de ce type ~ont d~crits, no~mment, 0~33 - LOW~NTHAt. ~ . F.XP. ~5ED. ~ 6~, 1~, p~ge 10G0, - S~CKINGER et al., TH~ JOVRNAL ~F IMMUNOLOGY ~19~7), 5 ~, pa~es 154 6-1549, - Princlpe: i 1.' IL-1~ ag~t sur des cellules par - l'intermédiaire d'un réc~pteur membranaire avec lequel 11 se lie sp~cifiquement. On ~peu~~ ~tu~ler la liai30n ~e ~ ¦
10 1' IL-la marqu~e ~ 1' iode 125. L~ anticorp~ monoclonau2s peuYent inhiber la liaison ~e 1' IL-la aux r~epteurs s' ils reconnaiss~nt la partle de la m~ cule impllquee dans le complexe. E;n inhlbant la liaison a~vec le réceptour ilo inhibent aussi l'ef~et b~ologl~ue.
1$ - Protocol~ exp~rimental:
L' IIJ-1 mar~u~e ~ ode 125 est ~ncub~ pend~nt une heure ~ 4 ' C avec les ant~Co~ps ~ une concen~:rat~on de 200 nglm~. A la f~n de la r~aCtion~ le m~lange est mi~ au contact des cellul~ El4 tlign~e cellulaire d~ Tnymome 20 m~rin) pen~ant 8 heures ~ ~ 4~C, ~ es cellules sont ensulte la~ es a~ec un tampon approprl~ et la radioactl~.rit~ ~ XéB est mesur~e avec un compteur ~ E~cint~llation 801ide ~multiqr~mma LXB). Les r~sultatg ~o~c expr~m~8 en pourcen~age 2S ~ inhibi~cior~ par rappor~ i3 un t~moin (100 % da l~aison) pour lecIuel 1' IL-la ma~Iu~e ~ 1~ lode 12~ n' ~ pas bt~
incubé avec un an~icorp~
., . .~. .
.
:
:
O C3~ 3 - R~sultats _ ANTIGORPS MONOCLONAUXINHIBITION
ANTI IL~la ~ % ) 5 5 6~

3~ 65 GROUPE A 7 3 ~3 184 g5 . ..

33 2~

~4 21 G~OUPE B 12 ~ . 2 8 176 ~0 1~6 0 ~q~ ilg ~ ' ,, -- . , ., _ .-- -%E~a 6 ~ en ~vld~n~e de la s~lbl~ dos ~ntiaorps ~ono~lo~ux con~orm~ nv~n~ion; ~ai~ 0 ~:ompar~if avec des te~ts s~ ant les ~ntiC!orp8 dl~
ant6r~e~r.
L' Exemple ~ de8sus, mon~r~ que dans les réactions optinlales des tests c:on~ormes ~ 1' invention, .. : . , . .
. . .
20~ 3 les concentrations minimal~s d~tec~ables sont inf~rieures p~/ml (volr en particulier le Tableau IV~.
~ Dosage par comp~tition : comparaison avec le test AMERSHAM de dosage de l'IL~
Comme pr~cisb dans l'exemple 1, l~ sensibil~t~
des tes~s a ~ caract~riS~e par la close df~-1 qui induit une diminution statisti~uement signiflcatlve da l~
fixation observbe en l'absenc~ ~e ~omp~t:Lte~r ~BQ), ~Oi~
Bo-3 dbviations sta~dard ~t~ux de confianc.e 99 %).
Un essa~ a ét~ r~alisé dans les cor~itions définies par AM~RSHAM ~ (dosage radioimmunologi~u~ la marqu~e ~ o~e 125) : on obtient la co~rbe co~e visible ~ la flgure 8, qui comprend en a~s~isse les concentra~ions d'IL-la en pg/ml et en ordonn~e, B/Bo en %
et qui montre que la limi~e de détectlon est de l'ordre de 80 pg/ml. ~eci correspond donc ~ une sensibilité
nettement inf~rieure ~ celle de~ tests con~ormes ~
l'invention, comme pr~cis~ ci dessu~.
2. Es8a~ immunométrique : comparaison ~vec l~
tes~ ME~GENIX.
Un ~ssai a ~ r~ali~ dans les con~lti~ns dé~inies par MEDG~NIX (do~age immunoradiométrique :
anticorps anti-IL-lg m~rqu~ à l~iode 125) : on obtient la courbe comme ~i~ible ~ la figure 9, qui comp~end en abscisse les concentrations en IL-1~ en pq~l et en ordonné~ la radloactivité li~e ~en ~pm) st qu.i m~ntre ~ue la limite de d~tection est de l'ordre de 15 pg/ml. Comme pr~cis~ ~ans l'Exemple 1, la sensibllité des test~
i~munombtrique~ est calculee comme étant la dose d'IL-1, qui correspond ~ la fixation non spécifi~ue + 3 d~viations standard (~vec un t~ux de c~nfianGe de ~9 ~).
CeGi cor~espond donc ~ une g~nsibili~ nettement inf~ri~ure ~ celle des tests ~on~ormes ~ l'in~ention, comme pr~cis~ ci-dessus, qui ~t ~e l~rdre ~e 2 pg/ml~
Ces deux tests montrent bien que les anti~orps monoclonaux con~ormes ~ l'inventi~n q~i pr~s~n~an~ une .
3r~ 3 constan~e de dissociation in~brieures ~ 5 10-1~
perme~tent de manière ina~endue d' accrol~r~ la sensib~ lité des tests de dosage dan~ lesquels ils sont, mis en oe-~vre.
, . . .
'

