BRPI0908270A2

BRPI0908270A2 - proteínas de fusão de imunoglobulinas purificadas e método para a sua purificação

Info

Publication number: BRPI0908270A2
Application number: BRPI0908270A
Authority: BR
Inventors: Evans David; Romero Jonathan; Mccue Justin; Macniven Richard; Notarnicola Stephen; Meier Werner
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2019-09-10
Also published as: MX2010009398A; EP2615112A2; IL207762A0; ZA201006150B; NZ587511A; WO2009111347A1; EA201070987A1; JP2011514895A; KR20100128315A; US20110129468A1; CA2717129A1; EP2260054A1; EP2615112A3; AU2009222115A1; EP2260054B1; CN102239177A

Abstract

"métodos para separar proteínas de fusão de imunoglobulina de receptor de linfotoxina 8 (lt-8- r-ig), bem como os usos das proteínas de fusão e composições as compreendendo". a presente invenção refere-se a métodos e composições para separar impurezas durante a produção de proteínas de fusão de imunoglobulinas (lg). exemplos de impurezas que podem ser removidas de acordo com os métodos da invenção incluem formas inativas da proteína de fusão lg e/ou agregados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA SEPARAR PROTEÍNAS DE FUSÃO DE IMUNOGLOBULINA DE RECEPTOR DE LINFOTOXINA B (LT-B-R-lg), BEM COMO OS USOS DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO E COMPOSIÇÕES AS COMPREENDENDO. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Diante da crescente aceitação de produtos biológicos como terapêuticos aprovados, passa a ser importante a caracterização detalhada dessas espécies de fármacos. A deterioração de produtos imprevista ou a presença de impurezas pode por em perigo a eficácia terapêutica, bem como a segurança dos pacientes. Exemplos de impurezas encontradas durante a fabricação de produtos biológicos podem incluir agregados dos produtos. Em composições farmacêuticas, agregados são indesejáveis, visto que podem ser de interesse imunogênico e presentes na segurança no que diz respeito ao uso in vivo. Agregados podem também diminuir a estabilidade in vivo do produto, devido à neutralização de anticorpos produzidos no paciente.

Além disso, proteínas inativas também podem ser produzidas durante a fabricação. Proteínas inativas podem resultar do dobramento incorreto durante o processo de fabricação. Por exemplo, U.S. 2002/0039580 (Browning et ai.) descreve duas formas, uma forma ativa e inativa da proteína de fusão de imunoglobulina do receptor de linfotoxina β (LTpR-lg) quando expressas em células de mamíferos. U.S. 2002/0039580 também ensina que reduzindo a temperatura da célula durante a produção da proteína de fusão Ig, a porcentagem de moléculas inativas em uma preparação pode ser reduzida. Aquela publicação descreve apenas uma forma inativa de LTpR-lg, que não tem habilidade de se ligar ao ligante.

Na fabricação de produtos biológicos, tais impurezas relacionadas com o produto podem apresentar desafios de purificação. Essas impurezas muitas vezes são difíceis de serem identificadas, visto que, frequentemente, possuem características comparáveis com a forma ativa da proteína terapêutica de interesse e, portanto, podem ser difíceis de detectar. Além disso, até mesmo quando tais impurezas forem identificadas, a separação da impureza do produto de fármaco pode ser difícil. Assim sendo, permane* 2 ce a necessidade de não apenas identificar as impurezas relacionadas ac produto, que podam estar presentes durante a produção dos produtos biológicos e processos de purificação, mas também para métodos de remoção das impurezas uma vez identificadas,

SüMÁRlO.PA.LHyENÇÃO

A presente invenção refere-se ao problema de purificar um biológico baseado em anticorpo, por exemplo, proteína de fusão ί.Τ-β-R-ig, a partir de impurezas que surgem durante a expressão de biológico em uma cultura de célula de mamífero, por exemplo, células CHO, de maneira que a 10 composição resultante seja adequada para o uso farmacêutico, tanto em termos da viabilidade de fabricação de grandes quantidades da proteína e pureza

Conforme descrito aqui, a expressão de proteínas de fusão LTβ-R-lg em células de mamíferos produz duas formas inativas de agregados 15 ΙΤ-β-R-íg e ΙΤ-β-R-lg. Tais impurezas precisam ser separadas da forma monomèrica, biologicamente ativa de LT-p-R-lg. a fim de oferecer pureza suficiente para uso em pacientes.. As formas inativas de ΙΤ-β-R-ig apresentam um desafio único no processo de purificação.. Por exempla, as duas formas inativas de LT~$~R-lg aqui descritas se assemelham estreitamento com 20 a forma monoméríca ativa da proteína de fusão, por exemplo, com relação ao tamanho e carga. Além disso, quando a produção de LT ^-R lg é amplia da para aumentar o rendimento (como è necessário para a fabricação de um terapêutico), altas niveís de agrega LT-p-R-lg são produzidos. Assim sendo., a fim de produzir proteínas de fusão LT-^-R-lg monomêricas ativas, a uma 25 concentração suficiente a com pureza necessitada para usa clínico, foi necessário um processo que minimiza a agregação, minimiza a presença de formas inativas da proteína, e minimiza a perda de proteína de fusão LT-βR-lc. A presente invenção fornece uma solução para este complexo problema

Mais específicamente, a invenção oferece um processo de eramatografía de Interação (HIC) hidrofúbice de alta resolução capaz de remo ver múltiplos produtos relacionados com as impurezas durante a purificação de um anticorpo baseado no biológico, isto é, uma proteína de fusão de impnogtobuíina (Ig). A presente invenção fornece um meio para purificar a forma ativa de uma proteina de fusão Ig, tal como de imunogiobuíina do receptor do finfotoxina β (LT-p-R-lg), de formas inativas da proteina. Um aspecto adicional da invenção inclui composições de proteínas de fusão Ig purificadas (por exemplo, tendo quantidades mínimas de contaminação com outras proteínas, de variantes inadequadamente dobradas que não possuem atividade biológica completa, e agregados de proteínas que frequentemente resultam de expressão de proteínas em células de mamífero). A invenção fornece, além disso, meios para purificar uma mistura de proteína, por exemplo, um estoque de alimentação de partida de cultura de célula de mamífero (per exemplo, grandes volumes de estoque de alimentação de cultura em um biorreator), que possui mais do que 30% de impurezas, tais como as formas inativas dos agregados de proteína e/ou proteina. Em uma modalidade, a invenção fornece meios para purificar uma mistura de proteina de partida que possui mais do que 50% de impurezas, por exemplo, cerca de 35% de protelas agregadas e cerca de 19% de proteínas inativas,

A invenção inclui um método para separar proteínas de fusão de imunogiobuíina do receptor de linfotoxina β (ΙΤ-β-R-lg) biologicamente ativas de proteínas de fusão de LT-β-R-lg biologicamente inativas compreendendo aplicar uma mistura compreendendo proteínas de fusão LT-^-R-lg biologicamente ativas e proteínas de fusão Ι..Τ-β-R-lg biologicamente inativas em uma resina de cromatografia de interação de builla hidrofóbíca (MÍG) e por a resina em contato com uma solução compreedendo um gradiente de sal, por exemplo, de 1,6M a 0,0M de NaCI para obter um primeiro eluato, compreendendo proteínas de fusão ΙΤ-β-FMg biologicamente inativas e um segundo eluato, compreendendo proteínas de fusão LT- ^ R Ig biologicamente ativas. Em uma modalidade, o segundo eluato compreendendo proteínas de fusão ΙΤ-β-Rlg biologicamente ativas é obtido pela lavagem da resina de HIC com um banho a 1.5 M de NaCí. Em uma modalidade, o gradiente de sal é uma etapa ou um gradiente continuo. Em uma modalidade, o gradiente de sal compreende de 0.6M a 0,OM de Em uma modalidade, o gradiente de sal é um gradiente reverse de 0,4 a 0,5 de Na_sSO₄ seguido de um gradiente de etapa e uma faixa de coluna. Em uma modalidade, gradientes de etapa de Na.íSCb sequenciais são usados para remover o primeiro inativo-1 (na tração do banho), seguido pelo ΙΤ-β-R-lg monaméríco ativo (fração de eluição), seguido peio inativo-2 (fração da faixa). E.m uma modalidade, a resina debutila HIC possui um tamanha de poro de 600 a 750 A. Em uma modalidade a resina de HIC possui uma capacidade de carga de cerca de 8 g de proteina/L de resina., Em uma modalidade, a resina de HIC possui uma capacidade de carga de cerca de 2.0 g de proteína/L da resina na presença 10 de Nm-SCç. Em uma modalidade, o segundo eluato compreendendo proteínas de fusão Ι.Ί -β-RJg biologicamente ativas compreende menos do que 2% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente inativas. Em uma modalidade. o segundo eluato compreendendo proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas compreende menos do que 1% de proteínas de fusão LT15 β-R-lg biologicamente inativas .

A presente invenção fornece um método para separar proteínas de fusão de imunoglobulina do receptor de linfotoxína β (LT-B-R-lg) biologicamente ativas, não agregadas de proteínas de tesão ΙΤ-β-R-lg agregadas compreendendo aplicar uma mistura compreendendo proteínas de tesão LT20 β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas e proteínas de tesão ΙΤ-β-R-lg agregadas, em uma resina de oromatografía de interação de fervia hidrofóbica (HíC), em que a resina tem uma capacidade de carga dentre cerca de 1020 g de proíeína/L de resina e uma altura de leito de cerca de 29 a 31 cm, e colocar em contato a resina corn uma solução a uma taxa de fluxo de cerca 25 de 50 a 150 cm/h (centlmetros/hora) para obter um primeiro eluato compreendendo proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e um segundo eluato compreendendo proteínas de tesão ΕΤ-β-Rlg agrogadas. Em uma modalidade, a resina é posta em contato com uma solução a uma taxa de fluxo de cerca de 100 cm/h. Em uma modalidade, o pri30 metro eluato, compreendendo proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas compreende menos do que 2% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg agregadas. Em uma modalidade, o primeiro eluato compreendem do proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas compreende menos que 1% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg agregadas,

A invenção também fornece um método para separar proteínas der fusão de imunoglobulína do receptor de línfotoxina β (L.T-3-R~lg) biologicamente ativas de proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente inativas, o referido método compreendendo as etapas de: aplicar uma mistura compreendendo proteínas de fusão LT- ^-R-ig biologicamente ativas e proteínas de fusão ΕΤ-β-R-!g biologicamente inativas em uma resma de cromatografia de interação de butila hidrofobica (HIC) sob condições que permitem as proteínas de fusão LT-b-R-lg biologicamente abvas se ligarem à resina butila; colocar em contato a resina de butila HIC com uma solução compreendendo um gradiente de sal, per exemplo, um gradiente de sal de etapa ou contínuo, para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteínas de fusão LT-p-R-íg biologicamente ativas, aplicar o primeiro eluato da etapa ii) em uma segunda resina de HIC sob condições que permitem as proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas se ligarem à segunda resina de HIC; e colocar em contato a segunda resina de HIC com uma solução para obter um segundo eluato mais enriquecido corn a presença der proteínas de fusão LT-0-R-lg biologicamente ativas, separando, desta maneira, as proteínas de fusão ΕΤ-β-R-lg biologicamente ativas das proteínas de fusão ί,.Τ-βR-lg biologicamente inativas. Em uma modalidade, a resina de butila HIC compreende uma estrutura principal química de polímero de metacrilato hídroxilade.

