BRPI0914137B1

BRPI0914137B1 - processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (hymenaea courbaril l.) e composição cosmética compreendendo os referidos polissacarídeos

Info

Publication number: BRPI0914137B1
Application number: BRPI0914137A
Authority: BR
Inventors: Rosa Ferrari Cintia; Gustavo Serafim Lisboa César; Fabiola Arroteia Kelen; Araujo Rodrigues Muchiutti Pamela; Da Luz Moreira Patrícia; De Moura Sá Rocha Vanessa
Original assignee: Natura Cosmeticos Sa
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2019-09-03
Also published as: EP2303928A1; FR2932803A1; BRPI0914137A2; EP2303928B1; FR2932803B1; US20120040926A1; WO2009152595A1; US10844141B2

Abstract

processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (hymenaea courbaril l) e composição cosmética compreendendo os referidos polissacarídeos a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (hymenaea courbaril) que compreende as etapas de: a) moagem das sementes; b) extração aquosa a 2% a uma temperatura de 60° a 80° c; c) precipitação com álcool; d) suspensão dos polissacarídeos em água até solubilização; e) separação dos polissacarídeos obtidos na etapa (d) da suspensão; e f) desidratação dos referidos polissacarídeos. em uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição cosmética contendo polissacarídeos obtidos de acordo com o processo acima definido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS A PARTIR DE SEMENTES DE JATOBÁ (HYMENAEA COURBARÍL L.) E COMPOSIÇÃO COSMÉTICA COMPREENDENDO OS REFERIDOS POLISSACARÍDEOS.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polissacarídeos, preferencialmente xiloglucanos, a partir de sementes de jatobá (Hymenaea courbaríl L., Hymenaea, entre outras espécies) para aplicação em composições cosméticas, preferencialmente em composições anti-idade Descrição do Estado da Técnica

A Hymenaea courbaríl L., conhecida como jatobá, é uma árvore originalmente encontrada desde o México até grande parte da América do Sul, incluindo o Brasil (norte até o sudeste), Venezuela, Colômbia, Peru e Bolívia. É normalmente encontrada em altitudes de até 900 metros acima do nível do mar.

A sua madeira é empregada na construção civil, marcenaria, peças torneadas, instrumentos musicais e laminados, dentre outros. A polpa é comestível e é usada na preparação de alimentos tais como farinhas, doces e bebidas, ou na alimentação de animais. A casca e a seiva do tronco são utilizadas para preparações de chás.

Os xiloglucanos são polissacarídeos presentes na parede celular dos vegetais superiores. O xiloglucano estruturai é aquele de parede celular primária. Já o xiloglucano obtido de sementes é predominantemente o de reserva. As unidades constituintes principais do siloglucano são galactose, glucose e xilose. No Brasil, uma fonte abundante de xiloglucanos são as sementes de jatobá (Hymenaea courbaríl). Os xiloglucanos atuam como ativos quando aplicados à pele humana, promovendo benefícios quanto à aparência e saúde geral da pele, estimulando a síntese de colágeno e elastina pelas células conjuntivas.

A patente US 5.488.105 descreve polissacarídeos de sementes de Hymenaea que são utilizados como espessante, geleificante, estabilizador em formulações alimentícias, químicas e medicamentos. Descreve ainda um processo de extração de sementes de Hymenaea incluindo as etapas de colocar as sementes de molho e remover as cascas; amassar e secar as sementes para formar pó de polissacarídeo bruto; suspender o polissacarídeo bruto em uma solução alcalina-alcoólica para remover as impurezas e formar um polissacarídeo purificado; em seguida secar e esmagar o polissacarídeo purificado para formar um pó de polissacarídeo purificado.

O documento JP 10236943 revela um ingrediente ativo de um cosmético que está dissolvido em um extrato de jatobá. O processo de extração é feito com solvente não-aquoso e fracionamento.

A partir da descrição da presente invenção a seguir, pode-se concluir que os documentos do estado da técnica não propõem vantagens referentes a um processo mais simples e limpo, isto é, ecologicamente correto e que possui um custo menor em relação aos processos do estado da técnica. Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (Hymenaea courbaril) que compreende as etapas de:

a) processamento das sementes (processo a seco);

b) extração aquosa a 1% a 5% de massa de pó por volume, preferencialmente de 2% de massa de pó por volume;

c) precipitação com etanol 96°GL usando 1 a 3 vezes o volume de extração aquosa;

d) filtração por pressão do precipitado obtido em (c);

e) solubilização dos polissacarídeos obtidos na etapa (d) com água; e

f) secagem dos polissacarídeos obtidos na etapa (e).