Claims (13)

LES REALISATIONS DE L'INVENTION AU SUJET DESQUELLES UN DROIT
EXCLUSIF DE PROPRIETE OU DE PRIVILEGE EST REVENDIQUE, SONT
DEFINIES COMME SUIT :

1. - Anticorps monoclonaux spécifiques des IL-1.alpha. et 1.beta., qui résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de rongeurs, et plus particulièrement de sou-ris, par les IL-1.alpha. ou -1.beta. selon le cas, qui reconnaissent spécifiquement les IL-1.alpha. naturelles ou recombinantes ou les IL-1.beta. naturelles ou recombinantes qui ne présentent pratiquement pas de réaction croisée entre les deux IL-1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux ont une constante de dissociation inférieure à 5.10-10, en ce qu'il se composent de plusieurs groupes qui reconnaissent des régions distinctes des IL-1.alpha. ou -1.beta. et dont les anticorps de certains groupes sont aptes à se lier de façon compatible avec tous les anticorps des autres groupes, à savoir :
- les anticorps anti-IL-1.alpha. se composent de trois groupes (A, B et C) qui reconnaissent trois régions distinctes de l'interleukine-1.alpha., tous les anticorps d'un groupe étant aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes mais n'étant pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe ;
- les anticorps anti-IL-I.beta. se composent de quatre groupes dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des anticorps anti-IL-1.alpha., dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompa-tibles avec l'un quelconque des anticorps des trois pre-miers groupes, et ne se lient pas à l'IL-1.beta. native recom-binante, reconnaissent une interleukine-1.beta. modifiée, et réagissent avec un conjugué IL-1.beta.-AChE ;
et en ce que lesdits anticorps anti-IL-1.alpha. et anti-IL-1.beta.
reconnaissent les conjugués IL-1.alpha. ou 1.beta./acétyl-cholinestérase (AChE),

2.- Conjugués d'acétylcholinestérase et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. ou -1.beta. ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'.

3.- Procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1.alpha. ou -1.beta.
selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F(ab')2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis en ce que ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié
tel, notamment, que la .beta.-mercaptoéthylamine (.beta.MEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire,

4.- Procédé de production de conjugués d'AChE
et d'anticorps monoclonaux entiers anti-IL-1.alpha. ou anti-IL-1.beta. et de conjugués d'AChE et de fragments d'anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. ou anti-IL-1.beta., notamment de frag-ments Fab' selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturellement présent dans l'un des fragments, est couplé à au moins un groupe maléimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-hydroxy-succinimide.

5.- Test immunoenzymatique par compétition de détection de l'IL-1.alpha. et de l'IL-1.beta. dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biologiques, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-1.alpha.
ou anti-IL-1.beta. approprié, utilisé comme premier anticorps, et des IgG portées par un support approprié utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d'IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-1.alpha. ou -1.beta., après quoi l'activité AChE
est révélée par tous moyens appropriés.

6.- Test enzymo-immunométrique hautement spé-cifique est sensible, de détection de l'IL-1.alpha. et de l'IL-1.beta. dans des surnageans de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérisé en ce que des anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et/ou anti-IL-1.beta. portés par un support approprié sont mis en contact avec de l'IL-1.alpha. ou -1.beta. et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité
AChE est révélée par tous moyens appropriés.

7.- Test selon la revendication 6, caractérisé
en ce que l'IL-1.alpha. ou -1.beta. est ajoutée à l'anticorps simul-tanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec avec l'IL-1.alpha. ou -1.beta..

8.- Test selon la revendication 6, caractérisé
en ce que l'IL-1.alpha. ou -1.beta. est tout d'abort introduite et réagit avec l'anticorps fixé sur le support, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité
AChe est révélée par tous moyens appropriés.

9.- Kit pour la réalisation des tests immuno-enzymatiques par compétition selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend :
. une série de plaques de microtitration revô-tues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin anti-souris ;
. au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-1.alpha. et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1.beta. ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-1.alpha. et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués de d'IL-1.beta. et d'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'un sub-strat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1.alpha.
et/ou d'IL-1.beta..

10.- Kit pour la réalisation des tests immuno-métriques selon l'une quelconques des revendications 6 à
8, caractérisé en ce qu'il comprend :

. une série de plaques de microtitration revê-tues d'anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et/ou d'anticorps monoclonaux anti-IL-1.beta. ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et/ou 1.beta. ;
. des quantités ou doses appropriées d'un sub-strat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1.alpha.
et/ou d'IL-1.beta..

11.- Agents à visées thérapeutiques caractéri-sés en ce qu'il sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et/ou des anticorps anti-IL-1.beta. et/ou leurs fragments, seuls ou conjugués ou hybridés ou associés avec d'autres substances.

12.- Agents de diagnostic aptes à être mis en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-1.alpha. et/ou des anticorps anti-IL-1.beta. ou leurs fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.

13.- Hybridomes mis en oeuvre pour la prépara-tion des anticorps monoclonaux anti-IL-1.alpha. et anti-IL-1.beta.
selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, déposés auprès de la COLLECTION NATIONAL DE CULTURES DE MICRO-ORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 8 Décembre 1988 et identifiés dans cette Collection sous les N' I-823, I-824, I-825, I-826, I-827, I-828, I-829.