BRPI1007630B1

BRPI1007630B1 - processo de preparação de um material de colágeno e material compósito

Info

Publication number: BRPI1007630B1
Application number: BRPI1007630A
Authority: BR
Inventors: Gagnieu Christian; Forest Patricia; Picot Sylvain
Original assignee: Biomup
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2018-10-09
Also published as: CN102458493A; DK2424579T3; JP6316795B2; JP5886187B2; US10004825B2; FR2944706A1; CN102458493B; EP2424579A1; WO2010125086A1; FR2944706B1; US9168326B2; JP2016116856A; JP2012525176A; CA2759654C; HUE028070T2; PL2424579T3; PT2424579E; US20160008509A1; US20120040119A1; ES2551168T3

Description

(54) Título: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM MATERIAL DE COLÁGENO E MATERIAL COMPÓSITO (51) lnt.CI.: A61L 27/24; A61L 27/58 (30) Prioridade Unionista: 28/04/2009 FR 0952768 (73) Titular(es): BIOM UP (72) Inventor(es): CHRISTIAN GAGNIEU; PATRÍCIA FOREST; SYLVAIN PICOT (85) Data do Início da Fase Nacional: 27/10/2011

1/36 “PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM MATERIAL DE COLÁGENO E MATERIAL COMPÓSITO”

Campo da Invenção [001] A presente invenção trata de novos materiais de colágeno e mais particularmente de membranas, tubos, filmes, esponjas, geis, matrizes e fios de colágeno. Esses materiais combinam excelentes propriedades de elasticidade e de resistência mecânica. A presente invenção tem igualmente por objeto um processo de preparação de materiais de colágeno a partir de colágeno fibroso ácido de tendões que comportam igualmente uma reticulação controlada do colágeno. A presente invenção trata igualmente de um colágeno fibroso ácido de tendões que apresenta fibras longas, de seu processo de obtenção bem como de suas aplicações na fabricação em particular de membranas, de tubos, de filmes, de esponjas, de geis, de matrizes e de fios de colágeno.

Antecedentes da Invenção [002] O colágeno é uma proteína conhecida desde a antiguidade. Ele vem sendo utilizado há vários anos para a fabricação de dispositivos médicos, pois suas propriedades físico-químicas e biológicas são notáveis. Historicamente empregado para a realização de compressas hemostáticas, sua biocompatibidade e sua atividade sobre a cicatrização fazem dele um material privilegiado para a confecção de biomateriais como membranas destinadas à Regeneração Tissular Guiada em cirurgia dentária e para o revestimento de materiais de reforços parietais e de próteses vasculares, para facilitar sua integração e garantir sua estanqueidade.

[003] Materiais inteiramente feitos de colágeno estão disponíveis no mercado como compressas hemostáticas, membranas para a prevenção das aderências, condutos de regeneração nervosa (WO 2007/147739, FR 2 810 889).

[004] Desde que o processo de extração do colágeno conduza a

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2/36 [004] Desde que o processo de extração do colágeno conduza a uma purificação suficiente, esses produtos são perfeitamente biocompatíveis e desempenham bem suas funções.

[005] Em função das indicações e, portanto, da duração de absorção desejada no organismo, o colágeno pode ser reticulado. Os processos de reticulação do colágeno são bem conhecidos e amplamente descritos. Podem ser citados, por exemplo, os documentos EP 0 862 468 e US 4,931,546. O uso do glicogênio oxidado como reticulante do colágeno já foi igualmente descrito em FR 2 877 669 bem como nas publicações de Forest et al. e Rousseau et al. Em função da natureza e da proporção de reticulante, bem como das condições de reticulação (pH, tempo de reação), é relativamente fácil fazer variar de modo controlado a duração de absorção de um material. Todavia, a dificuldade da reticulação reside em particular na escolha da taxa de reticulação, que deve permitir produzir um material estável, reprodutível, com um tempo de absorção desejado, que apresente propriedades mecânicas definidas compatíveis com a aplicação. Esse problema é ainda mais importante para materiais com um tempo de vida longo quanto mais um material colagênico for reticulado mais rígido ele será. Essa característica física que se traduz por um aumento da suscetibilidade ao rasgamento e uma diminuição da resistência à sutura pode ser totalmente inaceitável para certos usos em cirurgia. Entretanto, não existe atualmente um processo de reticulação que permita controlar de modo preciso e reprodutível a taxa de reticulação do colágeno e, portanto, controlar a rigidez do material final.

[006] Assim, em certos casos, e em particular quando os produtos são submetidos a fortes tensões mecânicas pelo cirurgião e/ou pelo paciente após a implantação, esses materiais colagênicos existentes atingem seus limites. É o caso, por exemplo, do produto descrito na patente FR 2 877

669 e na publicação científica FOREST et al (2007). Esses materiais

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3/36 desempenham perfeitamente suas funções, mas em certos casos extremos em que as suturas são delicadas ou as tensões mais fortes, o material não é suficientemente resistente.

[007] As propriedades mecânicas de um produto de colágeno dependem de três fatores:

- a escolha do nível de estruturação do colágeno,

- a escolha do reticulante e da taxa de reticulação,

- os processos de preparação e de modelagem do material.

[008] Diante das novas técnicas cirúrgicas e do amplo leque de possibilidades abertas aos cirurgiões, estes últimos buscam cada vez mais produtos biodegradáveis suficientemente resistentes para serem suturados e colocados sob tensão, eventualmente, embora não necessariamente, reforçados por uma tela têxtil, por exemplo. É em particular o caso das membranas para a regeneração tissular guiada. Para a realização desse material, o técnico no assunto escolherá um colágeno altamente estruturado e reticulará fortemente o colágeno. Ele obterá, porém, um produto muito rígido, quebradiço e difícil de manipular pelo cirurgião. O colágeno escolhido poderá ser um colágeno chamado de fibroso, isto é, pouco desestruturado, mas a ausência de controle sobre o processo de extração limita as possibilidades dos materiais produzidos com esses colágenos. A reticulação será realizada por imersão ou por colocação em contato de vapor de formaldeído ou de glutaraldeído, por exemplo, sem permitir a obtenção de uma reticulação flexível e controlada. Assim, não existem hoje produtos colagênicos resistentes mecanicamente (tensão, sutura) sendo ao mesmo tempo flexíveis e modeláveis e apresentando um tempo de absorção apropriado (vários meses).

[009] A fabricação de materiais de colágeno reticulado compreende habitualmente a preparação de uma solução aquosa de colágeno, a adição eventual de um agente de reticulação, a modelagem do material por

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4/36 fundição ou moldagem da solução de colágeno, a evaporação do solvente e o tratamento do material obtido por processos físicos ou químicos, em banhos, vapores ou sob pressão reduzida que permita a formação de ligações de reticulação, a eliminação e/ou a desativação do agente de reticulação residual ou qualquer molécula indesejável, e uma nova etapa de secagem do material se a forma final do material exigir essa etapa.

[010] Esses processos de acordo com o estado da técnica requerem diversas manipulações do material de colágeno e não permitem um controle satisfatório da etapa de reticulação em particular no que se refere à densidade das ligações reticulantes e da estruturação do colágeno. Esses processos não permitem em particular uma etapa de coagulação/fibrilação ou uma etapa de coagulação/fibrilação/reticulação suficientemente progressiva para permitir uma organização tridimensional das moléculas de colágeno. Devido a isso, os materiais reticulados geralmente obtidos são resistentes e rígidos, ou então flexíveis, mas pouco resistentes.

[011] A presente invenção descreve agora um processo que permite a obtenção de um material de colágeno e em particular membranas de colágeno que possuem uma resistência elevada à tração e ao rasgamento, conservando ao mesmo tempo uma flexibilidade e uma elasticidade suficiente para as aplicações cirúrgicas em particular.

