JP5689426B2 - 糖尿病性ネフロパシーに関連する尿および血清のバイオマーカー - Google Patents
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Description
本発明は、糖尿病性ネフロパシーに関連する尿および血清のバイオマーカーに関するものである。本願は、２００９年１月２８日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／１４７，７７８の優先権を主張するものであり、これらの内容は、本明細書中に参考として取り込まれる。
糖尿病性ネフロパシー（ＤＮ）は、長期の糖尿病に伴う進行性の肝臓疾病である。それは、異常な流体ろ過を生じ、尿中アルブミンの排泄を増加させ、最終的には、腎臓障害を引き起こす。
ＤＮは、その早期の経過では無症状である。よって、この疾病を初期に検出することは困難である。事実、現在のＤＮの診断は、微量アルブミン尿の進行に基づくが、そのときはすでに腎臓傷害が発生している。早期の診断検査がないことは、早期ＤＮの効果的な治療を阻止している。
よって、早期ＤＮを診断するのに有用な信頼性のあるバイオマーカーを同定することが非常に重要である。
本発明は、上記の問題を解決するため、糖尿病性ネフロパシーに関連する尿および血清のバイオマーカーを提供することを目的とする。
本発明は、数個の尿と血清タンパク質とそれらのフラグメントは、単独でも、組み合わせても、ＤＮを患わない被検者と比較して、ＤＮ患者中で異なって存在するとの予期せぬ発見に基づくものである。よって、これらのタンパク質分子は、早期ＤＮを診断する有効なマーカーである。
よって、本発明の一態様は、被検者中のＤＮを診断する方法である。本方法は、（ｉ）ＤＮを有することが疑われる被検者中のバイオマーカーのレベルを決定するステップと、（ｉｉ）バイオマーカーのレベルに基づいて、被検者がＤＮを有するかどうか評価するステップと、の少なくとも二つのステップを含む。ＤＮを患わない被検者と比較して、バイオマーカーのレベルの増加は、被検者がＤＮを有することを示す。
この診断法で用いられるバイオマーカーは、以下でリストされる４個のタンパク質分子の一つである：
（ｉ）第一の尿タンパク質分子は、α−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、成熟したα−２−ＨＳ−糖タンパク質、VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）、またはMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）である；
（ｉｉ）第二の尿タンパク質分子は、α−１抗トリプシン、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）;MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４），EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、またはEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）である。
（ｉｉｉ）第三の尿タンパク質分子は、少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するα−１酸性糖タンパク質のフラグメント、例えば、 GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である。
（ｉｖ）血清タンパク質分子は、オステオポンチン、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）、またはKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）である。
（ｉ）第一の尿タンパク質分子は、α−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、成熟したα−２−ＨＳ−糖タンパク質、VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）、またはMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）である；
（ｉｉ）第二の尿タンパク質分子は、α−１抗トリプシン、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）;MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４），EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、またはEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）である。
（ｉｉｉ）第三の尿タンパク質分子は、少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するα−１酸性糖タンパク質のフラグメント、例えば、 GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である。
（ｉｖ）血清タンパク質分子は、オステオポンチン、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメント、例えば、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）、またはKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）である。
上述の診断法は更に、評価ステップの後、バイオマーカーレベルとＤＮの状態（即ち、早期か末期か）を関連付けるステップを含む。バイオマーカーがタンパク質分子（ｉ）、または（ｉｖ）のとき、ＤＮを患わない被検者に比較して、そのレベルの増加は、末期のＤＮを示す。タンパク質分子（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のバイオマーカーについては、早期と末期ＤＮを示す所定の参照バイオマーカーレベルと比較し、そのレベルはＤＮの状態を示す。
別の態様において、本発明の特徴は、被検者（例えば、ヒト患者、または実験動物）のＤＮ治療の有効性を評価する方法にある。本方法は、被検者の治療前と治療後の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）のタンパク質分子のレベルを決定し、治療後のバイオマーカーのレベルの変化に基づいて、治療の効果を評価するステップを含む。治療前のバイオマーカーのレベルと比較して、バイオマーカーの治療後のレベルが同じか、または低下する場合、その治療が効果的であることを示す。
更に別の態様において、本発明の特徴は、ＤＮのステージを決定する方法にあり、少なくとも四つのステップ、（ｉ）糖尿病性ネフロパシーを患ったと疑われる被検者から、尿サンプル、および選択的に血清サンプルを得るステップと、（ｉｉ）前の段落でリストされるバイオマーカーの一つのレベルを決定するステップと、（ｉｉｉ）バイオマーカーのレベルに基づいて、疾患スコアを計算するステップと、（ｉｖ）疾患スコアに基づいて、種々の糖尿病性ネフロパシーのステージを示す所定のカットオフ値と比較して、被検者の糖尿病性ネフロパシーのステージを評価するステップと、を含む。この方法において、上記の計算ステップは、リッジ回帰分析、因子分析、判別関数分析、およびロジスティック回帰分析により実行される。
上述のＤＮ病期診断方法に用いられるバイオマーカーは、以下の五種のタンパク質分子の少なくとも二つからなる：前述の（ｉ）−（ｉｖ）タンパク質分子、および尿中オステオポンチン、またはそのフラグメントであるタンパク質分子（ｖ）である。一つの例において、バイオマーカーは、五種のタンパク質分子の全てからなる。別の例において、（ｉ）−（ｉｉｉ）と（ｖ）タンパク質分子の少なくとも二つからなる。
或いは、バイオマーカーは、上述の５種のタンパク質分子の少なくとも二種と、一つ、またはそれ以上の臨床学的因子、例えば、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）、糸球体ろ過量（ＧＦＲ）からなる。
更に別の態様において、本発明は、上述した任意のバイオマーカーのレベルに基づいてＤＮの進行をモニタリングする方法を提供する。本方法は、２週間から１２ヶ月の期間（例えば２−２４週、または３−１２ヶ月）、ＤＮを有することが疑われる被検者から、二つの尿サンプル、および選択的に二つの血清サンプルを得るステップと、バイオマーカーの一つのレベルを決定するステップと、バイオマーカーレベルに基づいて、疾患スコアを計算するステップと、疾患スコアに基づいて、被検者のＤＮの進行を評価するステップと、からなる。後に得られたサンプルの疾患スコアが、先に得られたサンプルより高いとき、ＤＮの悪化を示す。
上述のバイオマーカーもまた、ＤＮ治療の効果の評価に用いることができる。バイオマーカーの一つの治療後のレベルが、同じバイオマーカーの治療前のレベルと比較して変化しないか、または低下する場合、この治療は効果的である。