Em uma modalidade, a resina de butila HIC tem um tamanho de poro de 600 a 750 A, Em uma modalidade, o primeiro eluato compreende menos do que 2% da uma primeira forma da proteína de fusão LT-p-R Ig inativa (lnativa-1). Em uma modalidade, o primeiro eluate compreende menos do que 1% de uma primeira forma da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg inativa (Inativa-1). Em uma modalidade, o segundo eluato compreende menus do que 2% de uma segunda forma da proteína de fusão Ι,,Τ-β-R-lg inativa (Inativa-2), Em uma modalidade, o segunde eluato compreende menos do que 1% de urna segunda forma da proteína de fusão Ι..Τ-β-R-ig inativa (InativaA invenção também fornece um método para separar proteínas de fusão LT-p-R·-lg biologicamente ativas de proteínas de fusão LT-p-Rdg biologicamente inativas, empregando uma resina de modo misto. Em uma modalidade, o método compreendo aplicar uma mistura compreendendo proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas e proteínas de fusão LTβ-R-lg biologicamente inativas em uma resina de modo misto sob condições que permitem as proteínas da fusão LΤ-β-R-lg biologicamente ativas que se liguem à resma de modo mrsto, O método ainda compreende eluir as proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas de uma resina de modo misto com uma solução para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença do proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, o depois aphcar o primeiro eluato em uma resina hidrofóbíca de interação cromafogràfíca em uma resina de cromatografia de interação hidrofóbíca (HIC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão LT-3-R~íg biologicamente ativas se liguem à resina HIG; e finalmente eíuír as proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas com uma solução para obter urn segundo eluate adicionalmente enriquecido com a presença de proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas. Em uma modalidade, a resina de modo misto é posta errs contato corn uma etapa do lavagem de pré-eluição que è empregada para limpar a forma inativa-1 de ΙΤ-β-R-lg e parcialmente limpar formas agregadas de ΕΤ-β-R-lg, Tal método separa proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas de proteínas de fusão LT-^-Rdg biologicamente inativas,

A presente invenção ainda fornece um método para separar pro teínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas de proteí nas do fusão t.T-p-R-lg agregadas, empregando em uma modalidade, uma resine de modo misto. Em uma modalidade, o método compreende as etapas de aplicar uma mistura, compreendendo proteínas de fusão ΙΓ-β-R-íg biologicamente ativas, não agregadas e proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg agregadas, em que rnais de cerca de 30% ou cerca de 30% das proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg na mistura são agregadas em uma resina de modo misto sob condições que permitem que as proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologi carnerãe aüvas se liguem à resina de made rnisto; eluir as proteínas de fusão ΙΤβ-R-lg biologicamente ativas da resina de modo misto da etapa i), empregar uma solução para obter urn primeiro eiuaio enriquecido com a presença de proteínas de fusão LT-ff-R-lg biologicamente ativas; aplicar ο 5 primeiro eluate da etapa ii) em uma resina de cromafôgrafia de interação hidrofôbica (HIC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem à resma de HIC: e eluir as proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas da etapa iii) empregar uma solução para obter um segundo eluato adicionalmente enriquecido com a presença de 10 proteínas de fusão LT-$-R~lg biologicamente atives. Em uma modalidade, a resina de modo misto ê posta em contato com uma etapa de lavagem de pré-eluição que é usada para limpar a LT^-R-lg inativa-1 e limpar, parcialmente, formas agregadas de LT-P-R-lg. Ao empregar tal método., proteínas de fusão LT~p~R-lg biologicamente ativas, não agregadas podem ser sopa15 radas das proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg agregadas.

Em uma modalidade, a resina de mudo mista é caracterizada como tendo tanto capacidade de interação íõnica. quanto a capacidade de interação hidrofôbica. Em outra modalidade, a mistura é carregada na resina de moda misto a um pH de cerca de 5,0. Em ainda outra modalidade, a resi20 na de modo mista carregada é lavada com um tampão, por exemplo, Bis Tris ou citrato de sódio, tendo um pH de cerca de 7,0 a 7,2 antes da etapa (i) (an tes da primeira etapa de eíuíção).

Em uma modalidade, a resina de HIG é uma resina de fen Ha, tal come, porérrr não limitai© a, tenii sefarose. Em uma modalidade, a proteína 25 de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativa é eluida da resina de feníla empregando sulfato da amônio. Em uma modalidade, a concentração de sulfato de amônio varia de 0,3 a 0,5 M, incluindo 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,35, 0.37. 0,38, 0,39, 0.4, 0,41, 0,4.2, 0.43, 0,44, 0,45, 0.46, 0.,47,, 0,48, e 0,49 M. Em uma modalidade, a taxa de fluxo è de 50 a 150 crn/h. Em uma modaüda30 de, a taxa de fluxo è 100 cm/h. Em outra modalidade, a taxa de fluxo é 130 a 170 crn/h.

A invenção inclui um método para remover pelo menos 97% das proteínas de fusão LT-p-R-ig agregadas, presentes de uma mistura compreendendo proteínas de fusão LT-0-R-lg biologicamente ativas, não agregadas e proteínas de fusão LT-p-R-íg agregadas. E.m uma modalidade, o método compreende as etapas de aplicar a mistura em uma resina de modo misto 5 sob condições que permitam que as proteínas da fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas se liguem à resina de modo misto; eluir as proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, da resina de modo misto da etapa í) com uma solução pana obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologíoa10 mente ativas, nào agregadas; aplicar o primeiro eluato da etapa íi) em uma resina de cromatografís de interação hidrofóbica (HÍC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, se liguem à resina de NIC; e eluir as proteínas de fusão LT-P-RIg biologicamente ativas, nào agregadas, com uma solução para obter um 15 segundo eluato mais enriquecido devido à presença de proteínas de fusão

ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas. Tal método poderá ser usado para remover ao menos 97% de proteínas de fusão ίΤ-β-R-lg agregadas da mistura compreendendo proteínas de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas e proteínas de fusão LT-p-R-íg agregadas. Em uma 20 modalidade, o primeiro eluato compreende menos do que 25% de proteínas de fusão LT-pR-íg agregadas. Em outra modalidade, o primeiro eluato compreende menos do que 20% das proteínas de fusão LT-p-R-lg agregadas. Em ainda outra modalidade, o primeiro eluato compreende menos do que 15% de proteínas de fusão ΙΪ-β-R-lg agregadas. Em ainda outra rnodalida25 de, o primeiro eluato compreende cerca de 10% de proteínas de fusão LT-βR4g agregadas. Em uma modalidade, o segundo eluato compreende menos do que 2% da proteínas de fusão LT-p-R-ig agregadas. Fim outra modalidade, o segundo eluato compreende menos que 1% de proteínas de fusão LTβ-R-lg agregadas.

Qs métodos de purificação aqui descritos podem ser usados em uma composição que foi produzida de tal maneira que minimiza a presença de formas indesejadas de LT-p-R Ig ou de outras impurezas resultantes de uma fabricação baseada em células ou em uma composição que inclui agentes que facilitarão a purificação. Per exemplo, em uma modalidade da invenção, o método inclui prirneíramente colocar em contato a msstura com Proteína A. recombinante (rProteína A), Em uma modalidade, a mistura colocada 5 em contato com Proteína A recomblnante é um sobrenadante de cultura de célula de mamífero, Em uma modalidade, o sobrenadante de cultura de célula de mamífero é obtido de células de mamífero culturadas a Wc. Em uma modalidade, o sobrenadante de cultura de célula compreendo um tensoativo não lônico, tal como, porém não limitado a, Triton X-100,

Em uma modalidade da invenção, o método inclui colocar em contato a mistura com um adsorvente de membrana de troca de ânicn antes de aplicar a mistura em uma resina de modo misto. Em uma modalidade, a mistura é colocada em contato com um absorvente de membrana de troca de ânion após uma etapa de inatsvação viral (por exemplo, inativação viral de 15 pH baixo). Em uma modalidade, a mistura é posta em contato com um ad sorvente de membrana de troca de ânion apôs a mistura ler sido posta em contato com Proteína A recombinante (rProteina A).

A invenção ainda fornece um método para preparar uma compo sição purificada que é substancialmente enriquecida para proteínas de fusão 20 LT-p-R-lg de forma monomérica, biologicamente ativas. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 50% do agregados, Ern uma modalidade, a composição purificada compreende uma quantidade reduzida de agregados LT-fJ-R-lg. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 40% de agregados. Em outra modalidade, a 2.5 composição purificada compreende menos que 30% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 20% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 10% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 7,5% de agregados Em outra modalidade, a caro30 posição purificada compreende menos que 5% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 3% de agregados, Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que

2% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 1% de agregados. Em outra modalidade, a composição purificada compreende uma quantidade indetectável de «agregados.

Em outra modalidade, a composição purificada compreende uma quantidade reduzida da forma inativa-2 de proteína de fusão LT-p-R-ig, Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 20% dai forma ínatíva-2 da proteína de fusão LT-β -R-lg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 10% da forma ínativa-2 da proteína de fusão LT-p-R-lg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menus que 7,5% da forma inativa-2 de proteína de fusão LT-p-R-íg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 5% da forma inativa-2 da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 4% da forma inativa-2 da proteína de fusão ΙΤ-β-R-íg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 3% da forma ínativa-2 da proteína de fusão ΙΤ-β-RIg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% da forma inativa-2 da proteína de fusão LT-B-R-íg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 1% da forma ínatíva-2 da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg, Em outra modalidade, a composição purificada compreende uma quantidade não detectável da forma ínativa-2 da proteína de fusão LT-p-R-lg,

Em ainda outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 6% da forma inativa-1 da proteína de fusão LT-p-R Ig. Em uma modalidade, uma composição purificada compreende menos que 5% da forma inativa-1 da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg. Em outra modalidade, a composição purificada compreende menos que 4% da forma inativa-1 da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg. E.m outra modalidade, uma composição purificada compreende menos que 3% da forma inativa-1 da proteína de fusão ΕΤ-β-R-lg. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% da forma inativa-1 da proteína de fusão LT-$-Ríg. Em uma modalidade, uma composição purificada compreende menus que 1% da fomia inatíva-1 da proteína de fusão LT-p-R-lg. Em outra modalidade, a cornposi çào purificada .compreende, uma quantidade não detectáveí da forma inativa·' 1 da proteína de fusão LT-p-R-íg.

Bn outra modalidade, uma composição purificada da invenção compreende níveis de uma ou mais formas de agregados, inativa·· 1, e/ou 5 inativa-2 que são reduzidas daquelas presentes na composição de partida.

Por exemplo, em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 7,535 de uma primeira forma inativa da proteína de fusão LT-p-RIg (lnatíva-1), menos que 7,5% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p-R-íg (lnativa-2), e menos que 7,5% de proteínas de tesão LT-β10 R-ig agregadas. Por exemplo, em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 5% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão LTp-Rlg (Inativa··!). menus que 5% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão ΙΤψ-R-lg (lnativa-2), e menos que 5% de proteínas de tesão LT-p-R-lg agregadas. Por exemplo, em uma modalidade, a composí15 ção purificada compreende menos que 3% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg (lnativa-1). menos que 335 de uma segunda forma inativa da proteína de fusão ί.Γ-β-R-hg (ínativa-2), e menos que 3% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg agregadas Por exemplo, em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% de uma primeira forma 20 inativa da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg (I nativa-1), menos que 2% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p-F^ig (lnatíva-2), e menos que 2% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-íg agregadas. Por exemplo, em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 1% de uma primeira forma Inativa da proteína de fusão LT-p-R-Ig (lnatíva-1), menos que 25 1% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p-Rig (ínafiva2), e menos que 1% de proteínas de fusão LT p-R Ig agregadas.

Serà compreendido por um versado na técnica que os níveis de contaminação corn esses produtos podem não ser iguais e os exemplos acirna atados são meramente ilustrativos. For exemplo, em uma modalidade, 30 a composição punflcada compreende menos que 535 de uma primeira forma inativa da proteína de fusão Ι,.Τ-βΈΜρ (laafiva-1), menos que 10% de uma segunda forma inativa da proteína de fusào LT-p-R4g (lnaliva-2), e menos que 20% de proteínas de fusão LT^-R-lg agregadas. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão LT-^-R-lg íínatlva-l). menos que 5% de uma segunda forma inativa da proteins de fusão ΙΤ-β-R-lg (inaiiva-2), a menos que 5% de proteínas de fusão ΙΤ-β-R-íg agregadas. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% de uma primeira forma inativa da proteínas de fusão LT~p~R-lg (Inatíva-T), menos que 5% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão ΙΤ-β-R-íg (lnativa-2), e menos que 10% de proteínas de fusão ΙΤ-β-Rdg agregadas. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 2% de uma primeira forma snativa da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg (Inativa-d), menos que 5% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p R-lg (lnativa-2), e menos que 10% de proteínas de fusão LT-p-R -ig agregadas. Em uma modalidade, a composição purificada compreende menos que 5% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão LT-p-R-lg (lnativa-1), menos que 5% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p-R-lg (lnativa-2), e menos que 1% de proteínas de fusão LT-p-Rdg agregadas.

Em uma modalidade, o método compreende as etapas de obter um sobrenadante de cultura de célula a partir de um sistema de cultura de célula de mamífero, compreendendo uma célula hospedeira de mamífero transformada com DNA, codificando a proteína de fusão LT-p-R-lg, estabelecer contato com o sobrenadante da cultura de célula cem Proteína A. recombinante (rProteína A) para obter uma mistura de proteína de fusão ΙΊΓ-βRlg; aplicar a mistura da proteína de fusão L. T-p-R-lg de lí) em uma resina de mudo misto a um pH de cerca de 5,0 sob condições tais que as proteínas de fusão Ι..Τ-β-R-lg se ligam à resina de modo misto: lavar a resina da mudo misto com um tempão tendo um pH de cerca de 7,0 a 7,2; estabelecer contato com a resina de modo misto com uma solução para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg bmmginamente ativa; aplicar o primeiro eluato em uma resina de c-romatogratia de interação hidrofóbica (HIC) sob condiçbes que permitem que a proteína de fusão LT-P-R-lg se ligue á resina de HIC: e estabelecer contato com a resina de HIC da etapa vi) ran uma solução para obter urn seaundo eluato ainda mais enriquecido com a presença do proteína de fusão LT-p-R -lg biologicamente ativa, Em uma modalidade, taí método resulta em uma composição em que o segundo eiuato compreende menos que 1% da primeira forma inativa da proteína de fusão ΕΤ-β-R Ig (Inativa-1), rnenos que 1% da segunda forma inativa da proteína da fusão LT-p-R-lg (lnativa-2), e menos que 1% das proteínas de fusão Ι..Τ-β-R-lg agregadas.