[012] De fato, os inventores desenvolveram um novo processo de preparação de material de colágeno que compreende um tratamento de colágeno fibroso no estado úmido com amoníaco no estado gasoso durante sua modelagem. Esse tratamento progressivo com gás amoníaco permite obter ao mesmo tempo uma coagulação e uma fibrilação do colágeno fibroso durante sua modelagem. A presente invenção trata, portanto, igualmente de um processo de modelagem de colágeno fibroso e em particular do uso de uma base fraca tal como o amoníaco no estado gasoso para assegurar a

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5/36 coagulação e fibrilação completa do colágeno em forma de gel. Esse processo permite também a reticulação concomitante do colágeno durante sua modelagem pela adição direta do agente de reticulação na solução de colágeno fibroso antes de sua modelagem por fundição ou moldagem. A taxa de reticulação do colágeno pode assim ser controlada de modo preciso e reprodutível.

[013] Além disso, o processo pode permitir uma reticulação sensivelmente homogênea no material, ou seja, a taxa de reticulação pode ser sensivelmente idêntica fora e dentro do material. Isso permite em particular que esse material tenha propriedades melhoradas em relação aos materiais cuja reticulação é muito mais elevada tanto fora do que dentro do material, e mesmo inexistente dentro.

[014] O processo pode assim conduzir a um material que apresenta propriedades mecânicas e/ou de absorção melhoradas. Sem querer estabelecer qualquer vínculo com a teoria, é possível que a velocidade de absorção seja mais bem controlada graças à homogeneidade de reticulação e/ou de estrutura no volume do material. Por “mais bem controlado”, pode-se entender em particular no sentido da presente invenção que de uma amostra de produto para outra, em particular proveniente de dois lotes de fabricações diferentes, e/ou de um paciente para outro a velocidade de absorção apresenta diferenças menores do que no caso de produtos provenientes de processos conhecidos da arte anterior.

[015] Além disso, o material pode apresentar uma absorção sensivelmente constante, ou linear, em função do tempo. Isso pode assim conduzir a uma liberação progressiva das partes degradadas.

[016] Em compensação, no caso dos materiais existentes, nos quais a reticulação não é homogênea em volume, a degradação pode ser “súbita”. Sem querer estabelecer qualquer vínculo com essa teoria, é provável

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6/36 que depois que a parte externa estiver degradada, a parte interna, que apresenta um grau de reticulação menor, seja degradada muito rapidamente, ou mesmo muito rapidamente. Isso pode, portanto, provocar um aumento rápido da quantidade de produtos de degradação, o que pode causar de reações inflamatórias, e mesmo surtos inflamatórios repentinos.

[017] Preferencialmente, esses processos são realizados com colágeno fibroso e de preferência com colágeno que apresenta fibras longas. Os inventores também desenvolveram um processo de preparação de colágeno fibroso ácido de tendões que possuem a particularidade de apresentar fibras particularmente longas e elásticas. O colágeno fibroso obtido é útil para a preparação de materiais de colágeno em particular de membranas, filmes, esponjas, geis, matrizes, fios e tubos de acordo com a presente invenção.

[018] Os processos de acordo com a presente invenção permitem fabricar dispositivos médicos e em particular membranas, filmes, esponjas, geis, matrizes, fios e tubos que apresentam propriedades em termos de resistência mecânica, elasticidade, habilidade de suturar e conformabilidade jamais atingidas com os processos clássicos de produção de materiais de colágeno. Os materiais obtidos pelos processos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em cirurgia geral e especializada, em particular para as cirurgias urológica, ginecológica, cardíaca, torácica, vascular, articular, digestiva, plástica, espinhal, neurológica, ortopédica, traumatológica, dentária, maxilo facial e estomatológica, para a cicatrização guiada ou a substituição dos tecidos (dura-máter, gengiva, osso, nervos, tendões, ligamentos, vísceras, pericárdio, peritônio, tecidos conjuntivos em geral, derme, músculo, cartilagem) qualquer que seja a forma que o material assim fabricado possa tomar.

[019] Esses materiais, considerando suas características podem ser utilizados em forma de membrana ou filme como barreira de cicatrização

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7/36 guiada e/ou de anti-aderência em qualquer cirurgia em que a separação de dois órgãos ou tecidos é necessária durante as fases de cicatrização, como guia de regeneração em forma de tubo ou de luvas fabricada pelo cirurgião de acordo com sua conveniência na regeneração dos nervos e dos tendões, como matriz de regeneração para a engenharia tissular quando o colágeno está em forma de esponja, por exemplo. A conformabilidade dos produtos devida ao colágeno utilizada para sua fabricação, torna-os fáceis de usar e lhes permite adaptar-se às formas dos tecidos sobre os quais são colocados sendo ao mesmo tempo suturáveis a fim de serem mantidos no lugar se for preciso. Em função do sítio de implantação e da duração de absorção desejada, a reticulação pode ser ajustada fazendo variar a proporção dos grupos reativos do reticulante e os do colágeno na solução de colágeno de partida (e/ou aumentando ou diminuindo, a quantidade de amoníaco e/ou o tempo de contato com o amoníaco). A espessura do material pode igualmente ser ajustada para os mesmos fins.

[020] As aplicações preferidas são a obtenção de membranas (para a regeneração tissular guiada e substituição de tecidos (dura-máter, pericárdio etc.) em diversas cirurgias), de tubos (para a regeneração nervosa, por exemplo, para a regeneração dos tendões e dos ligamentos), e de matrizes (por exemplo, para a engenharia tissular).

Descrição da Invenção [021] A presente invenção tem por objeto um processo de preparação de colágeno fibroso ácido de tendões que compreende as seguintes etapas:

a) dilatação dos tendões de porco, de bezerro, de cordeiro, de potro ou de suas misturas em uma solução aquosa de ácido acético entre 0,1 e 0,5 M durante pelo menos sete dias,

b) trituração mecânica dos tendões para obter uma suspensão

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8/36 aquosa,

c) precipitação e lavagem do colágeno fibroso a partir da suspensão aquosa da etapa b),

d) desidratação do colágeno,

e) obtenção do colágeno fibroso ácido.

[022] De preferência, na etapa a) procede-se à dilatação de tendões de porcos que têm menos de 10 meses.

[023] Preferencialmente, na etapa c) a precipitação e a lavagem do colágeno são efetuadas em uma solução de NaCI 0,45-1,2 M.

[024] Tipicamente, na etapa d) a desidratação do colágeno compreende um tratamento com acetona.

[025] A presente invenção tem também por objeto um colágeno fibroso ácido de tendões suscetível de ser obtido pelo processo de acordo com a presente invenção. Vantajosamente, a presente invenção tem por objeto um colágeno fibroso que possui fibras longas tal que em uma solução aquosa a 0,1% menos de 20, 15, 10% das fibras contidas na solução fiquem retidos em um filtro de nylon de 50pm e mais de 20, 25, 30% atravessem um filtro de nylon de 5pm.

[026] A presente invenção trata também de um processo de preparação de um material de colágeno que compreende as seguintes etapas:

a) preparação de uma solução aquosa de colágeno em forma ácida,

b) opcionalmente, adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido,

c) moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

d) coagulação, e opcionalmente reticulação, da solução aquosa de colágeno por tratamento com gás amoníaco,

e) eliminação do amoníaco em excesso e obtenção do material de

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9/36 colágeno por secagem.

[027] De preferência, a solução aquosa da etapa a) compreende 0,05 a 3% em peso de colágeno em forma ácida.

[028] Preferencialmente, o colágeno em forma ácida é colágeno nativo ou colágeno desnaturado.

[029] Preferencialmente, a solução aquosa da etapa a) é preparada com colágeno fibroso ácido escolhido entre os colágenos de tendões de porco, de tendões de bezerro, de tendões de cordeiro e de tendões de potro.

[030] Em um modo de realização vantajoso, a coagulação e opcionalmente a reticulação da solução de colágeno são efetuadas por tratamento com gás amoníaco durante pelo menos 24 horas.

[031] Em um modo de realização vantajoso, o processo compreende a adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido, a coagulação e a reticulação da solução aquosa de colágeno por tratamento com gás amoníaco.

[032] Vantajosamente, o agente de reticulação aldeídico é escolhido entre o glicogênio e as amilopectinas aldeídicas.

[033] Mais vantajosamente, o agente de reticulação aldeídico é glicogênio oxidado.

