BRPI0919827B1 - processos para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-methug-csf processo para a produção em escala grama de peg- r-methug-csf - Google Patents

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Kumar Paliwal Dinesh
Lal Saksena Divya
Shripati Pawar Digamber
Kumar Rana Dilip
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Shekhawat Rakesh
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Abstract

processo aperfeiçoado para peguilação de proteínas a presente invenção refere-se a um processo para aumentar o rendimento da reação de peguilação de r-methug-csf compreendendo conjugar r-methug-csf a um peg aldeído em uma porção amina livre na extremidade n terminal da g-csf na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula cnh2n+2on onde varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo onde a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo varia na faixa de o, 1 % a 10% p/p.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE UMA REAÇÃO DE PEGUILAÇÃO DE R-METHUG-CSF PROCESSO PARA A PRODUÇÃO EM ESCALA GRAMA DE PEG- R-METHUG-CSF.
Pedido Correlato:
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório
Indiano N° 2261/MUM/2008 depositado em 10 de outubro de 2008.
Campo Técnico da Invenção:
[0002] A presente invenção refere-se ao campo da modificação de proteínas, e, mais especificamente, a um processo aperfeiçoado para a fixação seletiva de polímero solúvel em água ao terminal N de proteínas ou análogos das mesmas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para a peguilação de rmetHuG-CSF, caracterizado pelo fato de a reação ser realizada na presença de álcool de açúcar, como, por exemplo, sorbitol.
Antecedentes da Invenção:
[0003] Proteínas para uso terapêutico encontram-se atualmente disponíveis em formas adequadas em quantidades adequadas principalmente como resultado dos avanços nas tecnologias de DNA recombinante. A disponibilidade de proteínas recombinantes comprometeu os avanços na formulação e modificação química de proteínas. Um objetivo de tal modificação é proteger as proteínas. A ligação química pode bloquear eficazmente uma enzima proteolítica contra o contato físico com o esqueleto da proteína, dessa forma evitando a degradação. Vantagens adicionais incluem, em certas circunstâncias, aumentar a estabilidade e o tempo de circulação da proteína terapêutica e diminuir a imunogenicidade. Um método comumente usado para a modificação de proteínas é por ligação covalente de polímeros solúveis em água.
[0004] Polietileno glicol (PEG) é uma dessas porções químicas
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2/33 que é usada na peguilação de produtos proteicos terapêuticos. O FDA dos Estados Unidos aprovou o PEG para uso como um veículo ou base em alimentos, cosméticos e fármacos, incluindo formulações injetáveis, tópicas, retais e nasais. As moléculas acopladas ao PEG passam a ser atóxicas, não imunogênicas, solúveis em água e em muitos solventes orgânicos, e as superfícies modificadas pela fixação de PEG passam a ser hidrófilas e a rejeitar proteínas.
[0005] O FDA aprovou diversos polipeptídios peguilados como terápicos e outros mais estão em fase de investigação clínica. Em 1990, pegademase (Adagen) recebeu aprovação para o tratamento de imunodeficiência combinada severa (SCID). Pegaspargase (Oncaspar), aprovado em 1994, contém a enzima peguilada Lasparaginase, usada clinicamente em combinação com quimioterapia para o tratamento de leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda e leucemia mileogênica crônica. Em 2001, peginterferon a2b (PegIntron) foi colocado à disposição como um tratamento semanal para hepatite C. Peginterferon a2a (Pegasys) aprovado em 2002 usou um PEG ramificado de segunda geração de 40 kDa conjugado através de um grupo s-NH2 de lisina usado como espaçador para interferon α2a aumentou a meia-vida do IFN-a2a de 9 para 77 horas. Uma forma peguilada de um antagonista do hormônio de crescimento humano chamado pegvisomant (Somavert) foi aprovado pelo FDA em 2003 para o tratamento de acromegalia. Doxil, uma formulação lipossômica peguilada de doxorubicina foi aprovada em 1995 para o tratamento de sarcoma de Kaposi. Pegfilgrastim (Neulasta), aprovado em 2002, é uma forma peguilada da antiga droga filgrastim (Neupogen) usada para o tratamento de neutropenia. Foram necessários 20 anos para que a peguilação emergisse como uma ferramenta farmacêutica viável. Durante este período ocorrem avanços importantes na química de peguilação, na geração de terápicos biomoleculares e na interpretação
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3/33 de conjugados PEG-biomolécula. Hoje em dia a peguilação está estabelecida como o melhor método para melhorar a farmacocinética e a farmacodinâmica de fármacos proteicos.
[0006] Uma variedade de PEGs ativos já foram preparados. mPEG succinimidil succinato e mPEG succinimidil carbonato foram os reagentes usados e aprovados pelo FDA dos Estados Unidos. Os reagentes tinham a limitação de formar ligações fracas entre a porção PEG e a proteína, possíveis reações secundárias indesejadas, contaminação, e restrição a PEGs de baixo peso molecular. As limitações acima foram superadas com o uso de mPEG-propionaldeído que era mais fácil de preparar. PEG aldeídos são inertes em relação à água e reagem principalmente com aminas. A inércia em relação à água é desejada, não apenas por causa da eficiência de armazenamento, preparação, e aplicação, mas também porque permite a ligação graduada, em meio aquoso, de moléculas a superfície a superfícies e de moléculas à molécula. O mPEG aldeído tem essencialmente todas as propriedades de um derivado de PEG ideal, isto é, é reativo com grupos nucleofílicos (tipicamente amino) em proteínas e superfícies; é estável em meio aquoso e na prateleira; é preparado e caracterizado com facilidade; e é capaz de acoplar a proteínas sem reduzir a atividade da proteína.
[0007] A Patente US N° 5.824.784 concedida a Amgen reivindica uma preparação substancialmente homogênea de G-CSF Nterminalmente monopeguilada ou análogo da mesma e um método para fixar um polietileno glicol a uma molécula de G-CSF onde a porção PEG tem um único grupo aldeído. O processo de peguilação reivindica reagir G-CSF com polietileno glicol em condições de alquilação redutora a um pH suficientemente ácido para ativar seletivamente o grupo alfa amino no terminal amino da G-CSF. O processo mostra a adição de um excesso molar 5 vezes maior de
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4/33 metoxipolietileno glicol aldeído de peso molecular médio de 6 kDa a uma solução agitada e resfriada (4°C) de rhG-CSF (1 ml, 5 mg/ml) em fosfato de sódio 100 mM, pH 5, contendo 20 mM NaCNBH3. A agitação da mistura reacional continuou à mesma temperatura. O derivado mono-mPEG-GCSF foi purificado por cromatografia de troca iônica usando uma coluna HiLoad 16/10 S SEPHAROSE HP e foi eluído por 400 minutos com um gradiente linear de 0% a 45% de acetato de sódio 20 mM, pH 4, contendo 1M NaCl. A composição % de mono-mPEG-GCSF no terminal N obtida por alquilação redutora não foi divulgada. Uma análise comparativa da estabilidade da G-CSF N terminalmente mono-peguilada obtida pela ligação amida (derivado usando N-hidróxi succinimidil éster de carboximetil metóxi polietileno glicol como nucleófilo) e do outro obtido pela ligação amina por 8 semanas rendeu 82% de pureza em relação àquele tendo uma ligação amina entre a proteína e o mPEG-aldeído. Um resultado surpreendente foi observado quando a ligação amina produziu um material com muito menos agregados contra aquele com ligação amida.
