BRPI9911389B1 - Peptídeo de antígeno de domínio IgE-CH3, conjugados de peptídeo, peptídeo sintético, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, bem como uso do referido peptídeo ou conjugado do mesmo - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"composição de peptídio como imunógeno para o tratamento de alergia"<d>. a presente invenção apresenta peptídios que compeendem uma seqüência homóloga a uma porção do terceiro domínio constante da cadeia pesada epsílon da ige, covalentemente ligada ou a (1) uma proteína carreadora, ou a (2) um epítopo de célula auxiliar t e, opcionalmente, também a outras seqüências imunoestimuladoras. a presente invenção apresenta o uso de tais peptídios como imunógenos para acarretar a produção em mamíferos de anticorpos policlonais de elevada titulação, os quais são específicos para um sítio de efetor alvo na cadeia pesada epsílon de ige. os peptídios devem ser úteis em composições farmacêuticas, para que se obtenha uma imunoterapia para doenças alérgicas mediadas por ige.

Description

(54) Título: PEPTÍDEO DE ANTÍGENO DE DOMÍNIO IGE-CH3, CONJUGADOS DE PEPTÍDEO, PEPTÍDEO SINTÉTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS, BEM COMO USO DO REFERIDO PEPTÍDEO OU CONJUGADO DO MESMO (51) Int.CI.: C07K 16/46; A61K 39/44 (30) Prioridade Unionista: 20/06/1998 US 09/100,287 (73) Titular(es): UNITED BIOMEDICAL, INC.

(72) Inventor(es): CHANG Yl WANG; ALAN M. WALFIELD ' #

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEO DE ANTÍGENO DE DOMÍNIO lgE-CH3, CONJUGADOS DE PEPTÍDEO,

PEPTÍDEO SINTÉTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS, BEM COMO USO DO REFERIDO PEPTÍDEO OU CONJUGADO DO MESMO.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso de composições conjugadas de peptídio como um imunógeno, sendo que cada peptídio conjugado contido na presente invenção compreende um sítio antigênico alvo no terceiro domínio constante (CH3) da cadeia pesada epsílon (ε) de IgE, com o dito sítio antigênico alvo covalentemente ligado a (1) uma proteína carreadora, através do acoplamento químico, ou (2) um epítopo de célula auxiliar T e outras sequências imunoestimuladoras, através de acoplamento químico ou por meio de síntese direta, para o tratamento de alergia.

De forma mais particular, a presente invenção refere-se ao uso de tais composições conjugadas de peptídio, como um imunógeno, para obter a produção em mamíferos, inclusive em seres humanos, de anticorpos policlonais de alta titulação, específicos para um sítio efetor alvo no domínio CH3 da cadeia pesada ε de IgE, e ao uso de tal composição como uma composição farmacêutica para se obter uma imunoterapia para doenças alérgicas mediadas por IgE. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

No sistema imunológico de seres humanos e de outros mamíferos, a IgE medeia hipersensibilidades do tipo I. Estas são as respostas alérgicas a determinados alimentos, drogas e alérgenos ambientais, os quais são manifestados por sintomas, tais como rinite alérgica, asma, dermatite alérgica e anafilaxia. As estratégias existentes para o tratamento de doenças alérgicas são de utilidade limitada, e consistem em tentativas para dessensibilizar o indivíduo atópico a um alérgeno identificado ou para melhorar uma reação alérgica em andamento com compostos terapêuticos. As limitações para a imunoterapia de dessensibilização baseada em alérgeno incluem dificuldades na identificação do alérgeno envolvido, bem como as reações adversas frequentemente causadas pelo uso do alérgeno identificado (World Health Organization and International Union of Immunological Socie2 •r ties Working Group, Lancet, 1989; i: 259-261). 0utrfes^iâUV*]®9 W P$ra o alívio de alergias empregam compostos terapêuticos para o bloqueio da seqüência inflamatória aguda, a qual é responsável por reações alérgicas. Estes compostos incluem anti-histaminas, descongestionantes, agonistas β2 e corticosteróides. As anti-histaminas, os descongestionantes e os agonistas β2 agem nos eventos a jusante da IgE na seqüência alérgica, fazendo com que eles se tornem remédios paliativos, os quais atacam os sintomas alérgicos, ao invés dos tratamentos preventivos que devem agir nos eventos mais próximos do início de reações alérgicas mediadas por IgE. Estes remédios paliativos fornecem alívio, o qual é de curta duração e parcial, freqüentemente acompanhado por efeitos colaterais adversos. Muitos pacientes com alergias graves são tratados com eficácia com corticosteróides. A terapia com esteróides reduz a inflamação, mas no entanto é amplamente imunossupressiva.

Para evitar os inconvenientes das drogas terapêuticas conhecidas, seria mais desejável prevenir as respostas alérgicas por meio da intervenção seletiva voltada para arlgEcomoumalyq). Assim cofno com as outras imunoglobulinas, a IgE tem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, A cadeia pesada ε tem cinco domínios, um domínio variável de VH e domínios constantes, de CH1 a CH4. Os domínios constantes de ambas as cadeias ε de uma molécula de IgE combinam para compreender a região constante ou de Fc de IgE. A IgE circula e fica junto às células efetoras, tais como basófilos e mastócitos, através de um sítio na região de Fc da IgE, ficando ligadas a um receptor de ΡοεΙ3Ι de grande afinidade, na superfície da célula. Em uma resposta alérgica, os alérgenos (por exemplo, pólen, proteínas de ácaros da poeira, antígenos de pulga) se ligam aos sítios de ligação dos antígenos, na região variável do mastócito ou da IgE ligada ao basófilo. Esta ação produz uma ligação cruzada das moléculas de IgE com os receptores de FccRI subjacentes. Os complexos de alérgeno de IgE, sinalizam desse modo a desgranulação de mastócitos e basófilos com a liberação concomitante de histamina, bem como de outros mediadores infiamatórios. Estes mediadores produzem os sintomas de alergia, aumentam a •r

• · ♦····· · · ··· regulação da produção de IgE e resultam no aumentp dê .§fetfeibHid£d§:q£í alérgeno (Davis e outros, Sprínger Semin Immunopathol, 1993; 15: 51-73).

Foi sugerido que as doenças alérgicas podem ser tratadas por intervenções que inibem a ligação de IgE aos mastócitos e basófilos. Por exemplo, os peptídios sintéticos correspondentes a vários sítios do Fc da IgE foram estudados como inibidores competitivos para a ligação de IgE ao receptor de FcsRI. A hipótese dos pesquisadores foi que tais peptídios agem como antagonistas dos sítios da IgE que participam na ligação de IgE ao receptor de FcsRI e servem para mapear as porções do sítio de ligação.

Os resíduos de aminoácidos dos peptídios que inibem de modo competitivo a lgE„ bem como de todos os peptídios de IgE a seguir, incluindo os homólogos de peptídio de IgE não-humana, são indexados de acordo com a numeração para a IgE humana fornecida por Dorrington e Bennich (Immunol, Rev, 1978; 41: 3-25, a qual também é acessível pela Internet no endereço http:/www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids). Essa seqüência humana é listada aqui como SEQ. ID. N./i/e está numerada como representada na Tabela 1. As seqüências homólogas de cachorro, rato e camundongo para IgE (Patel e outros, Immunogenef/cs, 1995; 41: 282-286; Steen e outros, J Mol Biol, 1984; 177: 19-32; e, Ishida e outros, EMBO, 1982; 1: 1117-1123) também estão representadas na Tabela 1 e listadas como SEQ. ID. Ns.: 2, 3) e 4, ’respectivamente. As seqüências animais são apresentadas em registro, com IgE humana. As posições individuais de aminoácidos em IgE humana e em homólogos de outras espécies são aqui identificadas, de acordo com o sistema de numeração para as seqüências de aminoácidos representadas na Tabela 1, a menos que esteja especificado de uma outra maneira.

Helm e outros (Nature, 1988; 331: 180-183) mostraram que um polipeptídio recombinante de 76 aminoácido de extensão, transpondo a região de CH2 do terminal C e CH3 do terminal N da IgE humana, a partir de aminoácidos 301-376, reduz a ligação da IgE aos mastócitos humanos por inibição competitiva. Outros estudos relataram que somente o domínio CH3 está envolvido com a ligação ao FcsRI. Por exemplo, uma seqüência de peptídios de rato, a qual corresponde aos aminoácidos 401-415 da seqüên30

•ν ί

cia humana (Tabela 1), inibiu a ligação da IgE de ra(to.;áQ$· ofcçfpeíío^çjêf rato (Burt e Stanworth, Eur J Immunol, 1987; 17: 437-440). Um peptídio de 419 a 463 resíduos de IgE humana impediu a sensibilização de mastócitos de rato (Nio e outros, FEBS Lett, 1992; 314: 229-231). Jardieu e Presta (WO 93/04173) relataram sobre o homólogo de peptídios nas regiões de CH3 e CH4, as quais podem incluir aminoácidos 373-390, 420-428, 446-453, bem como as regiões adjacentes, que se ligam de forma diferente ao receptor de FceRI, No entanto, altas concentrações de todos os tais peptídios foram requeridas para se alcançar a inibição eficaz da ligação da IgE. Estas altas concentrações são previsivas das doses excessivamente altas para um efeito fisiológico significante, e não são terapeuticamente práticas.

Os^anticorpos anti-lgptambém foram aplicados como um método para o mapeamento de sítios na IgE, os quais participam na ligação ao receptor de FcsRI. Os estudos com os anticorpos monoclonais de camundongo direcionados contra vários domínios Fc de IgE revelaram que os anticorpos monoclonais anti-lgE, com especificidades para o domínio CH3, inibem a ligação de IgE ao seu receptor de grande afinidade (Baniyash e outros, Molec Immunol, 1988; 25: 705-711; e, Stadler e outros, Immunol Cell Biol, 1996; 74: 195-200). Estes estudos de anticorpos monoclonais estão de acordo com estudos anteriores, os quais utilizaram anticorpos de antipeptídios policlonais para mapear sítios que estão aparentemente envolvidos na ligação do receptor. Por exemplo, os anticorpos de coelho com específicidades para as posições 401-415 de aminoácido de IgE (Burt e outros, Molec Immunol, 1987; 24: 379-389) e 355-368 (Robertson e Llu, Molec Immunol, 1988; 25: 103-113) mostraram uma especificidade para IgE não ligada, e no entanto apresentaram uma má reação com a IgE ligada ao receptor.

Um fragmento de peptídio de IgE canina, contendo pelo menos cinco aminoácidos contínuos provenientes de aminoácidos 356-479 de IgE de cachorro, é útil para a preparação de anticorpos para diagnóstico de alergia em cachorros (JP 9179795, 1997). Tais resultados são indicativos de sítios efetores expostos na superfície, no domínio CH3 da cadeia ε de cachorro, no entanto, nenhum sítio efetor citado é apresentado e nem mesmo

é uma aplicação terapêutica descoberta para os arificoipftá

Estes estudos de mapeamento de epítopos demonstram de farma mais consistente que o domínio CH3 da cadeia pesada.....r DQde ser considerado um alvo para intervenções que têm como objetivo a inibição da ligação de IgE aos basófilos e mastócitos. No entanto, os vários estudos são bastante inconsistentes, quanto às localizações precisas para sítios em CH3, os quais são mais úteis. Além disso, os resultados de estudos de inibição cruzada em IgE, com anticorpos específicos do sítio (por exemplo, Burt e outros, 1987), muitas vezes têm sido exageradamente interpretados para significar que eles definiram uma localização precisa para o sítio de ligação de FcsR1 na cadeia ε. A interpretação de tais estudos de inibição cruzada é limitada, uma vez que, por intermédio deles, não se pode determinar que um sítio de reconhecimento de anticorpo seja equivalente a um sítio de ligação de ligante. Os anticorpos podem inibir por intermédio de ligação, diretamente ao sítio alvo desejado, mas eles também podem ocupar sítios efetores não-contínuos, bem como inibir a ligação do ligante, por intermédio de impedimento estérico ou indução de mudança conformacional.

Portanto, os estudos de mapeamento de epítopos forneceram observações empíricas, mas não separaram o sítio de ligação para o receptor de grande afinidade dentro do domínio CH3. Na ausência de um sítio de ligação definido, não se dispõe de meio algum para a previsão confiável de imunógenos sintéticos potencialmente terapêuticos, com reatividades cruzadas imunológicas para sítios efetores que participam direta ou indiretamente na ligação ao FceR1.

Além disso, na ausência de dados de cristalografia de raios X para IgE, os modelos estruturais disponíveis para a IgE não são suficientes para a previsão confiável dos sítios na IgE que são satisfatórios para intervenções anti-lgE. As estruturas conflitantes à base da estrutura tridimensional divulgada de IgG, foram modeladas para a IgE e para a região de CH2/CH3 da IgE que está associada com a interação entre a IgE e o seu receptor de grande afinidade. Estes modelos propõem várias estruturas conformacionalmente dependentes para o sítio, envolvendo o contato com

be resíduos linearmente não-adjacentes da molécula·' para o sítio sugerem interações entre os sítios não contíguos, na mesma cadeia ε, mediados por alças intramoleculares ligadas de dissulfeto (Helm e outros, Eur J Immunol, 1991; 21: 1543-1548) ou alças intramoleculares 5 mantidas por interações eletrostáticas (Presta e outros,J Biol Chem, 1994; 269: 26368-26373). Outros modelos propõem interações intermoleculares entre segmentos de cadeias ε dimerizadas de uma molécula de IgE (McDonnell e outros, Biochem Soc Trans, 1997; 25: 387-392). Em realidade, observações experimentais mostram que pontos potenciais de contato in10 cluem vários sítios dispersos e descontínuos no domínio CH3 da cadeia ε e deixam claro que a estrutura tridimensional do sítio de ligação de FceR1 não pode ser prontamente separada por intermédio de modelagem (Helm e outros, 1988; Baniyash e outros, 1988; e, Presta e outros, 1994). Portanto, a identificação de imunógenos e antagonistas sintéticos de peptídio úteis que 15 imitam os sítios efetores na IgE não foi descoberta por modelagem teórica.

Na ausência de uma estrutura para a IgE, separada por intermédio de cristalografia de raios X, tais sítios úteis de peptídios somente podem ser alcançados por meio de experimentação empírica.

O conceito de tratamento de doenças alérgicas com anticorpos 20 anti-lgE, com especificidades que inibam a ligação de IgE ao receptor de grande afinidade nos basófilos e mastócitos, também é conhecido (Stadler e outros, 1996; Davis e outros, 1993). Tais anticorpos anti-lgE são tanto anafilactogênicos (ligação cruzada) quanto não-anafilactogênicos (ligação nãocruzada). A maior parte de tais anticorpos anti-lgE é anafilactogênica. Eles 25 vão se unir e irão apresentar uma ligação cruzada com a IgE na superfície dos basófilos e mastócitos e irão ativar a liberação dos mediadores farmacológicos de alergia. Esta ligação cruzada pode levar à anafilaxia, bem como à morte.

Portanto, é crucial que os anticorpos anti-lgE para tratamento 30 sejam não-anafilactogênicos. Determinados anticorpos não-anafilactogênicos retêm a especificidade para o domínio CH3 da cadeia ε e não fazem a ligação cruzada da IgE da célula ligada, enquanto que exibem uma atividaIgE ^gLná.rnWqS:

de inibitória para a liberação de histamina mediádaipQH lâ£.:(Râyiç^: §7· 1993.; Stadler e outros, 1996). Rup e Kahn (Patente U.S. N^a 4.940.782) relatam como um anticorpo monoclonal não-anafilactogênico que reage com IgE livre de rato, bem como a IgE de rato, se une às células B, mas não como a IgE se une ao receptor de FceR1 de mastócito de rato. De forma mais significativa, este inibe a sensibilização de mastócitos de rato. Os anticorpos não-anafilactogênicos, com especificidade homóloga para IgE humana, também inibem a sensibilização por intermédio do mesmo modo de ação. Estes anticorpos de IgE anti-humana se unem à IgE sem soro, se unem à IgE unida à célula B, falham na união com IgE associada ao receptor de grande afinidade de basófilo e mastócito e impedem a sensibilização de células humanas. Presume-se que estes anticorpos ajam por especificidade, para o sítio da IgE que se liga ao receptor de FceR1 (Rup e Kahn, Patente U.S. N^a 4.940.782; Davis e outros, 1993; Chang, Patente U.S. N^s 5.420.251; Presta e outros, J Immunol, 1993; 151: 2623-2632). Além disso, foi declarado que um anticorpo monoclonal de IgE anti-humano nãoanafilactogênico, com uma especificidade diferente, também neutraliza a IgE livre (Rudolf e outros, J Immunol, 1996; 157: 5646-5652). Este anti-lgE não se liga diretamente com o sítio de ligação do receptor, porque ele também identifica a IgE ligada ao FceR1. Aparentemente, ele age de modo a reduzir a sensibilização dos basófilos, por intermédio da alteração do equilíbrio termodinâmico da IgE livre contra a IgE ligada ao receptor.

Deste modo, os anticorpos anti sítiodeligação de FceR1 e aos anticorpos anti-lgE, que interferem na ligação de FcsRI, em outros sítios efetores, servem ambos para bloquear a sensibilização de mastócitos e basófilos por IgE livre. Estes anticorpos potencialmentejmunoterapêutLçQé.....identificam o ,OM3. Cfimo o domínio de IgE que interage com o receptor de IgE Fc de grande afinidade.de.acordo.com os estudos prévios de mapeamento. No entanto, uma identificação mais precisa do sítio de ligação, bem como dos alternativos sítios efetores úteis, tais como aqueles descritos por Rudolf e outros permanece evasiva. Rudolf e outros também usaram uma biblioteca de exibição de fagos para identifi30

·.