[034] Preferencialmente, o agente de reticulação aldeídico é adicionado em proporções que variam de 0,05 a 5 para a relação CHO do agente de reticulação aldeídico sobre NH2 do colágeno.

[035] Em um modo de realização preferido do processo de acordo com a presente invenção, o material de colágeno é uma membrana, na etapa c) a solução aquosa de colágeno é depositada em um molde plano e na etapa e) o amoníaco em excesso é eliminado e obtém-se uma membrana de colágeno por secagem.

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10/36 [036] A presente invenção trata também de um material de colágeno suscetível de ser obtido por um processo de acordo com a presente invenção e/ou tal como descrito na presente descrição, mais particularmente o referido material é obtido pelo referido processo, ou mesmo o referido material é diretamente obtido pelo referido processo.

[037] De acordo com outro de seus aspectos, a presente invenção tem igualmente por objeto um material, em particular uma membrana de colágeno que apresenta uma reticulação homogênea.

[038] Por “reticulação homogênea”, entende-se no sentido da presente invenção que a diferença entre a reticulação na superfície externa e a reticulação no interior, em particular em direção, e mesmo, no meio do material é inferior ou igual a 25%, em particular inferior ou igual a 20%, em particular inferior ou igual a 15%, e mesmo inferior ou igual a 10%, e bem particularmente inferior ou igual a 5%.

[039] A diferença de reticulação em% pode corresponder ao valor absoluto de:

[((reticulação externa - reticulação interna) / (reticulação interna + reticulação externa)) x 100] [040] A reticulação pode ser avaliada pelo número de mols de lisina livre por mg de material, em particular do modo descrito no exemplo 7.

[041] O material, em particular a membrana, que apresenta uma reticulação homogênea pode ter uma espessura seca de pelo menos 50 pm, e bem particularmente seu comprimento, sua largura e sua altura são cada um superior ou igual a 50 pm.

[042] De modo bem particular, o material apresenta-se em forma de uma membrana que possui uma espessura seca de pelo menos 50 pm. O comprimento e a largura da referida membrana podem ser superiores ou iguais a 1 cm, e mesmo a 5 cm.

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11/36 [043] De acordo com mais um de seus aspectos, a presente invenção tem por objeto um material de colágeno que apresenta uma temperatura de desnaturação superior ou igual a 3°C, em particular superior ou igual a 5°C, e mesmo superior ou igual a 7°C, em relação ao material de colágeno não reticulado. Essa diferença de temperatura de reticulação pode ser medida por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), em particular do modo descrito no exemplo 8.

[044] O material de colágeno reticulado pode apresentar um aumento da temperatura de desnaturação em relação ao material não reticulado de pelo menos 5%, em particular 8%, em particular de pelo menos 10%.

[045] Essa % de aumento da temperatura corresponde à seguinte equação:

[((temperatura de desnaturação do material reticulado / temperatura do material não reticulado) -1) X IOO] [046] O aumento da temperatura de desnaturação do material reticulado o em relação à temperatura de desnaturação no material não reticulado pode permitir verificar se o referido material está efetivamente reticulado.

[047] De preferência, esse material de colágeno pode consistir em uma membrana de colágeno, um filme de colágeno, um fio de colágeno, um tubo de colágeno, uma esponja de colágeno ou um gel de colágeno.

[048] Em um modo de realização preferido, a presente invenção tem por objeto uma membrana de colágeno suscetível de ser obtida pelo processo de acordo com a presente invenção e que possui uma espessura seca compreendida entre 30 e 200 pm, preferencialmente de 80 a 120 pm.

[049] De preferência, a membrana de colágeno é constituída de uma monocamada de colágeno, não porosa, com uma espessura seca

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12/36 compreendida entre 50 e 150pm, preferencialmente de 80 a 120 pm.

[050] A membrana de colágeno obtida de acordo com a presente invenção possui vantajosamente uma densidade compreendida entre 12 mg/cm² e 16 mg/cm², uma taxa de dilatação inferior a 6, uma resistência à sutura superior a IN, uma tensão de ruptura superior a 4 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina inferior a 35%.

[051] A presente invenção tem também por objeto uma membrana de colágeno que possui uma espessura seca compreendida entre 80 e 120 pm, uma densidade compreendida entre 12 mg/cm² e 16 mg/cm², uma taxa de dilatação inferior a 6, uma resistência à sutura superior a 1N, uma tensão de ruptura superior a 4 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina inferior a 35%.

[052] Mais preferencialmente, a presente invenção trata de uma membrana de colágeno que apresenta uma taxa de dilatação compreendida entre 4 e 6, uma resistência à sutura compreendida entre IN e 2,5 N, uma tensão de ruptura compreendida entre 4 e 7 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina compreendida entre 20 e 35%.

[053] Vantajosamente, a membrana de colágeno obtida é reforçada com um têxtil reabsorvível ou não.

Descrição Detalhada da Invenção [054] A presente invenção trata, portanto, de um processo de extração do colágeno a partir de tendões de animais jovens que conduzem a um colágeno cujo comprimento e cuja elasticidade das fibras permite a seguir, durante sua utilização na fabricação de dispositivos médicos a obtenção de produtos resistentes mecanicamente, elásticos, suturáveis e modeláveis.

[055] Assim, um objeto da presente invenção é um processo de preparação de colágeno fibroso ácido de tendões que compreende as seguintes etapas:

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b) trituração mecânica dos tendões para obter uma suspensão aquosa,

c) precipitação e lavagens do colágeno fibroso a partir da suspensão aquosa da etapa b),

d) desidratação do colágeno.

[056] De preferência, a extração de colágeno fibroso é efetuada a partir de tendões de animais jovens que possuem menos de 10 meses e mais preferencialmente a partir de tendões de porcos que possuem menos de 10 meses.

[057] A primeira etapa comporta então a retirada dos tendões de pés de porcos de menos de 10 meses (os tendões podem igualmente ser retirados dos bezerros, cordeiros e potros), a limpeza, a eliminação a mais completa possível dos tecidos conjuntivos e outros tecidos não tendinosos seguida do corte dos tendões em pedaços de 1 cm de comprimento aproximadamente e do enxágue com água.

[058] A dilatação é efetuada durante pelo menos 7 dias e até 15 dias, preferencialmente 15 dias em um banho de ácido acético a uma concentração compreendida entre 0,1 e 0,5M preferencialmente 0,3M sob agitação à razão de 1 kg de tendões em um volume compreendido entre 20 e 30 L preferencialmente 25 L.

[059] A segunda etapa consiste em uma trituração suave, que permite a liberação de fibras tendinosas longas a partir dos fragmentos inchados de tendões. A trituração de um volume do banho de dilatação que contém os pedaços de tendões inchados é efetuada, por exemplo, durante 2 min a 3000 rpm, e em seguida etapas que compreendem, cada uma, uma

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14/36 diluição do meio por água seguida de uma trituração nas mesmas condições é realizada até a obtenção de uma pasta com uma concentração de matéria seca compreendida entre 4,8 e 6,5 g/ kg.

[060] A terceira etapa consiste na precipitação do colágeno fibroso a partir da pasta proveniente da trituração, e na sua purificação de acordo com processos clássicos. Essa etapa pode comportar uma ou mais precipitações por cloreto de sódio a uma concentração final compreendida entre 0,45M e 1,2 M e mais particularmente à concentração de 0,6M e uma ou mais etapas de lavagem do colágeno precipitado em uma solução de NaCl 0,45-1,2 M, preferencialmente 0,6M. Em geral, está também prevista uma etapa de inativação viral em uma solução de hidróxido de sódio 1N, a 20°C durante 1 hora. Devido a sua ação hidrolítica sobre as proteínas não colagênicas, essa etapa constitui uma purificação adicional. No final dessa etapa, são realizadas novas lavagens com NaCl 0,6M. A fim de desidratar o colágeno e eliminar os sais, é efetuado em seguida um tratamento com acetona que conduz à obtenção de uma fibra seca.

[061] Esse processo particular aplicado a tendões conduz a um colágeno diferente dos colágenos existentes, pois ele é composto de fibras longas sem conter pedaços de tecidos e conserva uma parte de colágeno solúvel.

