BRPI1007443B1 - método para diagnosticar nefropatia diabética em um indivíduo, método para avaliar a eficácia de um tratamento para nefropatia diabética em um indivíduo, método para determinação do estágio da nefropatia diabética em um indivíduo, método para monitoramento do progresso da nefropatia diabética em um indivíduo, e método para avaliar a eficácia de um tratamento para nefropatia diabética em um indivíduo - Google Patents
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Abstract
BIOMARCADORES SÉRICOS E DE URINA ASSOCIADOS Á NEFROPATIA DIABÉTICA. Uso de biomarcadores de urina e séricos no diagnostico de nefropatia diabética, estadiamento da nefropatia diabética, monitoramento do progreeso da nefropatia diabética e avaliação da eficácia dos tratamentos da nefropatia diabética. Estes marcadores incluem alfa-2-HS- glicoproteína precussora da urina, alfa-1 antitripsina da urina, alfa-1 glicoproteína ácida da urina, osteopontina da urina, osteopontina do soro e seus fragmentos e combinações das mesmas.
Description
Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US número 61/147.778, depositado em 5 de janeiro de 2009, o conteúdo do mesmo sendo incorporado ao presente documento em sua totalidade.
A nefropatia diabética (DN) é uma doença renal progressiva associada à longa duração do diabetes melito. A mesma causa filtração anormal de fluidos e excreção aumentada de albumina pela urina, eventualmente conduzindo à falência renal.
A DN não apresenta sintomas em seu curso inicial. Como tal é dificil a detecção da incipiência desta doença. De fato, o diagnóstico atual da DN depende do desenvolvimento da microalbuminúria, que ocorre quando a lesão renal já está em curso. A falta de um teste de diagnóstico precoce impede o tratamento eficaz da DN em seu estágio inicial.
É de grande importância a identificação de biomarcadores confiáveis que sejam úteis no diagnóstico precoce da DN.
A presente invenção se baseia em descobertas inesperadas, onde várias proteínas séricas e da urina incluindo seus fragmentos, tanto sozinhas quanto em combinação se apresentam de forma diferente nos pacientes portadores de DN, em comparação aos pacientes que não apresentam DN. Estas moléculas protéicas, portanto, são marcadores úteis para diagnosticar o estágio precoce da DN.
Consequentemente, um aspecto desta invenção retrata um método para diagnóstico de DN em um indivíduo. Este método inclui, pelo menos, duas etapas: (i) determinação de um nivel de um biomarcador em um indivíduo suspeito de portar DN, e (ii) avaliação se o indivíduo apresenta DN com base no nivel do biomarcador. Um aumento no nivel do biomarcador, em comparação aquele de um indivíduo que não apresenta DN, indica que o indivíduo apresenta DN.
O biomarcador utilizado neste método de diagnóstico se constitui em uma das quatro moléculas protéicas listadas a seguir. (i) uma primeira molécula protéica da urina que é alfa-2-HS-glicoproteina precursora ou um fragmento da mesma apresentando, pelo menos, dez residuos de aminoácido, tais como, alfa-2-HS-glicoproteina madura, WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1), ou MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2); (ii) uma segunda molécula protéica da urina que é uma alfa-1 antitripsina ou seu fragmento apresentando pelo menos dez residuos de aminoácido, tais como, KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3): MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), ou EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); (iii) uma terceira molécula protéica da urina que é um fragmento da alfa-1 glicoproteina ácida possuindo pelo menos dez resíduos de aminoácido, tal como, GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7): e (iv) uma molécula protéica de soro que é osteopontina ou um seu fragmento possuindo pelo menos dez resíduos de aminoácido, tais como: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) ou KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
O método de diagnóstico descrito acima pode incluir, adicionalmente, após a etapa de avaliação, uma etapa de correlação do nível do biomarcador com o estado da DN (isto é, se a mesma se encontra em um estágio precoce ou avançado). Quando o biomarcador se constitui nas moléculas protéicas (i) ou (iv), um aumento neste nível em relação aquele em um indivíduo que não apresenta DN é indicativo do estágio avançado da DN. Para um biomarcador que se constitui nas moléculas protéicas (ii) ou (iii), seu nível indica o estado da DN quando comparado aos níveis do biomarcador de referência pré-determinados que representam um estágio precoce ou avançado da DN.
Em outro aspecto, a presente invenção apresenta um método para avaliar a eficácia de um tratamento da DN em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou um animal de laboratório). Este método inclui determinação no indivíduo dos níveis de pré-tratamento e pós-tratamento das moléculas protéicas (i), (ii), (iii), ou (iv) e avaliação da eficácia do tratamento com base em uma alteração no nível do biomarcador após o tratamento. Se o nível de pós-tratamento do biomarcador permanecer o mesmo ou diminuir quando comparado ao nível de pré-tratamento do biomarcador, isto indica que o tratamento é eficaz.
Ainda em outro aspecto, esta invenção retrata um método para determinação de um estágio de DN incluindo, pelo menos, quatro etapas: (i) obtenção de uma amostra de urina e, opcionalmente, uma amostra sérica de um indivíduo com suspeita de nefropatia diabética, (ii) determinação na(s) amostra(s) do nivel de um dos biomarcadores listados no parágrafo precedente, (iii) cálculo de uma classificação da doença com base no nivel do biomarcador e (iv) avaliação do estágio da nefropatia diabética do indivíduo com base na classificação da doença comparado aos valores de corte predeterminados indicando estágios diferentes da nefropatia diabética. Neste método, a etapa de cálculo pode ser realizada por análise de regressão de Ridge, análise fatorial, análise discriminante funcional e análise de regressão logística.
