FR2640146A1 - Anticorps monoclonaux anti-interleukines 1(alpha) et 1(beta), leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines 1(alpha) et 1(beta) et en therapeutique - Google Patents

Anticorps monoclonaux anti-interleukines 1(alpha) et 1(beta), leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines 1(alpha) et 1(beta) et en therapeutique Download PDF

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Abstract

Anticorps monoclonaux anti-interleukines-1. Les anticorps concernés sont des anticorps monoclonaux anti-IL-1alpha et anti-IL-1beta. L'invention concerne également des conjugués IL-1alpha-AChE et IL-1beta-AChE, des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1alpha/AChE et des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1beta/AChE, ainsi que des conjugués AChE-fragments des anticorps. Lesdits anticorps monoclonaux et conjugués présentent de nombreuses applications : tests enzymoimmunométriques, agents de diagnostic, agents à visées thérapeutiques.

Description

La présente invention est relative à des anticorps monoclonaux anti-interleukines, et notamment antiinterleukines la et lss, a leur procédé de production, à des conjugués anticorps monoclonaux anti-interleukines la et 1ss-acétylcholinestérase, à des tests enzymo-immunométriques (EIA) de détection et de quantification des interleukines la et 1ss utilisant lesdits anticorps et/ou conjugués et à diverses autres applications desdits anticorps et/ou conjugués, notamment à des applications thérapeutiques,
Les lymphokines sont de puissants agents pharmacologiques qui résultent de l'interaction entre les lymphocytes et l'antigène spécifique qui les sensibilise elles peuvent modifier, induire ou supprimer les fonctions de nombreux types cellulaires ; elles jouent aussi un rôle essentiel au cours des réactions inflammatoires et dans les phénomènes de résorption osseuse, de fibrose et de chimiotactisme. De plus, elles interviennent dans le contrôle de l'hématopoïèse et la régulation des réponses immunitaires.
Les lymphokines sont produites par les lymphocytes T, étant cependant e gonnu que certaines d'entre elles telles l'interleukine-1 peuvent être produites par des cellules non-leucocytaires.
L'interleukine-l (cf. IMMUNOLOGIE, Jean Franchis BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3ème Edition 1986) est un médiateur qui Constitue un signal biologique de la présentation de l'antigène associé à l'histotope, qui marque la coopération monocytes-1ymphocytes T. L'activité de l'IL-1 est traditionnellement mesurée dans un test de prolifération de thymocytes de souris C3H/HeJ (résistantes au LPS) en présence de P (lpg/ml). En l'absence d'IL-1, les thymocytes stimulés par la PHA sont bloqués en phase
Go/G1. Ils peuvent. cependant se diviser si l'on ajoute de l'interleukine-2, ce qui suggère que l'action principale de l'IL-1 est l'induction de la synthèse de l'interleukine-2.
L'IL-1 humaine est une glycoprotéine de poids moléculaire estimé à 18 kDa, avec un contaminant majeur à 15 kDa. En outre1 deux fractions peptidiques de poids moléculaires 2 et 4 kDa qui présentent l'activité biologique de l'IL-l ont été isolées de l'urine normale.
L'IL-1 semble être produite par une grande variété de types cellulaires à l'exclusion des lymphocytes T, tels que les monocytes1 les macrophages, les kératinocytes, les astrocytes, les mélanocytes, les cellules mésangiales, les lymphoblastes B.
Les effets biologiques de l'IL-l ne se limitent pas à l'induction de la synthèse de 1'IL-2. L'IL-1 parti cipe à l'activation des cellules B, stimule la prolifération des fibroblastes et des synoviocytes, éleve la tempé- rature corporelle par action sur les centres thermorégulateurs et induit la production de protéines de l'inflammation par les hépatocytes, Un gène de l'IL-l codant pour un précurseur de 270 amino-acides a récemment été cloné. Les plasmides contenant ce gène induisent la production d'un peptide carboxy-terminal de 156 aminoacides, ayant les activités de l'IL-l. Alors que dans la référence précitée, l'hypothèse d'une famille de molécules de structure vc;sine était avancée, DINARELLO /J. CLIN.
IMMUNOL. (1985), 5, pages 285-297/ et OPPENHEIM et al.
/IMMONOL. TODAY (1986), o, pages 45-46/ ont montré que l'IL-l représente une famille importante de protéines biologiquement actives dérivées de cellules mononucléaires, qui sont impliquées dans des réactions inflammatoires et dans des réponses immunes. Deux espèces distinctes d'IL-1 humaines ont été identifiées : }'IL-la et l'IL-1ss /MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641-647/ ; ces deux espèces ont le même poIds moléculaire, des effets biolo giques similaires et les mêmes récepteurs sur les cellulescibles /WOOD et al., J. IMMUNOL. (198S), 134, pages 895-903 et KILIAN, J. IMMUNOL. (1986), 136, pp. 4509/.Jusqu'à présent, la présence de l'IL-1 dans des milieux ae culture et dans des fluides biologiques est essentiellement mesurée, comme indiqué plus haut, à l'aide de bio-essais tels que le test de co-stimulation de thymocytes murins ou la lignée cellulaire EL4 de thymome de souris. Ces méthodes, qui utilisent les propriétés d'activation des lymphocytes de l'IL-1, ont cependant leurs limites : elles ne permettent pas d'établir la distinction entre l'IL-la et l'IL-1ss et la présence d'autres substances actives telles que l'IL-2, les lectines et les facteurs de croissance, peut interférer avec le bio-essai.
FERRUA et al. J. OF IMMUNOL. METH. (1988) 114, pages 41-48] signalent que l'existence d'IL-1 recombinante et le développement de la technologie des hybridomes ont permis à plusieurs équipes de Chercheurs ÊGAFFNEY et al., 1987 ;KASAHARA et al.,- 1987 ;- KENNEY et al., 1987
KOICHIRO et al., 1987] de mettre au point des lmmuno-essais sandwich n'utilisant pas d'isotopes, pour la détection d'IL-1α et d'IL-1ss avec une limite de détection comparable à celle de la plupart des tests biologiques, et proposent à leur tour une méthode de détection de l'iL-a et de l'IL-1ss cette méthode utilise deux lmmuno-essals enzymatiques sandwich par colorimétrie, séparés, qui permettent une détection de l' IL-la et de l'IL-1ss à des taux inférieurs à la picomole. Cependant, les anticorps mis en oeuvre sont des anticorps polyclonaux de lapin ou de mouton.
il est cependant clair qu'il serait préférable de pouvoir tirer parti des proprietés des anticorps monoclonaux et notamment de leurs plus grandes spécificité et sensibilité pour déterminer séparément l'IL-1α et l t IL-lss.
TANAKA et al. tEUR. J. IMMUNOL. (1987), 17, pages 1527-1530 ont proposé de doser l'IL-1α et l'IL-1ss produites in vitro par des cellules mononucléaires de sang périphérique à l'aide d'un immuno-essai enzymatique sandwich qui utilise un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal : des bllles de polystyrène revêtues d'IgG1 monoclonaux anti-IL-la humaine ou d'IgG1 anti-IL-1ss humaine de lapin sont incubées avec de l'IL-1α recombinante humaine, de l'IL-1ss recombinante humaine ou des surnageants de culture de cellules mononucléaires puis, après le lavage, avec des conjugués Fab' anti-IL-1α humaine/peroxydase ou du conjugué Fab' anti-IL-1ss humaine/peroxydase purifié, par affinité, le second anticorps mis en oeuvre étant un anticorps polyclonal anti-IL-la ou anti-IL-1ss de lapin.
Le Brevet français N 83 13389, au nom de la
Demanderesse, a propose pour la réalisation de dosages enzymolmmunologiques, des conjugués dans lesquels un anticorps, un antigène ou un haptène est lié par covalence à
I'acétylcholinestérase, ce nouveau conjugué permettant, grâce aux propriétés de l'enzyme, la réalisation de dosages enzymoimmunologiques de quantités très faibles. de l'ordre du nanogramme.
GRASSI et al. ont décrit /ANAL. BIOCHEM.
(1988), 168, pages 436-450/ une application de conjugués conformes à ce Brevet, constitues par des antigènes marqués par l'acétylcholinesterase, au criblage d'antlcorps mono- clonaux diriges contre les protéines périphériques du pho tosystème 1 (PS1), qui est un complexe ae membrane. Les
Auteurs ont également testé cette méthode bans des immu- noessais par competition, ce qui leur a perm;s de quantifier de façon très précise des polypeptides de PS1 dans différents extraits biologiques.Le test immunoenzymatique comprend, pour le criblage d'une serie d'anticorps monoclo- naux aptes à reconnaître les différents polypeptides qui composent les deux classes de polypeptides dont est contre tue ie PS1, , les trois étapes suivantes
- les anticorps monoclonaux anti-PS1 présents dans les surnageants des cultures d'hybridomes se fixent å la phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte du composant biotinylé correspondant au PS1 ; - cet antigène biotinylé fixe fortement l'avidine, qui fixe elle-même l'AChE marquée à la biotine ; - l'activité de l'AChE fixée est mesurée par la méthode colorimétrique d'ELLMAN. Les
Auteurs ont montré que le système à l'AChE ameliore de façon très sensible les limites de détection des anticorps monoclonaux. Cette méthode de criblage s'applique parfaitement à la détermination quantitative de différents polypeptides du PS1 par compétition.