[062] A presente invenção trata, portanto, também de um colágeno fibroso ácido de tendões suscetível de ser obtido pelos processos de acordo com a presente invenção.

[063] A presente invenção trata também de um colágeno fibroso tal que em uma solução aquosa a 0,1% menos de 20, 15, 10% das fibras contidas na solução sejam retidas em um filtro de nylon de 50 pm e mais de 20,

25, 30% atravessem um de filtro nylon de 5 pm. O protocolo de medida das frações do colágeno fibroso obtido de acordo com a presente invenção,

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15/36 inferiores a 5μηη e superiores a 50 pm é o seguinte:

- Preparação de uma solução aquosa de colágeno a 0,1% sob agitação magnética ou mecânica durante 16 a 24 horas, (utilização de 500mg);

- Depósito da solução sobre uma tela de nylon com malhas calibradas de 5pm ou 50pm montada sobre um suporte circular de 9 cm de diâmetro. A difusão das moléculas na tela é feita à pressão atmosférica. A pressão exercida sobre a tela é considerada como insignificante, uma vez que a não ultrapassa 4 cm para uma seção de 63 cm²;

- A solução sobre a tela é agitada com uma lâmina quadrada plana que não atrita sobre a tela, mas está posicionada a alguns milímetros (no máximo 5) acima da tela. A velocidade de agitação é de 80 rpm;

- A largura da lâmina é 7 cm. Ela está posicionada no centro do suporte circular;

- Após a parada do escoamento da solução de colágeno através da tela, o retentado é lavado com 50 mL de ácido acético 0,05 M respeitando os diferenciais de pressão e até a parada do escoamento. Essa operação é repetida 3 vezes;

- As frações são recuperadas em seguida (filtrado e retentado) e o colágeno é precipitado a partir de cada uma das frações por adição de NaCI a fim de atingir uma concentração de 0,6M final.

[064] O precipitado é coletado em seguida por centrifugação ou filtração e depois desidratado com acetona, secado sob pressão reduzida e pesado.

[065] A presente invenção trata também dos processos de modelagem de colágeno ácido para a preparação de um material de colágeno.

[066] Em um primeiro modo de realização, a presente invenção tem por objeto um processo de preparação de um material de colágeno caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

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a) preparação de uma solução aquosa que compreende 0,05 a 3% em peso de colágeno em forma ácida,

b) moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

c) coagulação da solução aquosa de colágeno por tratamento com gás amoníaco,

d) eliminação do amoníaco e obtenção do material de colágeno.

[067] Em um modo de realização particularmente vantajoso, a presente invenção tem também por objeto um processo de preparação de um material de colágeno caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a) preparação de uma solução aquosa de colágeno em forma ácida,

b) adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido,

c) moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

d) coagulação e reticulação da solução aquosa de colágeno por tratamento com gás amoníaco,

e) eliminação do amoníaco e obtenção do material de colágeno.

[068] A primeira etapa dos processos de acordo com a presente invenção consiste na preparação de uma solução aquosa de colágeno. Por solução aquosa de colágeno entende-se igualmente uma suspensão de colágeno.

[069] O processo de acordo com a presente invenção utiliza colágeno em forma ácida, por colágeno em forma ácida, entende-se um colágeno em que a maior parte das funções carboxílicas é protonada, e que dá um pH ácido em solução ou suspensão na água.

[070] De preferência, o processo de preparação de material de colágeno de acordo com a presente invenção utiliza colágeno fibroso ácido.

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17/36 [071] Por colágeno fibroso, entende-se um colágeno no qual as moléculas de colágeno não são ou são muito pouco individualizadas, que é, portanto, composto de fibras e fibrilas constituídas de moléculas de colágeno naturalmente ligadas entre si por ligações fracas e covalentes, e por agregados dessas estruturas. O colágeno fibroso, em particular, é constituído de partículas de grandes tamanhos (predominantemente superiores a 5 pm quando estão hidratadas) que são uma suspensão homogênea por dispersão em meio aquoso.

[072] O colágeno fibroso pode ser em particular um colágeno fibroso de pele ou um colágeno fibroso de tendões. O colágeno fibroso de pele comporta fibras relativamente curtas em virtude da organização natural do tecido, do colágeno ácido-solúvel e dos agregados de pequeno tamanho. O colágeno de tendões comporta fibras longas e muito pouco colágeno solúvel.

[073] De preferência, os processos de acordo com a presente invenção são utilizados com colágeno fibroso de tendão, de preferência com colágeno fibroso de tendões de porcos e mais preferencialmente com colágeno de tendões de porcos jovens de menos de 10 meses.

[074] De modo vantajoso, os processos da presente invenção utilizam colágeno fibroso ácido de tendões preparado de acordo com o processo descrito acima e que apresenta fibras longas.

[075] A primeira etapa consiste, portanto, na colocação em solução do colágeno na água. Ela é efetuada pelos métodos clássicos descritos na literatura. Quando o colágeno for um colágeno fibroso ácido, essa etapa permite colocação em suspensão de fibras circundadas de colágeno micro-fibrilares e de colágeno chamado solúvel que conservou uma estrutura necessária à fibrilação.

[076] Tipicamente, a solução aquosa de colágeno compreende entre 0,05% e 3% em peso de colágeno e de preferência entre 0,05, 0,1, 0,8%,

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1, 1,5, 2, 2,5 e 3% de colágeno. Vantajosamente a solução aquosa compreende 0,8% de colágeno em peso. Essa colocação em solução é efetuada habitualmente na água por agitação mecânica de preferência sob pressão reduzida. A suspensão ou solução pode igualmente ser aquecida a uma temperatura compreendida entre 30°C e 100°C durante 2 a 20 minutos para desnaturar parcial ou completamente o colágeno.

[077] Os processos de acordo com a presente invenção permitem obter diversos materiais de colágeno em função da moldagem escolhida durante a moldagem ou a fundição. O material de colágeno pode assim em particular tomar a forma de uma membrana, de uma matriz, de um filme, de um fio, de um gel, de um tubo ou de uma esponja.

[078] A fundição ou a moldagem de uma solução aquosa de colágeno são bem conhecidas do técnico no assunto e descritas na literatura. A segunda etapa é, portanto, a fundição ou moldagem da solução de colágeno em moldes, e a espessura varia em função do material desejado e em função da superfície do molde.

[079] As membranas de colágeno são materiais em duas dimensões que resultam da secagem em um molde plano de uma suspensão homogênea ou de uma solução de colágeno que contém uma proporção de fibras e de fibrilas. O colágeno pode ser reticulado ou não. A concentração da suspensão secada condiciona a espessura do material final. Ela pode ir de alguns mícrons a várias centenas de mícrons.

[080] Um filme de colágeno é um material em duas dimensões que resulta da secagem em um molde plano de uma solução homogênea de colágeno. O colágeno pode ser reticulado ou não. A concentração da solução secada condiciona a espessura do material final. Os filmes e as membranas podem ser dobrados para formar luvas que podem ser fechadas, se for preciso, por suturas ou colagem. A espessura pode variar de alguns mícrons a várias

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19/36 centenas de mícrons. Um tubo de colágeno é um objeto cilíndrico em três dimensões oco cujas paredes podem ser um filme ou uma membrana de colágeno. Os tubos podem ser obtidos por moldagem em torno de um molde ou por extrusão. O colágeno pode ser reticulado ou não. A espessura das paredes é condicionada pela quantidade de colágeno depositado sobre os moldes ou utilizada na solução de extrusão.

[081] Um fio de colágeno é um conjunto cheio de colágeno e cuja resistência mecânica é suficiente para entrar na composição de um fio de filamentos múltiplos maior, de um têxtil compósito ou não, de outro material de colágeno.

[082] Uma esponja de colágeno pode ser obtida por liofilização de uma solução ou de uma suspensão de colágeno (ou de uma mistura dos dois). Antes ou depois da liofilização, o colágeno pode ser reticulado. A liofilização conduz a materiais que possuem geralmente 3 dimensões ou a pós.