O biomarcador usado no método de estadiamento da DN descrito anteriormente é composto de pelo menos duas das cinco moléculas protéicas que se seguem: moléculas protéicas (i)-(iv) listadas acima e molécula protéica (v) que é osteopontina da urina ou seu fragmento descrito acima. Em um exemplo, o biomarcador é composto de todas as cinco moléculas protéicas. Em outro exemplo, o mesmo é composto de pelo menos duas moléculas protéicas (i)-(iii) e (v) .
Alternativamente, o biomarcador é composto de pelo menos duas das cinco moléculas protéicas listadas acima e adicionalmente um ou mais fatores clínicos, por exemplo, idade, sexo, HbAlc, taxa de albumina/creatinina (ACR) e taxa de filtração glomerular (GER).
Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um método para monitorar o progresso da DN com base no nível de qualquer um dos biomarcadores mencionados acima. Este método inclui obtenção das amostras de urina e opcionalmente, duas amostras séricas, dentro de um espaço de tempo de 2 semanas a 12 meses (por exemplo, 2-24 semanas ou 3-12 meses) de um indivíduo com suspeita de apresentar DN, determinação nas amostras de um nível de um dos biomarcadores, cálculo das classificações da doença com base nos níveis do biomarcador e avaliação do progresso da DN no indivíduo com base nas classificações da doença. A classificação da doença para as amostras obtidas por último sendo maior que aquela para as amostras obtidas anteriormente o que indica a exacerbação da DN.
Os biomarcadores mencionados acima podem também ser usados para avaliar a eficácia de um tratamento para DN. O tratamento é eficaz se o nível de pós-tratamento de um dos biomarcadores permanecer inalterado ou diminuir em comparação ao nível de pré-tratamento do mesmo biomarcador.
A presente invenção provê, adicionalmente, um kit para uso em qualquer um dos métodos acima. Este kit inclui dois, três ou quatro anticorpos com diferentes especificidades de antígeno. Cada um destes anticorpos é capaz de se ligar a um dentre (i) alfa-2-HS-glicoproteína, (ii) alfa-1 antitripsina, (iii) alfa-1 glicoproteína ácida e (iv) osteopontina. Em um exemplo, este kit contém apenas anticorpos específicos para antígenos a serem detectados (por exemplo, biomarcadores associados à DN) para prática de um dos métodos revelados no presente documento. A saber, o mesmo consiste essencialmente em tais anticorpos.
Também dentro do escopo desta invenção se encontra um anticorpo isolado ligando especificamente um dos peptideos que se seguem: MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO : 2 ) , KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6), GQEHFAHLLILRDTKTYMLADVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7), YPDAVATWLNPDPSQKQ NLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8), e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
O termo "um anticorpo isolado" empregado no presente documento se refere a um anticorpo substancialmente isento de moléculas naturalmente associadas. Mais especificamente, uma preparação contendo o anticorpo é julgada como sendo "um anticorpo isolado" quando as moléculas naturalmente associadas na preparação constituem no máximo 20% em peso seco. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese de gel poliacrilamida e HPLC.
Qualquer um dos anticorpos descritos acima pode ser usado na fabricação de um kit útil na prática de qualquer um dos métodos desta invenção.
Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção são estabelecidos na descrição a seguir. Outros aspectos ou vantagens da presente invenção ficarão claros dos desenhos que se seguem e descrição detalhada das várias concretizações e também das reivindicações apensas.
O desenho é descrito primeiro.
A figura 1 é um diagrama mostrando gráficos caixa (box plot) para alfa-2-HS-glicoproteina de urina (uDN2; vide painel A), alfa-1 antitripsina de urina (uDN5; vide painel B), alfa-1 glicoproteina ácida da urina (uGR3; vide painel C) , e osteopontina sérica (sDNO; vide painel D) nos vários grupos de pacientes apresentando DN. Os limites superior e inferior das caixas marcam os valores de 25% e 75% com as médias como as linhas através das caixas. O diagrama whisker superior marca o maior valor abaixo do limite superior, que é o valor de 75% mais da distância interquartilica de 1,5 e o diagrama whisker inferior marca o menor valor acima do limite inferior, que é o valor de 25% menos a distância interquartilica de 1,5.
A DN é um transtorno renal associado ao diabetes. A mesma apresenta cinco fases de progressão: Estágio 1: caracterizado por diabetes melito com GFR normal e albuminúria normal (ACR < 30 mg/g); Estágio 2: caracterizado por hiperfiltração glomerular (superior a 120 mL/minuto/1,73 m2) e dilatação renal acompanhada de GFR normal e albuminúria normal (ACR < 30 mg/g); Estágio 3: caracterizado por microalbuminúria: Estágio 4: caracterizado por albuminúria visivel e um declinio progressivo em GFR; e Estágio 5: caracterizado por GFR inferior a 15 mL/minuto/1,73 m2.
De modo geral, os estágios 1-3 são tidos como estágios precoces e os estágios 4 e 5 são tidos como estágios avançados.
Nós identificamos vários biomarcadores associados à DN, especialmente DN em diferentes estágios. Estes biomarcadores são compostos de uma ou mais das quatro proteínas e seus fragmentos que se seguem, tanto na urina quanto no soro: (a) alfa-2-HS-glicoproteina (Número de acesso ao GenBank NP_001613; 10 de janeiro de 2010); (b) alfa-l-antitripsina (Número de acesso ao GenBank AAB59495: 10 de janeiro de 2010) : (c) alfa-1 glicoproteína ácida (Número de acesso ao GenBank EAW87416; 10 de janeiro de 2010); e (d) Osteopontina, que inclui duas isoformas conhecidas como fosfoproteina la secretada (Número de acesso ao GenBank NP_001035147; 17 de janeiro de 2010) e fosfoproteina 1b secretada (Número de acesso ao GenBank NP 000573; 10 de janeiro de 2010) .