« t ¹⁵ car os peptídios mimótopos que se ligam ao seu aüticprpii tffoíipçií>n£l ΦηΙ? IgE; no entanto, os mimótopos de peptídio não apresentaram homologia para a seqüência primária de aminoácidos da IgE humana (Rudolf e outros, J. Immunol., 1998; 160: 3315-3321).

Um anticorpo anti-lgE monoclonal humanizado com especificidade aparente para o sítio receptor de FcsR1 está sendo estudado clinicamente em seres humanos para o tratamento da alergia por uminoterapia passiva (MacGlashan e outros, J. Immunol. 1997; 158: 1438-1445). Foi veficicado que a infusão com este anticorpo, rhuMAb-E25, reduz a concentração do soro de IgE em pacientes, diminui a regulação da expressão do receptor de IgE das células efetoras, reduz as sensibilidades alérgicas para desafiar o alérgeno, bem como melhora os sintomas de asma e rinite alérgica. O anticorpo exibe um bom perfil de segurança. Os resultados de ensaios clínicos estabelecem a possibilidade de uma abordagem de anti-lgE para o tratamento de doenças alérgicas. No entanto, este modo de tratamento é problemático: a imunoterapia pela anti-lgE da invenção é realizada por imunização passiva, isto é, por intermédio da infusão do anticorpo. O anticorpo deve ser aplicado em doses bastante altas e em freqüências bastante repetidas, por vias intravenosas ou subcutâneas inconvenientes, para se alcançar uma concentração eficaz, farmacologicamente contínua, de anticorpos. A dose eficaz é determinada pelo peso corpóreo do paciente, pelo nível da linha de base de IgE livre em circulação e pela via de administração. Em experimentos clínicos recentes, a concentração do estado estável exigido para a eficácia terapêutica foi alcançada por meio de duas doses semanais e mantidas depois disso, por doses quinzenais. Uma série completa de tratamento para um paciente com alergia típica empregaria um total de 2000 a 3000 mg de anticorpos humanizados, assim como requer de sete a dez administrações intravenosas inconvenientes (MsGlashan e outros, 1997; Boulet e outros, Am J Respir Crít Care Med, 1997; 155: 1835-1840). O custo para esta quantidade de anticorpos, bem como as despesas e a inconveniência pelas múltiplas infusões em um ambiente hospitalar indicam que este tratamento é muito caro para todos, exceto para uma pequena proporção da

φ.

população de pacientes.

A eficácia clínica do anticorpo monoclonal rhuMAb-E25 estabelece a viabilidade de imunoterapia por anti-lgE, passivamente administrada. Ela também fornece o argumento para uma abordagem de alternativa de anti-lgE por imunização ativa, se e quando tais imunógenos puderem ser determinados.

Um tratamento com anti-lgE afetado por imunização ativa com um imunógeno de IgE, isto é, por meio de vacinação contra IgE endógena, seria preferível, com base em seu custo, bem como em sua conveniência. A vacinação contra a IgE oferece vantagens que estão acima da imunização passiva: pequenas quantidades de imunógeno de baixo custo, injeções intramusculares não freqüentes e convenientemente administradas e nenhuma necessidade de personalizar os anticorpos do rato por compatibilidade com a espécie presente, isto é, humanizar os anticorpos para serem utili15 zados em seres humanos, uma vez que o procedimento usa o próprio sistema imunológico do paciente para a produção dos anticorpos. No entanto, embora os anticorpos monocionais dessensibilizantes citados acima podem ser sugestivos quanto às vantagens dos imunógenos de IgE, eles não revelam a identidade de imunógenos seguros e eficazes. Tais imunógenos devem imitar os relevantes sítios efetores de IgE, com uma fidelidade suficiente para evocar os anticorpos inibidores cruzados, enquanto retêm a especificidade do sítio, de forma suficiente para evitar a indução de anticorpos anafilactogênicos. Além disso, os imunógenos eficazes de IgE devem ser altamente imunoestimuladores. Desse modo, para tais imunógenos, resta uma necessidade de especificidade de sítio relevante e segura, bem como de imunopotência suficiente.

Os imunógenos de IgE para a imunoterapia de alergia devem ser imunoestimuladores, a fim de evocarem níveis de anti-lgE que sejam suficientes para reduzir a sensibilização mediada por IgE. Tais imunógenos devem ser moldados de modo a superar a forte tolerância exibida direcionada às auto-moléculas. Haba e Nisonoff (Proc Nat! Acad Sci USA, 1990; 87: 3363-3367) induziram uma resposta anti-lgE eficaz, em camundongos, so10

·.

mente por imunizações com IgE, durante uma curta jaõejèf peopatêj dêWfe?envolvimento, desde o nascimento até o décimo dia. As vacinações que foram iniciadas depois deste tempo falharam na indução da resposta autoimune desejada, exceto pelo fato que a IgE de costume para a imunização dos camundongos foi covalententemente acoplada a uma proteína carreadora estranha, hemocianina de lapa “key hole (KLH). De forma semelhante, uma resposta de anti-lgE de dessensibilização foi evocada em ratos por uma proteína recombinante, a qual compreende os domínios da cadeia ε CH2-CH3 unidos à proteína de glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (Hellman, Eur J Immunol, 1994; 24: 415-420).

Outros pesquisadores demonstraram interesse em minimizar o risco de evocar os anticorpos anti-lgE anafilactogênicos que tenham ligação cruzada com IgE já ligados à superfície dos mastócitos e basófilos, por intermédio da busca de imunogenos IgE do peptfdio de especificidade de sítio mais fina. Por exemplo, um peptfdio que corresponda a um sítio no domínio

.................- ’ ,x

CH4 de IgE (resíduos 497-506 da SEQ. ID. N.:1) estava acoplado à KLH e costumava induzir anticorpos policlonais, os quais eram eficazes em suprimir a transdução do sinal mediada por IgE, em mastócitos de rato. No entanto, o conjugado de peptídio-KLH exibiu fracas capacidades imunoestimuladoras, as quais necessitaram de uma demonstração de eficácia por imunização passiva de ratos com anti-soro de coelho imune de pico (Stanworth e outros, Lancet, 1990; 336: 1279-1281). O imunógeno CH4 de Stanworth e outros foi produzido posteriormente, pelo trabalho do autor da presente invenção, como uma série de imunogenos completamente sintéticos, por meio de síntese, a qual forneceu ligação covalente para epítopos auxiliares de células T humanas promíscuos. A capacidade imunogênica destes peptídios foi melhorada, em relação àquela do conjugado KLHpeptídio original, mas nenhuma evidência foi fornecida para a eficácia dos anticorpos de CH4 anti-lgE resultante (Wang, WO 95/26365). Além disso, como aqui mostrado no Exemplo 1 (Tabela 2, entrada 34), os anticorpos antipeptídios com especificidade para o sítio efetor CH4 previamente descrito (Stanworth e outros, 1990) não teve nenhuma reatividade cruzada para

ϊ . , u < ?^j· *·»»: IgE humana. Os estudos anteriores sobre antipeptfdioS, φ pê^.e.Çt^ft^órtp. (1987), que tiveram como alvo o peptídio 401-415 lgE-CH3, também forneceram evidência de incitação da reatívidade cruzada dessensibilizante, mas isto exigiu demasisado anti-soro de coelho de pico selecionado, bem como o uso de um conjugado de proteína carreadora de peptídio definido pelo doente para se observar os efeitos por imunização passiva, em um exemplo de rato. Nenhum peptídio sintético já foi comprovado por sua eficácia para a obtenção da produção em hospedeiros imunizados de anti-soros policlonais, capazes de inibir a liberação de histamina.

O aperfeiçoamento da técnica anterior sobre os imunógenos, discutido acima, é necessário antes de um imunogéno peptídio sintético de capacidade imunogênica e especificidade suficientes, para que a eficácia e a segurança possam ser alcançadas. A presente invenção atinge estas melhoras através da incorporação de uma coleção de métodos adicionais para a identificação e a construção de imunógenos peptídios sintéticos. Estes métodos incluem: (1) um procedimento eficaz para a identificação de um epítopo alvo eficaz; (2) os meios para aumentar a capacidade imunogênica de um epítopo alvo da célula B, por meio da combinação deste com um peptídio que compreenda epítopo de células auxiliares T (Th) promíscuo, amplamente reagente; (3) os meios para aumentar o repertório dos epítopos da célula T, por meio da aplicação de química combinatória de peptídio e, desse modo, também favorecer a capacidade de imunorresposta variável de uma população gerada; e (4) a estabilização de características adaptáveis pela introdução de obstáculos cíclicos, para maximizar a reatívidade cruza25 da para a molécula nativa.

Os peptídios sintéticos foram utilizados para o mapeamento de epítopos para identificação de epítopos ou de determinantes imunodominantes, na superfície das proteínas, para o desenvolvimento de novas vacinas e diagnósticos. O mapeamento de epítopos emprega uma série de peptídios sobrepostos que correspondem às regiões na proteína de interesse para identificar os sítios que participam na interação determinante imunogênica do anticorpo. De forma mais comum, o mapeamento de epíto19 sente invenção podem ser representados pelas fórmulas:

(A)n - (antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-X ou (A)n-(Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de IgE-CH3)-X ou (A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-X ou (Antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-(A)n-X ou (Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-(A)n-X onde, cada A é, independentemente, um aminoácido ou uma seqüência comum imunoestimuladora;

cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(e-N)Lys-, e

-NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-;

cada Th é, independentemente, uma seqüência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula auxiliar T, ou um análogo imunointensificador, ou um segmento do mesmo;

O antígeno do domínio lgE-CH3 é um peptídio entre cerca de 25 e cerca de 29 aminoácidos de extensão, é homólogo a um dos segmentos representados na SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84 do domínio CH3 da cadeia pesada epsílon de um anticorpo de IgE de mamífero, e contém dois resíduos de cisteína, separados por cerca de 23 resíduos de aminoácido;

X é um aminoácido α-COOH ou a-CONH2;

n varia de 0 até cerca de 10;

m varia de 1 até cerca de 4; e o varia de 0 até cerca de 10.

De forma mais específica, o antígeno do domínio lgE-CH3 é selecionado do grupo que consiste em: SEQ. ID. N.:5, SEQ. ID. N.:6, SEQ. ID. N.:7, SEQ. ID. N.:8, SEQ. ID. N.:84 seqüências homólogas da cadeia pesada epsílon de

WH Freeman and Company: New York, 1992, 63-67).·' : ·*^: ·

Um outro fator importante que afeta a capacidade imunogênica de um peptídio derivado de IgE, para uma alergia farmacêutica, é a sua apresentação para o sistema imunológico, por intermédio dos epítopos da célula T auxiliar, os quais reagem com os receptores das células T auxiliares e as moléculas MHC de Classe II do hospedeiro (Babbitt e outros, Nature, 1985; 317: 359-361). Estes são freqüentemente fornecidos por proteínas carreadoras com desvantagens concomitantes, devido às dificuldades para a produção bem-definida de conjugados carreadores de peptídio, bem como a má direção da maior parte das respostas do anticorpo para o carreador e a supressão epitópica induzida pelo carreador (Cease, Intern Rev Immunol., 1990; 7: 85-107; Schutze e outros, J Immunol., 1985; 135: 2319-2322). Alternativamente, os epítopos da células auxiliares T (Th) também podem ser providos por peptídios sintéticos, incluindo os sítios da Th. Deste modo, os epítopos da Th, chamados de Th promíscuos, incitam o auxílio eficiente da célula T e podem ser combinados com epítopos sintéticos da célula B, que, sem ajuda, são pouco imunogênicos para que gerem imunogenos potentes de peptídios (Patente U.S. N^s 5.759.551). Os peptídios quiméricos do epítopo da célula B/Th promíscuos bem projetados são capazes de produzir respostas da Th e respostas resultantes do anticorpo, na maior parte dos membros de uma população geneticamente diversa, expressando haplótipos MHC diversos. A Th promíscua pode ser determinada por seqüências específicas derivadas de antígenos estranhos potentes, tais como, por exemplo, a proteína F de vírus de sarampo, antígeno de superfície de vírus de hepatite B e proteína da membrana exterior principal (MOMP) de Chlamydia trachomatis. Foi verificado que muitas Th promíscuas conhecidas, provenientes de elementos patogênicos virais e bacterianos são eficazes para o aumento da capacidade do peptídio pouco imunogênico, correspondente ao hormônio LHRH decapeptídio (Patente U.S. N^a 5.759.551).

Os epítopos de Th promíscua, derivados de elementos patogênicos estranhos, podem incluir, mas não ficam a eles limitados: epítopos de células auxiliares T do antígeno do núcleo e da superfície de hepatite B

(HBg Th e HBc Th), epítopos de células auxiliares T:cie io)àha;y4.q$.qiiêlÍK j:

che (PT Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de tétano (TT Th), epítopos de células auxiliares T de proteína F de vírus de sarampo (MVf

Th), epítopos de células auxiliares T de proteína de membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de difteria (DT Th), epítopos de células auxiliares T de circunsporozoíto de Plasmodium falciparum (PF Th), epítopos de células auxiliares T de isomerase de fosfato de triose de Schistosoma mansoni (SM Th) e epítopos de células auxiliares T de TraT de Escherichia coli (TraT Th). A Th derivada do elemento patogênico foi listada como SEQ. ID. Ns.: 2-9 e 42-52, na Patente U.S. 5.759.551; como sítio P11 auxiliar de clamídia, em Stagg e outros, Immunology, 1993; 79; 1-9; e como peptídio HBc 50-69, em Ferrari e outros, J Clin Invest, 1991; 88: 214-222.

Os epítopos promíscuos da Th variam em tamanho, de cerca de 15 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos, de extensão (Patente U.S. 5.759.551), e compartilham, freqüentemente, de características estruturais comuns e podem conter seqüências específicas de marco de limite. Por exemplo, uma característica comum consiste nas hélices antipáticas, as quais são estruturas helicoidais alfa com resíduos de aminoácido hidrofóbico que governam uma face da hélice e com resíduos polares e carregados que governam as faces circundantes (Cease e outros, Proc Nat! Acad Sei USA, 1987; 84: 4249-4253). Os epítopos da Th contêm, freqüentemente, modelos de aminoácidos primários adicionais, tal como um resíduo carregado ou Gly, seguido por dois a três resíduos hidrofóbicos, seguidos, por sua vez, de um resíduo polar ou carregado. Este modelo define o que é chamado de seqüências de Rothbard. Além disso, os epítopos da Th obedecem, freqüentemente, a regra 1, 4, 5 e 8, onde um resíduo positivamente carregado é seguido por resíduos hidrofóbicos na quarta, na quinta e na oitava posições, depois do resíduo carregado, consistente com uma hélice antipática que tem as posições 1, 4, 5 e 8 localizadas na mesma face. Uma vez que todas estas estruturas são compostas de aminoácidos hidrofóbicos comuns, carregados e polares, cada estrutura pode existir simultaneamente

dentro de um único epítopo da Th (Partidos e outros,’^:J Gefíityúôly.l&tyfê! 1293-1299). A maior parte, se não todos os epítopos promíscuos da célula T, se ajusta a pelo menos uma das periodicidades descritas acima. Estas características podem ser incorporadas nos projetos de sítios artificiais idealizados da Th.

Os sítios úteis de Th também podem incluir a Th combinatória que incorpora sítios degenerados selecionados na elaboração dos sítios idealizados de Th. Em Wang e outros (WO 95/11998), uma classe particular de um epítopo comblnatório foi designada como uma Biblioteca de Antígeno Sintético Estruturado ou SSAL. Uma Th construída como um epítopo da SSAL é composta por substituições posicionais organizadas ao redor de uma armação estrutural de resíduos constantes. A seqüência da SSAL é determinada mediante o alinhamento da seqüência de aminoácidos primários de uma Th promíscua, a retenção de resíduos relativamente constantes em posições responsáveis pela estrutura única do peptídio da Th e a provisão da degeneração nas posições associadas com o reconhecimento dos diversos elementos de restrição de MHC. As listas de aminoácidos variáveis e preferidos estão disponíveis por motivos ligados ao MHC (Meister e outros, Vaccine, 1995; 13: 581-591; Alexander e outros, Immunity, 1994, 1: 751-761).

Todos os membros da SSAL são simultaneamente produzidos em uma síntese de peptídio em fase sólida simples, em série, com o epítopo alvo da célula B e outras seqüências. A seqüência da biblioteca de Th mantém os motivos de ligação de uma Th promíscua e acomoda a reatividade para um alcance mais amplo de haplótipos. Por exemplo, o epítopo degenerado da Th descrito em WO 95/11998, como SSAL1TH1¹¹ foi modelado depois de um epítopo promíscuo ser tirado da proteína F do vírus de sarampo (Partidos e outros, 1991). O SSAL1TH1 foi projetado para ser usado em série com um peptídio alvo de LHRH. Como o epítopo de sarampo, SSAL1TH1 segue a seqüência de Rothbard, bem como a regra 1,4, 5 e 8:

Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu

Glu Ile	Glu Ile Arg	Ile Ile Ile	Arg Ile Glu	Ile
Vai	Vai	Vai Vai Vai	Vai	Vai
Phe	Phe	Phe Phe Phe	Phe	Phe

Os resíduos carregados Glu ou ASP são somados na posição 1 para aumentar a carga que circunda a face hidrofóbica da Th. A face hidrofóbica da hélice antipática é então mantida por resíduos hidrofóbicos em 2,

5, 8, 9, 10, 13 e 16, com variabilidade em 2, 5, 8, 9, 10, 13 e 16, para se obter uma aparência externa com a capacidade de ligação para uma grande variedade de elementos de restrição de MHC. O efeito de rede da característica da SSAL é o aumento do alcance de imunorresposta a uma Th artificial (WO 95/11998).

