CA1063028A - Compositions cosmetiques a base d'enzymes - Google Patents

Abstract

PRECIS DE LA DIVULGATION :
L'invention a pour objet en cosmétologie des enzymes superoxyde-dismutases extraites de bactéries, de champignons ou du sang et leur utilisation dans la préparation de compositions oosmétiques pour la peau et les cheveux. Lesdites enzymes jouent le role de protecteurs des substances kératiniques vivan-tes que constituent la peau et les cheveux, ce rôle d'une part consiste à maintenir l'intégrité de la structure kératinique naturelle de la peau ou des cheveux, d'autre part à maintenir ou améliorer les qualités de souplesse, d'élasticité et de dou-ceur de la peau, et aussi à protéger la peau contre les effets nocifs des rayonnements ultra-violets.

Description

~063028 ~ La présente invention a pour objet l'application en COSmétologie de certaines enzymes, ainsi que des compositions cosmétiques contenant ces enzymes.
L'invention a plus précisément pour objet l'application en cosmétologie des enzymes superoxyde-dismutases et en particu-lier l'utilisation de ces enzymes dans la préparation de compo-sitions cosmétiques pour la peau et les cheveux.
; On sait ~ue les superoxyde-dismutases sont des enzymes capables d'induire la dismutation des ions superoxyde, suivant la réaction:

2 2 + 2H+ - H22 + 2 On a déjà décrit des superoxyde-dismutases extraites d'érythrocyte de boeuf tMarkovitz, J. Biol~ Chem. 234, p 40, 1959) et des superoxyde-dismutases extraites d'Escherichia coli (Keele et Fridovich~,i J. Biol. Chem., 245, p 6176, 1970).
Dans le brevet français No. 73.13670 sont décrites de nouvelles superoxyde-dismutases extraites de souches bactériennes marines, ainsi que leur procédé
de préparation. La préparation de ces nouvelles en~ymes résulte des recherches de l'inventeur désigné dans le brevet français No. 73.13670, Monsieur Adolf Michael Michelson, et ne constitue pas l'objet de la présente demande.
Ce procédé consiste `a disperser dans l'eau et à main-tenir à environ 4C une culture bactérienne marine, ~ ajuster ensuite le p~ du milieu à 6,5-~, et de préférence à 7 environ, à
porter le mélange ~ 50-60C pendant quelques minutes, à le refroi-dir ~ environ 4C et, à cette température, ~ centrifuger, à
effectuer sur la fraction surnageante une première précipitation fra~tionnée au moyen de sels neutres, à centri~uger à nouveau et ~ effectuer sur la fraction surnageante une seconde précipita-` tion franctionnée aux sels neutres et à centrifuger. En variante, on peut compléter ce procédé par une étape de purification consis-10630;28 tant avantageusement en une dissolution dans du tampon phosphate à pH 7,~ du précipité recueilli dans la dernière centrifugation et en une dialyse de la solution ainsi obtenue, contre le même tampon ; phosphate de pH 7,~. On peut également purifier l'enzyme extrai-te de la culture bactérienne marine, après reprise du produit de la dernière centrifugation avec du tampon phosphate pH 7,~, et ~ dialyse contre ce même tampon, par une chromatographie qui est - de préférence une chromatographie sur colonne et en particulier une chromatographie sur trois colonnes successives qui sont respectivement: une premiare colonne de gel de Sephadex G 200, une colonne de diéthylaminoéthyl Sephadex*(DEAE-Sephadex*A-50) et une seconde colonne de gel de Sephadex* G 200. Pour ajuster à 6,5-~ le pH de la dispersion des bacbéries dans l'eau, ce qui constitue la première étape dudit procédé, on utilise par exem-ple de l'ammoniaque 2N et on ajoute ensuite du chlorure de potas-sium, de préférence du KCl 3M.
On porte ensuite le mél~nge ainsi constitué à une tem-pérature de 50 à 60C , pendant quelques minutes seulement et de préférence pendant 3 à 4 minutes. On refroidit alors le mélange à L~C environ, température à laquelle on effectue toutes les étapes suivantes du procédé selon l'invention.
Chacune des précipitations fractionnées constituant des étapes de ce procédé est réalisée, comme indiqué plus haut au moyen de sels neutres en solution aqueuse, et de préférence au moyen de sulfate d'ammonium.
Dans un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé
selon l'invention, on réalise la première précipitation fraction-née au moyen de sulfate d'ammonium ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique traité soit ainsi amené à
une concentration finale de 30 à 35% environ de la saturation `~ à ~C. Il faut toutefois noter que l'on peut remplacer pour tout ou partie le sulfate d'ammonium par un ou plusieurs autres sels ; * marque de commerce.

appropriés et la quantité totale desdits sels est alors une quan-tité équivalente et appropriée pour ~u'elle amène le mélange à
une concentration finale d'environ 30 à 35 % de la saturation à 4C.
En variante, on peut utiliser un système d'ultra~iltxa-tion, tel que par exemple un sys-tème mettant en oeuvre un dispo-sitif poreux tel que des tubes poreux, et en particulier un sys-tème utilisant un premier tube poreux retenant, en les concentrant, les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à ~0 000 et un seoond tube poreux laissant passer les molécules d'enzyme désirées mais retenant les bactéries res-tantes, procurant ainsi un extrait enzymatique stérile.
De même, on réalise avantageusement la seconde préci-; pitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium (~H4)2SOq ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique traité soit ainsi amené à une concentration finale de 70 à 75 %
environ de la saturation à 4C.
~ es superoxydes-dismutases obtenues à partir de diffé-rentes souches baotériennes marines par le procédé décrit oi-dessus sont toutes des superoxyde-dismutases comprenant du fer non hématinique, alors que les enzymes présentant une activité
` de superoxyde-dismutaseq qui sont décrites dans la littérature mentionnée précédemment, c'est-à-dire l'érythrocupréine et l'enzyme extraite d'Escherichia coli, comportent des cations divalents qui sont respectivement le cuivre et le zinc pour la première, et le manganèse pour la seconde.
~ a recherche de la présence d'un métal dans les superoxyde-dismutases considérées peut être réalisée par une ~ analyse au spectrographe d'absorption atomique.
1 30 On peut également effectuer un test colorimétrique qui, dans le cas présent, consiste à colorer un gel de migration électrophorétique d'une préparation de l'enzyme au moyen d'un colorant spécifique du fe:r ~erreux Fe2~, la bathophénanthroline, eventuellement en présence d'un réducteur tel que l'hydrazine.
Pour ce test, on coupe le gel en deux dans le sens de la lon-gueur et on place une des deux parties dans du bleu de coomassie, et ltautre partie dans de la bathophénanthroline. ~e test est positif si l'on obtient un anneau rose dans le dernier cas, au niveau de la bande protéique. Or, comme il est connu, une telle apparition d'un anneau rosé peut être considérée com~e l'indica-tion de la présence de fer ferxeux, ici dans la protéine ~0 superoxyde-dismutase.
On peut aussi utiliser du fer radioactif pour marquer la protéine et en déterminer la stoechiométrie en ce qui concerne le cation métallique divalent présent.
Les superoxyde-dismutases extraites de cellules bac-tériennes marines contiennent du fer non hématinique, elles ont un poids moléculaire de 40 000 ~ 2500 environ, et un point isoélectrique dç 4 à 7 environ; elles présentent un maximum -d'activité enzymatique pour un pH de 8,5 à 10 environ, avec un optimum à pH 9,5 environ.
On peut maintenir l'enzyme active sur une longue pé-riode de temps en la conservant dans une solution à 70-80 % de sulfate neutre d'ammonlum à 4~.
Pour mesurer l'activité des superoxyde-dismutases ~ produites selon l'invention, pn peut évaluer l'inhibition par ces dernières de la réaction de chimioluminescence provoquée par le système enzy~atique oxygène/hypoxanthine/xanthineoxydase/lu-- minol ainsi qu'on le montrera plus loin. Ce système enzymatique réagissant provoque la libération dlions 2 qui sont aptes à don-ner une réaction de chimioluminescence avec le luminol. L'addi-tion de superoxyde-di-smutases à ce système capte en effet des ions 2 et provoque ainsi une diminution de l'intensite de la lumière émlse dans cette réaction.