Os fragmentos destas quatro proteínas apresentam um comprimento minimo de dez aminoácidos e preferivelmente, um comprimento máximo de 190 a 410 aminoácidos. Por exemplo, os fragmentos das proteínas (a) , (b) , (c) e (d) podem conter até 357, 408, 191 e 290 resíduos de aminoácidos, respectivamente.
Nós verificamos que os biomarcadores compostos de uma ou mais proteínas/fragmentos mencionados anteriormente e um ou mais fatores clínicos (por exemplo, idade, sexo, IlbAIc, ACR e GFR) estão também associados à DN em estágios diferentes.
Consequentemente, um aspecto da presente invenção se refere a um método de diagnóstico de DN usando qualquer um dos biomarcadores descritos acima. Para praticar este método, uma amostra de urina e quando necessário, uma amostra sérica é coletada de um indivíduo suspeito de apresentar DN e os níveis séricos e da urina de uma ou mais das quatro proteínas listadas acima ou seus fragmentos podem ser determinados através dos métodos de rotina, por exemplo, espectrometria de massa e análise imune. Se aplicável, os fatores clínicos são determinados por métodos de rotina.
Quando o biomarcador contiver uma molécula de proteína simples, seu nível em um indivíduo pode ser comparado a um ponto de referência para determinar se aquele indivíduo apresenta DN. O ponto de referência, representando o nível do mesmo biomarcador em um indivíduo que não apresenta DN pode ser determinado com base nos níveis representativos do biomarcador nos grupos de pacientes que apresentam DN e indivíduos que não apresentam DN. Por exemplo, isto pode ser o ponto mediano entre os níveis médios destes dois grupos. Um nível de biomarcador maior que o ponto de referência é indicativo de DN.
Quando o biomarcador contiver pelo menos duas moléculas de proteína e opcionalmente, pelo menos um fator clínico, os níveis das moléculas de proteína e o(s) valor(es) do(s) fator(es) clínico(s) podem ser submetidos a uma análise apropriada para gerar uma classificação da doença (por exemplo, representado por um número) que caracteriza o nível dos biomarcadores. Os exemplos da análise incluem, porém não estão limitados a análise discriminante funcional, análise de regressão logística, análise de regressão de Ridge, análise de componente principal, análise fatorial e modelo linear generalizado. A classificação da doença é então comparada com um ponto de referência representando o nível do mesmo biomarcador em indivíduos que não apresentam DN. O ponto de referência pode ser determinado por métodos convencionais. Por exemplo, pode ser uma classificação obtida por análise dos níveis médios das moléculas de proteína e quando necessário, o(s) valor(es) médios do(s) fator(es) clínico(s) em indivíduos que não apresentam DN com a mesma análise. A classificação da doença sendo maior que o ponto de referência é indicativa da presença de DN.
Outro aspecto desta invenção se refere a um método para determinar um estágio DN em qualquer um dos biomarcadores descritos acima. Para praticar este método, um nível de biomarcador de um paciente apresentando DN, preferivelmente representado por uma classificação de doença é comparado a um conjunto de valores de corte pré- determinados que distinguem diferentes estágios de DN para determinar o estágio da DN do indivíduo. Os valores de corte podem ser determinados por análise dos níveis representativos do mesmo biomarcador nos pacientes com DN de estágio diferente através da mesma análise.
A seguir é descrito um procedimento exemplar para determinação dos valores de corte mencionados anteriormente com base em um biomarcador associado à DN em estágios diferentes. (1) alocação dos pacientes com DN aos diferentes grupos de acordo com suas condições de doença (por exemplo, estágios de DN e fatores de risco); (2) determinação em cada grupo de paciente dos níveis/valores das moléculas protéicas e fatores clínicos constituindo o biomarcador; (3) sujeição dos níveis protéicos e valores de fator clínico a uma análise apropriada para estabelecer um modelo (por exemplo, fórmula) para calcular uma classificação de doença, e (4) determinação de um valor de corte para cada estágio de doença com base em uma classificação de doença (por exemplo, valor médio) representando cada grupo de paciente, bem como outros fatores relevantes, tais como, sensibilidade, especificidade, valor predicativo positivo (PPV) e valor predicativo negativo (NPV).
Quaisquer modelos assim gerados podem ser avaliados quanto ao seu valor de diagnóstico por uma análise característica operacional do receptor (ROC) para criar uma curva ROC. Um modelo multivariável ótimo provê uma área sob a curva (AUC) grande na análise ROC. Vide os modelos descritos nos Exemplos 1-3 abaixo.
Ainda em outro aspecto, esta invenção se refere a um método para monitorar o progresso da nefropatia em um indivíduo com base em qualquer um dos biomarcadores descritos acima. Mais especificamente, duas amostras de urina e/ou amostras séricas de um indivíduo podem ser obtidas dentro de um intervalo de tempo apropriado (por exemplo, 2 semanas a 12 meses) e examinadas para determinar os níveis de um dos biomarcadores. As classificações da doença são então determinadas conforme descrito acima. Se a classificação da doença representando o nível do biomarcador na(s) amostra(s) obtida(s) mais tarde for superior ao da(s) amostra(s) obtida(s) anteriormente, isto indica exacerbação da DN no indivíduo.
O método de monitoramento pode ser aplicado ao ser humano sofrendo ou em risco de apresentar DN. Quando o indivíduo humano está em risco de um estágio precoce da DN, o nível do biomarcador pode ser examinado uma vez a cada 6 a 12 meses para monitorar o progresso da DN. Quando o indivíduo humano já está em um estágio avançado da DN, é preferível que o nível do biomarcador seja examinado uma vez a cada 3 a 6 meses.
O método de monitoramento descrito acima é também aplicável aos animais de laboratório, seguindo-se procedimentos de rotina, para estudar a DN. O termo "um animal de laboratório" empregado no presente documento se refere a um animal vertebrado geralmente usado no teste com animais, por exemplo, camundongo, rato, coelho, gato, cachorro, porco e primata não humano. Preferivelmente, um animal de laboratório é examinado para determinar o nível do biomarcador uma vez a cada 2 a 24 semanas.
