CN108033913A - 一种二氢吡唑啉衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN108033913A CN201711139900.4A CN201711139900A CN108033913A CN 108033913 A CN108033913 A CN 108033913A CN 201711139900 A CN201711139900 A CN 201711139900A CN 108033913 A CN108033913 A CN 108033913A
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盘鹰
郑锦鸿
王红
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Shantou University Medical College
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/06—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member

Abstract

本发明涉及一种二氢吡唑啉衍生物及其制备方法和应用。所述衍生物的结构式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：，其中，R1为氢或C1‑5烷氧基；R2为氢、卤素或C1‑5烷氧基；R3为C1‑5烷氧基；R4为氢或羟基；R5为氢、卤素、硝基、C1‑5烷基或C1‑5烷氧基；R6为卤素。本发明提供的二氢吡唑啉衍生物具有更好的生物活性，更高的选择性、更低的毒性，对人卵巢癌细胞（A2780）、宫颈癌细胞（Hela）以及肝癌细胞（HepG‑2）有明显的抑制作用，表现出具有较好的抗肿瘤效果；并且对正常的小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）有较低的抑制，可广泛应用于制备抗肿瘤药物中。

Description

一种二氢吡唑啉衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学领域，更具体地，涉及一种二氢吡唑啉衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，含吡唑啉环化合物在药物研究和生物学等方面显示出越来越重要的作用，其中含吡唑啉的化合物具有较强的生理活性，尤其受到研究者的重视。
吡唑是一类重要的杂环化合物，广泛分布在自然界中。比如含吡唑环的安替吡啉具有镇痛消炎及退热作用，自其被发现以来，该类化合物因其具有高效，低毒，和其环上取代基的多方位变换而在药物领域中得到广泛应用。研究发现吡唑类化合物具有消炎，止痛，抑菌，杀菌，抗高血糖，抗癌，抗凝血剂等药理活性。近年来，许多新型吡唑类医药相继商品化，对吡唑类化合物的深入研究已成为当今药物设计合成研究的热点之一。
2H吡唑是极为重要的含氮的五元杂环化合物，它具有较强的生物活性，比如抗肿瘤，抗菌，抗病毒，抗真菌，杀虫，抗结核等活性。它是一个具有各种药理特性的结构性存在亚基，存在普遍药用生物活性的活性先导化合物。更为重要的是：因为2H吡唑多为手性的，导致环上的取代及分子的构象具有更大的多变性，具有更好的生物活性潜在性。2H吡唑类化合物在有机合成和其他领域中的应用越来越广泛，且手性2H吡唑类化合物具有很多生物及药理活性，促进了药物的巨大发展，为以后的药物开发研究提供了很大的研究空间，发展前景非常广阔。构建具有2H吡唑结构的杂环化合物具有重要的意义，是近几年来被药化关注的热点。
因此，开发一种具有更好的生物活性的二氢吡唑啉衍生物具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的2H吡唑类化合物的活性不够高，其应用受到限制的缺陷，提供一种二氢吡唑啉衍生物。本发明提供的二氢吡唑啉衍生物具有更好的生物活性，更高的选择性、更低的毒性，具有较好的抗肿瘤效果，可广泛应用于制备抗肿瘤药物中。
本发明的另一目的在于提供上述二氢吡唑啉衍生物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述二氢吡唑啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种二氢吡唑啉衍生物，所述衍生物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：
其中，R1为氢或C1-5烷氧基；R2为氢、卤素或C1-5烷氧基；R3为C1-5烷氧基；R4为氢或羟基；R5为氢、卤素、硝基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；R6为卤素。
本发明通过在苯环对位引入甲氧基或在苯环对位和间位分别引入羟基和乙氧基，R6引入卤素，设计得到的二氢吡唑啉衍生物具有更好的生物活性，更高的选择性、更低的毒性，具有较好的抗肿瘤效果，可广泛应用于制备抗肿瘤药物中。
优选地，所述C1-5烷氧基为C1-5直链烷氧基。更为优选地，所述C1-5烷氧基为甲氧基或乙氧基。
优选地，所述C1-5烷基为C1-5直链烷基。更为优选地，所述C1-5烷基为甲基。
优选地，所述卤素为F、Cl、Br或I。
优选地，所述R2为氢、甲氧基或溴。
优选地，所述R5为氢、卤素、硝基、甲基或甲氧基。
优选地，所述R6为F。
上述二氢吡唑啉衍生物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的取代苯甲醛、式(Ⅴ)所示的取代苯乙酮、碱溶液和有机溶剂混合，在25～36℃温度下，搅拌、反应24～72h后，过滤、洗涤、干燥得中间体1或中间体2，所述取代苯甲醛和所述取代苯乙酮的摩尔比为1:1～1.5；
S2：将中间体1或中间体2、取代苯盐酸盐和有机溶剂混合，搅拌、加热回流、过滤、纯化即得所述二氢吡唑啉衍生物；
所述碱溶液为无机强碱溶液，所述有机溶剂为醇溶液。
本发明提供的制备方法可成功制备得到上述二氢吡唑啉衍生物，制备方法简单，产率高。