Descrição dos Desenhos figura 1 ilustra sementes de Hymenaea courbaril com casca, figura 2 ilustra um xiloglucano purificado.

figura 3 mostra um gráfico com resultados da atividade espessante dos polissacarídeos obtidos de acordo com a presente invenção.

figura 4 mostra a análise da expressão relativa do colágeno do tipo I em fribroblastos. Comparação com o controle e tratamento com diferentes concentrações de amostras 780 e 781 de xiloglucano.

figura 5 mostra os resultados obtidos na leitura de fluorescência obtida com manchamento de calcofluor branco de seções histológicas feitas em pele submetida à permeação cutânea com xiloglucano de jatobá e o controle. As leituras foram realizadas separadamente na derme e epiderme. Peles 1 a 3 são aquelas nas quais xiloglucanos de jatobá foram aplicados, e a pele 4 é o controle.

figura 6 mostra a intensidade de fluorescência encontrada na derme e epiderme após manchamento de calcofluor. A camada 1 se refere à epiderme e a camada 2 se refere à derme. Peles 1, 2 e 3 foram à permeação cutânea com xiloglucano de jatobá. Pele 4 foi submetida ao controle.

figura 7 mostra a imagem obtida da pele controle sem o tratamento com calcoflúor, em campos do microscópio com luz e no escuro.

figura 8 mostra a imagem obtida com a fluorescência da pele controle. Fotos da seção histológica da pele: A: pele controle contendo a área marcada para a medição da intensidade de fluorescência; B: pele controle sem a marcação da referida área.

figura 9 mostra a fluorescência após a permeação com xiloglucano de jatobá. Fotos da seção histológica da pele: ED: pedierme e D- derme. A: pele submetida à permeação com xiloglucano de jatobá por 24 horas. ED e D mostram intensidade de fluorescência homogênea com calcoflúor; B: pele submetida à permeação com xiloglucano de jatobá por 24 horas. ED mostra maior intensidade de fluorescência do que D em manchamento com calcoflúor. Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção tem como objeto um processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (Hymenaea courbaril)

Uma das vantagens da presente invenção é que o processo utiliza uma rota simples e limpa, não envolvendo purificação do polissacarídeo bruto com solução alcoólica-alcalina (NaOH).

Outro aspecto importante do processo da presente invenção é a etapa inicial do processamento das sementes. Foi observado que o uso de água para lavar as sementes afeta negativamente o resultado do processo, uma vez que provoca a migração de alguns componentes da casca para a parte interior da semente, resultando em uma modificação da cor do produto final, além de uma contaminação e a presença de impurezas.

Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polissacarídeos, preferencialmente xiloglucanos, a partir de sementes de jatobá (Hymenaea courbaril) que compreende as etapas de processamento das sementes, extração aquosa a 1 % a 5%, preferencialmente de 2%; precipitação com etanol 96°GL usando 1 a 3 vezes o volume de extração aquosa; solubilização dos polissacarídeos obtidos em água; e secagem dos referidos polissacarídeos.

O processo se inicia com o processamento (beneficiamento) das sementes. Nesta etapa, as cascas das sementes são removidas, remoção esta que pode ser realizada de duas maneiras:

1) as sementes intactas são moídas e peneiradas para a separação da casca. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a moagem é feita em moinho martelo por tempo exaustivo e as sementes moídas são passadas em peneiras de 9 mm para a separação da casca. As sementes sem cascas são então separadas granulometricamente através da passagem em peneiras de diferentes malhas, preferencialmente, peneiras de 3,35 mm, 2,36 mm, 1,18mm e 600 qm, respectivamente.

As frações oriundas da peneira de 9 mm são retidas na peneira de 3,35 mm e 2,36 mm, totalizando 54% da massa da semente completamente livre da casca;

2) de acordo com uma concretização preferida, a remoção da casca é feita usando utilizando-se microondas.