Em uma modalidade., a concentração de proteínas de fusão LTp-R-lg na mistura é ao menos de 300 mg/L. Em uma mortalidade, a concentração de proteínas de fusão LT-p-R-lg na mrstura é pelo menos de 800 mg/L. Em uma modalidade, a concentração de proteínas de fusão LT-p-R-lg na mistura é pelo menos de 1350 mg/L.

Em uma modalidade, o volume da mistura é paio menos de 5000 L. Em uma modalidade, o volume da mistura è pelo menos 10000 L. Em urna modalidade, o volume da mistura è pelo menos de 15000 L.

A invenção incluí uma composição que compreende as proteínas de fusão de imunoglobuiina do receptor de finfotoxina p (LT-p-R-lg) biologicamente ativas, que são substancíalmente livres de agregados. Em rama modalidade, menos de 634 das proteínas de fusão ΕΤ-β-R-lg são biologicamente inativas e menos de 2% das proteínas der fusão LT-p-R-lg são agregadas, Por exemplo, em uma modalidade, manos de 5% das proteínas de fusão LT-p-R-lg são biologicamente inativas. Em uma modalidade, menos de 3% das proteínas de fusão LT-P-R-lg são biologicamente inativas. Em uma modalidade, menos da 1% das proteínas de fusão LT-p-R-lg são biologicamente inativas. Em uma modalidade, menos de 0,5% das proteínas de fusão LT-p-R-lg são biologicamente inativas. Em uma modalidade, a invenção pertence a uma composição que compreende menos de 2% das proteínas de fusão LT-p-R-lg agregadas. Em uma modalidade, menos de 1% das proteínas de fusão LT-p-R-lg são agregadas, Em uma modalidade, menos de 1% das proteínas de fusão LT-p-R-lg são biologicamente inativas e menos de 1% das proteínas de fusão LT-P-R-íg são agregadas.

Em uma modalidade, a proteína de fusão LT-p-R-lg compreende uma reasâo constante de Ig de um isctipo lgG1. Em uma modalidade, a protein® de fusão Ι.'ϊ-β-R-lg compreende o domínio extracelular de LT-|3-R-lg determinado na SEQ ID NO. 1. Em uma modalidade, as proteínas de fusão ΐ.Τ-β-R-lg biologicamente ativas da invenção são monomédcas.. As proteínas de fusão ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas da invenção são capazes de ligar a LTp e podem obstruir uma atividade biológica em uma célula induzida pela ligação de LTpR a LT;3. Em uma modalidade, isto pode ser medida pela habilidade de LT-p-R-íg para inibir a produção de IL-S e/ou de obstruir a liberação IL-8 em um ensaio padrão de inibição II..-8 m v/fro. Por exemplo, em uma modalidade, células expressando LT$R são colocadas em contato com ΙΤα1β2 e ο ΙΤ-β-R-lg e a habihdade de LT-p-R-lg para inibir a liberação IL-8 pelas células (como comparada a um controle apropriado, por exemplo, a ausência da molécula de ligação) são medidas.

A invenção igualmente inclui uma composição farmacêutica que compreende a composição da invenção e urn veiculo farmaceuticamente acoitávet

A invenção ainda inclui uma composição que compreende pelo menos 97% da proteína de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativa (isto é, faltando lnativa-1, lnativa-2, ou ambas). A invenção ainda inclui uma composição que compreende a proteína de fusão ΙΤ-β-R-ig monomérica (isto é, substancialmente faltando agregados). Tal composição pode ser obtida visando os métodos da invenção descritos aqui.

A invenção ainda fornece urn método de tratar uma desordem auto-imune, por exemplo, artrite reumatosde, doença de Crohn, ou esclemse múltipla que compreende administrar a composição farmacêutica a um indivíduo com necessidade do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 fornece uma vista geral do processo de Ciclo-1 -1,

A figura 2 mostra os resultados da etapa da resina de HIC-1 butila de Ciclo-1-1,. incluindo as condições sob as quais a.s formas inativas 1 e 2 da proteína de fusão LipR-lg são eluídas.

A figura 3 descreve uma vista geral dos processos intermediarios usando HPLC-.

A figura 4 descreve graficamente as porcentagens lnativa-2 e ativa em Frações de Eluição da Purificação de Butil-650M LTpR-lg (Crete 1--1). Purificação da LT$R Ig em concentrações de carga e lavagem de 1.65 M de 5 NaQ. As colunas furam carregadas em duplicata a 8 mg/mb de resina. A eluiçãc foi executada a 0,7 M de NaC-i e as frações de eiuição foram coletadas em sequência (gráfico de barra mostra os dados de nada fração, não cumulativa) e as formas de LTpR-lg medidas.

A figura 5 fornece uma vista gerai do processo de Cicte-1 -2.

A figura 6 descreve a etapa e a estratégia de lavagem do gradiente: do Cicio 1-2.

A figura 7 fornece uma tabela que resume os aperfeiçoamentos na resolução da impureza seguindo os três métodos de separação de Ciclo1, isto é, proteína A, HIC-1 (buiíla). e HIC-2 (feníla).

A figura 8 descreve a liberação do agregado pela etapa (feníla)

HIC-2. incluindo o efeito da carga, a altura de sarna, e a velocidade de fluxo. A figura 8.A descreve o efeito da carga na porcentagem da proteína de fusão LTpR Ig agregada e ativa seguindo a etapa feníla. A figura 88 descreve o efeito da altura e da velocidade de cama na porcentagem do rendimento atí 20 vo de LTpR íg (monomero ativo) do desenvolvimento da etapa (feníla) de Oiclo-2 HlG.

A figura 9 fornece uma vista gerai do processo de Cíolo-2.

A figura 10 fornece um diagrama esquemático da proteína de fusão LTpR-lg.

As figuras 11 A. e 118 descrevem as condições de operação para a coluna de modo misto.

A figura 12 descreve graficamente as condições da crematografía para a terceira coluna de Qiclo-2.

A figura 13 fornece uma tabela que descreve as características 30 de desempenho chave do processo a jusante modificado na fabricação de 15000.

PãscriçA^

A firn de que a invenção descrita arpa passa ser inteiramente compreendida, a seguinte descrição detalhada é determinada.

i. Uefiniçôes

O termo ’'ativo ou '‘biologicamente ativo, usado permutavel5 mente aqui, refere-se à forma de uma proteína que seja capaz de ligar a sua própria parte de hgação cognata (por exemplo, a um ligante para um receptor) e de bloquear o efeito biológico da ligação de LTpR associado à célula com LT. Não incluída na definição de biologicamente ativo é uma resposta biológica ou imunológíca â proteína. A atividade biológica pode ser detenni10 nada de acordo com o tipo de proteina que está sendo caracterizado. Por exemplo, uma proteina que seja urn receptor (ou uma forma solúvel da mesma) pude ser mostrada para ser biologicamente ativa se a mesma pode ligar a seu respectivo ligarrte. Alternativamente, a proteína pode ser ligada por um específico anticorpo para a forma ativa da proteína. Em outra moda15 lidade, um efeito biológico da proteína poda ser medido usando o ensaio baseado na célula. Tais ensaios são bem conhecidos na feoráca (por exemplo, a atividade de LTpR pode ser determinada usando um ensaio padrão da inibição IL-8).

termo “inativo ou biologicamente inativo refere-se à uma 20 proteína que é incapaz de ligar a sua própria parte de ligação cognata e, portanto, não modifica uma resposta biológica em um sistema ou que ligue com afinidade insuficiente para causar uma resposta biológica. Par exemplo, em uma modalidade, no caso de um receptor ou de uma forma solúvel do mesmo, uma forma inativa do receptor é incapaz, de ligar a um íigante e,. desse 25 modo incapaz de negociar a atividade biológica da forma ativa. Em outra modalidade, uma forma inativa de um receptor pode ligar ao líganie, por exemplo, com afinidade reduzida, mas não causa uma resposta biológica apropriada, ou (quando na forma solúvel) não bloqueia inteiramente os sinais biológicos transduzidos sob ligação de formas baseadas em célula do renep30 tor oom seu ligarrte.

Como usado aqui, a frase monômero ativo refere-se a uma proteína de fusão LT-p-R-lg biologicamente ativa que seja não agregada e ~

compreende duas cadeias de LT-p-IR-lg ligadas através das ligações da dissulfeto. Um exemplo de um rnonômero ativo è fornecida na figura 11. Assim, um monômero é uma proteína de fusão Fc de duas cadeias que não seja agregada.

O termo agregado⁵¹ refere-se a um agrupamento de proteína rígido, não dobrável ou um material de alto peso molecular (que inclui multimeros de urna proteína). Em urna modalidade, um agregado refere-se a uma forma multimérica de um rnonômero LT-p-R-lg que compreende mais de duas cadeias de uma proteína de fusão Fe. uma forma muítiménca na ordem 10 por exemplo, dimérica ou maior (tetramérica, nctamérica) Os agregadas podem ser biologicamente ativos ou inativas.

Os termos proteína e polipeptidea são usados aqui permutavelmente, e referem-se a sequências de aminoácido de uma variedade de comprimentos, em suas formas (não carregadas) neutras ou como sais, e ou 15 não modificadas ou modificadas pela glícosílação, pela axidação da cadeia lateral, ou pela fosforííação. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácido è a proteína nativa de comprimento total. Em outras modalidades. a sequência de aminoácido é um fragmento menor da proteína de comprimento total. Em outras modalidades, a sequência de aminoácido codifica 20 uma proteína quimèríca que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de ímunoglobulina e um segundo de pelo menus uma porção de uma segunda molécula de não írmmoglobulina.. Em uma modalidade, a molécula de não-imunoglobulína compreende uma porção biologicamente ativa de uma molécula, por exemplo,, uma porção de ligação do receptor de um 25 ligante ou uma porção de ligação do ligante de um receptor, por exemplo, um receptor de TNF ou fragmento do mesmo.

O termo proteína de fusão refere-se a uma molécula que compreende duas ou mais proteínas ou fragmentos dos mesmos ligadas or urna ligação covalenfe através de suas estruturas principais de peptídeo individu30 ais, mais preferivelmente geradas através da expressão genética de uma molécula de polinudeotideo que codifica aquelas proteínas. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão inclui um domínio de Ímunoglobulina.

O termo ’'receptor de iinfotoxin-^” ou L.T0R^i! refere-se a um membro da família de TNF dos receptores que se ligam à superfície de linfotoxína (LT) que é composta de um complexo triménco de cadeias alfa e beta de línfotoxina (Crowe eta/, 1994) assim como ao ligante LIGHT (homólogo a 5 línfotoxinas. exibe expressão induzível, e compete com a glicoprotelna D do vírus simples de herpes para HVEM, um receptor expressado por linfòcitos T). O LT-p-R é envolvido no desenvolvimento do sistema imune periférico e na regulação de eventos nos nós de linfa e baço no sistema imune maduro (Ware ef at, 1995: Mackay et a/_t 1997; Rennert et aç 1996; Rennert et at, 10 199'7; Chaplin and Fu, 1996).

Em uma modalidade, uma proteins de fusão (LT0Rlg) de LT6Rimuooglobulina compreende a porção de ligação do ligante do domínio extraoelular de LT0R e de uma região constante de IgG, por exemplo, porção Fc de um ig. Uma proteína de fusão de LT|3R4g pode bloquear a sinalização 15 entre o ligante LT de superfície e LT8R com consequências no estado funcionai de células dendríticas foliculares (Mackay and Browning 1998). Este btoquearnento pode, além disso, conduzir à doença auto-imune diminuída em modelos do roedor (Mackay et at, 1998, LLS. numero de série 08/505,606 depositado em 21 de julho, 1995 e U.S. número de série 20 60/029,060 depositado em 26 de outubro, 1996). A sequência de LTpR é fornecida na SEQ ID NO: 1:

LT0R HUMANO SEQ. (PUBMED AAH262B2 E P36941)

MLLPWATSAP GLAWGPLVLG LFGLLAASQP QAVPPYASEN QTCRDQEKEY YEPQHRICCS

61 RCPPGTYVSA KCSRIRDTVC ATCAENSYNE. HWNYLTICQL.

CRPCDPVMGL EEIAPCTSKR

121 KTQCRCQPGM FCAAWALECT HCELLSDCPP GTEAELKDEV GKGNNHGVPG KAGHFGNTSS

181 PSARCQPHTR CENQGL.VEAA PGTAQSDTTC KNPLEPLPPE MSGT30 MLMLAV LLPLAFFLLL

241 ATVFSCIWKS HPSLCRKLGS LLKRRPQGEG PNPVAGSWEP

PKAHPYFPDL VQPLLPISGD

301 VSPVSTGLPA APVLEAGVPQ (M)SPLOLTRE PQLEPGEQSQ VAHGTNGIHV IGGSM I II GN

361 IYIYNGPVLG GPPGPGDLPA TPEPPYPIPE EGDPGPPGLS TPH-QEDGKAW HLAETEHCGA

4.21 TPSNRGPRNQ FITHD (SEQ ID NO: 1)

Em uma modalidade, uma proteína de fusão LT-S-R-lg podo incluir todo ou um fragmento do domínio exhaceiular de LT-RR-lg humano (por exemplo, ela pode incluir resíduos 40-200, 35-200, 40-210; 35-22.0, 32225, ou 28-225 de ΙΤ-β-R humano. Errs algumas modalidades, uma proteína 10 de Rfusão inclui a região extracelular de LT -β-Rmolécuía como representada pelos resíduos 3.2-225 de SEQ ID NO: 1.