Os imunógenos de peptídios que foram projetados com as tecnologias de peptídio e os elementos de projeto de peptídio discutidos acima, isto é, mapeamento preciso do epítopo, restrição cíclica e a incorporação de epítopos promíscuos de Th ou Th promíscua idealizada e epítopos idealizados de Th da SSAL, são a base para os imunógenos da IgE de peptídio sintéticos eficazes da presente invenção. Tais peptídios são preferidos para o alvo e para segurança apropriada, devido à apresentação eficaz do sítio efetor da IgE, por intermédio do posicionamento e ciclização aperfeiçoados, bem como para a imunopotência, devido à capacidade de resposta amplamente reagente da Th.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção apresenta novas composições conjugadas de peptídios sintéticos para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE, através de imunização ativa. A imunização induz a produção de anticorpos policlonais não-anafilactogênicos de alta titulação, específicos para um sítio efetor de IgE, em um hospedeiro imunizado. Isto, por sua vez,

-NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(e-N)Lys-NHCH(X)CH2S-succinimidil(s-N)Lys-, e

-NHCH(X)CH2S-(succinimidil)-;

cada Th é, independentemente, uma seqüência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula auxiliar T, ou um análogo imunointensificador, ou um segmento do mesmo;

o antígeno do domínio lgE-CH3 representa a seqüência de um peptídio de antígeno do domínio lgE-CH3, como aqui definido (ou um análogo imunologicamente funcional e de reação cruzada dos mesmos);

é um aminoácido α-COOH ou a-CONH₂;

varia de 0 até cerca de 10; varia de 1 até cerca de 4; e varia de 0 até cerca de 10.

O imunógeno de peptídio da presente invenção inclui de cerca de 25 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, de preferência, de cerca de 25 a cerca de 80 resíduos de aminoácidos, e mais preferencialmente de cerca de 25 a cerca de 65 resíduos de aminoácidos.

Quando A é um aminoácido, este pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente ou qualquer aminoácido que não ocorra naturalmente. Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, mas não ficam a eles limitados: Da-aminoácidos, β-alanina, omitina, norieucina, norvalina, hidróxi prolina, tiroxina, ácido γ-amino butírico, homosserina, citrulina e outros do gênero. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente incluem: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Além disso, quando n é maior do que A, e dois ou mais dos grupos A são aminoácidos, então, cada aminoácido pode ser independentemente o mesmo ou diferente.

Quando A é um domínio de invasina, este é um epítopo imunoestimulador proveniente da proteína invasina de uma espécie de Yersinia. Esta propriedade imunoestimuladora é resultante da capacidade deste domínio de invasina para interagir com as moléculas integrinas B1 presentes em células T, particularmente nas células T de memória ou imunes ativadas.

·'

ι : : : :: s ·: ·· <· também podem incluir de 1 a 5 aminoácidos adicionais, os qüajs âão^Jdfáp fidos de um ou outro terminal do segmento 413-435 da IgE, desde que a estrutura de alça de dissulfeto simples seja preservada.

Um peptídio de antígeno de domínio lgE-CH3 aperfeiçoado para IgE humana, que tem a seqüência Cys- Gly- Glu- Thr- Tyr- Gin- Ser- ArgVal- Thr- His- Pro- His- Leu- Pro- Arg- Ala- Leu- Met- Arg- Ser- Thr- Thr-LysCys (SEQ. ID. N.:5), é fornecido pela presente invenção. O sítio alvo de IgE humana é ciclizado através das cisteínas do terminal não-natural e alguns substitutos de resíduo de serina para o resíduo de cisteína da seqüência natural. O anticorpo que é evocado por imunógenos de peptídio que incluem este antígeno de domínio lgE-CH3 tem reação cruzada com IgE humana e inibe a sensibilização de basófilos humanos por intermédio de IgE humana.

Da mesma forma, os sítios alvo correspondentes para IgE, de outra espécie, podem ser derivados do segmento da cadeia ε homóloga, da espécie relevante. Por exemplo, tais seqüências alvo podem ser tiradas das seqüências de cachorro, de rato e camundongo apresentadas na Tabela 1 (SEQ. ID. Ns.; 2, 3 e 4), ou da seqüência lgE-CH3 de cavalo, fornecida por Navarro e outros, Molec. Immunol., 1995, 32: 1-8. Peptfdios adicionais de antígeno do domínio lgE-CH3 (SEQ. ID. Ns.: 6, 7, 8 e 84) podem ser derivados destas seqüências.

De preferência, os antígenos do domínio lgE-CH3 da presente invenção são tornados mais imunogênicos através de ligação covalente a uma proteína carreadora, através de acoplamento químico, ou de forma mais preferível, via ligação covalente com elementos imunoestimuladores sintéticos, tais como os epítopos promíscuos da Th, por síntese direta. Os exemplos específicos de proteína carreadora e elementos imunoestimuladores são fornecidos, por exemplo, por veículo de hemocianina de lapa key hole (KLH), uma Th artificial (SEQ. ID. N.:9), Th artificial da SSAL (SEQ. ID. Ns.: 10 e 11), uma Th derivada de elemento patogênico (SEQ. ID. N.:12), e um peptídio de invasina imunoestimulador (Inv) tirado de Yersinia (SEQ. ID. N.:13).

Os conjugados de peptídio completamente sintéticos da pre-

(A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(^antí9^eno d° domínio de lgE-CH3)-X, (A)n-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-X, (antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-(A)n-X, e (Th)m-(B)o-(^antíg6ⁿo do domínio de lgE-CH3)-(A)n-X.

O epítopo de Th é ligado, opcionalmente, através de espaçadores B, ou ao terminal N, ou ao terminal C do peptidio lgE-CH3 e análogos imunológicos funcionais e de ligação cruzada destes. Os imunógenos de peptídios preferidos da presente invenção são os peptídios que contêm os peptídios de antígenos do domínio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.: 5) (ou análogos imunológicos destes) e peptídios de Th e, opcionalmente, Inv (SEQ. ID. N.: 13). Em uma modalidade mais preferida, o epítopo de Th derivado de um patógeno externo natural da Tabela 5 ou um epítopo de Th artificial da Tabela 6, ou análogos imunogênicos funcionais destes e, opcionalmente, A é Inv (SEQ. ID. N.:13) ligado através de um espaçador (B)o, tal como Gly-Gly ou (e-N)Lys.

A estrutura do antígeno do domínio lgE-CH3 inclui uma seqüência de peptídios tirada do domínio CH3 de IgE humana (SEQ. ID. N.:1) ou as seqüências homólogas provenientes de outra espécie (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 6-8 e 84) e sujeitas às seguintes modificações:

o sítio alvo é modificado a partir daquele das seqüências de IgE que ocorrem naturalmente, pela inserção de um resíduo de cisteína no lado terminal N de posição 413 ou posição homóloga, a menos que a cisteína já esteja presente nas posições 413 ou 414, na seqüência natural, a substituição em lugar da cisteína nativa de posição 418 ou posição correspondente de uma seqüência homóloga não-humana ou de qualquer outra cisteína da seqüência nativa alvo por serina (a menos que as referidas cisteínas nativas estejam presentes nas posições 413 ou 414 e 435 ou 436), a inserção de cisteína no lado terminal C de posição 435 ou posição homóloga, a menos que a cisteína já esteja presente nas posições 435 ou 436, na seqüência natural, e

anticorpos lgE-CH3 de mamíferos e reação cruzada, bení comáós.arfálQg®,Ó imunologicamente funcionais dos mesmos.

As composições de peptídios da presente invenção compreendem imunógenos de peptídios de cerca de 25 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, de preferência de cerca de 25 a cerca de 80 resíduos de aminoácidos, e de forma mais preferível de cerca de 45 a cerca de 65 resíduos de aminoácidos.

Também são fornecidos os veículos adjuvantes e/ou de aplicação e outros ingredientes habitualmente incorporados em formulações de vacina, bem como as instruções para dosagem, tais como aqueles anticorpos imunoterapêuticos dirigidos contra o sítio efetor alvo da IgE que são gerados. Isto, por sua vez, inibe a sensibilização por IgE circulatória de basófilos e mastócitos, e assim previne o acionamento e a ativação de mastócitos/basófilos por complexos alérgenos de IgE. O mecanismo inibitó15 rio, mediado pelos anticorpos e induzido pela composição de peptídio da presente invenção, irá reduzir ou eliminar, especificamente, a patologia mediada pela IgE, enquanto que irá deixar os componentes defensivos do sistema imunológico, por exemplo IgG, inalterados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo peptídio e novas composições de conjugados de peptídios para a geração de anticorpos policlo, nais de alta titulação, com especificidade para um sítio efetor alvo, no terceiro domínio da porção de Fc de IgE, isto é, o domínio CH3 da cadeia ε.

Por conveniência, a expressão conjugado de peptídio, tal como aqui utilizada, refere-se às moléculas que incluem epítopos de Th covalentemente ligados aos peptídios de antígeno do domínio lgE-CH3, quer seja através das ligações peptídicas convencionais para formar um único peptídio maior, quer seja através de outras formas de ligação covalente.

A alta especificidade do sítio das composições da presente in30 venção minimiza a geração de anticorpos anti-lgE, que podem ter ligação cruzada com a IgE bivalente ligada ao FceR1, na superfície do basófilo/mastócito, e assim evocar a produção de anticorpos anti-lgE não-

' * * * · ~ * '» ^r *··$·; ,* *_β· anafilactogênicos. Portanto, a presente invenção tambám/rafere-sê. a.Vrjí, método seguro para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE, em mamíferos, inclusive seres humanos. __

A seqüência alvo antigênica foi determinada por uma triagem completa de sítios candidatos nos domínios CH2 e CH3 de IgE humana para úteis imunorreatividades. Os sítios CH2 e CH3 foram selecionados por síntese, como imunógenos de peptídios, com base nas apresentações feitas por Helm e outros (1988) e Presta e outros (1994), onde uma longa região que começa na região terminal de carboxila do domínio CH2 de IgE e procede através do domínio CH3, contém sítios efetores potenciais. As estruturas potenciais em alça, na conformação de IgE, que foram deduzidas de um modelo teórico para a estrutura tridimensional de IgE humana, foram disponibilizadas por Brookhaven National Laboratory, pelo endereço da Internet http://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids e relatado por Helm e outros (Eur J Immunol, 1991; 21: 1543-1548). As alças ligadas de dissulfeto foram incorporadas na elaboração de imunógenos de peptídios selecionados, para imitar as posições das alças previstas, de forma que maximizasse a possibilidade de reatividade cruzada entre os peptídios antigênicos alvo projetados e a molécula de IgE nativa. Os sítios antigênicos alvo potenciais foram sintetizados e se tornaram imunogênicos, tanto por conjugação química com KLH, seguindo a síntese de peptidio em fase sólida, quanto por ligação covalente aos epítopos promíscuos de Th e outras seqüências imunoestimuladoras por meio de síntese contínua (Tabela 2). Vários sítios foram sintetizados como peptídios cíclicos, com a incorporação de alças específicas de dissulfeto para estabilizarem os peptídios móveis em conformações que se assemelham às estruturas previstas de alças de IgE. Os sítios efetores alvo potencialmente úteis foram então identificados pela preparação de soro hiper-imune e teste do anti-soro para reatividade cruzada para IgE humana. Os anticorpos provenientes de soro, com alta reatividade cruzada para IgE humana, foram purificados e avaliados quanto à capacidade de inibir a sensibilização de basófilos humanos, mediada por IgE, em um teste in vitro para liberação de histamina. Os anticorpos antipeptídios evocados por peptídios, (ί

SEQ ID NO: 14 e 15 compreendendo SEQ ID NO:5, exibiram forte reatividade cruzada para IgE (Tabela 2) e, de forma mais consistente, exibiram alta atividade inibitória no teste de liberação de histamina (Tabela 3). O epítopo alvo comum aos peptídios da SEQ. ID. Ns.:14 e 15 corresponde a um segmento do domínio CH3 da IgE apresentado na Tabela 1. A Tabela 1 apresenta a seqüência de aminoácido dos domínios CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada ε da IgE humana alinhada com as seqüências homólogas tiradas de cachorro, rato e camundongo. O sítio alvo da seqüência da cadeia ε humana que foi determinado para ser útil para representação, como os antígenos do domínio IgECH3 da presente invenção está sublinhado na Tabela 1 e inclui os resíduos 413-435 da cadeia humana. As seqüências alvo homólogas em proteínas de cachorro, rato e camundongo também estão sublinhadas na Tabela 1. A seqüência homóloga no cavalo é a de resíduos 296-318 na seqüência de aminoácido de Navarro e outros, Molec. Immunol., 1995,32:1 -8.

Os sítios efetores alvo sublinhados IgE CH3 e os peptídios do antígeno do domínio lgE-CH3 derivados da presente invenção são pequenas seqüências de peptídios que, quando sintetizadas sem ajuda, são normalmente fracas ou não-imunogênicas, mais ainda por ser antígenos próprios. Estes peptídios pequenos podem ser imunopotencializados por meio do acoplamento químico a uma proteína carreadora, por exemplo, hemocianina de lapa key hole (KLH). Uma desvantagem de tais imunógenos à base de proteína carreadora de antígeno do domínio lgE-CH3 é a fraca capacidade imunogênica do antígeno em comparação com a grande capacidade da proteína carreadora, um problema inerente associado aos conjugados da proteína carreadora de peptídios. A maior parte dos anticorpos gerados por um tal conjugado consiste em anticorpos não-funcionais direcionados contra a proteína carreadora. Os imunógenos preferidos da presente invenção são peptídios completamente sintéticos que minimizam a geração de anticorpos irrelevantes e, assim, produzem imunorrespostas mais enfocadas para os antígenos do domínio alvo lgE-CH3, por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84.

No entanto, uma vez que os pequenos peptídios do antígeno do domínio lgE-CH3 da presente invenção (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e

84) são epítopos dependentes de célula T não-imu^bginjÇbg/qjç^-sãp Ué-.” pendentes da capacidade imunogênica de epítopos extrínsecos de Th. Estes são fornecidos para os peptídios preferidos da presente invenção, como epítopos de Th promíscuos covalentemente ligados. Os imunogenos da presente invenção produzem imunoreatividade específica ao sítio para propiciar a precisão alvo do sítio efetor e, deste modo, produzir anticorpos anti-lgE sem ligação cruzada. Os anticorpos específicos ao sítio resultantes inibem a sensibilização e a resposta alérgica, mas não induzem a desgranulação espontânea.

Os exemplos específicos são fornecidos na presente invenção como modalidades dos conjugados de peptídios imunogênicos da invenção. Estes exemplos fornecem a ligação de elementos sintéticos imunoestimuladores para os peptídios do antígeno do domínio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84), tais como aqueles anticorpos potentes de ligação cruzada são amplamente gerados, em uma população de hospedeiros geneticamente diversa, contra o sítio alvo no domínio CH3 de IgE. Estes anticorpos anti-lgE são anticorpos não-anafilactogênicos e são especificamente dirigidos contra a IgE (Exemplos 2 e 3). Estes anticorpos, por sua vez, levam à inibição da liberação de histamina e respostas reduzidas mediadas por IgE, deste modo resultam na prevenção e/ou tratamento efetivo de doenças alérgicas mediadas por IgE.

Para a imunização ativa, o termo imunógeno é aqui referido para relacionar uma composição conjugada de peptídio que é capaz de induzir os anticorpos contra um sítio efetor presente no terceiro domínio da cadeia pesada de IgE (por exemplo, SEQ. |D. Ns.: 5-8 e 84), levando à inibição ou à supressão de desgranulação de mastócito e basófilo mediado por IgE. As composições de peptídios da presente invenção incluem peptídios de antígenos do domínio lgE-CH3, de preferência ligadas às proteínas carreadoras via acoplamento químico, mais preferencialmente peptídios de antígeno do domínio lgE-CH3 ligados aos epítopos da célula T promíscua auxiliar (epítopos de Th), via acoplamento químico, e peptídios com mais preferência completamente sintéticos que contêm seqüências de antígenos â' de domínio lgE-CH3 e seqüências de epítopos da cêlulás.T prbcp/qijyaá &â-. xiliares (epítopos de Th).

As proteínas carreadoras são covalentemente ligadas aos peptídios de antígeno de domínio lgE-CH3, de preferência com um espaçador (por exemplo, Lys-Lys-Lys), via acoplamento químico. Os peptídios de Th (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 9-12) são covalentemente ligados aos peptídios de antígeno de domínio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84), ou por acoplamento químico, ou, de preferência, via síntese direta, de preferência com um espaçador (por exemplo, Gly-Gly), de forma que esteja adjacente para ambos os terminais N ou C das seqüências do antígeno de domínio lgE-CH3, a fim de evocar respostas eficazes do anticorpo. O imunógeno, opcionalmente, também pode inçluir uma seqüência geral de aminoácidos imunoestimuladores, por exemplo, um que corresponde a um domínio de uma proteína invasina proveniente da bactéria Yersinia spp (Brett e outros, Eur J Immunol, 1993, 23: 1608-1614) (SEQ. ID. N.:13). A seqüência geral imunoestimuladora pode compreender um espaçador opcional, através do qual é ligado a um peptídio de Th.