本発明は更に、上述の方法で使用される任意のキットを提供する。このキットは、種々の抗原特異性を有する２、３、または４種類の抗体を含む。これらの各抗体は、（ｉ）α−２−ＨＳ−糖タンパク質、（ｉｉ）α−１抗トリプシン、（ｉｉｉ）α−１酸性糖タンパク質、および（ｉｖ）オステオポンチンの一つと結合することができる。一つの例において、このキットは、ここに記載した方法の一つを実施するための、検出用抗原（例えば、ＤＮに関連するバイオマーカー）に特異的な抗体のみを含む。すなわち、キットは、基本的に、このような抗体からなる。
本発明の範囲にはまた、以下のペプチドの一つに特異的に結合する分離した抗体を含む：
MGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）、
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、
MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）、
GQEHFAHLLILRDTKTYMLADVNDEKNWGLS（配列番号７）、
YPDAVATWLNPDPSQKQ NLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）、および
KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）。
MGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）、
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、
MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）、
GQEHFAHLLILRDTKTYMLADVNDEKNWGLS（配列番号７）、
YPDAVATWLNPDPSQKQ NLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）、および
KYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）。
ここに用いられる「分離した抗体」の用語は、実質的に、天然に存在する分子を含まない抗体を意味する。より具体的には、その抗体を含む調製物であって、当該調製物中の天然に存在する分子が最大で、乾燥重量の２０％を占めるとき、「分離した抗体」とみなされる。純度は、適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＨＰＬＣで測定することができる。
上述のいかなる抗体も、本発明の方法を実行するのに有用なキットの作製に用いることができる。
以下、本発明の一またはそれ以上の実施形態の詳細を詳述する。本発明の他の特徴または利点は、以下の図および幾つかの実施形態の詳細な説明、更にはまた、添付の特許請求の範囲から明らかである。
本発明により、糖尿病性ネフロパシーに関連する尿および血清のバイオマーカーを提供することができた。
ＤＮは、糖尿病に関連する腎臓疾患である。それは、５個の進行段階を有する：
ステージ１：特徴は、正常なＧＦＲと正常なアルブミン尿（ＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇ）の糖尿病；
ステージ２：特徴は、糸球体過剰ろ過（１２０ｍＬ／分／１．７３ｍ2より大きい）、および正常なＧＦＲと正常なアルブミン尿（ＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇ）を伴う腎腫大；
ステージ３：特徴は、微量アルブミン尿；
ステージ４：特徴は、顕在的アルブミン尿、およびＧＦＲの進行性低下；および
ステージ５：特徴は、１５ｍＬ／分／１．７３ｍ2より低いＧＦＲ。
一般に、ステージ１−３は早期とみなされ、ステージ４と５は末期とみなされる。
ステージ１：特徴は、正常なＧＦＲと正常なアルブミン尿（ＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇ）の糖尿病；
ステージ２：特徴は、糸球体過剰ろ過（１２０ｍＬ／分／１．７３ｍ2より大きい）、および正常なＧＦＲと正常なアルブミン尿（ＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇ）を伴う腎腫大；
ステージ３：特徴は、微量アルブミン尿；
ステージ４：特徴は、顕在的アルブミン尿、およびＧＦＲの進行性低下；および
ステージ５：特徴は、１５ｍＬ／分／１．７３ｍ2より低いＧＦＲ。
一般に、ステージ１−３は早期とみなされ、ステージ４と５は末期とみなされる。
本発明らは、ＤＮ、特に、様々なステージのＤＮと関連する複数のバイオマーカーを同定した。これらのバイオマーカーは、尿中、または血清中のいずれにおいても、以下の四種のタンパク質、およびそれらのフラグメントの一つ、またはそれ以上からなる：（ａ）α−２−ＨＳ−糖タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿００１６１３；１０−Ｊａｎ−２０１０）；（ｂ）α−１−抗トリプシン（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＢ５９４９５；１０−Ｊａｎ−２０１０）；（ｃ）α−１酸性糖タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＥＡＷ８７４１６；１０−Ｊａｎ−２０１０）；および（ｄ）分泌型リンタンパク質１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５１４７；１７−Ｊａｎ−２０１０）、および分泌型リンタンパク質１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０００５７３；１０−Ｊａｎ−２０１０，）として知られている二個のアイソフォームを含むオステオポンチンである。
これらの４種のタンパク質のフラグメントは、最小長さで１０個のアミノ酸を有し、好ましくは、最大長さで１９０〜４１０個のアミノ酸である。例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のフラグメントは、それぞれ、３５７、４０８、１９１、および２９０個のアミノ酸残基を含む。
本発明者らはまた、上述のタンパク質／フラグメントの一つ、またはそれ以上からなるバイオマーカー、並びに一つまたはそれ以上の臨床学的因子（例えば、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、ＡＣＲ、およびＧＦＲ）は異なるステージのＤＮに関係することを見出した。
よって、本発明の一態様は、上述した任意のバイオマーカーを用いるＤＮの診断法に関連する。本方法を実施するため、ＤＮを有することが疑われる被検者から、尿サンプルを採集し、必要時、血清サンプルを採集し、常法、例えば、質量分析と免疫分析により、上述の４種のタンパク質またはそれらのフラグメントの一つまたはそれ以上の、尿と血清レベルが決定される。必要であれば、常法により臨床学的因子も決定される。
バイオマーカーが一つのタンパク質分子を含むとき、被検者のそのレベルを基準点と比較し、被検者がＤＮを有するか決定する。ＤＮを患わない被検者中の同じバイオマーカーのレベルを示す基準点は、ＤＮ患者とＤＮを患わない被検者の群のバイオマーカーの代表レベルに基づいて決定される。例えば、それはこれらの二群の平均レベルの中間点であり得る。基準点より高いバイオマーカーレベルは、ＤＮを示す。
バイオマーカーが、少なくとも二つのタンパク質分子、および選択的に少なくとも一つの臨床学的因子を含むとき、タンパク質分子のレベルと臨床学的因子の値は、適切な分析により、バイオマーカーのレベルを特徴とする疾患スコア（例えば、数字で表示される）を生成することができる。この分析の例は、これらに限定されないが、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、リッジ回帰分析、主成分分析、因子分析、および一般化線形モデルを含む。次に、疾患スコアを、ＤＮを患わない被検者中の同じバイオマーカーのレベルを示す基準点と比較する。この基準点は、公知の方法により決定され得る。例えば、それは、タンパク質分子の平均レベルを分析することにより得られるスコアで、必要時、同じ分析により、ＤＮを患わない被検者中の臨床学的因子の平均値により得られる。基準点より高い疾患スコアは、ＤＮの存在を示す。
本発明の別の態様は、上述した任意のバイオマーカーに基づいたＤＮステージの決定方法に関する。本方法を実施するため、好ましくは、疾患スコアにより表示されるＤＮ患者のバイオマーカーレベルを、異なるＤＮステージを区分する一組の所定のカットオフ値と比較し、被検者のＤＮのステージを決定する。このカットオフ値は、同じ分析により、異なるステージのＤＮ患者の同じバイオマーカーの代表レベルを分析することにより判断される。
以下の記述は、異なるステージのＤＮに関連するバイオマーカーに基づいて、上述のカットオフ値を決定する工程の例である。
（１）それらの疾病状況（例えば、ＤＮのステージおよび危険因子）に従って、ＤＮ患者を異なる群に分ける；