Um exemplo de urna proteína de fusão de LT-;3-R.-lg que possa ser incluído nos métodos e nas composições da invenção é determinado abaixo (SEQ ID NO: 2).

Mt.Pm7SAGGLAWPtVRGÍFGtíAAAyPPYASENQI'CRDQEKEY¥EPQ HRICCSRCPPGIYVSAKCSRIRDWCATQAENSYNEHWN¥I...TÍOQLCRPÇP

PyMGLEEIAPCTSKRKTQCRCQPGMFCAAWALECIHCEL.LSDCPPGTEAE LK.D.EVG.KGHNHCVPCKAGHFQNTSSPSARCQPHTRCENQGLVEAAPGTA Q.SPTrÇKNPLEPLPPEMSGTMVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF5CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (Os aminoácldos em itálico indicam a sequência do sinal; os a25 mínoácidos sublinhados indicam a sequência derivada da região extracelular de ΙΙ-β-R; e os aminoácidos em negrito indicam a sequência de IgG Fc, Uma vaíina se ligando à sequência de ΙΤ-β-R com a sequência de IgG-Fc é artificial, a derivou-se ou da sequência de ΙΤ-β-R ou IgG-Fc. A sequência sublinhada è uma parte substanciai do domínio extraceluíar de Ι,Τ-β-R e cor30 responde aos aminoácidos 32 a 225 de SEQ ID NO; 1.) Em urna modalidade, as proteínas de fusão de ΙΤ-β-R usadas nos métodos e composições da invenção incluem a sequência de aminoácido determinada na SEQ ID NO: 2 sem a sequência do sinal..

Superhcie do llgante LT refere-se a urna superfície de complexo LI' ou derivado do mesmo que possa especiflcamente se ligar ao LT-0-R.

O termo dominie de ligação do íigante” ou porção de ligação do Iígante como usado aqui refere-se a um receptor nativo (por exemplo, receptor de superfície de célula) ou região ou derivado do mesmu retendo pelo menos uma habilidade de ligação do iígante qualitativa, e preferivelmente a atividade biológica de um receptor nativo correspondente.

O termo proteína de fusão da imunoglobulina refere-se a uma fusão de uma porção de um polipaptldno (que compreende geraímente o domínio extracelular da uma porção de superfície da célula) com uma ou mais porções de uma região constante da imunoglobulina, por exemplo, os domínios CH1, CH2 ou CH3 ou combinações dos mesmos. Em urna modalidade, o polipeptídeo é um membro da familia de TNF dos receptores.. As porções da molécula de Ig podem derívar-se de qualquer um dos vários isotípos de imunoglobulina, incluindo, por exemplo, IgGI, lgG2, IgM, IgA, etc.

Em uma modalidade preferida, a proteína usada nos métodos e composições da invenção è uma proteína de fusão de imunoglobulina. Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender um receptor, ou porção de ligação do Iígante do mesmo, e um domínio de dimerízaçao, por exemplo, um domínio de Fc.

O termo genérico imunoglobulina'* compreende cinco classes distintas do anticorpo que pode ser distínguído bioguimicamente. Todas as cinco classes de anticorpos estão claramente dentro do escopo da presente invenção, a seguinte discussão serâ geralmente direcionada à olasse de IgG de moléculas de imunoglobulina,

A frase família de TNF de receptores refere-se a um receptor, se membrana ligada ou segregada naturalmente (como no caso de osteoprotegerin), que tem padrões de ligação de cístetna de família de TNF canônica ou qualquer receptor que se liga a um membro definido da família de TNF dos ligant.es (por exemplo,Banner et aí, 1993). A invenção reivindicada em outras modalidades refere-se ás fusões do receptor-Ig da família de TNF obtidas pelos, métodos discutidos aqui. assim como às preparações farmacêuticas que as compreendem.

Os termos aproximadamente e cerca de”., como usados aqui em referenda a um número incluem geralmente os números que caem dentro de uma faixa de 10% em outra direção do número (maior do que ou menos do que o número) a menos que indicado de outra maneira ou de outra maneira evidente do contexto (exceto onde tal numero excedería 100% de um valor possível).

II. Separação de formas diferentes de. protemes .de fusão Iq inativas e/ou agregadas

A invenção refere-se à habilidade de produzir formas ativas purificadas do proteínas de fusão (Ig) de ímunoglobulina, incluindo proteínas de fusão de LTpR-lg, separando formas ativas da proteína dos formas inativas e/ou separando formas ativas da proteína dos agregados.

Quando se soube que a expressão de proteínas de fusão Ig em células de mamífero pude conduzir em formas múltiplas de proteínas de fusão Ig inativas, a extensão da contaminação e os meios da adequadamente purificar as proteínas de fusão não foram conhecidos. Mais especificamente, a técnica ensinou que a proteína de fusão de LTpRlg ê expressada em duas formas em células de cos de macaco ou em células do ovário de hamster chinês. Uma forma foi ensinada para ligar o íigante com alta afinidade, a forma ativa se a outra forma inativa foi ensinada para não ligar o lígante (U.S. 20020039580), Entretanto, a realização que há de fato duas formas inativas diferentes da proteína de fusão de LT0R-lg (Inativa-1 e Ínativa-2) não foi previamente conhecida e, consequentemente, métodos de separação minimizam a presença de ambas dessas formas inativas (lnativa-1 e Inativa2) em uma preparação que não tinha sido desenvolvida previamente. Por exemplo, como descrito nos exemplos abaixo, a expressão de mamífero de proteínas de fusão de LTpR-lg resulta em uma mistura de proteínas de fusão de LTpR-lg, a mistura que compreende uma primeira forma inativa da proteína de fusão de LT^R-lg (referida aqui como lnativa-1 o que pode ser visto como o primeiro ombro antes do pico principal no painel HIC -HPLC de carga HIC-1 da figura 3), e uma segunda forma inativa da proteína de fusão de LTpR-ig (referida aqui como “lnativa-2 que pode ser visto como o ombro após o pico principal de painel HIC-HPLC de carga HIC-1 da figura 3), e formas agregadas de LTpR-íg.

A invenção pertence à separação da forma monoméríca, ativa desejada de LTPR~lg das formas múltiplas de proteínas de fusão Ig e/ou inativas, assim como agregados da proteína. O método da invenção confia em combinações de tipos diferentes de cromatografsa, por exemplo, oromatografia de interação hidrofóbica (HIC), para reduzir efioazmente a porcentagem 10 de proteínas da fusão Ig agregadas e/ou inativas de uma mistura (incluindo ambas as formas).

A invenção fornece um método para separar uma mistura que contêm proteínas de fusão (ig) de ímunogiobulina biologicamente ativas, proteínas de fusão Ig inativas, e agregadas. Em um aspecto, a separação é ai15 cançada pela primeira etapa que compreende uma resina de modo misto seguida por uma etapa HIC fenila. A primeira etapa no processo da invenção envolve colocar em contato a mistura com uma resina cie modo misto sob as condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem à resina de modo misto. Deve-se notar que as condições que são 20 conducentes à resina de modo misto que se liga à proteína de fusão Ig ativa podem igualmente ser conducenf.es à ligação de impureza. Domo tal, a lavagem e as condições de eluição podem ser usadas para separar as impurezas das proteínas de fusão Ig biologicamente ativas.. Por exemplo, para a purificação de ΙΤ-β-R-lg ativo, seguindo a carga da resina de modo misto 25 com a mistura da proteína, determinadas condições de eluíção e lavagens de pré-eluição podem ser usadas para separar o LT-0-R-lg ativo de Inativo 1. Os exemplos de tais condições de lavagem/eluição são fornecidos nos exemplos abaixo. As proteínas de fusão Ig biologicamente ativas são então eluídas da primeira etapa de resina de modo misto, tal que um eluato è obti30 do.

A segunda etapa no processo de purificação compreende colocar em contato o eluato da primeira etapa com uma resma de crcmatografia de interação (HIC) hídrofòbica sob as condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem à resina de HIC. As proteínas de fusão ig ativas são então duídas. A solução resultante contém as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas que foram separadas de ambas as formas inativas da proteína de fusão Ig e dos agregados de proteína. Em uma modalidade preferida, a resina de HIC è uma resina de fenila, por exemplo, fenil sefarose. Nu que diz respeito à purificação das proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg, a etapa de'fenila, como descrita em mais detalhe nos exemplos abaixo, o produto (proteínas de fusão de LT-^R-lg ativas), agregados, e lnativu-2 todos se ligam ã coluna de fenila sob carga, mas são separados usando condições de lavagem/eluição apropriadas. As condições de eluição podem resultar no agregado e lnatívo-2 que permanecem preferencialmente na coluna, quando o produto de ΙΤ-β-R lg elui em uma forma pura.

Um método para separar proteínas de fusão Ig ativas dos formas inativas efou agregados inclui colocar em contata urna mistura que compreende proteínas de fusão Ig biologicamente ativas e proteínas de fusão Ig biologicamente Inativas com uma resina de oromatografia de interação de bufila hídrofóbica (HIC) sob as condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem á resina de butiia. Deve-se notar que as condições que são conducentes à resina de butíla se ligando à proteína de fusão Ig ativa podem iguaimente ser conducentes á ligação de impurezas. Como tal, as condições de lavagem e eleição podem ser usadas para separar as impurezas das proteínas de fusão Ig biologicamente ativas. Por exemplo, para a purificação de ΙΪ-β-R-lg ativo, seguindo a carga da resina de butiia com a mistura de proteína, determinadas condições de eluição e lavagem de pré -eluição podem ser usadas para separar o LT-p-R lg ativo dos formas inativas. Inativo-1 pude ser lavado fora diminuindo a concent ração de NaCI. O Ι..Τ-β-R-lg ativo e os agregados podem ser eluatos diminuindo ainda a concentração de NaCI, quando o lnativo-2 permanece ligado à coluna atè que seja retirado com água (nenhum NaCI). Os exemplos de tais condições de lavagem/eluição são fornecidos nos exemplos abaixo.

Depois da eluição das proteínas de fusão Ig biologicamente ativas. o eluate é subsequentemente colocado em contato com uma segunda resina de HIC. tal que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se ligam à segunda resma de HIC. Depois da eleição das proteínas de fusão Ig 5 biologicamente ativas, a solução resultante contém as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas separadas das formas inativas e/ou dos agregados. Em uma modalidade, a resina do butiía HIC compreende urna estrutura principal de metacdlato hidroxílado.

Altemafivamente. o método de purificação da invenção pode ser alcançado usando uma combinação das etapas HIC de fonila. Nu que diz respeito às proteínas de fusão de L.T-p-R-lg, LT-^-R-lg biologicamente ativo, formas inativas (isto é, Inativa-1 e lnatíva-2), e agregados, cada um, se liga à resina de fenila. Corno tal, o LT-S-Rlg ativo pode ser purificado usando combinações apropriadas de lavar e eluir tampões.

Um aspecto importante da invenção é a purificação de proteínas de fusão de LTpR-lg biologicamente ativas das duas formas inativas da proteína, assim como agregados de proteína. Tais impurezas resultam da produção da proteins de fusão de ΙΤ-β-R-Ig, particularmente produção na cultura de célula de mamífero, mas podem ser reduzidas de acordo com as eta20 pas da purificação descritas aqui.