Os peptídios completamente sintéticos da presente invenção podem ser representados pelas fórmulas:

(A)n - (antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-X ou (A)n-(Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-X ou (A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-X ou (Antígeno do domínio de lgE-CH3)-(B)o-(Th)m-(A)n-X ou (Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-(A)n-X onde, cada A é, independentemente, um aminoácido ou uma seqüência geral imunoestimuladora;

cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos,

são do ensaio de histamina é expressa como a inibição percentual de libérX·; ção histamina mediada por IgE, em comparação com o anticorpo de controle da mesma espécie que foi cultivado com especificidade para um antígeno irrelevante, tal como mostrado na Tabela 4B.

Resultados

Os construtos representativos de peptídio foram de relevante capacidade imunogênica, bem como todos os peptídios testados produziram fortes reatividades cruzadas direcionadas ao sítio à IgE humana ou IgE de cachorro correspondente, tal como mostrado pelas titulações log₁₀ nos ensaios ELISA de IgE anti-humana ou IgE anticachorro superior a 3 (Tabela 4B). A inibição da sensibilização mediada por IgE foi observada nos anticorpos de porquinho-da-índia, porco e de babuíno e avaliada quanto à capacidade dos anticorpos de peptídio anti-lgE para inibir a liberação de histamina por basófilos. Esta reatividade cruzada funcional pelos anticorpos de babuíno é notável, de tal modo que a neutralização da IgE humana pela IgG de babuíno é quase um sistema humano. Deste modo, a eficácia de uma construção de peptídio da presente invenção, como um agente para a imunoterapia de alergia por imunização ativa, é indicada em um modelo que é quase homólogo para a espécie de peptídio e a espécie alvo.

EXEMPLO 5

IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS E AVALIAÇÃO DE EFICÁCIA IN VIVO

A eficácia de peptídios das SEQ. ID. Ns.: 24 e 25 é avaliada com cinco grupos de 16 camundongos, pelo protocolo de imunização e sensibilização esboçado abaixo.

Grupos de 16 camundongos (Balb/c), fêmeas, de 8 a 10 semanas de idade, são imunizados por via subcutânea com a composição de peptídio indicada da presente invenção. Os camundongos recebem doses de 20 pg/0,2 ml nas semanas 0, 3, 6 e 11. A primeira dose é preparada com Adjuvante de Freunds completo, doses subseqüentes com Adjuvante de Freunds incompleto. Os camundongos são sensibilizados para um conjugado de hapteno, KLH difenilatado (DNP-KLH), nas semanas 7 e 10. A sensibilização é realizada por meio de administração intraperitoneal de DNP-KLH

A seqüência específica para um domínio de invasina que interage com as moléculas integrinas B1 foi descrita por Brett e outros (Eur J Immunol, 1993). Uma modalidade preferida do domínio de invasina (Inv) para ligação a um epítopo de Th promíscua foi previamente descrita na Patente U.S. N^Q 5.759.551, a qual está aqui incorporada a título de referência. O domínio de Inv tem a seqüência Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-ThrTyr-Gln-Phe (SEQ. ID. N.: 13), ou é um homólogo estimulador imune deste, proveniente da região correspondente em outra espécie de proteína invasina de Yersinia. Tais homólogos, deste modo, podem conter substituições, deleções ou inserções de resíduos de aminoácido para acomodar a variação de tensão bacteriana, uma vez que os homólogos retêm propriedades estimuladoras imunes. Um homólogo estimulador imune também pode incluir um espaçador opcional, através do qual é ligado a um epítopo de Th.

Em uma modalidade, n é 3 e (A)3 é um domínio de invasina (Inv), glicina e glicina, nesta ordem.

(B)o é um espaçador opcional e inclui aminoácidos que podem estar acontecendo naturalmente ou aminoácidos que podem estar acontecendo não-naturalmente, tal como a descrição acima. Cada B é independentemente o mesmo ou diferente. As proteínas carreadoras são covalentemente ligadas aos peptídios com um espaçador (por exemplo, Lys-LysLys), por acoplamento químico. Os aminoácidos de B também podem fornecer um espaçador, por exemplo, Gly-Gly, ou ( -N)Lys, entre o epítopo da Th promíscua (por exemplo, SEQ. ID. N.:9) e o peptídio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.:5) e análogos imunológicos funcionais e de ligação cruzada destes. Além de separar fisicamente o epítopo de Th do epítopo da célula B, ou seja, o peptídio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.:5) e análogos imunológicos destes, os espaçadores podem romper quaisquer estruturas secundárias de artefato, criadas pelo acoplamento do epítopo de Th com o peptídio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.:5) e análogos imunológicos funcionais e de ligação cruzada destes, e desse modo eliminar a interferência entre as respostas da célula B e/ou da Th. Os aminoácidos de B também podem formar um espaçador que age como uma dobradiça flexível que au27 menta a separação dos domínios da Th e da IgE. C?ê eiceriipiCfe.fle.^oqliê.ã-. cias de codificação de dobradiças flexíveis são encontrados na região da dobradiça de cadeia pesada de imunoglobulina. As seqüências de dobradiça flexível são freqüentemente ricas em prolina. Uma dobradiça flexível particularmente útil é fornecida pela seqüência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ. ID. N.:16), onde Xaa é qualquer aminoácido, e de preferência, ácido aspártico. A separação adaptável fornecida pelos aminoácidos de B permite interações mais eficazes entre o imunógeno de peptídio apresentado e as apropriadas células Th e células B, e, deste modo, aumenta as imunorrespostas para o epítopo da Th e o epítopo produtor de anticorpos e seus análogos imunológicos funcionais e de ligação cruzada destes.

A Th é uma seqüência de aminoácidos (aminoácidos naturais ou não-naturais) que inclui um epítopo de Th. Um epítopo de Th pode consistir em um epítopo contínuo ou descontínuo. Por conseguinte, nem todo aminoácido de Th faz, necessariamente, parte do epítopo. Por conseguinte, os epítopos de Th, incluindo os análogos e os segmentos de epítopos de Th, são capazes de aumentar ou estimular uma imunorresposta para os peptídios do antígeno de lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84, e os análogos imunológicos destes). Os epítopos de Th, que são imunodominantes e promíscuos, são altamente e amplamente reagentes em populações animais e humanas, com tipos de MHC amplamente divergentes (Partidos e outros, 1991; na Patente norte-americana n^e 5.759.551). O domínio de Th dos peptídios presente tem de cerca de 10 a cerca de 50 aminoácidos e, de preferência, de cerca de 10 a cerca de 30 aminoácidos. Quando múltiplos epítopos de Th estiverem presentes (ou seja, m > 2), então, cada epítopo de Th é independentemente o mesmo ou diferente. Os segmentos de Th são porções contíguas de um epítopo de Th, que são suficientes para aumentar ou estimular uma imunorresposta para o peptídio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.:5) e análogos imunológicos do mesmo.

Os epítopos de Th da presente invenção incluem, como exemplos, mas não ficam limitados a eles: epítopos de células auxiliares T do antígeno do núcleo e da superfície de hepatite B (HBs Th e HBc Th), epíto-

pos de células auxiliares T de toxina de coquelucfíê (ΡΤ;Τθ)^:, .ÍpíÍjpçfe^:jíQ? células auxiliares T de toxina de tétano (TT Th), epítopos de células auxiliares T de proteína F de vírus de sarampo (MVF Th), epítopos de células auxiliares T de proteína de membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), epítopos de células auxiliares T de toxina de difteria (DT Th), epítopos de células auxiliares T de circunsporozoíto de Plasmodium falciparum (PF Th), epítopos de células auxiliares T de isomerase de fosfato de triose de Schistosoma mansoni (SM Th) e epítopos de células auxiliares T de TraT de Escherichia coli (TraT Th). A Th derivada do elemento patogênico foi listada como SEQ. ID, Ns.: 2-9 e 42-52, na Patente U.S. N^a 5.759.551; como sítio P11 auxiliar de clamídia, em Stagg e outros, Immunology, 1993; 79; 1-9; e como peptídio HBc 50-69, em Ferrari e outros, J Clin Investe, 1991; 88: 214-222, e estão aqui apresentados a título de referência.

Os sítios exemplares da Th da presente invenção incluem também o sítio artificial da Th chamado de Syn Th (1,2,4)” (SEQ. ID. N.:9), os sítios artificiais da Th da SSAL (1,4,9 PALINDROMIC)Th, ”IS (1, 4, 9 PALINDROMIC) LF Th e IS (1, 4, 9 PALINDROMIC) Th simplificada de LF (SEQ. ID. Ns.: 10, 11 e 60), e os análogos destes, imunologicamente funcionais. Os análogos funcionais de Th incluem análogos amplamente imunes, análogos de ligação cruzada e segmentos de quaisquer destes epítopos de Th. Os análogos funcionais de Th também incluem substituições conservadoras, adições, deleções e inserções de um até cerca de dez resíduos de aminoácido no epítopo de Th que não modificam, essencialmente, a função estimulante da Th do epítopo da Th.

O peptídio sintético da presente invenção geralmente é de cerca de 50 a cerca de 90 aminoácidos, e inclui:

(a) um domínio de invasina imunoestimulador, (b) um epítopo da célula T auxiliar (Th), e (c) um peptídio de antígeno de domínio lgE-CH3.

Mais especificamente, os peptídios sintéticos da presente invenção são descritos pelas fórmulas:

(A)n-(Th)m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-X,

em Alume 0,4%, 5 pg/0,2 ml/dose. As imunizações e as sensibilizações sas são realizadas em grupos de controle pela administração do adjuvante com solução salina tamponada por fosfato. Os grupos são tal como segue:

1: Imunização/sensibilização falsa, com peptídio de SEQ ID NO:24 e Alume 0,4%

2: Imunização/sensibilização, com peptídio de SEQ ID NO:24 e

DNP-KLH

3: Imunização Falsa/sensibilização, com Freunds e DNP-KLH 4: Imunização/sensibilização falsa, com peptídio de SEQ ID NO:

e Alume 0,4%

5: Imunização/sensibilização, com peptídio de SEQ ID NO:25 e

DNP-KLH

O soro é coletado nas semanas 0, 5, 7, 9, 10, 11, 13, 16 e 20. Os esplenócitos são preparados a partir de pares de camundongos de cada grupo, na semana 10 e 11.

A resposta de IgG para os antígenos de peptídio e DNP é monitorada por ensaios ELISA convencionais, ao se empregar um conjugado de peroxidase de rábano silvestre de IgG anticamundongo, e pratos de microtitulação, cujas cavidades são cobertas com não conjugado peptídio de antígeno do domínio lgE-CH3 de camundongo, (SEQ. ID. N.:8) para ELISA de peptídio, e pratos cobertos com conjugado de DNP-BSA para ELISA de DNP. A reatividade cruzada de anticorpos anti-SEQ ID NOs: 24 e 25 com IgE de camundongo é monitorada por um ensaio ELISA de IgG convencional, em pratos cobertos com IgE SPE 7 (Sigma) monoclonal de camundongo. A resposta de IgG para imunógenos de peptídio é comparada com a reatividade cruzada de IgE de camundongo entre os grupos, ao longo do período de 20 semanas, para determinar: 1) as respostas primárias e secundárias, 2) a presença de imunossupressão indesejável de capacidade de resposta de IgG, e, 3) a ocorrência de uma redução desejável em reatividade anti-lgE, durante a semana 10 e 20, como evidência de reversibilidade e segurança da resposta do anticorpo para a composição de peptídio da presente invenção.

Nas semanas 7, 9, 10, 11, 13 e 16, a resposta da IgE é monitorada por ensaio ELISA completo de IgE e por ensaio ELISA específico ao

a formação de uma alça de dissulfeto efítreia^OtSíeinaè rçtiâjSá? para produzir uma estrutura cíclica.

As referidas estruturas cíclicas também incluem de 1 a 5 aminoácidos adicionais tirados de ambos os terminais do segmento 413-435 de IgE, desde que a única estrutura de alça de dissulfeto seja preservada. Um antígeno alvo aperfeiçoado para IgE humana de seqüência Cys- Gly- GluThr- Tyr- Gin- Ser- Arg- Vai- Thr- His-Pro- His- Leu- Pro- Arg- Ala- Leu- MetArg- Ser- Thr- Thr- Lys- Cys (SEQ. ID. N.: 5) é fornecido pela presente invenção. O antígeno alvo de IgE humana é ciclizado através de cisteínas não-naturais do terminal e o primeiro resíduo de serina em vez do resíduo de cisteína da seqüência natural. O anticorpo que é evocado por imunógenos de peptídio que incluem este antígeno de domínio igE-CH3 tem reação cruzada com IgE humana e inibe a sensibilização de basófilos humanos por IgE humana.

Do mesmo modo, as seqüências do antígeno de domínio IgECH3 correspondentes à IgE de outra espécie podem ser derivadas do segmento homólogo da cadeia ε de espécie relevante. Por exemplo, tais seqüências alvo podem ser tiradas das seqüências de cadeia ε de cachorro, de rato e camundongo mostradas na Tabela 1, como SEQ. ID. Ns.: 2, 3 e 4, e a seqüência eqüina publicada por Navarro e outros, e as seqüências do antígeno de domínio lgE-CH3, como SEQ. ID. Ns.: 6, 7, 8 e 84 podem ser derivadas.

Os análogos imunologicamente funcionais e de reação cruzada dos peptídios do antígeno de domínio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84), de acordo com a presente invenção, também podem compreender substituições conservadoras, adições, deleções ou inserções de um até cerca de quatro resíduos de aminoácido, desde que os análogos de peptídio resultantes sejam capazes de produzir imunorrespostas de reação cruzada com os peptídios de lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84). As substituições conservadoras, as adições e as inserções podem ser realizadas com aminoácidos naturais ou não-naturais, tal como aqui definidos.

As composições de peptídio que contêm misturas do imunóge/1 :'t ·. Yí: ϊ Y Υ· nos de peptídio presente com dois ou mais epítopos-de síynfierttár y a imunoeficácia em uma população mais ampla e, deste modo, fornecer uma imunorresposta melhorada para o antígeno de domínio lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84).

Os imunógenos de peptídio da presente invenção podem ser feitos por métodos de síntese química que são bem conhecidos por elementos ordinariamente versados na técnica. Vide, por exemplo, Fields e outros, Capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Cia., New York, NY, 1992, pág. 77. Quando um imunógeno de peptídio inclui uma Th da SSAL, o acoplamento dos aminoácidos alternativos em uma determinada posição variável é realizado pelo fornecimento de uma mistura dos aminoácidos especificados para aquela posição. Por conseguinte, os peptídios podem ser sintetizados, através do uso das técnicas automatizadas de Merrifield de síntese de fase sólida com a a-NH2 protegi15 dos ou por uma química de Fmoc ou f-Boc, usando aminoácidos protegidos da corrente lateral em, por exemplo, um Sintetizador Aplicado de Peptídio de Biossistemas Modelo 430 A ou 431.

Depois da montagem completa do imunógeno de peptídio desejado, a resina é tratada de acordo com os procedimentos normais para clivar o peptídio da resina e desbloquear os grupos funcionais das correntes laterais de aminoácido. O peptídio livre é purificado, por exemplo, por meio de HPLC, e caracterizado bioquimicamente, por exemplo, através da análise do aminoácido, de espectrometria da massa, e/ou por seqüenciamento. Os métodos de purificação e caracterização de peptídios são bem conhecidos por aqueles elementos ordinariamente versados na técnica.

Outros recursos químicos para gerar os construtos de peptídio sintético da presente invenção que contêm sítios de IgE e Th incluem a ligação de peptídios haloacetilatados e cisteínados, através da formação de uma ligação “tioéter. Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada ao terminal C de um peptídio que contém Th e o grupo tiol de cisteína pode ser utilizado para formar um laço covalente com um grupo eletrofílico, tal como um grupo modificado por cloroacetila N ou um grupo a- ou ε-ΝΗρ derivado »·*··»· *· '· ' »^· * · de maleimlda de um resíduo de lisina ligado ao terifiin^l 'ζΐ d® Sp®ptfòjSo'4 lgE-CH3 (por exemplo, SEQ. ID. N.: 5) ou análogos imunológicos funcionais e de reação cruzada destes. Nesta maneira, uma construção com Th(antígeno de domínio lgE-CH3) ou seu reverso, (antígeno de domínio IgECH3)-Th, pode ser obtida.

O presente imunógeno também pode ser polimerizado. A polimerização pode ser realizada, por exemplo, por reação do imunógeno com um reagente de reticulação, por exemplo por reação entre glutaraldeído e os grupos -NH2 de resíduos de lisina, pelo uso de metodologia rotineira. Por outro método, um imunógeno sintético, como por exemplo Th A_mespaçador-(antígeno de domínio lgE-CH3), pode ser polimerizado ou copolimerizado com outro imunógeno por meio da utilização de uma cisteína adicional somada ao terminal N do imunógeno sintético. O grupo tiol da cisteína do terminal N pode ser usado para a formação de um laço de tioéter¹' com aminoácido modificado por haloacetila ou um grupo a-NH2 ou εNH2 derivado de maleimida de um resíduo de lisina que está ligado ao terminal N de uma molécula ramificada do núcleo de poli-lisil (por exemplo, K2K, K4K2K ou K8K4K2K). O presente imunógeno também pode ser preparado como um polímero ramificado através da síntese da construção de peptídio desejada, diretamente sobre uma resina ramificada do núcleo de poli-lisil (Wang e outros, Science, 1991; 254: 285-288).