La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à des moyens propres à permettre la réalisation d'essais enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection et de quantification d'IL-la et d'IL-1B, ces moyens étant en outre susceptibles d'applications thérapeutiques et d'applications diagnostiques in vivo.
La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines la et 1B, caractérisés en ce qu'ils résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de rongeurs, et plus particulièrement de souris, par des interleukines-la ou 113 selon le casr en ce qu'ils reconnaissent spécfiquement les interleukines-la -t 113 naturelles et recombinantes et les conjugués interleukine -1&alpha; ou 1ss - acétylcholinestérase (AChE) et en ce qu'il ne présentent pratiquement pas de réaction croisée ( < 0,01 %) entre les deux IL-1.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines la sont caracterisés en ce qu'ils se composent de trois groupes qui reconnaissent trois régions distinctes de l'lnterleukine-la, qui représentent trois épitopes de chacun de ces groupes, en ce que tous les anticorps d'un groupe sont aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes et en ce qu'ils ne sont pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines-1ss sont caractérisés en ce qu'ils se composent de quatre groupes dont les deux premiers (A et B) ont un comportement sim1iaire à celui des anticorps anti-iL-la, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes, en ce qu'ils ne se lient pas à l'Il-1ss native recombinante, reconnaissent une interleukine-1ss modifiée et réagissent avec un conjugué IL-lss-AChE.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines-la et 113 sont caractérisés en ce qu'ils se lient à des conjugués covalents préparés à partir de fragments Fab' des anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines IL-la et IL-1B et notamment à des conjugués Fab'
AChE présentant une activité spécifique très élevée.
La présente invention a également pour objet des conJugués d'acétylcholinestérase et d'inte-1&alpha; ou -113.
Elle a également pour objet des conjugués d'acétylchollnestérase et d'anticorps monoclonaux anti ILla ou -1ss ou de fragments de ces anticorps r notamment de fragments Fab'.
La presente invention a en outre pour objet un procédé de production d'antIcorps monoclonaux spécifiques des lnterleuklnes-la et 1ss, caractérisé en ce que des mammifères tels que, notamment, des rongeurs, et plus particulièrement des souris, sont immunisés par des injec tions appropriées d'interleukine-la ou -lss, puis des cellules de rates des mammifères immunisés sont fusionnées, selon une technique appropriée, avec des cellules de myélome de mammifères de la même espèce, les hybridomes résultants sont mis en culture et ceux dans les surnageants desquels ont été détectés des anticorps anti-interleukinela ou 1ss, selon le cas, sont sous-clonés pour obtenir des lignées cellulaires secrétant des anticorps monoclonaux anti-Il-1&alpha; ; ou anti-IL-1ss, selon l'interleukine contre laquelle ils ont été dirigés.
Conformément à la- présente invention, 1' interleukine-la ou-1ss mise en oeuvre pour immuniser les mammifères susdits, peut être aussi bien une interleukine naturelle purifiée, qu'une interleukine recombinante.
Les hybridomes mis en oeuvre pour l'obtention des anticorps monoclonaux anti-IL-la et anti-IL-1ss conformes à l'invention ont fait l'objet d'un dépôt en date du 8 Décembre 1988 auprès de la COLLECTICN NATIONALE DE
CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT
PASTEUR. Les hybridomes déposés sont identifiés par les
N suivants : I-823, I-824, I-825, I-826, I-827, I-828,
I-829.
La présente invention a, de plus r pour obJet un procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1&alpha; ou 113 conformes à la présente invention. Conformément à ce procédé, lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obten;r des fragments F(ab')2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis ces fragments
F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel, notamment, que la Bmercaptoéthylamine (13MEA), pour fournlr un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de production de conjugués d'AChE et d'IL-la et/ou d'IL-1ss.
Conformément à çe procédé, au moins un groupe thiol est introduit dans I'interleukine la ou 1ss, selon le cas, et au moins un groupe maléimido est introduit dans l'AChE, puis l'interleukine thiolée est couplée à l'AChE portant un groupe maléimido, par l'intermédiaire d'un agent de couplage hétérobifonctionnel approprié tel que, notamment, le N-succinimidyl-4-(N-maléimido-méthyl) cyclohexane1-carboxylate (SMCC).
La présente invention a également pour obJet un procédé de production de conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-la ou anti-IL-la et de conjugués d'AChE et de fragments desdits anticorps monoclonaux, notamment de fragments Fab', qui est caractérisé en ce qu'au moins un groupe thlol incorporé ou naturellement présent dans l'anticorps ou l'un de ses fragments, est couplé à au moins un groupe maléimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel quer notamment, un ester de N-succinimide.
La présente invention a, en outre, pour objet des tests immunoenzymatiques hautement spécifiques et sensibles, de détection de l'Il-la et de l'IL-1ss dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biolo giques, caractérisés en ce qu'un anticorps monoclonal anti
IL-la ou anti-IL-la approprié, utilisé comme premier anticorps, et des IgG, portées par un support solide approprié, utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d'IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine - la ou -113, après quoi l'activité
AChE est révélée par tous moyens appropriés.
La présente invention a également pour objet des tests enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection de l'Il-la et de l'IL-1ss dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biolo- giques, caractérisés en ce que des anticorps monoclonaux (Acm) anti-IL-la et/ou anti-IL-lss sont mis en contact avec de l'iL-la ou -1ss et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
Selon un mode de mise en oeuvre de ces tests enzymoimmunometrlques, l'IL-la ou -1ss est ajoutée à l'anticorps simultanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec 'IL-1&alpha; ou - 1ss.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de ces tests enzymoimmunométriques, l'IL-1&alpha; ou -1ss est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
La présente invention a, de plus, pour objet des agents à visées thérapeutiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-la et/ou des anticorps anti-IL-1ss et/ou leurs fragments, seuls ou conjugués ou hybridés ou associés avec d'autres substances.
Conformément à l'invention, une application thérapeutique particulièrement intéressante desdits anticorps monoclonaux anti-IL-la et anti-IL-1ss est leur activité d'inhibition de l'IL-I.
La présente invention a egalement pour objet des agents de diagnostic aptes a être mis en oeuvre pour le diagnostic in vive, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-la et/ou des anticorps anti-IL-I 13 ou leur fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.
La présente invention a, de plus pour objet, un kit pour la réalisation des tests enzymoimmunométriques précités, qui est caractérisé en ce qu'il comprend une première série de plaques de microtitration revêtues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin anti souris une seconde -série de plaques de microtitration de mêmes dimensions eten nombre égal à celui de la première série, au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-la et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1ss, -au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-la et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-lss et d d'AChE . des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE des quantltés ou doses appropriées d'IL-1&alpha; et/ou d'IL-lss.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention, dans ie premier desquels il sera fait référence aux dessins annexés dont les Figures 1 à 7 représentent respectivement, par des courbes
- La Figure 1 : l'effet non-spécifique de plasma sur des courbes standard d'un immunoessai d'IL-la, dans le cadre d'une comparaison entre deux couples différents d'anticorps monoclonaux.
- La Figure 2 : l'évolution de la courbe étalon de l'IL-1ss en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation).
- La Figure 3 : l'évolution des "profils d'imprécision" dans le test relatif à l'IL-13 en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation).
- La Figure 4 : la libération in vltro d'IL-la (#, #) et d'IL-1ss (#, #) établie par les EIA spécifiques dans les surnageants de monocytes, lymphocytes et neutrophiles humains non stimulés (#, #) et stimulés par le LPS (#, #), purifiés par élutriation centrifuge.
- La Figure 5 : la libération de PGE2 par des fibroblastes dermlques humains (5x104/puits) stimulés par de l'IL-1&alpha;, de l'IL-1ss et par IL-la + IL-113.
- La Figure 6 : la mise en évidence d'une substance "IL-l-like" dans les surnageants de cellules élutriées, en utilisant des fibroblastes en tant que cibles pour l'IL-1 et
- La Figure 7 : la répartition de l'immunoréactivité de l'IL-1&alpha; à la suite d'une chromato graphie sur tamis moléculaire "SUPEROSE 12" de surnageant de culture ou de plasma.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessins sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 1. PURIFICATION ET CONTROLE DE L'ACETYLCHOLINESTERASE
L'acétylcholinestérase (AChE) obtenue à partir de l'anguille électrique Electrophorus electricus. a été purifiée par chromatographie d'affinite par la méthode dé crite par MASSOULIE et BON /Eur. J. BIOCHEM (1976),68, pages 531-539/. La forme tétramère de l'enzyme, ou forme
G4, a été utilisee pouir marquer les interleukines et les anticorps. L'activité AChE a été mesurée à l'aide de la methcde colorimétrique d'ELLMAN et al. / BICCHEM. PHARM.