A invenção fornece um método para separar uma mistura que contém proteínas de fusão de LT3R Ig biologicamente ativas, proteínas de fusão de LTpR-lg inativas, e agregados. Em um aspecto, a separação é alcançada pela primeira etapa que compreende uma resina do modo misto 25 seguida por uma etapa HIC de fenila. A primeira etapa no processo envolve colocar em contato a mistura com uma resina de modo misto sob condições que permitem que as proteínas de fusão de LT3R-íg biologicamente ativas se liguem à resina de modo misto. Deve-se notar que as condições que são conducentes á resina de rnodo misto ligando a proteína de fusão Ig ativa 30 podem igualmente ser conducentes à ligação de impureza. Como tal, as condsções de lavagem e eluição podem ser usadas para separar as impurezas das proteínas de fusão Ig biologicamente ativas. As proteínas da fusão de LTpR-lg biologicamente ativas são enfâo eluídas da primeira etapa de resina de modo misto, tal que um eluato è obtido. Em uma modalidade, o eluato de resina de medo misto tom uma quantidade significativamente reduzida da forma inativa-1 da proteína de fusão de LTpR-Ig, isto é, o primeiro eluato contém menos que 2%, menos que 1%.. ou menos que 0,5% da forma inativa-1 da proteína de fusão de LTpR-Ig. Além disso, o agregado pode ser reduzido da .28% na carga para 8% no eluato dependendo das condições da cromatografia. A segunda etapa no processo de punficação compreende colocar em contato o eluato da primeira etapa com uma resina de nromatografia de interação hídrofôbica (HIC) sub as condições que permitem que as proteínas de fusão de LTpR-lg biologicamente ativas (que podern igualmente incluir impurezas) se liguem á resina de HIC. As proteínas de fusão de LTpR-lg ativas são então eluídas. teis que a forma ínativa~2 da proteína de fusão de LT0R-lg e os agregados da proteína sejam reduzidos significativamente. Em uma modalidade, o eluato da resina de HIC tem uma quantidade significativamente reduzida da forma inativa-2 da proteína de fusão de ΕΤβR-lg, isto é, o primeiro eluato contem menos que 2%, menos que 1%, ou menos que 0,534 da forma inativa 2 da proteína de fusão de LTpR-lg. A solução resultante contém as proteínas de fusão de LTpR-lg biologicamente ativas que foram separadas de ambas as formas inativas da proteína de fusão de LTpR Ig e dos agregados da proteína. Em uma modalidade preferida, a resina de HIC è uma resina de fenila, por exemplo, fenií sefarose,

Um outro método para separar proteínas de fusão Ig ativas das formas inativas e/ou dos agregados inclui colocar em contato uma mistura que compreende proteínas de fusão Ig biologicamente ativas s proteínas da fusão Ig biologicamente inativas com uma resina de cromatografia de interação de butila hídrofôbica (HIC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem ã resina de butila. As proteínas de fusão Ig biologicamente ativas são então eluídas e coletadas então no primeiro eluato. D eluato é subsequentemente colocado em contato com uma segunda resina de HIC, tal que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se ligam ã segunda resina de HIC, Depois da eleição das proteínas de fusão lg biologicamente ativas, a solução resultante contém as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas separadas dos formas inativas e/ou dos agregados. Em uma modalidade, a resina de burila HIC compreende uma estrutura principal de metacrílato hídmxilado.

igualmente caracterizado é um método para remover pelo menos 97% de agregados da proteína de uma mistura que compreende proteínas de fusão de I..T-p-R-lg biologicamente ativas e «agregados da proteína. O método é baseado nas combinações acima de etapas de cromstografia, por exemplo, HIC de fenila ou modo misto/HlC de fenila. Em uma modalidade, o 10 método inclui colocar em contato a mistura com uma resina de fenila HIC cu uma resina de modo misto sob condições que permitem que as proteínas de fusão do LT-P-R-ig biologicamente ativas se liguem à HIC de fenila ou resina de modo misto, e subsequentemente eluír as proteínas de fusão de LT-P~RIg biologicamente ativas de HIC de fenila ou resina de modo misto para obter 15 um primeiro eluate. O primeiro eluato reduziu as quantidades de agregado da proteína, incluindo menos que 25% de agregados da proteína, menos que 20% de agregados da proteína, menos que 15% de agregados da proteína. ou cerca de 10% de agregados da proteína. Em uma modalidade, seguindo a primeira etapa de HIC, e eluato pode ser colocado em contato com 20 uma segunda resina, por exemplo, HIC de fenila, sob as condições que permitem que as proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas se liguem à resina de HIC. Eluição das proteínas da fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas para obter um segundo eluato que contem menos que 2% de agregados da proteína, eu menos que 1% de agregado da proteína. Este 25 método resulta na remoção pelo menos de 97% dos agregados da proteína da mistura inicial que compreende proteínas de fusão de ί..Τ-β-R-lg biologicamente ativas e agregados da proteína.

Uma vantagem particular dos métodos descritos aqui, é que os vários processos podem ser usados para purificar o produto, por exemplo, 30 proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg, quando 5059 do material de partida compreender espécies de agregado e inativas não desejadas. Em uma modalidade, a etapa de resina de modo misto (por exemplo, Capto MMC) é capaz de re drndr o agregado de 28 a 8% e a ooiuna Cielo-2 fenlla è capaz de reduzir ο agregado de 24% a <1,0%.

Outro aspecto da invenção é um método para preparar uma composição que compreende proteínas da fusão de Ι,Τ-β-R-lg biologicamen5 te ativas. Como determinado aqui acima, em uma modalidade ilustrativa a composição compreende menos que 1% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão de Ι..Τ-β-R-lg (proteína inaiiva-1), menos que 1% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg (proteína ínativa2), e menos que 1% de agregado da proteína. O método è baseado em de10 terminadas combinações de etapas da cromatografia que prevêem a remoção das proteínas de fusão Ig inativas e das agregados da proteína. O método inclui obter um sobrenadante de cultura de célula de um sistema de cultura de célula de mamífero que compreende uma célula hospedeira de mamífero transformada com o DMA que codifica a proteína de fusão de 1.T15 β-R-lg, Depois da expressão, o sobrenadante da cultura de célula é colocado em contato com Proteína A recombinante (rProteína A) para obter uma mistura da proteína de fusão de LT-β-R-lg. A mistura de fusão de ΙΤ-β-R-lg é colocada em contato com uma resina de cromatografia de interação hídrofóbica (HIC) sob condições que permitem que a proteína de fusão de LT-β20 R~lg ativa se ligue ã resina. Depois da eluição da proteína de fusão de ΙΤ-βR~lg ativa., o e.luato é colocado em contato corn urna segunda, resina de cromatografia de interação hicirofòbica (HIC) sob condições que permitem que a proteína de fusão de L.T-β-R-lg ativa se ligue à resina de HIC. Em uma modalidade, depois da eluição das proteínas de fusão de Ι.Τ-β-R-lg ativas, o 25 eiuato conterá menos que 1% da primeira forma inativa da proteína de fusão da LTR-R-lg (proteína lnaiiva-1), menos que 1% da segunda forma inativa da proteína de fusão de LT-(3-R-lg inativa (proteína lnativa-2), e menos que 1% de agregado da proteína. Em uma modalidade, a invenção pertence a uma composição que compreende menos que 1% da primeira forma inativa 3Q da proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg (proteína Inativa-1), menos que 1% da segunda forma inativa da proteína de fusão de LT-B-R lg (proteína Inativa2), e menos que 1% de agregado da proteína.

Em urns modalidade., a fenila baseada na purificação das proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg expressadas na ouítura da célula incluem a etapa de eluição. por meio de que a coluna é carregada a 1 M de sulfato de amônio e eluída a Ü,44 M, Agregados a forma lnativa-2 de LT-0-R-lg eluem mats 5 tarde do que o produto.

Em uma modalidade, a butila baseada na purificação das proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg expressadas na cultura de célula incluem lavar a proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg Inativa-1 seguindo carga de coluna diminuindo a concentração de NaCI. Então, para a eluição de butila, a concentração 10 de NaCI é ainda diminuída, causando produto fe agregado) para eluir porém não lnativo-2. Einairnente, lnativo-2 é retirado da coluna de butila por diminuição da concentração de sal de NaCI a zero.

As formas ativas e inativas da proteina de fusão de LT-|3-R-lg podem ser determinadas de acordo com qualquer número de parâmetros 15 conhecidos na ténica, incluindo a ligação ao liganfe LT. Em uma modalidade, a afinidade da interação da ligação pude ser medida. Em outra modalidade, os ensaios /n vitro conhecidos na técnica que medem a habíhdade de uma molécula ΕΤ-β-R para causar uma resposta biológica podem ser usadas para distinguir as proteínas de fusão de ΕΤ-β-R-íg biologicamente inativas das 20 biologicamente ativas, tal como o ensaio da inibição IL-8.

Por exemplo, em uma modalidade um ensaio de liberação IL-8 é baseado na secreção de IL -8, que é observada depois que linfotoxina o 182 humana recombinants se liga ao receptor beta da linfotoxina de superfície de célula nas células A375 (linhagem celular de melanoma humano). Q ensaio 25 de liberação IL-8 mede a habilidade de uma molécula de ligação (por exemplo, LT-S-R-lg) para bloquear esta secreção 11.-8 ligando linfotoxina solúvel ο1β2, impedindo-a de se ligar ao receptor de linfotoxina beta. O IL-8 que é segregado no sobrenadante médio é então medido com um ensaio de ELISA. A molécula de ligação é diluída âs concentrações apropriadas e incuba30 da com linfotoxina α1β2 humana recombinant© (170ng/ml) durante 1 hora à temperatura ambiente em uma placa de microtitulação de 98 poços, A concentração de linfotoxina ο1β2 é otimizada pelos experimentos de titulação que determinam a quantidade máxima da liberação de IL-8. Vinte mil células A375 são então adicionadas a cada poço. e a placa é incubada por 17 horas a 37°C em 5% de COs. No fim do periodo de Incubação, a placa é centrifugada e o sobrenadante é coibido. Os sobrenadantes são testados para a 5 concentração de IL-8 com um ensaio ELISA padrão de sanduíche.. As concentrações de IL-8 são traçadas contra concentrações do anticorpo, e um IC50 é determinado de um ajuste da curva de 4 parâmetros dos dados.

Geralmenie, a proteína de fusão LT-p-R-lg é considerada ativa nu ensaio da inibição IL-8 se a inibição percentual estiver entre 75%-135% 10 de uma referência do controle. Ahernativamente, os formas ativas e inativas de proteínas de fusão LT-8-R-lg podem ser determinadas usando os anticorpos que são específicos para um forma ou outra. Os exemplos dos anticorpos específicos para a forma ativa ou funcional (anticorpos que falham para ligar a forma inativa) da proteína de fusão LT-p-R~íg incluem AGH1 15 (produzido por hibndoma AG.Hl.o.1; Ascensão ATCC Número HB11796) e

BDA8 (linhagem de célula de híbridoma (BD.A8.AB9) que produzem LT-p-R mAb BDA8 anti-humano de camundongo que foi depositado em 12 de janei ro de 1995 com a Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC) (Rockville, Md.) de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, e foi atribuído 20 o número de ascensão ATCC HB11796) que são. cada um, descritos nas

Patentes U.S. Números 7.001.598. U.S. 2002.0197254, U.S. 20020039580, cada qual é incorporada aqui peia referência. Além disso, as profeinas ativas e inativas podem ser caracterizadas por suas propriedades de eluição de acordo com as etapas da cromatografía descritas aqui. Por exemplo, usando 25 a coluna NIC butila de forma inativa-1 a proteína de fusão LT-p-R-lg é eluida na primeira lavagem de NaCI a 1.55 Μ. A proteína de fusão ί.Τ-β-R-íg e os agregadas da proteína são aluídos da coluna usando NaCI a 0_;7M como um tampão de eluição, e a forma inativa~2. ria proteína de fusão LT-0-R-lg é aluída usando a lavagem da tira ria água pura. Como descrito em mais detalhe 30 nos exemplos abaixo, a purificação similar pode ser alcançada usando gradientes de etapa do sulfata de sódio em vez do cloreto de sódio.

Deve-se notar que os métodos acima podem ser executados u·· sando processos de fabricação de grande escala Por exemplo, os métodos descritos aqui podem ser usados para separar eficazmente impurezas da mistura que tem um volume de pelo menos 5000 L, pelo menos 10000 L, pelo menos 15000 L, 15000 L, ou maior que 15000 L,

Alèm disso, determinados parâmetros da coluna podem ser ajustados para maximizar a recuperação de proteína. Em uma modalidade, a segunda etapa de HIC do método inclui uma coluna que tem uma altura dentre 25-35 centímetros, 29 a 30 cm, ou cerca de 30 centímetros,

Deve-se compreender que as composições obtidas usando os 10 métodos descritos aqui são igualmente abrangidas pela invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende proteínas de fusão lg biologicamente ativas, por exemplo, proteína de fusão LT-p-R-lg, em que menos que 10% das proteínas de fusão lg são iíiologicamente inativas. Em outra modalidade, menos que 5% das pro15 telnas de fusão lg são biologicamente inativas; menos que 1% das proteínas de fusão lg são biologicamente inativas; ou menos que 0<5% das proteínas de fusão lg são biologicamente inativas. As composições que contêm níveis reduzidos de agregados são igualmente descritas, incluindo uma composição que compreende proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas 20 e menos que 2% de agregados da proteína.

UI. Técnicas de Cromatografia

O método de separação da invenção pode ser executado ern uma população não purificada de polipeptídeos (por exemplo, sobrenadantes da cultura ou preparações das proteínas de fusão lg isoladas dos corpos 25 de inclusão prooanóficosi. Qs métodos para obter tais sabrenadant.es da cultura são descritos em rnais detalhes abaixo na seção IV. Altemativamente, os métodos de separação instantâneos podem ser usados nas misturas de polipeptideo obtidas após uma ou mais etapas de purificação ou seleção iniciai, por exemplo, após uma preparação que compreende formas inativas 3G e ativas que foram eluidas de uma matriz, -da afinidade, por exemplo, proteína A.