[083] Para a obtenção de uma membrana ou de um filme, a solução de colágeno pode ser depositada sobre um molde plano para obter um material em duas dimensões após secagem da solução ou da suspensão. O filme ou a membrana podem ser obtidos por evaporação do solvente.

[084] Tubos de colágeno são obtidos pelo depósito da solução ou da suspensão sobre um molde cilíndrico e secagem ou liofilização.

[085] Para a obtenção de esponjas, a retirada do solvente pode ser realizada por liofilização e não por evaporação do solvente em forma líquida.

[086] Já é conhecido utilizar amônia para a coagulação e modelagem do colágeno mais em geral tratava-se do uso da amônia para coagular uma solução ou um gel durante processos de extrusão, por exemplo.

O tratamento com amônia era então muito rápido e em banhos. O processo de acordo com a presente invenção repousa sobre a velocidade de difusão do

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20/36 amoníaco na solução de colágeno, velocidade que depende essencialmente da concentração dessa base na superfície da solução. O colágeno e o amoníaco são deixados em contato durante um tempo suficiente para permitir a coagulação do colágeno, mas também sua fibrilação na totalidade da solução tratada. Isso conduz à preparação de materiais de colágeno que apresentam propriedades mecânicas que não são obtidas com os processos do estado da técnica, em termos de resistência à tração, de elasticidade e de resistência à sutura.

[087] A terceira etapa é, portanto, a coagulação do colágeno por tratamento com amoníaco durante um tempo suficiente para permitir ao mesmo tempo a coagulação e a fibrilação do colágeno. Tipicamente, o tratamento com o amoníaco é efetuado por um período de 4, 8, 12, 24, 36, a 48 h. De preferência, o tempo de tratamento é superior a 24 ou 36 horas.

[088] A quantidade de amoníaco deve ser ajustada para permitir um aumento de pH do gel de colágeno de um pH ácido até um pH pelo menos superior a 8. De fato, a reticulação do colágeno se inicia quando o gel de colágeno atinge um pH pelo menos superior a 8. Esse tratamento longo permite um aumento progressivo do pH do colágeno que conduz não apenas à sua coagulação mais também à sua fibrilação. Em função do comprimento das fibras de colágenos utilizadas, essa fibrilação forma uma malha que confere aos produtos ao mesmo tempo resistência mecânica e elasticidade.

[089] Em um modo de realização preferido, o gás amoníaco é preparado a partir de uma solução de amônia da qual ele se libera. Obtém-se geralmente uma quantidade apropriada de gás amoníaco com uma solução de amônia a pelo menos 30%, a uma temperatura compreendida entre 10°C e 25°C. De preferência, essa etapa é realizada em um recinto fechado hermeticamente de modo que o gás amoníaco se espalhe no interior do recinto e entre em contato com a solução de colágeno, a qual não está em contato

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21/36 com a solução de amônia.

[090] O gel de colágeno obtido é tratado para eliminar o amoníaco em excesso e é conservado tal qual ou desidratado. Para isso, o gel pode ser colocado em um recinto dotado de um sistema de eliminação da umidade e/ou de um absorvedor de amoníaco. Após eliminação do amoníaco em excesso, as membranas, filmes e tubos são obtidos por desidratação do gel sob corrente de ar seco, ao passo que as esponjas, as matrizes 3D ou os tubos igualmente são obtidos por liofilização do gel. Os geis podem ser mantidos hidratados.

[091] Nesse processo de preparação de materiais de colágeno, o processo de fibrilação ocorre em um meio líquido altamente viscoso. Essa fibrilação se produz de fora para dentro da solução e progride em profundidade à medida que aumenta o pH ligado à difusão do amoníaco. Ela se produz quando o pH atingir um valor superior a 4-5. A vantagem do processo com vapor de amoníaco é que o produto não precisa ser imerso em soluções de neutralização, o que permite um ganho de tempo, de rentabilidade e de homogeneidade.

[092] Quando se deseja aumentar o tempo de absorção de um dispositivo médico colagênico e também reforçar suas propriedades mecânicas, o material de colágeno deve ser reticulado. Existem diversos métodos de reticulação do colágeno bem conhecidos do técnico no assunto. Eles são classificados em duas grandes categorias: as reticulações físicas como, por exemplo, a desidratação térmica e as reticulações químicas por adição ou colocação em presença de agentes reticulantes. Os reticulantes do colágeno mais conhecidos são os agentes aldeídicos em particular o formaldeído e o glutaraldeído. Esses processos de reticulação podem evidentemente, ser utilizados nos materiais de colágenos obtidos acima.

[093] Assim, a fim de aumentar a resistência mecânica do

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22/36 colágeno ou dos materiais de colágeno, pode-se, portanto, proceder à sua reticulação. Essa etapa de reticulação é então efetuada após a última etapa d) do processo que conduz à obtenção do material de colágeno. Ela é efetuada, por exemplo, por imersão do material de colágeno em um banho que compreende um agente reticulante escolhido entre o formaldeído, o glutaraldeído, o glicogênio oxidado e a amilopectina oxidada.

[094] De modo particularmente vantajoso, a reticulação pode, ao contrário, ser realizada em uma única etapa, mas de mo sequencial com a coagulação e a fibrilação do colágeno. Nesse caso, introduz-se na solução de colágeno de partida um agente reticulante aldeídico que não reage com o colágeno a pH ácido e procede-se em seguida ao tratamento com o amoníaco para a obtenção de um pH pelo menos superior a 8.

[095] O agente de reticulação aldeídico é de preferência escolhido entre os polissacarídeos e mais particularmente os polissacarídeos oxidados. De preferência, o agente de reticulação aldeídico é escolhido entre o glicogênio oxidado e as amilopectinas oxidadas. Agentes de reticulação utilizáveis nos processos de acordo com a presente invenção são, por exemplo, o amido oxidado, o dextrano oxidado, a celulose oxidada conhecidos do técnico no assunto. Preferencialmente, o agente de reticulação aldeídico é glicogênio oxidado.

[096] O agente de reticulação é adicionado em proporções que variam de 0,05, 0,1, 0.5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 a 5 para a relação CHO do agente de reticulação aldeídico sobre NH2 do colágeno. As proporções de agente de reticulação poderão ser ajustadas pelo técnico no assunto em função da taxa de reticulação desejada. A quantidade de agente de reticulação a ser introduzida na solução de colágeno poderá assim ser determinada utilizando os conhecimentos gerais técnico no assunto.

[097] De preferência, procede-se então à preparação de uma

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23/36 solução aquosa concentrada (15%) do polissacarídeo oxidado escolhido. A taxa de oxidação e a quantidade de reticulante a serem adicionados devem ser avaliados em função da absorção desejada e das propriedades mecânicas procuras. É então possível adicionar reticulante ao colágeno em uma quantidade perfeitamente controlada e reprodutível (diferentemente das reticulações por vapor de formol, por exemplo, ou por imersão em banhos). Aqui, apenas o reticulante introduzido pode reagir. A solução de reticulante é adicionada à solução de colágeno antes da fundição ou modelagem, ou seja, a no fim da homogeneização sob pressão reduzida. O meio resultante é uma mistura homogênea do colágeno e do reticulante, mas as ligações entre ambos não se criam enquanto o conjunto não atingir um pH básico. As seguintes etapas são idênticas às da fibrilação do colágeno; a fibrilação e a reticulação são feitas sucessivamente e nessa ordem.

[098] O técnico no assunto saberá adaptar a quantidade de amoníaco e o tempo de exposição para atingir a fibrilação e a reticulação desejada.

[099] Essa etapa do processo de acordo com a presente invenção é notável por várias razões. A reticulação pelos polissacarídeos aldeídicos já foi descrita na literatura (Gagnieu CH e Forest PO, EP 0 862 468). Essa reticulação é feita por imersão dos produtos a serem reticulados em uma solução do polissacarídeo oxidado, ou por introdução no produto do polissacarídeo oxidado seguida imersão do produto seco em um banho que permite a reação de reticulação (aumento do pH). Em geral, a mudança de pH é efetuada por um tampão e levando-se em conta o princípio de reticulação bem conhecido (reação de Maillard -> reação dos CHO do reticulante com os NH2 do colágeno), evita-se realizar a mudança de pH por bases que apresentam elas próprias resíduos aminas. Assim, em presença de amoníaco, a teoria prediz que o polissacarídeo oxidado vai reagir com a amina do

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24/36 amoníaco e consequentemente será inativado. A reticulação não pode, portanto, ocorrer.