(1961), 7, pages 88-55 1. Une unité ELLMAN est définie comme etant la quantité d'enzyme produisant une augmentation de l'absorbance de 1 DO à 25 C, pendant 1 minute, dans 1 ml de milieu et pour une longueur de pas optique d'l cm ; elle correspond à environ 8 ng d'enzyme et a 7,32 unités enzymatiques (une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 mole d'acétylcholine à 25 C pendant 1 minute). Les concentrations d'AChE ont été déterminées par voie enzymatique en utilisant un nombre de rotations de 4,4 x 107 moles h-1 par site et une masse moléculaire de 80 kDa pour la sous-unité catalytique.A partir de ces valeurs, une limite de détection de 1,8 amole d'enzyme peut être calculée pour la forme G4 (ctest-à-dire la quantité d'AChE qui produit une augmentation d'absorbance de 0,01 DO pendant 1 heure, dans 20 ' de milieu de ELLMAN, pour une longueur ae pas de 0,5 cm.
2. IMMUNISATION ET PROCESSUS DE PRODUCTION D'HYBRIDOMES.
Des anticorps anti-interleukine-la et 1-ss ont été produits chez des sourIs de race Biozzi High Responder (HR) en utilisant le processus d'immunisation suivant : au jour 0, 15 g d'interleukine recombinante la ou 113 émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund,ont été injectés dans le coussinet d'une patte. Les souris ont été traitées par de l'aspirine {0,1 mg/jour) pour éviter les effets secondaires tels que l'hyperthermie. Une première injection de rappel (dans le coussinet d'une patte) a été administrée au jour 21 et les souris ont été saignées une semaine plus tard. La présence d'anticorps anti-interleukine murins dans les sérums correspondants a été contrôlée en testant leur capacité de fixer des conjugués interleukine-1- AChE.Ces tests ont été réalisés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, en mettant en oeuvre le même processus que celui qui sera utilisé ultérieurement pour cribler les surnageants de cultures d'hybridomes. On a choisi pour chaque interleukine-1, la souris présentant le titre le plus élevé dans lllmmunoessal-en2ymatique, pour la préparation d'anticorps monoclonaux. A ce stade, des titres compris entre 1/1000 et 1/10000 ont été observés. Les souris sélectionnées ont reçu une Injection intraveineuse de rappel (7g d'interleukine) 3 et 2 jours avant la fusion. Des cellules de rate des souris correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris NS1, comme décrit dans l'Article de
GRASSI et al. cité dans le préambule.
3. MARQUAGE D'INTERLEUKINES PAR L'AChE
Les interleukines la et 113 ont été couples par covalence à l'AChE par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, à savolr le N-succinimidyl-4-(N-maléi- mido-méthyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), en mettant en oeuvre une technique connue pour le marquage du facteur de croissance acide bovin (aFGF) et de la prolactine de rat. Cette méthode comprend la réaction d'un groupe thiol (préalablement introduit dans les interleuk1nes) avec un groupe maléimido incorporé dans l'enzyme après la réaction avec le SMCC. Les interleukines ont été thiolées par réaction de leurs groupes amine primaire avec du N succinimidyl-S-ac8tyl-thioacétate (SATA) dans un milieu alcalin.
INCORPORATION DE GROUPES THIOLS DANS LES INTERLEUKINES
10 jil d'une solution à 2,7 mg/ml de SATA dans du diméthylformamide (DMF) anhydre sont ajoutés å 100 eg d'interleukines la ou 113 dissoutes dans 200 l de tampon borate 0,1 Mr pH 8. Le mélange réagit pendant 30 minutes à 25 C avant que lui soient ajoutés 200z1 d'une solution d'hydroxylamine 1 M, pH 7. Au bout d'une nouvelle durée de réaction de 30 minutes à 25'C, les réactifs en excès (SATA et hydroxylamlne) sont éliminés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne Sephadex G25 (15 x 1 cm.) équilibrée par un tampon phosphate 10-1 M, pH 6, contenant 5.10-3M d'EDTA.Avant et pendant la chromatographie, l'éluat est maintenu sous un courant continu d'azote pour éliminer 1'oxygène dissous et éviter une éventuelle oxydation des groupes thiols. Des fractions contenant des interleukines thiclées sont réunies. La concentration des interleukines est évaluée par spectrométrie U.V. en supposant que le coefficient d'extinction à 280 nm est de
lg-1L cm-l et que le poids moléculaire est de 17000. Leur teneur en groupes thiols a été déterminée par colorimétrie (a 412 nm) après réaction avec de l'acide 3-5' dithiobis nitrobenzoïque (DTMB) 0,5 mM. Ces mesures ont fait apparaitre qu'environ un groupe thiol a été incorporé par molécule d'interleukine.
INCORPORATION DE GROUPES MALEIMIDO DANS L'AChE ET
COUPLAGE AVEC LES INTERLEUKINES THIOLEES
Des groupes maléimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec du SMCC ; si elle n'est pas utilisée immédiatement, la préparation d'AChE-SMCC peut être congelée à -80 C et être conservée sans perdre ses propriétés réactives, pendant au moins plusieurs semaines.
Les interleukines thiolées ont été couplées à la -préparation d'AChE-SMCC (forme G4 > en mélangeant les deux réactifs immédiatement après qu'ils ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire ou dès qu'ils ont été décongelés. A ce stade, on a utilisé un rapport moléculaire (SH- interleukine/G4-SMCC) de 50/1. Après réaction pendant 3 heures à 30'C, l'interleukifle qui n'a pas réagi est éliminée par chromatographie sur une colonne (90 x 1.5 cm) de
Biogel A 0,5 M. Les conjugués sont conservés à l'état congelé a - 20 C. Aucune perte d'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage.
Il ne s'est pas produit de modification significative des propriétés immunologiques ou enzymatiques des conjugués dans ces conditions de conservation , en l'espace d'une année.
4. MARQUAGE D'ANTICORPS MONOCLONAUX par l'AChE
Des anticorps monoclonaux (Acm) ont été purifiés à partir de fluides ascitiques par précipitation par de l'acide caprylique et du sulfate d'ammonium, selon une technique décrite dans l'Art antérieur. La pureté de la préparation a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes et réductrices. Deux méthodes de marquage différentes ont été utilisées pour coupler des Acm purifiés à de l'AChE.
4.a) Marquage d'Acm par la biotine
La biotine a été liée par covalence à des Acm par réaction d'un N-hydroxysuccinimide ester de biotine activé (IBF, France) avec les groupes amine primaire des anticorps. L'ester activé a été dissous dans du diméthylformamide anhydre et ajouté à une solution alcaline de l'anticorps a marquer : on a ajouté 401 d'une solution à
Smg/ml d'ester de biotine dans au DMF, à 1 mg d'anticorps dissous dans 2 ml de tampon borate 0,1M, pH 8,5. Au bout de 30 minutes à la température ambiante1 on a ajouté 2 ml de tampon EIA < qui sera défini plus loin). Cette préparation a été utilisée pour déterminer la "compatibilité de fixation" des différents Acm sans subir d'autres purifications. Elle a été conservée à l'état congelé à -20;C.
4. b) MARQUAGE COVALENT DE FRAGMENTS Fab' par l'AChE
Des fragments Fab' d'Acm ont été couplés par covalence a l'AChE par l'intermédiaire du SMCC en mettant en oeuvre une technique dérivée de celle décrite par
ISHIKAWA et al. E J. 'IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327~ pour le marquage de fragments d'anticorps par d'autres enzymes. Le- principe de la méthode mise en oeuvre est très semblable à celui utilisé pour marquer les interleukines, qui a été décrit plus haut, a ceci près que; dans le cas présent, les groupes thiols impliqués dans la réaction de couplage sont naturellement présents dans les fragments
Fab' obtenus par réduction du fragment F(ab')2 correspondant.
Préparation de fragments F(ab')2
Des fragments F(ab')2 ont été obtenus par traitement d'Acm par de la pepsine en milieu aciae (tampon acétate pH 4,3). Ils ont été isolés de la préparation brute traitée par la pepsine, par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de Biogel A 0,5 m équilibrée dans du tampon phosphate 0,1M, pH 6, contenant 5.10-3M d'EDTA. La pureté de la fraction F(ab')2 a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes non réductrices. Ces mesures ont montré que plus de 80 % de la teneur totale en pro téines étaient composés de fragments de F(ab')2.
Préparation de fragments Fab'
Des fragments F(ab')2 ont été réduits en présence de ss-mercaptoéthylamine 0;1M (BMEA) à 37'C pendant 1 heure. La ssMEA en excès a été éliminée par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de
Séphadex G25, comme décrit précédemment pour les interleu kines thiolées. La concentration en fragments Fab' a été mesurée par spectrométrie U.V. en prenant pour coefficient d'extinction à 280 nm, 1,48 g-l. L cm-l et comme poids moléculaire 46000. La teneur en groupes thiols de la préparation de Fab' a été déterminée par réaction avec le DTNB, comme pour les interleukines thiolées.Selon l'Acm utilisé, on a trouvé des valeurs comprises entre 1 et 4 groupes SH par molécule de Fab'.