Em uma modalidade preferida, as etapas oromatogràficas des cntas aqui podem ser aplicadas às misturas que foram parcialmente purificadas por outros procedimentos da purificação da proteína. O termo parcíalmente purificado como usado aqus inclui uma preparação da proteína em que a proteína de fusão Ig de interesse està presente em uma concentração de pelo menos 5% em peso, mais preferivelmente pelo menos 10% e mais preferivelmente pelo menos 45% em peso. As etapas da purificação iniciais ou subsequentes podem ser usadas para remover, por exemplo, os agregados da imunoglobuíina, espécies desdobradas, proteína de célula hospedeira, material de resíduo de etapas oromatográficas precedentes (tal como, a proteína A quando empregada}. Conformemente, a aplicação das etapas da cromatografia específicas descritas aqui pode ígualmeote ser apreciada no contexto de um protocolo de purificação total. As etapas de purificação exemplares que podem ser usadas antes ou subsequentes à purificação incluem: crometografía de afinidade (por exemplo, PROSE P-A® (BioProcessing Ltd., Reino Unido) que consiste da proteína A covaientemente acoplada a vidro de poro controlado ou Prateio A SEPHAROSE®? East Flow (Pharmacia) ου TOYOPEARL 650Μ Protein A (TosoHaas)). Proteína z\ ê preferida para cadeias pesadas 1, .-2 ou ' z humanas e a proteína G para isotipos de camundongo. A resina de Bakerbond ABXtm pode ser usada se a molécula compreenda um domínio OH3.

Um exemplo da crumatografia que pode ser usado nos processos da invenção é cromatografia de modo misto. Uma resina de modo misto preferida é uma que tenha urna capacidade de ligação dinâmica de mais de 45 mg BSA/rnl médio a 30 mS/cm e é um permutador de cation fraco multimodal. Um exemplo de uma resina de medo misto que possa ser usado é Capto MMC (GE Healthcare).

Um exempla da cromatografia que pode ser usado é cromatografia de interação hídrofòblca ou HIC. O termo HIC, como usado aqui,, refere-se à cromatografia de interação hidrofôbica que emprega uma interação hidrofobica entre a coluna e a proteína de fusão íg para separar os formas inativas da proteína e de outros contaminardes, tais como- agregadas, produto redobrado, isto é, proteína de fusão Ig biologicamente ativa.

A cromatografia da interação hidrofóbica foi desenvolvida primeíramente depois da observação que as proteínas poderíam ser retidas nos geles da afinidade que compreenderam os braços do espaçador de hidrocarbonato mas faltou a afinidade do lígante. A eluiçâo das sustentações de HIC pode ser efetuada por alterações no solvents, pH, intensidade iônica, ou pela adição de agentes uaotropicos ou modifioadores orgânicos, tal como etíleno ou propíleno glicol. Uma descrição dos principies gerais de cremategrafia de interação hidrofóbica pode ser encontrada, por exemplo, na Patente U.S. Numero 3.917.527 e na Patente U.S. Número 4.000.098. H.IG no contexto da cromatografia líquida de pressão elevada (HPLC) foi usado para separar os fragmentos do anticorpo faltando as porções de cadeia longa (par exemplo. F(ab*)g) das moléculas do anticorpo intactas em um protocolo de etapa única. (Morimoto, K. efa/., L Biochem. Biophys. Math. 24:107 (1992)).

A crornatografla de troca iônica poda igualmenfe ser empregada nos métodos da invenção, A este respeite, vários substituíntes catiônicos ou aníônicos podem ser unidos ás matrizes a fim de formar suportes catiõnícos ou aniônícos para a cromatografia. Os substituintes de troca aníônioa incluem grupos dietilaminoetila (DEAE), aminoetiía quaternária (QAE) e amina quaternária (Q). Substituíntes de troca catiônica incluem carboxirnetiía (CM), sulfoetila (SE). suífopropila (SP), fosfato (P) e sulfonate (S). As resinas de troca iônica de celulose, tais como DE23, DE32, DE52, GM-23, CM-32 e CM-52 são disponíveis de trocadores de ton de baixa reficuiação e baseados em Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. SEPHADEX® são igualmente conhecidos. Por exemplo, DEAE-, Q.AE-, CM-, e SP-SEPHADEX® e DEAE-, Q-, CM- e S-SEPHAROSE® e SEPHAROSE® Fast Flow são todos disponíveis de Pharmacia AS. Além disso, ambos DEAE e oopolímero glícolmetaorílato de etíleno derivatízado de CM. tal como TOYOPEARL DEAE650S ou M e TOYOPEARL. CM-650S ou M são disponíveis de Toso Haas Co., Philadelphia, Pa..

As interações hidrofóbícas são mais fortes em alta intensidade iônica, consequentemente, esta forma de separação é executada convententemente seguindo precipitações de sal ou procedimentos de troca iônica. A adsorçào das proteínas a uma coluna de HIC é favorecida por concentrações altas de sal, mas as concentrações reais podem variar sobra uma escala ampla dependendo da natureza da proteína a da escolha do Iígante de HIC particular, Os vários ions podem ser arranjados em uma sèríe assim 5 chamada soiufóbica dependendo se eles promoveram interações hidrofóbicas (efeitos de salifioaçào) ou Interromperam a estrutura da água (efeito cao~ tropics) e conduziram ao enfraquecimento da interação hidrofõbica.. Cátions são classificados nos termos do aumento de efeitos de salifícaçâo corno 8a**c Ca*x; Mg** <; Li* <; Cs* q Na* <; K* <; Rb* <; NH₄*. enquanto ânions ü podem se? ordenados nos termos de aumento do efeito caotròpioo como PD ' <; W <: CHaCOOO’ <; Cf <; Pr <: NOÇ <: Cí0₄ <: I <; SCN. Cromatografia HIC pode ser usada em um modo eluato e de ligação. Alíernativamente, HIC pode ser usado em mudo através de fluxo.

Em geral, os sulfates de Na, K ou NH.< promovem eficazmente a 5 interação protelna-ligante em HIC, Os sais podem ser formulados em que influenciam a intensidade da interação como dada pelo seguinte relacionamento; (NH₄)₂S0₄>; Na₂SO₄>; NaCb; NH₄Cb; NaBn; NaSCN. Em geral, as concentrações de sal dentre cerca de 0,75 e cerca de 2M de sulfato de amônio ou entre cerca de 1 e 4M de NaCi são úteis. Em uma modalidade, de Q 0,3 a 0,6 M de Na_;>SO.< é usado para ligar a proteína de fusão de LT^R-lg a

HIC. As eiuições de NB de HIC podem iguaíme.nte ser alcançadas em concentrações de sal inferiores àquelas indicadas aqui, por exemplo, menos de 0,3 de Na₂SO₄, Em uma modalidade, de 0,0 a 0,5 M de sulfato do amô.nio é usado para eluír o produto da proteína, incluindo mas não limitado a, de 0,3 5 a 0,5 M de sulfato de amante.

Protocolas de purificação adicionais podem ser adicionados incluindo mas não necessariamente limitados a: cromatografia de troca iônioa adicional, cromatografia de exclusão de tamanho, inatívação viral, concentração e secagem por gelo, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforase em 0 gei. díàíise, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em silica, cromatografia em heparina SEQHAROSEA cromatografia por tono, precipitação de PEG, ou precipitação de sulfato de amônio.

Uma etapa de purificação adicionai encontrada nas modalidades da invenção inclui a filtragem de membrana de troca de ânion (por exemplo, purificação de preparações de proteína corn um adsorbents da membrana Q). Em algumas modalidades, a purificação da proteína com um adsorbente 5 da membrana Q è executada em um pH acima de 6.2 e em uma solução de alta condutibílidade. Como usado aquí, “alta eonduiibilidade” refere-se a uma condutibilidade de cerca de 50 mS/om ou maior.

Um número da suportes cromatográficos pode ser empregado na preparação das colunas, os mais extensivamente usados são agarose, 10 silica e resinas de copolimero ou polimem orgânico. O material de interação hidrofóbica e geraímente uma matriz base (por exemplo, um cafóoidrstu hidrofilico (iai como, agarose reticuíada) ou material de copolimero sintético) a que os iigantes hidmfàblcos (por exemplo, grupos alquíla ou aríla) são acoplados Em uma modalidade, o material de HIC compreende uma resina de 15 agarose substituída com grupos feniía. O material de HIC exemplar inclui:, phenyl SEPHAROSE*, FAST FLOW com substituição baixa ou alta (GE Healthcare; Pharmaoia I.KB Biotecnology, AB, Suécia): phenyl SEPHAROSES High Performance column; phenyl ou butyl-SEPIiAROSBt!) CL-4B, butyiSEPHAROSE® FF, octyl-SEPHAROSE€> FF e phenyl-SEPHAROSE® FF 20 (Pharmacia LKB Biotecnology, AS, Suécia); Fractogei^ EMO Propyl ou FRACTOGEt.^ EMG Phenyl columns (E. Merck. Alemanha); MACROPREP® Methyl ou MACRO-PREP^ t-Butyl Supports (Bio-Rad, Califórnia); WP HlPropyl (G3)® column (J.T., Baker, Nova Jersey).

Os materiais de HIC exemplares são igualmente disponíveis de 25 Tosoh Corporation, Téqui, Japão sob os nomes de produto TOYOPEARL éter 650, fenila 650, butíla 650 (EMD Merck), butila 600 (EMO Merck), éter5PW-HR, ou fenil-5PWHR; Miles-Yeda, Rehovot, Israel sob o nome de produto alquil-agarose, em que o grupo alquiía contém de 2-10 átomos de carbone, e J.T., Baker Phillipsburg, N.J. sob o nome de produto Bakerbond WP30 Hl-propila. É igualmente possível preparar a coluna de HIC desejada usando a química convencional. (Ver, por exemplo, Er-el. Z. et a/.< Biochem. Biophys. Res. Comm. 49:383 (1972) ou Uíbrích, V. et a.( Coll. Czech. Chem.

Gornmum.9:1466 (1964)).

A escolha de urn gel particular pode ser determinada pelo versado na técnica. Em geral a força da interação da proteína e os aumentas do ligante com o comprimento de cadeia dos ligantes d® alquíla, porém os lígaa5 tes que têm d® cerca 4 a cerca do 8 átomos de carbono são apropriados para a maioria das separações. Um grupo fenila tern aproximadamente a mesma hidrofobicídad® como um grupo pentila, embora a seletividade possa ser diferente devido à possibilidade da interação orbitai pi-pi com grupos aromãticos na proteína. Seietivamente pode igualmente ser afetado pela quí10 rniea de suporta r resina.

A densidade do ligante é um parâmetro importante que influencia não somente a força, a especificidade e a interação mas a capacidade da coluna também. A densidade do ligante dos géis ootii fenila ou fenila comercialmente disponíveis està na ordem de 40 pmoles/mí de leito d® gel. A ca15 pacidade do gel è uma função da proteína particular na questão assim como o pH_: a temperatura e o tipo e a concentração de saí mas geralmente pode ser esperada cair na faixa de 3-20 mg/ml de gel.

Em geral uma diminmçâo na temperatura diminui a interação com o material da cromatografia. Entretanto, qualquer benefício que resulte .20 aumentando a temperatura deve- igualmente ser posado contra os efeitos adversos tal como um aumento pode ter na estabilidade da proteína.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão Ig podem ser isucraticament® etuídas. Na eluíção isocrática, todos os compostos começam a migração através da coluna no início. Entretanto, cada um migra ern uma 25 taxa diferente, tendo por resultado urna taxa de eluição mais râpída ou mais lenta.

Em outra modalidade, as proteínas da mvençâo podem ser umitadas à coluna e eluidas, por exemplo, usando a eleição por etapas ou a eluição de gradiente. Eluição, se por etapas ou na forma de urn gradiente, 30 pode ser reahzada em uma variedade de maneiras; (a) mudando a concentração de sal (b) mudando a polaridade do solvente ou (c) adicionando detergentes. Diminuindo a concentração de saí as proteínas absorvidas são atuídas a fim de aumentar a hidrofobicidade. As mudanças na polaridade podem ser afetadas por adições de solventes íal somo o eíileno ou propíleno gliaoi ou o (ísc)propanol, diminuindo desse modo a força das interações hi~ dmfébicas. Os detergentes podem funcionar como deslooadores de proteí5 nas e podem ser usados primeiramente em relação à purificação de proteínas: de membrana·:.

Em executar a separação, a mistura de poiipeptideo pode ser colocada em contato com o material de cromatograãa, por exemplo, usando uma técnica de purificação de batelada ou usando uma coluna. .Antes da 10 purificação pode ser desejável remover todos osquaisquer agentes oaotrópícos ou muitas substâncias hídrofòbicas, por exemplo, passando a mistura através de uma pré-coluna.

Por exemplo, para a purificação de batelada, o material de cromaíografia é preparado em ou equilibrado ao tampão de partida desejado.

Uma pasta fluida do material é obtida. A solução de poiipeptideo é colocada em contata cam a pasta fluida para absorver pelo menos um dos poíipeptideos a ser separado ao material de cromaiografm A solução que contém os polípeptídeos que não ligam aa material de crcmaíografia é separada da pasta fluida, por exemplo, permitindo que a pasta fluida estabeleça e remova o sobrenadante.. A pasta fluida pode ser sujeitada a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejada, a pasta fluida pode ser colocada em contato com uma solução da uma condutíbilidade mais baixa para deserção de polipeptideos que furam ligados ao material de HIC. A fim e eluir os polípeptídeos ligados, a concentração de sal pode ser diminuída.