[0008] A presente invenção apresenta um processo simples e aperfeiçoado para aumentar a eficiência do processo de peguilação por meio da adição de um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo. De acordo com o exemplo 2 da Patente US N° 5.824.784, foi surpreendentemente descoberto que a adição de um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo ao tampão de peguilação depois da troca de tampão do tampão de armazenamento pelo tampão de peguilação e manutenção da concentração do referido poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo durante todo o processo de peguilação não apenas aumenta o rendimento de peguilação como também resulta na formação de rPetição 870200011536, de 24/01/2020, pág. 13/51
5/33 metHuG-CSF monopeguilada pura com pureza > 80% dessa forma minimizando a formação de agregados. Além disto a adição de poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo leva à quantidade mínima de r-metHuG-CSF não reagida em relação ao processo realizado na ausência do mesmo. [0009] Kinstler et al. investigaram a estabilidade em líquido da rhG-CSF depois de PEG com um peso molecular médio de 6000 daltons covalentemente ligado à metionina N-terminal onde a ligação covalente foi efetuada seja através de alquilação ou de acilação. Os conjugados rhG-CSF N-terminalmente peguilados foram purificados por cromatografia de troca catiônica. A caracterização física não indicou diferenças visíveis nas moléculas de rhG-CSF que foram conjugadas com qualquer um dos métodos. A estabilidade, em líquido a temperaturas elevadas, destas moléculas conjugadas indicou que a principal via de degradação foi a agregação. Conjugação através de alquilação ofereceu a distinta vantagem de diminuir, em aproximadamente 5 vezes, a quantidade de agregação presente em comparação com a acilação. Por conseguinte, foi sugerido que a agregação aumentada observada com o método de conjugação por acilação pode resultar da neutralização de cargas do grupo α-amino Nterminal de rhG-CSF.
[00010] Os efeitos prejudiciais da agregação nas formulações parenterais de proteínas terapêutica corrobora a importância de minimizar este tipo de degradação.
[00011] A agregação de proteínas e sua subsequente deposição como fibrilas insolúveis ou precipitados amorfos é responsável por inúmeras doenças tais como mal de Alzheimer, mal de Parkinson, doença de Huntington, e amiloidose sistêmica. A agregação de proteínas também é uma via de degradação dominante para proteínas terapêuticas, ocorrendo potencialmente durante todas as fases de
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6/33 produção, purificação, expedição, armazenamento, e administração. Agregados de proteínas em formulações proteicas distribuídas por via parenteral podem causar nos pacientes reações adversas que variam de respostas imunológicas a choque anafilático. É sempre necessário obter formulações parenterais estáveis através de minimização da formação de agregados que afetam a pureza e a atividade das proteínas durante sua vida de prateleira.
[00012] Carpenter et al. investigaram a agregação de rhGCSF, uma proteína que se agrega rapidamente e precipita a um pH 6,9 e 37°C. Foi descoberto que a rhGCSF monomérica nativa forma reversivelmente um dímero em condições fisiológicas e que a espécie dimérica não participa no processo de agregação irreversível. A sacarose, um estabilizante termodinâmico, inibe a agregação de rhGCSF. Carpenter et al. postularam que a sacarose agia reduzindo a concentração de espécies estruturalmente expandidas, consistente com a hipótese de que a exclusão preferencial favorece a maioria das espécies compactadas no conjunto em seu estado nativo.
[00013] Rajan et al., em um estudo conduzido em pH e temperatura fisiológicos, mostraram a fixação N-terminal de uma porção PEG de 20 kDa à GCSF tinham o poder de 1) prevenir a precipitação de proteínas tornando os agregados solúveis, e 2) reduzir a taxa de agregação em relação à GCSF.
[00014] Yun et al. apresentaram um novo derivadoa de mPEG, contendo um grupo de reação de 1-metil piridínio tolueno-4-sulfonato conjugado à rhGCSF e interferon de consenso para obter proteínas monopeguiladas homogêneas que foram identificadas por exclusão de tamanho de alta eficiência e espectrometria de massa MALDI-TOF.
[00015] Agregação é a aglomeração de proteínas que frequentemente é irreversível quando introduzida em fluidos fisiológicos, levando à inativação ou imunogenicidade aumentada. A
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7/33 agregação é um problema comum com fármacos proteicos e pode comprometer os rendimentos do processo de isolamento, limitar a vida de prateleira, causar falha na produção, e impedir aplicações em novos avanços na distribuição. A exposição de proteínas ao cisalhamento, agitação, e múltiplas superfícies é inevitável e pode induzir a agregação.
[00016] A concentração de proteínas é uma variável importante para melhorar a agregação. Espera-se que a reação relacionada com a conformação inicial que leva à agregação seja um processo de primeira ordem, mas também se espera que a subsequente agregação de estados não nativos seja um processo de segunda ordem ou de ordem mais alta porque a frequência de colisões varia com a concentração. Portanto, espera-se que a agregação seja acelerada com a concentração aumentada de proteínas.
[00017] Sorbitol (D-glucitol) é um poliol comumente usado como excipiente em formulações biológicas parenterais líquidas e até mesmo como agente adoçante de alimentos. O sorbitol proporciona uma eficaz estabilização das proteínas no estado líquido e diversos produtos biológicos comercializados são formulados em sorbitol incluindo Neulasta e Neupogen.
[00018] Carboidratos tais como sacarose, glicose, manose, e trealose assim como álcoois poli-hídricos como glicerol, sorbitol, e manitol também são frequentemente usados para aumentar a solubilidade de proteínas. Este efeito é presumivelmente mediado através de uma combinação de mecanismos que incluem efeitos de hidratação preferencial e aumento na tensão superficial do solvente assim como interações fracas com a superfície das proteínas. A excelente biocompatibilidade destes compostos faz com que eles tenham utilidade geral neste contexto uma vez que se observa pouco efeito na estrutura e atividade da proteína na presença de altas
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8/33 concentrações de polióis, especialmente carboidratos. O problema de solubilidade das proteínas é de muitas formas análogo ao problema de pregas nas proteínas no sentido de que diferenças muito pequenas entre os estados termodinâmicos complexos explicam o fenômeno. Segue-se daí que é necessária uma descrição exata dos dois estados de interesse críticos, a estrutura do invólucro de hidratação superficial da proteína e natureza dos contatos intermoleculares na fase sólida, para explicar quantitativamente a solubilidade de uma macromolécula particular. Alteração da solubilidade usando variáveis externas sugere que apenas pequenas alterações do solvente ou soluto devem ser suficientes para perturbar a solubilidade da proteína. A adição de compostos fisiologicamente aceitáveis tais como sais, açúcares, e aminoácidos pode ser usada para controlar a solubilidade da proteína de forma empírica. Como estes mesmos agentes vão às vezes aumentar a estabilidade da proteína, a combinação certa das circunstâncias pode resultar em um composto único proporcionado capacidade estabilizante, solubilizante, e tamponante.
