BRPI1005050B1 - precursores dendriméricos tris- e tetra-funcionalizados, com atividade antimicrobiana e antitumoral e processo de preparação e uso - Google Patents

Abstract

PRECURSORES DENDRIMÉRICOS TRIS- E TETRA-FUNCIONALIZADOS, COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTITUMORAL E PROCESSO DE PREPARAÇÃO E USO. A presente invenção propõe a preparação de compostos tipo amina trise tipo etilenodiamina tetra-funcionalizados substituÍdos por grupos tioureido e ureido, derivados carboxílicos (os próprios ácidos carboxílicos e seus derivados hidroxâmicos, ésteres, hidrazidas e amidas) e por grupos amidínicos (não alquilado, mono- alquilado e bis-alquilado) e bioisósteros correspondentes (imidato, tioimidato, amidoxima e derivados amidínicos - não alquilado, mono-alquilado e bis-alquilado) todos denominados especificamente como precursores dend riméricos tris-funcionalizados (PD2) e tetra-funcionalizados (PD3) (Figura 1). Esses compostos apresentam aplicações farmacológicas, dentre as quais, antimutagênicas, apoptóticas específicas, antioncológicas devido à interação com o DNA, antibacterianas e antifúngicas específicas, o que já foi observado em pesquisas in vitro.

Description

A presente invenção propõe a preparação de compostos tipo amina trise tipo amina tetra-funcionalizados substituídos por grupos tioureido e ureido, derivados carboxílicos (os próprios ácidos carboxílicos e seus derivados hidroxâmicos, ésteres, hidrazidas e amidas) e por grupos amidínicos (não alquilado, mono-alquilado e bis-alquilado) e bioisósteros correspondentes (imidato, tioimidato, amidoxima e derivados amidínicos - não alquilado, mono- 10 alquilado e bis-alquilado) todos denominados especificamente como precursores dendriméricos tris-funcionalizados (PD2) e tetra-funcionalizados (PD3) (Figura 1). Esses compostos apresentam aplicações farmacológicas, dentre as quais, antimutagênicas, apoptóticas específicas, antioncológicas y; devido à interação com o DNA, antibacterianas e antifúngicas específicas, o 15 que já foi observado em pesquisas in vitro.

Moléculas que apresentam interações específicas com o DNA têm despertado interesse como potenciais agentes terapêuticos em uma variedade de doenças humanas tais como o câncer, a AIDS, a hepatite, a malária e mesmo para o tratamento antifúngico e antibacteriano (Henderson, D.; Hurley, 20 L.H. Nat. Med., v.6, p.5, 1995; Neidle, S. Nat. Prod. Rep.,v.18. p.291, 2001Bischoff, G.; Hoffmann, S. Current Medicinal Chemistry,v.9, p.321-348, 2002).

A existência da forma convexa de DNA leva a interações seletivas com algumas drogas bis-catiônicas, conhecidas como bis-amidinas ou amidinas bis- catiônicas (HCrH2N-(HN=)C-(R)-C(=NH)NH2HCI, onde R é uma cadeia 25 carbônica) que são conformacionalmente côncavas e que apresentam conformações ditas iso-hélicas; ou seja, possuem estrutura favorável para a ocorrência de interações com o DNA (Goodsell, D.; Dickerson, R.E. J. Med. Chem., v.29, p.727, 1986; Gilman, A.; Phillips, F. S. Science-, v.103, p.409, 1946). Sabe-se que existem ligantes que fazem interação com a fenda menor < 30 do DNA na ordem de 10'12 Kcal mol’1 e são justamente estas espécies que têm despertado interesse, conforme já dito, como potenciais agentes terapêuticos em uma variedade de doenças humanas como o câncer, por exemplo (Kopka, M.L., Yoon, C., Goodsell, D., Pjura, P., Dickerson, J.R.E. Mol. Biol., 1985, V.183, p.553; Starcevic et Al., Eur. J.Med.Chem., v.41(8), p.925-939; Clercq, E., J. Med. Chem., v.23, p.787-795, 1980; Cory,M., Tidwell R.R., Fairley T.A., J. Med. Chem., v.35, p.431-438, 1992; Jansen K., Lincoln P., NordBn’ B., Biochemistry, v.32, p.6605-6612, 1993).