Após o beneficiamento das sementes, o pó resultante é lentamente adicionado à água com o auxílio de uma peneira. Então é realizada uma extração aquosa a 1% a 5%, preferencialmente de 2% em massa de pó por volume. A extração é preferencialmente realizada com o preaquecimento de água a uma temperatura que varia de 60° a 80°C, mais preferencialmente 70°C. Após o preaquecimento é realizada agitação por um período de cerca de 1 hora. Em seguida, realiza-se o resfriamento de preferência até 40°C.

Opcionalmente, o processo pode compreender ainda uma etapa de separação realizada, preferencialmente, através de centrifugação. A centrifugação é preferencialmente realizada a 4100 RPM por 15 minutos.

Após a extração e, se for o caso, da centrifugação, o material é submetido à precipitação com um etanol 96°GL, de 1 a 3 vezes o volume, preferencialmente 3 vezes o volume. Foi verificado que a dita precipitação com etanol 96°GL permite a obtenção de dois polissacarídeos distintos: GEL (precipitado mais denso e mais geleificado) e SOB (polissacarídeo menos denso e mais fibroso). Tais polissacarídeos possuem a mesma constituição de sacarídeo (monômeros - galactose, xilose e glicose), porém possuem pesos moleculares distintos.

Opcionalmente, o processo pode compreender ainda, após a precipitação alcoólica, uma etapa de separação, que será realizada, preferencialmente, através de filtração com prensa para comprimir a massa resultante.

Em seguida, os polissacarídeos resultantes são suspensos em água até a solubilização em uma concentração de 2% peso/volume. Normalmente, para se alcançar essa solubilização são necessários 10 minutos em um liquidificador industrial. Também pode ser realizada em um triturador de alto cisallhamento até completa dispersão da matéria sólida.

Após a solubilização, é realizada uma separação, preferencialmente através de centrifugação, sendo a mesma realizada preferencialmente a 4100 RPM por 15 minutos.

Após a separação, ocorre a desidratação do sobrenadante por secagem por atomização ou congelamento e posterior liofilização. No caso de secagem por congelamento é necessário também que se efetue uma etapa de moagem.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de xiloglucanos de sementes de jatobá (Hymenaea courbaril) compreendendo as etapas de:

a) tratamento de semente por secagem das sementes em um forno de micro-ondas;

b) extração aquosa a 2% em uma temperatura na faixa de 60 a 80°C por 1 hora;

c) centrifugação a 4100 RPM por 15 minutos;

d) filtração (com granulometria em micropartículas) em um recipiente com cobertura;

e) precipitação com etanol 96 ⁰ GL, a 1 a 3 vezes o volume;

f) solubilização dos polissacarídeos obtidos em água;

g) secagem por atomização ou congelação e liofilização.

Em outra modalidade da presente invenção, composições compreendendo os polissacarídeos obtidos de acordo com o processo da invenção são providas em combinação com excipientes cosmeticamente aceitáveis. Tais polissacarídeos podem ser vantajosas usados, por exemplo, para preparar composições antirrugas ou anti-idade e também como espessantes em formulações cosméticas.

A tabela abaixo ilustra algumas composições cosméticas compreendendo xiloglucanos obtidos em conformidade com o processo da presente invenção:

Exemplo 3 (%)	83,500	0,100	5,000	O o o	1	2,000	2,000	2,000	0,050	5,000	0,250	16,500
Exemplo 2 (%)	83,070	o o θ'	5,000	0,100	L0J80	3,000	o o o	2,000	0,050	5,000	0,500	16,930
Exemplo 1 (%)________	76,580	0,100	5,000		; 0,250	1,000	1,000	2,000	0,070	o o o o”	4,000	23,420
componentes	Água desmineralizada	EDTA Dissódico	Glicerina Bidestilada BXR Vegetal	Goma Xantana	Carbopol ETD 2020	Álcool cetilico	Álcool estearilico	HIDROXIETIL ACRILATO, COPOLÍMERO DE ACRILOILDIMETIL TAURATO DE SÓDIO E ESQUALANO E POLISORBATO 60	Hidróxido de Sódio	[Água desmineralizada	Xiloglucano de Jatobá
Fase do Processo		<N	CO		IO	CO	CD	r-	CO	o	σ>

