BRPI0922922A2 - métodos para regenerar plantas de jatropha curcas para transformação mediada por agrobacterium de plantas de jatropha curcas - Google Patents

Abstract

transformação genética de jatrophacurcas. a presente invenção refere-se a métodos para a regeneração e a transformação de plantas mediada por agrobacterium, pertencentes ao gênero jatropha, mais especificamente, jatropha curcas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA REGENERAR PLANTAS DE JATROPHA

CURCAS PARA TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERIUM DE PLANTAS DE JATROPHA CURCAS". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido de patente reivindica prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório Nº de série 61/122 454 depositado em 15 de dezembro de 2008, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. Antecedentes da Invenção

[002] A presente invenção refere-se ao campo de regeneração e transformação de plantas, especialmente a métodos para a regeneração e a transformação de Jatropha. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método e composições de meios para regeneração e transformação de plantas da espécie Jatropha curcas.

[003] As publicações e outros materiais utilizados neste relatório descritivo para esclarecer os antecedentes da invenção ou para fornecer detalhes adicionais que referem-se à prática são incorporados por referência e, por conveniência, são agrupados respectivamente na Bibliografia.

[004] O mundo está enfrentando a escassez crescente das reservas de combustível fóssil e a piora do Efeito Estufa. Existe uma demanda urgente para aumentar a produção e o consumo de energia renovável. Os biocombustíveis foram reconhecidos como prioridade nacional para muitos países em sua busca por fontes alternativas que atendam às necessidades de sua segurança energética e que, ao mesmo tempo, reduzam as emissões de CO 2, causadoras do Efeito Estufa. A demanda por biocombustível tem aumentado a pressão sobre a produção de alimentos. Por exemplo, para fazer face à necessidade de biocombustíveis na Alemanha em 2017, de acordo com o estipulado pelo governo alemão, todos os terrenos agrícolas desse país deveriam ser utilizados para o plantio de culturas bioenergéticas, sem qualquer terreno destinado à produção de alimentos. Para que essa competição por terra seja mais fácil e para atender à nossa necessidade por combustíveis renováveis, é preciso em grande medida utilizar terras marginais para produção bioenergética.

[005] Jatropha curcas é uma pequena planta lenhosa pertencente à família Euphorbiaceae. Diversas características únicas da Jatropha curcas a tornam uma planta ideal para produção de biodiesel. Estas incluem seu rápido crescimento, fácil propagação, custo baixo de sementes, alto teor de óleo, período curto de gestação, grande capacidade de adaptação, tolerância à seca e a capacidade para florescer em solos degradados. Além disso, seu tamanho de planta torna conveniente a colheita de sementes (Jones, 1991; Sujatha et al., 2008).

[006] No entanto, Jatropha sofre de várias desvantagens que podem limitar sua ampla adoção. A produtividade da planta é restringida pela proporção desfavorável na floração de machos para fêmeas e seu teor de óleo não ter sido otimizado por melhoramento. Esta planta é sensível também a estresses bióticos, causados por vírus (Narayanna et al., 2007), fungos e bactérias patogênicas, e estresses abióticos, especialmente frio e seca (http: www.jatropha.org). A presença de vários componentes tóxicos (por exemplo, a toxina proteica, curcina, e os ésteres de forbol, agentes causadores de câncer) em sementes e folhas da planta representa riscos para a saúde de agricultores e trabalhadores em bioprocessos que fazem uso de Jatropha no setor industrial.

[007] A maneira tradicional para melhorar traços de qualidade de plantas é pelo melhoramento visando obter genótipos superiores. No entanto, uma avaliação da diversidade genética, usando marcadores moleculares, revelou baixa variabilidade entre os acessos locais do germoplasma de J. curcas (Sujatha at al., 2008). Portanto, ferramentas alternativas de manipulação genética, tais como métodos de transformação genética, são urgentemente necessárias que ofereçam estratégias adicionar para o melhoramento genético desta cultura. A transformação genética mediada por Agrobacterium tornou-se a escolha principal para gerar plantas transgênicas. No entanto, o número de relatos surgidos sobre o uso de transformação de plantas pertencentes à família Euphorbiaceae é muito pequeno. O único protocolo relatado de transformação para Jatropha (Li et al., 2008) não é reproduzível em nossas mãos.

[008] Dessa forma, existe necessidade de métodos de transformação de J. curcas que possibilitem o melhoramento genético nesta espécie de cultura. Sumário da Invenção

[009] A presente invenção refere-se a métodos para a regeneração e a transformação de plantas mediada por Agrobacterium do gênero Jatropha, more especificamente, em Jatropha curcas.

[0010] Por conseguinte, uma modalidade da presente invenção provê um protocolo eficiente e reproduzível de regeneração de plantas para J. curcas por meio de otimização da cultura de tecido e das condições para regeneração de ramos. Este protocolo de regeneração foi utilizado em combinação com transformação mediada por Agrobacterium para produzir ramos/plantas T0 transgênicos de Jatropha. A presente invenção provê também o uso de uma etapa de enxertia, usando os ramos T0 transgênicos como mudas e plantas não transgênicas como porta-enxerto. Esta etapa de enxertia torna desnecessário que as plantas regeneradas produzam raízes em cultura de tecido e encurta consideravelmente o tempo para floração de ramos e para produção de sementes T1.

[0011] Em uma concretização, a presente invenção provê um método para regenerar plantas da espécie J. curcas. De acordo com esta concretização, explantes são obtidos a partir de cotiledôneos de plântulas de 5 a 7 dias de vida. Os explantes são cultivados em meio de formação de calo, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-benzilaminopurina (6-BA) e ácido 1-naftalenoacético (NAA) como hormônios vegetais. O tecido do calo é então transferido para um primeiro meio de regeneração de ramos, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, adenina, sacarose, além de 6-BA e ácido 3-indolbutírico (IBA) como hormônios vegetais. Os ramos que se regeneram a partir do tecido do calo são transferidos para um segundo meio de regeneração de ramos, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA, IBA e ácido giberélico (GA 3) como hormônios vegetais. O tecido do calo sem ramos regenerados é transferido para um terceiro meio de regeneração de ramos, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA e IBA como hormônios vegetais para regeneração adicional de ramos. Os ramos que se regeneraram são transferidos para um meio de alongamento de ramo, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA e GA3 como hormônios vegetais para alongamento e multiplicação de brotos. Os ramos alongados são transferidos para um meio de enraizamento, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, sacarose e IBA. Após enraizamento, as plântulas são transferidas para o solo. Alternativamente, os ramos alongados podem ser enxertados em porta-enxertos de J. curcas.

[0012] Em uma segunda concretização, a presente invenção provê um método para transformação mediada por Agrobacterium de plantas da espécie J. curcas. De acordo com esta concretização, transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas utiliza o mesmo esquema básico que o descrito acima para a regeneração de regeneração de J. curcas. Para transformação, os explantes são primeiramente co- cultivados com células de Agrobacterium antes que transferidos para o meio de formação de calo com transferências subsequentes para os meios de regeneração de ramos, meio de alongamento de ramos e meio de enraizamento como descrito acima. O meio de co-cultivo compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, glicose, além de acetosiringona, 6-BA e NAA como hormônios vegetais. O meio de formação de calo é igual ao meio para regeneração, exceto que compreende ainda um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. Do mesmo modo, os meios de regeneração de ramos compreendem ainda um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. Para transformação, a cultura no meio de formação de calo é realizada no escuro. Agentes seletivos convencionais podem ser utilizados para a transformação mediada por Agrobacterium de plantas da espécie J. curcas. Exemplos de agentes seletivos incluem, entre outros, o herbicida BASTA, higromicina e os semelhantes. Breve Descrição das Figuras

[0013] A figura 1 ilustra um método de transformação de Jatropha mediada por Agrobacterium de acordo com a presente invenção. A escala de tempo listada à esquerda é para uso no protocolo de enraizamento, enquanto à esquerda é para uso no protocolo de enxertia.