Outros tipos de agentes antitumorais conhecidos e usados clinicamente são os agentes alquilantes, que têm seus mecanismos e ação relacionados com a interação com o DNA (disponível em http://quimioterapia. com.sapo.pt/quimioterapia.htm; e em http://www.entreaqui.com.br/farmacologia/produtos/ver.aspid=8; acessado em 09/01/2008; Donnici et al.; Quim. Nova, v.28, n.1, p.118-29, 2005). Um exemplo específico de agentes alquilantes pertence ao grupo de compostos conhecidos como mostardas nitrogenadas. Estes são produtos clínicos pioneiros principalmente a Mecloretamina, o Melfalan e Clorambucil (disponível em http://www.entreaqui.com.br/farmacologia/produtos/ver.aspid=8 , acessado em 09/01/2008; Hopkins, P.B.; Millard, J.T.; Woo, J.; Weidner, M.F.; Kirchner, J.J.; Sigurdsson, S.T.; Raucher, S. Tetrahedron, v.47, p.2475, 1991; Kohn, K. W. In Topics in Structural & Molecular Biology. Neidle, S., Waring, M., Eds.; Verlag Chemie: Weinheim, Molecular aspects of anticancer drug action, 1994, p.315; Lawley, P.D., BioEssays, v.17, p.561, 1995; Gniazdowski, M.; Cera, C. Chem. Rev., v.96, p.619, 1996; Paustenbach, D.J.; Finley, B.L.; Kacew, S. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v.211, p.211, 1996; Gilman, A.; Phillips, F.S. The biological actions and therapeutic applications of the betachloroethyl amines and sulfides, Science, v.103, p.409, 1946; Haskel, C. M. Cancer Treatment, 2nd; Saunders: Philadelphia, 1990; Gilman, A.; Phillips, F.S.; Science, v.103, p.409, 1946.

A maioria dos agentes terapêuticos atua de forma não específica, podendo acarretar inúmeros efeitos colaterais, pois esses agentes podem lesionar tanto células malignas quanto normais, particularmente as células de rápido crescimento, como as gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico, o que explica a maior parte dos efeitos colaterais da quimioterapia, tais como náuseas, perda de cabelo e susceptibilidade maior a infecções (Salmonm, S.E.; Katzung, B.G. In Farmacologia Básica & Clínica, p.629-655, 1998).Cabe ressaltar que existem fármacos antifúngicos como a Flucitosina que tem a sua ação farmacológica também relacionada à interação com o DNA e, outros, como o Metalaxyl, típico agente de alquilação de DNA e o LY214352 (8-cloro-4-(2-cloro-4-fluorofenóxi) quinolina), típico agente intercalante de DNA (Dixon, G.K.; Copping, L.G.; Hollomon, D.W. Antifugal Agents: Discovery and Mode of Action, Oxford, 1995).

Vários pesquisadores vêm estudando novos derivados funcionalizados, procurando-se um efeito sinérgico que aumente a especificidade e a potência e gere menor toxidez, obtendo agentes farmacológicos mistos ou híbridos (Tietze, L.F.; Bell, P.H.; Chandrasekhar, S. Angew. Chem. Int., 2003, v.42, p.3996; Porzel, A., et al., Tetrahedron,v.36, p.865, 2000; Morphy, R.; Kay, C.; Rankovic, Z. DDT, v.9, p.641, 2004).

Contudo, não se encontrou ainda na literatura a descrição de estudos de derivados mistos/híbridos que contenham simultaneamente a estrutura geral análoga a dos agentes alquilantes (CICH2CH2XCH2CH2CI; onde o substituinte X pode ser N,S,O) e ao mesmo tempo funcionalizadas com grupos amidinas bis-catiônicas. Os especialistas afirmam que estes compostos amidino- funcionalizados são excelentes modelos para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos que possuem o mecanismo de ação relacionado com o DNA, podendo-se encontrar possíveis novos fármacos para tratamento da AIDS, hepatite, malária e, mesmo, para o tratamento antifúngico e antibacteriano (Neidle.S. Nat.Prod.Rep., v.18, p.291, 2001; Bischoff, G.; Hoffmann, S. Current Medicinal Chemistry,v.9, p.321-348, 2002).

Porém, apesar das amidinas terem sido investigadas em diversas pesquisas, os métodos clássicos para síntese de amidinas ((RCN(NR’)(NHR"), onde R, R’ e R” correspondem a uma cadeia carbônica) são complexos pela necessidade de uso de reagentes de alta pureza e com baixa reprodutibilidade (Shriner, R.L.; Neumann, F.W. Chem. Rev., v.35, p.351, 1944; Roger, R.; Neilson, D. G. Chem. Rev., 1961, v.61, p.179; Pinner, A; Em die iminoãther und ihre derivative, Oppenheim: Berlin, 1892;. Santos, M.S et al. Quím. Nova,v.29, n.6, p. 1301-1306, 2006). Assim, nos trabalhos correspondentes a este pedido de patente, buscou-se a síntese de derivados carboxílicos e os correspondentes ésteres, amidas, metilamino, ácidos hidroxâmicos (R- C=O(NHOH)), ácidos hidrazidas (R-C=O(NHNH2) e os derivados S-tioureído (R-S-C=NR’(NR”)), que são realmente compostos análogos (bioisósteros) do grupo amidina e que também possuem potencial atividade biológica.