[00019] Além do acima exposto, o uso de solventes orgânicos polares para aumentar a eficiência de peguilação já é conhecido na técnica anterior. A publicação PCT N° WO 02/28437 apresenta a peguilação em fase líquida do fator de liberação do hormônio de crescimento, que permite obter regiosseletivamente o conjugado GRFPEG tendo 1 molécula de PEG covalentemente ligada ao grupo εamino Lys12, caracterizada pelo fato de a reação ser realizada em um solvente estruturante, especificamente álcool e mais especificamente trifluoretanol. As vantagens citadas foram rendimentos mais altos e a escalabilidade do processo de peguilação.
[00020] Uma outra publicação PCT n° WO 2008/051383 A2 apresentou um método para produzir uma composição de matéria onde o método envolve obter um peptídio farmacologicamente ativo, e
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9/33 conjugar o peptídio a um PEG farmacologicamente aceitável por reação do peptídio com um composto de PEG-aldeído em uma porção amina livre no peptídio em uma solução de tampão compreendendo um cossolvente alcoólico. O uso do método é particularmente útil para a peguilação de peptídios que são relativamente insolúveis em um meio aquoso, tipicamente peptídios com solubilidade em água inferior a cerca de 0,1 a 10 mg/ml. Benefícios adicionais incluíam aceleração da reação de peguilação e eficiência de peguilação aumentada. A eficiência de peguilação por aminação redutora de sequências peptídicas se beneficia do uso de álcoois mais hidrófobos e o aumento de eficiência proporcionado por flúor álcoois foi mais vantajoso para reações de aminação redutora. A % de álcoois que se mostrou benéfica variou na faixa de 30% a 70% v/v.
[00021] O documento WO 2008/051383 A2 exemplificou o uso de álcool isopropílico (IPA), trifluoretanol (TFE), e álcool hexafluorisopropílico (HFIPA) como cossolventes para aumentar a eficiência de peguilação mostrando rendimentos de produto aumentados para a peguilação de peptídios relacionados com o gene de calcitonina (CGRP) que são relativamente insolúveis em um meio aquoso, tipicamente peptídios com solubilidade em água inferior a cerca de 0,1 a 10 mg/ml. O produto peptídico monopeguilado foi quantificado por integração de cromatogramas de RP-HPLC e reportados como % de pico do produto. 50% de IPA e 50% de TFE mostraram surpreendentemente um aumento 2,6 vezes maior no rendimento de produto com IPA e 4,1 vezes maior com TFE, respectivamente. Os rendimentos da reação de peguilação em quase 42 peptídios CGRP testados mostraram que a reação rende entre cerca de 50% e cerca de 70% contra menos de 20% observados na ausência do cossolvente alcoólico. Diversos cossolventes alcoólicos foram testados na solução de tampão quanto à reação de conjugação
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10/33 em uma tentativa de solubilizar peptídios menos solúveis e aumentar o rendimento de conjugados.
[00022] A técnica anterior acima é aplicável aos peptídios sintéticos produzidos por síntese de peptídios em fase sólida ou por síntese em fase líquida. No entanto, as condições rigorosas quando álcoois são usados a uma concentração alta não podem ser usadas para peguilar proteínas. Além disto, a peguilação foi realizada a uma concentração de 2 mg/ml em um tampão livre de amina (fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0) ao passo que no caso de proteínas como a rhG-CSF a peguilação tem que ser realizada pelo menos a uma concentração de 5 mg/ml e um pH ácido suficiente para que a reação seja concluída. Por conseguinte um elemento essencial da presente invenção é o uso de aditivos não perigosos para aumentar a eficiência de peguilação especialmente de proteínas. Também uma limitação inerente da técnica anterior é que a manipulação de álcoois voláteis e perigosos limita o uso para operações em grande escala.
[00023] Um elemento essencial da presente invenção é o surpreendente efeito de eficiência de peguilação e rendimento de produto aumentados por adição de um poliol ou um carboidrato ou um derivado do mesmo ao tampão de peguilação na presença de um agente redutor adequado mantendo a r-metHuG-CSF na forma solubilizada. Um outro elemento da presente invenção é desenvolver um processo de baixo custo e robusto para a produção em escala grama de PEG-r-metHuG-CSF onde a peguilação é realizada no tampão de armazenamento de r-metHuG-CSF simplesmente por concentração da proteína por adição de um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo, por ajuste do pH do meio reacional para induzir a reação de peguilação e conjugação do mPEG aldeído à r-metHuG-CSF onde o processo leva menos tempo e elimina a etapa inicial de troca de
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11/33 tampão. Ainda um outro elemento da presente invenção é a redução no uso da relação molar estequiométrica de r-metHuG-CSF para PEG de 1:5 para 1:2,5 onde a redução de custo obtido é de 1,5 vez em relação ao processo que usa um excesso de 5 molar do reagente PEG. Um outro elemento importante da invenção é eluir a r-metHuG-CSF monopeguilada na presença de um poliol ou carboidrato ou um derivado do mesmo usando um gradiente de sal na faixa de 0-500 mM e concentrar a r-metHuG-CSF monopeguilada agrupada contra um tampão de armazenamento consistindo essencialmente em poliol ou carboidrato ou um derivado do mesmo e um tensoativo não-iônico caracterizado pelo fato de a pureza de r-metHuG-CSF monopeguilada concentrada ser > 99%.
Objetivo da Invenção [00024] Existe sempre a necessidade de obter um processo aperfeiçoado e robusto para melhorar o rendimento da reação de peguilação para proteínas. O principal objetivo da invenção é um processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da GCSF na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo onde a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo varia na faixa de 0,1% a 10% p/p. constitui um outro objetivo da invenção um processo para a produção em escala grama de PEG- rmetHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF na presença de um agente redutor, o
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12/33 aperfeiçoamento constituindo conjugar a r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído com eliminação da etapa de troca do tampão pelo tampão de peguilação. Constitui ainda um outro objetivo da invenção um processo para a produção em escala grama de PEG- r-metHuGCSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuGCSF na presença de um agente redutor, caracterizado pelo fato de o PEG aldeído ser adicionado em uma relação molar estequiométrica de
2,5 em relação à r-metHuG-CSF. Constitui ainda um outro objetivo da invenção um processo para a produção em escala grama de PEG- rmetHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo to a PEG aldeído em uma porção amina livre no terminal N, isolar a monoPEG-r-metHuG-CSF usando cromatografia de troca iônica e eluir e concentrar a r-metHuG-CSF monopeguilada agrupada contra um tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM consistindo essencialmente em poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6 ou carboidrato ou um derivado do mesmo e um tensoativo não-iônico, caracterizado pelo fato de a pureza da r-metHuG-CSF monopeguilada concentrada ser > 99%.
Sumário da Invenção [00025] A presente invenção oferece um processo para a peguilação seletiva de proteínas.
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13/33 [00026] Mais especificamente, a presente invenção oferece um processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da GCSF na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo em que a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo varia na faixa de 0,1% a 10% p/p.
[00027] A presente invenção oferece ainda um processo para obter um rendimento aumentado da reação de peguilação de r-metHuG-CSF onde o rendimento da reação da r-metHuG-CSF monopeguilada é de pelo menos 80%.
[00028] A presente invenção oferece ainda um processo onde o teor de r-metHuG-CSF não reagida na reação de peguilação é inferior a 5%, de preferência inferior a 2%.
[00029] A presente invenção oferece ainda um processo para produzir r-metHuG-CSF monopeguilada com pureza > 99%.
[00030] A presente invenção oferece ainda um processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuGCSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da G-CSF na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo em que a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo na faixa de 0,1% a 10% p/p.