Qualquer um dos biomarcadores pode também ser usado para avaliar a eficácia de um tratamento para DN em um indivíduo que necessite (isto é, um paciente humano apresentando DN ou um animal de laboratório portando DN) . Neste método, as classificações da doença representando níveis de um dos biomarcadores descritos acima são determinadas antes, durante e após o tratamento. Se as classificações da doença permanecerem as mesmas ou declinarem com o curso do tratamento, isto indica que o tratamento é eficaz.
Também é revelado no presente documento um kit útil na prática de qualquer um dos métodos descritos acima. Este kit contém dois, três ou quatro anticorpos com diferentes especificidades de antígeno. Cada um destes anticorpos é capaz de se ligar a um dentre (i) alfa-2-HS-glicoproteína, (ii) alfa-1 antitripsina, (iii) alfa-1 glicoproteína ácida, ou (iv) osteopontina. Os anticorpos específicos para proteínas (i), (ii), (iii) e (iv) podem se ligar aos seus fragmentos MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 2) , KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6), GQEHFAHLLILRDTKTYMLADVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7), YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8), e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9), isto é, especifico para quaisquer epitopos de anticorpo contidos nestes fragmentos. Em um exemplo, este kit contém apenas anticorpos específicos para antigenos a serem detectados (por exemplo, moléculas protéicas associadas à DN) para prática de um dos métodos revelados no presente documento. A saber, o kit consiste essencialmente em tais anticorpos.
O kit descrito acima pode incluir dois anticorpos diferentes (isto é, um anticorpo de revestimento e um anticorpo de detecção) que se ligam ao mesmo antigeno. Tipicamente, o anticorpo de detecção é conjugado com uma molécula que emite um sinal detectável tanto propriamente quanto através da ligação a outro agente. O termo "anticorpo" empregado no presente documento se refere a uma imunoglobulina integral ou um fragmento da mesma, tal como Fab ou F(ab')7 que mantém atividade de ligação ao antigeno. O mesmo pode ocorrer naturalmente ou ser construído geneticamente (por exemplo, anticorpo de cadeia simples, anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado).
Os anticorpos incluídos no kit desta invenção podem ser obtidos de vendedores comerciais. Alternativamente, eles podem ser preparados por métodos convencionais. Vide, por exemplo, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. De modo a produzir anticorpos contra urn biomarcador especifico conforme listado acima, o marcador opcionalmente acoplado a uma proteina veiculo (por exemplo, KLH) pode ser misturado com um adjuvante e injetado no animal hospedeiro. Os anticorpos produzidos no animal podem então ser purificados por cromatografia por afinidade. Os animais hospedeiros geralmente empregados incluem coelhos, camundongos, porquinhos da India e ratos. Vários adjuvantes que podem ser usados para aumentar a resposta imunológica dependem das espécies hospedeiras e incluem adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais, tais como, hidróxido de aluminio, CpG, substâncias ativas em superfície, tais como, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptideos, emulsões oleosas, hemocianina do molusco keyhole limpet (lapa californiana) e dinitrofenol. Adjuvantes humanos úteis incluem BCG (bacilos Calmette- Guerin) e Corynebacterium parvum. Anticorpos policlonais, isto é, populações heterogêneas de moléculas de anticorpo estão presentes nos soros dos animais imunizados.
Anticorpos monoclonais, isto é, populações homogêneas de moléculas de anticorpos podem ser preparados usando tecnologia de hibridoma padrão (vide, por exemplo, Kohler e outros, (1975) Nature 256, 495; Kohler e outros, (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511; Kohler e outros, (1976) Eur. J. Immunol. 6, 292; e Hammerling e outros, (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.). Especificamente, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por qualquer técnica que provê a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células continuas na cultura, tal como descrito em Kohler e outros, (1975) Nature 256, 495 e Patente US número 4.376.110; a técnica do hibridoma de célula B humana (Kosbor e outros, (1983) Immunol Today 4, 72; Cole e outros, (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 2026, e a técnica de EBV-hibridoma (Cole e outros, (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) . Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e quaisquer subclasses dos mesmos. O hibridoma que produz os anticorpos monoclonais da invenção pode ser cultivado in vitroou ín vivo. A capacidade de produzir altas titulações de anticorpos monoclonais in vivo torna este um método de produção especificamente útil.
Além disto, os fragmentos do anticorpo podem ser gerados pelas técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, porém não estão limitados aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão da pepsina de uma molécula de anticorpo e fragmentos Fab que podem ser gerados por redução das pontes de dissulfeto dos fragmentos de F(ab')2.
Sem elaboração adicional, acredita-se que um versado na técnica possa, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção em sua extensão plena. As concretizações especificas que se seguem são, portanto, construídas como meramente ilustrativas e não limitam o restante da revelação de que forma for. Todas as publicações citadas no presente documento são incorporadas como referência.
Exemplo 1: Diagnóstico de DN com base em alfa-2-HS- glicoproteina na urina, alfa-1 antitripsina na urina, alfa- 1 glicoproteína ácida na urina ou osteopontina no soro Materiais e Métodos (i) Indivíduos
Oitenta e três pacientes apresentando diabetes melito (denominados "indivíduos DM") e 82 pacientes apresentando DN (denominados "indivíduos DN") foram recrutados no Tri- General Military Hospital em Taipei, Taiwan, seguindo o padrão estabelecido pela American Diabetic Association e também descritos abaixo: DM: sofrendo de diabetes melito porém não apresentando DN (vide o padrão descrito abaixo); DN: sofrendo de diabetes melito e secretando a proteína urinária em um nível superior a 1 g por dia, apresentando DN como prova de biópsia ou apresentando uremia.