O grupo S-tioureído é de mais fácil preparação do que as amidinas correspondentes e, têm sido mais investigado mostrando casos de alta afinidade com DNA e atividade como agente antitumoral e antifúngico (Oliveira, S.R. “Síntese, estudos de relações estrutura-atividade e da atividade antifúngica de novos agentes quimioterápicos para tratamento de doenças infecciosas emergentes”, 2008. Dissertação (Mestrado em Química) - Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Orientador: Cláudio Luis Donnici; Nogueira, L.J. “Síntese, avaliação da atividade antifúngica e determinação do log p de precursores dendriméricos”, 2007. Dissertação (Mestrado em Química) - Instituto de Ciências Exatas Departamento de Química, Orientador: Cláudio Luis Donnici.; Silva, L.L. “Estudo da síntese e da interação de precursores dendriméricos com DNA e avaliação da atividade antifúngica”, 2007. Dissertação (Mestrado em Química) - Instituto de Ciências Exatas Departamento de Química, Orientador: Cláudio Luis Donnici). Contudo, a ação farmacológica do grupo S-tioureído (SC=NHNH2) é pouco estudada e o mesmo é comumente usado como intermediário sintético para obtenção de grupos tióis ou mercaptanas (RSH) obtidos a partir da hidrólise alcalina, seguida de acidificação destes intermediários formados pela reação de haletos de alquila (RX) com excesso de tiouréia (NH2C(=S)NH2), em etanol aquecido a refluxo; conforme pode ser visualizado pelas equações abaixo: R-X + NH2C=S(NH2) — R-S-C=NH(NH2) + X' (etapa 1) R-S-C=NH(NH2) + X- -» R-SH (etapa 2)

A literatura relata poucos estudos acerca das atividades farmacológicas das moléculas similares às sintetizadas e funcionalizadas com outros bioisósteros da amidina. Destacam-se alguns trabalhos, como o de Gergely e colaboradores que mostraram a atividade antitumoral contra a leucemia dos tipos HL-60 e U-937 do composto tris-((2-tioureído)-S-etil) amina e o trabalho de Supuran e colaboradores, onde foi relatada a atividade antifúngica, contra Aspergillus sp. e Candida sp., de derivados tioureído substituídos da 2- aminofenoxatiina (Nagy, E.; Mihalik, R.; Hraák, A.; Vértesi, C.; Gergely, P.; Immunopharmacology,v.47, p.25, 2000; Supuran, C. T. Scozzafava, A.; Briganti, F.; Loloiu, G.; Maior, O.; J. Med. Chem., v.33, p.821; 1998). Estudos similares são encontrados na literatura e levam a concluir que o grupo tioureído é de grande interesse, pois, apesar de ainda não ser muito conhecido, este grupo funcional apresenta atividade potencial como antitumoral por ser bioisóstero do grupo amidina e por apresentar capacidade similar de interação com o DNA, além de gerar outras atividades farmacológicas especialmente a possível potencialidade como novos compostos antifúngicos (Cameron, D.G.; Hudson, H.R.; Pianka, M.; Phosph. Sulfur Rel. Elements. 1993, v.83, p.21; Chen, R.Y.; Wang, H.L.; Zhou, J.; Chem. J. Chin. Univ. 1995, v.16, p.1229; Subbagh, H. I.; Obaid, A.M.; J. Med. Chem. v.31, p.1017, 1996; Supuran, C.T.; Scozzafava, A.; Jurca, B.C.; Hies, M. A.; J. Med. Chem. v.33, p.83, 1998).

Os derivados tris- e tetra-funcionalizados denominados PD2 e PD3 (Figura 1) propostos na presente invenção foram previamente planejados, tendo-se como protótipo inicial a mecloretamina (CICH2CH2NCH3CH2CH2CI). O grupo central amino desta estrutura foi substituído por outros grupos bioisostéricos amidínicos e também se variou o tamanho das cadeias metilênicas internas; visando um efeito sinérgico global para melhor interação com DNA. Assim sendo, a forma, 0 tamanho, as distâncias e ângulos de ligação do protótipo modificado favoreceram ao máximo a interação com o DNA, de modo que fosse possível avaliar preliminarmente as atividades antitumoral e antifúngica; investigando-se alterações moleculares racionalmente planejadas por métodos teóricos e também se obtendo, além da otimização das atividades, a diminuição de efeitos colaterais.

Os PDs ora propostos e denominados especificamente de PD2 e PD3 podem ser, respectivamente, compostos tris- e tetra- funcionalizados por derivados carboxílicos que podem estar ligados a nitrilas e aos correspondentes derivados reduzidos metilamino, aos ácidos carboxílicos e aos derivados ésteres, amidas, hidrazidas, ácidos hidroxâmicos correspondentes e ligados também a grupos bioisostéricos amidínicos do tipo ureído e tioureído e outros, como imidato, tioimidato e amidina.