（２）各患者群中、バイオマーカーを構成するタンパク質分子と臨床学的因子のレベル／値を決定する。
（３）タンパク質レベルと臨床学的因子の値に適切な分析を行い、疾患スコアを計算するモデル（例えば、公式）を構築する。
（４）各患者群を示す疾患スコア（例えば、平均値）とその他の関連要因、例えば、感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）と陰性予測率（ＮＰＶ）に基づいて、各疾病のステージのカットオフ値を決定する。
（２）各患者群中、バイオマーカーを構成するタンパク質分子と臨床学的因子のレベル／値を決定する。
（３）タンパク質レベルと臨床学的因子の値に適切な分析を行い、疾患スコアを計算するモデル（例えば、公式）を構築する。
（４）各患者群を示す疾患スコア（例えば、平均値）とその他の関連要因、例えば、感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）と陰性予測率（ＮＰＶ）に基づいて、各疾病のステージのカットオフ値を決定する。
このようにして得られる任意のモデルは、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によりＲＯＣ曲線を生成し、その診断値を評価することができる。任意の多変数モデルは、ＲＯＣ分析で、大きい濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を提供する。このモデルとして、以下の例１−３を参照する。
更に別の態様において、本発明は、上述した任意のバイオマーカーに基づいて被検者のネフロパシーの進行をモニタリングする方法に関する。より具体的には、被検者からの二つの尿サンプル、および／または血清サンプルを、適切な期間（例えば、２週〜１２ヶ月）で得て検査し、バイオマーカーの一つのレベルを決定することができる。次に、上述のように、疾患スコアを決定する。後で得られたサンプル中、バイオマーカーのレベルを示す疾患スコアが、先に得られたサンプルより高い場合、それは被検者のＤＮの悪化を示す。
モニタリング方法は、ＤＮを患うヒト被検者、またはＤＮのリスク者に応用することができる。被検者がＤＮのリスク者、または早期ＤＮにあるとき、バイオマーカーのレベルは６〜１２ヶ月ごとに一回検査し、ＤＮの進行をモニタリングする。被検者がすでに末期ＤＮのとき、好ましくは３〜６ヶ月ごとに一回、バイオマーカーのレベルを検査する。
上述のモニタリング方法はまた、ＤＮを研究するため、以下に記載の一般方法に基づいて実験動物に応用することができる。ここに用いられる「実験動物」の用語は通常、動物試験に用いられる脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、猫、犬、豚、およびヒト以外の霊長類である。好ましくは、２〜２４週毎に一回、実験動物を検査し、バイオマーカーのレベルを決定する。
任意のバイオマーカーはまた、必要に応じて、被検者の（即ち、ヒトのＤＮ患者、またはＤＮを患う実験動物）のＤＮ治療の有効性を評価するのに用いることができる。この方法において、治療前、治療中、および治療後、上述のバイオマーカーの一つのレベルを示す疾患スコアが決定される。治療の過程において、疾患スコアが、同じまま維持されるか、または低下する場合、この治療が効果的であることを示す。
ここではまた、上述した任意の方法を実施するのに有効なキットも開示される。このキットは、異なる抗原特異性を有する、２、３、または４種類の抗体を含む。これらの各抗体は、（ｉ）α−２−ＨＳ−糖タンパク質、（ｉｉ）α−１抗トリプシン、（ｉｉｉ）α−１酸性糖タンパク質、または（ｉｖ）オステオポンチンの一つと結合することができる。タンパク質（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）に特異的な抗体は、それらのフラグメントであるMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）、KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）、GQEHFAHLLILRDTKTYMLADVNDEKNWGLS （配列番号７）、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）、およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）に結合することができ、即ち、これらのフラグメントに含まれるすべての抗体のエピトープに特異的である。一つの例において、このキットは、ここに記載された方法の一つを実施するための検出用抗原（例えば、ＤＮに関連するタンパク質分子）に特異的な抗体だけを含む。よって、このキットは基本的に、このような抗体からなる。
上述のキットは、同じ抗原に結合される二つの異なる抗体（コーティング抗体と検出抗体）を含み得る。通常、検出抗体は、それ自身により、または他の試薬への結合を介して、検出可能な信号を発光する分子に抱合される。ここに用いられる「抗体」の用語は、全免疫グロブリン、またはそのフラグメント、例えば、抗原−結合活性を保留するＦａｂ、またはＦ（ａｂ’）2である。抗体は自然発生するか、または遺伝子操作（例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体）で生成され得る。
本発明のキットに含まれる抗体は、民間のベンダーから入手することができる。あるいは、または公知の方法により調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）抗体：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。上記のリストされた特定のバイオマーカーに対する抗体を作製するため、任意でキャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合されるマーカーをアジュバントと混合し、宿主動物に注射することができる。次に、動物内で生成される抗体をアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。一般的に使用される宿主動物は、ウサギ、マウス、モルモット、およびラット等を含む。免疫反応を増加するのに用いられる様々なアジュバントは、宿主動物種に基づいて選択することができ、フロインドアジュバント（完全、または不完全）、ゲル状鉱物、例えば、水酸化アルミニウム、ＣｐＧ、表面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールを含む。有用なヒトアジュバントは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム−パルヴムを含む。ポリクローナル抗体、即ち、抗体分子の不均一集団は、免疫動物の血清中に存在する。
モノクローナル抗体、即ち、抗体分子の均質集団は、標準のハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，２９２；ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８１）モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を用いて調製され得る。特にモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞株により、抗体分子の生成を提供する任意の技術により得られ、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５、および米国特許番号第４，３７６，１１０；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４， ７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２０２６、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）モノクローナル抗体と癌治療，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）などに記載されている。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、体内、または体外で培養され得る。体内で、モノクローナル抗体の高力価を生成する能力により、特に効果的な生産方法となる。
更に抗体フラグメントは、既知の技術により生成することができる。例えば、このようなフラグメントは、これに限定されないが、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることにより生成されるＦａｂフラグメントを含む。
更なる説明はないが、当業者なら、前述の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができる。よって、以下の特定の実施形態は、単なる説明とみなされ、いかなる方式でも、本発明の開示を制限しない。ここに記載された全ての公開情報は参照されて組み込まれる。