[00031] A presente invenção oferece ainda um processo para a produção em escala grama de PEG- r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento
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14/33 compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuGCSF na presença de um agente redutor o aperfeiçoamento constituindo conjugar a r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído com eliminação da etapa de troca do tampão pelo tampão de peguilação.
[00032] A presente invenção oferece ainda a um processo para a produção em escala grama de PEG- r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF na presença de um agente redutor caracterizado pelo fato de o PEG aldeído ser adicionado em uma relação molar estequiométrica de 2,5 em relação à r-metHuG-CSF.
[00033] A presente invenção oferece ainda um processo para a produção em escala grama de PEG- r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre no terminal N, isolar a monoPEG-rmetHuG-CSF usando cromatografia de troca iônica e eluir e concentrar a r-metHuG-CSF monopeguilada agrupada contra um tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM consistindo essencialmente em poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6 ou carboidrato ou um derivado do mesmo e um
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15/33 tensoativo não-iônico caracterizado pelo fato de a pureza da rmetHuG-CSF monopeguilada concentrada ser > 99%.
Breve Descrição dos Desenhos Anexos [00034] A maneira pela qual os objetivos e vantagens da invenção podem ser obtidos ficarão completamente evidentes a partir da descrição detalhada e dos desenhos anexos, que representam o seguinte:
[00035] Figura 1: Perfil de SEC-HPLC da r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV em que a peguilação é realizada na ausência de sorbitol. [00036] Figura 2: Perfil de SEC-HPLC da r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV onde a peguilação é realizada na presença de 5% sorbitol em tampão de peguilação.
[00037] Figura 3: SDS-PAGE não redutora de r-metHuG-CSF peguilada purificada de USV em diferentes concentrações; Faixa 1: PEG-GCSF de USV (2000 ng), Faixa 2: U PEG-r-metHuG-CSF de USV (1000 ng), Faixa 3: PEG- r-metHuG-CSF de USV (200 ng), Faixa 4: PEG- r-metHuG-CSF de USV (40 ng), Faixa 5: PEG- r-metHuG-CSF de USV (20 ng), Faixa 6: Neulasta (200 ng), Faixa 7: Neulasta (40 ng), Faixa 8: escada do peso molecular da proteína.
[00038] Figura 4: Perfil de SEC-HPLC de r-metHuG-CSF monopeguilada de USV com uma pureza >99%.
[00039] Figura 5: Perfil de mapeamento por HPLC do peptídio endoproteinase SV8 da r-metHuG-CSF monopeguilada; A: r-metHuGCSF monopeguilada de USV, B: Neulasta.
[00040] Figura 6: Perfil de SEC-HPLC de r-metHuG-CSF monopeguilada com uma pureza >99%; A: r-metHuG-CSF monopeguilada de USV; B: Neulasta.
[00041] Figura 7: Gráfico ilustrando uma comparação da bioatividade in vitro de r-metHuG-CSF monopeguilada de USV comparada com Neulasta & Neupogen.
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16/33 [00042] Figura 8: Perfil de SEC-HPLC da r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV onde a peguilação é realizada na presença de 5% sacarose em tampão de peguilação.
[00043] Figura 9: Perfil de SEC-HPLC de r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV de B.N°0309/F (escala de 8 g) em que a peguilação é realizada na presença de 5% sorbitol em tampão de peguilação.
[00044] Figura 10: Perfil de SEC-HPLC r-metHuG-CSF monopeguilada de USV com uma pureza >99% de B.N°0309/F (escala de 8 g).
[00045] Figura 11: Perfil de SEC-HPLC da r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV onde a peguilação é realizada na presença de 5% sorbitol em tampão acetato, pH 5,0, com uma proporção r-metHuGCSF : mPEG propionaldeído de 1:2,5.
[00046] Figura 12: Perfil de SEC-HPLC da r-metHuG-CSF peguilada bruta de USV em que a peguilação é realizada na presença de 5% sorbitol em tampão acetato, pH 5,0.
Descrição Detalhada da Invenção [00047] A ligação covalente de polietileno glicol (PEG) a uma proteína terapêutica é frequentemente usada para aumentar a meiavida daquela proteína nos pacientes e ao mesmo tempo reduzir sua resposta imunogênica. A peguilação específica para o sítio é uma abordagem atraente para maximizar o valor terapêutico de drogas peguiladas porque este processo gera apenas isômero peguilado com propriedades otimizadas. Agentes modificadores específicos para aminas incluem PEG NHS éster, PEG tresilato, PEG aldeído, PEG isotiocianato, e vários outros. Todos eles reagem em condições moderadas e são muito específicos para grupos amino. O PEG-NHS éster talvez seja um dos agentes mais reativos; no entanto, sua alta reatividade pode dificultar o controle da reação de peguilação em grande escala. O PEG aldeído forma uma imina com o grupo amino,
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17/33 que é então reduzida para uma amina secundária com cianoboroidreto de sódio. O cianoboroidreto de sódio não reduz as ligações dissulfeto mas a substância química é altamente tóxica e deve ser manipulada com cautela, particularmente a um pH mais baixo onde ela fica volátil. Devido à presença de múltiplos resíduos lisina na maioria das proteínas, a peguilação específica para o sítio pode se tornar um desafio. Mas como o reagente PEG aldeído reage com grupos amino desprotonados, é possível direcionar a peguilação para grupos amino de pK mais baixo efetuando a reação a um pH mais baixo. Geralmente o pK do grupos alfa-amino é 1-2 unidades de pH mais baixo que aquele do grupo epsilon-amino dos resíduos lisina. Com a peguilação da molécula a um pH 7 ou inferior, é possível atingir com frequência alta seletividade para o terminal N. A abordagem é extremamente útil para proteínas nas quais a porção N terminal não é essencialmente necessária para bioatividade.1 [00048] Um aspecto específico da invenção é um processo para aumentar o rendimento da reação de peguilação compreendendo conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo. Foi surpreendentemente descoberto durante a troca de tampão da r-metHuG-CSF concentrada tendo uma concentração de 2 mg/ml ou mais pelo tampão de peguilação (tampão acetato, pH 5,0) onde a proteína tende a precipitar causando uma perda líquida de 25% e resultando portanto em rendimento reduzido de produto monopeguilado, mas com a simples adição de um a poliol tendo a fórmula de CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo ao tampão de peguilação durante a troca de tampão resultou em rendimento aumentado de produto peguilado e
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18/33 impediu a perda de r-metHuG-CSF. O produto peguilado continha essencialmente pelo menos 80% de r-metHuG-CSF monopeguilado e teve uma eficiência de peguilação de 98%. A r-metHuG-CSF monopeguilada N-terminal tinha uma pureza essencialmente >99% com impurezas totais de no máximo 1%.
[00049] Tampão de peguilação conforme usado neste relatório significa qualquer solução tampão aquosa feita com qualquer tampão conhecido na literatura bioquímica que proporcione tamponamento de pH 4,0 a pH 6,0, com cerca de pH 5 sendo preferido para realizar a peguilação específica para o sítio de r-metHuG-CSF. Estes tampões podem incluir, porém sem limitação, acetato, citrato, glutamato, sorbato, succinato, ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfônico (MES), ou fosfato. Concentrações de tampão úteis podem variar de 5 mM a 100 mM.