Todos os indivíduos foram cedidos a um grupo de treinamento e um grupo de teste em uma razão de 57:3. (ii) Coleta de Amostra e Processamento
Amostras da primeira urina da manhã e amostras séricas foram coletadas de cada um dos indivíduos mencionados acima. Os peptídeos contidos nas amostras de urina foram examinados por espectrometria urinária de massa com analisador de tempo vôo e ionização por dessorção de matriz assistida a laser (MALDI-TOF-MS) e por marcadores isobáricos para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ).
Moléculas protéicas incluindo alfa-2-HS-glicoproteína (DN2), alfa-l-antitripsina (DN5), osteopontina (DNO) e alfa-1 glicoproteína ácida (GR3), foram examinadas para determinar suas concentrações em ambas as amostras de urina e séricas por ELISA. Em resumo, as amostras de urina foram misturadas com inibidores de protease e diluidas em 1:100 com um tampão de diluição e as amostras séricas foram diluidas a 1:10. As amostras diluidas foram colocadas em placas ELISA em triplicatas. Os niveis de concentração de DNO, DN2, DN5 e GR3 foram medidos através do método ELISA direto padrão.
Uma curva padrão de parâmetro 5 foi empregada para cálculo da concentração. Apenas padrão e amostras com %CV de menos de 15 foram incluídos, aqueles não satisfazendo os critérios foram repetidos. Os niveis de proteina nas amostras de urina foram normalizados contra os niveis de creatinina nas mesmas amostras de urina, que foram medidos com o Quantichrom Creatinine Assay (BioAssay Systems, (Hayward) Califórnia, USA). (iii) Análise Estatística
Os dados indicando as concentrações de proteina sérica e na urina de cada proteina examinada foram analisados estatisticamente e preparados conforme representado por AUROC a partir de 0,44-0,87 em sua capacidade independente de distinguir indivíduos DN e indivíduos DM.
Para cada indivíduo, a correlação entre os valores foi determinada por análise Spearman ou Pearson dependendo dos resultados do teste para normalidade. A média por grupo ou comparações médias foram realizadas com Teste t de Student ou Teste Mann-Whitney não paramétrico conforme apropriado. O significado estatístico foi obtido quando p < 0,05. As estatísticas foram apresentadas tanto como média ± erro padrão da média (SEM) ou como média com [25%, 75%]. Resultados (i) Características do Paciente
As Tabelas 1 e 2 a seguir mostram as características dos pacientes no grupo de treinamento e grupo de teste e aquelas nos grupos DM e DN:
Tabela 1: Características dos pacientes nos grupos de Treinamento e teste
Tabela 2: Características dos pacientes nos grupos DM e DN
Diferenças estatisticamente significativas nos niveis de GFR, ACR, proteina e creatinina do soro foram observados nos individuos DN versus os individuos DM. Não houve diferença na distribuição de sexo entre os grupos. (ii) Moléculas protéicas associadas a DN
Através da análise proteômica da urina, foi verificado que os peptideos listados na Tabela 3 a seguir são apresentados de forma diferente nas amostras e urina dos individuos DM e individuos DN.
Tabela 3. Peptideos na urina/soro apresentados de forma diferente e proteínas nas quais os mesmos estão localizados
Através da análise ELISA, foi verificado que três moléculas protéicas da urina, isto é, uDN2, uGR3 e uDN5 e uma molécula protéica do soro, isto é, sDNO estavam associadas à DN. Vide figura 1, painéis A-D e Tabela 2 acima. Mais especificamente foi verificado que os niveis de uDN2, uDN5, uGR3 e sDNO estavam elevados nos indivíduos DN em comparação a DMs (sem DN) , indicando que elas eram marcadores confiáveis para DN. Adicionalmente, os niveis de uDN5 e uGR3 nos indivíduos que exibiram macroalbumiuria (ACR > 300 mg/g) foram maiores que nos indivíduos DN exibindo microalbuminúria (ACR 30 mg/g a 300 mg/g) . A macroalbuminúria é um indicador de DN em estágio avançado e a microalbuminúria indica estágio DN precoce.
Modelo de duas proteínas
Os niveis combinados de dois dentre uDN2, uDN5, uGR3, uDNO e sDNO nos indivíduos DM e indivíduos DN foram submetidos à análise discriminante funcional, análise de regressão logística e análise de regressão de Ridge. Os resultados deste estudo indicam que qualquer combinação de duas das cinco proteínas ou seus fragmentos pode ser usada como marcados confiáveis para determinar estágios DN.
Abaixo é mostrado um modelo de duas proteínas exemplar, isto é, uDN5 e uGR3 incluindo equações para o cálculo das classificações da doença com base nos niveis combinados destas duas moléculas protéicas. Também são mostradas a seguir tabelas (isto é, Tabelas 4-9) listando valores de corte, sensibilidades, especificidades, valores predicativos positivos (PPV) e valores predicativos negativos (NPV) e a área sob a curva ROC (AUROC) para este modelo de duas proteínas.
Classificação da Doença = 0,3303 x log2[uDN5](ng/mg) + 0,2732 x log2[uGR3](ng/mg) + 5
Tabela 4: Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 5: Valores de corte representando estágios 1-5 na DN
Classificação da doença = exp (valor_ logaritmo)/(1 + exp (valor logaritmo), onde valor_Logaritmo = -12,5332 + 0,7197 x log? [uDN5] (ng/mg) + 0, 4941 x log? [uGR3] (ng/mg)
Tabela 6. Valores de corte representando estágios precoces e avançados da DN indicados pelos níveis de albumina na urina
Tabela7.ValoresdecorterepresentandoosestágiosDN1-5
Classificação da doença = -1,7697 + 0,1520 x log2 [uDN5] (ng/mg) +0,2254 x log2[uGR3] (ng/mg)
Tabela 8. Valores de corte representando estágios precoces e avançados de DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 9. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Modelo de três proteínas
Os niveis combinados de três dentre uDN2, uDN5, uGR3, uDNO e sDNO e nos individuos DM e individuos DN foram submetidos à análise discriminante funcional, análise de regressão logística e análise fatorial além da análise de regressão de Ridge. Os resultados indicam que qualquer combinação de três proteínas pode ser usada como marcador confiável para estadiamento da DN.