[0100] Na prática, ocorre que a presença de amoníaco modifica satisfatoriamente pH do gel de colágeno para permitir a fibrilação e também a reticulação. De modo totalmente surpreende, a reticulação ocorre a uma taxa eficaz, pois a reação de Maillard que deveria ocorrer entre o amoníaco e os aldeídos do reticulante, inativando este último está ausente, é de baixa amplitude, ou então não competitiva com a reação de reticulação dos grupos aldeído do polissacarídeo oxidado com as aminas das lisinas do colágeno. Isso é provado pelo fato de que os materiais reticulados dessa maneira não são mais solúveis em meio aquoso ácido apresentam degradações ao contato de enzimas proteolíticas inferiores a materiais não reticulados e que as propriedades mecânicas dos materiais em forma hidratada, e em particular a resistência mecânica, são igualmente melhoradas em relação a um material não reticulado.

[0101] A presente invenção a igualmente por objeto um material de colágeno suscetível de ser obtido pelos processos de acordo com a presente invenção. De preferência, o material de colágeno é reticulado. Esse material de colágeno pode, por exemplo, consistir em uma membrana de colágeno, um fio de colágeno, um tubo de colágeno, uma esponja de colágeno ou um gel de colágeno.

[0102] A presente invenção trata assim igualmente filmes, fios e tubos de colágeno suscetíveis de serem obtidos pelos processos de acordo com a presente invenção. Em um modo de realização vantajoso, a presente invenção trata de membranas de colágeno suscetíveis de serem obtidas pelos processos de acordo com a presente invenção.

[0103] Os processos de acordo com a presente invenção permitem a preparação de membranas secas de espessuras variáveis que

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25/36 podem ir de alguns mícrons a algumas centenas de mícrons. A espessura geralmente utilizada para assegurar a cicatrização guiada (= conservação dos planos de divagem) ou a substituição de tecidos em cirurgias urológica, ginecológica, cardíaca, torácica, vascular, articular, digestiva, plástica, espinhal, neurológica, ortopédica, traumatológica, dentária, maxilo facial e estomatológica, para a cicatrização guiada dos tecidos (dura-máter, gengiva, ossos, nervos, tendões, ligamentos, vísceras, pericárdio, peritônio, tecidos conjuntivos em geral, derme, músculo, cartilagem) está compreendida entre 30 e 200 pm.

[0104] A presente invenção tem, portanto, por objeto membranas de colágeno suscetíveis de serem obtidas pelos processos de acordo com a presente invenção que possuem uma espessura seca compreendida entre 30 e 200pm. De preferência, essas membranas são reticuladas.

[0105] Vantajosamente, essas membranas são constituídas de uma monocamada de colágeno, não porosa, com uma espessura seca compreendida entre 50 e 150pm.

[0106] Em um modo de realização, a presente invenção tem por objeto membranas de colágeno que possuem uma espessura seca compreendida entre 80 e 120 pm, uma densidade compreendida entre 12 mg/cm² e 16 mg/cm², uma taxa de dilatação inferior a 6, uma resistência à sutura superior a IN, uma tensão de ruptura superior a 4 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina inferior a 35%.

[0107] Em um modo de realização preferido, a presente invenção tem por objeto as membranas de colágeno previamente descritas que apresentam uma taxa de dilatação compreendida entre 4 e 6, uma resistência à sutura compreendida entre 1 e 2,5 N, uma tensão de ruptura compreendida entre 4 e 7 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina compreendida entre 20 e 35%.

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26/36 [0108] A taxa de dilatação é medida da seguinte maneira: 20 mg de produto são imersos Phosphate Buffer Saline IX pH 7,4 durante 60min a 37°C. Após uma hora, o excesso de água é removido com papel absorvente e a amostra é pesada novamente. A taxa de dilatação é calculada pela relação da massa do produto úmido / massa do produto seco.

[0109] As medidas de tensões mecânicas (resistência à sutura e tensão) são mensuradas em um corpo de prova de 5 mm de largura por meio de um banco de ensaio de tração. No que diz respeito à sutura, um fio de sutura de tipo trança poliamida 3/0 é passada através da membrana e a forma máxima a ser aplicada para romper a sutura é medida com um banco de ensaio de tração.

[0110] Para determinar a degradação enzimática pela tripsina, fragmentos de produto de massas compreendidas entre 10 e 20 mg são imersos em 3 mL de PBS IX pH 7,6, 500 unidades de tripsina são adicionadas à amostra. Apos 48 horas de degradação, as amostras digeridas são coletadas, desidratadas e pesadas. A perda de massa em relação à massa de partida é calculada em seguida.

[0111] A presente invenção trata também das membranas de colãgeno reforçadas com um têxtil, reabsorvível ou não. Essas membranas reforçadas com um têxtil constituem um reforço parietal e são particularmente apropriadas para a cirurgia visceral e uroginecológica ou um penso transdérmico para ligamentos destinados a reforçar, prolongar ou substituir um ligamento ou um tendão.

[0112] A presente invenção tem, portanto, também por objeto um material compósito que compreende, ou consiste em, um têxtil recoberto em uma face por um material de colãgeno tal como descrito acima.

[0113] Pode se tratar, em particular, de um têxtil que porta uma membrana de colãgeno de acordo com a presente invenção sobre uma de

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27/36 suas faces. Esses tecidos protéticos e seus processos de fabricação estão, por exemplo, descritos no documento US 6,451,032.

[0114] Membranas de colágeno reforçadas com um tecido de acordo com a presente invenção podem ainda ser fabricadas de acordo com processos bem conhecidos do técnico no assunto.

[0115] No contexto da presente invenção esse processo pode compreender as seguintes etapas:

- preparação de uma solução aquosa de colágeno em forma ácida, adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido,

- moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

- depósito do têxtil sobre o colágeno, coagulação e reticulação da solução aquosa de colágeno por tratamento com amoníaco, eliminação do amoníaco e obtenção do material de colágeno.

[0116] As membranas reforçadas com um têxtil sobre uma face obtidas de acordo com o processo acima são particularmente apropriadas para a cirurgia parietal.

[0117] De modo alternativo, o processo pode compreender as seguintes etapas:

- preparação de uma solução aquosa de colágeno em forma ácida,

- adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido,

- moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

- inclusão do têxtil no colágeno,

- coagulação e reticulação da solução aquosa de colágeno por

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28/36 tratamento com amoníaco,

- eliminação do amoníaco e obtenção do material de colágeno.

[0118] Os têxteis que compreendem assim uma membrana de acordo com a presente invenção dos 2 lados são particularmente apropriados para a cirurgia ligamentar, por exemplo.

[0119] A presente invenção tem, portanto, ainda por objeto um material compósito que compreende, e mesmo consiste em, têxtil recoberto nas duas, em particular em cada uma, de suas faces por um material de colágeno tal como descrito acima, em particular o têxtil pode ser incluído no material de colágeno.

[0120] Outros processos que permitem associar um material de colágeno de acordo com a presente invenção com um têxtil são conhecidos do técnico no assunto.

[0121]A presente invenção trata, portanto, igualmente de um material de colágeno de acordo com a presente invenção, e em particular de uma membrana, associado a um têxtil.

[0122] Os processos de acordo com a presente invenção conduzem também à preparação de tubos para assegurar a guia de órgãos em cirurgia nervosa, tendinosa e ligamentar, vascular. As membranas podem igualmente para essa indicação serem enroladas e fechadas em forma de luva por sutura e/ou colagem.

[0123] Finalmente, os processos permitem a preparação de matrizes 3D de uma espessura superior a 200pm, porosas ou não, que permitem, entre outras coisas, a inoculação de células previamente ou não à implantação do material para aplicações em medicina regenerativa ou que permitem a obtenção de pensos transdérmicos suturáveis e elásticos para aplicações cardíacas, regeneração de dura-máter, guia de tecidos moles e duros.