[00050] Por polióis conforme usado neste relatório entende-se qualquer poliol selecionado do grupo derivado dos carboidratos tendo pelo menos três átomos de carbono. Estes têm a fórmula geral CnH2n+2On, onde n varia de 3 a 6.
[00051] Eles incluem, porém sem limitação, sorbitol, manitol, eritritol, glicerol, xilitol e ribitol. Em uma modalidade particular da invenção o poliol é adicionado a tampão de peguilação em uma quantidade de 0,1% a 10% p/p, em particular em uma quantidade de 0,5% a 5% p/p. De preferência o poliol escolhido também é aquele usado para estabilizar a r-metHuG-CSF assim como a formulação de PEG- r-metHuG-CSF.
[00052] Por carboidratos conforme usado neste relatório entende-se qualquer um dos carboidratos tendo quatro ou mais átomos de carbono, de preferência de 4 a 6 átomos de carbono. Em particular um monossacarídeo selecionado do grupo que consiste em glicose, frutose, manose e galactose é preferido ou um dissacarídeo
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19/33 selecionado do grupo que consiste em lactose, maltose, trealose e sacarose é preferido. Em uma modalidade particular da invenção o carboidrato é adicionado ao tampão de peguilação em uma quantidade de 0,1% a 10% p/p, em particular em uma quantidade de 0,5% a 5% p/p.
[00053] Por derivados conforme usado neste relatório entende-se derivados incluindo metil glicosídeos, ácidos glucorônicos, amino açúcares, ou N-acetil glicosaminas.
[00054] Por tampão de armazenamento entende-se qualquer solução tampão aquosa feita com qualquer tampão conhecido na literatura bioquímica que proporcione tamponamento de pH 4,0 a pH 6,0, com cerca de pH 5 sendo de preferência usado como veículo carreador aquoso para armazenar r-metHuG-CSF assim como PEG-rmetHuG-CSF. Estes tampões podem incluir, porém sem limitação, acetato, citrato, glutamato, succinato, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), ou fosfato. Concentrações de tampão úteis podem variar de 0,5 mM a 100 mM.
[00055] Por rendimento do produto peguilado conforme usado neste relatório entende-se o produto peguilado total formado incluindo o produto monopeguilado, e dímeros de peso molecular mais alto e agregados, segundo determinado por SEC-HPLC.
[00056] Por rendimento do produto monopeguilado conforme usado neste relatório entende-se o teor de produto monopeguilado, segundo determinado por SEC-HPLC.
[00057] Por r-met-HuG-CSF não reagida conforme usado neste relatório entende-se a proteína r-met-HuG-CSF que não reagiu com PEG aldeído.
[00058] Por r-metHuG-CSF conforme usado neste relatório entendese o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) humanos metionil recombinante, uma proteína de 175 resíduos produzida em
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Escherichia coli.
[00059] Por PEG-r-met-HuG-CSF conforme usado neste relatório entende-se peguilar r-metHuG-CSF na metionina N terminal com reagente PEG aldeído usando alquilação redutora na presença de um agente redutor em condições suficientes para efetuar a peguilação no terminal N.
[00060] Por rendimento da reação de peguilação conforme usado neste relatório entende-se a quantidade total de proteína convertida nos conjugados peguilados incluindo uma mistura de dímeros e agregados monopeguilados de peso molecular mais alto, segundo determinado por HPLC por exclusão de tamanho.
[00061] Por escala grama conforme usado neste relatório entendese realizar a peguilação da proteína em uma escala de pelo menos um grama ou mais.
[00062] Em um aspecto diferente, a presente invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para maximizar a quantidade de produto peguilado produzida durante a reação de peguilaçã com minimização dos custos associados à produção do produto monopeguilado através da eliminação da etapa de precipitação da proteína durante a concentração e subsequentemente durante a peguilação pela simples adição de um poliol tendo a fórmula de CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo antes da concentração e subsequentemente durante a troca de tampão do tampão de peguilação onde o rendimento do produto peguilado é 98% e o rendimento de produto da espécie monopeguilada é de pelo menos 80% contra o rendimento de produto peguilado de 80% e o rendimento de produto da espécie monopeguilada de 74,33% para o controle.
[00063] Um outro aspecto da presente invenção é minimizar o impacto no custo por grama de r-metHuG-CSF monopeguilada. Quando um processo para a produção de uma droga proteica é
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21/33 otimizado, existem três considerações principais: alta qualidade do produto (pureza, estabilidade, e atividade), robustez do processo, e custo baixo. A redução de custo é crítica durante o aprimoramento do processo em escala grama. Os possíveis problemas durante um aprimoramento efetivo para um processo de peguilação envolvem grandes volumes de processamento a baixas concentrações de proteína. Por conseguinte concentração de proteína antes da peguilação aumenta os custos de produção. Implicações de custos com o uso de ultrafiltração (UF) ou diafiltração (DF) ou filtração de fluxo tangencial (TFF) para concentrar a proteína não podem ser evitadas. Porém, se eliminado o custo adicional decorrente de diafiltração do produto para a troca de tampão do tampão de peguilação contendo um agente redutor pode poupar uma grande parcela dos custos de peguilação. Também se sabe na técnica anterior que a r-metHuG-CSF em uma concentração mais alta é bastante instável e tem uma tendência inerente para precipitar. Por conseguinte, uma reação de peguilação rápida é preferida para evitar a instabilidade da alta concentração de proteína, o que necessita de um estabilizante e reforma das ligações S-S envolvendo o Cys superficial.
[00064] Assim sendo, um aspecto essencial da invenção é a eliminação total da segunda etapa de diafiltração, evitando assim a troca de tampão pelo tampão de peguilação pela simples adição de mPEG-aldeído ao tampão de armazenamento na presença de um agente redutor onde foi surpreendentemente descoberto que o rendimento de r-metHuG-CSF monopeguilada ainda é > 80%. A invenção contempla o uso de tampão acetato, pH 5,0 que também é um tampão de armazenamento para Neupogen assim como para Neulasta. A presente invenção oferece portanto um processo de peguilação simplificado pela simples do reagente mPEG aldeído e cianoboroidreto de sódio à formulação de filgrastim comercialmente
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22/33 disponível para obter o efeito desejado.
[00065] Além do acima exposto, um aspecto essencial da presente invenção é reduzir o impacto do custo das matérias-primas sobre a produção de monoPEG r-metHuG-CSF por meio de otimização da relação molar de PEG aldeído para r-metHuG-CSF. Para modificações específicas para amina, os parâmetros a serem considerados ao se desenvolver um procedimento de peguilação incluem a concentração de proteína, a proporção de PEG para proteína (em uma base molar), a temperatura, o pH e o tempo de reação. Holtschlag et al. apresentam um processo para otimização de uma reação de peguilação usando Projeto de Experiências por meio de otimização da proporção PEG/proteína, pH e proporção agente redutor/proteína no respectivo rendimento de produto monopeguilado. Os dados demonstraram que a espécie monopeguilada foi mais alta nas seguintes condições: pH 6,74, uma relação molar de 3,0 para o agente redutor, e uma relação PEG/proteína de 2,25 com um rendimento de 78,7%. No entanto, quando o custo e a disponibilidade dos reagentes são levados em consideração (além do tempo necessário para ajuste do pH durante a produção) as condições que resultaram na espécie monopeguilada mais alta e no custo mais baixo foram pH 7,0, uma relação molar de 2,0 para o agente redutor, e uma relação PEG/proteína de 1,75 com um rendimento reduzido para 72,1%. Na presente invenção foi surpreendentemente descoberto que com a relação molar PEG/proteína quando reduzida de 5:1 para 2,5:1, o rendimento de produto monopeguilado ainda era > 80% onde a redução no custo por grama do produto foi de 1,5 vez.