Exemplo 7 (%)	80,852	0,100	5,000	0,100	0,100	4,000	2,000	2,000	0,048	5,000	O o CO o~	19,148
Exemplo 6 (%)	82,455	o o o'	5,000	o o θ'	0,300	1,500	1,500	2,000	0,045	5,000	2,000	17,545
Exemplo 5 (%)_________	83,671	o o o	5,000	0,120	0,250	2,300	1,200	2,000	0,059	5,000	0,300	16,329
Exemplo 4 (%)__	80,481	o o o	o o o in	0,150	0,210	0,500	2,500	2,000 I \|	0,059	o o o 00*	o o o	19,519
componentes	Água desmineralizada	EDTA Dissódico	Glicerina Bidestilada BXR Vegetal	Goma Xantana	Carbopol ETD 2020	o o (D O Õ O O <	Álcool estearilico	HIDROXIETIL ACRILATO, COPOLlMERO DE ACRILOILDIMETIL TAURATO DE SÓDIO E ESQUALANO E POLISSORBATO 60	Hidróxido de Sódio	Água desmineralizada	Xiloglucano de Jatobá
Fase do Processo		CM	CO		IO	CO	CO	r-	00	OJ	O

Processo para preparação das composições descritas na tabela acima:

- colocar e pesar água em um recipiente (fase 1);

- Adicionar os componentes indicados para a fase 2 e agitar até completa solubilização;

- Adicionar os componentes indicados para fase 3 e agitar;

- Adicionar os componentes da fase 4 aos poucos até completa solubilização. Agitação forte (aprox. 1000 a 2000 rpm);

- Adicionar os ingredientes da fase 5 aos poucos com agitação forte ate completa dispersão. Não pode formar grumos. Aquecer esta fase para 70-80°C.

- Em paralelo, aquecer os componentes descritos para fase 6 na mesma temperatura.

- Com os componentes da fase 6 fundidos e na mesma temperatura da fase aquosa, adicionar a fase 6 na fase aquosa e agitar entre aprox. 1000-2000 rpm.

- Adicionar em seguida os componentes da fase 7 e agitar fortemente até formação de emulsão lisa e brilhante aprox. 10-15 minutos.

- Em paralelo no início do processo, dispersar os polissacarídeos em água, adicionando lentamente até completa solubilização.

Esta fase entrará como fase de resfriamento e os polissacarídeos em contato com outras gomas promoverá uma sinergia, havendo formação de pontes de hidrogênio e alterando as propriedades viscoelásticas/reológicas da emulsão.

Aplicação cosmética

Foram realizados alguns testes que demonstram as características aperfeiçoadas e vantajosas dos polissacarídeos obtidos com o processos da presente invenção para uso em composições cosméticas:

1) Atividade na proliferação celular:

Foram realizados testes para avaliar o potencial dos polissacarídeos obtidos de acordo com a presente invenção em promover a proliferação celular (aumento do número de células frente a um grupo controle não tratado com o ativo) através da análise da viabilidade celular pelo corante vermelho neutro. Outro objetivo do teste foi o de avaliar o potencial prócolágeno de ativos (quantidade excedente de colágeno produzido pelas células tratadas com o ativo em relação às células controles não tratadas), através da detecção de colágeno no sobrenadante de cultura, pelo corante sirius red.

O ensaio permite avaliar:

a) se a presença de determinado ativo na cultura celular, por um ou mais períodos, resulta em aumento do número de células em relação ao grupo controle (células não tratadas com o mesmo ativo). O número de células é estimado em função da taxa de viabilidade celular, a qual é monitorada por incubação dos fibroblastos com o corante vital Neutral Red (vermelho neutro), ao final do período do ensaio (96h). Este corante é incorporado pelas células que estão vivas, de modo que a taxa de viabilidade celular é dada pela intensidade de corante absorvida pelas células, em uma relação diretamente proporcional. A leitura colorimétrica é realizada em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 540 nm.

b) se a presença do ativo induz as células a produzirem mais colágeno per se. Para tanto, fibroblastos humanos derivados da derme são incubados com o fator de crescimento de tumor -p.(TGF-P) conhecido indutor da síntese e secreção de colágeno (controle positivo). Simultaneamente, outros fibroblastos nas mesmas condições são incubados com o ativo em teste. O colágeno é identificado pelo corante sirius red (solução de picrossirus), o qual tem afinidade para moléculas de pró-colágeno e colágeno. O potencial pró-colágeno de cada ativo é identificado pelo aumento da densidade ótica (absorbância . filtro de 540 nm) mensurada após dissolução dos pigmentos previamente absorvidos pelo colágeno presente nos sobrenadantes de cultura.