[0014] A figura 2 ilustra vetores para transformação via Agrobacterium utilizados para demonstrar o método de transformação da presente invenção.

[0015] As figuras 3A-3K mostram a transformação, a regeneração,

a floração e a formação de plântulas de J. curcas. figura 3A: Plântula MD 5 dias de J. curcas adequada para transformação. figura 3B: Formação de calo e geração de ramos. Esquerda, cotiledôneos inoculados com Agrobacterium sem carrear qualquer vetor. Direita, cotiledôneos inoculados com Agrobacterium carreando um vetor com um traço genético. Observar a regeneração de ramos a partir de explantes. figura 3C: visão aumentada de calo resistente à higromicina e órgãos do tipo ramos na superfície de cotiledôneos amarronzados. figura 3D: Regeneração de ramos de J. curcas resistentes à higromicina. figura 3E: Alongamento de ramos. figura 3F: Enraizamento de ramos transgênicos. figura 3G: Alta eficácia do enraizamento de J. curcas transgênico. figura 3H: J. curcas transgênico cultivado em solo. figura 3I e figura 3J: Ramos de J. curcas transgênico enxertados em porta-enxertos não transgênicos. A seta branca indica o sítio de enxertia. figura 3K: Floração e formação de plântulas de J. curcas transgênico. As barras da escala indicam 10 mm.

[0016] A figura 4 apresenta a análise por PCR de plantas J. curcas ubi:GFP resistentes à higromicina. Linha -: Jatropha de controle do tipo selvagem; Linha +: DNA de plasmídeo de p1300-GFP; Linhas nº 1- nº 10 de folhas de ramos de Jatropha resistentes à higromicina.

[0017] As figuras 5A-5P mostram a expressão de GFP em raiz de planta T0 (figura 5B, figura 5D), flor macho (figura 5F, figura 5H) e sementes T1, após 3 semanas da fertilização (figura J, figura K, figura L, figura N, figura O, figura P). A figura A, figura C, figura E, figura G, figura I e figura M representam controles do tipo selvagem para cada órgão vegetal. As barras da escala indicam 2 mm.

[0018] A figura 6 apresenta análises por PCR de plantas J. curcas 35S:JcWRI1 resistente ao BASTA. Linha M, Marcador de fragmentos de DNA (Ladder); Linha nº 1 – nº 7 de folhas de ramos de Jatropha resistente ao BASTA; linha -, controle de tipo selvagem; linha +, DNA de plasmídeo de pBA002-MYC-JcWRI1.

[0019] A figura 7 apresenta a análise por Western Blotting de níveis de RcFAH12 e JcDGAT1 em folhas de plantas transgênicas de Jatropha expressando 35S:RcFAH12 e 35S:JcDGAT1, utilizando anticorpo anti- HA. Painel inferior: Coloração com Azul Brilhante de Coomassie da RUBL (a grande subunidade de RUBISCO) que serve como controle de carregamento. Descrição Detalhada da Invenção

[0020] A presente invenção refere-se a métodos para a regeneração a transformação mediada por Agrobacterium de plantas do gênero Jatropha, more especificamente, em Jatropha curcas.

[0021] Em uma modalidade, a presente invenção provê um método de regeneração de plantas da espécie J. curcas. De acordo com esta concretização, explantes são obtidos a partir de cotiledôneos de plântulas com aproximadamente 5 dias a aproximadamente 12 dias de vida, de preferência plântulas de aproximadamente 5 a 7 dias de vida. A cultura é realizada no claro a 25 °C ± 2 °C em um ciclo de 16 h de luz (100 µmol/m2S)/8 h de escuro. As plântulas são cultivadas em cultura de tecido. A superfície de sementes de J. curcas é esterilizada usando técnicas convencionais e imersas em água estéril durante a noite a 28 °C no escuro. Os embriões sem endosperma são germinados em meio de germinação sem hormônios com os radicais em contato com o meio. O meio de germinação compreende ½ da concentração de sais minerais de MS, vitaminas B5 e sacarose. A concentração de sacarose é de aproximadamente 5% (p/v). O meio de germinação pode compreender ainda um tampão. Em uma concretização, o tampão é ácido 2-(4- morfolino)etanossulfônico (MES) a aproximadamente 0,5 g/L em pH de aproximadamente 5,6. O meio de germinação é solidificado com ágar ou fitogel. A cultura é realizada na luz a 25 °C ± 1 °C em um ciclo de 16 h de luz (100 µmols/m2S)/8 h de escuro.

[0022] Os explantes são cultivados em meio de formação de calo no escuro por aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, de preferência por aproximadamente três semanas. O meio de formação de calo compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6- benzilaminopurina (6-BA) e ácido 1-naftalenoacético (NAA) como hormônios vegetais. A concentração de ácido cítrico é de aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L. A concentração de glutamina é de aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L. A concentração de hidrolisado de caseína é de aproximadamente 100 mg/L. A concentração de sacarose é de aproximadamente 3%. A concentração de 6-BA é de aproximadamente 1,5 mg/L. A concentração de NAA é de aproximadamente 0,05 mg/L. O meio de formação de calo, de preferência, compreende ainda MgCl2 em concentração de aproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 0,95 g/L, de preferência, 0,5 g/L. O pH do meio de formação de calo é de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0. O meio de formação de calo é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência fitogel em concentração de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 3 g/L, de preferência 2,5 g/L.

[0023] O tecido do calo é então transferido para um primeiro meio de regeneração de ramos e cultivado na luz por aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, de preferência, aproximadamente três semanas. O primeiro meio de regeneração de ramos compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, adenina, sacarose, além de 6-BA e ácido 3-indolbutírico (IBA) como hormônios vegetais. As concentrações do ácido cítrico, da glutamina, do hidrolisado de caseína e de 6-BA são iguais às presentes no meio de formação de calo. A concentração de adenina é de aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, de preferência aproximadamente 2 mg/L. A concentração de IBA é de aproximadamente 0,05 mg/L. O primeiro meio de regeneração de ramos compreende ainda de preferência MgCl2 em concentração de aproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 0,95 g/L, de preferência 0,5 g/L. O pH do primeiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0. O primeiro meio de regeneração de ramos é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência fitogel em concentração de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 3,0 g/L, de preferência 2,5 g/L.

[0024] Os ramos que se regenerarem a partir do tecido do calo são transferidos para um segundo meio de regeneração de ramos e cultivados na luz por aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas. O segundo meio de regeneração de ramos compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA, IBA e ácido giberélico (GA 3) como hormônios vegetais. As concentrações do ácido cítrico, da glutamina, do hidrolisado de caseína, de 6-BA e IBA são iguais às presentes no primeiro meio de regeneração de ramos. A concentração de GA 3 é de aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,5 mg/L. O segundo meio de regeneração de ramos compreende ainda de preferência MgCl2 em concentração de aproximadamente 0,5 g/L. o pH do segundo meio de regeneração de ramos é de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0. O segundo meio de regeneração de ramos é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência ágar em concentração de aproximadamente 6,5 g/L a aproximadamente 7 g/L, de preferência 7 g/L.

[0025] O tecido de calo sem ramos regenerados é transferido para um terceiro meio de regeneração de ramos e cultivado na luz por aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 5 semanas, de preferência aproximadamente 4 semanas. O terceiro meio de regeneração de ramos compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA e IBA como hormônios vegetais para regeneração adicional de ramos. A concentração do ácido cítrico, da glutamina, do hidrolisado de caseína, de 6-BA e de IBA são iguais às presentes no primeiro meio de regeneração de ramos. O terceiro meio de regeneração de ramos compreende ainda de preferência MgCl2 em concentração de aproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 0,95 g/L, de preferência 0,5 g/L. O pH do terceiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0. O terceiro meio de regeneração de ramos é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência fitogel em concentração de aproximadamente 2,5 g/L a aproximadamente 3 g/L, de preferência 2,5 g/L.