Os precursores dendriméricos (Figura 1) tris- e tetra-funcionalizados propostos neste pedido de patente são representados genérica e respectivamente por PD2 e PD3, em que: • PD2 representa os compostos do tipo amina tris-funcionalizada. • PD3 representa compostos do tipo amina tetra-funcionalizada. • PD2 e PD3 possuem o substituinte Y representado por um grupo éster (RCO2R’), ácido carboxílico (RCO2H), ácido hidroxâmico (RCONHOH), amida (RCO2NH2) ou hidrazida (RCONHNH2); • PD2N e PD3N representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo nitrila (RCN); • PD2MA e PD3MA representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo metilamino (CH2NH2); • PD2F1 e PD3F1 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo tioureído (SCNHNH2); • PD2F2 e PD3F2 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo N,N-alquiltioureído (SCNHNR2); • PD2F3 e PD3F3 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo N,N-alquiltioureído (SCNRNHR); • PD2F4 e PD3F4 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo ureído (-NHCONH2); • PD2F5 e PD3F5 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo imidato (-C=NHOR); • PD2F6 e PD3F6 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo tioimidato (-C=NHSR); • PD2F7 e PD3F7 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo amidoxima (-C=NHNHOH); • PD2F8 e PD3F8 representam os compostos que possuem 0 substituinte Y representado por grupo amidina (-C=NHNH2); • PD2F9 e PD3F9 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo N-alquilamidina (-C=NHNHR); • PD2F10 e PD3F10 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo N,N-dialquilamidina (-C=NRNHR); • PD2F11 e PD3F11 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo N,N-dialquilamidina (-C=NHNR2); • PD2F12 e PD3F12 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo tetrazólico (-CN4H2-); • PD2F13 e PD3F13 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo 1,3,4-oxadiazólico; • PD2F14 e PD3F14 representam os compostos que possuem o substituinte Y representado por grupo 1,3,4-tiadiazólico; R, R’ e R2= -CHS, -CH2CH3 e -CH2CH2CH3; e, séries homólogas onde n e m do substituinte -CH2- iguais a 0, 1,2 ou 3;

A busca realizada no estado da técnica trouxe como resultado algumas sínteses e aplicações relacionadas aos precursores dendriméricos (PDs) propostos na presente invenção, conforme mostrados a seguir:

a) Em relação ao PD2N, verificou-se que:

Nie sintetizou tris(2-cianoetil)amina a partir da reação entre amónia líquida e acrilonitrila sob irradiação de microondas (Nie, G.C.; Microwave- assisted and phase transfer catalysis synthesis of tris(2-cyanoethyl)amine; Ganguang Kexue Yu Guang Huaxue, (2004), 22(4), 293-297).

Alguns pesquisadores também sintetizaram tris(2-cianoetil)amina a partir da reação entre amónia líquida e acrilonitrila, no entanto 0 fizeram sob aquecimento a diferentes faixas de temperatura (Xu, Xing-you; Sun, Gui-jin; Gao, Jian; Zhang, Xing-yang; Tang, Yan-ling. Synthesis and characterization of tris(2-nitriloethyl)amine; Huaihai Gongxueyuan Xuebao, Ziran Kexueban (2003), 12(2), 32-34. Gao, Jian; Xu, Xing-you; Tang, Yan-ling; Zhang, Xing- yang. Synthesis and characterization of bis(2-cyanoethyl)aminoacetonitrile and tris(2-cyanoethyl)amine; Huagong Kuangwu Yu Jiagong (2003), 32(2), 23-25. Dietrich, B.; Hosseini, M.W.; Lehn, J.M.; Sessions, R.B. Synthesis of macrobicyclic polyamines by direct macrobicyclization via tripode-tripode coupling; Helvetica Chimica Acta, (1985), 68(2), 289-99).

A patente US2002115018 mostra a síntese de tris(2-cianoetil)amina a partir da reação entre amónia aquosa e bromoacetonitrila.

A patente US4841092 mostra alguns métodos de síntese de tris(2- cianoetil)amina. Mostra também a reação entre acrilonitrila e acetato de amônio a temperaturas entre 70-104°C.

A patente US4552705 mostra a síntese de tris(2-cianoetil)amina a partir de diferentes proporções molares de acrilonitrila/NHs e água, a temperaturas entre 27-80°C.

b) Em relação ao PD2MA, verificou-se que:

Hosoya e colaboradores investigaram a tris(3-aminopropil)amina para exame de perfil quimiotaxonômico e termofílico sendo que alguns destes termófilos adicionaram as penta-aminas (Hamana, K.; Tanaka, T.; Hosoya, R.; Niitsu, M.; Itoh, T. Journal of General and Applied Microbiology,(2003), 49(5), 287-293).

A patente W003087121 relata a preparação de uma poliamina esteroidal derivada como agente antimicrobiano.

A patente JP2001325016 reporta a ativação e incremento de transcrição in vitroda RNA polimerase pela poliamina citada.

A patente W02002062755 reporta o uso de derivados poliamina e poliamida como agentes antibacterianos, antifúngicos e antiparasitários.