优选地，所述无机强碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液；所述醇溶液为甲醇溶液或乙醇溶液。
优选地，S2中通过TLC跟踪反应来确定加热回流的时间。
将TLC跟踪反应应用到本发明中，可简便地判断取代苯甲醛和取代苯乙酮是否被消耗完全，从而判断反应是否结束。
常用的纯化手段均可应用于本发明中，优选地，S2中选用层析或重结晶的方法进行纯化。
上述二氢吡唑啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围内。
优选地，所述二氢吡唑啉衍生物在制备抗卵巢癌药物、抗宫颈癌药物或抗肝癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的二氢吡唑啉衍生物具有更好的生物活性，对人卵巢癌细胞(A2780)、宫颈癌细胞(Hela)以及肝癌细胞(HepG-2)有明显的抑制作用，表现出具有较好的抗肿瘤效果；并且对正常的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)有较低的抑制，可广泛应用于制备抗肿瘤药物中。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1：化合物1
本实施例提供的化合物1为：1-(4-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物1的制备方法如下：
(1)中间体1-1的制备：
将取代苯甲醛：(1.96g)、等摩尔数的取代苯乙酮(1.38g)、10％NaOH溶液(3gNaOH溶于10mL水中)和甲醇溶液(5mL)混合，在25℃温度下，搅拌、反应24h后，过滤、洗涤、干燥，乙醇重结晶得中间体1-1
(2)化合物1的制备
在搅拌下依次将合成的中间体1-1(0.25g,0.0008mol)，4-氟苯肼盐酸盐(0.19g,0.001mol)，乙醇(20mL)加入到50mL的圆底烧瓶中，加热回流搅拌反应12h，TLC跟踪反应(展开剂V石油醚：V乙酸乙酯＝2:1)，反应结束后，将反应液静置，有沉淀析出，过滤，固体用乙醇洗涤，最后真空干燥，将得到的固体用无水乙醇和丙酮重结晶提纯得到纯的目标化合物。
浅黄色固体，产率50.75％，mp:182.2-182.3℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.79(m,2H,Ar-H),7.27(m,2H,Ar-H),7.03(m,4H,Ar-H),6.63(s,2H,Ar-H),5.29(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.89(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis ofpyrazoline),3.15(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.71(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):425.0[M+H]+。
实施例2：化合物2
本实施例提供的化合物2为：1-(4-氟苯基)-3-(4-氯苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物2的制备方法除取代苯乙酮的R5为Cl外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
白色晶体，产率75.76％，mp:173.6-173.8℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.76(d,2H,J＝12.0Hz,Ar-H),7.49(d,2H,J＝12.9Hz,Ar-H),7.04(m,4H,Ar-H),6.62(s,2H,Ar-H),5.33(dd,1H,J＝8.0 and 4.0Hz,5-H of pyrazoline),3.88(dd,1H,J＝12.0 and12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.15(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans ofpyrazoline),3.70(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3).
MS(ESI)(m/z):441.1,442.2[M+H]+。
实施例3：化合物3
本实施例提供的化合物3为：1-(4-氟苯基)-3-(4-溴苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物3的制备方法除取代苯乙酮的R5为Br外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
浅黄色晶体，产率93.75％，mp:177.2-177.4℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.69(d,2H,J＝12.0Hz,Ar-H),7.62(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.04(m,4H,Ar-H),6.62(s,2H,Ar-H),5.33(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.88(dd,1H,J＝12.0 and12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.15(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans ofpyrazoline),3.70(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3).