[0026] Os ramos que se regeneraram no segundo meio de regeneração de ramos são transferidos para um meio de alongamento de ramos e cultivados na luz por aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, de preferência aproximadamente duas semanas. O meio de alongamento de ramos compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de 6-BA e GA3 como hormônios vegetais para alongamento e multiplicação de brotos. As concentrações do ácido cítrico, da glutamina e do hidrolisado de caseína são iguais às existentes no primeiro meio de regeneração de ramos. A concentração de 6-BA é de aproximadamente 0,3 mg/L. A concentração de GA 3 é de aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,1 mg/L. O pH do meio de alongamento de ramos é de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0. O meio de alongamento de ramos é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência ágar em concentração de aproximadamente 6,5 g/L a aproximadamente 7 g/L, de preferência 7 g/L.

[0027] Os ramos alongados são transferidos para um meio de enraizamento e cultivados na luz por aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas. O meio de enraizamento compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, sacarose e IBA. A concentração de sacarose é de aproximadamente 3%. A concentração de IBA é de aproximadamente 0,07 g/L. O pH do meio de enraizamento é de aproximadamente 5,6. O meio de enraizamento é solidificado com ágar ou fitogel, de preferência fitogel em concentração de aproximadamente 2,2 g/L. Após o enraizamento, as plântulas são transferidas para o solo. Alternativamente, os ramos alongados podem ser enxertados em porta- enxertos para J. curcas utilizando técnicas convencionais em vez de serem transferidas para o meio de enraizamento.

[0028] Em uma segunda modalidade, a presente invenção provê um método para transformação mediada por Agrobacterium de plantas da espécie J. curcas. De acordo com esta concretização, a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas utiliza o mesmo esquema básico descrito acima para a regeneração de J. curcas. Vetores contendo DNA de interesse são introduzidos em Agrobacterium, utilizando técnicas convencionais tais como eletroporação. As células transformadas de Agrobacterium são cultivadas antes do uso, utilizando técnicas convencionais. De acordo com uma destas técnicas, células de Agrobacterium são inoculadas em meio LB suplementado com canamicina e carbicilina. A concentração de canamicina é de aproximadamente 25 mg/L to aproximadamente 100 mg/L, de preferência aproximadamente 50 mg/L. A concentração de carbicilina é de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 100 mg/L, de preferência aproximadamente 100 mg/L. As células de Agrobacterium são cultivadas durante a noite a 28 °C, 250 rpm. As células de Agrobacterium são coletadas por centrifugação e novamente suspensas em meio MS líquido, suplementado com sacarose, glicose, acetosiringona (AS), 6-BA e NAA. A concentração de sacarose é de aproximadamente 30 g/L. A concentração de glicose é de aproximadamente 10 g/L. A concentração de AS é de aproximadamente 20 mg/L. A concentração de 6-BA é de aproximadamente 1,5 mg/L. A concentração de NAA é de aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,1 mg/L, de preferência aproximadamente 0,1 mg/L.

[0029] Para transformação, os explantes são primeiramente co- cultivados com células de Agrobacterium antes de serem transferidos para o meio de formação de calo com transferências subsequentes para os médios de regeneração de ramos, o meio de alongamento de ramos e o meio de enraizamento, como descrito acima. O cocultivo é realizado no escuro por aproximadamente 2 a 3 dias. O meio de cocultivo compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, além de AS e 6-BA e NAA como hormônios vegetais. As concentrações de ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína e sacarose são iguais às presentes no meio de formação de calo. A concentração de AS é de aproximadamente 20 mg/L. A concentração de 6-BA é de aproximadamente 1,5 mg/L. A concentração de NAA é de aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,1 mg/L, de preferência aproximadamente 0,05 mg/L. O meio de co-cultivo pode compreender ainda um tampão adequado. Em uma concretização, o tampão é MES. A concentração de MES é de aproximadamente 0,5 g/L em pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2.

[0030] O meio de formação de calo utilizado para a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas PE o mesmo que o utilizado para regeneração, exceto por compreender ainda um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. O agente seletivo pode ser qualquer agente seletivo para o qual um gene marcador, tal como descrito abaixo, tenha sido incluído no Agrobacterium transformado. Em uma concretização, o agente seletivo é higromicina em concentração de aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, de preferência 3,5 mg/L. Em outra concretização, o agente seletivo é glufosinato de amônio em concentração de aproximadamente 1 mg/L. O erradicante de Agrobacterium pode ser qualquer erradicante convencional, tal como cefotaxima e os semelhantes. Em uma concretização, o erradicante de Agrobacterium é cefotaxima em concentração de aproximadamente 100 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de preferência 100 mg/L. A cultura no meio de formação de calo para transformação mediada por Agrobacterium é realizada no escuro por aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, de preferência aproximadamente 3 semanas.

[0031] O tecido de calo é então tratado como descrito acima no que refere-se à regeneração de J. curcas, com transferência e cultura na luz como descrito acima para o primeiro meio de regeneração de ramos, o segundo meio de regeneração de ramos, o terceiro meio de regeneração de ramos, o meio de alongamento de ramos, o meio de enraizamento ou de enxertia. O primeiro meio de regeneração de ramos utilizado para a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas é igual àquele utilizado para regeneração, exceto por compreender ainda um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. O agente seletivo pode ser qualquer agente seletivo para o qual um gene marcador, tal como descrito abaixo, tenha sido incluído no Agrobacterium transformado. Em uma concretização, o agente seletivo é higromicina em concentração de aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, de preferência 3,5 mg/L. Em outra concretização, o agente seletivo é glufosinato de amônio em concentração de aproximadamente 1 mg/L. O erradicante de Agrobacterium pode ser qualquer erradicante convencional, tal como cefotaxima. Em uma concretização, o erradicante de Agrobacterium é cefotaxima em concentração de aproximadamente 100 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de preferência 100 mg/L.

[0032] O segundo meio de regeneração de ramos utilizado para a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas é igual àquele utilizado para regeneração, exceto por compreender ainda um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. O agente seletivo pode ser qualquer agente seletivo para o qual um gene marcador, tal como descrito abaixo, tenha sido incluído no Agrobacterium transformado. Em uma concretização, o agente seletivo é higromicina em concentração de aproximadamente 4 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, de preferência 4 mg/L. Em outra concretização, o agente seletivo é glufosinato de amônio em concentração de aproximadamente 1 mg/L. O erradicante de Agrobacterium pode ser qualquer erradicante convencional, tal como cefotaxima. Em uma concretização, o erradicante de Agrobacterium é cefotaxima em concentração de aproximadamente 100 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de preferência 100 mg/L.

[0033] O terceiro meio de regeneração de ramos utilizada para a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas é igual àquele utilizado para regeneração, exceto por compreender um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium. O agente seletivo pode ser qualquer agente seletivo para o qual um gene marcador, tal como descrito abaixo, tenha sido incluído no Agrobacterium transformado. Em uma concretização, o agente seletivo é higromicina em concentração de aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 5 mg/L, de preferência 3,5 mg/L. Em outro concretização, o agente seletivo é glufosinato de amônio em concentração de aproximadamente 1 mg/L. O erradicante de Agrobacterium pode ser qualquer erradicante convencional, tal como cefotaxima. Em uma concretização, o erradicante de Agrobacterium é cefotaxima em concentração de aproximadamente 100 mg/L a aproximadamente 150 mg/L, de preferência 100 mg/L.

[0034] O meio de alongamento de ramos e o meio de enraizamento, utilizados para a transformação mediada por Agrobacterium de J. curcas, são iguais àqueles utilizados para regeneração.