A patente W02002055112 descreve o uso de poliaminas para preparação de quelantes polipodais para formação de metalofármacos utilizáveis em técnicas de diagnóstico por imagem.

A patente WO200189653 mostra a utilização de aminas para formação de quelatos imobilizados e suportados para uso catalítico na hidrólise de fosfatos-ésteres e aplicações para a descontaminação eficiente e de baixo custo de pesticidas desta classe.

Fabien e colaboradores descreveram a obtenção de poliamina, com aplicações para a complexação de lantanídeos (Renaud, F.; Decurnex, C.; Piguet, C.; Hopfgartner, G. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions,(2001), (12), 1863-1871).

Uzawa e colaboradores reportaram a obtenção de poliamina para uso em sintese de polipeptideos (Uzawa, T.; Hamasaki, N.; Oshima, T. Journal of Biochemistry, (1993), 114(4), 478-86).

c) Em relação ao PD2F1, verificou-se que:

Gergely e colaboradores estudaram a tris-((2-tioureido)-S-etil) amina e investigaram a sua atividade antitumoral contra a leucemia dos tipos HL-60 e U-937 (Nagy, E.; Mihalik, R.; Hraák, A.; Vértesi, C.; Gergely, P.; Immunopharmacology; v.47, p.25, 2000).

d) Em relação ao PD3N, verificou-se que:

Buhleier mostrou a metodologia de síntese utilizada na preparação de tetranitrila (Buhleier, E.; Wehner, W.; Vogtle, F. Synthesis 1978, 155).

Os documentos US6331519, US 6300306, US6180590, DE19611977 e W09735948 relatam o uso de aminas e polinitrilas como detergentes em composição de tinturas de cabelo.

Os precursores dendriméricos possuem baixa toxidez e apresentam aplicações farmacológicas, dentre as quais: antimutagênicas, apoptóticas específicas, antioncológicas (devido à forte interação e mecanismo de ação com o DNA), podendo-se encontrar possíveis novos fármacos para o tratamento da AIDS, da hepatite, malária e mesmo para o tratamento antifúngico e antibacteriano. São excelentes protótipos para o desenvolvimento de agentes farmacológicos, além de possuírem sinergismo (de funcionalização) com outras drogas, favorecem a obtenção de novos agentes antineoplásicos mistos. São facilmente selecionáveis e monitoráveis em ensaios biológicos in vitro e in vivo. A potencialidade destes novos agentes é notável, pois alguns deles já mostraram atividade antitumoral no nível de 10'8 mol L'1. Dentre os compostos investigados, há diversos que já foram sintetizados anteriormente e na presente invenção métodos sintéticos diferentes e inovadores - com o uso de metodologias sintéticas e reações com condições novas e mais eficientes, com a utilização de solventes que melhoram os rendimentos e aceleram as reações para tempos reacionais menores.

A presente invenção justamente mostra a aplicabilidade de compostos híbrido-mistos entre análogos do tipo amina da mecloretamina e derivados funcionalizados com bioisósteros da amidina, particularmente os derivados tipo tioureído e ureído substituídos. O grupo S-tioureído, por sua vez é o de mais fácil preparação - quando comparado às amidinas correspondentes - e também possui alta afinidade com DNA, demonstrando elevado potencial como agente antitumoral. De fato, o grupo S-tioureído não é comumente estudado do ponto de vista farmacológico, pois é usado como intermediário sintético para obtenção de grupos tióis ou mercaptanas (RSH).

Uma das metodologias de síntese de tioureídos semelhantes foi relatada na patente US2463998. No entanto, a reação dura cerca de 20 horas, o solvente utilizado foi etanol em temperatura de ebulição e o rendimento reacional não foi relatado.

O artigo publicado por Worrell descreve uma metodologia de síntese clássica de tioureídos utilizando como solvente o etanol com rendimento de 84%. A pesquisa mostrou que os melhores rendimentos são obtidos a partir de sínteses mais demoradas, na ordem de 8 a 20 horas, ou realizadas em altas temperaturas. O método de preparação descrito na presente invenção (com uso de isopropanol ou n-butanol como solvente por exemplo) oferece melhores rendimentos em um tempo menor, de no máximo 6 horas de reação e irradiação com microondas o tempo de reação é ainda menor chegando a 2 horas (Worrell, J.H.; Jackman, T.A. Inor. Chem., v.17, p.12; 1978).

O pedido de patente US3844788 também descreve um processo de preparação de tioureídos semelhantes utilizando como solvente tetrahidrofurano e tetrametileno sulfona em refluxo durante a noite.