Alternativamente, os imunogenos mais distantes de peptídio sintético podem ser sintetizados por meio de técnicas recombinantes de DNA bem conhecidas. Muitos manuais padrão de tecnologia de clonagem molecular fornecem protocolos detalhados para a produção de peptídios da presente invenção, por expressão de DNA e RNA recombinantes. Para construir um gene que codifique um peptfdio da presente invenção (por exemplo, peptídios imunogênicos que incluem a SEQ. ID. Ns.: 5-8 e 84, e outros homólogos específicos de outra espécie), a seqüência de aminoácido é reversa, traduzida em uma seqüência ácida nucléica, de preferência, pelo uso de códon aperfeiçoado, no organismo em que o gene será expresso. Logo em seguida, um gene que codifica o peptídio é feito, tipicamente através da síntese de oligonucleotídeos sobrepostos que códiScâmio $epífcfi.<J p; necessários elementos reguladores. O gene sintético é ajuntado e inserido no vetor de expressão desejado. As seqüências de ácidos nucléicos sintéticos englobadas pela presente invenção incluem aquelas que codificam os peptídios da presente invenção, homólogos imunologicamente funcionais, e construtos de ácido nucléico caracterizados por mudanças nas seqüências de não codificação que não alteram as propriedades imunogênicas do peptídio codificado relacionado a elas. Os ácidos nucléicos que incluem seqüências que codificam os peptídios da presente invenção também são fornecidos. O gene sintético é inserido em um vetor de clonagem satisfatório e os recombinantes são obtidos e caracterizados. O peptídio é então expresso sob condições apropriadas para o sistema de expressão e hospedeiro selecionados. O peptídio é purificado e caracterizado por métodos padrão.

Os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser úteis como componentes das denominadas vacinas de DNA. Nesta modalidade da invenção, a expressão dos peptídios imunogênicos da presente invenção é induzida nas próprias células do paciente, por introdução naquelas células de ácidos nucléicos que codificam os peptídios. Os métodos de produção e para o uso das vacinas de DNA são apresentados nas Patentes U.S. números 5.580.859, 5.589.466 e 5.703.055; vide também WO 97/02840 e W. McDonnell e F. Askari, New Engl. J. Med., 1996, 334: 2-45, todos as quais estão aqui incorporadas a título de referência. Esses métodos de produção e para o uso dos peptídios e os conjugados de peptídio da presente invenção são fornecidos a título de ilustração e não se prestam a limitar o âmbito da invenção.

A eficácia de qualquer composição de peptídios da presente invenção pode ser estabelecida por teste in vitro, no qual o animal hospedeiro é imunizado com uma composição de peptídios da presente invenção e os anticorpos resultantes são mostrados para inibir a sensibilização de basófilos e mastócitos por IgE, tal como está mostrado nos Exemplos 2 e 6. A eficácia da invenção pode ser estabelecida in vivo, através da injeção de um hospedeiro com uma composição de peptídio apropriada à espécie (por

exemplo, imunizar camundongos com uma formulação: de-loôúpfôgêjiQé Çbç” compreende a SEQ. ID. Ns.: 24 e/ou 25), seguida pelo monitoramento da imunorresposta humoral ao peptídio lgE-CH3 e homólogos imunológicos funcionais e de reação cruzada destes, tal como detalhes contidos no Exemplo 5.

Um outro aspecto da presente invenção apresenta uma composição de peptídios que inclui uma quantidade imunologicamente eficaz de um ou mais dos imunógenos de peptídios da presente invenção em um sistema de distribuição farmaceuticamente aceitável. Por conseguinte, os peptídios presentes podem ser formulados como uma composição farmacêutica ao se empregar adjuvantes, veículos farmaceuticamente aceitáveis, ou outros ingredientes habitualmente fornecidos em composições de vacina. Entre os ingredientes que podem ser usados na presente invenção estão os adjuvantes ou emulsificantes, incluindo alume, adjuvante incompleto de Freund , liposina, saponina, escaleno, L121, emulsígeno, lipídeo A monofosforil (MPL), QS21, ISA51, ISA35, ISA 206 e ISA 720, como também outros adjuvantes e emulsificantes eficazes conhecidos. As formulações incluem formulações para liberação imediata e/ou para liberação prolongada, bem como para indução de imunidade sistêmica e/ou imunidade localizada de mucosa, que pode ser realizada através de, por exemplo, armadilha de imunógeno por ou com co-administração de micropartículas. Tais formulações são prontamente determinadas por um elemento de competência ordinária na técnica, bem como os métodos para a preparação, a preservação e a esterilização de tais formulações são conhecidos por aqueles elementos versados na técnica.

Os presentes compostos farmacêuticos podem ser administrados por qualquer via conveniente, incluindo a via subcutânea, oral, intramuscular, ou outra via parenteral ou enteral. De forma semelhante, os compostos farmacêuticos podem ser administrados como uma dose única ou doses múltiplas. As programações de imunização são prontamente determinadas pelo elemento ordinariamente versado na técnica.

A composição farmacêutica da presente invenção contém uma

Ί quantidade eficaz de um ou mais dos imunógenoside pepiídro.iJaipresêjite? invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição em uma forma satisfatória de unidade de dosagem contém em geral de cerca de 0,5 pg a cerca de 1 mg do imunógeno por kg do peso corpóreo. Quando oferecida em doses múltiplas, pode ser convenientemente dividida em uma quantidade apropriada, tal como a forma da unidade de dosagem. Por exemplo, uma dose inicial, por exemplo de 0,2 a 2,5 mg; de preferência, 1 mg, de imunógeno representado como uma composição de peptídio da presente invenção, pode ser administrada por injeção, de preferência, via intramuscular, seguida por doses repetidas (reforço). A dosagem vai depender da idade, do peso e do estado geral de saúde do paciente, como é bem conhecido por aqueles elementos versados nas técnicas de vacinação e terapêutica.

A imunorresposta para os imunógenos de peptfdios lgE-CH3 sintéticos pode ser melhorada por distribuição, através de captura em ou sobre micropartículas biodegradáveis do tipo descrito por O'Hagan e outros (Vaccine, 1991; 9: 768-771). Os imunógenos podem ser encapsulados com ou sem um adjuvante em micropartículas biodegradáveis, para aumentar a potência das imunorrespostas, inclusive a imunidade localizada de mucosa, que pode ser especialmente aplicável para reações alérgicas localizadas na mucosa, bem como para fornecer liberação controlada por tempo para respostas periódicas ou prolongadas, para administração oral e para administração tópica (O'Hagan e outros, 1991; Eldridge e outros, Molec. Immunol., 1991; 28: 287-294).

As composições farmacêuticas da presente invenção são usadas de uma forma similar àquelas de vacinas, para a prevenção de reações alérgicas atópicas, incluindo rinite alérgica, aquelas de alergias de alimentos, asma, anafilaxia, dermatite de alergia de pulga e outras hipersensibilidades mediadas por IgE.

Todas as referências feitas de patentes e literatura foram aqui apresentadas a título de referência.

Os imunógenos conjugados de peptfdios e o peptídio específico

são fornecidos nos exemplos seguintes para ilustiar ã prespnfe .if]vçh|âo.;! Estes exemplos são somente a título de ilustração e não devem ser interpretados como uma limitação do âmbito da presente invenção, de qualquer maneira.

EXEMPL01

IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS EFETORES POTENCIAIS NA MOLÉCULA DE

IgE HUMANA Elaboração do Peptídio

Os sítios dentro dos domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada ε de IgE humana foram selecionados através de imitação de peptídios, de acordo com as descrições de Helm e outros (1988) e Presta e outros (1994), onde um longo segmento da cadeia ε que sobrepõe ambos os referidos domínios participa na ligação de IgE ao receptor de FceR1. As seqüências de tais sítios foram sintetizadas como peptídios do sítio alvo e obteve-se os peptídios por (1) ligação deles através de acoplamento químico com as proteínas carreadoras grandes, tal como KLH, ou pela (2) construção de peptídios, onde a Th promíscua e Ihv (SEQ. ID. N.:13) foram ligados ao terminal de amino dos sítios alvo. Os sítios específicos dentro destes domínios foram selecionados como peptídios para ciclotização, com base nas predi20 ções feitas pelo modelo tridimensional Brookhaven para IgE humana (http:www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids) de alças expostas de superfície. Os obstáculos cíclicos especificados foram instalados na elaboração destes peptídios para maximizar as reações cruzadas entre os antígenos e a molécula nativa de IgE. Por conseguinte, alguns dos construtos sintéticos foram sintetizados com cisteínas introduzidas não encontradas na seqüência nativa para a produção de alças ligadas de dissulfeto, de posição especificada, imitando estruturas de alças preditas pelo modelo Brookhaven. Em alguns casos, cisteínas que ocorrem naturalmente foram substituídas por serinas, para prevenir a formação de conformações não favorecidas pelo modelo.

Os construtos são listados na Tabela 2. Os peptídios marcados por'* na coluna de descrição da Tabela 2 são ciclizaçlos por laços de dissulfeto de cisteína. Os resíduos de cisteína que foram inseridos na seqüên37 cia nativa para ciclotização são denotados nas seqüêhciãs.3q da Tabela 2 entre parênteses, outros resíduos que foram inseridos, no lugar de um resíduo nativo, ou são cisteínas naturais que participam nos laços de dissulfeto estão indicados nas seqüências de aminoácido da Tabela 2 pelo uso de sublinhado. Outros peptídios são lineares. Os peptídios identificados por a” na terceira coluna representam a lgE-CH2/3 ou o peptídio de antígeno de CH3, quimicamente ligados à proteína carreadora de KLH por glutaraldeído convencional ou por reações de acoplamento de MBS (mMaleimidobenzoil-N-éster hidroxissuccinimida, Pierce Chemical Co., catálogo N² 22510). Os peptídios marcados por “b na terceira coluna foram sintetizados como peptídios de antígeno de IgE em série com os sítios de Th mostrados. Os sítios de Th usados incluem a HBsi 9-32 Th tirada do vírus de hepatite B, a MVf Th tirada do vírus de sarampo e PT149-146 Th tirada de toxina de coqueluche, tal como referência feita na Patente U.S. N² 5.759.551, a CT Th chamada P11 (Stagg e outros, 1993) e novos sítios de Th artificiais chamados 1,4,9 Th PALINDROMIC (SEQ. ID. N.: 10), IS(1,4,9 PALINDROMIC)LF Th (SEQ. ID. N.: 11), IS(1,4,9 PALINDROMIC)Th simplificada de LF“ (SEQ. ID. N.: 60), e Syn Th (1,2,4) (SEQ. ID. N.: 9). Os peptídios marcados por c são variantes dos construtos b sintetizadas em série com o domínio de peptídio imunoestimulador de Inv (SEQ. ID. N.: 13).

Os construtos b“ e “c também foram sintetizados com espaçadores Gly-Gly para separação do sítio alvo de antígeno CH3 ou lgE-CH2/3 proveniente do sítio da Th, e separação da Th do sítio imunoestimulador de inv. Os construtos b e c da Tabela 2 tiveram os domínios de Th e/ou Inv ligados ao terminal do amino do sítio alvo de IgE. Os imunógenos de peptídios da Tabela 2 foram classificados como candidatos de peptídios antigênicos alvo para o tratamento de alergia, por hiperimunização de animais seguida por teste do soro hiperimune para reatividade cruzada em IgE humana.

• ; · · · » » ·· ·· ·····

Procedimentos Específicos para Classificação de fcanSdidátds Je-Pecftftífogi

Antiqênicos Alvo:

1. Síntese de Peptídios de Antíqenos de domínio lqE-CH3 e Conjugados.

Os peptídios listados na Tabela 2 foram sintetizados pela técnica de síntese de fase sólida Merrifield em sintetizadores automatizados de peptídio da Applied Biosystems, ao se empregar química de Fmoc. Quando um imunógeno de peptídio incluiu uma Th da SSAL, o acoplamento de um dos aminoácidos alternativos em uma determinada posição variável foi realizado pelo fornecimento de uma mistura de aminoácidos em proporções molares equivalentes. Depois da montagem completa do peptídio desejado, a resina foi tratada, de acordo com os procedimentos normais, ao se empregar ácido trifluoroacético para clivar o peptídio da resina e desbloquear os grupos funcionais das correntes laterais de aminoácido. Para os peptídios cíclicos, os peptídios clivados foram dissolvidos em DMSO a 15%, em água, durante 48 horas para facilitar a formação de laço de intradissulfeto entre as cisteínas.

2. Imunizações Experimentais.

Os ratos ou os porquinhos-da-índia foram imunizados por via intramuscular, com imunógenos experimentais de peptídio. A dose foi de 100 pg de peptídio suspenso em um volume de 0,5 ml. A primeira dose foi administrada com Adjuvante Freunds Completo. As doses subseqüentes foram administradas em Adjuvante de Freunds Incompleto. Os animais receberam injeções nas semanas 0, 3, 6 e 10 ou 0, 2, 4 e 8. Exames de sangue foram feitos em intervalos quinzenais, as reatividades foram determinadas por ELISA de peptídio humano e as reatividades cruzadas foram determinadas por ELISA de IgE humana.

3. Ensaios ELISA.

Os ensaios ELISA de peptídios, para a determinação da reativif (9 dade anti-lgE do peptídio, foram realizados em pratos de microtitulação de 96 cavidades cobertos de peptídio, cobertos por uma hora, de incubação, a 37°C, com um peptídio '^a alvo adequado do sítio de antígeno, sem veículo, a 0,5 pg/ml, ao se empregar 100 pl por cavidade, em tampão de 10 mm

NaHCO3, pH de 9,5. Para a determinação de reéffivicjiaçrs ,«u2açfa φ:ΐ0Ε anti-humana, os ensaios ELISAs de IgE humana foram realizados em pratos de microtitulação de 96 cavidades cobertos de IgE humana, cobertos de forma semelhante, com uma proteína de mieloma de IgE humana (American Biosystems, Inc. cat. η. A113) em 5 pg/ml. As cavidades cobertas de peptídio ou de IgE humana foram incubadas com 250 pg de 3% em peso de gelatina, em PBS, a 37°C, por uma hora, para bloquear os sítios nãoespecíficos de ligação de proteína, lavados três vezes com PBS, contendo 0,05% em volume de TWEEN 20 e, posteriormente, secados. As amostras do teste foram diluídas em série com PBS, contendo 20% em volume de soro normal de cabra, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEEN 20. Foram adicionados 100 pl da amostra diluída em cada uma das cavidades e deixados reagir por uma hora, a 37°C. As cavidades foram então lavadas seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN 20 em PBS para remover os anticorpos rotulados soltos. 100 pl de anticorpos de cabra de IgG anti-rato rotulada de peroxidase de raiz forte ou de anticorpos de cabra de IgG anti-porquinho-da-índia, em diluição adequada predeterminada em 1% em volume de soro normal de cabra, 0,05% em volume de TWEEN 20 em PBS foram adicionados em cada uma das cavidades e incubados por trinta minutos, a 37°C. As cavidades foram lavadas seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN 20 em PBS para remover os conjugados de anticorpos rotulados soltos e reagidos com 100 pl da mistura do substrato, contendo 0,04% em peso de ortofenileno diamina (OPD) e 0,12% em volume de água oxigenada a um pH 5,0 de tampão de citrato de sódio, por quinze minutos. As reações foram cessadas pela adição de 100 pl de H2SO4 1,0 M e a absorbância foi medida em A492. As titulações do ensaio ELISA, expressas logio de diluição recíproca, foram calculadas com base na análise linear da regressão das absorbâncias, com corte A492 fixado em 0,5. Este valor de corte foi rigoroso em relação aos valores para a série de amostras normais diluídas de controle do porquinho-da-índia que, em cada ensaio, foi inferior a 0,15.

Resultados ·’ : .>* ,ξ _t . s : _r

Os sítios candidatos alvo do antígeno são descritos na Tabela 2. Eles são mostrados ou como peptídios a ligados ao veículo de KLH ou como peptídios b” ligados aos sítios de Th sintética ou como peptídios c” ligados a Inv e Th sintética. Tanto os ratos quanto os porquinhos-da-índia foram imunizados, de acordo com os Procedimentos Específicos descritos acima, e o anti-soro hiperimune coletado na oitava semana foi analisado por ELISA de antipepTÍDIO e ELISA de IgE anti-humana, de acordo com os Procedimentos Específicos.

Muitos dos imunógenos de peptídios CH2/3 e CH3 eram imunogênicos, à medida que eles evocaram os anticorpos antipeptídios com titulações na faixa de loglO 2-5. Todos os sítios alvo antigênicos CH2/3, incluindo longos segmentos da cadeia humana de 301-376 (esquema de numeração da Tabela 1) tiveram fortes reações cruzadas com IgE humana, tal como demonstrado por titulações de logio no ELISA de IgE anti-humana superior a 3. A reatividade cruzada foi perdida por alguns peptídios de CH3 que iniciaram na posição 342 e além desta (por exemplo, entradas 21 e 22). No entanto, nos peptídios de CH3 que incluíam uma região relativamente pequena, compreendendo 354-372, a reatividade cruzada foi em grande parte restabelecida (por exemplo, entradas 27, 28 e 29), com exceção da entrada 31 (354-368). Outra região pequena de reatividade cruzada é vista na entrada 20 (posições cíclicas de transposição de peptídio 374-385).