Resultados:

Os resultados obtidos com os polissacarídeos produzidos de acordo com o processo da presente invenção mostraram:

- Potencial de proliferação/viabilidade das células incubadas com as diferentes concentrações da amostra de xiloglucano;

- Potencial pró-colágeno do ativo, normalizado em função da viabilidade celular

- Produção total de colágeno, descrito na Tabela 1.

Tabela 1. Proliferação celular (%), densidade ótica (Abs) +/- desvio padrão obtido da leitura de colágeno total e síntese de colágeno após normalização pelo índice de viabilidade (pg/ml e %), para fibroblastos humanos de pele em cultura primária, após 96 horas de incubação.

Tratamento	Prol. Celular {%)	DO Colágeno Total +/desviopadrãc	Colágeno normalizado (ug/ml)	Colágeno normalizado {%)
Controle	100	0,152 +f- 0,008	100,00	0,00
TGF	136,00	0,224 +/- 0,009	198,10	98,10
Lote 16 Xito 0,01%	108,57	0,236 +/- 0,031	274,15	174,15
Lote 16 Xito 0,025%	113,14	0,207 +/- 0,001	202,76	102,76
Lote 16 X0o 0,05%	113,14	0,21+/-0,036	209,00	109,00
Lote 16 Xito 0,075%	114,86	0,196 +/- 0,025	177,20	77,20
Lote 16 XBo 0,1%	115,43	0,173 +/- 0,031	129,44	29,44

Tabela 2. Proliferação celular (%) e síntese de colágeno após a normalização do índice de viabilidade (%), para os fibroblastos da pele humana em cultura primária, após 96 horas de incubação com os lotes 780 e

781 (xiloglucanos de jatobá).

Tratamento	Proliferação Celular (%)	Colágeno (%)
Controle	100,00	100,00
TGF	148,1	109,4
Lote 780-0.1%	109,3	266,0
Lote 780 - 0.05%	123,5	260,7
Lote 781 - 0.01%	146,6	164,8
Lote 781 - 0.05%	121,5	147,8

Em relação à proliferação celular:

A incubação dos fibroblastos com as amostras de xyloglucano nas concentrações acima indicadas e nas condições testadas (96 horas) resultou em aumento da quantidade de células do ensaio em todas as concentrações de xiloglucano. Considerando os resultados das Tabelas 1 e 2 acima, o menor índice de proliferação celular foi de 8,6% na menor concentração testada (0,01%) enquanto que o maior índice de proliferação foi de 46,6%, ocorrido com a amostra de xiloglucano a 0,01%.

Em relação à síntese de colágeno:

Quando aplicada a 0,01% pelo período de 96 horas, a amostra proporcionou aumento de 174,15% na síntese de colágeno. Nas concentrações de 0,025 e 0,05% de polissacarídeos, o aumento da síntese de colágeno foi de 102 e 109%, respectivamente. Esses resultados são semelhantes ao encontrado para o controle positivo do ensaio (TGF-b, 98,1%) e significativamente maiores que o controle basal do ensaio (células incubadas apenas com meio de cultura).

Nas duas maiores concentrações do ensaio (0,075 e 0,1%), os índices de aumento de colágeno foram menores que os observados para as outras concentrações da amostra (77,2 e 29,4%, respectivamente), porém ainda significativamente superiores ao controle negativo do ensaio.

2) Senescência celular in vitro

O objetivo deste estudo foi o de avaliar o potencial de ativos em proteger a célula do envelhecimento celular causado por exposição seqüencial à irradiação UVB, pelo parâmetro de diminuição da quantidade do marcador de senescência bgalactosidase (enzima lisossomal). Este teste permite avaliar se a presença de ativos em culturas de fiborblastos humanos de derme pode retardar o aumento da expressão da enzima b-galactosidase, cuja elevação está associada à células em estado de senescência (envelhecimento) celular. Após o descongelamento do lote celular, as células são cultivadas em meio DMEM contendo 10% de SFB, em atmosfera com 5% de CO2 e à temperatura de 37°C. Após o plaqueamento, as células são cultivadas nas mesmas condições por no mínimo 48 horas.