~ - ' 1063028 ~ es superoxyde-dismutas~s catalysent en effet la réac-tion 2 2 + 2 H ~ H202 ~ 2 Si l'on utilise alors comme substrats dans ce-tte réac-tion les ions superoxyde produits par la réaction enzymatique mettant en jeu xantine-oxydase et xanthine ou hypoxan1;hine, les ions superoxyde ainsi produits son-t très instables et émettent spontanément de la lumière. Cette dernière est cependant trop faible et les mesures ne pourraient avoir une reproductibilité
suffisante.
C'est pourquoi on complète en pratique le dispositif analytique en utilisant, pour mettre en évidence la quantité
~ d'ions superoxyde formés, une substance chimioluminescente, le ; luminol ou 5-amino-2,3-dihydro~ -phtalazinedione.

Luminol + O ~ émission de lumière + produit 2 d'oxydation Selon une technique décrite dans le brevet français No. 73.13670, on mesure l'activité des superoxyde-dismutases à l'aide de systèmes producteurs d'ions superoxyde, systèmes catalytique~ ~usceptibles de promouvoir l'oxydation du luminol constitués d'ions ~e2+, ~i2+,ou Co2 dans des solutions aqueuses d'oxygène moléculaire en présence de certains ligan~s.
~a superoxyde-dismutase introduite dans le système diminue la quantité d'ions 2 et par conséquént la production de lumière.
On effectue le dosage comme suit:
On utilise le mélange réactionnel ci-après:
Luminol 1o-3M 0,3 ml Tampon phosphate 10 3M pH 7;8 0,3 ml EDTA - 1o-3M 0,3 ml Eau qsp 2 ml + 50 ~1 de xanthine-oxydase (1,05 ml d'une solution à

. .
c ~;

~ 1063028 1 mg/rnl cle xanthine-oxydase).
On place ce mélange dans une cuve argentée, devant un photomultiplicateur On initie la réaction en injectant dans la cuve le substrat: 1 ml d'une solution contenant 0,3 ~ mole d'hypo-xanthine.
Il se pxoduit alors une émission d'un flux de photons, qui donne naissance, sous l'action du photomul-tiplicateur, à un courant dont l'intensité est mesurée par un picoampèremètre et enregi~trée. Si l'on introduit dans le mélange réactionnel 5 ~1 de la superoxyde-dismutase à évaluer, avant l'initiation de la réaction, on réalise une inhibition de cette émission de lumière.
On définit alors arbitrairement l'unité d'enzyme superoxyde-dismu-tase comme étant la quantité de cette enzyme qui provoque une inhibition de 50 % de l'émission de lumière.
Cette unité est dont indépendante de la souroe d'enzyme et de l'enzyme superoxyde-dismutase utilisée.
On notera cependant que l'on peut égalemen-t évaluer l'activité des superoxyde-dismutases selon l'invention en p~o-voquant l'inhibition de la même réaction que celle mentionnée ZO plus haut, directement en injectant 1 ml d'une solution d'ions 2 ~ préparée par réduction électrochimique (J.M. Cord, I. ~ri-dovitch, J.B.C. vol. 244, 25 (1969), pp. 6049-6055), dans 2 ml d'une solution contenant 0,5 ~ mole de luminol et 0,17 millimole de tampon phosphate pH 7,8.
Dans certains cas, il peut être avantageux, pour appré-cier sur une période raisonnable de temps l'efficacité des supe-roxyde-dismutases dans l'application considérée, d'activer l'oxy-dation des matières. Pour ce faire, on opère en pratique soit à
l'aide de flavines réduites par irradiation à 365 m~, soit au moyen d'un système enzymatique, par exemple le système xanthine-oxydase/hypoxanthine/oxygène.
~orsque l'on accélère l'oxydation par les flavines . -- 1063028 reduites, on irradie une solution de flavine mononucléotide (FMN) 10 4 M d'ED~A 10 3M et de tampon phosphate 10 2M pH 7,0 dans une cuve en quartz placée dans un spec-trofluorimètre Zeiss, équipé d'un filtre M 365; on suit la photoréduction, qui se produit rapidement, en suivant la diminution de l'intensité de fluorescence émise à 530 m~.
En fin de réduction, on reprend les solutions pour les agiter vigoureusement en présence d'air, obtenant ainsi leur reoxydation complete, ce qui produit des ions superoxude 2-1~ Il est à noter que ce cycle de réduction-réoxydation des flavi-nes peut être répé-té plusieurs fois, sans que la structure du flavine mononucléotide soit altérée. ~n variante,on peut procé-der aux irradiations à 365 m~, à l'aide d'une lampe ~ 100 A four-nie par Ultraviolet Products Inc. sur des solutions telles que décrites ci-dessus agitées en continu.
~orsque l'on désire accélérer l'oxydation par le sys-tème enzymatique hypoxanthine/xanthine-oxydase/oxygène, il est avantageux d'utiliser une solution contenant 0,3 ml d'hypoxan-thine 10 3M, 0,3 ml de tampon phosphate 1 M pH 7,8, 0,3 ml d'~DTA 10 3M, 2,1 ml d'eau et 0,05 ml d'une solution de xanthine oxydase à 1 mg/ml.
On a maintenant découvert que les superoxyde-dismutases présentent des propriétés de protection de la peau et du cheveu qui permettent de les utiliser en cosmétologie.
~es superoxyde-dismutases permettent notamment de pro-teger la peau et les cheveux en main-tenant l'intcgritc de la structure kératinique naturelle. Il est possible que cette pro-tection soit due à l'inhibition de phénomènes d'oxydation de la kéra-tine. ~es superoxyde-dismutases améliorent la respira-tion cellulaire cutanée e-t maintiennent ou améliorent les qualités de la peau: douceur au toucher, souplesse e-t élasticitc. ~eur prcsence dans des cor~po itions pour cheveux permet aussi le * marque de commerce.

maintien ou ]'a~élioration ~e l'état du cuir chevelu, tout en pro-tégeant également la peau des mains de la personne qui applique ces compositions.
En outre, on a découvert que les superoxyde-dismutases protègent la peau contre les phénomènes d~inflam~ation causés par les rayonnèments ultra-violets.
Grace à ces différentes propriétés, les superoxyde-dismutases sont utilisables dans des compositions co~métiques pour la peau ou pour les cheveux.
~n raison de leurs proprietés particulières d'oxydo-réduction, les supero~yde-dismutases jouent en outre dans les compositions cosmétiques un rôle de protection et de stabilisa-tion, car elles empêchent les phénomènes d'oxydation ou d'auto-oxydation qui entra~nent la dégradation de certains constituants des compositions cosmétiques. Par exemple elles emp~chent le ranoissement des corps gras présents dans de nombreuses formula-tions cosmétiques; et plus généralement elles inhibent la dégra-dation de tous les corps oxydables ou auto-oxydables présents dans la composition.
On a découvert notamment que les superoxyde-dismutases peuvent inhiber l'oxydation de certains composés, fortement oxy-dables, avant leur utilisation, en particulier:
a) certains composés de coloration ou précurseurs de colorants utilisés dar~s les teintures d~oxydation développées soit par un agent oxydant habituellemen~ utilisé (eau oxygéné, persul-- fate, peroxyde d'urée, sels métalliques, et les autres) soit par l'oxygène de l~air.
Ces composés de coloration sont des bases, des cou-pleurs ou des leucodérivés, et notamment:
- certains dérivés de l'orthoaminophénol tels que dé-crits dans le brevet français No. 1.374.983 et son addition No. 84.324.

.1063028 - certains dérivés du dihydroxy-5~6 indole et composés aminés apparentes, par exemple cevx décrits dans les brevets français Nos. 1.1 ~3.594, 1.166.172 et 1,264.707;
- certains leucodérivés tels que décrits dans les brevets français 2.056.799, 2.174.473.
- certaines bases qui ont été décrites dans les bre- -vets français 1.473.843, 2.017.995, 2.016.123.
b) certains composés réduc-teurs utilisés pour la défor-mation permanente des cheveux, par exemple sulfite~ alcalin~, mercaptans et dérivés, notamment ceux revendiqués dans les bre-~ets français 1.175.560 et 2.005.648.
En l'absence de superoxyde-dismutase, l'oxydation du sulfite conduit, dans ce cas, à l'anion radical superoxyde, selon la réaction suivante:

3 2 ~ 2 2 ~ ~ S03.
~ 'irradiation des bases organiques, notamment les ami-nes tertiaires telles que la triéthanolamine, utiliséeæ pour la neutralisation des compositions cosmétiques contenant des résines acide~ (par exemple des résines carboxyvinyliques du type Carbo-pol marque de commerce ou du type acétate de vinyle - acide cro-tonique, ou des résines contenant des motifs anhydride maléique du type Gantrez marque de commerce), favorise en présence d'oxy-gène, la formation d'ions superoxyde. ~'addition de superox~Tde-dismutases permet la destruction de ces ions, et on évite ai~si les réactions d'oxydation provoquées par ces ions.
~ 'oxyde de titane ou l'oxyde de zinc, qui sont utilisés dans de nombreuses compositions cosmétiques, initient des réac-tions d'oxydation en formant des ions superoxydes par irradiation.
` ~a présence de superoxyde-dismutases permet d'éviter ces oxydations.
~ a présente invention a pour objet l'application en cosmétologie des enzymes superoxydes-dismu-tases.