Incorporation de groupes maléimido dans l'AChE et
couplage avec des fragments Fab'
Des groupes maléimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec le SMCC, suivie de purification. Le couplage de l'enzyme avec des fragments
Fab' a été réalisé par mélange de la préparation AChE-SMCC (immédiatement après qu'elle a été isolée par chromatographie sur tamis moléculaire ou décongelée) avez un excès de fragments Fab'. On utilise habituellement un rapport molaire de 50 à ce stade tc'est-à-dlre groupes thiols de Fab'/G4-SMCC). Après réaction pendant 3 heures à 30'C, les conjugués G4-Fab' ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne de Biogel A 0,5M. Le conjugué a été élué sous la forme d'un seul-pic homogène, la fraction correspondante a été recueillie et conservée à l'état congelé à -20 C.Aucune perte significative de l'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage. La stabilité des conjugués s'est avérée excellente car ils ont pu être conservés soit à l'état congelé à -20 C, soit à l'état lyophilisé , soit à l'état liquide a +4'C, sans perdre leurs propriétés enzymatiques ou lmmunologiques.
5. CRIBLAGE DES SURNAGEANTS DE CULTURE
La présence d'anticorps anti-interleuklne-l dans des Surnageants de cultures d'hybridomes a été détectée en mettant en oeuvre un test immunoenzymatíque analogue à celui décrit plus haut. Les surnageants de culture ont été incubés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, conjointement avec des conjugués d'interleukine 1-AChE. Pendant cette étape, les Acm anti-interleukine 1 éventuellement présents dans les surnageants se lient simultanément au conjugué IL-1
AChE et à la,phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte de l'activité AChE sur les plaques.La présence de l'AChE sur la phase solide a en outre été révélée (après une étape de lavage) par addition du substrat et mesure par colorimétrie. La préparation et les caractéristiques du second anticorps en phase solide sont bien connues ; 50 pl de chaque surnageant présent sur les plaques de microtitration comportant 96 puits, ont été transférés dans des conditions stériles dans des plaques de microtitration de mêmes dimenslons, revêtues du second anticorps. 50M1 de conjugué interleukine 1-AChE (1 unité ELLMAN/ml) dissous dans du tampon EIA ont alors été ajoutés et on a laissé réagir le mélange pendant une nuit à +4 C. A la fin de cette première période de réaction, les plaques ont été soigneusement lavées avant d'ajouter 200;;1 de réactif d'ELLMAN dans chaque puits. A ce stade les puits contenant de l'activité AChE liée à la phase solide ont développé une forte coloration jaune qui indique la présence d'anticorps anti-IL-1 dans le surnageant correspondant. L'absorbance a 414nm de chaque puits a été mesurée 30 minutes ou une heure plus tard en utilisant un lecteur automatique de plaques (TITERTEK, Finlande). Ce processus de criblage permet une sélection très rapide et efficace des hybridomes attendu que des quantités d'Acm de l'ordre du nanograme sont facilement détectées, le criblage de 2 000 surnageants ne requérant pas plus de 4 heures de travail pour une personne.
6. DETERMINATION DE LA COMPATIBILITE DE FIXATION POUR
CHAQUE PAIRE D'Acm
La compatibilité de fixation de deux Acm différents sur une seule molécule d'Interleukine-1 a été déterminée dans un test immunométrique dans lequel l'un des Acm a été immobilisé sur une phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine. Ces tests ont été effectués comme suit : toutes les dilutions ont été réalisées dans du tampon EIA et 100 ctl d'une solution à 100 ng/ml d'interleukine-îa ou 1B recombinante ont éte ajoutés à des puits de plaques de microtitration revêtus de l'un des Acm.Au bout d'une heure de réaction à la température ambiante sous agitation, 100 1 d'une solution 10 g/ml d'un autre Acm marqué à la biotine, ont été ajoutés. Après une nouvelle période de 3 heures de réaction à la température ambiante sous agitation, les plaques ont été soigneusement lavées. La présence éventuelle d'anticorps marqués à la biotine sur la phase solide a été ensuite révélée par addition d'un mélange d'avidine et d'AChE biotinylée. Une fixation non spécifique d'AChE sur la phase solide a été évaluée dans des expériences témoins au cours desquelles 100 l de tampon ont remplacé l'interleukine-1.
Lorsque l'on a obtenu une fixation simultanée des Acm immobilisés sur la phase solide et des Acm marqués à la biotine, il s'est développé une forte couleur jaune après addition du réactif d'ELLMAN.
7. ESSAIS IMMUNOENZYMATIQUES DE DETECTION DE L'IL-la ET DE L'IL-1B
Deux types différents d'EIA pour les interleukines-la et 1ss ont été développés.
Des anticorps monoclonaux provenant de surnageants de culture ou de fluides ascitiques ont tout d'abord été testés dans un immuno-essai par compétition en utili- sant des conugués IL-1-AChE comme traceurs. Dans une deuxième étape, ont été développés des essais immunométriques impliquant l'utilisation simultanée d'Acm anti-interleukines, soit revêtant une phase solide, soit marqués par de l'AChE. Tous les réactifs utilisés dans l'immuno-essai ont été dilués dans le tampon EIA dont il a été question plus haut, dont la composition est la suivante phosphate O,1 M, pH 7,6, contenant 0,4 M NaCl, 10-3 M
EDTA, 0,1 % BSA et 0,01 % azide de sodIum.Toutes les concentrations mentionnées dans les immuno-essais se réf è- rent à la concentration des réactifs dans le "volume initial" (50 pl pour l'essai par compéttion, 100 l pour l'essai immunométrique) avant mélange avec les autres réactifs.
Immuno-essais par compétition utilisant des conjugués IL-l-AChE.
Des immuno-essais par compétition classiques utilisant des Acm comme premiers anticorps et des conjugués IL-1-AChE comme traceurs ont été réalisés comme décrit dans la Littérature en relation avec les haptènes ou les antigènes. Ces essais ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits r revêtues d'un second anticorps constitué par des IgG de lapin anti-souris. Ce second anticorps en phase solide assure une séparation entre les fractions liées et les fractions libres du traceur pendant le cours de l'immunoréaction spécifique.Le volume total de la réaction était de 150 pl, chaque composant (traceur', Acm et IL-1 recombinante) a été aJouté en un volume de 50 1, Les conjugués IL-1-AChE ont été utilisés à une concentration de 1 unité ELLMAN/ml. Les dilutions de travail des Acm ont été déterminées au préalable en réalisant des courbes de dilution d'anticorps à partir de surnageants de culture ou de fluides ascitiques. La sensibilité des tests a été caractérisée par la dose d'IL-1 qui induit une diminution de 50 * de la fixation observée en l'absence de compétiteur (B/Bo = 50 %).
Essais immunométriques utilisant des conjugués
Acm-AChE.
Des essais immunométriques ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits r revêtues- de l'un des anticorps monoclonaux. Le revêtement a été réalisé exactement comme décrit plus haut pour le second anticorps en phase solide. En bref, les puits des plaques de microtitration ont été remplis de 200 p1 d'une solution à 10 pg/ml d'Acm dissous dans du tampon phosphate 5 x 10-2M, pH 7,4. Après avoir laissé la réaction se produire pendant une nuit à la température ambiante, les plaques ont été soigneusement lavées avec du tampon pncsphate o-2, pH 7,4 contenant du TWEEN 20, 0,05 %. La phase solide a alors été saturée en ajoutant dans chaque puits 300 ni de tampon EIA pendant au moins 4 heures à la température ambiante.Les plaques ont été conservées à 4' C dans ce tampon de saturation jusqu'à ce qu'elles soient utilisées. Lorsqu'elles ont été conservées dans ces condi tisons, il n'a pas été observé de modifications de leurs propriétés de fixation pendant au moins une période de quatre mois. Les essais immunométriques ont été réalisés en utilisant deux processus différents.
Le premier processus (dénommé "Processus simut- tané") a consisté å aJouter 100 ctl d'lnterleuklne-l en solution (introduite sous la forme d'un standard recombinant ou d'uc échantillon) dans des puits de plaques de microtitration, conjointement avec 100 de conjugués Acm
AChE (habituellement à une concentration de 10 unités
SLLMAN. . Dans cette méthode, les deux antlcorps (1'anticorps en phase solide et l'anticorps marqué par 1'AChE) réagissent simultanement avec 1'interleukine-1.