Os precursores dendriméricos mostrados nesta invenção possuem baixa toxidez e apresentam aplicações farmacológicas, dentre as quais: antimutagênicas, apoptóticas específicas, antioncológicas (devido à forte interação e mecanismo de ação com o DNA), podendo-se encontrar possíveis novos fármacos para o tratamento da AIDS, da hepatite, malária e mesmo para o tratamento antifúngico e antibacteriano. São excelentes protótipos para o desenvolvimento de agentes farmacológicos inéditos, além de possuírem sinergismo (de funcionalização) com outras drogas, favorecem a obtenção de novos agentes antineoplásicos mistos. São facilmente selecionáveis e monitoráveis em ensaios biológicos in vitro e in vivo. A potencialidade destes novos agentes é notável, pois alguns deles já mostraram atividade antitumoral no nível de 10'8 mol.L'1.

Entretanto, a presente invenção é distinta de todos os documentos supracitados, uma vez que descreve a obtenção de novos precursores dendriméricos, bem como métodos sintéticos diferentes e inovadores. O uso de metodologias sintéticas e reações com condições novas e mais eficientes, através da utilização de solventes, melhoraram os rendimentos e/ou aceleraram as reações.

LISTA DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a fórmula estrutural genérica dos precursores dendriméricos tris- e tetra-funcionalizados, representados respectivamente por PD2 e PD3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os precursores dendriméricos, revelados na Figura 1, tris- e tetra- funcionalizados propostos neste pedido de patente são representados genérica e respectivamente por PD2 e PD3, e estão definidos nas páginas 6 e 7.

A identificação dos compostos foi feita utilizando RMN de 1H, RMN de 13C, IV e espectrometria de massas.

A determinação estrutural por espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e de carbono-13 (RMN de 13C) foram feitas em espectrofotômetro de 200 MHz. Os deslocamentos químicos (δ) foram relatados em partes por milhão em relação ao tetrametilsilano (TMS), usado como padrão interno. Os solventes utilizados foram a água deuterada, o deuteroclorofórmio (CDCI3) e o dimetilsulfóxido (DMSO).

Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos em um espectrofotômetro interferométrico, na faixa de 400 a 4000 cm‘1. Os espectros em filme líquido foram obtidos utilizando-se janelas de NaCl ou celas de NaCl de 0,025 mm de espessura e para sólidos, foram obtidos na forma de pastilhas de KBr. Os pontos de fusão foram determinados em aparelho Fisher-Jons. O processo proposto na presente tecnologia visa à preparação de compostos dendriméricos, conforme mostrados na Figura 1 e pode ser melhor compreendido com os exemplos a seguir, não limitantes:

EXEMPLO 1 - Preparação de tris(2-tioureídoetil)amina (PD2F1, em que n= 0)

Em um balão tritubulado, dotado de agitação magnética e condensador para refluxo, contendo de 0,5 a 1,50 g de trimustina (tris(2-cloroetil)amina) e de 30 a 60 mL de álcool isopropílico; adicionou-se de 0,539 a 1,584 g de tiouréia. A solução resultante permaneceu sob refluxo por 5 h. A mistura foi esfriada até temperatura ambiente e levada à geladeira. Filtrou-se o sólido branco formado e após secagem com pressão reduzida em dessecador dotado de pentóxido de fósforo, obteve-se em média 55% de rendimento do produto desejado. A fórmula molecular obtida foi C9H20N7S3.4HCI. Tabela 1. Dados de RMN de 1H de PD2F1

Tabela 2. Dados de RMN de 13C de PD2F1

Tabela 3. Dados de Infravermelho (IV) de PD2F1

EXEMPLO 2- Preparação de tris(2-(1-metil-2-tioureídoetil)amina (PD2F2, em que n= 0)

Reagiu-se de 0,257 a 0,753 g de trimustina com 0,31 a 0,926 g de 1- metil-2-tiouréia em 15 a 45mL de álcool etílico. Após refluxo por 5h, adicionou- se de 15 a 45 ml_ de acetato de etila. Filtração e secagem à pressão reduzida, levou a um sólido branco, com média de 55% de rendimento. A fórmula molecular obtida foi C12H27N7S3.4HCI. Tabela 4. Dados de RMN de 1H de PD2F2

Tabela5,.Dados de RMN de 13c de PD2F2

Tabela 6. Dados de Infravermelho (IV) de PD2F2

EXEMPLO 3- Preparação de tris(2-(1,3-dimetil)-tioureídoetil)amina (PD2F3, em que n= 0)

Reagiu-se de 0,649 a 1,946 g de 1,3-dimetil-2-tiouréia com 0,500 a 10 1,500 g de trimustina em 15 a 45mL de isopropanol e com adição de 0,104 a0,311g de iodeto de potássio. Após refluxo por 4 h a mistura foi concentrada e adicionou-se de 15 a 45 mL de acetato de etila. Filtração a pressão reduzida e secagem levou a um óleo extremamente viscoso de coloração branca, com média de 83% de rendimento. A fórmula molecular encontrada foi C15H33N7S3.15 4HCI. Tabela 7. Dados de RMN de 1H de PD2F3