例１：尿中α−２−ＨＳ−糖タンパク質、尿中α−１抗トリプシン、尿中α−１酸性糖タンパク質、または血清オステオポンチンに基づくＤＮの診断
材料および方法
（ｉ）被検者
台湾台北市の三軍総医院（Ｔｒｉ−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で、８３人の糖尿病患者（「ＤＭ被検者」と称される）、および８２人のＤＮ患者（「ＤＮ被検者」と称される）が募集されたが、これは、米国糖尿病協会に基づいて設立された下記基準によるものである：
ＤＭ：糖尿病を患っているが、ＤＮを有していない（基準は以下のとおり）；
ＤＮ：糖尿病を患い、尿タンパク質の分泌濃度が一日当たり１ｇより高く、生検により、ＤＮまたは尿毒症が確定される。
（ｉ）被検者
台湾台北市の三軍総医院（Ｔｒｉ−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で、８３人の糖尿病患者（「ＤＭ被検者」と称される）、および８２人のＤＮ患者（「ＤＮ被検者」と称される）が募集されたが、これは、米国糖尿病協会に基づいて設立された下記基準によるものである：
ＤＭ：糖尿病を患っているが、ＤＮを有していない（基準は以下のとおり）；
ＤＮ：糖尿病を患い、尿タンパク質の分泌濃度が一日当たり１ｇより高く、生検により、ＤＮまたは尿毒症が確定される。
全被検者を、７：３の比率で訓練群とテスト群に分けた。
（ｉｉ）サンプルの収集と処理
上述の各被検者から、朝一番に排出された尿サンプルと血清サンプルを採集した。尿サンプルに含まれるペプチドは、尿のマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、およびｉＴＲＡＱ（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により測定した。
上述の各被検者から、朝一番に排出された尿サンプルと血清サンプルを採集した。尿サンプルに含まれるペプチドは、尿のマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、およびｉＴＲＡＱ（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により測定した。
α−２−ＨＳ−糖タンパク質（ＤＮ２）、α−１抗トリプシン（ＤＮ５）、オステオポンチン（ＤＮＯ）、およびα−１酸性糖タンパク質（ＧＲ３）を含むタンパク質分子は、ＥＬＩＳＡにより、尿中と血清サンプル中の濃度を測定するために調べた。具体的には、尿サンプルをプロテアーゼ阻害剤と混合し、希釈バッファで１：１００に希釈し、血清サンプルを１：１０に希釈した。希釈した検体は、ＥＬＩＳＡプレートで三回実験した。ＤＮＯ、ＤＮ２、ＤＮ５、およびＧＲ３の濃度レベルは、標準のサンドイッチＥＬＩＳ方法により測定した。
濃度計算には５−パラメータ標準曲線を用いた。％ＣＶが１５以下の標準品とサンプルだけが含まれ、基準に符合しないものは、上述のステップを繰り返した。尿サンプル中のタンパク質レベルは、同じ尿サンプル中、クレアチニンレベルで規格化され、Ｑｕａｎｔｉｃｈｒｏｍクレアチニンアッセイ（バイオアッセイシステム，（Ｈａｙｗａｒｄ）Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により測定した。
（ｉｉｉ）統計分析
検査した各タンパク質の尿と血清タンパク質濃度のデータを統計分析し、ＤＮ被検者とＤＭ被検者を区別する独自の能力を示すのにａｕＲＯＣ範囲０．４４−０．８７で表した。各被検者に対する、数値の相関関係は、常態テストの結果に基づき、ＳｐｅａｒｍａｎやＰｅａｒｓｏｎ分析により決定した。群の平均または中央値の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ−ｔｅｓｔ、またはＮｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｔｅｓｔにより適切に行った。ｐ＜０．０５のとき、統計的有意性が得られた。統計は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）、または［２５％，７５％］を伴う中央値で示した。
検査した各タンパク質の尿と血清タンパク質濃度のデータを統計分析し、ＤＮ被検者とＤＭ被検者を区別する独自の能力を示すのにａｕＲＯＣ範囲０．４４−０．８７で表した。各被検者に対する、数値の相関関係は、常態テストの結果に基づき、ＳｐｅａｒｍａｎやＰｅａｒｓｏｎ分析により決定した。群の平均または中央値の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ−ｔｅｓｔ、またはＮｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｔｅｓｔにより適切に行った。ｐ＜０．０５のとき、統計的有意性が得られた。統計は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）、または［２５％，７５％］を伴う中央値で示した。
結果
（ｉ）患者の特徴
下記の表１と表２に、訓練群とテスト群中の患者の特徴、およびＤＭ群とＤＮ群の患者の特徴を示す。
（ｉ）患者の特徴
下記の表１と表２に、訓練群とテスト群中の患者の特徴、およびＤＭ群とＤＮ群の患者の特徴を示す。
ＤＮ被検者とＤＭ被検者の間で、ＧＦＲ、ＡＣＲ、タンパク質、および血清クレアチニンレベルに統計的有意差が観察された。群の間で性別分布の差はなかった。
（ｉｉ）ＤＮに関連するタンパク質分子
尿中プロテオーム分析により、以下の表３でリストされるペプチドは、ＤＭ被検者とＤＮ被検者からの尿サンプルで異なって存在することが分かった。
尿中プロテオーム分析により、以下の表３でリストされるペプチドは、ＤＭ被検者とＤＮ被検者からの尿サンプルで異なって存在することが分かった。
ＥＬＩＳＡ分析により、３つの尿タンパク質分子、即ち、ｕＤＮ２、ｕＧＲ３、およびｕＤＮ５と、一つの血清タンパク質分子、即ち、ｓＤＮＯは、ＤＮと関連することが発見された。図１のＡ−Ｄおよび表２を参照。より具体的には、ＤＭ（ＤＮを患わない者）と比較して、ＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、およびｓＤＮＯのレベルが増加することが見出されたが、これは、これらが信頼性のあるＤＮマーカーであることを示す。更に、マクロアルブミン尿（ＡＣＲ＞３００ｍｇ／ｇ）を有するＤＮ被検者中のｕＤＮ５とｕＧＲ３のレベルは、微量アルブミン尿（ＡＣＲ３０ｍｇ／ｇ〜３００ｍｇ／ｇ）を示すＤＮ被検者より高かった。マクロアルブミン尿は末期ＤＮの指標であり、微量アルブミン尿は早期ＤＮの指標である。
例２：ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの組み合わせに基づいたＤＮの病期診断
二つのタンパク質モデル
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの二つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、およびリッジ回帰分析を行った。これらの研究で得られた結果は、五種のタンパク質、またはそれらのフラグメントの任意の二つの組み合わせが、ＤＮのステージを決定する信頼できるマーカーとして利用できることを示している。
二つのタンパク質モデル
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの二つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、およびリッジ回帰分析を行った。これらの研究で得られた結果は、五種のタンパク質、またはそれらのフラグメントの任意の二つの組み合わせが、ＤＮのステージを決定する信頼できるマーカーとして利用できることを示している。
以下に、二つのタンパク質モデル、即ち、ｕＤＮ５とｕＧＲ３であって、これらの二つのタンパク質分子の組み合わせレベルに基づいて疾患スコアを計算する式の例を示す。以下の表（即ち、表４−９）に、この二つのタンパク質モデルのカットオフ値、感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、および陰性予測率（ＮＰＶ）、並びにＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＲＯＣ）をリストする。
判別関数分析：
疾患スコア＝０．３３０３×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２７３２×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
疾患スコア＝０．３３０３×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２７３２×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
ロジスティック回帰分析：