_ g _ -` 10630Z8 Cette application est principalement caractérisée par le fait que l'on realise des compositions hygi~niques ou cosmé-tiques, pour la peau ou pour les cheveux, contenant lesdites enzymes.
Dans l'application de l'invention, les enY,ymes super-oxydes-dismutases peuvent jouer no-tamment le r81e de protecteurs des substances kérati.niques vivantes ~ue constituent la peau et le~ cheveux. Ce rôle pro-tecteur consiste d'une part ~ maintenir l'intégrité de la structure kératinique naturelle de la peau du cuir chevelu ou de3 cheveux, soit à titre préventif, soit pour en arrêter la dégradation, d'autre part à maintenir ou améliorer les qualités de la peau ou du cuir chevelu (douceur, souplesse, élasticité), et aussi à protéger la peau contre les effets no-cifs (notamment les effets inflammatoires) à l'origine de cer-taines réactions des rayonnements ultra-violets.
Dans l'application selon l'invention, les superoxyde-dismutases peuvent également jouer le rôle de protecteurs de substances oxydables ou auto-oxydables présentes dan.~ les com-positions cosmétiques.
C'est ainsi que les superoxyde-dismutases peuvent être incorporées dans des formules con-tenant des composés for-tement auto-oxydables pour protéger contre l'oxydation lesdites for~ules:
- soit pendant leur conservation, - soit pendant leur mise en oeuvre au con-tact des fibres kératiniques et/ou de la peau, même si une étape ulté-rieure d'o2ydation est nécessaire.
On peut citer, en particulier, la conservation et la répartition sur cheveux des compositions tinctoriales (composi-tions de teinture ou shampooing colorant) à base de composés de la p.phénylène diamine et de ses dérivés, d'ortho-aminophénols (eventuellement en présence de colorants directs) afin d'éviter l'auto-oxydation prcma-turee conduisant à une mauvaise péné-tra-tion _ 10 --~--.~

i 10630;~8 des pigments dan~ la fibre~
Il s'agit dans ce dernier cas d'empêcher temporaire-ment, et donc de retarder, ce phénomène d'auto-oxydation pendant l'utilisation de la composition.
De façon analogue, l'application des superoxyde-dismu-tases, selon l'invention, permet la protection de composé du type leucodérivés et dihydroxy indoles avant le développement ultime de la coloration. Elle permet également la protection des dérivés réducteurs sulfhydrylés - (lors de leur conservation et de leur mise en oeuvre) - utilisés dans la première étape de la déformation permanente des fibres kératiniques.
~'invention a également pour objet des compositions hygiéniques ou cosmétiques pour la peau ou pour les cheveux caractérisées par le fait qu'elles renferment au moins une enzyme superoxyde-dismutase, dans un excipient approprié.
~'invention a en outre pour objet un procédé de trai-tement oosmétique caractérisé par le fait que l'on applique sur ; les cheveux ou sur la peau au moins une enzyme superoxyde-dis-mutase.
~es enzymes superoxyde-dismutases utilisables selon l'invention peu~ent être d'origine quelconque, animale, bacté-rienne ou végétale.
Parmi les superoxyde-dismutases utilisables selon l'invention, on citera notamment, sans que cette énu~ération soit limitative, celles extraites de bactéries, celles extraites de champignons ou celles extraites du sang.
Parmi les exemples de superoxyde-dismutases extraites de bactéries on citera en particulier celles extraites d'Esche-richia coli; parmi les superoxyde-dismutases extraites de cham-pi~nons on citera en particulier celles extraites de Pleurotus olearius; parmi les superoxyde-dismutases extraites du sang, on citera en particulier les érythrocupréines.

_ 11 -. ~063028 On peut citer égalemen- les superoxyde-dismutases extraites de souches bactériennes marines, telles que par exemple des souches de Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi ou Photobactérium sepia.
Parmi les diverses souches utilisables, on peut citer les souches de Photobactérium phosphoreum No. ATCC 11040, de Photobactérium leiognathi ~o. ATCC 25521, de Photobactérium sepia No. A~CC 15709, d'Escherichia coli No. A~ac 15224 et de Yleurotus olearius Gillet (~aboratoire de Cryp~ogamie de Paris).
~es superoxyde-dismu~ases extraites de souches bacté-riennes marines peuvent être pré:arées selon le procédé décrit dans le brevet francais No. 73.13670. Ce procédé a ~té
rappelé ci-dessus.
Les compositions pour la peau de l'invention sont notamment des solutions du type lotions; des émulsions de con-sistance liquide ou semi-liquide du type laits, obtenues par dispersion d~ne phase grasse dans une phase aqueuse ou inverse-ment; ou des suspensions ou émulsions de consistance molle du type crèmes ou gels.
Ces compositions sont preparées selon les methodes usuelles. Elles constituent notamment des crèmes de nettoyage, de protection ou de soins pour le visage, pour les mains ou pour le corps, (par exemple crèmes de jour, crèmes de nuit, crèmes démaquillantes, crèmes fond de teint, crèmes anti-solaires), des fonds de teint fluides, des laits de démaquillage, des laits corporels de protection ou de soins, des laits anti-solaires;
des lotions de nettoyage, des lotions anti-solaires, des lotions de bronzage artificiel, des compositions pour bain ou des compo-si-tions désodorisantes contenant un agent bactéricide.
~es compositions pour la peau selon l'invention peuvent ~galement consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.