Abaixo é mostrado um modelo de três proteínas exemplares, isto é, uDN2, uDN5 e uGR3 incluindo equações para cálculo das classificações da doença com base nos níveis combinados destas moléculas de três proteínas. Também são mostradas a seguir tabelas listando valores de corte (isto é, Tabelas 10-17), sensibilidades, especificidades, PPV, NPV e AUROC para este modelo de três proteínas.
Classificação da doença = 0,3340 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,0142 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2784 x logiíuGRS](ng/mg) + 5
Tabela 10. Valores de corte representando estágios avançado e precoce de DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 11. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = 0,9190 x log2[uDNS](ng/mg) + 0,6997 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,9003 x log2 [uGR3](ng/mg)
Tabela 12. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados por niveis de albumina da urina
Tabela 13. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação de doença = exp (valor_logaritmo)/(1 + exp. (valor_logaritmo)) onde Valor_logaritmo = -11,2820 + 0,8810 x log2[uDN5] (ng/mg) - 0, 3478 x log2 [uDN2] (ng/mg) + 0,5576 x log2[uGR3](ng/mg)
Tabela 14. Valores de corte representativos dos 5 estágios precoce e avançado indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 15. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = -1,2900 + 0,1800 x log2[uDN5](ng/mg) -0,1013 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2505 x log2[uGR3](ng/mg)
Tabela 16: Valores de corte representando estágios 5 precoce e avançado de DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 17. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Modelo de quatro proteínas
Os niveis combinados de quatro dentre uDN2, uDN5, uGR3, uDNO e sDNO em indivíduos DM e indivíduos DN foram submetidos à análise discriminante funcional, análise de regressão logística, análise fatorial e análise de regressão de Ridge. Os resultados indicam que qualquer combinação de quatro das cinco proteínas ou seus fragmentos pode ser usada como um marcador confiável para determinar estágios da DN.
A seguir é mostrado um modelo de quatro proteínas exemplar, isto é, uDN2, uDN5, uGR3, e sDNO, incluindo equações para cálculo das classificações da doença com base nos niveis combinados destas quatro moléculas de proteína. Também são mostradas a seguir tabelas (isto é, tabelas 18- 25) listando os valores de corte, sensibilidades, especificidades, PPVs e AUROC para este modelo de quatro proteínas.
Classificação da doença = 0,2972 x log2[uDN5](ng/mg) + 0,0159 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2014 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,5688 xlog2[sDNO](ng/mL) + 5
Tabela 18. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos níveis de albumina na urina
Tabela 19. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = 0,9132 x log2f uDN5](ng/mg) 5 + 0, 6950 x log2[uDN2] (ng/mg) + 0, 9080 x log2[uGR3] (ng/mg) + 0,4549 x log2[sDNO](ng/mL).
Tabela 20. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 21 - Valores de corte representando estágios 1- da DN
Classificação da doença = exp (Valor_logaritmo)/(1 + exp (Valor_logaritmo)), onde Valor_logaritmo = -13,7529 + 0,9460 x log2]uDN5] (ng/mg) -0,3110 x log2[uDN2] (ng/mg) + 0,4957 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,4787 xlog2[sDNO](ng/mL)
Tabela 22. Valores de corte representando estágios 10 precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 23. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = -1,7588 + 0,1729 x log2[uDN5](ng/mg) -0,0971 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2381 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,1312 x log2[sDNO](ng/mL)
Tabela 24. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 25. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Modelo de cinco proteínas
Os niveis combinados de uDN2, uDN5, uGR3, uDNO e sDNO nos individuos DM e individuos DN foram submetidos a análise discriminante funcional, análise de regressão 5 logística, análise fatorial e análise de regressão de Ridge. Os resultados indicam que a combinação destas cinco proteínas ou seus fragmentos pode ser usada como um marcador confiável para determinação dos estágios de DN.
As equações mostradas a seguir calculam a classificação das doenças com base nos niveis combinados destas moléculas de cinco proteínas, bem como as tabelas 5 (isto é, Tabelas 26-33) listando os valores de corte, sensibilidades, especificidades, NPVs, PPVs e AUROC para este modelo de cinco proteínas.
Classificação da doença = 0,2780 x logctuDNõ](ng/mg) + 10 0, 0231 x log2[uDN2] (ng/mg) + 0,2236 x log2[uGR3] (ng/mg) + 0,6043 x log2[sDNO](ng/mL) - 0,1513 x log2 [uDNO](ng/mg)+ 5
Tabela 26. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 27. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença: = 0,9117 x log2[uDN5](ng/mg) + 0,6949 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,9095 x log2[uGR3] (ng/mg) + 0,4554 x log2[sDNO] (ng/mL) + 0, 0384 x log2 [uDNO] (ng/mg)
Tabela 28. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 29. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = exp (Valor_logaritmo)/(1 + exp (Valor logaritmo )), onde Valor__logaritmo = -11,4318 + 0,8188 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,5376 x log2[uDN2](ng/mg) + 5 0,7561 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,3940 x log2[sDNO](ng/mL) - 0,1741 x log2[uDNO](ng/mg)
Tabela 30. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos níveis de albumina na urina
Tabela 31. Valores de corte representando estágios da DN 1-5
Classificação da doença = -1,3112 + 0,1648 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,0968 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2468 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,1426 x log2[sDNO](ng/mL) - 0,0552 x log2[uDNO](ng/mg)
Tabela 32. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 33. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Exemplo 3: Estadiamento da DN com base em uma combinação de uDN2, uDN5, uGR3 e idade
São mostradas a seguir as equações para cálculo das classificações das doenças determinadas pela análise discriminante funcional, análise fatorial, análise de regressão logística e análise de regressão de Ridge, com base no nivel de um biomarcador composto de três moléculas 10 protéicas, isto é, uDN2, uDN5, e uGR3, e um fator clinico, isto é, a idade. Também são mostradas a seguir tabelas (isto é, Tabelas 34-41) listando os valores de corte, sensibilidades, especificidades, PPVs, NPVs e AUROC para este modelo.