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Exemplos

Exemplo 1: Produção de colágeno fibroso ácido de Tendões

Dilatação dos tendões [0124] 1 kg de tendões de pés de porcos é limpo para retirar as partes musculares e aponeuróticos. Eles são imersos em 25L de uma solução aquosa de ácido acético 0,3M durante 10 dias a 20°C (+/- 2°C) sob agitação lenta.

Trituraçãq dos tendões [0125] 3 L da suspensão obtida são triturados a 3000 rpm em um triturador com facas durante 2 minutos. O meio é diluído por 2L de água e o conjunto é homogeneizado durante 1 minuto. O meio é filtrado em um filtro com uma porosidade 200 pm e o filtrado é ajustado a 0,6M de NaCl para fazer precipitar o colágeno.

Recuperação do Colágeno e Lavagens [0126] A suspensão é filtrada ou centrifugada para separar o precipitado do sobrenadante. O precipitado é coletado e lavado em 10 L de NaCl 0,6M sob agitação durante pelo menos 1 hora; o precipitado é novamente coletado por filtração sobre tela ou centrifugação. A etapa de lavagem pode ser realizada o número de vezes desejado em função da pureza do colágeno final desejado (idealmente 2 vezes).

Inativação Viral e Lavagens [0127] O colágeno precipitado e escorrido é dissolvido a 1% na água durante 16 horas sob agitação. A concentração do meio é trazida a 1M de NaOH e a solução é agitada durante 1 hora a 20°C. No final da etapa de inativação, a solução é neutralizada com ácido clorídrico 6M até a precipitação do colágeno. O colágeno é recuperado por filtração ou centrifugação. O colágeno pode ser novamente lavado em 10 L de NaCl 0,6M e depois coletado por filtração sobre tela ou centrifugação. A etapa de lavagem pode ser

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30/36 realizada o número de vezes desejado em função da pureza do colágeno final desejado (idealmente 2 vezes).

Cultura e Secagem [0128] No final do processo de purificação, o colágeno precipitado é escorrido e depois secado em banhos de acetona. O colágeno é finamente secado sob fluxo de ar controlado para eliminar a acetona residual e depois conservado, por exemplo, a - 20°C.

Exemplo 2: Caracterização de um Lote de Colágeno Fibroso Ácido de

Tendões [0129]603mg de colágeno fibroso ácido de tendões que apresentam uma taxa de umidade de 17,05% são colocados em dispersão em 500 mL de água desmineralizada durante 16h sob agitação magnética. Uma tela de porosidade calibrada de 50 pm é colocada sobre um suporte cilíndrico de 9 cm de diâmetro acima de um recipiente. Um volume de solução de colágeno é vertido sobre a tela de modo a não ultrapassar 4 cm de altura. Uma lâmina de 7 cm de diâmetro é colocada a 2 mm da tela e uma agitação de 80 rpm é efetuada, a solução de colágeno escoa progressivamente através da tela. Quando o volume contido na câmara superior deixa de diminuir, o sistema é recarregado de modo à nunca ultrapassar 4 cm de altura. Essas operações são realizadas até o esgotamento da solução preparada. Depois que o sistema atingir o equilíbrio, o retentado é lavado com 3 χ 50 mL de ácido acético 0,05M com o mesmo sistema, respeitando os diferenciais de pressão. A fração superior é coletada.

[0130] A fração inferior é recuperada e a análise é prosseguida da mesma maneira sobre uma tela calibrada de 5 pm de porosidade. O retentado bem como o filtrado são coletados. As 3 frações, ou seja, o retentado da filtração sobre 50 pm, o retentado e o filtrado da filtração sobre 5 pm, são trazidos a 0,6 M de NaCI e o colágeno é recuperado por centrifugação e depois

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31/36 secado com 2 banhos de acetona 70 e 3 banhos de acetona 100. O excesso de acetona é eliminado por secagem sob fluxo de ar. As frações são pesadas e comparadas com a massa total coletada. A análise conduz a 6,5% de fibras retidas em um filtro de 50 pm, 27% de fibras que atravessaram um filtro de 5pm e 66,5% compreendidas entre 5 e 50pm.

Exemplo 3: Preparação de um Filme / Membrana de Colágeno Reticulado #1 [0131] 800 mg de colágeno fibroso ácido de tendões são colocados em suspensão sob agitação mecânica em 100 mL de água durante 16 horas. A suspensão viscosa é vertida em um molde à razão de 4mg de colágeno/cm². O molde que contém a solução de colágeno é colocado em um recinto fechado hermeticamente de 3L que contém 2 mL de amônia 30% durante 24 horas a 20°C. O gel é colocado em um recinto que permite eliminar o excesso de amoníaco com um absorvedor de amoníaco e de umidade para obter um filme com uma espessura próxima de 40 pm. O filme pode ser utilizado tal qual ou reticulado por imersão em um banho de formaldeído, glutaraldeído, glicogênio oxidado, amilopectina oxidada de diversas concentrações durante tempos que podem variar entre 2 minutos e 24 horas. Os reticulantes são inativados por imersão do filme em uma solução de glicina 0,1 M; pH 8 durante 2 horas. O filme é secado novamente a seguir.

[0132] Por exemplo, o filme obtido após a primeira secagem é imerso durante 1 hora em um banho de formaldeído 0,1% pH 8 e depois enxaguado em um banho de glicina 0,1 M pH 8 durante 2 horas. Após um enxágue com água, o filme é secado novamente.

Exemplo 4: Preparação de uma Membrana de Colágeno Reticulado #2 [0133] Para a obtenção de uma membrana que contém 10 mg de colágeno/ cm², 100g de colágeno são colocados em suspensão em 12, 5L de água sob agitação mecânica durante 16 horas. Paralelamente, 2,5g de glicogênio oxidado dissolvido a 15% em tampão fosfato pH 7,7 são preparados

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32/36 e adicionados à suspensão após 16 horas. Após homogeneização, a solução é vertida em um molde de 1 m² (ou equivalente). O ou os moldes que contêm a solução de colágeno é colocado em um recinto fechado hermeticamente de 300 L aproximadamente contendo 160 mL de amônia 32% distribuídos de modo homogêneo durante 48 horas a 20°C. No fina da fase de fibrilação, reticulação, o ou os geis são colocados em um recinto que permite eliminar o excesso de amoníaco com um absorvedor de amoníaco e de umidade para obter uma membrana com uma espessura próxima de 100 pm.

Exemplo 5: Medida da Taxa de Dilatação de uma Membrana Preparada no

Exemplo4 [0134] 3 amostras de 20,5 / 22 e 20mg de produto são pesadas com precisão e imersas em 3 ml de PBS IX pH 7,4 durante 1 hora a 37°C. Após uma hora, o excesso de água de cada amostra é retirado e as amostras são pesadas novamente. Os resultados são os seguintes:

	Massa retirada (mg)	Massa após dilatação (mg)	Taxa de dilatação
Amostra 1	20,5	110	5,5
Amostra 2	22	127,6	5,8
Amostra 3	20	114	5,7
Média	5,66

Exemplo 6: Esponja de Colágeno Fibroso Ácido Reticulado pelas

Amilopectinas Oxidadas [0135] Uma solução aquosa de colágeno fibroso ácido é obtida por mistura de 0,8 g em 100 mL de água. O meio é agitado durante 16 horas a 20°C. 28 mg de amilopectina contendo 1,4 mols de aldeídos / mols de sacarídeos são aquecidos a 75°C em 1 ml de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,7 até dissolução completa. Após resfriamento a 20°C, essa solução é vertida sob agitação na solução de colágeno a 0,8%. O meio homogêneo é vertido em um molde a uma altura de 5 mm e transferido para um recinto fechado hermeticamente com um volume de aproximadamente 3 L contendo 3 ml de

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33/36 amônia a 28% durante 16 horas. O dispositivo que contém o gel é colocado em seguida em um recinto hermeticamente fechado que contém um absorvedor de amoníaco até o desaparecimento total no amoníaco no recinto. O gel de colágeno é congelado em seguida e depois liofilizado para dar uma esponja de atelocolágeno reticulado.