~063028 ~ es com~ositions pou~ la peau qui sont de nature ~luide peuvent etre présentées sous forme de bombe aérosol contenant également un propulseur sous pression.
~ es compositions pour la peau ~elon l'invention contiennent, outre les superoxyde-dismutases, des ingrédients actifs ou excipien~s utilisés de façon usuelle dans les formula-tions mentionnées ci-dessus, tels que des tensio-actifs, des colorants, des parfums, des agents conservateur35 des émulsion-nantst de~ véhicules liquides tels que l'eau, des corps gras tels que huiles naturelles ou synthétiques destinées à constituer la phase grasse des laits ou des cxèmes, des résines du type carboxyvinylique ou anhydride maléique neutralisés par des amines tertiaires et notamment par des aminoalcools tels que la triétha-nolamine et les autres. ~es composés destinés à constituer une phase grasse sont par exemple, l'huile d'amande douce, l'huile d~avocat, l'huile d~olive des esters d'acides gras comme la - stéarine, le monostéarate de glycérine ou l~huile de Purcellin, les palmitates d~éthyle ou d'isopropyle, les myristates d'alkyle tels que les myristates de propyle, de butyle ou de cétyle. G~
peut en outre ajouter des alcools gras comme l'alcool cétylique, des alcools gras polyoxyéthylénés, ou des cires telles que par exemple la cire d'abeille, des ciressynthétiques, ou les autres.
~ es compositions pour cheveux selon l'invention peuvent 8tre présentées sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou ; hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, ou encore sous forme de bombes aérosols contenant également agent propulseur sous pression.
Elles renferment les superoxyde-dismutases soit à titre d'ingrédient actif principal, soit à titre de protecteur contre l'oxydation des autres ingrédients.
Outxe les ingrédients actifs classiques, elles peuvent renfermer divers adjuvants habituellement présents dans ces compo-1063~28 sitions pour cheveux par exemple des véhicules liquides ou sous~orme de gels, des parfums, des colorants, des agents conserva-teurs, des agents séquestrants, des agents épaississants, et les autres.
Elles constituent par exemple des shampooings, des lotions de mise en plis, des lotions traitantes, des crèmes ou des gels coi~fants, des compositions de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restruoturantes, de8 composi~io~s de per~anente (notamment des compositions pour le premier temps d'une perma-nente), et les autres.
~es compositions de l'invention sont par exemple:
- des shampooings contenant, outre une superoxyde dismutase, un détergent cationique, anionique ou non ionique;
- des compositions de teinture y compris des shampooings colorants, qui contiennent des colorants ou des précurseurs de oolorants tels que ceux déjà mentionnés précédemment par exemple sul~ate de m-diaminoanisol, o-,m- ou p-aminophénol, nitropara-phénylènediamine, paraphénylène-dia~ine, p-toluè~ediamine, 5,6-dihydroxy indole, et les autres;
- des compositions pour le premier temps (temps de réduction) d'une déformation permanente aes cheveux, contenant des dérivés réducteurs tels que mercaptane, sulfites, et les ~ autres.
; Il convient de remarquer que les compositions cosméti-ques selon l'invention sont aussi bien des compositions pretes à l'emploi que des concentrés devant être dilués avant l'utili-sation. ~es compositions pouvant être présentées sous forme de concentrés sont par exemple des shampooings ou des compositions pour bains. ~es compositions de l'invention ne sont pas limitées à un domaine particulier de concentration en superoxyde-dismutases.
On peut cependant indiquer que généralement les compo-sitions prêtes à l'emploi renferme~t de 0 01 ~ à 5 % en poids, et notamment de 0,05 à 1 % en poids, de superoxyde dismutase.
Dans le cas où l'ingrédient oxy~able à protéger æubit ~e décomposition accélérée en présence de fibres kératiniques et/ou de la peau, la superoxyde-dismutase peu-t être conservée seule, en solution aqueuse diluée ou concentrée, ou sous forme de complexe ou de lyophilisat, et être ajoutée aux autres ingré-~lients de la composition au moment de l'emploi.
De même, lorsque la superoxyde-di~mutase est utilisée dans le but de maintenir ou d'améliorer les qualités de la peau ou des cheveux, elle peut n'être ajoutée à la composition qu'au moment de l'emploi.
~es compositions de l'invention peuvent donc être pré-sentées sous la forme d'un conditionnement en plusieurs parties contenant d'une part la superoxyde-dismutase, et d'autre part les autres ingrédients de la composition. Comme indiqué ci-dessus, la ~i ,superoxy~3e-dismutase peut être conservée par exemple sous forme de solution aqueuse, de complexe ou de lyophilisat.
~e procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être mis en oeuvre par application des compositions hygiéniques ou cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions. Par exemple: appli-cation de crèmes, de laits de démaquillage ou de compositions anti-solaires sur la peau, application d'une lotion pour cheveux sur cheveux mouillés, shampooings et tous les autres.
-~ ~e procéde de traitement cosmétique de l'invention est mis en oeuvre de façon à appliquer une quantité efficace de su-peroxyde-dismutase, c'est-à-dire une quantité suffisante pour obtenir l'effet de protection recherché. -Ce procédé de traitement cosmétique est destiné soit à
maintenir la structure kératinique de la peau ou des cheveux, soit à main-tenir ou améliorer les qualités de la peau (douceur, souples-- i063028 se, élasticité), soit à protéger la peau contre les effets nocifs des rayons ultra-violets.
~ es exemples suivants illustren-t l'invention sans tou-tefois la limiter. Les exemples 1 et 3 ont simplement pour but d'illus-trer le procédé de préparation de superoxyde-dismutases extraites de bactéries d'origine marine, procédé qui est décrit dans le brevet français No. 73.13670.
EXEMPI,E 1 On a cultivé des bactéries de Photobactérium leio-gna-thi de souche No. ATCC 25 521 sur un milieu synthétique Gonte-nant en grammes par litre:
NaCl 30g/l N 2 4' 2 18,7 KH2Po4 2 MgS 4~ 7 2 0,2 (NH4)2HP04 ,5 Glucose 1,5 Glycérol 1,5 lrypticase 5 Extrait de levure 5 On a amené ce milieu au pH de 7,2 avec de la soude et on l'a stérilisé pendant 1 heure à 100 C.
On s'est servi d'une préculture de 1 litre, poussée pendant la nuit et répartie entre 4 Erlenmeyer contenant 250 ml ` de milieu chacun, pour ensemencer un fermenteur de 12 litres de milieu.
On a poursuivi la culture pendant 12 heures à 20 C
- avec forte aération et on a ainsi ob1;enu 100 g de bactéries exprimés en poids de produit mouillé.
On a dispersé 135 g en poids mouillé de bactéries de Photobactérium leiognathi, provenant de plusieurs cultures dans 650 ml d'eau et on a laissé reposer à 4C pendant une nuit. On ~, a ajouté de l'ammoniaque 2N, jusqu'à amener le pH du milieu à
7,5 et on a ensuite ajouté 18 ml de KCl 3M.
On a porté le méla~ge à 58C et on l'a maintenu à cette température pendant 4 minutes, après quoi on l'a rafra~chi jusqu'à 4C et centrifugé pendant 10 minutes à la vitesse de 10 000 tours/minutes. ~oujours en opérant à 4C, on a ajusté
le surnageant à 35 ~ de saturation avec du sulfate d'ammonium solide à pH 8; on a centrifugé et on a amené le surnageant à
75 % de saturation en sulfate d'ammonium et on a laissé reposer pendant une nuit à 4C. On a récolté par centrifugation la protéine précipitée et on l'a conservée dans une solution de sulfate d'ammonium à 75 %.
~ 'activité d'une solution de 9 mg de protéine par millilitre (~iuret) était de 40 unités/mg, alors qulelle était à titre comparatif, de O unité/mg pour de la catalase en solution de 9 mg de protéine/ml.
Après une nouvelle précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium avec un gradient de concentration de 35 ~ 75 % de la saturation, on à obtenu une superoxyde-dismutase qui, en solution à 14,8 mg de protéine/ml (~iùret) présentait une activité de 134 unités/mg à 500 unités/mg.
On a dissous le précipité protéique dans du tampon phosphate pH 7,8 et on a dialysé pendant 48 heures à 4C. On a conservé l'enzyme superoxyde-dismutase à - 20C.
Pour déterminer l'activité de cette dernière, on a utilisé une cuve placée devant un photomultiplicateur et renfer-mant le mélange réactionnel ci-après:
~uminol 1o-3M 0,3 ml lampon phosphate 10 3~5 pH 7,8 0,3 ml ED~A 1o-3M 0,3 ml Eau 1,0 ml Xan-thine oxydase (1mg/ml) 0,050 ml On a ini-tie la réaction en injectant dans la cuve 1 ml d'hypoxanthine 3X10 4M.
Un flux de photons était alors émis, qui a donné nais-sance, sous l'action du photomultiplicateur, à un courant dont on a mesuré l'intensité au picoampèremètre et on a également enregistré les variations de cette intensité.
~ n introduisant dans le mélange réactionnel, avant ; initiation de la réaction, 5 lul d'une solution de la superoxyde-dismutase préparée comme indiqué plus haut, on a obtcnu une inhibition de l'émission de lumière et on a considéré arbitrai-rement que l'unité d'enzyme superoxyde-dismutase serait la quan-tité d'enzyme qui provoque une inhibition de 50 ~ de l'émission . de lumière.
~ n spectroscopie UV, la superoxyde-dismutase extraite a donné le spectre classique des protéines non hématiniques, ; a~ec l'épaulement du tryptophane à 160 m~u.
; Pour en déterminer le poids moléculaire, on a utilisé
deux techniques connues, l'une consistant à déterminer un gra-dient de centrifugation au saocharose et l'autre mettant en oeuvre un gel ~ Sephadex G 200.
On a pour ce faire utilisé les marqueurs suivants, - dont on connaissait le poids moléculaire (P.M.):
P.M.
ADH de ~evure 150 000 Albumine bovine 66 000 Peroxydase 40 200 On a conclu à un poids moléculaire de 40 000 + 2500.
- . Pour déterminer les sous-unités de la structure pro-téique de l'enzyme, on a réalisé une électrophorèse en gel de polyacrylamide additionné de dodécyl sulfate de sodium à 10 %.
On a observé un seul type de sous-unité, de poids moléculaire dlenviron 21 000. ~e poids moléculaire de la super-oxyde-dismutase obtenue peut donc être estimé ~ 21 000 x 2, soit 42000.
Toujours sur le gel de polyacrylamide, on a obtenu une bande rouge en présence de bathophénanthroline et d'hydra zine, au niveau précisément de la bande de superoxyde-dismutase révélée par le bleu de coomassie.
On a effectué un dosage colorimétrique d'une solution de protéine et on a obtenu pour le fer une valeur qui, en esti-mant le poids moléculaire de l'enzyme à 42 000, donnait environ 2 atomes de fer par molécule.
Une spectrométrie d'absorption atomique d'une solution de protéine à 0,2 mg/ml a confirmé ce chlffre.
On peut donc raisonnablement estimer à 2 le no~bre d'ato~es de fer par molécule de cette superoxyde-dismutase.
Par ailleurs, l'enzyme extraite selon cet exemple ne subit pas de perte appréciable d'activité après 5 minute~ à la température de 70C.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase a permis d'évaluer à 4,4 le pHi ou point isoélectrique de cette enzyme.
~'enzyme présentait un maximum d'activité pour un pH
d'environ 9,5.
On a obtenu une enzyme identique avec des caractéris-tiques semblables à partir d'une souche bactérienne de Photo-bactérium leio~nathi No. A~CC 25 587.
l~EMPI~ ?
On a soumis une culture de bactéries de Photobactérium de souche No. ATCC 15 709 à une lyse en l'agitant dans de l'eau froide, à raison de 1 g de poids mouillé de bactéries pour