MS(ESI)(m/z):486.1,487.2[M+H]+。
实施例4：化合物4
本实施例提供的化合物4为：1-(4-氟苯基)-3-(4-碘苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物3的制备方法除取代苯乙酮的R5为I外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
黄色固体，产率80.95％，mp:172.9-174.5℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.79(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.53(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.05(m,4H,Ar-H),6.62(s,2H,Ar-H),5.32(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.87(dd,1H,J＝12.0 and12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.13(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans ofpyrazoline),3.70(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):533.0,534.0[M+H]+。
实施例5：化合物5
本实施例提供的化合物5为：1-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物5的制备方法除取代苯乙酮的R5为甲氧基外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
粉红色晶体，产率60.15％，mp:149.5-150.7℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.69(d,2H,J＝12.0Hz,Ar-H),7.01(m,6H,Ar-H),6.63(s,2H,Ar-H),5.23(dd,1H,J＝8.0and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.87(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis ofpyrazoline),3.11(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.80(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):437.0[M+H]+。
实施例6：化合物6
本实施例提供的化合物6为：1-(4-氟苯基)-3-(4-甲基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物6的制备方法除取代苯乙酮的R5为甲基外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
黄色晶体，产率44.58％，mp:153.0-153.8℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.64(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.24(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.03(m,6H,Ar-H),6.63(s,2H,Ar-H),5.26(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.87(dd,1H,J＝12.0 and12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.12(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans ofpyrazoline),3.70(s,6H,OCH3),3.63(s,3H,OCH3),2.34(s,3H,CH3).MS(ESI)(m/z):421.3[M+H]+。
实施例7：化合物7
本实施例提供的化合物7为：1-(4-氟苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物7的制备方法除取代苯乙酮的R5为硝基外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例1一致。最终得到：
橙色固体，产率86.76％，mp:203.3-203.4℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.26(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.96(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.09(m,4H,Ar-H),6.62(s,2H,Ar-H),5.49(dd,J＝8.0 and 4.0Hz,5-H of pyrazoline),3.95(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.24(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.70(s,6H,OCH3),3.62(s,3H,OCH3).
MS(ESI)(m/z):452.2[M+H]+。
实施例8：化合物8
本实施例提供的化合物8为：1-(4-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-5-(2,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物8的制备方法如下：
(1)中间体1-2的制备：
将取代苯甲醛：(1.96g)、等摩尔的取代苯乙酮(1.38g)、10％NaOH溶液(3gNaOH溶于10mL水中)和乙醇溶液(5mL)混合，在36℃温度下，搅拌、反应72h后，过滤、洗涤、干燥，乙醇重结晶得中间体1-2
(2)化合物8的制备
在搅拌下依次将合成的中间体1-2(0.25g,0.0008mol)，4-氟苯肼盐酸盐(0.19g,0.001mol)，甲醇(20mL)加入到50mL的圆底烧瓶中，加热回流搅拌反应12h，TLC跟踪反应(展开剂V石油醚：V乙酸乙酯＝2:1)，反应结束后，将反应液静置，有沉淀析出，过滤，固体用乙醇洗涤，最后真空干燥，将得到的固体用无水乙醇和丙酮重结晶提纯得到纯的目标化合物。
白色固体，产率37.31％，mp:149.6-151.5℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.79(m,2H,Ar-H),7.26(t,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.02(t,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),6.95(m,2H,Ar-H),6.76(s,1H,Ar-H),6.59(s,1H,Ar-H),5.47(dd,J＝4.0 and 4.0Hz,5-H ofpyrazoline),3.85(dd,1H,J＝16.0 and 16.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.04(dd,1H,J＝8.0and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.86(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.50(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):425.1[M+H]+。
实施例9：化合物9
本实施例提供的化合物9为：1-(4-氟苯基)-3-(4-氯苯基)-5-(2,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物9的制备方法除取代苯乙酮的R5为Cl外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例8一致。最终得到：
浅黄色固体，产率61.93％,mp:158.2-159.6℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.75(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.48(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.17(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.02(m,2H,Ar-H),6.96(m,1H,Ar-H),6.76(s,1H,Ar-H),6.59(s,1H,Ar-H),5.50(dd,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.85(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis ofpyrazoline),3.04(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.85(s,3H,OCH3),3.78(s,3H,OCH3),3.50(s,3H,OCH3).