Tal como comprovado pela falta de reatividade cruzada das entradas 14, 17, 23, 24, 25, e 26, um trecho da seqüência que se estende de 365 até 413 é destituído de reatividade cruzada, apesar de sobrepor com a região 354-372 de reatividade cruzada e uma região de reatividade cruzada representada pela entrada 20 (374-385). De maneira interessante, as pequenas reatividades cruzadas exemplificadas pelas entradas 27, 28, 29 (354-372) e 20 (374-385) são perdidas na conformação da entrada 17 (365396) do peptídio ciclizado longo, apesar de sua sobreposição naquelas regiões de reação cruzada. Os sítios de reação cruzada que sobrepõem os sítios sem reação cruzada são novamente encontrados em mais de uma

região que começa ao redor da posição 399 e estendí pârá'á posição 445; tal como mostrado pelas reatividades cruzadas das entradas 15 e 30, e as reatividades cruzadas fracas das entradas 19 (432-445) e 23 (404-413). É significativo o fato que, de dois peptídios semelhantemente ciclizados que incluem a posição 418, 15 (413-435) e 18 (404-434), somente a entrada 15 (SEQ. iD. N.:5), em que a cisteína na posição 418 foi substituída por serina, tenha reação cruzada com IgE humana. Um sítio de CH4 que corresponde a um sítio efetor de IgE descrito por Stanworth (Stanworth e outros, Lancet, 1990; 336: 1279-1281) falhou ao mostrar a reatividade cruzada (entrada

34).

Estes resultados demonstram que a reatividade cruzada para peptídios de IgE é um fenômeno complexo influenciado por características adaptáveis, e não podem ser previstas a partir de uma análise direta de peptídios iineares sobrepostos. Os antígenos candidatos do domínio IgE15 CH3 foram selecionados entre os conjugados mostrados, os quais devem ter reação cruzada com IgE humana, na Tabela 2, e usados para análises adicionais.

EXEMPLO 2

IDENTIFICAÇÃO DO SÍTIO EFETOR NA MOLÉCULA de IgE HUMANA

Os peptídios do antígeno do domínio lgE-CH3 foram selecionados para análise adicionai entre aqueles conjugados de peptídio da Tabela que exibiram reatividades cruzadas de grande afinidade com IgE humana, como comprovado por titulações anti-lgE para o seu respectivo anti-soro superior a logio=3. O soro hiperimune de porquinho-da-índia foi produzido tal como a descrição acima. Os anticorpos da IgG de porquinho-da-lndia foram purificados a partir do soro hiperimune, por cromatografia de afinidade da proteína A, e analisados por um ensaio funcional para a determinação da capacidade da anti-lge inibir a sensibilização de basófilos humanos através de IgE alérgena específica. A conclusão do ensaio é expressa como a inibição percentual de liberação de histamina mediada por IgE.

Os anticorpos da IgG de porquinho-da-índia foram purificados a partir do soro, por meio de cromatografia de afinidade da Proteína A (Im-

Γλ

munoPure® Immobiiized Recomb® Protein A, Piercêj, ê os arttiêprpps^-iiií-;» dos foram preparados em uma concentração normal de 8 mg/ml em tampão PIPES de 25 mm, 0,15 M NaCl, pH 7,2. Uma preparação de controle anticorpo foi preparada a partir do soro reunido de porquinhos-da-índia imunizadas com um imunógeno de peptídio irrelevante. Estes anticorpos foram usados em ensaios que medem a redução da sensibilização mediada por IgE de basófilos humanos. Os basófilos humanos foram preparados a partir do sangue venoso de voluntários, utilizando centrifugação dos gradientes de densidade de Percoll (MacGlashan. J Alfergy Clin Immunol, 1993; 91: 605-615). Os leucócitos associados foram coletados, lavados e resuspensos em 0,1 ml de tampão PAGCM, tal como descrição (MacGlashan, 1993), a não ser que o tampão PAGCM utilizado para suspender as células seja formado com água que contenha 44% D2O. A IgE utilizada para o ensaio era específica ao alérgeno, ou IgE humana específica ao BPO, ou IgE humana quimérica específica à glicoproteína gp120 de HIV. A IgE específica ao alérgeno utilizada para sensibilização, em 0,25 pg/mí, foi pré-incubada, com um volume igual de anticorpos purificados de porquinho-da-índia, em 8 mg/ml, volume total de 0,1 ml, por 15 minutos, a 37° C, antes de ser adicionada aos basófilos. A mistura de anticorpos foi adicionada às células e incubada por vinte minutos para permitir a sensibilização das células por IgE não complexa. As células sensibilizadas foram então estimuladas pela adição do alérgeno, ou BPO21-HSA ou um polipeptídio gp120, tal como na descrição (MacGlashan, 1993).

Depois de um período de incubação adequado (normalmente de 45 minutos), as células foram separadas do sobrenadante e o sobrenadante foi analisado quanto ao teor de histamina, por meio de uma técnica fluorimétrica automatizada (Siraganian, Biochem Anal, 1974; 57: 383-394). Todas as reações foram executadas em duplicata, A porcentagem de liberação de histamina foi calculada a partir da proporção da amostra com a histamina total, depois que a liberação espontânea foi subtraída de ambas. Os resultados são expressos como a inibição percentual de liberação de histamina, tal como determinado pela proporção de liberação de histamina por anticor30 po experimental pela liberação de histamina pelo $hti<5oi#b.JjQjÇQtitPQfé.êe? especificidade irrelevante. Os ensaios de liberação de histamina em basófilos humanos foram suavemente executados, sob as condições codificadas pelo Dr. Donald W. MacGlashan, The Johns Hopkins University School of Medicine, Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Baltimore.

Resultados

Os resultados dos ensaios para a inibição de liberação de histamina são apresentados na Tabela 3 para anticorpos antipeptídio de porquinhos-da-índia que exibiram reatividades cruzadas para IgE humana de Ιθ910 >3. As determinações foram feitas a partir de anticorpos purificados provenientes de sangramento na 8^a semana, com exceção dos anticorpos contra as entradas de peptídio 15b e 15c que também foram caracterizados a partir do soro coletado na 12^a semana. Os resultados de inibição mostrados para os anticorpos anti-15b e anti-15c, de 61% e 71%, foram feitos com anticorpos purificados provenientes de sangramento, retirados na 8^a e na 12^a semana, respectivamente. Os animais separados foram imunizados com 15b e 15c, mas os anticorpos de ambos os grupos de animais foram aglutinados nos resultados da 8^a e da 12^a semana, os quais são mostrados na Tabela 3. (Os porqulnhos-da-índia destes grupos receberam uma dose adicional de conjugado de peptídio na 10^a semana e assim retiveram níveis altos de anticorpo no sangramento na 12^a semana). A significativa reatividade inibitória dos anticorpos anti-15 foi inesperada, em comparação com as reatividades dos anticorpos de reação cruzada da IgE evocados pelo remanescente dos peptídios mostrado na Tabela 3. Estes outros peptídios antigênicos do domínio lgE-CH3 falharam ao fornecer inibição, ou apresentaram níveis de inibição para liberação de histamina que eram desprezíveis e não-reproduzíveis.

Os resultados de inibição de liberação de histamina e as reatividades cruzadas para os anticorpos produzidos pelos peptídios de antígeno do domínio lgE-CH3 que se sobrepõem com o sítio antigênico (SEQ. ID. N.: 5) das entradas 15b (SEQ. ID. N.: 14) e 15c (SEQ. ID. N.: 15) podem ser comparados. Os antígenos de IgE representados pelas entradas de peptídio /

19, 23, 24 e 33 compreendem pequenas sobreposições .φόφ %.errada·.15? para reatividade cruzada com a IgE, e são destituídos de atividade inibitória. A seqüência de antígeno de IgE (SEQ. ID. N.: 44), de entrada 18, inclui a seqüência completa de antígeno da entrada 15, a não ser que (1) a lisina terminal de carboxila seja deletada, (2) a cisteína que ocorre naturalmente na posição 418 esteja retida, e (3) haja nove aminoácidos adicionais no terminal-N, Não tem reação cruzada com IgE e falha ao inibir a liberação de histamina. Em contraste, os imunógenos da entrada 15, tendo a SEQ. ID. N.: 5 de antígeno, fornecem reatividades inesperadas. A seqüência de antígeno do domínio lgE-CH3 da entrada 15, com uma estrutura cíclica especificada pelas cisteínas introduzidas do terminal, e sem contribuição da cisteína na posição 418 (a qual foi substituída), fornece um antígeno que tem reação cruzada com a IgE e produz anticorpos que inibem a sensibilização da IgE,

Os anticorpos produzidos pelas entradas 15b (SEQ. ID. N.: 14) e 15c (SEQ. ID. N.: 15) foram preparados a partir do sangramento da 13^a semana e testados individualmente. Na 13® semana, ambas as reatividades cruzadas para IgE, como determinado pelo ELISA de IgE, e a inibição percentual da liberação de histamina diminuíram, em relação aos valores da 12® semana. Não obstante, foi verificado que os anticorpos de ambas as preparações são individualmente eficazes na redução da liberação de histamina: anti-15b inibiu 28% e anti-15c inibiu 20%.

A extensão até a qual a liberação de histamina foi inibida por qualquer um destes anticorpos foi dependente da dose, tal como comprovado pelo efeito de diluição nos anticorpos. Quando uma preparação de anti15b da 13® semana foi analisada em concentração completa (8 mg/mi), posteriormente, em diluições 1:3 e 1:9, a inibição percentual de liberação de histamina foi de 28%, 21 % e 14%, respectivamente.

Uma preparação de anti-15b de porquinho-da-índia foi testada por desafio direto de basófilos sensibilizados por IgE, na ausência de alérgeno, como uma avaliação de sua capacidade de apresentar ligação cruzada com a IgE ligada ao receptor e induzir a desgranulação. A liberação de histamina por anti-15b foi equivalente ao nível de liberpçâõ.éteBQQtâR^sf.^Ç? histamina pelas células do doador. Isto indica que o anticorpo de especificidade para o antígeno da IgE da SEQ. ID. N.: 5 é não-anafilactogênico. Deste modo, a imunização ativa com imunógenos conjugados de peptídio que inclui a SEQ. ID. N.: 5 (SEQ. ID. Ns.: 14 e 15) do antígeno do domínio lgE-CH3 produz anticorpos anti-lgE não-anafilactogênicos que inibem a sensibilização mediada por IgE sem que eles mesmos causem a liberação de histamina. Estes anticorpos policlonais ativamente evocados exibem uma especificidade para um sítio efetor da IgE que não foi descrita por estudos anteriores, incluindo os estudos anteriores de anticorpos monocionais antilgE não-anafilactogênicos e terapêuticos, destinados para o tratamento de alergia por imunização passiva (Patentes U.S. números 4.940.782 e 5.420.251, e Presta e outros, 1993).

EXEMPLO 3

ESPECIFICIDADE DE ISOTIPO E CAPACIDADE PARA IMUNOSSUPRESSÃO

Os anticorpos policlonais produzidos por imunorresposta ativa para as SEQ. ID. Ns.: 14 e 15 foram examinados quanto à especificidade para IgE, em comparação com a IgG. Os anticorpos anti-15b de porquinhosda-índia descritos no Exemplo 2, que foram preparados a partir do sangramento da 12^a semana, foram submetidos a uma comparação paralela de reatividades cruzadas à IgE e à IgG, pelo ensaio ELISA da IgE descrito no Exemplo 1 e por um ensaio ELISA da IgG similar. Para o ensaio ELISA da IgE, foram utilizados pratos cobertos com a mieloma de IgE humana, em 5 pg/ml. Para o ensaio ELISA da IgG, os pratos foram cobertos com IgG humana purificada (IgG humana de grau reagente Sigma), também em 5 pg/ml. O anti-15b purificado de porquinho-da-índia foi testado quanto às reatividades em ambos os ensaios ELISA, a concentrações de 0,5 e 0,1 pg/ml. Os resultados foram comparados com os anticorpos purificados provenientes do soro de controle de porquinho-da-índia e com um controle de nenhum anticorpo. Os valores A₄₉₀ para o anticorpo anti-15b na IgE foram de 1,126 em 0,5 pg/ml e 0,344 em 0,1 pg/ml. Qs valores A490 para o anti-

corpo anti-15b na IgG foram iguais aos valores do anticorpo de controle e aos valores antecedentes. Não houve nenhuma reatividade cruzada do anti15b de porquinho-da-índia com a IgG humana. A composição de peptidio da presente invenção não incitou anticorpos que reconhecem os anticorpos de

IgG, e, portanto, são isotipos, específicos à IgE. Eles irão suprimir as reações alérgicas mediadas por IgE e não irão resultar em imunossupressão indesejável de respostas protetoras de anticorpo da IgG.

EXEMPLO 4

CONJUGADOS REPRESENTATIVOS DE PEPTÍDIO DA INVENÇÃO 10 Os conjugados imunogênicos de peptídios da presente invenção apresentados na Tabela 4A, que são peptídios completamente sintéticos, foram sintetizados pelo método de fase sólida esboçado no Exemplo 1. Cada peptidio da Tabela pode ser representado pela fórmula (A)n-(Th)m(B)o-(antígeno do domínio lgE-CH3)-X, mas os peptídios das outras fórmu15 Ias apresentadas acima devem abranger os peptídios da presente invenção. A seqüência do antígeno do domínio lgE-CH3 é a SEQ. ID. N.: 5, 6 ou 8, nos peptídios da Tabela 4A, mas deve-se saber que as seqüências homólogas do antígeno do domínio lgE-CH3 provenientes de outras espécies mamíferas devem abranger os peptídios da presente invenção. Os peptídios imunogênicos compreendem os sítios da Th derivada de elementos patogênicos estranhos (por exemplo, SEQ. ID. N.: 20, 87), e também da Th artificial (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 14, 18, 21 e 90). Além dos exemplos apresentados na Tabela 4A, outra Th relacionada ao elemento patogênico pode ser selecionada entre os sítios da Th promíscua exemplificada na Tabela 5, bem como a Th artificial pode ser selecionada entre os sítios da Th exemplificada na Tabela 6. Cada peptidio deste exemplo tem espaçadores Gly-Gly ou ( -N)Lys entre os elementos imunogênicos, mas os peptídios da presente invenção podem ter outros espaçadores (por exemplo, SEQ. ID. N.: 16) ou nenhum espaçador.

Os peptídios destes exemplos também incluem um sítio opcional imunoestimulador Inv (por exemplo, SEQ. ID. Ns.: 15-19 e 22). Deve ficar entendido, no entanto, que a presente invenção não fica limitada ao Inv,

como um elemento imunoestimulador adicional. Tal çonK\rôofetràdq:pelô;! conjugado de KLH, o conjugado de peptídio da presente invenção também inclui um antígeno do domínio lgE-Ch3 acoplado a uma proteína carreadora.

Materiais e Métodos

Os construtos representativos de peptídios da presente invenção, tal como listado na Tabela 4A (SEQ. ID. Ns.: 18, 85, 87, 88, 90 e 91) foram sintetizados, clivados, ciclicizados e purificados, tal como na descrição no Exemplo 1. O construto de peptídio foi formulado para imunização em animais pequenos, tal como em porquinhos-da-índia, ou em animais maiores, tais como porcos ou babuínos, para a avaliação de suas capacidades imunogênicas. Os peptídios foram suspensos em um volume de 0.5 ml, contendo emulsificantes ou adjuvantes representativos, tais como ISA51,

ISA720, DDA ou lipídeo A monofosforil (MPL). A dose foi de 100 pg de peptídio para porquinhos-da-índia ou 300 pg de peptídio para suínos ou ba15 buínos, e os animais foram imunizados via intramuscular.

Os animais receberam injeção nas semanas 0, 3 e 6 ou nas se--------------------manas 0, 2 e 4, tal como especificado na Tabela 4B. O exame de sangue de oito semanas após a imunização inicial foi avaliado quanto às reatividades cruzadas por ensaio ELISA de IgE humana ou IgE de cachorro, tal como na descrição no Exemplo 1, exceto pelo fato que, para o ensaio ELISA de IgE de cachorro, uma proteína de mieloma de IgE de cachorro (Bethyl Laboratoties Inc., Montgomery TX) foi utilizada para cobertura do prato, em 1 pg/ml, e reagente A/G de proteína rotulada de peroxidase de rábano silvestre (Pierce Chemical Co., Rockford IL) em uma diluição apropriada predetermina25 da foi utilizada como o traçador para a descoberta de IgE de cachorro. As reatividades cruzadas induzidas por peptídio também foram avaliadas quanto à capacidade de inibir a liberação de histamina mediada por IgE. A IgE de porquinho-da-índia, de porco ou de babuíno foi purificada a partir do imunossoro representativo, por meio da cromatografia de afinidade da pro30 teína A, e analisada por um ensaio funcional para a determinação da capacidade de inibir a sensibilização de basófilos humanos através de IgE alérgena específica, tal como na descrição detalhada no Exemplo 2. A conclu69

DNP. Na semana 10 e na 11, as células B do espléftóc3to.$y^ sfecfétam-lgÇ? com especificidade para o DNP são enumeradas pelo ensaio ELISPOT específico ao DNP. Além disso, como os níveis de IgE do soro não podem ser completamente previstos quanto à anafilaxia, ou seja, as determinações da IgE podem perder efeitos significativos em sensibilidade in vivo, a sensibilização dos camundongos é medida por ensaio de Anafilaxia Percutânea Passiva de soro de camundongo em ratos (PCA heteróloga). A PCA heteróloga é preferida para o ensaio de PCA autólogo em camundongos porque os mastóides da pele de rato têm seletiva sensibilidade cruzada por IgE de camundongo em vez de IgG de camundongo. Portanto, a reação da PCA heteróloga de camundongo/rato é específica à IgE e não é confundida com a anafilaxia mediada por IgG que pode acontecer em ensaio da PCA autóloga de camundongos (Maekawa and Ovary, J Immunol Methods, 1984; 71:

229-239).