Classificação da doença = 0,3342 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,0201 x log2[uDN2](ng/mg) + 0,2826 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,0059 x Idade(anos) + 5
Tabela 34. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina 5 na urina
Tabela 35. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = 0,9184 x log2[uDN5](ng/mg) +0, 7006 x log2[uDN2] (ng/mg) + 0, 9005 x logstuGRS] (ng/mg) + 0,1863 x Idade(anos)
Tabela 36. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina na urina
Tabela 37. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = exp (Valor_logaritmo)/(1 + exp (Valor_logaritmo)), onde
Valor logaritmo= -15,9748 + 0,8688 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,4966 x logi[uDN2](ng/mg) + 0,6436 x logtKuGRS](ng/mg) + 0,0879 x Idade(anos)
Tabela 38. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina 5 na urina
Tabela 39. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
Classificação da doença = -2,1690 + 0,1771 x log2[uDN5](ng/mg) - 0,1074 x logi[uDN2](ng/mg) + 0,2474 x log2[uGR3](ng/mg) + 0,0168 x Idade(anos)
Tabela 40. Valores de corte representando estágios precoce e avançado da DN indicados pelos niveis de albumina 5 na urina
Tabela 41. Valores de corte representando estágios 1-5 da DN
OUTRAS CONCRETIZAÇÕES
Todos os aspectos revelados neste relatório descritivo podem ser combinados de qualquer forma. Cada aspecto revelado neste relatório descritivo pode ser substituído por um aspecto ilustrativo servindo ao mesmo fim, 5 equivalente ou semelhante. Assim, a menos que expressamente definido de outra forma, cada aspecto revelado é apenas um exemplo de uma série genérica de aspectos equivalentes ou semelhantes.
A partir da descrição acima, um versado na técnica 10 pode determinar facilmente as características essenciais da presente invenção e sem fugir do espirito e escopo da mesma, pode realizar várias alterações e modificações na invenção para adaptar aos vários usos e condições. Assim, outras concretizações também se encontram dentro das 15 reivindicações.
Claims (26)
1. Método para diagnosticar nefropatia diabética em um indivíduo, caracterizadopelo fato de que compreende: determinação de um nivel de um biomarcador em uma amostra de urina de um indivíduo suspeito de apresentar nefropatia diabética, em que o biomarcador é um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina selecionado do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 2) , ou um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e avaliação se o indivíduo apresenta nefropatia diabética com base no nivel do biomarcador; onde um aumento no nivel do biomarcador, quando comparado aquele em um indivíduo que não apresenta nefropatia diabética, indica que o indivíduo apresenta nefropatia diabética.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de um segundo biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa- 2-HS-glicoproteina selecionado a partir do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), e o segundo biomarcador é um fragmento da alfa-1 antitripsina selecionado a partir do grupo que consiste em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), e EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); ou em que o biomarcador é um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e o segundo biomarcador é alfa-2-HS-glicoproteina ou um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2) .
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de um terceiro biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o terceiro biomarcador é alfa-1 glicoproteina ácida ou o fragmento de alfa-1 glicoproteina ácida que é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de osteopontina ou um fragmento de osteopontina em uma amostra de sérica do indivíduo, em que o fragmento da osteopontina compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que compreende, adicionalmente, após a etapa de avaliação, correlação do nivel do biomarcador com o estado da nefropatia diabética, onde um aumento no nivel do biomarcador, com relação aquele de um indivíduo que não apresenta nefropatia diabética, indica que o indivíduo está no estágio avançado de nefropatia diabética.
6. Método para avaliar a eficácia de um tratamento para nefropatia diabética em um individuo, caracterizado pelo fato de que compreende: determinação de um nivel pré-tratamento de um biomarcador em uma amostra de urina de um individuo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina selecionado do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 2) , ou um fragmento de alfa-l-antitripsina consistindo em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3); determinação de um nivel pós-tratamento do biomarcador em uma amostra de urina de um individuo; e avaliação da eficácia do tratamento com base em uma alteração no nivel do biomarcador após o tratamento, onde o nivel de pós-tratamento do biomarcador sendo o mesmo ou inferior ao nivel de pré-tratamento do biomarcador indica eficácia do tratamento.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de um segundo biomarcador na amostra de urina do individuo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa- 2-HS-glicoproteina selecionado a partir do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), e o segundo biomarcador é um fragmento da alfa-1 antitripsina selecionado a partir do grupo que consiste em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), e EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); ou em que o biomarcador é um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e o segundo biomarcador é alfa-2-HS-glicoproteína ou um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteína compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2).
8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de um terceiro biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o terceiro biomarcador é alfa-1 glicoproteína ácida ou o fragmento de alfa-1 glicoproteína ácida que é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de osteopontina ou um fragmento de osteopontina em uma amostra sérica do indivíduo, em que o fragmento da osteopontina compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é um paciente humano.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é um animal de laboratório.