Em uma modalidade, u material de cromatografla pode ser embalado em uma coluna.. Uma mistura que compreende os polipepíideos a ser separados pode ser aplicada à coluna permitindo que pelo menos um dos polípeptídeos seja separado para absorver è coluna. Os polipepíideos que não absorveram á coluna passam através e podem ser coletados. A fim de eluir cs polipepíideos ligados, a concentração de sal pode ser diminuída, por exemplo, em uma forma por etapas ou usando um gradiente de saí. incluindo um gradiente contínuo ou de etapa de sai. para conseguir a separação de material ligado através da dessorção diferencial /As combinações de cmmatogrsfia específicas que foram identificadas como sendo eficazes em separar formas inativas de uma proteína de fusão Ig e/ou de agregados de proteína são ainda descritas aqui.

ÈV. Expressão de Proteínas de Fusão Ig

Os métodos da invenção são usados para purificar as misturas de proteínas de fusão ig que são primeiramente feitas usando técnicas, por exemplo, todas as técnicas de cultura de célula, conhecidas na técnica.

Em resumo, um ácido nucíeico que codifica a proteína de fusão 10 ig é introduzido tipicamente ern um vetor de expressão para a introdução nas células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de polipeptideo que, por sua vez, fornece proteínas de fusão ig para a purificação de acordo com os métodos descritos aqui.

O termo vetor” ou vetor de expressão é usado aqui para as fi15 nalidades da especificação e reivindicações, para significar os vetores usados da acordo com a presente invenção como um veículo para introduzir em e expressar um gene desejado em uma célula. Corno conhecido por aqueles versados na técnica, tais vetores podem facilmente ser selecionados do grupo que consiste de píasmideos, fagos, vírus e retrovirus. Em gerai, os veto20 res compatíveis com invenção instantânea compreenderão um marcador de seleção, locais de limitação apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a habilidade de entrar e/ou replicar em células eucanúticas ou procarióticas.

Para as finalidades desta invenção, os numerosos sistemas de 25 vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza os elementos de DNA que são derivados de virus animais tais como o vírus papiloma bovino, o vírus de polioma. o adenovirus, o vírus de vacina, o bacuiovírus, o retrovirus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou o vírus SV4Ü. Outros envolvem o uso de sistemas policístrônicos com os locais de 30 ligação da ribossomos internes. Adicíonaimente, as células que integraram o DNA em seus cromossomas podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitem a ssteçâo de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode prover prototrofia a um hospedeiro auxotréfíco, resistência de biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência aos metais pesados tal como o cobre. O gene marcador selecíoaàvel pode ou diretamente ser ligado às sequências de ONA a serem expressas, ou ser introdu5 zido na mesma célula pela cotransformaçâo. Os elementos adicionais podem íguaímente ser necessários para a síntese ótima de mRNA. Estes elementos podem incluir sequências da sinal, sinais de união, assim como promotoras, intensiflcadores, e sinais de terminação transcripclonaís. Nas modalidades particularmenfe preferidas, os genes da região variáveis danados 10 são introduzidos em um veiar de expressão junto com cs genes de região constante de cadeias curtas e longas sintéticos (preferivelmente, ser humano) como discutidos acima. Preferivelmente, isto é efetuado usando um vetor de expressão de propriedade de IDEC. ínc., referido como NEOSPLA (Patente U.S. Número 6.159.730). Este vetor contém a promotar/intensificador 15 de citomegalovirus, promotor principal de globina beta de oamundongo, a origem SV40 da replicaçâo, a sequência de políadenlíação de hormônio de crescimento bovino, neomscin de fosfotransferasa exon 1 e exon 2, o gene do redutase da dibidrofolato e sequência lidar. Os sistemas de vetor são ensinados igualmente nas Patentes U.S. Números 5.736.137 e 5.655.570, ca20 da qual è aqui incorporada peía referencia em sua totalidade. Este sistema prevê níveis de expressão elevados, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sdemas de vetor exemplares são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 6.413.777.

Em outras modalidades preferidas, as proteínas de fusão Ig po2.5 dern ser expressadas usando os constructor policistrônicos. tais como aqueles descritos no pedido provisional dos Estados Unidos co-pendente Número 60/331.481 depositado em 16 de novembro de 2001 e incorporado aqui em sua totalidade. Nestes novos sistemas de expressão, os produtos do gene múltiplo de interesse tais corno as cadeias longas e curtas dos anticorpos 30 podem ser produzidos de um único constructo poíicislronico Estes sistemas usam vantajcsamente um locai interno da entrada do ribossomo (IRES) para fornecer relativamente altos níveis de polipeptideos da invenção em células hospedeiras eucariõticas. As sequências de? IRES compatíveis são descritas na Patente U.S. Número 6.193.980 que é igualmente aqui incorporada. Aqueles versados na técnica apreciarão que tais sistemas da expressão podem ser usados para produzir eficazmente a faixa completa dos pohpeptí5 deos descritos na aplicação instantânea.

Mais gerairneráe, uma vez o vetor ou a sequência de DNA que codifica uma proteína de fusão ig foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada, tato é. as células hospedeiras podem ser transformadas. A introdução do plasmídeo na célula 10 hospedeira pode ser realizada pelas várias técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não são limitados a_; iransfecçâo (incluindo a eíetrofcrese e eietroporaçâo), fusão do protoplasts, precipitação do fosfato de cálcio, fusão de célula com ÜNA envolvido, microínjeção, e infecção som vírus intacto. Ver, Ridgway, AA.G. Mammalian Expression 15 Vectors Chapter 24.2., PP. 470-472 Vectors, Rodriquez and Denhardt, Eds.

(Butterworths, Boston, Mass 1088). Mais preferivelmente, a introdução do plasmídeo no hospedesro é através da eietroporaçâo. As células transformadas são crescidas sob as condições apropriadas à produção das cadeias leves a pesadas, e ensaiadas para sínteses de proteína de cadeia curia e/ou 20 longa. As técnicas de ensaio exemplares incluem o ensaio da imunoabsorcão ligado à enzima (EIJSA). o radioimunoensaío (RíA), ou a análise do classifícador da célula ativada por fluorescência (FACS), ímunohístoquimica e similares.

Como usado aqui, o termo Transformação será usado em um 2.5 sentido amplo para se referir a qualquer introdução de DMA em uma célula hospedeira recipiente que mude o genófipo e conduza consequentemente em uma mudança na célula recipiente.

Ao longo daquelas mesmas linhagens, as células hospedeiras referem-se às células que foram transformadas com os vetores construídos 30 usando técnicas da DMA racombinante e codificando pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições dos processos para a isolação dos anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos oélula e cultura de célula são u sados permutavelmente para denotar a fonte de anticorpo a menos que especificada olaramante de outra maneira. Em outras palavras, a recuperação do poiípeptídeo de ’'células*' pode significar ou células inteiras centrifugadas, ou da cultura de célula contendo ambas as células suspensas e medianas.

A linhagem de célula hospedeira usada para a expressão da proteína é mais preferivelmente do origem mamífera; aqueles versados na técnica são reconhecidos com a habilidade de determinar preferencialmente as linhagens de célula hospedeira particular que são melhor adequadas para que o produto do gene desejado seja expressado no mesmo. As linhagens 10 do células hospedeiras exemplares incluem, mas não são limitadas a, DG44 e DUXB11 (linhagens de ovário de hamster chinês, DHER minus), HEt.A (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim do macaco), COS (um derivado de CVI com o antígeno de SV40 T), R.161Q (fibroblasto de hamster chinês) 8AÍ..BC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim do 15 hamster), SP2/O (mieioma de camundongo), P3.times.83-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJt (linfócifo humano) e 793 (rim humano». As células de CHO sao particularmente preferidas. As linhagens de células hospedeiras são tipicamente disponíveis dos servrços comerciais, a Coleção de Cultura de Tecido Americana ou da iítera2(1 tura publicada.

Produção tn wPo permite escala para proporcionar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados, As técnicas para o cultivo da célula de mamífero sob condições da cultura do tecido são conhecidas na técnica e incluem a cultura da suspensão homogênea, por exemple em um reator 25 de agitação pneumática ou em um reator agitador contínuo, ou na cultura de célula imobilizada ou eclusa, por exemplo em fibras ocas, mícrocápsulas, em microgotas de agarose ou em cartuchos cerâmicos.

Os genes que codificam o polipeptideo da invenção podem Igualmente ser células não mamífero expressadas tais como as bactérias ou 30 as leveduras ou as células da planta. Nesta consideração apreciar-se-á que os vários microorganismos náo-mamlferos unicelulares tais como as bactérias podem ígualmente ser transformados; isto é aqueles capazes de crescer nas culturas ou na fermentação. As bactérias, que são suscetíveis à transformação, incluem membros dos enterobactanaceae.. tais como cepas de Escherichia Cell ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, e Haemophilus influenzae. Ainda será apre5 ciado que, quando expressados nas bactérias, os polípeptídeos tipicamente tornam-se parte de corpos de inclusão Os polípeptídeos devem ser isolados, purificados e então montados em moléculas funcionais.

Além de procariotos, os micróbios eucariôticos podem igualmente ser usados. Sacoharomyoes Cerevisiae, ou levedura baker comum, é o 10 mais comumente usado entre microorganismos eucariôticos embora um número de outras cepas seja geraimente disponível. Para a expressão em Sacoharomycas, o plasmídeo YRp7, por exemple, (Stinchoomb st a/., Nature, 282.39 (19792 Kingsman ef a/., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et aí, Gene, 10:157 (i960)) è comumente usado. Este plasmldeo já contêm o ge15 ne TRP1 que fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante da levedura que falia a habilidade de crescer em úiptofano, por exemplo ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)), A presença da lesão trpl como urna característica do genoma de célula hospedeira de levedura fornece então urn ambiente eficaz para detectar a transformação pe-ío ares20 cimente na ausência de friptofana.

Em uma modalidade, as proteínas da fusão ig da invenção são expressadas usando a cultura da célula de mamífero em uma baixa temperatura de cultivo, isto é, menos do qua 37X convencional ou entre 28X e 32X, Q cultivo baixo de proteínas de fusão Ig, partícularmente proteínas de 25 fusão do raceptor-lg de TNF, diminuem a porcentagem total da proteina de fusão inativa..

Os métodos de cultivar as proteínas de fusão Ig em uma baixa temperatura são descritos em U.S. 28020039580 (Browning et aí), incorporados pela referência em sua totalidade aqui.

Em uma modalidade, o material da partida para a purificação usanso os métodos da invenção è um subrenadante das células de CHO que expressam a proteína de fusão Ig reoombínante. Em uma modalidade,

4Z as células de CHO são cultivadas em uma temperature de oeroa de 28X a 32^<;G. Em uma modalidade, o material de partida para a purificação compreende cerna de 20-40% de material agregado. Em uma modalidade, u material de partida para a purificação compreende cerca de 30% du material agregado. Ern uma alternativa, o material de partida compreende cerca de 50% ou mais de 50% du material agregado.

Antes de purificar usando os métodos da matéria, a composição que compreende a mistura de polipeptideos a ser separada será colocada preferivelmente em um tampão de pH aproximadamente acídico ou neutro. Isto pode ser feito, por exemplo, adicionando o tampão concentrado, ressuspendendo a amostra nu tampão, trocando o tampão (por exemplo, usando a diáhse ou a ultrafiltraçâo), Aifernativamente, o pH do tampão da amestra pode simplesmente ser ajustado para estar dentro da faixa desejada.

V. Proteínas de Fusão da imunpglobulina

Qs métodos descritos aqui são ateis para as proteínas de fusão íg que podem ser mais prováveis de ter a dabradura imprópria, por exemplo, devido às pontes de dissulfeto múltiplas. Tais proteínas podem ser mais prováveis de ter a dobradura incompleta uu aberrante. tendo por resultado formas diferentes das proteínas inativas que se assemelham próxima à proteína ativa no tamanha e nas características, mas são, todavia, inativas e não desejáveis para o uso terapêutico.

Em um aspecto, os métodos da invenção podem ser usadas para purificar as proteínas de fusão que tem a dobradura complexa, tal como as proteínas que têm um número elevado de resíduas de cisterna que formam as ligações de dissulteto.

Em uma modalidade uma proteína de fusão Ig combina es domínios de ligação do íigante ou receptor (por exempla, o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com pelo menos um domínio de cadeia longa e um peptídeo de conexão em uma mudalidade, ao preparar as proteínas de fusão da presente invenção, u áoido nucleico que codifica o domínio de ligação do lígante ou domínio do receptor sera C-terminaímente fundido ao ácido nucleico que codifica o N-térmlno de uma sequência de domínio aonstan te de imunoglobulina. As fusões do N terminal são igualmente possíveis Em uma modalidade, uma proteína de fusão inclui os domínios CH2 e CH3. As fusões podem igualmente ser feitas ao Ü-término da porção Fc de um domínio constante, ou imediatamente de N-terminal ao CHI da cadeia longa ou a região correspondente da cadeia curta.