~ Os resultados dos ensaios_ELISA, ELISPOT e PCA são comparados entre os grupos pela imunossupressão de capacidade de resposta de----------------------IgE e pela especificidade isotípica da imunossupressão. Os métodos experimentais estão descritos abaixo.

Ensaio ELISA de IgE Completo

Para um ensaio ELISA medir a IgE total de camundongo no soro, os pratos de microtitulação são cobertos com IgE monoclonal anticamundongo de rato, R35-72 (Pharmingen), a 1 pg/ml. Os pratos são cobertos, lavados e bloqueados, tal como descrito. Os soros de camundongo diluídos em série são adicionados nos pratos e incubados. A IgE capturada é detectada pela reação com IgE monoclonal biotinilada anticamundongo de rato, R35-118 (Pharmingen), acompanhada por adições consecutivas de estreptavidina de rábano silvestre (Pierce) e OPD. Os valores A₄₉₂ estão determinados.

Ensaio ELISA de IgE específico de DNP

Para um ensaio ELISA determinar a IgE de camundongo específica ao hapteno do DNP em soro proveniente de camundongos que foram sensibilizados com DNP-KLH, os cavidades de microtitulação são cobertas

♦ *·**»- ·«· » · com conjugado de DNP-BSA (Molecular Probes, íhc.|, st g^:yij/niL A capturada com especificidade para o hapteno do DNP é detectada tal como o descrito acima.

Ensaio ELISPOT específico de DNP

Para um ensaio ELISPOT determinar as células B que secretam

IgE de camundongo específica ao hapteno do DNP, o conjugado de DNPBSA, a 5 pg/ml, é utilizado para cobrir as cavidades de pratos estéreis de <

microtitulação, cavidades essas que são demarcadas com 0,45 pm de filtros * de nitrocelulose, por exemplo, um Prato MULTISCREEN HA (Míllipore Inc.,

Cat. N. MAHAS4510). Os esplenócitos diluídos em série, preparados a partir de camundongos sensibilizados e controlados, são adicionados às cavidades e incubados durante toda a noite, a 37°C, sob CO₂ a 5%. As células são lavadas dos pratos e as células que secretam IgE, com especificidade ao hapteno de DNP, são contadas como manchas localizadas nos filtros que

......... 15 acompanham o fingimento pojyajTticorpo monoclonal de rato conjujado a fosfatase alcalina R35-118 com fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoíla (Sig---------·------ma), como substrato colorido.

PCA heteróloqa

As diluições consecutivas dos soros provenientes de camun20 dongos imunizados/sensibilizados e controlados são injetadas por via intradérmica, nas costas depiladas de ratos Sprague-Dawley machos adultos.

Os animais anestesiados recebem de 10 a 12 injeções de soro diluído em cada uma das três séries paralelas da pele dorsal (50 μΙ/sítio). De cada modelo de injeção, é feita uma réplica em animais duplicados. Depois de um período latente de 24 horas, para a sensibilização efetiva dos mastóides da pele, os ratos são desafiados por intermédio de uma injeção intravenosa de 1 mg de DNP-BSA, em corante azul 1% Evans, em PBS. Entre 30 minutos a 1 hora, os ratos são asfixiados e esfolados, de forma que as reações azuladas possam ser observadas na parte interior da pele dorsal. Uma titulação da PCA é determinada a partir da mais alta diluição do soro, da qual resulta uma mancha prontamente definível.

EXEMPLO 6 .........^.. ··· ··’

IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS E INIBIÇÃO DE ANAFILAXIA PASSIVA

CUTÂNEA

No intuito de estudar o efeito da imunização por um peptídio imunogênico da presente invenção, em uma reação inflamatória mediada por IgE, uma resposta de anticorpo foi produzida para o sítio antigênico alvo da lgE-CH₃ de camundongo, SEQ. ID. N.: 8, pela imunização de camundongos com um peptídio da presente invenção. O anti-soro de camundongo resultante foi então utilizado para suprimir a anafilaxia cutânea passiva (PCA) ativado pela ligação cruzada de IgE de camundongo ligada aos mastócitos de rato.

Materiais e Métodos

Os ratos Balb/c foram imunizados com uma composição de peptídio da presente invenção, SEQ. ID. N,: 25, tal como na descrição feita

T5 no Exemplo 5, exceto peias injeções subcutâneas que foram dadas somente nas semanas 0, 3 e 6 e os camundongos não foram sensibilizados. Na 8^ã-------------------semana, o soro do camundongo foi coletado e avaliado pela reatividade cruzada ao ensaio ELISA de IgE de camundongo. O ensaio ELISA de IgE de camundongo foi como o descrito para o ensaio ELISA de IgE humana, no

Exemplo 1, exceto pelas cavidades de microtitulação que foram cobertas com 1 pg/ml de anticorpo monoclonal de IgE anti-DNP de SPE7 (Sigma Chemical Co., St. Louis MO), e a IgG anticamundongo de cabra rotulada de peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Kirkegaard and Perry Laboratories,

Gaithersburg MD) foi utilizada para a detecção de IgG de camundongo capturada. Treze entre os vinte camundongos imunizados tiveram anticorpos de reação cruzada para IgE de camundongo. Os soros foram aglutinados de sete camundongos exibindo titulações do ensaio ELISA contra a IgE de camundongo de =log₁₀ 2,3 para serem utilizados como o anti-lgE específico ao sítio.

Um outro grupo de 10 camundongos balb/c foi utilizado para produzir IgE murina. Este grupo foi sensibilizado com uma administração única, via intraperitoneal, de ovalbumina (Oa) em Alume 0,4%, 1,0 pg/0,2

ml. O teor de IgE do soro de camundongo foi medido no dia’20, âtravés-díT .? ensaio ELISA completo descrito no Exemplo 5, exceto pela IgE capturada que foi detectada pela IgE anticamundongo de ovelha rotulada por HRP, fornecida pela The Binding Site Inc. (San Dlego, CA). Dentre os 10 ratos, 7 tiveram respostas apreciáveis de titulação de IgE de =log_w 1,6. Estes soros foram aglutinados para serem utilizados como a reserva funcional e IgE antiOa.

A coligação de soro de IgE foi diluída em série 1:62, 1:124 e 1:248 em PBS e, então, diluída também com um volume igual do soro anti10 IgE específico ao sítio. Deste modo, as diluições finais para IgE de camundongo foram 1:124, 1:248 e 1:496, enquanto a anti-lgE de camundongo foi diluída em 1:2. As diluições de controle de IgE foram preparadas tendo somente PBS como o diluente.

As diluições de IgE, com e sem o soro anti-lgE, foram incubadas por uma hora, a 37°C e 50 μ Ide cada foram retirados para avaliação quanto à reação heteróloga de PCA, ~..... -Resultados

As amostras de 50 μΙ de IgE de camundongo diluídas foram injetadas por via intradérmica, nas costas depiladas de ratos, em um padrão que era de um conjunto de duas séries de quatro injeções. As séries consistiram em uma série de três controles de IgE diluída somente em PBS, de 1:124, 1:248 e 1:496, em paralelo com uma série de IgE diluída e incubada com a anti-lgE específica ao sítio. A quarta injeção de cada série era somente de PBS, como um controle para o trauma de tecido. O padrão foi du25 plicado em dois ratos.

Depois de 24 horas, as reações de PCA foram induzidas por injeção intravenosa de 1 mg de conjugado de DNP-Oa, em corante azul Evans a 1%. Uma hora mais tarde, os ratos tiveram morte indolor e foram esfolados. O alérgeno de DNP-Oa teve a IgE anti-Oa de ligação cruzada de camundongo ligada ao receptor nas mastóides de rato. A ligação cruzada ativou a desgranulação, aumentou a permeabilidade do corante azul Evans e a aparência das zonas azuis no lado inferior das peles do rato, proporcio-

nal à extensão de desgranulação. No entanto, em todos os lugârêfe êtrrqué' a IgE livre foi esvaziada pela anti-lgE murina específica ao sítio, menos estavam disponíveis para sensibilizar os mastóides de rato e as reações de PCA foram suprimidas, as reações de PCA foram avaliadas através da me5 dição dos diâmetros das zonas azuis nos lados inferiores das peles do rato, em duas direções, em ângulos retos e tirando o média. Os resultados são mostrados na Tabela 7 para a inibição duplicada de determinações de PCA em dois ratos.

Os ratos foram diferenciados por suas sensibilidades inerentes para a IgE de camundongo, de forma que o controle e as reações de PCA inibidas anti-lgE devem ser comparados apenas no mesmo rato. As reações de PCA mediadas por IgE de camundongo foram inibidas em ambos os ratos pelo anti-soro murino, com especificidade para o sítio antigênico alvo da IgE de camundongo. Deste modo, a resposta do anticorpo que resulta a partir da imunização por uma composição de peptídio específico para o sítio antigênico alvo de uma IgE não-humana resultou em supressão da resposta inflamatória mediada pela própria IgE não-humana.

Tabela 1

Seqüência	224 230 240 250 253b 260
ε Humano	I
(SeqlDNo:1)	VCS R DFTP PTVKILQSS-CDGGG H F]-P PTIQLLCLVSG YTPGTI N I
ε de cachorro	ACALNFIPPTVKLFHSS-CN-PVGDTHTTIQLLCLISGYVPGDMEV
(Seq ID No:2)
ε de rato	ARPVNITKPTVDLLHSS-CD-PNAF-HSTIQLYCFVYGHIQNDVSI
(Seq ID No:3)	f
ε de camundongo	VRPVTHSLSPPWSYSIHRCD-PNAjF-HSTIQLYCFIYGHILNDVSV
(Seq ID No:4)	I
	270 280 290 300 310
ε Humano	1
(SeqlDNo:1)	TWLEDGQ-VMDVDLSTA-STTQEQELASTQSELTLSQKHWLSDRTY
ε de cachorro	i 1
(Seq ID No:2)	IWLVDGQKATNIFPYTAPGTK-EQNVTSTHSELNITQGEWVSQKTY
ε de rato	i
(Seq ID No:3)	HWLMDDRKIYDTHAQNV-LIKEEÒKLASTYSRLNITQQQWMSESTF /·'·
ε de camundongo	! »***
(Seq ID No:4)	S W LM D D R E IT DT L AQT V - L1 Κ Ε E G K L A ST C S K L N IT E Q Q W M S E ST F

• . ί · continuação

	320 330 340 j 350
ε Humano	I
(SeqlD:No:1)	TCQV-TYQGHTFEDSTKKCADSNPFÍGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT
ε de cachorro
(Seq ID:No:2)	TCQGFTFKDEARK.....CSESDPRÇVTSYLSPPSPLDLYV ΗKAPK
ε de rato	[
(Seq ID:No:3)	TCKV-TSQGENYWAHTRRCSDDERRGVITYLIPPSPLDLYENGTPK
ε de camundongo	í I
(Seq ID:No:4)	TCRV-TSQGCDYLAHTRRCPDHEFjRGAITYLIPPSPLDLYQNGAPK
	360 370 380 390
ε Humano	I
(Seq ID:No:1)	ITC L V V DLA PS KGT V N LTWS R AS Gí K P- V N H STR K Ε Ε KQR - N GTLT
ε de cachorro	í - i
(Seq ID:No:2)	ITC L V V D L ATM E G Μ-N LTW Y R E S,K Ε P- V N PG P LN K-KD H FN GTIT	·· · t •
ε de rato		··♦« ·
(Seq ID:No:3)	LT C L V L D L E S Ε Ε - NIT VT W V R E R K S IG S A S Q R S T-K Η Η - N ATTS	···· • · I • ·· 1
ε de camundongo
(Seq ID:No:4)	LTC L V V D L ES Ε - K N V N VT W N QE-)k KTS VS ASQ W YT-KH Η N N ATTS I	····« « •

continuação

	400 410 420 430	í 440 - I .......................
ε Humano	ftj .........
(Seq ID:No:1)	VTSTLPVGTRDWlEÍGETYQÒIRVTH^HLPRALMRSTTKrlVsGPRAAP
ε de cachorro		I ‘ ! I í
(Seq ID:No:2)	VTSTLPVNTNDWIEGETYYCRVTHPHLPKDIVRSIAKA-iPGKRAPP
ε de rato	i
(Seq ID:No:3)	ITSILPVDAKDWIE-GEGYQCRVDHI^HFPKPIVRSITKA-LGLRSAP
ε de camundongo		i ΐ .
(Seq ID:No:4)	ITS I L P V V A KD W I EG YG YQCI V D R P D F P K P IV RS ITKTQPGQ R S A P
	450 460 470	I 480
ε Humano		j
(Seq ID:No:1)	EVYAFATPEWPGSRDK-R-TLACIjIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPD
ε de cachorro		i
(Seq ID:No:2)	DVYLFLPPE-EEQGTKDRVTLTCL	IQNFFPADISVQWLRNDSPIQT ··;
ε de rato		··»«
(Seq ID:No:3)	EVYVFLPPE-EEEKNK-R-TLTCL|QNFFPEDISVQWLQDSKLIPK
ε de camundongo	ί	····!
(Seq lD:No:4)	Ε V Y V F P P P Ε - Ε E S E D K - R-T LTC Ul Q N F F P E DI S V Q W L G D G K LIS N í .·

ί i

continuação

	490 500 510	520
ε Humano		I
(Seq ID:No:1)	ARHSTTQ-PRKTKGS--GFFVFSRLÉVTRAEW-QEKDEFICRAVHE
ε de cachorro		í i
(Seq ID:No:2)	D Q Y-TTTG P Η K V S G S R P A F FI F S R L,E VS R V D W E Q-K N K FTCQ V V Η E
ε de rato		I
(Seq ID:No:3)	S Q H STTT-P L KT N G S N Q R F FI FS R LÍE VT K A L WTQT KQ-FTC R VI Η E I
ε de camundongo
(Seq ID:No:4)	SQH STTT-P LKS NG-NQG FFI FS R L	EVAKTLWTQRKQ-FTCQVIHE
	530 540
ε Humano
(Seq ID:No:1)	AASPSQTVQRAVSVNPGK í
ε de cachorro	I
(Seq ID:No:2)	ALSGSR í I	*·;
ε de rato	j	.....
(Seq iD:No:3)	ALREPR (
ε de camundongo	i I	• , »···. ·
(Seq ID:No:4)	ALQKPR I	......

··♦·

• . ί. ·

Tabela 2

Triagem de Peptídeos de IgE CH2/3f)ara a Seleção de Antígenos Óaçididatos de IgE;

Sítio Antígeno Alvo Derivado de IgE 1 1 1 1	~ Seqüência Imunoestimula- dora Ligada ao Sítio Antigênico Alvo	Reatividade Cruzada com IgE humano
Entrada Ns; Descrição f	Seqüência de aminoácicjo i I	Logio ELISA Titer vs Hul- gE
1	CH2/3 (328-376) (C358—>S)	CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAP(èKGTVNLTWSR i (SEQ ID NO:28T'	a	KLH	3.66
2	CH2/3 (317-376) (C358—>S)	QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAPSKGTV NLTWSR | ί (SEQ ID NO:29) i I	a	KLH	5.08
b	1,4,9 Palindromic Th lib-GG	3.77
3	CH2/3 (313-376) (C358—>S)	QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAPS KGTVNLTWSR í i i (SEQ ID NO:30)	a	KLH	3.12 ···<
4	CH2/3 (301-376) (C358->S)	QKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRèvSAYLSRPSPFDLFIRKS PTITSLVVDLAPSKGTVNLTWSR I I (SEQ ID NOÍ31)	a	KLH	4.04

• . ι · ! ». ' continuação

5	CH2/3 ¢328-362) (C358->S)	CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVD j i (SEQ ID NO:32)	a	KLH	4.40
6	CH2/3 (317-362) (θ358—>S)	QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVD I (SEQ ID NO:33)	a	KLH	4,30
7	CH2/3 (313-362) (C358-4S)	QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDL	-IRKSPTITSLVVD (SEQ ID NO:34)	a	KLH	3.92
8	CH2/3 ¢301-362) (C358—>S)	QKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRC PT ITSLVVD i I	5VSAYLSRPSPFDLFIRKS- (SEQ ID NO:35)	a	KLH	3.37
9	CH2/3 ¢328-356)	CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI I (SEQ ID NO:36)	a	KLH	3.49
10	CH2/3 (317-356)	QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI I í (SEQIDNO:37) I	a	KLH	4.71
b	HBs1M2Th- GG	3.76 ...
c	InvOGHBs» $IhGG	2.94 • · • · » »·

