CN114516842B - 一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法。本发明的热休克蛋白抑制剂是取代芳基脲亚胺基二芳基嘧啶类化合物，还包括该化合物药用盐、水合物及溶剂化物，其多晶或共晶，其同样生物功能的前体和衍生物。体外酶水平抗Hsp90活性实验结果显示，该小分子具有较强的结合干扰Hsp90的活性，由此引发Hsp90客户蛋白(如：肿瘤相关激酶)的降解，具有较低的细胞毒性，具有抗肿瘤抗病毒的应用前景。

Description

一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法。
背景技术
热休克蛋白(Hsp90)具有350多种高度多样化的HSP90客户蛋白1,2多为肿瘤生长发展信号通路中的蛋白激酶和转录因子3。Hsp90抑制剂可阻断肿瘤生长转移信号通路中的多个靶点，从多环节影响癌细胞生长，可降低单一抑制某一通路时肿瘤细胞易产生耐药性的风险。另外，Hsp90可激活一些HIV-1特异性的细胞转录因子，如NF-κB、NFAT和STAT5等，抑制Hsp90则可大大降低由这些因子所致基因表达，从而抑制HIV复发4。宿主细胞Hsp90可修复利托那韦-耐药性的HIV复制损伤5，抑制Hsp90可治疗干预HIV的复制6。因此，开发新型Hsp90抑制剂对抗肿瘤，抗HIV-1的药物研发也具有重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种效果优异的热休克蛋白(Hsp90)抑制剂及其制备方法。
本发明提供的Hsp90抑制剂，是一种取代芳基脲亚胺基二芳基嘧啶类衍生物，其结构式为(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003509581570000011
本发明提供的Hsp90抑制剂，还包含化合物(Ⅰ)的药用盐，水合物及溶剂化物，其多晶或共晶，其同样生物功能的前体和衍生物。
本发明还提供所述Hsp90抑制剂的制备方法，其反应路线为：
Figure BDA0003509581570000012
本发明以2-氯苯基-2-(4-氰基苯氨基)-嘧啶酮(化合物II)与N-(2-甲氧基苯基)氨基脲(化合物III)为原料，在碱的作用下进行缩合反应，得目标化合物I；其中：
使用的溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种或者多种；
使用的催化剂为下述无机酸之一种：浓盐酸、烯盐酸等；
所述的化合物II、化合物III与碱的摩尔比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.3)，优选1:1:1.1；
反应温度为80～100℃，优选反应温度为85～90℃；
反应时间为4～8h，优选反应时间为5-6h。
本发明的提供的化合物(Ⅰ)，经1H NMR和13C NMR等波谱分析方法鉴定，部分化合物经ESI-MS验证。对目标化合物(Ⅰ)进行了体外细胞水平和酶水平的抗HIV-1活性筛选实验。细胞水平活性测试结果表明，目标化合物(Ⅰ)对Hsp90结合的△Tm达到了3.25℃，表示化合物(Ⅰ)对该蛋白具有好的抑制活性，由此可对其多种客户蛋白产生抑制活性，具有潜在的抗肿瘤抗病毒的应用前景。
附图说明
图1为目标化合物I与Hsp90氮端结合部位之间的相互作用模拟。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步介绍本发明。
实施例1，目标化合物的制备
将N-(2-甲氧基苯基)氨基脲(III,1.5mmol)与2-氯苯基-2-(4-氰基苯氨基)-嘧啶酮(II,1.5mmol)溶于无水乙醇(10.0mL)中，加入催化剂浓盐酸(2～3滴)，升温至(80～90℃)，并保持回流5.5小时。反应过程中有淡黄色固体析出，薄层色谱显示反应完全，过滤，产物可用乙酸乙酯洗涤，得黄色固体为纯的目标化合物(产率69.4％，熔点235.3～236.7℃)，即2-氯苯基-2-(4-氰基苯氨基)-嘧啶-4-基酮-N-(2-甲氧基苯基)缩氨基脲(I)。1H NMRδ:10.35(s,1H,Ph-NH-pyrimidine),10.21(s,1H,＝N-NH-CO),8.94(s,1H,CO-NH-Ph”),8.61(d,J＝5.2Hz,1H,pyrimidine CH6),7.83(d,J＝4.9Hz,1H,pyrimidine CH5),7.75–7.68(m,2H,Ph’H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H,Ph’H),7.43(t,J＝9.2Hz,3H,PhH3,5+Ph’H),7.37(d,J＝8.6Hz,2H,PhH2,6),7.21-7.18(m,2H,Ph”H4,5),7.07(d,J＝8.0Hz,1H,Ph”H6),6.60(d,J＝8.0Hz,1H,Ph”H3),2.49(s,3H,CH3)ppm；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:162.88,160.06,159.30,158.83,151.85,145.17,144.00,140.42,133.11,132.96,131.84,131.59,131.50,130.28,129.99,128.47,119.98,118.36,112.13,109.20,108.66,105.67,102.56,55.47ppm。
实施例2，目标化合物的合成条件研究