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１２．５３３２＋０．７１９７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４９４１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１２．５３３２＋０．７１９７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４９４１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
リッジ回帰分析：
疾患スコア＝−１．７６９７＋０．１５２０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２２５４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝−１．７６９７＋０．１５２０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２２５４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
３種のタンパク質モデル
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの三つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、三つのタンパク質の任意の組み合わせが、ＤＮの病期診断の信頼できるマーカーとして用いることができることを示す。
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの三つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、三つのタンパク質の任意の組み合わせが、ＤＮの病期診断の信頼できるマーカーとして用いることができることを示す。
以下に、三つのタンパク質モデル、即ち、ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、およびｕＧＲ３であって、これらの三つのタンパク質分子の組み合わせレベルに基づいて疾患スコアを計算する式の例を示す。以下の表（即ち、表１０−１７）に、この三つのタンパク質モデルのカットオフ値、感度、特異性、ＰＰＶ、ＮＰＶ、およびＡＵＲＯＣをリストする。
判別関数分析
疾患スコア＝０．３３４０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０１４２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２７８４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
疾患スコア＝０．３３４０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０１４２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２７８４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
関数分析
疾患スコア＝０．９１９０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９９７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９００３×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝０．９１９０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９９７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９００３×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
ロジスティック回帰分析：
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１１．２８２０＋０．８８１０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．３４７８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．５５７６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１１．２８２０＋０．８８１０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．３４７８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．５５７６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝−１．２９００＋０．１８００×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．１０１３×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２５０５×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）
４つのタンパク質モデル
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの４つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、五種のタンパク質、またはそれらのフラグメントの任意の四つの組み合わせが、ＤＮステージを判断する信頼性のあるマーカーとして利用できることを示す。
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの４つの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、五種のタンパク質、またはそれらのフラグメントの任意の四つの組み合わせが、ＤＮステージを判断する信頼性のあるマーカーとして利用できることを示す。
以下に、ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、およびｓＤＮＯの四つのタンパク質モデルであって、これらの四つのタンパク質分子の組み合わせレベルに基づいて疾患スコアを計算する式の例を示す。以下の表（即ち、表１８−２５）に、この四つのタンパク質モデルのカットオフ値、感度、特異性、ＰＰＶｓ、ＮＰＶｓ、およびＡＵＲＯＣをリストする。
判別関数分析：
疾患スコア＝０．２９７２×ｌｏｇ２［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０１５９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２０１４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．５６８８×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）＋５
疾患スコア＝０．２９７２×ｌｏｇ２［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０１５９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２０１４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．５６８８×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）＋５
因子分析：
疾患スコア＝０．９１３２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９５０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９０８０×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４５４９×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
疾患スコア＝０．９１３２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９５０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９０８０×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４５４９×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
ロジスティック回帰分析：