4 ml d'eau. On a ensuite centrifugé à 16 000 tours/minute pen-dant 20 minutes à 4~. On a ajouté au surnageant jaune clair du RC1 3 M jusqu'à une concentration finale de 0,1 M.
On a chauffé la solution pendant 3 à 4 minutes dans . .

un bain d'eau porte à 60C. On l'a ensuite refroidie à 4C et on l'a clarifice par centrifugation.
On a soumis le surnageant à une précipitation fractionnée par addition de sulfate d'ammonium solide. ~a fraction active a précipité entre 45 et 75 % de saturation en sulfate d'ammonium e-t on l'a ~éparée par centri~ugation; on l'a redissoute dans le volume minimal de K2HP04 5 x 10 3M, pH 7,8, et on a dialysé
pendant une nuit contre le même tampon phosphate. ~e produit de cette dialyse a en~uite été dirige sur une colonne de gel de "Sephadex"G100 ou G 200, é~uilibrée avec du tampon phosphate

5 x 10 3M,pH 7,8. On a concentré la fraction active éluée à
l'aide d'une membrane d'ultracentrifugation Diaflo PM-10, et on a ensuite dialysé pendant une nuit contre du K2HP04 5 x 10 3M, pH 7,8.
On a absorbé l'enzyme superoxyde-disrnutase sur une colonne de DEAE-Sephadex''A-50 tamponnée avec du K2HP04 5 x 10 3M, pH 7,8. On a élué la protéine de la colonne avec un gradient linéaire de K2HP04, pH 7,8 (de 5 x 10 3M à 3 x 10 1M). La supe-roxyde-dismutase etait ainsi éluée à une concentration en phosphate de 1,4 x 10 M et on l'a ensuite concentrée. On a effectué une nouvelle filtration dans les mêmes conditions que la précédente sur une colonne de DEAE''Sephadex'A-50. On a ainsi éluée l'enzyme à une concentration en phosphate de 1,6 x 10 1M
et on a concentré.
~a protéine ainsi extraite et puri~iée a donné une bande unique à l'électrophorèse en gel d'acrylamide (100 ~ug de protéine pour un gel).
Ainsi, on a obtenu 3 mg de superoxyde-dismutase pure à partir de 20 g de cellules congelées de Photobactérium sepia (avec une activité de superoxyde-dismutase de 250 à 5000 unités~
mg).

On a maintenu l'enzy.ne active sur une longue période de * marque de commerce.

, ~

` --` 1063028 temps en la conservant dans une solu-tion à 70 à 80 7~ de (NH4)2S04 à 4C
- On a déterminé le poids moléculaire de l'enzyme puri-fiée au moyen d'une ultracentrifugation à 45 000 tours/minute et pendant 16 heures, à 4C. On a mesuré la vitesse de sédimen-tation par la méthode de Martin et Ames, avec un gradient linéaire en sucrose de 5 à 20 (en poids/volume) et en utilisant un appa-reillage Beckman Spinco modèle ~2-65B, avec un rotor SW 65K. On a trouvé un coefficient de sédimentation de 3,2 pour cette O dismutase, contre un coefficient de 4,82 et 7,~ respectivement pour des alcools déshydrogénases de foie de cheval et de levure.
partir de cette constante de sédimentation, on a donc calculé
le poids moléculaire de la superoxyde-dismutase extraite comme étant de 42 500 environ.
On a d'autre part établi que la molécule de cette protéine contenait 2 atomes de fer.
~ 'électrophorèse en gels d'acrylamide a donné pour la dismutase une bande unique correspondant à un poids molécu-laire de 20 000 à 20 500, montrant ainsi que la molécule pro-téinique était composée de deux sous-unités identiques.
La superoxyde-di-smutase s'est en ou-tre révélée être très résistante à l'action protéolytique de la trypsine, puis-qu'un traitement pendant 60 minutes de 150 ~g de cette super-oxyde-dismutase avec 10 lug de trypsine à 20C n'a en-traîné aucun changement dans l'activité enzymacique, non plus d'ailleurs que dans la mobilité électrophorétique de la protéine non dissociée.
~ 'enzyme obtenue etait très stable vis-à-vis de la chaleur: aucune perte d'activité enzymatique n'es-t apparue après ~0 minutes à 20C, 30C et même 40C; après 15 minutes à 50C, 3 une diminution de l'activité de 28 a~o est apparue; après 30 minutes à 50C, la perte d'activité nlétait toujours que de 50 ~0 c-t elle n'était que de 10 ~0 et 50 ~0 après respectivement 3 mi-* marque de commerce.

B
. `
.

. . 10630Z8 nutes et 10 minutes à 60C.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase a permis d'évaluer à 4,1 le point isoélectrique de cette enzyme.
On a déterminé au moyen d'une solu-tion d'ions 2 pré-parée par voie électrolytique que l'enzyme présentait un maximum d'activité pour un pH de 8,5 à 10, avec un optimum à pH 9,5.
EXEMP~E 3 -On a traité une souche No. A~CC 11040 de bactéries Photobactérium phosphoreum qui sont des bactéries marines et ont par conséquent une fQrte concentration saline interne.
~ a lyse des bactéries était spontanée dans une solu-tion d'~DTA 10 3M, pH 7,8.
On a éliminé les débris cellulaires au moyen d'une centri~ugation à 16 000 tours/minutes pendant 20 minutes et ~ à oa.
Des études préliminaires avaient montré que l'enzyme superox~de-dismutase était stable à 50C et on a donc éliminé
les autres protéines, ~lles-mêmes thermolabiles, en portant le lysat pendant 3 minutes à 50C, après une addition de KCl jusqu'à molarité de 0,1, et on a séparé les protéines dénaturées par une centrifugation classique.
On a ensuite opéré à 4C. A cette température, on a réalisé une précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammo-nium ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait ; enzymatique traité soit amené à un gradient de concentration de O à 30 % environ de la saturation à 4C. On a éliminé la fraction précipitée en centrifugeant pendant 45 minutes à
- 16 000 tours/minutes et à 0C.
On a ajouté au surnageant la quantité de sulfate d'ammonium requise pour l'amener à 75 % de la saturation à 4C.
On a réuni la fraction précipitée par une centri~u-gation analogue à la pr~cédente.

En vue de purifier la superoxyde-dismutase ainsi ex~
traite, on a dissous le précipité recueilli dans un peu de tampon phosphate 5 x 10 3M, pH 7,8 et on a dialysé contre ce même tampon pendant 48 heures à 4C, pour obtenir un extrait (A).
On a ensuite séparé les protéines encore présentes en fonction de la taille de leurs molécules, a l'aide d'un ge]
de Sephadex G 100, dont la réticulation des grains est telle qu'elle exclut les protéines ayant un poid~ moléculaire superieur à 100 000, qui donc sortent très rapidement à l'extérieur du gel. ~es molécules dont le poids moléculaire est plus faible pénètrent dans le gel et en sont éluées plus ou moins rapidement selon leur taille.
Pour ce faire, on a mis la résine de Sephadex à
gonfler pendant 3 heures dans l'eau, on l'a dégazée et on a filtré
sur B~chner pour éliminer l'eau; on l'a placée dans le tampon de filtration et on l'a versée dans une colonne de 50 cm de long sur 3 cm de diamètre int~rieur, On a équilibré la colonne par passage de 2 litres de tampon.
On avait au préalable repris l'extrait enzymatique (A) proven~nt de la dialyse pour le concentrer sur une membrane Diaflo millipore (P.M. -10) sous pression d'a~ote, jusqu'à un ~olume de 5 ml. On a déposé ce concentrat sur la colonne préparée comme indiquée ci-dessus et on l'a élué par passage de 500 ml de tampon phosphate 5 x 1Q 3M, pH 7,8. Le débit était de une goutte tou-tes les 8 secondes et on a recueilli des fractions -~ de 2,5 ml, dont celles ayant une activité notable ont été réunies et concentrées sur membrane Diaflo. On a ainsi obtenu un extrait concentré (~).
On a réalisé une nouvelle étape de purification par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions à base de DEAE
Sephadex, résine sur laquelle les protéines son-t éluées selon leur charge, par des tampons de force ionique croissan-te.