目标化合物是含有亚氨基的缩氨基脲类席夫碱(Schiff base)，由含有羰基的中间体Oxo-CH2-DAPYs与取代氨基脲反应消去一分子水制得，反应历程涉及加成、重排和消除。经典席夫碱反应过程中，为加快反应速度并提高产率，可以加入酸性催化剂，或加入除水剂以除去反应过程中产生的水，也可通过延长反应时间，或升高反应温度等途径。合成目标化合物所用缩合反应形成席夫碱的机理如下：
Figure BDA0003509581570000031
常见除水剂有分子筛、无水硫酸钠等，酸性催化剂一般为硫酸、盐酸、冰醋酸等7。本发明对席夫碱反应的条件进行了探讨，如表1所示，采用常用催化剂醋酸时，反应5个小时不能得到目标产物，加长反应时间到24小时，原料完全转化，反应体系很杂，得到目标产物产率在5％左右。而以硫酸做催化剂，反应5小时，结果与以醋酸作催化剂反应时间为24小时的反应体系相似。而以盐酸为催化剂，5小时后原料完全转化，以80％的收率得到目标产物。
表1.缩合反应的条件探索
Figure BDA0003509581570000032
采用合理可行的缩合反应合成了目标化合物。对目标化合物以Thermal Shift方法进行了Hsp90的生物活性测试，结果发现其中一个目标化合物I与Hsp90的△Tm值达到3.25℃，活性测试表明目标化合物作用于HIV-1RT，具有低微摩尔水平的抗HIV-1活性。分子对接研究结果阐释了该化合物与热休克蛋白N端活性口袋的可能的结合模式。
实施例3，目标化合物I对Hsp90抑制活性测试
对目标化合物I针对Hsp90进行了Thermal shift实验。实验所用空白(Control)样品荧光染料+DMSO+缓冲液，对照(Reference)样品为蛋白+荧光染料+DMSO+缓冲液，实验(Sample)样品：蛋白+荧光染料+抑制剂+缓冲液。仪器为实时定量荧光PCR。所用数据分析软件：蛋白热熔软件。
测试原理和方法如下：蛋白质对外界温度敏感，加热会引起蛋白质变性。蛋白质的热稳定性是指在温度升高和其它因素的影响下保持生物活性的能力，是衡量蛋白稳定性的重要指标。TSA是检测蛋白热稳定性的一种方法。在TSA中，蛋白质随外界温度升高而渐渐升温，当温度大于临界温度时，蛋白质变性，结构发生伸展、去折叠，发生变性的温度即变性温度(Tm)或熔化温度。Tm值越高，热稳定性越好。变性后的蛋白质结构伸展，暴露出疏水区域，与溶液中的荧光染料结合。由于采用的荧光染料在接触水时荧光很弱，而在接触疏水环境时会被激发产生荧光信号，荧光染料的荧光强度的变化反应了蛋白质的变性情况。化合物与蛋白质的结合后使蛋白质更加稳定，使Tm值升高。以Tm2(加入化合物)减去Tm1(未加入化合物)，得到△Tm值，△Tm值越高，蛋白与化合物结合越强。一般可认为△Tm超过2℃时，蛋白与化合物有结合作用。该方法利用荧光实时定量PCR仪运行熔解曲线，对小分子配体进行筛选。每个目的蛋白在一定条件下(缓冲液、pH、盐离子强度)有一个相对恒定的熔解温度(Tm)。
具体实验操作过程如下：蛋白质加缓冲液溶解，小分子配体用DMSO溶解。蛋白质分别与小分子配体、荧光染料混合作为实验样品，并设置空白及对照样品，4个重复。蛋白质与小分子配体的摩尔数之比为1:3～1:5。样品分别加入96孔板，升温策略为25～95℃，升温1℃/min，测定Tm与△Tm值。目标化合物的Hsp90活性筛选结果显示了Hsp90与化合物I之间的相互作用的△Tm达到了3.25℃。
实施例4，目标化合物I对Hsp90相互作用分子模拟预测
用Sybyl软件的Surflex-Dock模块进行分子对接，研究了化合物I与Hsp90的结合模式，采用Hsp90复合晶体(1UY6)。分子模拟结果如图1所示。化合物I的嘧啶环和与之靠近的Phe138上的苯环处于同一平面，形成π-π堆积作用。化合物I右翼芳环上的氰基可与Asn51形成氢键。化合物I与Hsp90的相互作用表明，化合物I可用作Hsp90抑制剂。该发现可对后续以化合物I进行结构优化以开发新型Hsp90抑制剂提供依据。
总之，通过热休克蛋白(Hsp90)酶水平的实验结果表明，目标化合物对Hsp90具有较为明显的相互作用，可作为伴侣蛋白调节剂的形式，用于抗肿瘤疾病药物的协助治疗。
本发明不限于上述实施例。
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Claims (3)

1.一种Hsp90抑制剂，其特征在于，是取代芳基脲亚胺基二芳基嘧啶类衍生物，其结构式为(Ⅰ)所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.如权利要求1所述的Hsp90抑制剂的制备方法，其特征在于，以2-氯苯基-2-(4-氰基苯氨基)-嘧啶酮(化合物II)与N-(2-甲氧基苯基)氨基脲(化合物III)为原料，有溶剂和催化剂存在条件下，经碱的作用，进行缩合反应，得目标化合物I；反应路线为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中：
使用的溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种或者多种；
使用的催化剂为下述无机酸之一种：浓盐酸、稀盐酸；
所述的化合物II、化合物III与碱的摩尔比为1：（0.8-1.2）：（0.8-1.3）；
反应温度为80~100 ℃；
反应时间为4~8h。
3.一种取代芳基脲亚胺基二芳基嘧啶类衍生物在制备Hsp90抑制剂中的应用，所述取代芳基脲亚胺基二芳基嘧啶类衍生物结构式为(Ⅰ)所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
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