Após esse período, uma placa de células será submetida à exposição de UVB por 6 minutos, durante 5 dias (1 exposição por dia), ou durante 4 dias, e a outra será apenas incubada com solução tampão (PBS) pelos mesmos períodos. O grupo de células controle é tratado somente com PBS e meio de cultura; o grupo de tratamento é incubado com o ativo em teste, diluído em PBS (momento da irradiação) ou meio de cultura (intervalos entre as irradiações). Após a finalização da exposição, as células permanecem em repouso por 48 a 72 horas (para consolidação do efeito crônico decorrente da exposição à irradiação), incubadas em meio (controle) ou com ativo diluído em meio (grupo teste). Após esse período, as células são expostas ao substrato da enzima b-galactosidase, que é convertido em cromógeno azul após 12 horas de incubação. Células controle negativo apresentam até 10% de células b-galactosidade positivas; células do grupo controle positivo (expostas à UVB sem proteção de ativos) apresentam de 45 a 65% de células b-galactosidade positivas;

- O método de obtenção do envelhecimento de fibroblastos humanos de derme in vitro foi desenvolvido e validado pelo projeto Galápagos (Funil de Tecnologia / Natura). Contudo, a utilização destas células em aplicações potenciais experimentais (por exemplo, avaliação da atividade metabólica das células senescentes, redução da senescência) não foi ainda completamente validada na presença de substâncias controles.

Resultados

As Tabelas 3 e 4 indicam a porcentagem de célula b-galactosidase positivas +/- o desvio padrão da porcentagem após cada tratamento com amostras contendo xiloglucanos obtidos de acordo com a presente invenção. UVB- se refere a células que não foram expostas à radiação UVB, e UVB+ se refere a células que foram expostas à radiação UVB Tabela 3

Tratameshto ; [ 3-gal positiva

Controle 10,96 +/-1,77 _________Ç__49,72+/-1,80

Xilo12B 11,25+/-0,2

39,55 +/- 2,06

Tabela 4 - Trolox 0,005% é uma substância usada como controle positivo para o teste já que previne a senescência celular positiva (cerca de 30% de células senescentes contra cerca de 50% nas células não tratadas).

	Tratmento	β-gal Positiva
UVB-	Controle Trolox 0,005% Xiloglucano 780 Xiloglucano 781	11,67+/- 1,05 11,33+/- 1,39 9,58 +/- 3,70 8,67 +/-1,39
UVB +	Controle Trolox 0,005% Xiloglucano 780 Xiloglucano 781	51.67 +/-2,36 31.67 +/-2,36 27,26+/- 1,40 25,28+/- 1,25

Os resultados do ensaio mostrados na Tabela 3 demonstraram que a presença de 0,01% de xiloglucano resultou em redução de 10% na população de células envelhecidas, reconhecidas pela % de células b-gal positivas, após o período de exposição fracionada a UVB. A presença do ativo protegeu as células dos danos causados pelo fotoenvelhecimento.

Os resultados dos ensaios da Tabela 4 demonstraram que a presença de 0,025% de xiloglucano resultou em uma redução na população de células envelhecidas, reconhecida pelas células b-gal positivas, depois do período fracionado de exposição aos raios UVB. A presença do ingrediente ativo protegeu as células dos danos causados pelo fotoenvelhecimento.

Sem a incubação as amostras (somente em meio de cultura), a população de células senescentes correspondeu a 51,67% do total de células analisadas. Na presença de ativos (780 e 781), o índice de senescência foi de 27,26% e 25,28%, respectivamente.

Ambas as amostras propiciaram proteção ao fotoenvelhecimento induzido. A morfologia foi melhor preservada na presença de ativos do que em sua ausência.

Este dado está de acordo com as informações prestadas no relatório preliminar número 55, que apresentou a taxa de 40% de senescência induzida quando as células foram tratadas com xiloglucano (lote 0755507PI012B) na concentração de 0,01%. A concentração testada no presente ensaio (0,025%) é 2,5 vezes maior do que a testada no ensaio anterior.

Conclusão:

Para resumir, foi observado que o xiloglucano apresenta capacidade de aumentar a síntese de colágeno, aumentar a expressão gênica de colágeno tipo I, aumentar a síntese de tropo-elastina, aumentar proliferação celular. Além disso, protegeu as células do envelhecimento celular induzido pela exposição prolongada aos raios UVB no modelo de senescência celular. Todos estes ensaios foram conduzidos em cultura celular, utilizando fibroblastos humanos da derme.