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１３．７５２９＋０．９４６０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．３１１０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４９５７×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４７８７×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１３．７５２９＋０．９４６０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．３１１０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４９５７×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４７８７×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
リッジ回帰分析：
疾患スコア＝−１．７５８８＋０．１７２９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０９７１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２３８１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１３１２×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
疾患スコア＝−１．７５８８＋０．１７２９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０９７１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２３８１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１３１２×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）
５つのタンパク質モデル
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、これらの５つのタンパク質、またはそれらのフラグメントの組み合わせが、ＤＮのステージを判断する信頼できるマーカーとして利用できることを示す。
ＤＭ被検者とＤＮ被検者中のｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、ｕＤＮＯ、およびｓＤＮＯの組み合わせレベルに対し、判別関数分析、ロジスティック回帰分析、因子分析、およびリッジ回帰分析を行なった。この結果は、これらの５つのタンパク質、またはそれらのフラグメントの組み合わせが、ＤＮのステージを判断する信頼できるマーカーとして利用できることを示す。
以下に、これらの５つのタンパク質分子の組み合わせレベルに基づいて疾患スコアを計算する式を示すと共に、表（即ち、表２６−３３）に、この５タンパク質モデルのカットオフ値、感度、特異性、ＮＰＶｓ、ＰＰＶｓ、およびＡＵＲＯＣをリストする。
判別関数分析：
疾患スコア＝０．２７８０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０２３１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２２３６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６０４３×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．１５１３×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
疾患スコア＝０．２７８０×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０２３１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２２３６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６０４３×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．１５１３×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）＋５
因子分析：
疾患スコア＝０．９１１７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９４９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９０９５×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４５５４×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）＋０．０３８４×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝０．９１１７×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６９４９×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９０９５×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．４５５４×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）＋０．０３８４×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
ロジスティック回帰分析：
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１１．４３１８＋０．８１８８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．５３７６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．７５６１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．３９４０×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．１７４１×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１１．４３１８＋０．８１８８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．５３７６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．７５６１×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．３９４０×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．１７４１×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
リッジ回帰分析：
疾患スコア＝−１．３１１２＋０．１６４８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０９６８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２４６８×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１４２６×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．０５５２×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
疾患スコア＝−１．３１１２＋０．１６４８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０９６８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２４６８×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１４２６×ｌｏｇ2［ｓＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｌ）−０．０５５２×ｌｏｇ2［ｕＤＮＯ］（ｎｇ／ｍｇ）
例３：ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、ｕＧＲ３、および年齢の組み合わせに基づくＤＮの病期診断
以下に、３つのタンパク質分子、即ち、ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、およびｕＧＲ３と、臨床学的因子、即ち、年齢からなるバイオマーカーのレベルに基づいて判別関数分析、因子分析、ロジスティック回帰分析、およびリッジ回帰分析により決定される疾患スコアを計算する式を示す。また、以下の表（即ち、表３４−４１）に、このモデルのカットオフ値、感度、特異性、ＰＰＶｓ、ＮＰＶｓ、およびＡＵＲＯＣをリストする。