`` 1063028 Pour préparer la colonne, on l'a mise à gonfler dans l'eau, puis on l'a degazée et lavée dans les solutions suivantes:
NaOX 0,5 M
KH2P4 0,5 M
en ay~lt soin de rincer la résine à l'eau distillée entre chaaue étape, jusqu'à un pH voisin de la neutralité. Après filtration sur ~chner, on a mis la résine en suspension dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,8 et on l'a placée dans une colonne de 30 cm de long sur 3 cm de diamètre intérieur. On a équilibré la colonne en y faisant passer 300 ml de tampon 0,1 M.
On a placé l'extrait concentré (~) sur la colonne ainsi préparée. Une fois cet extrait complètement adsorbé, on ; l'a élué par 500 ml de tampon phosphate pX 7,8, composés de 250 ml de tampon phosphate 0,1 M auxquels on a progressivement ajouté 250 ml de tampon phosphate 0,5 M. ~e débit était de une goutte toutes les 5 secondes et le volume des fractions recueil-lies de 2,5 ml. On a réuni les fractions actives et on les a précipitées par du sulfate d'ammonium, puis conservées sous -cette forme à - 18 à - 20C.
; 20 ~a pureté de l'enzyme superoxyde-dismutase a pu être ~- contr~lée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Une détermination du poids moléculaire de l'enzyme au moyen d'une étude de l'élution lors d'une filtration sur Sephadex G 200 a permis, à l'aide de la relation ~og(PM) = f (volume d'élution) et des marqueurs connus, d'attribuer à la superoxyde-dismutase extraite un poids moléculaire d'environ 40 000.
On a également dé~erminé ce poids moléculaire par une centrifugation en gradient de sucrose: on a coulé des gradients de sucrose de 5 a 20 % dans du tampon phosphate 5 x 10 3M, pH 7,8 en mélangeant progressivement 2,60 ml de la solution à 20 %
à 225 ml de la solution à 5 %,dans un dispositif approprié.
On a déposé sur ces gradients de sucrose différents " 1063028 marqueurs proteiques de poids moleculaire connu et de la supero-xyde-dismutase. On a rc-alisé l'équilibre par une centrifugation à 45 000 tours/minute, à 5C et pendant 22 heures. Qn a alors percé les tubes par le fond et on a recueilli lés fractions de 10 gouttes, sur lesquelles on a mesuré les activités enzymati-queæ présentées par les différents marqueurs utilisé~. Après avoir tracé la droite représentant la varia-tion du poids molécu-laire en .fonction du numéro ae la fraotio~ d'élution, on a éva-lué à environ 40 000 le poids moléculaire de la superoxyde dis-mutase extraite de Photobactérium phosphoreum, ce qui confirmait le ré~ultat précédent.
Pour déterminer le poids moléculaire des sous-unités de la protéine, on a æoumis cette dernière, ainsi que des mar-queurs dont le poids moléculaire des sous-unités était connu, à
une migration électrophorétique sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium. ~a résolu-tion graphique des valeurs trouvées a permis d'attribuer la valeur 20 000 au poids moléculaire de chaque sous-unité de la molécule de supero-xyde-dismutase.
Cette dernière s'est avérée être très stable encore à 50C et présenter un maximum d'activité enzymatique pour un pH de 9,5 environ.
Une électrofocalisation de la superoxyde-dismutase a conduit à évaluer à 4,2 le pHi ou point isoélsctrique de cette enzyme.
Un test colorimétrique tel que décrit précédemment a permis de relever la présence de fer ferreux dans la protéine, un anneau rose apparaissant au niveau de la bande protéique dans un gel de migration électrophorétique préalablement addi-tionné de bathophénanthroline. ~e nombre d'atomes de fer ~er-reux par molécule a été évalué comme etant pratiquement égal à
2.

. 1063(~28 EXEMP~E 4 - ~tude de_l'effet pho 110 Protecteur Ce test est conduit à l'aide d'un appareil XENON, U.V.
Solar Simulator commercialisé par Solar ~ight Company, Philadel-phie U.S.A.
~ a lumière est produite par une lampe à arc XENON
250 W qui a un spectre semblable à celui du soleil; les lon-gueurs d'onde vont de 285 nm à 410 nm.
~ 'irradiation avec ce spectre permet de reproduire l'érythème solaire. On l'appelle ~ED (minimal erythemal dose) temps minimal d'irradiation qui donne un érythème 24 ou 48 heures après l'exposition. Cette grandeur est exprimée en secondes.
~ 'irradiation est effectuée sur des portions de la peau du dos de sujets volontaires.
En échelonnant les durées d'exposi-tion on détermine d'abord la MED.
Chaque suje-t est ensuite soumis à une irradiation de 5 MED, certaines zones irradiées de la peau étant traitées par application du produit étudié, mélangé à un excipient de façon à former une crème. Certaines parties irradiées de la peau sont traitées par applicacion de l'excipient seul. On effectue en :.
même temps l'irradiation d'une partie de peau nue non traitée.
~ e produit étudié es-t une superoxyde-dismutase obtenue comme à l'exemple 1 ci-dessus.
On évalue subjectivement l'intensité de l'érythème par lecture 24 ou 48 heures après l'exposition.
On note un ertythème faible par + et un érythème intense par +*. L'absence d'érythème est notée 0. ~es résul-ta-ts obtenus sont résumés dans le tableau suivant:
* marque de commerce.

~.~

: `

~raitement peau non excipient produit étudié
traitée seul excipien-t .... ._ _ .. .. ..

Sujet 1 ~+ + O
Sujet 2 ++ ++ +
Sujet 3 - I _ _ _ _ Auto-oxydation de la p-phénylènediamine.
On a préparé une solution aqueuse 10 3 molaire de p-phénylènediamine dans un tampon phosphate pH 8,6. La densité
optique de la solution mesurée à 520 nm au bout de 2 heures est de 0,07. ~a meme solution contenant 10 unités par millilitre de 1'enzyme préparée comme dan9 1 t exemple 1 ci-dessus conduit à
une densité optique de 0,036, ce qui correspond à 49 % d'inhi-bition.

Auto-oxydation du dihydroxy 5,6-indole. -On a préparé une solution 6,7 x 10 5 molaire de dihydro-xy-5,6-indole dans un tampon phosphate pH 7,8. La densité opti-que de la solution mesurée à 330 nm croît de 0,1 unité par minu-te. En présence de 407 x 10 9g. par millilitre de l'enzyme citée d~ns l'exe~ple 5, la densité optique cro~t de 0,062 unité
par minute ce qui correspond à 38 ~o d'inhibition.
EXEM~P~E 7 Auto-o~ydation du trihydroxy-1,2,4-benzène.
On prépare une solution aqueuse 10 3 molaire de trihydroxy-1,2,4-benzène. On ajoute 1 millilitre de cette solu-tion à 1 millilitre de tampon phosphate pH 7,8. La densité
optique de cette solution mesurée à 480 nm croit de 0,375 unité