Selon la nature de l'echantillon à tester, on dissout l'lnter}euklne-l recombinante standard dans le diluant cor respondant, c'est-à-alre du milieu de culture, du plasma ou du sérum. Dans toute la mesure du possible, tous les diluants utilisés doivent être dépourvus d'interleukine-la ou 13. Pour le plasma ou le serum, ceci est possible en sélectionnant les fluides individuels pour lesquels les tests immunométriques ne pourraient pas détecter de quantités significatives d'IL-1&alpha; ou d'IL-1ss.Lorsque les EIA sont réalises dans ces milieux, on utilise de l'immunoglobuline de souris (introduite à une dilution de 1120 dans de l'ascite d'ERLICH) ajoutée pendant l'immuno réaction pour neutraliser les anticorps humans anti-souris présents dans ces fluides. Une fixation non spécifique a été évaluée dans des pu;ts séparés dans lesquels 100 nl de tampon ou d'un diluant approprié avaient été ajoutés à la place de l'interleukine-1 recombinante. La réaction a alors eu lieu pendant des périodes de temps variables à différentes températures, sous agitation ou sans agitation. A la fin de cette étape d'immuno-réaction, les plaques ont été soigneusement lavées en utilisant un tampon phosphate-Tween.
L'activité AChE fixée à la phase solide a été déterminée par addition de 200 pl de réactif d'ELLMAN.
Un second processus (dénommé "Processus séquentiel") consiste à faire réagir l'interleukine-1 et le conjugué Acm-AChE séparément. Au cours d'une première période d'incubation, 200 l d'interleukine-1 (introduite sous forme d'étalon ou d'échantillon) dissous dans du tampon EIA ou tout autre diluant approprié (milieu de culture, plasma,etc...) réagissent avec la phase solide. A la fin de cette première incubation, les plaques sont lavées avant d'ajouter 200-M1 de conjugué Acm-AChE (habituellement à 10 unités ELLMANN/ml) dissous dans du tampon EIA. Après une seconde période de réaction, les plaques sont lavées à nouveau et l'activité AChE est révélée comme décrit plus haut,
Des "profils d'imprecision" de courbes standard ont été établis en réalisant toutes les mesures (fixation non spécifique aussi bien que mesures standards) à huit reprises.Pour chaque dose, la précision a été exprimée en termes de coefficient de variation (CV %) et a été mise sous forme de courbe en fonction du logarithme de la dose.
La sensibilité des essais immunométriques a été caractérisée par leur "concentratlon détectable mlnimum" (MDC) qui correspond à la concentration d'IL-1 produisant une augmentation statistiquement significative de la fixation observée en l'absence d'IL-1 recombinante standard. La
MDC a été calculée comme étant la dose d'IL-1 qui correspond à la fixation non spécifique plus une déviation standard de 3 (avec une précision de 99 t).
8. TESTS FPLC
Une substance immuno-réactive détectée par des essais immunométriques dans des milieux biologiques (surnageant de culture, plasma) a été caractérisée en fractionnant les échantillons par chromatographie sur tamis moléculaire à l'aide d'un équipement FPLC et d'une colonne de Superose 12 équilibrée par du tampon EIA. On a injecté de l'IL-1 recombinante étalon et des échantillons sous un volume de 500 pl et à un débit de 24 ml/heure puis on a collecté des fractions de 0,8 ml. A la fin de la chromatographie, on a testé 100 pl de chacune des fractions en mettant en oeuvre le test IL-la et/ou IL-1B comme décrit plus haut.
9. PREPARATION D'ECHANTILLONS DESTINES A ETRE SOUMIS A DES
EIA POUR LA DETECTION D'IL-la ET D'IL-18
Surnageants de cellules elutriées.
Des leucocytes mononucléaires (lymphocytes et monocytes) et polymorphonucléaires (neutrophiles) de sang périphérique ont été obtenus par centrifugation sur du
FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMtCALS) et ont été ensuite soumis à une-élutriation centrifuge à contre-courant pour permettre l'obtention de lymphocytes , de monocytes et de neutrophiles purs. Pour ce faire, on a injecté des cellules mononucléalres ou polymorphonucléaires dans une chambre de séparation d'un rotor élutriateur de BECKMAN (JE-6), à un débit de 8 ou 20 ml/minute respectivement, à une vitesse constante du rotor de 2 500 tours/minute. Le tampon d'élutriation était constitué par une solution saline de
PBS de Dulbecco supplémentée par 0,25 % de BSA et 2mM d'EDTA. Les plaquettes ont été lavées après une demi-heure d'élutriation, ou débit d'injection. Le fractionnement de leucocytes mononucléaires a été réalisé comme suit : des lymphocytes purs ont été obtenus en augmentant le débit de 8 à 20 ml/min. 50 ml de milieu ont été collectés à chaque étape, centrifugés (350 x g, 10 min.) et le culot de cellules a été lavé une fois dans une solution isotonique et finalement remis en suspension dans le milieu d'incubation (RPMI 1640 avec de la L-glutamine, 7,5 % de sérum bovin foetal et penstrep). Des fractions de lymphocytes purs (monocytes, < 0,5 %) ou des fractions de monocytes enrichis (l,ymphocytes, < 20%) ont été collectées et ajustées à 10 x 106 ou 1 x 106 cellules/ml, respectivement.Les neutrophiles ont été débarrassés de monocyteS contaminants en augmentant le débit de 20 a 25 ml/min en utilisant des paliers de 0,25 ml/min et en collectant des fractions de 5 ml. Des neutrophiles purs ont alors été collectés en une fraction unique en arrêtant le rotor. La fraction de neutrophiles a été lavée une fois dans une solution isotonique et finalement remise en suspension dans le milieu d'incubation à 20 x 106 cellules/ml.Des incubations ont été réalisées dans des tubes de culture en propylène de 12 x 75 mm à 37 C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Des comptages de cellules différentiels de leucocytes ont été réalisés par
1) cytométrie en flux en utilisant des caractéristiques de dispersion de lumière à angle aigu et à angle droit,
2) par coloration non spécifique à l'estérase et au colorant de WRIGHT,
3) par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine et
4) par analyse au microscope en contraste de phases, pour la contamination des plaquettes.
La viabilité des cellules a étA établie en routine à l'aide du test d'exclusion au bleu trypan dans chaque expérience et a été supérieure à 95 %. Des cellules ont été cultivées aussi bien en l'absence qu'en présence de 5 pg/ml de lipopolysaccharide (LPS) ; les cultures cellulaires ont été réalisées en présence de 0,1 m d'indométhacine. A différents intervalles de temps, les milieux de culture ont été centrifugés (600 x g, 10 min., 4' C) et immédiatement congelés à - 20 C jusqu'à la mesure de l'IL-la et de l'IL-lss en utilisant des EIA sélectifs.
10. BIO-ESSAI DE DETECTION DE L'IL-1 : PRODUCTION DE PGE2
PAR LES FIBROBLASTES HUMAINS NORMAUX
Comme on le sait, i'interleukine-l stimule la synthèse de la PGE2 par les fibroblastes dans différents modèles expérimentaux et actuellement on peut utiliser la production de la PGE2 dans les fibroblastes en tant que bio-essai pour tester des milieux contenant des substances IL-1-like sans discriminer entre les deux formes d'IL-1 ou d'autres facteurs stimulant les f;broblastes.Pour valider les EIA de détection de 1'IL-1 conformes à l'invention, il s'est avéré opportun d'étudier la production de la PGE2 par des fibroblastes dermiques en réponse à différentes concentrations d'IL-la et/ou d'IL-lss recombinantes humaines ou en réponse aux différents milieux conditionnés de cultures cellulaires élutriées.
Préparation de fibroblastes
Des fibroblastes humains ont été cultivés dans du milieu de HAM supplémenté par 20 % de sérum bovin foetal et des antibiotiques. Pour mesurer la libération de PGE2, les cellules ont été utilisées au passage 3 ou 4 et ont été utilisées pour ensemencer des plaques de 12 puits à une densité de 5 x 104 cellules/puits. Les cellules ont été mises en culture pendant 24 heures dans le milieu précité.
Le milieu de culture a alors été enlevé, les puits ont été lavés une fois et remplis d'l ml de milieu contenant une solution de sels d'EARLE équilibrée (37 C, 5 % C02) avec 5% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur et le milieu conditionné des préparations cellulaires élutriées à différenles dilutions. Après six heures d'incubatlon, des aliquots de surnageant ont été collectés et immédiatement congelés à - 20 C jusqu'à ce que l'on vérifie leur teneur en PGE2.
Mesure de la PGE2
La PGE2 a été mesurée directement dans les milieux d'incubation à l'aide d'un essai lmmunoenzymatique spécifique (en utilisant l'acétylcolinesterase comme traceur). L'essai a détecté de façon significative des quantités de PGE2 aussi faibles que 5 pg/ml.
Calibrage du bio-essai à l'aide d'IL-la ou d'IL-1ss recombinante.
Des fibroblastes dermiques humains (5 x 104/ml) se sont avérés libérer spontanément 420 + 51 pg/ml de PGE2 (n = 12) au bout de 6 heures d'incubation. Lorsqu'on les incube avec de l'IL-1&alpha;, de l'IL-1ss ou avec un mélange -IL- la + IL-1ss humaines recombinantes, la libération de PGE2 par les fibroblastes est dose-dépendante, ainsi que cela ressort de la figure 5 annexée, qui représente la llbera- tion de PGE2 par des fibroblastes dermiques humains (5 x 104/puits) stimulés par l'IL-la, l'IL-1ss ou un mélange d'IL-1&alpha;; + IL-1ss (où chaque forme représente 50 % de la quantité ajoutée à la culture cellulaire) pendant une période d'incubation de six heures à 37 C sous 5 % de CO2.