以下に、３つのタンパク質分子、即ち、ｕＤＮ２、ｕＤＮ５、およびｕＧＲ３と、臨床学的因子、即ち、年齢からなるバイオマーカーのレベルに基づいて判別関数分析、因子分析、ロジスティック回帰分析、およびリッジ回帰分析により決定される疾患スコアを計算する式を示す。また、以下の表（即ち、表３４−４１）に、このモデルのカットオフ値、感度、特異性、ＰＰＶｓ、ＮＰＶｓ、およびＡＵＲＯＣをリストする。
判別関数分析：
疾患スコア＝０．３３４２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０２０１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２８２６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．００５９×年齢（歳）＋５
疾患スコア＝０．３３４２×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．０２０１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２８２６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．００５９×年齢（歳）＋５
因子分析：
疾患スコア＝０．９１８４×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．７００６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９００５×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１８６３×年齢（歳）
疾患スコア＝０．９１８４×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．７００６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．９００５×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．１８６３×年齢（歳）
ロジスティック回帰分析：
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１５．９７４８＋０．８６８８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．４９６６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６４３６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０８７９×年齢（歳）
疾患スコア＝ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ）／（１＋ｅｘｐ（Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ））、
ここで、Ｌｏｇｉｔ＿ｖａｌｕｅ＝−１５．９７４８＋０．８６８８×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．４９６６×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．６４３６×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０８７９×年齢（歳）
リッジ回帰分析：
疾患スコア＝−２．１６９０＋０．１７７１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．１０７４×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２４７４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０１６８×年齢（歳）
疾患スコア＝−２．１６９０＋０．１７７１×ｌｏｇ2［ｕＤＮ５］（ｎｇ／ｍｇ）−０．１０７４×ｌｏｇ2［ｕＤＮ２］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．２４７４×ｌｏｇ2［ｕＧＲ３］（ｎｇ／ｍｇ）＋０．０１６８×年齢（歳）
別の実施形態
本明細書で開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせても良い。本明細書で開示される各特徴は、同等、等価、または類似の目的により代替することができる。よって、明確な説明がない限り、開示される全特徴は、単に相同または類似の特徴による一般的な例である。
本明細書で開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせても良い。本明細書で開示される各特徴は、同等、等価、または類似の目的により代替することができる。よって、明確な説明がない限り、開示される全特徴は、単に相同または類似の特徴による一般的な例である。
上記の記載から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を容易に確定することができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなしに、種々の使用および状態に適合できるように本発明の種々の変更および改変を行なうことができる。従って、他の実施形態もまた、特許請求の範囲の範囲内に包含される。
Claims (21)
- 被検者が糖尿病性ネフロパシーを患っている可能性を推定する方法であって、
糖尿病性ネフロパシーを患っていると疑われる被検者の尿サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定するステップであって、前記バイオマーカーは、
VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）およびMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）よりなる群から選択される、α−２−ＨＳ−糖タンパク質のフラグメント、および
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、およびEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）よりなる群から選択される、α−１抗トリプシンのフラグメントであるステップと；
前記バイオマーカーのレベルに基づいて、前記被検者が糖尿病性ネフロパシーを患っているか評価するステップと；
からなり、
糖尿病性ネフロパシーを患わない被検者と比較して、前記バイオマーカーのレベルが増加するとき、前記被検者は糖尿病性ネフロパシーを患っている可能性が増加していることを示すことを特徴とする方法。 - 前記バイオマーカーは、前記被検者の尿サンプル中のα−１酸性糖タンパク質のフラグメントを更に含み、前記α−１酸性糖タンパク質のフラグメントは、GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である請求項１に記載の方法。
- 前記バイオマーカーは、前記被検者の血清サンプル中のオステオポンチンのフラグメントを更に含み、前記オステオポンチンのフラグメントは、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）よりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
- 前記評価ステップの後、前記バイオマーカーのレベルと糖尿病性ネフロパシーの状態を関連付けるステップを更に含み、糖尿病性ネフロパシーを患わない被検者と比較して、前記バイオマーカーのレベルが増加するとき、前記被検者が末期の糖尿病性ネフロパシーであることを示す請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 被検者の糖尿病性ネフロパシー治療の有効性を評価する方法であって、
前記被検者の尿サンプル中の治療前のバイオマーカーのレベルを決定するステップであって、前記バイオマーカーは、
VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）およびMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）よりなる群から選択される、α−２−ＨＳ−糖タンパク質のフラグメント、および
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、およびEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）よりなる群から選択される、α−１抗トリプシンのフラグメントであるステップと；
前記患者の尿サンプル中の治療後のバイオマーカーのレベルを決定するステップと；
前記治療後のバイオマーカーレベルの変化に基づいて、治療の効果を評価するステップと；からなり、