[00066] Treuheit et al. descreveram o desenvolvimento da formulação para Neulasta (pegfilgrastim), e as técnicas analíticas usadas para monitorar a degradação durante esses estudos. A estabilidade foi avaliada em função do pH, da concentração de
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23/33 proteína, do tipo de tampão, dos modificadores de tonicidade e da concentração de tensoativo tanto em condições aceleradas como em armazenamento prolongado quiescente. Treuheit et al. descreveram o papel dos tensoativos nas formulações para proteger a proteína em várias interfaces potencialmente desestabilizantes e para alterar a estabilidade conformacional termodinânica das proteínas.
Alternativamente, o uso de tensoativos estabiliza a proteína minimizando a agregação induzida por congelamentodescongelamento, armazenamento quiescente, estresse térmico e agitação. O polissorbato 20 foi preferido ao polissorbato 80 porque está disponível a partir de uma fonte de vegetal.
[00067] Kinstler et al.(2002) apresentaram um método direcionado para o sítio de unir proteínas a polietileno glicol para a preparação de derivados PEG-proteína essencialmente homogêneos com uma única cadeia de PEG conjugada ao terminal amina da proteína por condução da alquilação redutora de proteínas com PEG-aldeídos a um pH mais baixo. O exemplo funcional ilustrou as condições nas quais a uma solução de r-metHuG-CSF (5 mg/ml) em acetato de sódio 100 mM, pH 5,0, contendo cianoboroidreto de sódio 20 mM foi adicionado um excesso molar cinco vezes maior de mPEG aldeído de 6kDa e reagentes foram agitados em um banho de gelo. A extensão de modificação da proteína foi monitorada por HPLC por exclusão de tamanho empregando uma coluna Bio-Sil SEC250-5 eluída com fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 150 mM, azida de sódio 10 mM, pH 6,8, a 1 ml/minuto. Ao final de 10 horas, 92% da proteína haviam sido convertidos no conjugado mono-PEG, o pH foi ajustado em 4,0 com HCl 100 mM e diluído 5 vezes com HCl 1 mM. O conjugado monomPEG-r-metHuG-CSF foi isolado por cromatografia de troca iônica usando uma coluna HiLoad 16/10 SP Sepharose HP equilibrada com tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,0, e eluída com um gradiente
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24/33 linear de 0-1 M NaCl.
[00068] Sempre existe a necessidade de desenvolver processos de baixo custo para a peguilação de proteínas por meio de otimização das etapas de processamento descendente e concentração neutralizando a perda de proteína peguilada durante o processo. Um outro elemento da presente invenção é a surpreendente descoberta onde durante isolamento da monoPEG-r-metHuG-CSF usando cromatografia de troca iônica e eluição da referida monoPEG-r-metHuG-CSF e concentração adicional da r-metHuG-CSF monopeguilada agrupada contra um tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM com 5% sorbitol ou sacarose e essencialmente um tensoativo não iônico produziu r-metHuG-CSF monopeguilada com > 99% contra a etapa de concentração realizada na ausência do tensoativo não-iônico.
[00069] Uma modalidade da presente invenção é um processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuGCSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da G-CSF na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo onde a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo na faixa de 0,1% a 10% p/p.
[00070] Uma segunda modalidade da presente invenção é um processo para a produção em escala grama de PEG-r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF na presença de um agente redutor o
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25/33 aperfeiçoamento constituindo conjugar a r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo to a PEG aldeído com eliminação da etapa de troca do tampão pelo tampão de peguilação.
[00071] Uma terceira modalidade da presente invenção é um processo para a produção em escala grama de PEG-r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuGCSF na presença de um agente redutor caracterizado pelo fato de o PEG aldeído ser adicionado em uma relação molar estequiométrica de
2,5 em relação à r-metHuG-CSF.
[00072] Uma quarta modalidade da invenção é um processo para a produção em escala grama de PEG-r-metHuG-CSF compreendendo conjugar r-metHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre no terminal N, isolar a monoPEG-rmetHuG-CSF usando cromatografia de troca iônica e eluir e concentrar a r-metHuG-CSF monopeguilada agrupada contra um tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM consistindo essencialmente em poliol tendo a fórmula CnH2n+2On onde n varia de 3 a 6 ou carboidrato ou um derivado do mesmo e um tensoativo não-iônico caracterizado pelo fato de a pureza da rmetHuG-CSF monopeguilada concentrada ser > 99%.
EXEMPLOS:
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Exemplo -1 [00073] Concentração e diafiltração (troca de tampão) da r-metHuGCSF:
[00074] A solução de estoque líquida de r-metHuG-CSF oriunda de USV (concentração de cerca de 1,9 mg/ml fornecida em acetato de sódio 10 mM, 5% sorbitol pH 4,0) que foi armazenada a 2-8°C, foi dividida em alíquotas do estoque. A proteína foi então concentrada para cerca de 6-7 mg/ml. A amostra foi diluída duas vezes o volume com tampão fosfato de sódio 100 mM pH 5,0 contendo cianoboroidreto de sódio 20 mM e 5% Sorbitol. A diluição e concentração foram feitas 3 vezes com o tampão. A concentração diafiltrada final foi de 67mg/ml. O procedimento de diafiltração foi efetuado a 4°C em um banho de gelo. A solução concentrada foi então armazenada a 4°C ou levada para a reação de peguilação. A % de recuperação da rmetHuG-CSF após troca de tampão e concentração foi de cerca de 95% a 97%.
Exemplo -2 [00075] Preparação de r-metHuG-CSF peguilada:
[00076] A proteína diafiltrada e quantificada obtida no exemplo 1 foi colocada em um frasco de vidro de 250 ml. Um tampão consistindo em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 5,0 com cianoboroidreto de sódio 20 mM e com/sem 5% Sorbitol foi adicionado à mistura reacional. O metoxi-polietileno glicol-propionaldeído (mPEG-aldeído; SUNBRIGHT ME-200AL da NOF Corp., Japão) de aproximadamente 20 Kda foi adicionado à solução de proteína agitada acima. O mPEG-aldeído foi então transferido para o frasco contendo a solução de proteína. A concentração de proteína foi mantida a 5 mg/ml. A mistura reacional foi então agitada a 2-8°C por uma noite. A mistura reacional foi resfriada bruscamente pela adição de tampão acetato de sódio 40 mM pH 4,0 com e sem 5% Sorbitol no tampão (volume completado até cinco
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27/33 vezes o volume da reação) (figuras 1 & 2).
[00077] A percentagem de conversão de r-metHuG-CSF foi >98% onde a peguilação foi realizada na presença de sorbitol.
Exemplo -3 [00078] Purificação usando cromatografia de troca iônica:
[00079] A r-metHuG-CSF peguilada obtida no exemplo -2 foi carregada em uma coluna de troca catiônica fraca tendo a seguinte especificação:
Sistema: sistema de pressão média AKTA UPC 100 [00080] A proteína peguilada foi eluído em um modo de gradiente usando o sistema tampão que se segue.