Benefício

Concentração

% aumento | Relatório

	testada		in vitro
Proliferação celular	0,05%	15	24/08
Colágeno	0,01%-0,1%	40-80	24/08
Expressão gênica de colágeno tipo I	0,05%	75%	-
Produção de tropo-elastina	0,01%	68%	-
Senescência celular	0,01%	10%	55/08

Além das vantagens acima descritas, foi verificado que os polissacarídeos da presente invenção podem usados como espessante em composições cosméticas. A figura 3 contém um gráfico que demonstra a melhor atividade espessante do polissaccarídeo da presente invenção quando com5 parado à goma xantana.

3) Expressão qênica de colágeno por fibroblastos humanos

O objetivo deste ensaio é avaliar o efeito procolágeno de extratos de em concentrações não-citotóxicas, por quantificação relativa da expressão gênica de colágeno tipo I utilizando uma cultura de fibroblastos da 0 pele humana.

Uma das principais características do envelhecimento da pele (tanto cronológica como as causadas pela exposição aos raios UV, ou por uma combinação desses factores) consiste na perda gradual do teor de colágeno da pele, especialmente de colágeno tipo I, o mais abundante na pele. A presente metodologia visa determinar extratos botânicos com potencial para estimular o neossíntese de colágeno, e dados suplementares obtidos a partir da metodologia para avaliar a secreção de colágeno, levando a um aumento na expressão gênica de colágeno, fechando, assim, o circuito - expressão gênica, produção de proteína de colágeno.

Fibroblastos humanos derivados da derme são incubadas com o factor-β de crescimento de tumor (TGF-β), que é um conhecido indutor da síntese e secreção de colágeno (controle positivo). Simultaneamente, outros fibroblastos nas mesmas condições são incubadas com o ativo está sendo testado. O período de incubação é de 24 horas. Em seguida, o material 5 celular foi coletado. Para as reações de PCR em tempo real foram utilizados sistemas de amplificação específica para colágeno tipo I e também B2M (controle endógeno), além de Taqman Master Mix, da Applied Biosystems. As reações foram conduzidas em um termociclador.

Resultados:

Os resultados podem ser vistos na Tabela 5.

Conclusão:

Este teste indicou que o xiloglucano de jatobá tem um potencial de procolágeno de promover um aumento no tipo I, a expressão gênica de colágeno nas concentrações de 0,001% (10ug/ml) e 0,0005% (5 ug / ml). A amostra 781 apresentou melhor desempenho na indução de expressão gênica de colágeno de tipo I do que a amostra 780. Estes dados confirmam os resultados anteriormente obtidos para a secreção de colágeno após o tratamento de fibroblastos com o mesmo ativo, sugerindo que o ativo modula a expressão de colágeno tanto transcricional e pós-traducionalmente.

3) Avaliação da permeação in vitro

Neste ensaio, uma avaliação semiquantitativa da permeação de xiloglucano de jatobá foi realizada por microscopia de fluorescência com manchamento de calcõfluor branco. A fluorescência é o resultado de um fenômeno no qual os elétrons fluoróforos absorvem fótons com energia ho de uma fonte (uma lâmpada ou laser) e passam de um estado fundamental (estado de menor energia) para um estado excitado (estado de energia mais elevado). Neste estado, o fluoróforo passa por uma mudança em sua conformação e pode interagir com uma série de moléculas que a rodeiam. Assim, a energia deste estado excitado é dissipada e o elétron passa por um estado de baixa energia, o que não é necessariamente o estado fundamental. A diferença de energia entre o estado excitado e o estado de menor energia é emitida na forma de um fóton.

O procedimento a seguir é realizado neste ensaio:

Permeação com xiloglucano de jatobá durante 24h (3 células de Franz aplicando a solução de xiloglucano a 2% e 1 célula de Franz aplicando o controle de PBS).

Corte histológico por congelação. Espessura da seção: 10pm. Pele fixa com metanol.

Mancha feita com sol. calcofluor em KOH 10% (1:1 v / v) por 1 min. Lavar com água.

Leitura em microscópio de fluorescência com excitação em 400 nm

Número de leituras/imagens capturadas: Três (3) diferentes áreas foram capturados para cada seção de lâminas, tanto da epiderme e da derme. Cada lâmina tinha três cortes histológicos. Total de imagens = 216.

Software de imagem: 4,6 Axiovision

Análise estatística: A análise de variância e teste de Tukey de comparação múltipla.