MS(ESI)(m/z):441.1,443.2[M+H]+。
实施例10：化合物10
本实施例提供的化合物10为：1-(4-氟苯基)-3-(4-溴苯基)-5-(2,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物10的制备方法除取代苯乙酮的R5为Br外，其余原料、用量及操作步骤均与实施例7一致。最终得到：
白色固体，产率56.25％,mp:154.1-154.4℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.68(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.61(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.03(t,2H,J＝12.0 and 8.0Hz,Ar-H),6.96(m,2H,Ar-H),6.76(s,1H,Ar-H),6.59(s,1H,Ar-H),5.50(dd,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),3.84(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.03(dd,1H,J＝4.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.85(s,3H,OCH3),3.78(s,3H,OCH3),3.50(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):485.2,487.1[M+H]+。
实施例11:化合物11
本实施例提供的化合物11为1-(4-氟苯基)-3-(2-羟苯基)-5-(3-溴-4-羟基-5-乙氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物11的制备方法如下：
(1)中间体2-1的制备：
将取代苯甲醛：(4.9g)、等摩尔的取代苯乙酮(2.72g)、10％NaOH溶液(3gNaOH溶于10mL水中)和甲醇溶液(5mL)混合，在25℃温度下，搅拌、反应24h后，过滤、洗涤、干燥，丙酮重结晶得中间体2-1
(2)化合物11的制备
在搅拌下依次将合成的中间体2-1(0.25g,0.0008mol)，4-氟苯肼盐酸盐(0.19g,0.001mol)，乙醇(20mL)加入到50mL的圆底烧瓶中，加热回流搅拌反应12h，TLC跟踪反应(展开剂V石油醚：V乙酸乙酯＝2:1)，反应结束后，将反应液静置，有沉淀析出，过滤，固体用乙醇洗涤，最后真空干燥，将得到的固体用无水乙醇和丙酮重结晶提纯得到纯的目标化合物。
浅黄色晶体，产率26.19％，mp:189.2-192.2℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:10.45(s,1H,OH),10.16(s,1H,OH),7.43(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.28(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.16(t,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.08(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.01(m,1H,Ar-H),6.94(m,1H,Ar-H),5.28(dd,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H of pyrazoline),4.37(dd,1H,J＝4.0 and4.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.29(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans ofpyrazoline),3.98(q,2H,J＝4.0 and 12.0Hz,CH2),1.29(t,3H,J＝8.0Hz,CH3).MS(ESI)(m/z):471.0,473.0[M+H]+。
实施例12：化合物12
本实施例提供的化合物12为：1-(2-氟苯基)-3-(4-氟苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡唑啉，其结构式如下：
化合物1的制备方法如下：
(1)中间体1-3的制备：
将取代苯甲醛：(1.96g)、等摩尔数的取代苯乙酮(1.97g)、10％NaOH溶液(3gNaOH溶于10mL水中)和甲醇溶液(5mL)混合，在25℃温度下，搅拌、反应24h后，过滤、洗涤、干燥，乙醇重结晶得中间体1-3
(2)化合物12的制备
在搅拌下依次将合成的中间体1-3(0.25g,0.0008mol)，2-氟苯肼盐酸盐(0.19g,0.001mol)，乙醇(20mL)加入到50mL的圆底烧瓶中，加热回流搅拌反应12h，TLC跟踪反应(展开剂V石油醚：V乙酸乙酯＝2:1)，反应结束后，将反应液静置，有沉淀析出，过滤，固体用乙醇洗涤，最后真空干燥，将得到的固体用无水乙醇和丙酮重结晶提纯得到纯的目标化合物。
浅黄色固体，产率65.67％，mp:180.2-180.3℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.70(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.63(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.52(m,1H,Ar-H),7.07(m,2H,Ar-H),6.89(m,1H,Ar-H),6.47(s,2H,Ar-H),5.60(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,5-H ofpyrazoline),3.82(dd,1H,J＝12.0 and 12.0Hz,4-Hcis of pyrazoline),3.26(dd,1H,J＝8.0 and 8.0Hz,4-Htrans of pyrazoline),3.63(s,6H,OCH3),3.57(s,3H,OCH3).MS(ESI)(m/z):485.0,487.0[M+H]+。