Tampão A: acetato de sódio 40 mM em 5% Sorbitol pH 4,0
Tampão B: acetato de sódio 40 mM, 5% Sorbitol, NaCl 0,5 M pH 4,0 [00081] As frações contendo a mono PEG-r-metHuG-CSF (>99%) foram agrupadas. Polissorbato 20 (Tween 20) foi adicionado a essas frações antes da concentração. A amostra foi concentrada e diafiltrada com acetato de sódio 10 mM, 5% Sorbitol, Tween 20. A concentração final obtida foi >10mg/ml, com a pureza de mono PEG r-metHuG-CSF >99% (figura 4). A tabela 1 mostra o efeito da adição de 5% sorbitol ao tampão de peguilação e subsequente adição de tween-20 ao tampão de armazenamento antes da concentração.
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Tabela 1: Análise comparativa para peguilação realizada na presença e na ausência de sorbitol
Etapa envolvida Na ausência de sorbitol Na presença de 5% sorbitol
% Agregados % Dímero % r-metHuG-CSF monopeguilada % r-metHuGCSF não reagida % Agregados % Dímero % r-metHuG-CSF monopeguilada % r-metHuGCSF não reagida
Peguilação 0,36 4,39 74,33 21,03 0,24 16,62 82,32 0,83
Purificação e agrupamento antes da concentração NA NA NA NA 0,07 0,2 99,73 -
Purificação e concentração na ausência de tween 20 0,33 0,35 99,03 @ 0,953 mg/ml 0,29 0,09 0,42 99,49 @ 5 mg/ml -
0,17 0,73 99,11 @ 9,35 mg/ml -
Purificação e concentração na presença de tween 20 0,20 0,18 99,26 @ 0,982 mg/ml 0,36 0,09 0,14 99,76 @ 5 mg/ml
0,09 0,25 99,66 @ 10,52 mg/ml -
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29/33 [00082] A r-metHuG-CSF monopeguilada de USV foi caracterizada usando 1) SDS-PAGE não redutora de r-metHuG-CSF peguilada purificada de USV (figura 3), 2) perfil de HPLC por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) de r-metHuG-CSF monopeguilada de USV sobreposta com Neulasta (Figura 6), 3) análise por mapeamento de peptídios (figura 5), 4) bioensaio de r-metHuG-CSF in vitro (figura 7), 5) teste in vivo em camundongos.
Exemplo 4:
[00083] Atividade Biológica:
[00084] Células NFS-60 (ATCC CRL 1838) cultivadas em RPMI + 10% FBS foram usadas para o ensaio de proliferação celular de PEGr-metHuG-CSF. As células foram plaqueadas em uma placa de 96 compartimentos e incubadas com GCSF monopeguilado de USV na faixa de concentração de 10 - 100 pg/ml por 72 horas em uma incubadora umidificada a 37°C e 5% CO2. 5 mg/ml de solução de MTT feita em PBS foram adicionados a cada compartimento. As placas foram incubadas em uma incubadora umidificada a 37°C e and 5% CO2 por 4-5 horas.
[00085] MTT é usado para a determinação quantitativa da proliferação celular e ativação em resposta à PEG-r-metHuG-CSF. O ensaio baseia-se na clivagem do sal de tetrazólio amarelo MTT ando cristais de formazan roxos por células ativas metabólicas. Estes cristais são então dissolvidos pela adição de uma solução de SDS a 25% acidificada.
[00086] O produto de formazan solubilizado foi quantificado por espectrofotometria usando uma leitora de ELISA a 570 nm. Um aumento no número de células vivas resultou em um aumento na atividade metabólica total na amostra. Este aumento tem correlação direta com a quantidade de cristais de formazan roxos formados, segundo monitorado pela absorvência.
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Exemplo 5:
[00087] Atividade in vivo:
[00088] A farmacinética e a farmacodinâmica da r-metHuG-CSF peguilada foram avaliados em ratos Sprague Dawley machos. Uma única dose subcutânea (100 mcg/kg de peso corporal) de r-metHuGCSF peguilada (USV) foi administrada aos animais experimentais. Amostras de sangue foram coletadas 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 e 216 horas após a administração. As amostras de sangue foram divididas em duas alíquotas. O plasma foi separado de uma alíquida e a concentração de r-metHuG-CSF foi medida por ELISA usando um kit comercialmente disponível. A segunda alíquota de sangue foi submetida à estimativa de contagem absoluta de neutrófilos (ANC), um parâmetro para a avaliação da resposta farmacodinâmica. A r-metHuG-CSF monopeguilada (USV) teve uma meia-vida de eliminação de cerca de 12 horas. O aumento na ANC atingiu um pico em 48 horas e a ANC voltou para os valores de prétratamento ao final de 168 horas.
Exemplo 6:
[00089] Concentração e diafiltração (troca de tampão) da r-metHuGCSF na presença de 5% Sacarose:
[00090] A solução de estoque líquida de r-metHuG-CSF oriunda de USV (concentração ca 2,04 mg/ml) que foi armazenada a 2-8°C, foi dividida em alíquotas do estoque. A proteína foi então concentrada para cerca de 6-7 mg/ml. A amostra foi diluída duas vezes o volume com tampão fosfato de sódio 100 mM pH 5,0 contendo cianoboroidreto de sódio 20 mM e 5% Sacarose. A diluição e concentração foram feitas 3 vezes com o tampão. A concentração diafiltrada final foi de 67mg/ml. A solução concentrada foi então armazenada a 4°C ou levada para a reação de peguilação. A % de recuperação da r-metHuG-CSF após troca de tampão e concentração foi quase quantitativa.
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Exemplo 7:
[00091] Preparação de r-metHuG-CSF peguilada na presença de 5% Sacarose:
[00092] A proteína diafiltrada e quantificada obtida no exemplo 1 foi colocada em um frasco de vidro de 250 ml. Um tampão consistindo em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 5,0 com cianoboroidreto de sódio 20 mM e com/sem 5% Sacarose foi adicionado à mistura reacional. O metoxi-polietileno glicol-propionaldeído (mPEG-aldeído; SUNBRIGHT ME-200AL da NOF Corp., Japão) de aproximadamente 20 Kda foi adicionado à solução de proteína agitada acima. O mPEG-aldeído foi então transferido para o frasco contendo a solução de proteína. A concentração de proteína foi mantida a 5 mg/ml. A mistura reacional foi então agitada a 2-8°C por uma noite. A mistura reacional foi resfriada bruscamente pela adição de tampão acetato de sódio 40 mM pH 4,0 com e sem 5% Sacarose no tampão (volume completado até cinco vezes o volume da reação) (figura 8).
Exemplo 8:
[00093] Preparação do processo de peguilação na escala de 8 gramas:
A) Concentração e Difiltração:
[00094] 8 g de Filgrastim API foram concentrados para 1,6 litro usando um cassete de 5 kDA. A solução de proteína concentrada foi diafiltrada contra o tampão fosfato de sódio 100 mM pH 5,0 + 5% sorbitol. Depois da diafiltração a solução de proteína foi recolhida em um frasco de 2 litros. O teor de proteína foi estimado usando UV 280 nm.