[0035] O DNA que é inserido (o DNA de interesse) em plantas do gênero Jatropha não é fundamental para o processo de transformação. Em geral, o DNA que é introduzido em uma planta integra um construto. O DNA pode ser um gene de interesse, por exemplo, uma sequência codificadora de uma proteína ou pode ser uma sequência capaz de regular a expressão de um gene, tal como sequência antissenso, sequência senso de supressão ou sequência de miRNA. O construto inclui tipicamente regiões reguladoras ligadas operacionalmente à extremidade 5’ do DNA de interesse e/ou à extremidade 3’ do DNA de interesse. Um cassete contendo todos esses elementos é denominado também neste relatório descritivo cassete de expressão. Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líderes 5' no construto de cassete de expressão. As regiões reguladoras (ou seja, regiões promotoras, reguladoras de transcrição e regiões de terminação de tradução) e/ou o polinucleotídeo codificando uma ancoragem de sinal podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo codificando um sinal de ancoragem podem ser heterólogos à célula hospedeira ou entre si. Consultar a Patente U.S. Nº 7 205 453 e a Publicação do Pedido de Patente U.S. N os 2006/0218670 e 2006/0248616. O cassete de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis. Consultar a Patente U.S. Nº 7 205 453 e a Publicação do Pedido de Patente U.S. N os 2006/0218670 e

2006/0248616.

[0036] Em geral, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Habitualmente, o gene marcador selecionável de plantas codificará resistência a antibióticos, com genes adequados incluindo pelo menos um conjunto de genes que codificam resistência ao antibiótico espectinomicina, o gene estreptomicina fosfotransferase (spt) que codifica resistência à estreptomicina, o gene neomicina fosfotransferase (nptII) que codifica resistência à canamicina ou a geneticina, o gene higromicina fosfotransferase (hpt ou aphiv) que codifica resistência à higromicina e genes acetolactato sintase (als). Alternativamente, o gene marcador selecionável de plantas codificará resistência a herbicidas, tal como resistência às herbicidas do tipo sulfonilureia, glufosinato, amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D), incluindo genes que codificam resistência a herbicidas que atuam ao inibirem a ação de glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar). Consultar, em geral, WO 02/36782, Patente U.S. Nº 7 205 453 e a Publicação dos Pedidos de Patente U.S. Nos 2006/0248616 e 2007/0143880, e aquelas referências citadas nos mesmos. Essa lista de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser uma limitação. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado.

[0037] Alguns promotores podem ser utilizados na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Ou seja, os ácidos nucleicos podem combinados com promotores constitutivos, com preferência por tecidos, ou outros, para expressão na célula hospedeira de interesse. Estes promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor contendo o domínio central (core) do Rsyn7 (WO 99/48338 e Patente U.S. Nº 6 072 050); o promotor contendo o domínio central CaMV35S (Odell et al., 1985); da actina de arroz (McElroy et al., 1990); ubiquitina (Christensen e Quail, 1989 e Christensen et al., 1992); pEMU (Last et al., 1991); MAS (Velten et al., 1984); promotor ALS (Patente U.S. Nº 5 659 026) e os semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes U.S. N os 5 608 149, 5 608 144, 5 604 121, 5 569 597, 5 466 785, 5 399 680, 5 268 463 e 5 608 142.

[0038] Outros promotores incluem promotores induzíveis, especialmente um promotor induzível por patógenos. Estes promotores incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), as quais são induzidas após infecção por patógeno, por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Outros promotores incluem aqueles que são expressos localmente ou próximo do sítio de infecção por patógenos. Em concretizações adicionais, o promotor pode ser um promotor induzível por feridas. Em outras concretizações, promotores regulados por substâncias químicas podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta por meio de a aplicação de um regulador químico exógeno. O promotor pode ser induzível por substância química, em que a aplicação da substância química induz a expressão do gene, ou um promotor reprimível por substância química, em que a aplicação da substância química reprime a expressão do gene. Além disso, promotores com preferência por tecidos podem ser utilizados, direcionados para intensificar a expressão de um polinucleotídeo de interesse dentro de um tecido vegetal específico. Cada um destes promotores está descrito nas Patentes U.S. Nos 6 506 962, 6 575 814, 6 972 349 e 7 301 069 e na Publicação dos Pedidos de Patente U.S. N os 2007/0061917 e 2007/0143880.

[0039] Quando apropriado, o DNA de interesse pode ser otimizado para melhorar a expressão na planta transformada. Ou seja, as sequências codificadoras podem ser sintetizadas, utilizando códons preferidos para plantas para melhorar a expressão. Existem métodos disponíveis no estado da técnica para sintetizar genes preferidos para plantas. Consultar, por exemplo, as Patentes U.S. N os 5 380 831, 5 436 391 e 7 205 453 e a Publicação dos Pedidos de Patente U.S. N os 2006/0218670 e 2006/0248616.

[0040] A prática da presente invenção emprega, a não ser se indicado de outra forma, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biologia celular, cultura celular e biologia transgênica, as quais estão dentro da capacidade do estado da técnica. Consultar, por exemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2ª edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3ª edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, inclusive atualizações periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); o tratado, Methods In Enzymology (Academic Press,

Inc., N.Y.); Methods In Enzymology, Volumes 154 e 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6ª edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004. Exemplos

[0041] A presente invenção é descrita por referência aos Exemplos a seguir, os quais são oferecidos a título de ilustração e não pretendem limitar a invenção em qualquer maneira. Técnicas padrão bem- conhecidas no estado da técnica ou as técnicas especificamente descritas abaixo foram utilizadas. Exemplo 1 Materiais e Métodos

[0042] Matérias e métodos para cultura de plantas: sementes MD de Jatropha curcas (L.) foram obtidas da Indonésia. Após remoção do revestimento externo da semente, a superfície das sementes foi esterilizada por 60 segundos com etanol 75% (v/v), seguido por imersão em H2O2 10% (v/v) por 1 hora, em seguida, as sementes foram lavadas duas vezes com água estéril e finalmente imersas em água estéril durante a noite a 28 °C no escuro. Os embriões sem endosperma foram germinados em meio sem hormônios de Murashige e Skoog com metade da concentração de sal (1/2 MS) (Murashige e Skoog, 1962),

contendo vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 5 g/L de sacarose, 0,5 g/L de ácido 2-(4-morfolino)etanossulfônico (MES) e 2,2 g/L de fitogel (Sigma), pH 5,6, com os radicais em contato com o meio, e cultivados em cultura de tecido a 25 °C ± 2 °C em um ciclo de luz de 16 h (100 µmol/m2S)/8 h de escuro.

[0043] Meio: Os meios utilizados na presente invenção foram como segue.

[0044] Meio I (meio basal): principais sais MS, sais secundários MS e vitaminas B5, 10 mg/L de ácido cítrico, 150 mg/L de glutamina ,100 mg/L de hidrolisado enzimático de caseína, sacarose 3% (p/v), 0,5 g/L de MgCl2 (utilizado somente em meio contendo fitogel), em combinação com reguladores de crescimento vegetal foram utilizados. O Meio I foi ajustado para pH de 5,8 – 6,0 com KOH 1 N, solidificado com 2,5 g/L de fitogel e tratado em autoclave a 121 °C por 20 min. Todos os reguladores de crescimento vegetal foram esterilizados e filtrados antes de serem adicionados ao meio autoclavado.

[0045] Meio de cocultivo: meio basal acrescido de 20 mg/L de acetosiringona (AS), 0,5 g/L de MES, 1,5 mg/L de 6-benzilaminopurina (6-BA) e 0,05 mg/L de ácido 1-naftalenoacético (NAA), pH 5,0 – 5,2.

[0046] Meio de formação de calo: meio basal acrescido de 1,5 mg/L de 6-BA, 0,05 mg/L de NAA, 3,5 mg/L de higromicina (hyg, A.G scientific, SanDiego, CA), como agente seletivo para transformação de planta ou 1 mg/L de glufosinato de amônio (BASTA, Crescent Chemical, NY), e 100 mg/L de cefotaxima (Cef) para eliminação de células de Agrobacterium.

[0047] Meio I de regeneração de ramos: meio basal acrescido de

1.5 mg/L 6-BA, 0,05 mg/L de ácido 3-indolbutírico (IBA), 2 mg/L de adenina (sal de hemissulfato de adenina, SIGMA), 3,5 mg/L de Hyg ou 1 mg/L de glufosinato de amônio e 100 mg/L de Cef.