性能测试：二氢吡唑啉衍生物体外抗肿瘤的活性研究
采用MTT[3-4(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定二氢吡唑啉衍生物对人肝癌细胞(HepG-2)，宫颈癌细胞(Hela)，卵巢癌细胞(A2780)以及正常的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)的半数抑制浓度(IC50值)。
(1)细胞培养：肿瘤细胞接种在含10％胎牛血清，100IU/mL青霉素G钠盐及100ug/mL硫酸链霉素的1640培养液中，正常细胞接种在含10％胎牛血清，100IU/mL青霉素G钠盐及100ug/mL硫酸链霉素的高糖DMEM培养液中，置于37℃，95％相对湿度，含5％CO2的培养箱中，传代3次后备用。
(2)实验药液的配制：将测试样品用DMSO溶解，配成储备液，DMSO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.1％。储备液保存于-20℃冰箱中备用。
(3)细胞接板：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为50000个mL-1，在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。
(4)加药：将测试药物按照最终浓度的浓度梯度(6.25μmol/L,12.5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,和2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)，分别加入到各个孔中，每孔加100μL，每个浓度设4个复孔。另外，每个浓度设阴性对照(等浓度DMSO)及空白本底(不加细胞)。将加药后的96孔板置于37℃，95％相对湿度，5％CO2培养箱中培养48h。阳性对照药的活性按照测试样品的方法测定。
(5)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT20μL(用生理盐水配成5mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10-12min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在595nm波长处检测各孔的吸光度(OD值)，每次试验平行两次，重复至少三次。
半数抑制浓度(IC50值)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。以下述方法计算细胞生长抑制率作为评价指标。
抑制率(％)＝[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)/(对照组OD均值-空白组OD均值)]x100％。根据细胞生长抑制率，以直线回归方法计算IC50值。
测得的IC50值见表1所示，结果表明本发明所述化合物在体外对这3种肿瘤细胞株均具有较强的抑制作用，对正常细胞具有较低的毒性，例如表1中的化合物1对宫颈癌细胞的IC50为18.71μM,对正常小鼠胚胎成纤维细胞的IC50为49.22μM，其选择指数为2.63(IF＝IC50NIH/3T3/IC50Hela)，因此本发明所述的二氢吡唑啉衍生物可用于制备抗癌的药物。
表1化合物对肿瘤细胞株和正常细胞生长的抑制作用(IC50值μmol/L)

Claims (10)

1.一种二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述衍生物的结构式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：
，
其中，R1为氢或C1-5烷氧基；R2为氢、卤素或C1-5烷氧基；R3为C1-5烷氧基；R4为氢或羟基；R5为氢、卤素、硝基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；R6为卤素。
2.根据权利要求1所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述C1-5烷氧基为C1-5直链烷氧基。
3.根据权利要求2所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述C1-5烷氧基为甲氧基或乙氧基。
4.根据权利要求1所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述C1-5烷基为直链烷基。
5.根据权利要求1所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述R2为氢、甲氧基或Br。
6.根据权利要求1所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述R5为氢、卤素、硝基、甲基或甲氧基。
7.根据权利要求1所述二氢吡唑啉衍生物，其特征在于，所述R6为F。
8.权利要求1~7任一所述二氢吡唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：将式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示的取代苯甲醛、式（Ⅴ）所示的取代苯乙酮、碱溶液和有机溶剂混合，在25~36℃温度下，搅拌、反应24~72 h后，过滤、洗涤、干燥得中间体1或中间体2，所述取代苯甲醛和所述取代苯乙酮的摩尔比为1:1~1.5；
S2：将中间体1或中间体2、取代苯盐酸盐和有机溶剂混合，搅拌、加热回流，然后过滤、纯化即得所述二氢吡唑啉衍生物；
所述碱溶液为无机强碱溶液，所述有机溶剂为醇溶液。
9.根据权利要求8所述二氢吡唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述无机强碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液；所述醇溶液为甲醇溶液或乙醇溶液。
10.根据权利要求1~7任一所述二氢吡唑啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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