Les résultats obtenus sont une moyenne t SEM de 4 expériences. La libération de PGE2 a été de 420 + 51 pg/m.
(n = 12).
La concentration d'IL-1 ajoutée, qui a induit des quantités de PGE2 significativement différentes de la libération de PGE2 de base, s'est avérée être de 0,1 pg/ml (800 + 52, 817 + 51, 690 ' 104 pg/ml PGE2 pour IL-1&alpha;,
IL-1ss, IL-la + IL-1ss respectivement ; dans le dernier cas, la concentration de chaque forme de IL-1 est de 50 % de la concentration finale). Chaque concentration d'IL-1 1 été testée à 4 reprises sur des fibroblastes dermiques cultivés en provenance d'un meme donneur. Dans ces conditions, il a été possible de tracer une courbe étalon de libération de
PGE2 en réponse à des concentrations bien definies d'IL-1 et d'utiliser cette courbe pour approcher les quantités de substances IL-1-like trouvees dans des surnageants de cellules elutriées (avec ou sans LPS) lorsqu'elles sont incubées avec des fibroblastes dermiques en culture, de la même origine. Dans ce système, le LPS s'est avéré n'exercer aucun effet sur la production de PGE2 par les fibroblastes en culture.
A - CARACTERISATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
ANTI-IL-1 ET REALISATION D'ESSAIS
IMMUNOMETRIQUES
Pour chaque interleukine, la souris dont le sérum présentait le titre ie plus élevé dans les essais lmmu- noenzymatiques, a été sélectionnée pour la fusion. Les cellules de rate correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de NS1 comme décrit plus haut. Une semaine après la fusicn, environ 500 puits présentaient des hybridomes qui se multipliaient activement pour les deux interleukines. La présence d'anticorps de souris antiinterleukine a été vérifiée dans tous les surnageants de culture en testant leur capacité à fixer le conjugué correspondant IL-1-AChE.Dans un criblage primaire, 90 et 116 surnageants de culture fortement positifs ont été détectés respectivement pour l'IL-la et l'IL-12. Les hybridomes correspondants ont été sous-clonés par des dilutions limitantes pour obtenir une lignée cellulaire secrétant des anticorps, stable, unique pour chaque culture. Finalement, 36 et 11 lignées cellulaires ont été stabilisées respectivement pour l'IL-1&alpha; et l'IL-1I3. Tous les clones ont été caractérisés par un nombre précédé. par la lettre a ou ss selon lllnterleuk;ne contre laquelle ils avaient été dirigés.Ils ont été cultivés en tant que tumeurs ascitiques et les anticorps monoclonaux ont été purifiés a partir de fluide ascitique par précipitation par de l'acide capry lique et du sulfate d'ammonium. Les isotypes ont été déterminés à partir du fluide ascitique par la technique de double diffusion d'OUCHTERLONY. Tous les Acm étaient des
IgG possédant une chaine légère K, la sous-classe IgG1 étant de loin la plus commune (cf.Tableaux I et II ci après),
TABLEAU I : RESULTATS DE TESTS DE COMPATIBILITE
DE FIXATION POUR LES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI IL-la
ACM MARQUES
Figure img00270001
<tb> <SEP> 231 <SEP> 267 <SEP> 275 <SEP> 294 <SEP> 311
<tb> <SEP> 153 <SEP> 159 <SEP> 176 <SEP> 177 <SEP> 195 <SEP> 168
<tb> <SEP> 137 <SEP> 147 <SEP> 184 <SEP> 238 <SEP> 260 <SEP> 48 <SEP> 50 <SEP> 71 <SEP> 82 <SEP> 117 <SEP> 124
<tb> <SEP> 5 <SEP> 29 <SEP> 35 <SEP> 73 <SEP> Ils <SEP> 18 <SEP> 22 <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 34 <SEP> 44 <SEP> 191
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<tb> ACM IMMOBILISES EN PHASE SOLIDE
Les tests de compatibilité de fixation ont été réalisés comme décrit plus haut. Les cercles pleins indi- quent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués. Pour clarifier la présentation, les Acm présentant la même définition ont été groupes en trois catégories (A a C).
Tous les Acm sont de la sous-classe IgG1 sauf l'Acm 100 (groupe A) et les Acm 50 et 176 (groupe B) qui sont des IgG2.
TABLEAU II . RESULTATS DES TESTS DE
COMPATIBILITE DE FIXATION POUR LES ANTICORPS MONOCLONAUX
ANTI IL-1ss
ACM MARQUES
Figure img00280001
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<tb> ACM IMMOBILISES EN PHASE SOLIDE
Les tests de compatibilité de fixation ont été realisés comme décrit plus haut. Les cercles pleins indiquent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués.Pour clarifier la présentation, les Acm présentant le même type de fixation ont été groupés en quatre catégories (A a Dl. La sous-classe d'IgG de chaque Acm est men tionnée dans la dernière colonne.
Des surnageants de culture aussi bien que des fluides ascitiques ont été utilisés dans des essais lmmu- noenzymatiques par compétition impliquant des conjugués
IL-1-AChE comme traceurs. Dans la plupart des cas ( sauf en ce qui concerne les clones ss26 et ss54), des courbes standard ont pu être établies en utilisant l'IL-la et l'IL 113 recombinantes comme étalons. Lorsqu'elle est définie en termes de B/Bo = 50 %, la sensibilité de ces essais est comprise entre 4 et 100 ng/ml. Dans les meilleurs cas, la concentratlon minimale détectable de 1 ng/ml a pu être calculée. Tous les Acm se sont avérés être très spécifiques de l'interleukine contre laquelle ils avaient été dirigés car on nra pu mesurer qu'une réactivité croisée inexistante ou tres fable entre l'IL-1&alpha; et l'IL-1ss. On trouvera a titre indicatif dans le tableau III qu; va suivre, les caractéristiques de quelques-uns de ces essais par compétition pour l'IL-la, ainsi que les résultats obtenus avec des anticorps polyclonaux de mouton ou de lapin,
TABLEAU III :PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DES
ESSAIS IMMUNOENZYMATIQUES PAR CCMPETITION POUR L'IL-la EN
UTILISANT SOIT DES ANTICORPS POLYCLONAUX SOIT DES ANTICORPS
MONOCLONAUX ET DES CONJUGUES D'IL-la-AChE
Anticorps Dilution de Sensibilité *
spécifique l'anticorps spécifique (B/B0-50 , ng/ml)
Antisérum
polyclonal 1/5.10@ 15
de mouton
Antisérum
polyclonal 1/105 40
de lapin
Acm 39
(surnageant) 1/4000 6
Acm 260
(surnageant) l/l000 10
Acm 29
(surnageant) l/500 20
Acm 185
(surnageant) l/l000 100
* B/B0 = 50 % correspond à la dose qui induit
une diminution de 50 8 de la fixation du traceur
observée en l'absence de compétiteur.
La présente Invention a pour l'un de ses buts essentiels de aévelopper des essais lmmunométriques en deux sites aussi bien pour l'IL-la que pour l'IL-lss, en sorte qu'il convient de déterminer quelles sont les paires d'Acm qui pourraient se fixer simultanément à chaque interleukine. Ces études de complémentarité de fixation ont été réalisées à l'aide de tests lmmunométriques dans lesquels l'un des Acm était immobilisé sur la phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine.A ce stade, le marquage par la biotine a été choisi car il s'agit d'une méthode tout à fait simple qui permet le marquage d'un grand nombre d'Acm (plus de 40) en quelques minutes. En outre, l'utilisation subséquente d'un mélange d'avidine et d'AChE marquée par la biotine permet une détection sensible d'anticorps biotinylés immobilisés sur la phase solide.
Les tableaux I et II ci-dessus présentent les résultats de ces tests complémentaires pour l'IL-la et l'IL-1ss respectivement. Dans le cas de l'IL-la, on voit qu'il existe trois groupes d'Acm qui reconnaissent des épitopes qui se trouvent dans trois régions différentes des molécules d'IL-la. Ces groupes, qui ont été désignés par A, B et C, contiennent respectivement 10,25 et 1 anticorps monoclonaux. Tous les Acm d'un groupe présentent une fixation compatible avec tous les Acm des deux autres groupes, tandis qu ils ne se fixent pas simultanément entre eux ou avec des Acm du même groupe. Dans le cas de l'IL-lP;, la situation est moins claire.En fait, on observe quatre groupes diffXrents. Dans les deux premiers groupes (dénommés A et B, contenant respectivement 4 et 3 Acsi on observe un comportement logique, analogue à celui observé pour l'IL-la (cf. Tableau II). Le troisième groupe (C) contient deux Acm qui sont compatibles uniquement avec un
Acm des groupes A et B (ss 28 et ss 36 respectivement).
Enfin, le groupe D contient 2 Acm qui ne permettent l'immobilisation d'aucun des autres Acm en phase solide.