[0048] Meio II de regeneração de ramos: meio basal acrescido de

1,5 mg/L de 6-BA, 0,05 mg/L de IBA, 0,5 mg/L de ácido giberélico (GA 3), 4 mg/L de Hyg ou 1 mg/L glufosinato de amônio e 100 mg/L CEF 100, alteração de fitogel para 7 g/L de ágar.

[0049] Meio III de regeneração de ramos: meio basal acrescido de 1,5 mg/L de 6-BA, 0,05 mg/L de IBA, 3,5 mg/L de Hyg ou 1 mg/L de glufosinato de amônio e 100 mg/L de Cef.

[0050] Meio de alongamento de ramos: meio basal acrescido de 0,3 mg/L de 6-BA, 0,1 mg/L de GA3, alteração de fitogel para 7 g/L de ágar.

[0051] Meio de enraizamento: principais sais MS, sais secundários MS e vitaminas B5, sacarose 3%, 0,5 g/L de MES, 0,07 g/L de IBA, 2,2 g/L de fitogel, pH 5,6.

[0052] Meio II: Meio MS líquido, suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de MES, 20 mg/L de AS, 1,5 mg/L de 6-BA, 0,1 mg/L de NAA, pH 5,0 – 5,2.

[0053] Extração e análise de RNA: Tecido fresco de folha ou semente (100 mg) foi moído em nitrogênio líquido e extraído com reagente de purificação de RNA vegetal (Invitrogen). A concentração de RNA foi medida por Nanodrop (Thermo, USA). Tratamento com DNase e transcrição reversa (RT) foram realizados como descritos (Qu et al., 2007).

[0054] Cepa de Agrobacterium e vetores: As sequências WRINKLE1 (JcWRI1) e DGAT1 de J. curcas foram identificadas por sequenciamento de uma biblioteca de cDNA de semente de Jatropha. O cDNA completo de JcWRI1 foi amplificado a partir do primeiro produto de cDNA em fita de semente de J. curcas com dois iniciadores 5′- AATCGGATCCTAATGAAGAGGTCTTCTGCT-3′ (SEQ ID NO:1) e 5′- TCATGTTAATT AATCAAACAGAATAGTTACAAGAAA-3′ (SEQ ID NO:2) (os nucleotídeos sublinhados representam sítios de reconhecimento de enzima). O produto da PCR foi posteriormente inserido no vetor pBA002-MYC, tratado com a BamHI e PacI para formar pBA002-MYC-JcWRI1. o cDNA completo de JcDGAT1 foi amplificado a partir do primeiro produto de cDNA em fita de semente de J. curcas com dois iniciadores 5′- CAATATCTAGACCATGACGATTTTGGAGACCACT-3′ (SEQ ID NO:3) e 5′-TATTAGATCTGGTCTTAATTCAGCATTGCC-3′ (SEQ ID NO:4) (os nucleotídeos sublinhados representam sítios de reconhecimento de enzima). O produto da PCR foi posteriormente inserido no vetor pBA002-HA, tratado com XbaI e BamHI para formar pBA002-JcDGAT1- HA. O cDNA completo de RcFAH12 foi amplificado a partir de um primeiro produto de cDNA em fita de semente de mamona com dois iniciadores: 5′-CAATATCTAGACCATGGGAGGTGGTGGTC-3′ (SEQ ID NO:5) e 5′-TGTAGGATCCGGATACTTGTTCCGGTACCAG-3′ (SEQ ID NO:6) (os nucleotídeos sublinhados representam sítios de reconhecimento de enzima). O produto da PCR foi posteriormente inserido no vetor BA002-HA, tratado com XbaI e BamHI para formar pBA002-RcFAH12-HA. Os vetores foram introduzidos na cepa AGL1 de Agrobacterium por eletroporação (BIO-RAD, CA, EUA). Células transformadas de Agrobacterium foram utilizadas para inocular meio LB líquido, suplementado com 50 mg/L de canamicina (para pCAMBIA 1300-GFP) ou 50 mg/L de espectimicina (para pBA002-MYC-WRI1, pBA002-JcDGAT1-HA, pBA002-RcFAH12-HA) e 100 mg/L de carbicilina, e foram cultivadas durante a noite a 28 °C, 250 rpm até OD 595 final de 0,7 - 1. Células de Agrobacterium foram coletadas por centrifugação a 4200 rpm por 10 min. a 20 °C. O precipitado celular foi novamente suspenso com Meio II e ajustado para OD595 de 0,25 – 0,35 (somente Agrobacterium AGL1), antes do cocultivo.

[0055] Isolamento de DNA a partir de folhas de J. curcas e análise de genótipo: Cinquenta mg de folhas frescas de J. curcas foram rompidas em nitrogênio líquido e incubadas a 65 °C por uma hora após adição de 400 µL de tampão de extração CTAB (Tris 100 mM, pH 8,0;

NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; brometo de cetil trimetilamônio 2% (CTAB)). Após duas extrações com clorofórmio resfriado, o DNA foi precipitado com isoprepanol e coletado por centrifugação. Para genotipagem de gene de resistência à higromicina, os iniciadores utilizados foram hyg5: 5′-CGATGTAGGAGGGCGTGG-3′ (SEQ ID NO:7), hyg3: 5′- ACTTCTACACAGCCATCGGT CC-3′ (SEQ ID NO:8). Para genotipagem de gene bar, os iniciadores utilizados foram bar5: 5′- GTCTGCAC CATCGTCAACC-3′ (SEQ ID NO:9), bar3: 5′- GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′ (SEQ ID NO:10).

[0056] Anticorpos e análise de proteínas pela técnica de blotting em gel: Anticorpo contra a proteína curcina foi preparado pelo laboratório do Dr. Yin Zhongcao. A análise por Western Blotting foi realizada como previamente descrita (Qu et al., 2007). As proteínas vegetais totais foram separadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio 12%-poliacrilamida. Peroxidase ECL conjugada a anti-imunoglobulina G de coelho de burro foi utilizada como anticorpo secundário. Faixas imunorreativas foram visualizadas usando os reagentes de detecção de Western Blotting de ECL (GE healthcare). Exemplo 2 Transformação de explantes de cotiledôneos de J. curcas

[0057] A figura 1 ilustra o método de transformação de Jatropha mediada por Agrobacterium, como descrito mais detalhadamente neste Exemplo. A figura 2 ilustra os vetores de transformação de Agrobacterium que foram utilizados neste Exemplo.

[0058] Cocultivo: Cotiledôneos de sementes com 5 a 7 dias de vida (Exemplo 1; figura 3A) foram cortados em pequenos pedaços (5 X 5 mm) e incubados com células de Agrobacterium (Exemplo 1), abrigando o cassete de expressão-alvo em 20 ml de meio II por 10 a 20 min. a 25C. Explantes foram então transferidos e mantidos no meio de cocultivo por 2 a 3 dias a 22C no escuro. Após o co-cultivo, os explantes foram lavados vários vezes com água estéril, seguido por uma lavagem com 300 mg/L de cefotaxima. Os tecidos de cotiledôneo foram secos com papel absorvente esterilizado para retirar o excesso de água superficial.

[0059] Seleção de calos resistentes à higromicina ou resistentes ao glufosinato de amônio: Após o cocultivo, os explantes foram semeados sobre a placa contendo o meio de meio de formação de calo e transferidos para o escuro e mantidos a 25 C ± 1C por três semanas. Explantes não transformados e transformados formam o tecido do calo (figura 3B), e alguns formam calo após a cultura (figura 3B, painel direito; figura 3C). Explantes não transformados normalmente se tornarão marrons quando cultivados no escuro.