Exemplo 7: Medida da Homogeneidade de Reticulação [0136] Um gel de aproximadamente 1 cm de espessura foi preparado pelo processo descrito no exemplo 4 até etapa de reticulação.

[0137] No final dessa etapa de reticulação, o gel foi desmoldado, cortado em dois, aproximadamente no meio, no sentido horizontal e os dois fragmentos são secados separadamente.

[0138] Uma amostra “externa” e uma amostra “interna” de material (aproximadamente 10 mg cada uma) são retiradas respectivamente do que corresponde à parte externa e à parte interna do gel.

[0139] A taxa de reticulação é determinada por uma dosagem das aminas que permaneceram livres no colágeno por TNBS (ácido 2,4,6 trinitrobenzeno sulfônico). Esse reagente TNBS reage especificamente com as aminas dos resíduos lisina e dos ácidos aminados terminais livres.

[0140] As amostras interna e externa são retiradas e incubadas em uma solução água-propanol (1 ml) a 60°C durante 1 hora. 500 pl_ de bicarbonato 8% e 1 ml de TNBS diluído 1/120 são adicionados. A reação é realizada durante 3 horas a 40°C.

[0141] Após resfriamento, 200 μΙ_ de HCI 6N são adicionados para interromper a reação. O excesso de TNBS é extraído com 5 mL de acetato de etila. Uma hidrólise ácida (3 mL de HCI 6N durante 1 h 15) libera todos os ácidos aminados. Os ácidos aminados terminais N-TNBS são extraídos do mesmo modo que para o excesso de TNBS.

[0142] Após uma diluição adequada, a absorvência da fase

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34/36 aquosa é medida a 345nm. O coeficiente de extinção molar do complexo a 345nm, medido de acordo com o protocolo descrito por Kakade et al., é de 1,46.10^-4 M’¹. cm'¹, ele permite calcular a quantidade de lisina que permaneceu livre na membrana. O resultado é expresso em pmol de lisina livre por mg de membrana.

[0143] Para uma membrana reticulada com glicogênio oxidado à razão de 0,4 CHO do glicogênio oxidado para 1 NH2, os resultados são os seguintes:

	pmol de lisina livre/mg de membrana
Amostra externa	0,161
Amostra interna	0,150

[0144] A diferença de reticulação é, portanto, de 3,5%, ou seja:

((0,161- 0,150)/(0,161 + 0,150) x 100).

[0145] As taxas de reticulação da parte externa e da parte interna são, portanto, sensivelmente equivalentes. A reticulação é, portanto, bastante sensivelmente homogênea em toda a espessura do material.

Exemplo 8: Medida da Reticulação [0146] Uma membrana chamada de “reticulada” foi preparada de acordo com o processo descrito em exemplo 4, inclusive a etapa de adição do amoníaco.

[0147] Uma membrana chamada de “não reticulada” foi preparada de acordo com o processo descrito no exemplo 4 no qual a etapa de adição do amoníaco é omitida.

[0148] A reticulação pode ser caracterizada por uma medida de DSC (Differential Scanning Calorimetry ou calorimetria diferencial de varredura). Esse método mede as diferenças das trocas de calor entre uma amostra a ser analisada e uma referência.

[0149] Ela permite determinar as transições de fase:

• a temperatura de transição vítrea (T_g)

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35/36 • as temperaturas de fusão ou desnaturação • as entalpias de reação (para conhecer as taxas de reticulação dos polímeros).

[0150] As análises são realizadas sob varredura de um gás inerte (por exemplo, o nitrogênio ou o argônio) para evitar qualquer reação do material a ser estudado com a atmosfera do forno.

[0151] No que diz respeito ao colágeno, a reticulação acarreta o aumento da temperatura de desnaturação. Para provar que a incubação da solução de colágeno que contém o reticulante nos vapores de amônia conduz à formação de ligações químicas estáveis de reticulação entre o colágeno e o reticulante, o perfil em DSC de uma membrana reticulada e uma membrana não reticulada foram determinados.

	Temperatura de desnaturação (°C)
Membrana reticulada	49,62
Membrana não reticulada	42,37

[0152] A temperatura de desnaturação da membrana reticulada é, portanto, bem superior à da membrana não reticulada. A reação entre o reticulante aldeídico e o colágeno ocorre, portanto, efetivamente durante a incubação das soluções nos vapores de amônia.

Referências [0153]Forest PO, Karoum R, Gagnieu CH. Influence of gradual introduction of hydrophobic groups (stearic acid) in denatured atelocollagen on fíbroblasts behavior in vitro, J Biomed Mater Res A. 2007 Mar l;80(3):758-67.

[0154] Gagnieu CH, Forest PO. In vivo biodegradability and biocompatibility of porcine type I atelocollagen newly crosslinked by oxidized glycogen, Biomed Mater Eng. 2007; 17(1): 9-18).

[0155]Rousseau, CF. and CH. Gagnieu, In vitro cytocompatibility of porcine type I atelocollagen crosslinked by oxidized glycogen. Biomaterials,

2002.23(6): p. 1503-10.

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36/36 [0156]Kakade ML., Liener IE, Determination of available lysine in proteins, Anal Biochem, 1969; 27(2): 273-280.

Patentes de Referência

WO 2007/147739

FR 2 810 889

FR 2 877 669

EP 0 862 468 US 4,931,546

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Claims

Reivindicações

1. PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM MATERIAL DE COLÁGENO, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) preparação de uma solução aquosa de colágeno nativo ou desnaturado em forma ácida,

b) adição de um agente de reticulação aldeídico não reativo a pH ácido,

c) moldagem ou fundição da solução aquosa de colágeno,

e) eliminação do amoníaco em excesso e obtenção do material de colágeno por secagem.

2/3 glicogênio oxidado.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução aquosa da etapa a) compreender 0,05 a 3% em peso de colágeno em forma ácida.

3/3 uma densidade compreendida entre 12 mg/cm² e 16 mg/cm², uma taxa de dilatação inferior a 6, uma resistência à sutura superior a 1N, uma tensão de ruptura superior a 4 MPa e uma porcentagem de degradação enzimática à tripsina inferior a 35%.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela solução aquosa da etapa a) ser preparada com colágeno fibroso ácido escolhido entre os colágenos de tendões de porco, de tendões de bezerro, de tendões de cordeiro e de tendões de potro.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, durante etapa d), a coagulação e a reticulação da solução de colágeno serem efetuadas por tratamento com gás amoníaco durante pelo menos 24 horas.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo agente de reticulação aldeídico ser escolhido entre o glicogênio e as amilopectinas aldeídicas.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo agente de reticulação aldeídico ser

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7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado pelo agente de reticulação aldeídico ser adicionado em proporções que variam de 0,05 a 5 para a relação CHO do agente de reticulação aldeídico sobre NH2 do colágeno.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo material de colágeno ser uma membrana e, na etapa c), a solução aquosa de colágeno ser depositada em um molde plano e, na etapa e), 0 amoníaco em excesso ser eliminado e obter-se uma membrana de colágeno por secagem.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo material apresentar uma reticulação homogênea, apresentando uma diferença entre a reticulação sobre a superfície externa e a reticulação no interior do material inferior ou igual a 25%.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo material apresentar uma temperatura de desnaturação superior ou igual a 3°C em relação ao material de colágeno não reticulado.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo material apresentar um aumento da temperatura de desnaturação em relação ao material não reticulado de pelo menos 5%.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo material consistir em uma membrana de colágeno, um filme de colágeno, um fio de colágeno, um tubo de colágeno, uma esponja de colágeno ou um gel de colágeno.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo material consistir em uma membrana de colágeno que possui uma espessura seca compreendida entre 80 e 120 pm,

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14. MATERIAL COMPÓSITO, caracterizado por compreender um têxtil recoberto, em uma de suas faces ou em cada uma de suas faces, por um material de colágeno obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em particular o têxtil pode estar incluído no material de colágeno.

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