Après avoir déterminé tous les couples possibles d'Acm présentant une fixation compatible, il s'agit à présent de sélectionner pour chaque interleukine le couple présentant.
les propriétés optimales en vue de développer un essai immunométrique sensible, spécifique et fiable. Cette sélection doit être réalisée en utilisant des conjugues covalents A cm-AChE (et non des Acm marqués à la biotine) car ils permettent une détection plus sensible des interleukines. Dans le cas de l'IL-lss, comme il n'existait que 29 possibilités différentes, cette sélection a été facile à réaliser et il a été proposé de choisir de préparer les 9 conjugués Acm-AChE correspondants. Ceci s'est avéré cependant plus difficile dans le cas de l'IL-la car la préparation de 36 conjugués Acm-AChE aussi bien que la vérification des 570 possibilités différentes existantes représente un travail considérable.C'est la raison pour laquelle il a été procédé différemment : au cours d'une première étape, quelques conjugués Acm-AChE ont été préparés et ont été ensuite testés contre toutes les phases solides pertinentes. Au des resultats correspondants, les
Acm qui ont procuré les résultats les meilleurs (c 'est-à- dire la fixation la plus Importante de conjugués Acm-AChe pour une dose donnée d'interleukine) ont été marqués et on a poursuivi les tests avec eux en utilisant les Acm immobilisés correspondants. Ainsi, les anticorps a5, a29, r100, a147 (groupe A), al76, a3 (groupe B;, et &alpha;101 (groupe C) ont été sucessivement marqués et testés.
Ce processus a permis de mettre en évidence un petit nombre de couples qui permettent une détermination plus sensible de chaque IL-1. Pour l'IL-1&alpha;, les résultats les meilleurs ont eté obtenus en utilisant soit alO1 (en tant que phase solide ou traceur) ou des traceurs du groupe
A avec des phases solides du groupe B.Dans le cas de l'IL 1, un couple compcsé de ss79 comme phase sciide et de
B70-AChE comme traceur s'est avéré significativement supérieur à tous les autres couples. 'Une sélection finale du couple optImal a été réalisée en tenant compte non seulement de l'intensité du signal mais également d'autres critères incluant l'absence de réactivité croise avec d'autres Interleukines ou des substances apparentées, un taux de fixation non spécifique, une influence non spécifique exercée par les milieux blologiques (plasma ou sérum).Les critères de pecificité ne sont pas essentiels car tous les couples testés présentent une réactivité croisée très faible avec les autres interleukines (IL-la ou IL-1S et IL-2). Toutefols, la sélection de couples présentant une faible fixation non spécifique est importante car ceci a une influence critique sur la sensibilité du test. De même, il est nécessaire de minimiser les effets non spécifiques dus aux milieux biologiques afin de renforcer la validité des mesures réalisées dans ces milieux. Enfin, les~couples suivants ont été sélectionnés : a185 en phase solide + a29-AChE pour ILla et B79 en phase solide + R70-AChE pour IL-1ss.Dans le cas de l'IL-1ss, ce choix a été réalisé essentiellement parce que ce couple est caractérisé par une fixation non spécifique très faible et est très peu sensible aux effets non spécifiques. Cette dernière caractéristique est représentée à la figure annexée et le tableau IV résume les principales caractéristiques des tests de détection d'IL-la et d'IL-1 dans le cas d'une incubation d'une nuit à 40C et d'un processus simultané. Les deux essais semblent très sensibles car des concentrations minimales détectables inféreures a 4 pg/ml ont pu être calculées pour chaque interleukine en utilisant une période de 30 minutes pour la mesure enzymatique. Une sensibilité accrue est observée lorsque la réaction enzymatique (étape de révélation) dure plus longtemps. En pareil cas, des concentrations minimales détectables inférieures a 2 pg/ml peuvent etre obtenues (cf. tableau IV ci-après).
TABLEAU IV
CARACTERISTIQUES PRINCIPALES DES ESSAIS IMMUNOMETRIQUES POUR L'IL-1&alpha; et L"IL-1ss
REALISES AVEC DES COUPLES SELECTIONNES D'Acm SENSIBILITE * SPECIFICITE **
Fraction M.D.C. M.D.C.
Test non spécifioque pg/ml pg/ml IL-1&alpha; IL-1ss IL2
(% Totale activité) 30 mn 2 heures (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml)
IL-1&alpha; 0.03 3 1.5 - 2000 2000
IL-1ss 0.02 2 1 100 - 5000
Les résultats présentés dans ce Tableau ont été obtenus en utilisant le processus simultané et une réaction d'une nuit à + 4 C
* MDC concentration minimale détectable
** Dose d'interleukine produisant une fixation par traceur
significativement différente de la fixation non spécifique.
L'évolution des courbes étalons en fonction du temps dévolue à la mesure enzymatique est représentée à la figure 2 annexée.
Cette augmentation de sensibilité est accompagnée d'une augmentation de la précision de la mesure dans la partie inférieure de la courbe étalon, comme le montre la figure 4 qui présente l'évolution des "profils d'imprécision" en fonction du temps. Les meilleurs résultats (en termes de sensibilité) ont été obtenus en utilisant une immuno-réaction pendant une nuit à + 4:C toutefois, des courbes étalon excellentes ont été obtenues en utilisant des periodes de réaction de plus courte durée (de 3 à 5 heures à + 4-C). Dans tous les cas, on a observé des concentrations minimales détectables inférieures à 10 pg/m. -Ta réalisation des essais à la température amblante ou à 37 C n'a eu aucune incidènce sur leurs résultats.
B - MESURE DE L'IL-la ET DE L'IL-1ss DANS DES
MILIEUX DE CULTURE
La détermination des deux interleukines dans les surnageants de cultures stimulées a été réalisée à l'aide ae courbes étalons. I1 y a lieu d'observer que la présence de sérum ae veau foetal 10 % dans le milieu de culture a induit une diminution significative de la fixation non spécifique sans altérer la pente des courbes étalons.
Ces tests ont révélé que les essais permettent effectivement de détecter des substances lmmuno-réactives
IL-1-like dans les surnageants de cultures, l'apparition de cette immuno-réactivité étant en relation avec la stimulation des cellules. Un exemple typique est présenté à la figure 4 annexe cans laquelle on a dessiné, en fonction du temps, les variations des concentrations d'IL-la et d'IL-1ss amans les supernageants de leucocytes elutriés humains (monocytes, lymphocytes ou neutrophiles) stimulés par 5 g/ml de lipopolysaccharide.
Pour confirmer la validité des mesures effectuées, les mêmes échantillons ont été testés à l'aide d' un bio-essai basé sur la mesure de la libération de PGE2 par des fibroblastes stimulés aussi bien par l'IL-la que par l'IL-lss. Les courbes étalons correspondantes sont présentées à la figure 5 annexée. Les résultats obtenus, représentés à la figure 6, confirment qualitativement les résultats des mesures lmmunométriques, ce qui démontre la spécificité des immuno-essais.
L'identité entre la substance détectée dans les surnageants de culture (ou les extraits intracellulaires de cellules) et l'IL-1 recombinante utilisée pour établir les courbes-étalons est confirmée par trois types d'expérim'entations de contrôle. Le premier est représenté par les dilutions d'échantillons dans du milieu de culture, lesquelles ont donné des courbes de dilution parallèles aux courbes-étalons. C'est ce que montre le tableau V ci-apres, qui présente les résultats de deux différents tests reiatifs à l'IL-la et à l'IL-1B, réalisés à différentes dilutions. Des résultats similaires ont été obtenus avec tous les échantillons testes.
TABLEAU U ' DEMONSTRATION DU PARALLELISME ENTRE
LA COURBE ETALON ET LA COURBE DE DILUTION DES ECHANTILLONS
ECHANTILLON DILUTION IL1 (pg/ml) IL1 (pg/ml)
1/1 - 366
1/2 1600 340
A 1/4 1760 304
1/8 1782
l/2 940 532
1/4 892 564
B 1/8 960 576
1/16 992 480
Les échantillons A et B ont été dilués comme indiqué dans le tableau V et testés pour y détecter l'IL-la et l'IL-1 par EIA. Les dilutions aussi bien que la courbe étalon ont été réalisées dans du milieu de culture (RPMI + 10 % de sérum de veau foetal).Les données brutes ont été multipliées par le facteur de dilution avant d'être énumérées dans le Tableau, afin de faire apparaître clairement le parallélisme entre la courbe-étalon et les courbes de dilution des échantillons.
Echantillon A surnageant de macrophages alvéolaires dans une culture stimulée par TNF&alpha;.
Echantillon B : extrait intracellulaire de macrophages alvéolaires en culture.
Ces résultats sont également confirmés par des expériences de récupération qui démontrent que des quantités connues d'IL-1 recombinante introduites dans des échantillons peuvent être effectivement mesurées. Pendant la totalité des expérimentations réalisées dans des milieux de culture, le taux de récupération était compris entre 86 % et 93 %.