par mi~ute.
Par addition de:
2 x 10 6 g par millilitre d'enzyme définie dans l'exemple 5 la densité optique cro~t de 0,09 unité par minute, - ce qui correspond a 76 % d'inhibition.
4 x 10 6 g par millilitre d'enzyme, la densité optique croît de 0,064 unité par minute, ce qui correspond à 8~ ~ d'in-hibition.
40 x 10 6 g par millilitre d'enzgme la densité optique ~0 cro~t de 0,023 unité par minute, ce qui correspond à 96,5 ~o d'inhibition.
- ~XEMPIæ 8 Auto-oxydation de l'ortho-aminophénol.
On prépare une solutlon aqueuse 5 x 10 3 molaire d'orthoaminophénol. On prépare une solution contenant:
1 millilitre d'eau bidistillée 1 millilitre de la solution ci-dessus 1 millilitre de tampon phosphate pH 9,2 On suit la densité optique de cette solution à 430 nm;
au bout de 15 minutes elle est de 0,22.
Par addition de 2,7 x 10 6 g par millilitre d'enzyme préparée selon l'exemple 1 la densité optique au bout de 15 minu-tes est 0,02, ce qui correspond à 91 % d'inhibition. Par addition ~-~ de 27 x 10 6 g par millilitre la densité optique est de 0,01 soit 96 % d'inhibition.
, ~E:MPI,:E 9 - Inhibition de l'auto-oxydation de la triéthanolamine.
~a triéthanolamine est l'une des bases organiques cou-ramment utilisée pour la neutralisation de compositions cosméti-ques contenant des résines acides, par exemple des résines car-boxyvinyliques du type Carbopol marque de commerce.
~es amines tertiaires de ce type ~orment des complexes -106~028 de transfert de charge aYec l'ox~gène, et ces complexes, sous l'action d'un rayonnemen~ lumineuxS se dissocient pour donner naissance à des quantités importa~tes d'ions superoxyde. Ces derniers peuvent entraîner des peroxyda~ions dans les formllles cosmétiques qui les contiennent. Ces peroxydes, en particulier ceux dérivant de lipides gras insaturés (fréquem~ent présents dans les compositions cosmétiques par exemple l'alcool oléique) ont une action toxique et il est souhaitable d'inhiber leur for-mation.
En utilisant comme révélateur d'ion superoxyde le bleu de nitrotétrazolium (ou NBT), comme décrit par I. Friodovich et Ch ~eauchamp Analytical biochemistry 44, 276 (1971), on a trouvé que l'addition de superoxyde-dismutase (en abrégé: SOD) à une solution aqueuse de triéthanolamine permettait d'inhiber fortement la formation d'ions superoxyde. ~a SO~ utilisée est celle obtenue à l'exemple 1.
~'inhibition de la formation d'ions supero~yde est ~ évaluée par mesure de la densité optique à 560 nm et de son évo-`~ lution en fonction du temps d'irradiation. Avec une concentra-tion en triéthanolamine de 0,4 ~ on observe une inhibition i~por-tante pour des concentrations en SOD de l'ordre de 10 2 à 10 1 - mg/cm3.
On obtient les mêmes résultats en remplaçant la SOD
obtenue à l'exemple 1 par une quantité équivalente de SOD extraite d'Escherichia coli ou de Pleurotus olearius.
EXE~P~E 10 Inhibition de l'auto-oxydation du ~i 2 Certaines variébés d'oxyde de titane ou d'oxyde de zinc conduisent par irradiation à la formation d'ions superoxyde.
C'est ainsi qu'une suspension de Ti 2 dans une solu-tion contenant du bleu de nitrotétrazolium laissait apparaître par irradiation à la lumière solaire, une coloration bleue in-tense révélatrice de la formation d'ions supero~yde a la sur-face des grains de pigment. Si le même type de suspension est maintenu à l'obscurité elle conserve sa couleur initiale.
Par contre, lorsqu'à une meme suspension, on ajoute une solution de superoxyde-dismutase, on obtlent lors de l'ir-; radiation une très nette inhibition de la coloration bleue.
Pour cette expérience on a utilisé une suspension de100 mg de ~i 2 dans 5 cm3 d'une solutio~ de N.~.T. de concen-tration 8.10 5 M.
SOD ajoutée 5.10 2 mg (obtenue à l'exemple 2) On sait l'importance des pigments minéraux tels que Ti 2 et Zn O dans Ies compositions cosmétiques susceptibles d'être utilisées ou stockées à la lumière (compositions de ma-quillage, compositions anti-solaires....). ~'introduction de SOD dans ces mê~es compositions permet d'y inhiber la formation d'ion superox~de et les dégradations qu'il y entraîne.
On obtient les mêmes résultats en remplaçant la SOD
obtenue à l'exemple 2 par une quantité équivalente de SOD
extraite du sang (érythrocupréine).
l~EMP~E 1 1 Inhibition de l'auto-o~.ydation de la riboflavine.
~ es compositions cosmétiques pour le soin ou le trai-tement de la peau contiennent fréquemment de la riboflavine (vi-tamine B2). En effet, la présence de cette vitamine est néces-saire pour maintenir les fonctions normales de la peau.
Il est bien connu que, lorsqu'elle est irradiée en présence d'oxygène, la riboflavine conduit à la formation d'ion superoxyde. Ce dernier peut donc induire des peroxydations dans les émulsions qui contiennent la ribo~lavine et il est alors souhaitable d'y adjoindre une superoxyde-dismutase pour inhiber ce phénomène.

E~P~E 12 Sh~npooing colorant moussant ule C12H25-0 CH2-~HO~I - CH2-SO-C~2-C~IOH-CH O~ 0 g Nonyl phénol à 9 moles d'oxyde d'éthylène 20 g Diéthanolamine de coprah 10 g Butylglycol 7 g Propylèneglycol ~5 g NH4 OH a 22Bé (11 M) 12 ml Sulfate de m~diamino anisol 0,030 g ; 10 Résorcine 0,400 g m-aminophénol base 0,150 g p-aminophénol base 0,087 g ~ nitro para phénylène diamine 0,004 g `~. p-toluylène diamine 1 g SOD obtenue à l'exemple 3 0,05 g ~isulfite de sodium (d _ 1,32) i,2 ml eau q.s.p. 100 g On melange 50 g de cette formule avec la rnême quantité
- d'eau oxygénée à 20 volumes et on applique sur les cheveux le gel obteml. Après 30 minutes de pause, on rince et sèche les cheveux.
Sur des cheveux bruns, on obtient une nuance châtain.
Dans la composition ci-dessus, on peut remplacer la SOD obtenue à l'exemple 3 par une quantité équivalente de SOD
obtenue à l'exemple 1 ou à l'exemple 2.
EXEMP~ 13 Crème support de teinture (coloration d'oxydation) Cétyl stéaryl sulfate de sodium 3 g Alcool cétyl stéarylique 10 g ~0 Diéthanolamide oléique 4 g Ammoniaque à 22 ~é 10 ml Sulfate de m-dia~ino anisol 0,048 g Résorcine 0,420 g m-aminophénol base 0,150 gNitro p-phénylènediamine 0,085 g P-toluylènediarnine 0,005 gBisulfite de sodium (d = 1,32) 1,2 g Superoxyde dismutase de l'exemple 1 0,1 g Eau q.s.p. 100 g On mélange 30 g de cette crème avec 45 g d'eau oxygénée à 20 volumes et on applique sur les cheveux la crame lisse obte-nue. Après un temps de pause suffisant on rince et on sèche les cheveux.
EXE~P~E 14 Gel moussant ou solution épaissie.
Alcool oléique à 12 moles d'oxyde d'éthylène 9 g Méthyl cellulose 2,5 g Superoxyde dismutase de l'exemple 2 0,2 g Parfum 0,1 g Eau q.s.p. 100 g Cette composition s~applique sur la peau. Elle peut également, par addition d'un agent de bronzage artificiel tel quela dihydroxyacétone, former une composition pour le bror.zage arti-ficiel de la peau.
On a obtenu une composition analogue en remplaçant la SOD de l'exemple 2 par une quantité équivalente de la SOD obte-nue à l'exemple 3.
~XEMPIæ 15 Crème (pour le corps) Cire de sipol (alcool cétyl stéarylique partiellement oxyéthylené commercialisé par SINNOVA-~RANC~)5 g Huile-de vaseline 6 g Myristate d'isopropyle 3 g Glycérine 10 g . 1063028 Parfum 0,2 g SOD obtenue à l'exemple 3 0,5 g ~au q.s.p. 100 g On a obtenu une crème analogue en remplaçant dans la composition ci-dessus la SOD de l'exemple 3 par une quantité
équivalente de SOD de l'exemple 1 ou de SOD extraite de Pleuro-tus oléarius gillet.
EX~IP~E 16 Crème (pour le corp~) Cire de Sipol 6 g Perhydrosqualène 4 g Palmitate d'isopropyle ` 2 g Glycerine 15 g - Parfum o 3 g `' SOD de l'exemple 1 o~5 g Eau q.s.p. 100 g On a obtenu une crème analogue en remplaçant dans la composition ci-dessus la SOD de l'exemple 1 par une quan~ité
équivalente de SOD extraite d~Escherichia coli No. ATCC 15224 EXEMP~E 17 ~ait de beau-té pour le corps Huile de Purcellin (Dragoco) 2 g Huile de vaseline 6 g Alcool oléique 1 g Myristate d'isopropyle 1,5 g Monostéarate de glycérine 2 g Stéarine 1,4 g Alcool cétylique 0,1 g Parfum 0.9 g Carbopol 941 (Goodrich Chem. Co) 0,~5 g trriéthanolamine pure 0,35 g Parahydroxybenzoa~,e de butyle 0,04 g * marque de commerce æ ~