Tabela 8. Dados de RMN de 13C de PD2F3

Tabela 9. Dados de Infravermelho (IV) de PD2F3

EXEMPLO 4-Preparação de N,N,N’,N’- tetrakis (2-tioureidoetil) etilenodiamina (PD3F1, em que n= m= 0)

Reagiu-se de 0,491 a 1,473 g (6,45 a 19,35 mmol) de tiouréia com 0,500 a 1,500 g de N,N,N’,N’-tetrakis(2-cloroetil)etilenodiamina em 25 a 75mL de 10 isopropanol sob refluxo por 4 h. Após o resfriamento da mistura, obteve-se um sólido que foi retirado por filtração e a solução gerada foi concentrada a pressão reduzida. Após evaporação, obteve-se um sólido alaranjado, com média de 61% de rendimento. A fórmula molecular obtida foi C14H32N10S4. Tabela 10. Dados de RMN de 1H de PD3F1

Tabela 11. Dados de RMN de 13C de PD3F1 

Tabela 12. Dados de Infravermelho (IV) de PD3F1

EXEMPLO 5- Preparação da N,N,N’,N’-tetrakis(2-1,3-dimetil-tioureido- etil)etileno-diamina (PD3F3, em que n= m= 0)

Reagiu-se de 0,671 a 2,012 g (6,435 a 19,305 mmol) de 1,3-dimetil-2- tiouréia com 0,500 a 1,500 g (1,61 a 4,83 mmol) de N,N,N’,N’-tetrakis-2- cloroetil-etilenodiamina em 15 a 45mL de isopropanol. Após refluxo por 6 h a solução foi resfriada, filtrada e concentrada, obtendo um óleo amarelo escuro, com média de 80% de rendimento. A fórmula molecular obtida foi10 C18H4ONIOS4.4HCI. Tabela 13. Dados de RMN de 1H de PD3F3

Tabela 14. Dados de RMN de 13C de PD3F3

Tabela 15. Dados de Infravermelho (IV) de PD3F3

EXEMPLO 6 - Preparação de N,N,N’,N’-tetrakisamidino-N-acetil-L-cisteinato)- )etileno-diamina (PD2F, em que n= 0)

Em um balão tritubulado, dotado de condensador para refluxo e agitação magnética, colocou-se de 0,344 a 1,031 g de 3,3-tiodipropionitrila, de 10 a 30 mL de metanol anidro e de 1,6 a 3,72 g de N-acetil-L-cistefna. Após dissolução, acrescentou-se de 0,505 a 1,515 g de acetato de amónio e deixou-se sob 10 refluxo com agitação magnética durante 14h. Adicionou-se de 10 a 30 mL de acetona, obtendo-se um sólido que foi filtrado, parcialmente secado à pressão reduzida e secado totalmente em dessecador sob pressão reduzida na presença de pentóxido de fósforo. Obteve-se um sólido laranja com média de 96% de rendimento e fórmula molecular igual a C16H32N6O6S3. Tabela 16. Dados de RMN de 1H de PD2F7

Tabela 17. Dados de RMN de 13C de PD2F7

Tabela 18. Dados de Infravermelho (IV) de PD2F7

EXEMPLO 7 - Avaliação de Atividade Antifúngica

Os compostos PD2F1, PD2F2-Me, PD3F1, PD3F2-Me, PD3F3-Me e PD3F7, em que n=m= 0 foram submetidos a ensaios antifúngicos.

Os microorganismos que foram utilizados nos ensaios para determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) sobre microorganismos ATCC (American Type Culture Collectionou ATCC): Candida albicans (ATCC 18804); Candida glabrata (ATCC 2001); Candida krusei (ATCC 200298); Candida parapsilosis (ATCC 22019) e Cryptococcus neoformans (ATCC 32608); Sporothrix schenckii (ATCC 10212). Foi utilizado o seguinte microorganismo isolado clinicamente: Candida dubliniensis (CD28).

Para a determinação da CIM foram utilizadas placas de Elisa com 96 poços. Esses foram preenchidos com meio RPMI 1640 como controle negativo de crescimento da levedura e controle de esterelidade. Como controle positivo, foi utilizado RPMI 1640 contendo inóculo da levedura correspondente ao ensaio. O crescimento de microorganismos mostrou a viabilidade da cultura usada e seu crescimento foi comparado visualmente ao crescimento verificado nos poços referentes às diferentes concentrações testadas. O controle negativo não evidenciou o crescimento de microorganismos. Foram realizadas duplicatas das concentrações para os compostos sintetizados e os antifúngicos utilizados como controle foram Anfotericina B (AMB) e Fluconazol (FLC).

Os compostos foram testados em uma concentração que variou de 32 a 256 μg/mL em microorganismos que, por sua vez, foram incubados a 35 °C.

Considerou-se que as CIMs como a menor concentração do composto testado ou antifúngico que inibiu 80 a 100% o crescimento do microorganismo em relação ao controle de crescimento após a incubação.