La troisième expérimentation a consisté en l'analyse de surnageant de culture après fractionnement par chromatographie sur tamis moléculaire ; cette analyse montre que la substance lmmuno-réactive est éluée sous la forme d'un pic unique homogène, comme déjà indiqué plus haut, qui correspond exactement au pic observé avec les interleukines recombinantes.C'est ce que montre la figure 7 où sont présentés différents profils chromatographiques obtenus pour des surnageants de macrophages alvéolaires stimulés, aussi bien dans le test de détection de l'IL-la que dans le test de détection de 1'IL-1B. Des résultats similaires ont été observés avec d'autres surnageants de culture ou avec des extraits intracellulaires. Prlses dans leur ensemble, toutes ces données indiquent nettement que les deux tests permettent effectivement une détermination quantitative des Interleukines 1 dans ces milieux.
C - MESURE DE L'IL-la ET DE L'IL-1B DANS LE
PLASMA ET LE SERUM
En utilisant ces EIA spécifiques, des tests de détermination des taux d'IL-la et d'IL-lss dans le plasma ou le sérum de donneurs sains ou de patients souffrant de troubles rhumatoïdes, ont été réalisés. Ces mesures ont été effectuées, comme indiqué plus haut, en présence d'IgG de souris afin de neutraliser les anticorps IgG humains antisouris éventuellement présents dans ces fluides. Cette précaution est tout à fait nécessaire car d'autres expérimentations ont montré que les mesures réalisées en l'absence d'IgG murines pourraient conduire à une surestlmation importante des taux d'IL-1, spécialement dans les fluides de patients atteints de troubles rhumatoides.
Des tests réalisés dans le plasma ou le sérum de volontaires sains ont révélé qu'il est possible de sélectionner des fluides ne contenant pas de quantités détectables d'IL-la ou d'IL-1ss. Ces plasmas ou ces sérums réunis peuvent être utilisés comme diluants pour établir des courbes-étalons appropriées. L'établissement de ces courbes a permis de mesurer les taux d'IL-1 dans ces fluides et de détecter des concentrations d'interleukines comprises entre 5 pg/ml et quelques ng/ml aussi bien chez des donneurs apparemment sains que chez des patients.Bien que les résultats representés à la figure 6 qui donnent un profil typique obtenu avec un plasma ne soient pas satisfaisants puisque la substance immuno-réactive est éluée à un poids moléculaire de beaucoup supérieur à celui qui correspond à l'IL-1 recombinante ( > 500 000) néanmoins, ces tests de détermination des IL-1 conviennent également aux dosages dars le plasma et le sérum.
EXEMPLE 2
L'activité inhibitrice exercee par les anticorps monoclonaux anti-IL-l conformes à l'invention, à l'égard de l'activité biologique de l'IL-1, été mise en évidence à l'aide de deux séries de tests
1. Les tests d'inhibition de l'induction du récepteur de l'IL-2.
De tels tests ont été décrits notamment par
KAYE et al., JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1984), 133, N 3, pages 1339-1345
2. Les tests d'inhibition de la liaison des -1 aux cellules T.
Des tests de ce type sont décrits, notamment, dans - LOWENTHAL et al., J. EXP. MED. (1986). 164, page 1060, et - SECKINGER et al., THE JOURNAL or IMMUNOLOGY (1987), 139,
pages 1546-1549.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se lImite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (15)

REVENDICATIONS
1.- Anticorps monoclonaux spécifiques des lnterleukines la et 1ss, caractérisés en ce qu'iis résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de rongeurs, et plus particulièrement de souris, par des lnterieuklnes-la ou -1ss selon le cas, en ce qu'ils reconnaissent spéci fiquement les interleukines-1&alpha; et -1ss naturelles et recombinantes et les conjugués interleukine-1&alpha;/acétyl- cholinestérase (AchE) et en ce qu'ils ne présentent pratiquement pas de réaction croisée ( < 0,01 %) entre les deux 11-1.
Anticorps monoclonaux selon la revendication 1 specifiques de l'interleukine-1&alpha;, caractérisés en ce qu'ils se composent de trols groupes qui reconnaissent trois régions distinctes de l'interleukine- a, qui représentent tros épitoges de chacun de ces groupes, en ce que tous les anticorps d'un groupe sont aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes et en ce qu'ils ne sont pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe.
3.- Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, spécifiques de l'interleukine-1ss, caractérisés en ce qu'ils se composent de quatre groupes dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des antlcorps anti-IL-la, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps ae chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes en ce qu'ils ne se lient pas à l'IL-1ss native recombinante.
reconnaissent une inter-leukine-1ss modifiée, et reagissent avec un conjugué IL-1ss-AChE.
4.-. Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils se lient à des conjugués covalents préparés à partir de fragments Fab' des anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines IL-la et IL-lss et notamment à des conjugués
Fab'-AChE présentant une activité spécifique très élevée.
5.- Conjugués d'interleukine -la ou -1 et d' acétylcholinestérase.
6.- Conjugués d'acétylcholinestérase et d'anticorps monoclonaux anti-IL-la ou -lss ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'.
7.- Procédé de production d'anticorps monoclonaux spécifiques des interleukines-la et -lss, caractérise en ce que des mammifères tels que, notamment, des rongeurs, et plus particulièrement des souris sont immunisés par des injections appropriées d'interleukine-1&alpha;; ou -lB, puis des cellules de rates des mammifères immunisés sont fusionnées, selon une technique appropriée, avec des cellules de myélome de mammifères de la même espèce, les hybridomes résultants sont mis en culture et ceux dans les surnageants desquels ont été détectés des anticorps anti lnterleuklne-la ou -lss. selon le cas, sont sous-clonés pour obtenir des lignees cellulaires secrétant des anticorps monoclonaux anti-L-la ou anti-IL-lB, selon l'interleukine contre laquelle ils ont été dirigés.
8.- Procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux ant1-interleukine-la ou -lB obtenus par ie procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F(ab')2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel, notamment, que la B-mercaptoéthylamine (BMEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.
9.- Procédé de production des conjugués d'interleukine-1&alpha; ou -1ss et d'acétylcholinestérase selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol est introduit dans l'lnterleukine-la ou -lB, selon le cas, et au moins un groupe maléimido est introduit dans l'AChE, puis l'interleukine thiolée est couplée à l'AChe portant un groupe maléimido, par l'intermédiaire d'un agent de couplage hétérobifonctionnel approprié tel que, notamment, le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC).
10.- Procédé de production de conjugues d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-la ou anti-Il-lB et de conjugués d'AChE et de fragments desdits anticorps monoclonaux, notamment de fragments Fab', caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturellement présent dans l'anticorps ou l'un de ses fragments, est couplé à au moins un groupe maléimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-succinimide.
11.- Test immuncenzymatique hauteent spécifique et sensible, de détection ae l'IL-la et de l'IL1ss dans des@ surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides blologiques, caracterise en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-la ou anti-IL-1ss approprié, utilisé comme premier anticorps, et des IgG portées par un support approprié utilisées comme second antIcorps, sont mis en contact avec des conjugués d'IL-1-AChE, qui Jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-la ou -lss, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
12.- Test enzymo-immunométrique hautement spécifique et sensible, de détection de '' IL-la et de l'IL- 1ss dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérise en ce que des anticorps monoclonaux anti-IL-la et/ou anti-IL-1ss sont mis en contact avec de l'IL-1&alpha; ou -lB et avec du conjugué Acm-AChE. après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
13.- Test selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'IL-1&alpha; ou -1ss est aJoutée à l'anticorps simultanément avec le conJugue Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec l'IL-la ou -lss.
14.- Test selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'IL-1&alpha; ou -lss est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps, puis le conjugué
Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité AChe est révélée par tous moyens appropriés.
15.- K;t pour la réalisation des tests enzymoimmunométriques selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend
une première série de plaques de microtitration revêtues d'un anticorps constitué par des
IgG de lapin anti-souris
une seconde serie de plaques de microtitration de mêmes dimensions et en nombre egal à celui de la première série
au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-la et/ou nticorps monoclonal anti-IL-1ss
au moins- un flacon contenant des conjugués d'IL-1&alpha;; et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-1ss et d'AChE
des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE
des quantités ou doses appropriées d'IL-la et/ou d'IL-lss.
16.- Agents à visées thérapeutiques caractérisés en ce qu'ils sont const;tués par, cu comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux antl-IL-la et/ou des anticorps anti-IL-lB et/ou leurs fragments. seul5 ou conjugués ou hybridés ou associés, avec d'autres substances.
17.- Agents de diagnostic aptes à être m15 en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-la et/ou des anticorps anti-IL-1ss ou leurs fragments, associés à Un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'antIcorps, et/ou marqués par des marqueurs stables cu radioactifs.
18.- Hybridomes mis en oeuvre pour la préparation des anticorps monoclonaux anti-IL-la et anti
IL-1ss selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, déposés auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE
MICROQRGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 8 Décembre 1988 et identifiés dans cette Collection sous les N I-823, I-824, I-825, I-826, I-827, I-828,
I-829.
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