12. Método para determinação do estágio da nefropatia diabética em um indivíduo, caracterizadopelo fato de que compreende: determinação de um nivel de um biomarcador em uma amostra de urina de um indivíduo suspeito de apresentar nefropatia diabética e, opcionalmente, um ou mais fatores clínicos, em que o biomarcador é um fragmento de alfa-2-HS- glicoproteína selecionado do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), ou um fragmento de alfa-l-antitripsina consistindo em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e os fatores clínicos são selecionados do grupo consistindo em idade, sexo, HbAlc, razão de albumina/creatinina, e razão de filtração glomerular; cálculo da classificação da doença com base no nível do biomarcador; e avaliação do estágio de nefropatia diabética do indivíduo com base na classificação da doença em comparação aos valores de corte predeterminados indicando estágios diferentes da nefropatia diabética.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nível de um segundo biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa- 2-HS-glicoproteína selecionado a partir do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), e o segundo biomarcador é um fragmento da alfa-1 antitripsina selecionado a partir do grupo que consiste em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), e EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); ou em que o biomarcador é um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e o segundo biomarcador é alfa-2-HS-glicoproteína ou um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteína compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2) .
14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de um terceiro biomarcador na amostra de urina do individuo, em que o terceiro biomarcador é alfa-1 glicoproteina ácida ou o fragmento de alfa-1 glicoproteina ácida que é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7).
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de osteopontina ou um fragmento de osteopontina em uma amostra sérica do individuo, em que o fragmento da osteopontina compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizadopelo fato de que a classificação da doença é calculada por uma análise selecionada do grupo consistindo em análise de regressão de Ridge, análise fatorial, análise discriminante funcional e análise de regressão logística.
17. Método para monitoramento do progresso da nefropatia diabética em um individuo, caracterizadopelo fato de que compreende: obtenção de uma primeira amostra de urina de um individuo suspeito de apresentar nefropatia diabética; obtenção de uma segunda amostra de urina de um indivíduo 2 semanas a 12 meses mais tarde; determinação na primeira e segunda amostras de um nível de um biomarcador, em que o biomarcador é um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteína selecionado do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), ou um fragmento de alfa- 1-antitripsina consistindo em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e os fatores clínicos são selecionados do grupo consistindo em idade, sexo, HbAlc, razão de albumina/creatinina, e razão de filtração glomerular; cálculo de uma primeira classificação da doença e uma segunda classificação da doença com base nos níveis do biomarcador, e opcionalmente, um ou mais fatores clínicos, na primeira e segunda amostras, respectivamente; e avaliação do progresso da doença no indivíduo, onde a segunda classificação da doença sendo maior que a primeira classificação da doença é indicativa da exacerbação da nefropatia diabética.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nível de um segundo biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa- 2-HS-glicoproteína selecionado a partir do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2) , e o segundo biomarcador é um fragmento da alfa-1 antitripsina selecionado a partir do grupo que consiste em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), e EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); ou em que o biomarcador é um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e o segundo biomarcador é alfa-2-HS-glicoproteina ou urn fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) , ou MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2).
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de um terceiro biomarcador na amostra de urina do individuo, em que o terceiro biomarcador é alfa-1 glicoproteina ácida ou o fragmento de alfa-1 glicoproteina ácida que é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7).
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de osteopontina ou um fragmento de osteopontina em uma amostra sérica do individuo, em que o fragmento da osteopontina compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizadopelo fato de que a classificação da doença é calculada por uma análise selecionada do grupo consistindo em análise de regressão de Ridge, análise fatorial, análise discriminante funcional e análise de regressão logística.
22. Método para avaliar a eficácia de um tratamento para nefropatia diabética em um indivíduo, caracterizadopelo fato de que compreende: obtenção de uma primeira amostra de urina do indivíduo antes do tratamento, obtenção de uma segunda amostra de urina do indivíduo após o tratamento, determinação nos niveis das amostras de um biomarcador, em que o biomarcador em que o biomarcador é um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina selecionado do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), ou um fragmento de alfa- 1-antitripsina consistindo em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e os fatores clínicos são selecionados do grupo consistindo em idade, sexo, HbAlc, razão de albumina/creatinina, e razão de filtração glomerular; cálculo de uma primeira classificação da doença e uma segunda classificação da doença com base nos niveis dos biomarcadores e, opcionalmente, em um ou mais fatores clinicos, na primeira e segunda amostras, respectivamente; e avaliação da eficácia do tratamento no indivíduo, onde a segunda classificação da doença sendo igual ou inferior à primeira classificação da doença indica eficácia do tratamento.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação de um nivel de um segundo biomarcador na amostra de urina do indivíduo, em que o biomarcador é um fragmento de alfa- 2-HS-glicoproteína selecionado a partir do grupo consistindo em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2), e o segundo biomarcador é um fragmento da alfa-1 antitripsina selecionado a partir do grupo que consiste em: KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), MIEQNTKSPLFMGKWNPTQK (SEQ ID NO:4), EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE (SEQ ID NO:5), e EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA (SEQ ID NO:6); ou em que o biomarcador é um fragmento de alfa-1 antitripsina consistindo em KGKWERPFEVKDTEEEDF (SEQ ID NO:3), e o segundo biomarcador é alfa-2-HS-glicoproteina ou um fragmento de alfa-2-HS-glicoproteina compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: WSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO: 1) e MGWSLGSPSGEVSHPRKT (SEQ ID NO:2) .
24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de um terceiro biomarcador na amostra de urina do individuo, em que o terceiro biomarcador é alfa-1 glicoproteina ácida ou o fragmento de alfa-1 glicoproteina ácida que é GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS (SEQ ID NO:7).
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizadopelo fato de compreender ainda a determinação do nivel de osteopontina ou um fragmento de osteopontina em uma amostra sérica do individuo, em que o fragmento da osteopontina compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em: YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK (SEQ ID NO:8) e KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK (SEQ ID NO:9).
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizadopelo fato de que a classificação da doença é calculada por uma análise selecionada do grupo consistindo em análise de regressão de Ridge, análise fatorial, análise discriminante funcional e 5 análise de regressão logística.
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