»· continuação

11	CH2/3 (313-356)	QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI	(SEQ ID NO:38)	a	KLH	4.31
12	CH2/3 (301-356) (C312—>S)	GKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT j · I. )	a	KLH	2.79
		í - I	(SEQ ID NO:39)
13	CH2/3 (301-376)	QKHWLSDRP/TCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT í ITCLWDLAPSKGTVNLTWSR , I I (SEQ ID NO:40)	a	KLH	3.77
14	(C)CH3 (391-398) (C)*	(C)KQRNGTLT(C) ί í i	(SEQ ID NO:41)	b	HBs,g-32Th- GG	1.47
		I I		c	Inv-GG- HBsi9-32Th- GG	0.77

f

15 : -,.	(C)CH3 (413-435)(C)’ (θ41£^θ)	(C)GETYQ^RVTHPHLPRALMRSTTK(C) j I [ í (SEQIDNO:5p. i I	b	SynTh (1,2,4)-GG	4.24
c	Inv-GG-Syn Th (1,2,4)GG	4.17
16	CH2/3 (301-345)	QKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRG\	/SAYLSRPSP (SEQ ID NO:42)	b	HBSig-32Th- GG	2.31
17	(C)CH3 (365-396) (C)*	(C)PSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGT(C	) í (SEQ ID NO:43)	b	HBsiM2Th- GG	<1.0
18	(C)CH3 (404-434) (C)‘	(C)PVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTT(C) : ; (SEQ ID NO:44)	b	HBsi9~32Th- GG	<1
19	CH3 (432-445)	STTKTSGPRAAPEV	(SEQ ID NO:45)	b	HBsi^Th- GG	2.725
20	(C)CH3(374-382- (C)-383-385)‘	(C)WSRASGKPV(C)NHS ,	' (SEQ ID NO:46)	b	HBsi9-32Th- GG	3.976 ·'·

σ>

Μ

continuação

21	CH3 (345-357)*	(C)PSPFDLFIRKSPT(C)	I j (SEQ ID NO:83) ) f 1 i 1	b	HBS19.32TI1- GG	<1Δ
c	Inv-GG- HBsiMíTh- GG
22	(C)CH3 (343360)*	(C)SRPSPFDLFIRKSPTITC	{ ! (SEQ ID NO:47)	b	HBsi9_32Th- GG
			ί i í	c	Inv-GG- HBsi9-32Th- GG	<1Δ
23	(C)CH3 (404-413) (P)(C)*	(C)VGTRDWIEGE(P)fC)	I1 1 | (SEQ ID NO:48)	b	HBsi9-32Th- GG
			j i 1 í	c	Inv-GG- HBsiMjTh- GG	<1Δ

·»>··?

continuação (C)(P)CH3 (403413) (P)(C)‘ (C)(P)PVGTRDWIEGE(P)(C) (C)CH3 (387-400) (C)‘ (C)KEEKQRNGTLTVTS(C)

CH3 (387-394)

KEEKQRNG

(SEQ ID NO:49)	b	HBsi9.32Th- GG
c	Inv-GG- HBsi9.32Th- GG
(SEQ ID NO:50)	b	HBsi9-32Th- GG
c	Inv-GG- HBsi9-32Th- GG
(SEQID NO:51)	b	HBsi9.32Th- GG
c	Inv-GG- HBsi9-32Th- GG

<1^Δ <1^Δ

continuação

27	(C)CH3 (373- 381)(C)‘	(C)WSRASGKPV(C)	i (SEQ ID NO:52) I	b	HBsig-32Th- GG	2.40a
c	Inv-GG- HBsi9-32Th- GG
28	CH3 (354-373)(C)*	PTITCLVLDLAPSKGTVNLT(Ç) j j (SEQ ID NO:53)	b	HBsiMíTh- GG	2.59
29	CH3 (354-369)	PTITÇLVLDLAPSKGT	(SEQ ID NO:54)	b	HBsi9-32Th- GG	2.39
30	CH3 (399-424)	TSTLPVGTRDWIEGETYQÇRVTHPH i ' i	(SEQ ID NO:55)	b	HBs19-32Th- GG	4.01
31	CH3 (354-368) (0* (C358^S) (D362—>C)	PTITSLVLCLAPSKG(C) í ; (SEQ ID NO:56) I	b	HBsi9-32Th- GG	<1
32	(C)CH3 (370390)(C)‘	(C)VNLTWSRASGKPVNHSTRKEE(C) j í (SEQ ID NO:57)	b	HBs19.32Th- GG	3·45	•
33	(C)CH3 (373424)*	(C)TWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTF	ffiWIEGETYQÇRVTHPH (SEQ ID NO:58)	b	HBsWh- GG	2-33 L.
{

continuação

CH4 (497-506)	KTKGSGFFVF I	(SEQ ID NO:59)	b	HBs1M2Th- GG+MVF288302Th-GG + PT,49-176Th-
	i			GG

* = Peptídeo ciclizado t = Números de resíduo de aminoácidos da Tabela 1, SEQ ID NO: 1

Δ = Os resultados da reatividade cruzada são para uma mistura de peptídeos b e c (C) = Cistina introduzida na seqüência nativa para ciclização

I

Ch>S = Serina substituída por resíduo de cisteina; D->C = cisteina substituída p:ór resíduo de ácido aspártico σ» σ»

Avaliação de Anticorpos Anti-lgE para Inibição da Liberação de Histamina

Antígeno da IgE Entrada N.:	Antígeno da IgE Descrição (SEQ ID NO)	Elementos Imunogênicos Ligados ao Antígeno da IgE	% Inibição de Liberação de Histamina t
1	CH2/3 (328-376) (C358^S) (SEQ. ID. Ν.: 2§>	a	KLH	0
2	CH2/3 (317-376) (Casa->S) x·	a	KLH	14%
	(SEQ. ID. N.: 29)	b	1,4,9 PALINDROMIC Th-GG-	17%e0
5	CH2/3 (328-362) (C358^S) (SEQ. ID. N.: 32)	a	KLH	0
6	CH2/3 (317-362) 4Ga5fc±S)JSEQ. ID. N.: 33)	a	KLH	0
7	CH2/3 (313-362) (C358^S) (SEQ. ID. N.: 34)'	a	KLH	6%
8	CH2/3 (301-362) (Caaa^S) (SEQ. ID. N.: 35f	a	KLH	6%
11	CH2/3 (313-356) (SEQ. ID. N.: 3§>	a	KLH	6%
15	(C)CH3 (413-435) (C)‘(Ç^S) (SEQ. ID. N.: 5)	b	Syn Th(1,2,4)-GG	58%* e 71%-Φ
c	Inv-GG-Syn Th(1,2,4)-GG-
20	(C)CH3 (374-382(C)-383-385)* (SEQ. ID. N.: 4£)	b	HBsi8.32Th-GG	0
30	CH3 (399-424) (SEQ. ID. N.: 55)	b	HBsi9-32Th-GG-	9% e 0
32	(C)CH3 (370-390) (C)*(SEQ. ID. N.: 57)	b	HBsw^Th-GG-	0

Peptídio Ciclizado

(C) (C^S) Φ	Cisteína introduzida na seqüência nativa p£ra piçt®tj23a$=íq:, Serina substituída por resíduos de cisteína Os resultados são apresentados para anti-15b e anti-15c coligados
5 t	da IgG. Inibição da liberação de histamina pelos anticorpos aos peptídeos, purificados a partir do soro coletado na semana 8, exceto quando observado pelo símbolo ©
©	Inibição da liberação de histamina pelos anticorpos aos peptídeos, purificados a partir do soro coletado na semana 12.

_q

ο.

E φ

x φ

to

T3 ro co o

-C >.

Φ

-X ro

CL ro <o σ

ro

Q_

II <

Q_ <

F<s ü^iutv

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3 entre 25 e 29 ami noácidos de extensão, caracterizado pelo fato de que é da cadeia pesada épsilon de lgE-CH3, compreendendo um peptídeo antigênico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: í5)SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SÈQ

   ID NO: 8 e SEQ ID NO: 84. Kfi
2. 2. Peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 6 e

   SEQ ID NO: 84.
3. 3. Peptídeo sintético de 50 a 90 aminoácidos, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) um epítopo de célula T auxiliar (Th);

   (b) um peptídeo de antígeno do domínio lgE-Ch3, como definido na reivindicação 1; e (c) um domínio de invasina imunoestimulador.
4. 4. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de epítopos de células T auxiliares (Th) covalentemente ligada a um peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3, como definido na reivindicação 1.
5. 5. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (A)_n - (antígeno do domínio lgE-CH3) - (B)_o - (Th)_m- X ou (A)_n - (Th)_m-(B)o - (antígeno do domínio lgE-CH3)- X em que, / cada A é SEQ ID NOHSdigada através de um aminoácido ou espaçador (B)_o, em que dois ou mais de A são aminoácidos, cada aminoácido pode ser o mesmo ou diferente;

   cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-, succinimidil(e-N)Lys-, e -NHCH(X)CH₂S-, (succinimidil)-;

   cada Th é, independentemente, uma sequência de aminoácidòsTr?G que constitui um epítopo de célula auxiliar T, o antígeno do domínio lgE-CH3 representa a sequência de um peptídeo de antígeno do domínio de lgE-CH3, como definido na reivindicação 1;

   X é um aminoácido α-COOH ou a-CONH2;

   n varia de 0 até 10;

   m varia de 1 até 4; e o varia de 0 até 10.
6. 6. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula ((antígeno do domínio lgE-CH3)->(B)o-(Th)_m-(A)_n -X ou (Th)_m-(B)o-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-(A)_n -X em que, cada A é SEQ ID NO: 13 ligada através de um aminoácido ou espaçador (B)_o, em que dois ou mais de A são aminoácidos, cada aminoácido pode ser o mesmo ou diferente;

   cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos, NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-, succinimidil(e-N)Lys-, e - NHCH(X)CH₂S-, (succinimidil)-;

   cada Th é, independentemente, uma seqüência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula auxiliar T, o antígeno do domínio lgE-CH3 representa a seqüência de um peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3, como definido na reivindicação 1; X é um aminoácido α-COOH ou a-CONH2;

   n varia de 0 até 10;

   m varia de 1 até 4; e o varia de 0 até 10.
7. 7. Conjugado de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a dita Th é uma biblioteca de antígeno sintético estruturado (SSAL).

   Tabela 4B

   Imunogenicidade dos Construções de Peptídios Representativos da Presente Invenção

   SEO. ID. N. das construções dejãeptídiojs Espécie imunizada A Reatividade Cruzada à IgE direcionada ao Sítio (Titulação Logi₀) % HR^C %HR^ri inibição IgE Humana Alvo SEQ. ID. N.:jSó ) ^Gpa 4,4^e 1 96 ^{5 * 7} SEQ. ID. N.^/ ' GP^{8 * 10} 4,2- 3 Xi SEQ. ID. N.:M | Porco⁸ 4,1^e 3 84 SEQ. ID. N.:^ · Babuíno⁸ -h. 00 tt> 8 53) IgE de Cachorro Alvo SEQ. ID. N.:87 GP^b 3,4' NT NT SEQ. ID. N.:88 GP^b 3,2' NT NT SEQ. ID. N.:90 GP^b 3,2' NT NT SEQJD. N,:91 GP^b 3,2' NT NT

   Cobaias, porcos e babuínos foram imunizados com construções de

   5 peptídios de IgE humana, nas semanas 0, 3 e 6, com os soros coletados em
8. 8 wpi para teste, através do ensaio ELISA da IgE humana e inibição de HR;

   ^b As cobaias foram imunizadas com construtos de peptídios de IgE de cachorro, nas semanas 0, 2 e 4, com os soros coletados em 6 wpi para

   10 o ensaio ELISA da IgE de cachorro;

   ⁰ Média em % HR.

   ^d Inibição de %HR = controle - %HR/ controle x 100;

   GP = Cobaia;

   NT = não testado.

   Tabela 5

   Seqüência de Aminoácidos de Th derivado de Elementos Patogênicos Estranhos

   Descrição da Th SEQ. ID. N. Seqüência de Aminoácidoss MVF288-302 Th 61 LSEIKGVIVHRLEGV MVF258-277 Th 62 GILESRGIKARITHVDTESY ΤΤβ3Ο-844 Th 63 KKQYIKANSKFIGITEL TT947-986 Th 64 KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL PT149-176 Th 65 KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY TT73.99 Th 66 YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK PT-18-41 Th 67 GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL HBS19-32 Th 68 FFLLTRILTIPQSLD HBC120-140 Th 69 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL HBc₂mo Th 70 SDFFPSVRDLLDTASALYRE HBC50-69 Th 71 ~.......~ PHHTALRQAILCWGELMTLA....... TTeis-631 Th 72 WVRDIIDDFTNESSQKT HIV gp41 The (N-) 73 RAGRAILHIPTRIRQGLER HIV gp41 Th₆ (C-) 74 AVAEGTDRVIEVLQRAGRAIL CT A8ioe-i3o Th ⁷⁵ ALNIWDRFDVFTLGATSGYLKGNS CT P11 Th 12 TINKPKGYVGKE DT1 Th 76 DSETADNLEKTVAALSILPGHG DT4Th 77 EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDI GFAATNFVESC PFTh 78 Dl EKKI AKMEKASSVFN VVNS SM Th 79 KWFKTNAPNGVDEKIRI TRatl Th 80 GLQGKIADAVKAKG TRat4 Th 81 GLAAGLVGMAADAMVEDVN TRat6 Th 82 STETGNQHHYQTRVVSNANK SMTPITh 86 KWFKTNAPNGVDEKIRI

   Tabela 6 < ps

   Seqüência de Aminoácidos de Epítopos Th

   Artificiais e SSAL Representativos

   Descrição da Th SEQ. ID. N.: Seqüência de Aminoácidos (1,4,9 PALINDROMIC) Th 10 ISEIKGVIVHKIEGI MT RT TRM TM LLV SynTh(1,2,4) 9 KKKIITITRIITIITTID IS(1,4,9 PALINDROMIC)LF Th simplificada 60 ISISEIKGVIVHKIEGILF T RT TR T IS(1,4,9 PALINDROMIC)LF Th 11 ISISEIKGVIVHKIEGILF MT RT TRM TM LLV ArtMVF Th 89 ISLTEIRTVIVTRLETVLF

   Tabela 7

   Inibição de Reação de PCÀ

   Diluição de IgE Rato N^e 5 Rato N^s 6 Sem Anti-lgE (mm) Anti-lgE 1:2 (mm) Sem Anti-lgE (mm) Anti-lgE 1:2 (mm) 0 0 0 0 0 1:496 0 0 4,3 0 1:248 0 0 7,0 6,0 1:124 11 4* 13,0 12,7

   = azul muito pálido.

   V

   REIVINDICAÇÕES

   1. Peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3 entre 25 e 29 aminoácidos de extensão, caracterizado pelo fato de que é da cadeia pesada épsilon de lgE-CH3, compreendendo um peptídeo antigênico de SEQ ID NO:

   ⁵ 5.

   2. Peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 5.

   3. Peptídeo sintético de 50 a 90 aminoácidos, caracterizado pelo fato de que compreende:

   10 (a) um epítopo de célula T auxiliar (Th);

   (b) um peptídeo de antígeno do domínio lgE-Ch3, como definido na reivindicação 1; e (c) um domínio de invasina imunoestimulador.

   4. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que com15 preende uma sequência de epítopos de células T auxiliares (Th) covalentemente ligada a um peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3, como definido na reivindicação 1.

   5. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula

   20 (A)_n - (antígeno do domínio lgE-CH3) - (B)_o - (Th)_m - X ou (A)_n - (Th)_m-(B)₀ - (antígeno do domínio lgE-CH3)- X em que, cada A é SEQ ID NO: 13 ligada através de um aminoácido ou 25 espaçador (B)_o, em que dois ou mais de A são aminoácidos, cada aminoácido pode ser o mesmo ou diferente;

   cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos,

   -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-, succinimidil(c-N)Lys-, e -NHCH(X)CH₂S-, (succinimidil)-;

   30 cada Th é, independentemente, uma sequência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula auxiliar T, o antígeno do domínio lgE-CH3 representa a sequência de um peptídeo de antígeno do domínio de lgE-CH3, como definido na reivindicação 1;

   X é um aminoácido α-COOH ou a-CONH2;

   n varia de 0 até 10;

   5 m varia de 1 até 4; e o varia de 0 até 10.

   6. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (antígeno do domínio lgE-CH3)-(B)o-(Th)_m-(A)_n -X

   10 ou (Th)_m-(B)₀-(antígeno do domínio de lgE-CH3)-(A)_n -X em que, cada A é SEQ ID NO: 13 ligada através de um aminoácido ou espaçador (B)_o, em que dois ou mais de A são aminoácidos, cada aminoáci15 do pode ser o mesmo ou diferente;

   cada B é escolhido do grupo que consiste em aminoácidos, NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-, succinimidil(£-N)Lys-, e - NHCH(X)CH₂S-, (succinimidil)-;

   cada Th é, independentemente, uma seqüência de aminoácidos

   20 que constitui um epítopo de célula auxiliar T, o antígeno do domínio lgE-CH3 representa a seqüência de um peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3, como definido na reivindicação 1; X é um aminoácido α-COOH ou a-CONH2;

   n varia de 0 até 10;

   25 m varia de 1 até 4; e o varia de 0 até 10.

   7. Conjugado de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a dita Th é uma biblioteca de antígeno sintético estruturado (SSAL).

   30 8. Conjugado de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo de antígeno do domínio lgE-CH3 possui uma sequência de aminoácidos de SEQ

   A

   ID NO: 5.
9. 9. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 15, 17-23 e 85.

   5 10. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:18eSEQ ID NO. 85.

   11. Conjugado de peptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um A é SEQ ID NO: 13.
10. 10 12. Conjugado de peptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou

    6, caracterizado pelo fato de que n é 3.
11. 13. Conjugado de peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína carreadora covalentemente ligada a um ou mais peptídeos de antígeno do domínio lgE-CH3, como definidos na reivindicação 1.
12. 15 14. Conjugado de peptídeo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é hemocianina de lapa key hole (KLH).

    15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um peptídeo ou

    20 conjugado de peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6 ou 10, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
13. 16. Uso de um peptídeo ou conjugado do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6 ou 14, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica aplicável na indução

    25 da produção de anticorpos anti-lgE em um mamífero.