前記治療後のバイオマーカーのレベルが前記治療前のバイオマーカーのレベルと同じか低いとき、前記治療が有効であることを示すことを特徴とする方法。 - 前記バイオマーカーは、前記被検者の尿サンプル中のα−１酸性糖タンパク質のフラグメントを更に含み、前記α−１酸性糖タンパク質のフラグメントは、GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である請求項５に記載の方法。
- 前記バイオマーカーは、前記被検者の血清サンプル中のオステオポンチンのフラグメントを更に含み、前記オステオポンチンのフラグメントは、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）よりなる群から選択される請求項５または６に記載の方法。
- 前記被検者はヒトの患者である請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記被検者は実験動物である請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 被検者の糖尿病性ネフロパシーのステージを決定する方法であって、
糖尿病性ネフロパシーを患っていると疑われる被検者の尿サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定し、選択的に一つ、またはそれ以上の臨床学的因子を決定するステップであって、前記バイオマーカーは、
VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）およびMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）よりなる群から選択される、α−２−ＨＳ−糖タンパク質のフラグメント、および
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、およびEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）よりなる群から選択される、α−１抗トリプシンのフラグメントであり、
前記臨床学的因子が、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン／クレアチニン比、および糸球体ろ過量よりなる群から選択されるステップと；
前記バイオマーカーのレベルに基づいて、疾患スコアを計算するステップと；
前記疾患スコアに基づいて、異なる糖尿病性ネフロパシーのステージを示す所定のカットオフ値と比較して、被検者の糖尿病性ネフロパシーステージを評価するステップと；
からなることを特徴とする方法。 - 前記バイオマーカーは、前記被検者の尿サンプル中のα−１酸性糖タンパク質のフラグメントを更に含み、前記α−１酸性糖タンパク質のフラグメントは、GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である請求項１０に記載の方法。
- 前記バイオマーカーは、前記被検者の血清サンプル中のオステオポンチンのフラグメントを更に含み、前記オステオポンチンのフラグメントは、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）よりなる群から選択される請求項１０または１１に記載の方法。
- 前記疾患スコアは、リッジ回帰分析、因子分析、判別関数分析、およびロジスティック回帰分析よりなる群から選択される分析により計算される請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 被検者中の糖尿病性ネフロパシーの進行をモニタリングする方法であって、
糖尿病性ネフロパシーを患っていると疑われる被検者の第一と第二の尿サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定し、選択的に一つ、またはそれ以上の臨床学的因子を決定するステップであって、前記第二のサンプルは、前記第一のサンプルの２週〜１２ヶ月後の前記被検者からのものであり、前記バイオマーカーは、
VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）およびMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）よりなる群から選択される、α−２−ＨＳ−糖タンパク質のフラグメント、および
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、およびEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）よりなる群から選択される、α−１抗トリプシンのフラグメントであり、
前記臨床学的因子が、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン／クレアチニン比、および糸球体ろ過量よりなる群から選択されるステップと；
前記第一および第二のサンプルのバイオマーカーのレベルのそれぞれに基づいて、第一の疾患スコアおよび第二の疾患スコアを計算するステップと；
前記被検者の疾病進行を評価するステップと；
からなり、
前記第二の疾患スコアが前記第一の疾患スコアより高いとき、糖尿病性ネフロパシーの悪化を示すことを特徴とする方法。 - 前記バイオマーカーは、前記被検者の尿サンプル中のα−１酸性糖タンパク質のフラグメントを更に含み、前記α−１酸性糖タンパク質のフラグメントは、GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である請求項１４に記載の方法。
- 前記バイオマーカーは、前記被検者の血清サンプル中のオステオポンチンのフラグメントを更に含み、前記オステオポンチンのフラグメントは、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）よりなる群から選択される請求項１４または１５に記載の方法。
- 前記疾患スコアは、リッジ回帰分析、因子分析、判別関数分析、およびロジスティック回帰分析よりなる群から選択される分析により計算される請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 被検者の糖尿病性ネフロパシー治療の有効性を評価する方法であって、
前記被検者の第一と第二のサンプルのバイオマーカーのレベルを決定し、選択的に一つ、またはそれ以上の臨床学的因子を決定するステップであって、前記第一のサンプルは、前記治療前の前記被検者からのものであり、前記第二のサンプルは、前記治療後の前記被検者からのものであり、前記バイオマーカーは、
VVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号１）およびMGVVSLGSPSGEVSHPRKT（配列番号２）よりなる群から選択される、α−２−ＨＳ−糖タンパク質のフラグメント、および
KGKWERPFEVKDTEEEDF（配列番号３）、MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK（配列番号４）、EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAE（配列番号５）、およびEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFA（配列番号６）よりなる群から選択される、α−１抗トリプシンのフラグメントであり、
前記臨床学的因子が、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン／クレアチニン比、および糸球体ろ過量よりなる群から選択されるステップと；
前記第一および第二のサンプルのバイオマーカーのレベルのそれぞれに基づいて、第一の疾患スコアおよび第二の疾患スコアを計算するステップと；
前記被検者の治療の効果を評価するステップと；
からなり、
前記第二の疾患スコアが前記第一の疾患スコア以下であるとき、前記治療が有効であることを示すことを特徴とする方法。 - 前記バイオマーカーは、前記被検者の尿サンプル中のα−１酸性糖タンパク質のフラグメントを更に含み、前記α−１酸性糖タンパク質のフラグメントは、GQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLS（配列番号７）である請求項１８に記載の方法。
- 前記バイオマーカーは、前記被検者の血清サンプル中のオステオポンチンのフラグメントを更に含み、前記オステオポンチンのフラグメントは、YPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSK（配列番号８）およびKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSK（配列番号９）よりなる群から選択される請求項１８または１９に記載の方法。
- 前記疾患スコアは、リッジ回帰分析、因子分析、判別関数分析、およびロジスティック回帰分析よりなる群から選択される分析により計算される請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
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