[0060] Regeneração de ramos: Explantes recentemente criados com calo resistente à higromicina ou resistente ao glufosinato de amônio foram transferidos para o meio I de regeneração de ramos e mantidos por 3 semanas a 25 C com ciclos de 16 h de luz (100 µmols/m2S1)/8 h de escuro. Os métodos descritos neste relatório têm como base em indução direta de ramos a partir de calo transformado por adição de adenina. Enquanto o termo "regeneração" é utilizado neste relatório para descrever a recriação de uma planta completa a partir destes calos transformados. Embora tenha efeito semelhante sobre a regeneração de ramos, 6-BA (6-benziladenina) não pode ser utilizada nesta etapa especial durante os métodos aqui descritos. Além disso, concentração mais alta ou mais baixa, adição precoce ou tardia de adenina dificultarão a regeneração de ramos ou darão origem a ramos anormais. Em uma concretização alternativa, o método para obter regeneração de ramos envolve adicionar 2 mg/L a mais de 6-BA normal ou de outro derivado de adenina, tal como 2-isopentenil adenina. Durante esse período, os ramos regenerados a partir dos calos (aproximadamente 40-50%) foram transferidos para o meio II de regeneração de ramos (figura 3D). Calos sem ramos regenerados foram transferidos para o meio III de regeneração de ramos para cultura adicional e regeneração de ramos.

[0061] Alongamento de ramos: Após 4 semanas, ramos regenerados foram transferidos para o meio de alongamento de ramos para alongamento e multiplicação de brotos (figura 3E).

[0062] Enraizamento: Os ramos alongados com aproximadamente 2,5 cm de comprimento foram enraizados em meio de enraizamento (figura 3F). Normalmente, é preciso mais de um mês para se obter raízes como mostradas na figura 3F. O protocolo de enraizamento dos requerentes pode resultar em alta eficácia de enraizamento de aproximadamente 45% (figura 3G), e uma raiz principal com comprimento mais longo do que 10 mm pode ser bem sucedidamente transferida para o solo e obter mais de 90% de vivas (figura 3H).

[0063] Enxertia: Os ramos alongados transgênicos podem também ser utilizados como mudas para enxertos em porta-enxertos não transgênicos. Plantas da espécie J. curcas, sadias e crescendo vigorosamente, foram escolhidas para servirem de porta-enxertos. Tanto mudas como porta-enxertos foram cortados na região de transição, de modo que tecidos de floema de ambos sejam conectados após a junção. A junção do enxerto foi envolvida com parafina e presa por uma fita. Plantas J. curcas enxertadas foram mantidas sob baixa intensidade de luz (28 C com ciclos de 16 h de luz (50 µmol/m2S1)/8 h de escuro) e 85% de umidade por 7 dias. Ramos de J. curcas transgênico enxertados em porta-enxertos não transgênicos são mostrados nas figuras 3I e 3J. A planta J. curcas transgênica exibiu floração e semeação normais em estufa (figura 3K). Exemplo 3 Transformação e análise de J. curcas transgênico

[0064] Exemplos de transformação e regeneração de Jatropha de plantas resistentes ao BASTA ou a higromicina, a partir de células transformadas usando o método da presente invenção são detalhados abaixo. Resumidamente, o método requer que um construto de DNA heterólogo, compreendendo um promotor vegetal, uma sequência de DNA codificadora de uma proteína que confere uma vantagem seletiva, tal como tolerância ao BASTA ou a higromicina, e uma região 3’ terminadora transcricional não traduzida, seja provido. O construto de DNA compreende um promotor vegetal conectado operacionalmente a uma região de DNA de codificação que codifica uma proteína que confere tolerância ao BASTA ou a higromicina, e um sinal de terminação 3’. De preferência, o construto de DNA codifica um gene adicional de interesse. Por exemplo, o construto de DNA pode incluir um gene cuja expressão renda mais ou altere o teor de ácidos graxos em plantas transformadas.

[0065] No exemplo abaixo, plantas Jatropha resistentes à higromicina, expressando proteína verde fluorescente (GFP), foram obtidas a partir de tecido transformado com construtos de DNA que incluía um gene de GFP. Este gene de GFP e outros genes, tais como GUS, gene luciferase, que podem servir de marcadores facilmente rastreáveis, foram utilizados em alguns dos exemplos descritos abaixo, simplesmente porque seus fenótipos podem ser rapidamente detectados nas plantas transformadas. É razoável esperar que usando construtos de DNA, criados por técnicas padrão de biologia molecular, a presente invenção possa ser empregada para se obter plantas Jatropha expressando virtualmente qualquer outro gene. Em uma concretização alternativa, o método para se obter plantas Jatropha transformadas envolve a cotransformação de dois construtos de DNA, um destes compreendendo um marcador selecionável, tal como marcador de tolerância ao BASTA ao a higromicina, e o outro compreendendo um gene de interesse.

[0066] A transformação e regeneração de ramos de supostas plantas Jatropha GFP transgênicas resistentes à higromicina foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 2. DNA genômico de ramos resistentes à higromicina foi extraído com o método descrito no Exemplo 1. A genotipagem foi realizada com o par de iniciadores do gene higromicina (SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8). Nove de 10 eventos foram positivos pela PCR, enquanto o controle de não transformação não mostra faixa na linha CK (figura 4). A expressão de GFP foi rapidamente rastreada quando raízes transgênicas de Jatropha foram excitadas com luz ultravioleta (figura 3B). A fluorescência indicou que este novo cassete de expressão de GFP introduzido foi expresso em plantas T0 de Jatropha. Após floração de Jatropha ubi:GFP transgênico, a expressão de GFP foi verificada na inflorescência. A flor macho, especialmente o pólen, exibe algum nível de fluorescência verde clara (figura 5H). A expressão de GFO foi verificada também na 3ª semana após a fertilização de sementes. Forte expressão de GFP pode ser vista na semente inteira transgênica T1, a partir do exterior (figura 5N, figura 5O) ou do interior (figura 5P). Isso indica que GFP também expressa bem nas sementes de progênie em Jatropha transgênico.

[0067] Triacilgliceróis (TAG) representam a principal forma de armazenamento energético depois que a planta converte energia solar em energia química. No entanto, a via bioquímica padrão para sua síntese era considerada um grande desperdício quando plantas usam uma variação de glicólise como intermediário. WRINKLED1 (WRI1), um fator de transcrição da família AP2/EREB, afeta aspectos mais específicos do processo de armazenamento de sementes, especialmente conversão de controle transcricional de variantes de açúcar em TAG, e, portanto, demonstra um importante papel em controle de teor de óleo em sementes. A expressão de cDNA em Arabidopsis WRI1, sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor aumentou em 10 - 20% o teor de óleo de sementes. Além disso, a expressão ectópica do cDNA de WRINKLED1 causou o acúmulo de triacilgliceróis em plântulas em desenvolvimento (Cernac e Benning, 2004). Os requerentes propõem que a expressão do gene WRI1 de Jatropha WRI1 em Jatropha levaria a teor mais alto de óleo. Adicionalmente, as plântulas transgênicas podem se desenvolver em embriões ou órgão do tipo embrião produtores de óleo quando alimentadas com açúcares, exatamente igual um reator lipídico que pode ser suprido com substrato líquido contendo açúcar para forte expressão de WRI1 direcionada pelo promotor constitutivo 35S do CaMV em órgãos vegetais.

[0068] Foi feita a clonagem do cDNA completo de Jatropha WRII (JcWRI1), amplificado por PCR a partir de produtos de PCR-RT de sementes de Jatropha, utilizando iniciadores de PCR (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) para a sequência do clone JcWRI1 derivado do sequenciamento de uma biblioteca de cDNA de sementes de Jatropha. A sequências completa de cDNA de JcWRI1 é apresentada em SEQ ID NO:11. O vetor de superexpressão (pBA002-MYC-JcWRI1), com o cDNA de JcWRI1 sob o controle do promotor 35S do CaMV 35S, foi construído e transformado na cepa AGL1 de Agrobacterium. O WRII proposto da fusão de tag 6xMYC pôde ser detectado com anticorpo contra tag MYC. A transformação e regeneração de ramos de supostas plantas Jatropha transgênicas de superexpressão de JcWRI1 resistentes ao BASTA foi conseguida de acordo com o método descrito no Exemplo 2. DNA genômico de ramos resistentes à higromicina foi extraído com o método descrito no Exemplo 1. A genotipagem foi realizada com o par de iniciadores do gene BASTA (SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10). Todos os eventos testados foram positivos para PCR, enquanto que o controle de não transformação não mostrou faixa no CK (figura 6).