B) Peguilação:
[00095] A proteína concentrada por TFF foi ajustada em 5,5 mg/ml usando o tampão de diafiltração acima. A solução de proteína foi então mantida a 5°C com agitação. Depois que a temperatura da mistura
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32/33 reacional atingiu um valor abaixo de 7°C, 5,2 g de metoxi-polietileno glicol-propionaldeído foram adicionados para cada grama de proteína. 111 ml de solução de estoque de cianoboroidreto de sódio 200 mM foram adicionados por litro de solução de proteína para obter uma composição 20 mM. A reação de peguilação foi realizada por 16 horas a 5°C com agitação. O rendimento de monoPEG-r-metHuG-CSF depois de 16 horas de reação era de mais de 80% (figura 9). Depois de terminada, a reação foi interrompida por diluição da mistura reacional com 4 vezes (v/v) acetato de sódio 50 mM pH 4,0 + 5% sorbitol a 10 oC.
C) Cromatografia de troca iônica:
[00096] 1,6 litro de matriz CM-HP sepharose acondicionada em uma coluna Quickscale 100 foi equilibrada com acetato de sódio 50 mM pH 4,0 + 5% sorbitol a 10 oC. A solução de proteína peguilada foi diluída com água para atingir uma condutividade inferior a 3 ms/cm antes do carregamento. Depois do carregamento a coluna foi primeiro lavada com tampão de equilíbrio e em seguida a proteína foi eluída usando um gradiente linear na faixa de 0-500 mM cloreto de sódio. Frações da proteína com pureza de monômero superior a 99% foram agrupadas para a etapa seguinte.
D) Concentração e diafiltração:
[00097] 10 ml de uma solução estoque de Tween 20 (3,3 mg/ml) foram adicionados por litro de fração agrupada. As frações agrupadas foram então concentradas por um cassete de 10 kDa até 2 mg/ml e em seguida diafiltradas contra acetato 10 mM (pH 4,0) + 5% sorbitol + 0,0033% tampão Tween 20. Depois da diafiltração, a solução de proteína até mais de 10 mg/ml. A solução de proteína concentrada foi então filtrada por um filtro de cápsula de 0,2 μ para obter uma concentração de proteína superior a 10 mg/ml e pureza de monômero superior a 99% (figura 10).
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Exemplo 9:
[00098] Concentração e diafiltração e peguilação em tampão acetato (pH 4,0):
[00099] r-metHuG-CSF API foi concentrada em tampão acetato 20 mM (pH 4,0) até 5,5 mg/ml. O pH foi então ajustado em 5,0 usando acetato de sódio 2 M de pH não ajustado. A reação de peguilação, a cromatografia de troca iônica e a concentração foram realizadas de acordo com o procedimento do Exemplo 8 (Figura 12).
Exemplo 10:
[000100] Concentração e diafiltração e peguilação em tampão acetato (pH 4,0) com uma relação proteína:mPEG-aldeído de 1:2,5: [000101] 2,6 g de metoxi-polietileno glicol-propionaldeído foram adicionados por grama de proteína em vez de 5,2 g e a reação foi realizado por 20 horas. O rendimento de monoPEG r-metHuG-CSF foi de 80% em tampão acetato 20 mM pH 5,0. A reação de peguilação, a cromatografia de troca iônica e a concentração foram realizadas de acordo com o procedimento do exemplo 8 (figura 11).
[000102] Embora a presente invenção tenha sido descrita acima em relação a modalidades preferidas ou ilustrativas, estas modalidades não pretendem ser completas ou limitativas da invenção. Ao contrário, a invenção pretende cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes incluídos em seu espírito e escopo, segundo definidos pelas reivindicações anexas.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuG-CSF, caracterizado pelo fato de que compreende conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF em uma solução de tampão de peguilação que compreende um carboidrato, ou um derivado do mesmo na presença de um agente redutor, em que o carboidrato é um monossacarídeo selecionado do grupo que consiste em glicose, frutose, manose e galactose ou um dissacarídeo selecionado do grupo que consiste em lactose, maltose, trealose e sacarose, e em que o referido derivado é selecionado do grupo que consiste em metil glicosídeos, ácidos glucorônicos, amino açúcares e N-acetil-glucosaminas.
  2. 2. Processo para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-metHuG-CSF, caracterizado pelo fato de que compreende conjugar r-metHuG-CSF a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF na presença de um agente redutor em uma solução de tampão de peguilação que compreende um carboidrato, ou um derivado do mesmo em que a concentração do referido poliol ou carboidrato ou derivado do mesmo varia na faixa de 0,1% a 10% p/p, em que o carboidrato é um monossacarídeo selecionado do grupo que consiste em glicose, frutose, manose e galactose ou um dissaca-rídeo selecionado do grupo que consiste em lactose, maltose, trealose e sa-carose, e em que o referido derivado é selecionado do grupo que consiste em metil glicosídeos, ácidos glucorônicos, amino açúcares e N-acetil-glucosaminas.
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    2/3
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o carboidrato é sacarose.
  4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o PEG aldeído é metóxi polietileno glicol propionaldeído de 20 Kda.
  5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é selecionado do grupo que consiste em boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, dimetilamina borano, trimetilamina borano, triacetóxi boroidreto de sódio e piridina borano.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cianoboroidreto de sódio.
  7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a r-metHuG-CSF peguilada é ainda submetido à cromatografia de troca iônica e a rmetHuG-CSF monopeguilada é eluída com um gradiente linear de 0500 mM de sal.
  8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pureza cromatográfica por exclusão de tamanho da r-metHuG-CSF monopeguilada eluída e agrupada é > 99%.
  9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o tampão de peguilação é selecionado do grupo que consiste em acetato, citrato, glutamato, sorbato, succinato, ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfônico (MES), ou fosfato com uma molaridade na faixa de 0,5 mM a 100 mM.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tampão de peguilação é tampão fosfato 100 mM, pH 5,0 com 5% sorbitol ou 5% sacarose.
  11. 11. Processo para a produção em escala grama de PEG- r
    Petição 870200011536, de 24/01/2020, pág. 44/51
    3/3 metHuG-CSF, caracterizado pelo fato de que compreende conjugar rmetHuG-CSF em solução de tampão de armazenamento tendo uma molaridade na faixa de 10 mM a 50 mM compreendendo um poliol tendo a fórmula CnH2n+2On em que n varia de 3 a 6, ou um carboidrato, ou um derivado do mesmo a um PEG aldeído em uma porção amina livre na extremidade N terminal da r-metHuG-CSF na presença de um agente redutor, em que o PEG aldeído é adicionado em uma relação molar estequiométrica de 2,5 em relação à r-metHuG-CSF, em que o referido derivado é selecionado do grupo que consiste em metil glicosídeos, ácidos glucorônicos, amino açúcares e N-acetil-glucosaminas.
  12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão de armazenamento é selecionado do grupo que consiste em acetato, citrato, glutamato, sorbato, succinato, ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfônico (MES), ou fosfato.
  13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tampão de armazenamento é tampão acetato 20 mM, pH 5,0 com 5% sorbitol.
  14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o rendimento do produto peguilado de r-metHuG-CSF monopeguilada é de pelo menos 80% e pelo menos 95% ou pelo menos 98%.
  15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a r-metHuG-CSF não reagida é no máximo 5% ou no máximo 2%.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/04/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

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