Para avaliar a atividade fungicida, usou-se uma placa de Petri, onde nela foram adicionados 65,0 g ASD dissolvidos em 1,0 L de água deionizada.

Após determinação da CIM, efetuou-se uma transferência de 10 μL das soluções inoculadas presentes na placa de Elisa para uma de Petri contendo ASD. Foram aguardados cerca de 15 minutos até que o RPMI do subcultivo evaporasse e levou-se a placa à estufa de 35°C com a finalidade de determinar a concentração fungicida mínima (CFM ) após 24 h de cultivo.

Com os testes observou-se que o derivado tris-tioureido PD2F1(0) foi o mais ativo contra candidíase (Candida albicans e C. glabrata) em faixa de concentração inibitória mínima (CIM) de 0,49 μg/mL. O derivado P2F2-Me(0) mostrou-se o composto com mais amplo espectro de ação, pois todos os fungos testados foram susceptíveis em CIM de 250 μg/mL. Os derivados PD3- F2-Me(0), PD3F3-Me(0) e PD3F7(0) foram ativos contra C. albicans, C. glabrata, C. krusei e Cryptococcus neoformans) com CIM na faixa de 125-250 μg/mL, destacando-se que PD3F7(0) foi ativo também contra C. parapsolisis.

Para controle positivo dos ensaios, não se utilizou nenhum antineoplásico. Em cada micro placa de 96 poços, utilizou-se como branco o meio RPMI 1640 a 5 % v/v de SFB e MTT.

EXEMPLO 8 - Estudo da Atividade Antitumoral

Os compostos PD2F1, PD2F2-Me, PD3F1, PD3F2-Me, PD3F3-Me e PD3F7, em que n=m= 0 foram submetidos a ensaios farmacológicos de citotoxicidade.

Para isso, as células foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 a 5 % v/v de soro fetal bovino (SFB) e incubadas em atmosfera úmida com 2,5 % de CO2, ausência de luz e à temperatura de 37 °C. Suspensões celulares foram distribuídas em micro placas de 96 cavidades contendo 1000 células/poçoApós 48 h foram adicionados os compostos, dissolvidos em DMSO, nas concentrações de 10'7 a 10’4 mol/mL. O DMSO utilizado foi 1 % e este não afetou a metabolização celular na concentração utilizada. O MTT foi adicionado 4 h antes das leituras (0,05 mg/cavidade) sendo estas realizadas cinco dias após a adição dos compostos.

As leituras foram realizadas em um Leitor de Elisa, a 600 nm. Antes da adição do MTT, o meio RPMI 1640 a 5 % de v/v de soro fetal bovino (SFB) foi trocado para se evitar qualquer interação entre os compostos analisados e o MTT. Os cristais de formazana formados, devido à metabolização do MTT, são insolúveis em meio aquoso e por isso, foram solubilizados em 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), antes das leituras. Para controle positivo dos ensaios, não se utilizou nenhum antineoplásico. Em cada micro placa de 96 poços, utilizou-se como branco o meio RPMI 1640 a 5 % v/v de SFB e MTT.

O crescimento celular foi acompanhado pelo controle negativo, composto apenas de células em meio RPM11640 a 5 % v/v de SFB. As médias aritméticas das densidades ópticas obtidas para os controles foram consideradas como 100 % de viabilidade celular. Sendo assim, as porcentagens de células viáveis foram calculadas pela fórmula: B/A x 100, onde A = média aritmética da densidade óptica do controle e B = densidade óptica na presença de amostra. A porcentagem de inibição da viabilidade celular foi determinada subtraindo-se de 100 % o valor.

No caso da avaliação da atividade citotóxica e antitumoral foram utilizadas contra algumas linhagens de células sadias (BHK) e de células cancerígenas do tipo carcinoma mamário murino (4T1(M)), adenocarcinoma de pulmão (A549), melanoma (MEWO) e glioma de rato (C6). Os compostos investigados mostraram-se pouco tóxicos para células saudáveis, células epitélio de rim de hamster bebê (BHK21) e quanto à atividade contra células cancerígenas estudadas todos os compostos estudados mostraram-se ativos com IC50 igual a 1,00.10’5 mol.L'1.

Claims (3)

1. Precursores Dendriméricos, caracterizados por compreenderem as seguintes fórmulas estruturais:

onde Y é: um substituinte tioureído (-SCNHNH2); um substituinte alquiltioureído (-SCNHNHR’); um substituinte N,N-dialquiltioreido (-SCNHNR2); ou um substituinte do grupo tioimidato (-C=NHSR; R=Me, Et, C6H5); e onde n ou m representam uma série homóloga do substituinte (-CH2-), variando de 0 a 5.

2. Precursores Dendriméricos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por apresentarem atividade antifúngica e antitumoral.

3. Uso dos precursores Dendriméricos definidos nas reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratamento antitumoral e antifúngico.

Images