[0069] Diacilglicerol aciltransferases (DGAT) de plantas e animais são responsáveis por acondicionar ácidos graxos nascentes em TAGs, os quais subsequentemente se acumulam em corpos oleosos que brotam do retículo endosplasmático. Genes vegetais de DGAT tipo 1 (DGAT1) demonstraram contribuir significativamente para o teor de óleo de sementes, tanto por estudos de superexpressão como por meio de estudos regulação negativa mutacional (Zou et al., 2999; Jako et al., 2001). Os requerentes propõem que a expressão ectópica do gene DGAT1 de Jatropha em Jatropha levaria a nível mais alto de teor de óleo.

[0070] O cDNA completo de DGAT1 de Jatropha DGAT1 foi clonado a partir de produtos de PCR-RT de sementes de Jatropha, usando iniciadores de PCR (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4) de acordo com a sequência do clone de DGAT1. A sequência completa do cDNA de JcDGAT1 é apresentada em SEQ ID NO:13. O vetor de superexpressão (pBA002-JcDGAT1-HA) com o cDNA de JcDGAT1, sob o controle do promotor 35S do CaMV, foi construído e transformado na cepa AGL1 de Agrobacterium. O DGAT1 proposto da fusão de marcador 3xHA pôde ser detectado com anticorpo contra marcador HA. A transformação e regeneração de ramos de supostas plantas Jatropha transgênicas JcDGAT1 resistentes ao BASTA foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 2. A expressão de 35S- JcDGAT1 foi comprovada por Western Blotting com base no anticorpo contra HA com o método descrito no Exemplo 1 (figura 7). A faixa específica para HA pode ser vista em duas linhas de três linhagens transgênicas de Jatropha.

[0071] Óleos vegetais (e seus derivados) podem ser usados em inúmeras situações e aplicações como matérias-primas derivadas de plantas para fins industriais. Quando comparada ao petróleo não renovável, a natureza renovável os torna especialmente atraentes em muitas aplicações industriais para aplicações de perda total, nas quais questões ambientais são objeto de preocupação. Óleo de mamona (Ricinus communis) possui inúmeras aplicações em transporte, cosméticos e produtos farmacêuticos e indústrias transformadoras. O óleo de mamona contém mais 90% de ácido ricinoleico, o qual é um ácido graxo monossaturado de 18 carbonos. É incomum no sentido de que possui um grupo funcional hidroxila no décimo segundo carbono. Este grupo funcional faz com que o óleo ricinoleico (e o óleo de mamona) seja excepcionalmente polar (http://en.wikipedia.org/wiki/Castor_oil). Uma enzima específica, ácido graxo hidroxilase 12 (FAH12) é responsável por adicional o grupo hidroxila em vez de a função normal FAD2 par introduzir uma banda insaturada no décimo segundo carbono (van de Loo et al., 1995). Comparado a outros óleos de sementes desprovidos do grupo hidroxila, o óleo de mamona exige um preço mais alto. Apesar de uma vasta demanda por óleo de mamona, o cultivo desta cultura é restringido pela presença de uma toxina (ricina) e proteínas alergênicas e, dessa forma, o custo de óleo de mamona é relativamente alto. FAH12 transgênica exógena consegue produzir hidroxila-óleo de mamona em sementes de Arabidopsis (Lu et al., 2006). Os requerentes propuseram que a expressão ectópica do gene FAH12 de mamona em Jatropha levaria à produção de óleo de mamona.

[0072] O cDNA completo de FAH12 de mamona (RcFAH12) foi clonado a partir de produtos de PCR-RT de semente de mamona, usando iniciadores de PCR (SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6) de acordo com a sequência FAH12 CDS. A sequências completa de cDNA de RcFAH12 é apresentada em SEQ ID NO:15. O vetor de superexpressão (pBA002-RcFAH12-HA) com o cDNA de RcFAH12 sob o controle do promotor 35S do CaMV foi construído e transformado na cepa AGL1 de Agrobacterium. O RcFAH12 proposto da fusão de tag 3xHA pôde ser detectado com anticorpo contra tag HA. A transformação e regeneração de ramos de supostas plantas Jatropha transgênicas RcFAH12 resistentes ao BASTA foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 2. A expressão de 35S-RcFAH12 foi comprovada por Western Blotting com base em anticorpo contra HA com o método descrito no Exemplo 1. A faixa específica para HA pode ser vista em 5 linhas de 7 linhagens transgênicas de Jatropha (figura 7). Duas linhagens, nº 1 e nº 5, possuem nível muito alto de expressão da proteína de fusão FAH12-HA.

[0073] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “a" e referentes semelhantes, no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deverá ser interpretado de modo a abranger o singular e o plural, a não ser que indicado em contrário neste pedido de patente ou claramente contraditado pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” deverão ser interpretados como termos em aberto (ou seja, significando “incluindo, entre outros”), a não ser se notado de outra forma. A récita de intervalos de valores, neste relatório descritivo, destina-se meramente a servir como método abreviado de referir-se individualmente a cada valor separado que se enquadre dentro do intervalo, a não ser se indicado de outra forma neste relatório descritivo, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo conforme se tivessem sido individualmente citados neste pedido de patente. Por exemplo, se for descrito o intervalo de 10 - 15, então 11, 12, 13 e 14 estão também descritos. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a não ser que indicado de outra forma ou se claramente contraditado pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem de exemplificação (por exemplo, “tal como”), neste relatório descritivo, destina-se meramente a esclarecer melhor a invenção e não impõe uma limitação sobre o âmbito da invenção, a não ser que de outra forma afirmado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como se indicasse qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

[0074] Será apreciado que os métodos e composições da presente invenção podem ser incorporados na forma de uma variedade de concretizações, somente algumas destas são descritas neste pedido de patente. Concretizações estão descritas neste relatório, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para execução da invenção. Variações destas concretizações podem tornar-se evidentes para aqueles versados no estado da técnica ao lerem a descrição precedente. Os inventores esperam que técnicos versados no assunto empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja posta em prática de outra forma como especificamente descrita neste relatório. Dessa forma, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto recitado nas reivindicações anexas na forma permitida por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as suas variações possíveis é abrangida pela invenção, a não ser que indicado de outra forma neste relatório descritivo ou de outra forma claramente contraditado pelo contexto. Bibliografia Cernac, A. and Benning, C. (2004). WRINKLED1 encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J 40:575-585. Gamborg, O.L. et al. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50:151-158. Jako, C. et al. (2001). Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight. Plant Physiol 126:861-874. Jones, N.M.J. (1991). Jatropha curcas - a multipurpose species for problematic sites. Land Resources Series 1:1-12.

Li, M.L.H. et al. (2008). Establishment of an Agrobacterium- mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas.

Plant Cell Tiss Org Cult 92:173-181. Lu, C. et al. (2006). A high-throughput screen for genes from castor that boost hydroxy fatty acid accumulation in seed oils of transgenic Arabidopsis.

Plant J 45:847-856. Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.

Physiol Plant 15:473-497. Narayana, D.S.A et al. (2007). Distinct Begomoviruses Closely Related to Cassava Mosaic Viruses cause Indian Jatropha Mosaic Disease.

Int’l J Virol 3:1-11. Qu, J. et al. (2007). Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants.

J Virol 81:6690-6699. Sujatha, M. et al. (2008). Role of biotechnological interventions in the improvement of castor (Ricinus communis L.) and Jatropha curcas L.