Software para análise estatística: SPSS

Resultados

Os resultados são mostrados nas figuras 5-9. Além disso, a análise estatística dos dados foi realizada pela ANOVA (Análise de Variância) e teste de Tukey, como pode ser visto nas Tabelas 5-8 abaixo. Como a análise estatística ANOVA indicou que existe uma diferença entre as amostras, ou seja, na derme ou na epiderme, sem indicar qual é a amostra diferente, um teste de Tukey foi realizado para verificar quais as amostras eram diferentes.

Tabela 5 - Análise estatística ANOVA para a epiderme (ANOVA³) Flúor^b

	soma de quadrados	df	quadrado médios	F	Sig
Entre Grupos	1,31 E+08	3	43588451.65	154.643	.000
Dentro dos Grupos	29314050	104	281865.866
Total	1.60E+08	107

a = camada _

Tabela 6 - Análise estatística ANOVA para a derme (ANOVA³) Flúor^b

	soma de quadrados	df	quadrado médios	F	Sig
Entre Grupos	59739758	3	19913252.63	97.077	.000
Dentro dos Grupos	21333454	104	205129.367
Total	81073212	107

a = camada _

Tabela 7 - Análise estatística usando método Turkey (resulatdos para camada 1 - epiderme)

Flúor⁰

Trukey HSD^a

Pele	N	Subtestes para alfa = 0,05
		1	2	3	4
4,00	27	340.7241
1,00	27		939.7607
2,00	27			2408.0067
3,00	27				3084.3689
Sig.		1,000	1,000	1,000	1,000

Média para grupos em subtestes homogêneos são descritos ^a usos de tamanho de amostra media harmônica = 27.000 ^b camada = 1,00

Tabela 8 - Análise estatística usando método Turkey (resultados para camada 2 - derme)

Flúor¹⁵

Trukey HSD^a

Pele	N	Sub	testes para alfa = 0,05
		1	2	3
4,00	27	401.7596
3,00	27		1760.8648
1,00	27		1974.5856
2,00	27			23837537
Sig.		1,000	0,312	1,000

Média para grupos em subtestes homogêneos são descritos ^a usos de tamanho de amostra media harmônica = 27.000 ^b camada = 2,00

Para a camada da epiderme, o teste de Tukey indicou que todas as peles tinham diferenças, enquanto a pele controle apresentou menor fluorescência (Tabela 7). Para a camada da derme, todas as peles tratadas com xiloglucano de jatobá (1, 2 e 3) foram diferentes do controle (4). A pele 2 foi diferente das peles 1 e 3 (Tabela 8).

Conclusão

A técnica de microscopia de fluorescência utilizada neste estudo é considerada semiquantitativo, uma vez que nenhuma relação é estabelecida entre a intensidade de fluorescência e a concentração de xiloglucano de jatobá na pele. No entanto, o aumento dos valores de fluorescência medidos face à concentração de xiloglucano de jatobá, permitindo se concluir se xiloglucanos são retidos na pele após o teste. Os resultados mostram que há evidência estatística (Anova e Tukey), que a intensidade da fluorescência das amostras submetidas à permeação cutânea in vitro com xiloglucanos de jatobá é maior que o controle (ANOVA e Tukey), indicando que o xiloglucano testado foi mantido na pele tratada. A diferença estatística encontrada entre as peles tratadas refletem a variabilidade do teste.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de obtenção de polissacarídeos a partir de sementes de jatobá (Hymenaea courbaril), caracterizado pelo fato de que compreende:

a) tratamento das sementes através do uso de um microondas para separação das cascas;

b) extração aquosa a 1% a 5% de massa de pó por volume, , a uma temperatura de 70°C por 4 horas;

c) precipitação com etanol 96°GL usando 1 a 3 vezes o volume de extração aquosa;

d) filtração por pressão do precipitado obtido em (c);

e) solubilização dos polissacarídeos obtidos na etapa (d) com água; e

f) secagem dos polissacarídeos obtidos na etapa (e) por secagem por atomização ou por liofilização, em que o processo também compreende uma etapa de separação dos polissacarídeos após a etapa de extração aquosa, a dita separação sendo realizada por centrifugação a 4100 RPM por 15 minutos.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a extração aquosa na etapa (b) é realizada a 2% de massa de pó por volume.