. -" 1063028 Triéthanolamine pure 0,7 g Agent conservateur 0.3 g Propylène glycol 5 g Rhodorsil antimousse 410 (R.P.) 0,2 g Hydroviton (Dragoco) : mélange d'amino-acides, ' de principes hydratants de la peau et de lactate de sodium allantoine (tampon) 1,5 g ~l¢ool (96 ~) 5 ' g Colorant F.D.C. blue 1 (Kohnstamn) à 1 % dans l'eau 0,03 g 10 SOD de l'exemple 1 0.08 g Eau déminéralisée 71,55 g 100,00 g On a obtenu un lait de beauté analogue en remplaçan-t la SOD obtenue à l'exemple 1 par une quantité équivalente de SOD extraite du sang (érythrocupréines).
EXEMP~E 18 Amélioration de l'état de la peau in vivo ~ 'experience est faite ~ur de~ rats fe~elles dont on modifie expérimentalement l~état de la peau sous l'action du propionate de testostérone et que l'on traite par la superoxyde dismutase en application topique.
~ 'action de,la superoxyde dismutase est appréciée par examen clinique de la peau et par diverses déterminations bio-chimiques.
1) Pro-tocole expérimental :
Qua-tre séries de 8 rats femelles agées de 40 jours sont utilisés.
1ère serie :
Rats recevant un implant intra-peritonéal de 30 - 40 mg `~ 30 de propionate de testostérone.
2ème_série :

M~me traitement ~ue la première série, avec en outre * marque de com~erce.

~:, . ,.,~ ~
.. .,,~, -` 10630Z8 ; une application quotidienne de 15 U de superoxyde-dis-rnutase dans ~,3 ml de sérum physiologique sur le dos préalablement tondu, 5 jours par se~aine.
3ème ~série :
Témoins sans aucun traitement.
~ es animaux sont sacrifiés 20 jours après le début de l'expérience pour les déterminations biochimiques.
2) Examen clin~
~e propionate de testostérone administré à des rats femelles provoque des modifications cutanées qui se manifestent par une augmentation de l'activité cellulaire au niveau de la couche de malpighi, une augmentation de l'épaisseur des couches épidermiques et un encombrement sébacé plus important.
~ a peau devient plus épaisse et plus rêche, elle est aussi moins élastique au toucher.
C'est ce que l'on observe sur la série No. 1.
~ es observations sont faites par trois personnes dif-férentes en aveugle.
Au contraire, les rats de la 2ème série ont une peau analogue à celle des rats de la série témoin No. 3: peau douce, souple et élastique au toucher.
3) Déterminations biochimiques:
Les résultats obtenus sur des fragments de peau sont reportés dans le tableau ci-joint.
Ils sont exprimés en milliunités par minute et par cm2 de peau, ou bien en milliunités par minute et par mg de protéines présentes dans le fragment de peau.

_ 35 _ -`` 1063~Z8 ~AB~EAU
- Variations biochimiques cutanees en fonction du traitement de rats femelles, par le propionate de testos-térone associé ou non à la SOD administrée par voie topique.

.. . .. . .. _ . . _ .
Témoins ~estotérone ~estostérone + SOD
:;
mu/min/cm2 6600 6500 10 400 Cyto~
mu/min/mgProt 13100 9500 13 700 cytox: cytochrome-oxydases ; ~'examen de ces résultats montre que la superoxyde dis~utase, administrée par voie topique, a une action nette sur les cytochrome-oxydases rapportées aux protéines. Alors que la testostérone provoque une forte diminution, le traitement à la SOD pexmet de retrouver le même taux que chez les témoins.
On sait que les cytochrome-oxydases permettent de caractériser la respiration cellulaire.
~0 ~a superoxyde dismutases améliore la respiration cellulaire cutanée et les qualités de la peau: douceur au tou-cher, souplesse et élasticité.

~' - ' . .
,j.

Claims (29)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de fabrication de compositions hygiéniques ou cosmétiques pour la peau ou pour les cheveux, caractérisé en ce que l'on introduit à titre d'ingrédient actif au moins une enzyme superoxyde-dis-mutase dans un excipient approprié.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on introduit en outre un autre ingrédient actif choisi, suivant l'usage recherché, dans le groupe constitué par un agent détergent, un agent colorant, un agent de bronzage, des parfums.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on introduit lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour protéger les substances kératiniques vivantes que constituent la peau et les cheveux.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on introduit lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour maintenir l'intégrité de la structure kératinique de la peau ou des cheveux, et pour maintenir ou améliorer les qualités de souplesse, d'élasticité
et de douceur de la peau.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on introduit lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour protéger la peau contre les effets nocifs des rayonnements ultra-violets.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on introduit lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour protéger la composition contre l'oxydation des ingrédients oxydables ou auto-oxydables qu'elle renferme.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé
en ce que l'on introduit lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante, soit pour protéger les ingrédients oxydables contre l'oxydation pendant leur conservation, soit pour retarder leur oxydation pendant leur utilisation.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on choisit l'enzyme superoxyde-dismutase parmi celles extraites de bactéries, celles extraites de champignons et celles extraites du sang.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on choisit l'enzyme superoxyde-dismutase parmi celles extraites de souches bactériennes marines.

10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on choisit la superoxyde-dismutase dans le groupe constitué par les superoxyde-dismutases extraites d'Escherichia coli, celles extraites de Pleurotus olearius et les érythrocupréines.

11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé
en ce que l'on choisit les souches bactériennes marines dans le groupe constitué par Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi et Photobacterium sepia.

12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on choisit les superoxyde-dismutases parmi celles extraites de Photobacterium phosphoreum No. ATCC 11040, de Photobacterium leiognathi No. ATCC 25521, de Photobacterium sepia No. ATCC 15709, d'Escherichia coli No. ATCC 15224 et de Pleurotus olearius Gillet.

13. Compositions hygiéniques ou cosmétiques pour la peau ou pour les cheveux, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre d'ingrédient actif au moins une enzyme superoxyde-dismutase en association avec un excipient approprié.

14. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles renferment en outre un autre ingrédient actif choisi, suivant l'usage recherché, dans le groupe constitué par un agent détergent, un agent colorant, un agent de bronzage, des parfums.

15. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles renferment lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour protéger les substances kératiniques vivantes que constituent la peau et les cheveux.

16. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles renferment lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour maintenir l'intégrité de la structure kératinique de la peau ou des cheveux, et pour maintenir ou améliorer les qualités de souplesse, d'élasticité et de douceur de la peau.

17. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles renferment lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour protéger la peau contre les effets nocifs des rayonnements ultra-violets.

18. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles renferment lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante pour prévenir l'oxydation des ingrédients oxydables ou auto-oxydables présents dans les compositions.

19. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 18, caractérisées en ce qu'elles renferment lesdites superoxyde-dismutases en quantité suffisante, soit pour protéger les ingrédients oxydables contre l'oxydation pendant leur conservation, soit pour retarder leur oxydation pendant leur utilisation.

20. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce que l'enzyme superoxyde-dismutase est choisie parmi celles extraites de bactéries, celles extraites de champignons et celles extraites du sang.

21. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce que l'enzyme superoxyde-dismutase est choisie parmi celles extraites de souches bactériennes marines.

22. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce que la superoxyde-dismutase est choisie dans le groupe constitué par les superoxydes-dismutases extraites d'Escherichia coli, celles extraites de Pleurotus olearius et les érythrocupréines.

23. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 21, caractérisées en ce que les souches bactériennes marines sont choisies dans le groupe constitué
par Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi et Photobacterium sepia.

24. Compositions hygiéniques ou cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce que les super-oxyde-dismutases sont choisies parmi celles extraites de Photobacterium phosphoreum No. ATCC 11040, de Photobacterium leiognathi No. ATCC 25521, de Photobacterium sepia No. ATCC 15709, d'Escherichia coli No. ATCC 15224 et de Pleurotus olearius Gillet.

25. Compositions selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles constituent des compositions anti-solaires, des compositions de teinture d'oxydàtion, ou des compositions pour le premier temps d'une permanente.

26. Compositions selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles constituent des compositions pour bains, des compositions désodorisantes, des compositions démaquillantes ou des shampooings.

27. Compositions selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles constituent des laits ou des crèmes.

28. Compositions selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles renferment de 0,01 à 5% en poids de superoxyde -dismutase.

29. Compositions selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles renferment de 0,05 à 1% en poids de superoxyde-dismutase.