Biotechnol Adv 26:424-435. van de Loo, F.J. et al. (1995). An oleate 12-hydroxylase from Ricinus communis L. is a fatty acyl desaturase homolog.

Proc Natl Acad Sci USA 92:6743-6747. Zou, J. et al. (1999). The Arabidopsis thaliana TAG1 mutant has a mutation in a diacylglycerol acyltransferase gene.

Plant J 19:645- 653

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para regenerar plantas de Jatropha curcas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar explantes de cotiledôneos em meio sólido de formação de calo, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6- benzilaminopurina (6-BA) e ácido 1-naftalenoacético (NAA) por um período de tempo para produzir explantes com tecido de calo; (b) cultivar o tecido de calo em um primeiro meio sólido de regeneração de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, adenina, 6-BA e ácido 3-indolbutírico (IBA) por um período de tempo para produzir tecido de calo com ramos e tecido de calo; (c) cultivar os ramos em um segundo meio sólido de regeneração de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA, IBA e ácido giberélico (GA 3) por um período de tempo para produzir ramos; (d) cultivar ramos da etapa (c) em um meio sólido de alongamento de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA e GA3 por um período de tempo para produzir ramos alongados; e (e) enraizar ou enxertar os ramos alongados, em que o enraizamento é realizado pela cultura dos ramos alongados em meio sólido de enraizamento, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, sacarose e IBA por um período de tempo para produzir plântulas, ou que a enxertia é realizada enxertando os ramos alongados em porta-enxertos de J. curcas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cultivar o tecido de calo da etapa (b) em um terceiro meio sólido de regeneração de ramos, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA e IBA por um período de tempo para produzir tecido de calo com ramos, o qual é então cultivado na etapa (c).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as concentrações de componentes dos meios são: (a) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; e NAA: aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0.1 mg/L, de preferência aproximadamente 0,05 mg/L, no meio de formação de calo; (b) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; adenina: aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, de preferência aproximadamente 2 mg/L; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; e IBA: aproximadamente 0,05 mg/L, no primeiro meio de regeneração de ramos; (c) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; IBA: aproximadamente 0,05 mg/L e GA 3: aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,5 mg/L, no segundo meio de regeneração de ramos; (d) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 0,3 mg/L; e GA 3: aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,1 mg/L, no meio de alongamento de ramos; e (e) sacarose: aproximadamente 3% e IBA: aproximadamente 0,07 g/L no meio de enraizamento.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a concentração dos componentes dos meios no terceiro meio de regeneração de ramos é de ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; IBA: aproximadamente 0,05 mg/L.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os períodos de tempo para a cultura são de: (a) aproximadamente duas semanas a aproximadamente três semanas na formação de calo; (b) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no primeiro meio de regeneração de ramos; (c) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no segundo meio de regeneração de ramos; (d) aproximadamente duas semanas a aproximadamente três semanas no meio de alongamento de ramos; e

(e) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no meio de enraizamento.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o período de tempo para cultura no terceiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente quatro semanas a aproximadamente cinco semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os períodos de tempo para a cultura são de: (a) aproximadamente três semanas na formação de calo; (b) aproximadamente três semanas no primeiro meio de regeneração de ramos; (c) aproximadamente quatro semanas no segundo meio de regeneração de ramos; (d) aproximadamente duas semanas no meio de alongamento de ramos; e (e) aproximadamente quatro semanas no meio de enraizamento.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o período de tempo para cultura no terceiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente quatro semanas a aproximadamente cinco semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas.

9. Método para transformação mediada por Agrobacterium de plantas de Jatropha curcas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cocultivar explantes de cotiledôneo com Agrobacterium em um meio sólido, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, acetosiringona (AS), 6-benzilaminopurina (6-BA) e ácido 1-

naftalenoacético (NAA) por um período de tempo para produzir explantes transformados de cotiledôneo; (b) cultivar explantes transformados de cotiledôneo em um meio sólido de formação de calo, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA, NAA, um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium no escuro por um período de tempo para produzir explantes com tecido de calo transformado; (c) cultivar o tecido de calo transformado em um primeiro meio sólido de regeneração de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, adenina, 6-BA, ácido 3-indolbutírico (IBA), um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium no escuro por um período de tempo para produzir tecido de calo transformado com ramos transformados e tecido de calo transformado; (d) cultivar os ramos transformados em um segundo meio sólido de regeneração de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA, IBA, ácido giberélico (GA 3), um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium no escuro por um período de tempo para produzir ramos transformados; (e) cultivar ramos transformados da etapa (c) em um meio sólido de alongamento de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA e GA3 por um período de tempo para produzir ramos transformados alongados; e (f) enraizar ou enxertar os ramos alongados transformados, em que o enraizamento é realizado cultivando os ramos alongados transformados em um meio sólido de enraizamento, o qual compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, sacarose e IBA por um período de tempo para produzir plântulas transformadas, ou em que a enxertia é realizada enxertando os ramos alongados transformados em porta- enxertos de J. curcas.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cultivar o tecido de calo transformado da etapa (c) em um terceiro meio sólido de regeneração de ramos, que compreende sais minerais de MS, vitaminas B5, ácido cítrico, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 6-BA, IBA, um agente seletivo e um erradicante de Agrobacterium por um período de tempo para produzir tecido de calo com ramos, que é então cultivado na etapa (d).

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as concentrações de componentes dos meios são de: (a) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; AS: aproximadamente 20 mg/L; 6-BA: 1,5 mg/L; e NAA: aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,1 mg/L, de preferência aproximadamente 0,05 mg/L, no meio de cocultivo; (b) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; e NAA: aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,1 mg/L, de preferência aproximadamente 0,05 mg/L, no meio de formação de calo; (c) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; adenina: aproximadamente 2 mg/L a aproximadamente 4 mg/L, de preferência aproximadamente 2 mg/L; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; e IBA: aproximadamente 0,05 mg/L, no primeiro meio de regeneração de ramos; (d) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; IBA: aproximadamente 0,05 mg/L e GA 3: aproximadamente 0,05 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,5 mg/L, no segundo meio de regeneração de ramos; (e) ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 0,3 mg/L; e GA 3: aproximadamente 0,1 mg/L a aproximadamente 0,5 mg/L, de preferência aproximadamente 0,1 mg/L, no meio de alongamento de ramos; and (f) sacarose: aproximadamente 3% e IBA: aproximadamente 0,07 g/L no meio de enraizamento.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as concentrações de componentes do meio no terceiro meio de regeneração de ramos são ácido cítrico: aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 30 mg/L, de preferência aproximadamente 10 mg/L; glutamina: aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 200 mg/L, de preferência aproximadamente 150 mg/L; hidrolisado de caseína: aproximadamente 100 mg/L; sacarose: aproximadamente 3%; 6-BA: aproximadamente 1,5 mg/L; IBA: aproximadamente 0,05 mg/L.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os períodos de tempo para a cultura são de: (a) aproximadamente 2-3 dias; (b) aproximadamente duas semanas a aproximadamente três semanas na formação de calo; (c) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no primeiro meio de regeneração de ramos; (d) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no segundo meio de regeneração de ramos; (e) aproximadamente duas semanas a aproximadamente três semanas no meio de alongamento de ramos; e (f) aproximadamente três semanas a aproximadamente quatro semanas no meio de enraizamento.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o período de tempo para cultura no terceiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente quatro semanas a aproximadamente cinco semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os períodos de tempo para a cultura são: (a) aproximadamente 2-3 dias; (b) aproximadamente três semanas na formação de calo; (c) aproximadamente três semanas no primeiro meio de regeneração de ramos; (d) aproximadamente quatro semanas no segundo meio de regeneração de ramos; (e) aproximadamente duas semanas no meio de alongamento de ramos; e (f) aproximadamente quatro semanas no meio de enraizamento.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o período de tempo para cultura no terceiro meio de regeneração de ramos é de aproximadamente quatro semanas a aproximadamente cinco semanas, de preferência aproximadamente quatro semanas.