Em uma modalidade, a sequência do domínio de ligação do receptor ou ligante é fundida ao N-téonino do domínio de Fc de uma molécula de imunoglobulina. é Igualmente possível fundir a região constante de cadeia inteira pesada ã sequência do domínio de ligação do receptor ou do ligante. Em uma modalidade, uma sequência inicia na região de dobradiça apenas a montante do local de chvagem de papaína que defina IgG Fc quirnicamente (isto é, resíduo 2.16, tomando o primeiro resíduo da região constante de cadeia longe pars ser 114), ou os locais análogos de outras imunoglobulínas são usados na fusão. O local preciso em que a fusão é feita não ã crítico, os locais particulares são bem conhecidos e podem ser selecionados a fim de otimizar a atividade bsoiógica, secreção, ou as características de ligação da molécula. Os métodos para fazer proteínas de fusão são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a proteína que contém o domínio de ligação é ligada ao domínio de Fc através de um ligante de aminoãcido que seja, por exemplo, 1 a 5 aminoácidos no comprimento. Em uma modalidade, o receptor de TNF e o domínio de Fc são ligados através de um único amíaoácido.

Em uma modalidade preferida, os métodos de purificação descritos aqui, podem ser asados para separar proteínas de fusão Ig do receptor de TNF. A invenção reivindicada em outras modalidades refere-se ãs fusões de receptor-lg da família de TNF obtidas pelos métodos discutidos aqui, assim como às preparações farmacêuticas que compreendem as mesmas, Um exemplo de um receptor de TNF é LTpR. Outros exemplos incluem: HVEM.

Em um aspecto, os métodos da invenção alcançam composições purificadas de proteína de fusão de LTpR-lg.

Em uma modalidade, a proteína de fusão de Ι..ΤβΗ-lg compreende o domínio extraceluiar de LTpR humano (forma que falta o domínio da transmembrana) e a região de Fa de imunoglcíbulina (domínio de igGI Fc). SEQ ID NO: 1 descreva a sequência de comprimento total de ΙΐβΝ humano, incluindo o domínio extraceluíar. Um diagrama esquemátlco da fusão LT-βR-lg é fornecido na figura 10.

Outras proteínas de fusão são igualmente incluídas na invenção.

As proteínas de fusão exemplares relatadas na literatura incluem fusões do receptor de célula T (Gascoigne et a/.. Proc Natl. Acad. Sol. USA 84.29362940 (1987)): CD4 (Capon ei at, Nature 337.525-531 (1989): Traunecker et a/., Nature 339:68-70 (1989): Zettrneissl at a/., DNA Cell Biol . USA 9:34710 353 (1990); e Bym et a/., Nature 344:687--670 (1990)): L-selectin (receptor de direção) (Watson eta/., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); e Watson etM, 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo eta/., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 e B7 (Linsley of a/.. J. Exp. Med. 173:7.21-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley at a/., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic. ef e/._: Cell 66:113315 1144 (1991)); Receptor de TNF (Ashkenazi at a/„ Pros. Natl. Asad. Sci. USA

88:10535-10539 (1991); Lessiauer et a/., Eur. 3. Immunol. 27:2883-2886 (1991); e Peppel ef at. J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); e receptor de IgE (Ridgway and Gorman, J. Ceil Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)).

Os ligantes exemplares adicionais e seus receptores que podem ser incluídos nas proteínas de fusão da matéria incluem o seguinte;

C.it9çinas.ê..Rq.ç^ptor^sdeCltpcinas

Citocinas têm efeitos pleiotrôpicos na proliferação, na diferenciação, e na ativação funcional dos linfòcitos. As várias citocinas, ou as porções de ligação do receptor dos mesmos, podem ser utilizadas nas proteínas de 25 fusão da invenção. As citocinas exemplares incluem as interleucinas (por exemplo, IL·· 1. IL-2, IL-3, 11.-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, 11-13, e II-18), os fatores de estimulação da colônia (CSFs) (por exemplo, granuióclto CSF (G-CSF), granuiõcito-macrófago QSF (GM-C-SF), e macrófago CSF de monõcíto (M-CSF)), fator de necrose de tumor (TNF) alfa e beta, e interfe30 rons tal como o interfercn-o. β_: nu y (Patentes U.S. Números 4.925.793 e 4.929.554). Os receptores de citccína consistem tipicamente de uma cadeia alfa de íigante especifica e uma cadeia beta comum. Os receptores de atocine exemplares Incluem aqueles para GM-CSF, IL-3 (Patente U.S. Numera 5.639,605), IL-4 (Patente U.S. Numera 5.599,905), IL-5 (Patente U.S, Número 5.453.491), ΙΡΝγ (EP0240975), e a família de TNF dos receptores (por exemplo, TNFa (por exemplo, TNFR-1 (EP 417, 563), TNFR-2 (EP 417.014) 5 receptor beta de linfotoxína).

Proteínas de Adesão

As moléculas da adesão são proteínas ligadas à membrana que permitem que as células interajam umas com as outras. Varias proteínas da adesão, incluindo receptores de retorno de íeucócitos e moléculas de ade0 são celular das suas porções de ligação do receptor podem ser incorporadas em uma proteína de fusão da mvenção. Os receptores de retorno de leucocitos são expressos na superfície das células de leucócítos durante a inflamação e incluem integrinas β-1 (por exemplo, VLA-1,2. 3, 4, 5 a 6) que medeiam a ligação a componentes da matriz extracelular. e as integrinas β2 (por 5 exemplo, LFA-1, Ι..ΡΑΜ-1, CR3 e CR4). que se ligam as moléculas de adesão celular (CAMs) no endotélio vascular. Exemplos de MACs incluem lCAM-1, ICAM-2, VCAM-1, e MAdCAM-1. As CAMs incluem as da família selectína incluindo E-selectina. l.-selectina e P-seíectína,

Quimigcinas

Quimíocinas, proteínas quimlotéíicas que estimulam a migração dos teucõcitos para urn sitio de infecção, também podem ser incorporadas em uma proteína de fusão da invenção. Exemplos de químiocinas incluem proteínas ínflamatôrias de macrófagos (ΜΙΡ·1··α e MlP-1-β), fator quimictático de neutrófilos e RA.NTES (regulado na ativação da células T normalmente 5 expressas e secretadas).

Fatpres.de Crescimento e Receptores de Fator de Crescimento

Os fatores de crescimento ou seus receptores (ou ligação ao receptor ou suas porções de ligação ao ligante) podem ser incorporados nas proteínas de fusão da invenção. Exemplos de fatores de crescimento inclu0 em Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF) e suas isoformas (Patente U.S. Número 5.194.596); Fatores de crescimento fíbroblástlco (FGF), incluindo aFGF e bFGF, fator natríurético atrial (ANF), fatores de crescimento hepáfico (HGFs; Patentes U.S. Números 5.227.158 e 6 059.841). fatores neurotróficos, tais como o fator neuratrófiao dehvado do cérebro (BDNF), neurotrofina 3. 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou N‘f-8), ou um fator de crescimento neural, tais somo fator de crescimento derivado de 5 plaquetas de NGF-S (PDGF) (Patentes U.S. Números 4.880.919, 4 845.075.

5.910.574 e 5.877.016), o fator transformador de crescimento (TGF), como o TGF-alfa e TGF-beta (WO 90/14359), fatores osteoindutores, incluindo proteína morfogenética óssea (BMP), fatores de crescimento semelhantes à insulina I e -II (IGF-I e IGF4I; Patentes U.S. Números 6.403.764 e 10 6.506.874); Eritropoietina (EPO), fator de células-tronco (SCF), trombopoietina (lígante c-Mpf) a os polipeptídecs Wnf (Patente U.S. 6 159.462). Exemplos de receptores do fator de crescimento que podem ser usados como domínios de receptores alvo da invenção incluem receptores EGF. receptores VEGF (ex. Flt1 ou FíkVKDR), receptores PDGF (WO 90/14425), reeeplo15 res de HGF (Patentes U.S. Números 5.648.273 e 5.686.292) e receptores neurotróficos incluindo o receptor de baixa afinidade (L.NGFR), também denominado como ρ?5^ΝΪ ou p75. que liga NGF, BDNF e NT-3, e os receptores de alta afinidade que são membros da família trk do receptor tirosina quinases (por exemplo, trkA, trkB (EP 455 460), trkC (EP 522.530)).

Hormônios

Exemplos de hormônios de crescimento para uso nas proteínas de fusão da invenção incluem renina, hormônio de crescimento humano (HGH; Patente U.S. Número 5.834.598), hormônio de crescimento humano N~ mefíonila; hormônio da crescimento bovino; fator de liberação do hormônio 25 de crescimento, hormônio da paratireoide (PTH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), tiroxina, proinsullna a insulina (Patentes U.S. Números 5.157.021 e 6.576.608), hormônio folioulo estimulante (FSH), calcítonina, hormônio luteinizante (I..H), leptina. glucagon, bombesina, somatropina, substância inibidora mulíenana, relaxma e prorelaxína, peptídeo associado a 30 gonadofrofina, prolaoiina. lactogênio placentário. proteína OB, ou substância inibidora muilenana.

Fatores, de Cqagulaçâo

Exemplas de fate-res de coagulação do sangue para use nas proteínas de fusão da invenção induem -os fatores de coagulação (por exemplo, fatores V, VH, VIII, X, IX. XI, Xtí e Xiíl, fator de von Willebrand), fator de tecido (Patentes U.S. Números 5.346.991, 5.349.991, 5.726.147 e 6.596.84), trombina e pretrombina, fibnna e ãbrínogênio, plasmins e plasme nogénío, atívadures d® plasmiaogênio, como a uroquinase ou urina humana ou ativador do plasminogênio tecidual (t~PA).

Outros exemples de proteínas de fusa® são ensinados, por exemplo, em W00089913A1 e W0004Q615A2.. Outro exemplo de molécula que pode ser incluído em uma proteína de fusão da invenção é IGSF9.

.As proteínas de fusão podem ser preparadas através de métodos que são bem conhecidas na técnica (ver, por exemple, Patentes U.S. Números 5.116.964 e 5.225,538). Normalmente, o íigante ou parceiro de ligação do lígante é fundido com terminai C ao terminal N da região constante da cadeia longa (ou parte da cadeia longa) e nu lugar da região variável. Todas as regiões da transmembrane ou üpideos ou sequências de reconhecimento de âncora de fosfolipideos do receptor de ligação do lígante são preferendalmente ínativadas ou eliminadas antes da fusão. O DNA que codifica o íigante ou parceiro d® ligação do lígante è cíivado por uma enzima de restrição em ou próximo às terminações 5 e 3 do DNA que codifica o segmento ORF desejado. D fragmento de DNA resultant® è então facilmente inserido no DNA que codifica uma região constante da cadeia longa. O sítio exato em que a fusão é feita empiricamont® pode ser selecionado para otimizar a secreção ou características de ligação da proteína de fusão solúvel. O DNA que codifica a proteína de fusão è então transferido para uma célula hospedeira para expressão.

VI Composições Farmacêuticas

Os métodos e composições da invenção são partícuiarmente bern adaptados para a purificação de proteínas de fusão Ig para uso em urna formulação farmacêutica, como agregados inativos e/ou agregados de proteína podem ter efeitos deletérios quando administrados a um paciente em uma terapia. Por exemplo, formas inativas da proteína de fusão e os agre43 gados da proteína podem resultar na parda de eficácia da proteína de fusão Ig oo imunogenicidade aumentada.

Assim, a invenção fornece composições de proteínas biológicas purificadas que são adequadas para uso terapêutico Os métodos de preparação e administração de proteínas obtidas através dos métodos da invenção a um indivíduo são bem conhecidos ou facilmente determinados por aqueles versados na técnica.

Em uma modalidade, a invenção pertence a composições farmacêuticas que compreendem proteínas de fusão LT-β R-lg purificadas. A Ι..Τ-β-R-lg solúvel pode ser formulada como uma composição farmacêutica, por exemplo, para a administração a urn indivíduo para tratar uma desordem auto-imune, por exemplo, uma doença desmíeíinizante, tais como a Esclerose Múltipla. Normaírnente, uma composição farmacêutica inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, ’’veículo farmaceutiçamente aceitável” inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antlfàngicos, isotômocs e agentes de atraso na absorção e semelhantes que são fisíologicarnente compatíveis. A composição poda incluir um sai farmaceutiçamente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base (ver, por exemplo, Berge ei al, J. Pharm. Sei. 66:1-19. 1977).

A LT~j3-R-lg solúvel pode ser formulada de acordo com métodos padronizados. A formulação farmacêutica é uma técnica bem estabelecida, e é ainda descrita, por exemplo, em Gennaro (ed), Remington', l he Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams 6amp: Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel ef af, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed.. Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683365727): and Kibbe (ed.). Handbook of Pharmaoeutical Excipients American Pharmaceutical Association. 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

Em uma modalidade, uma ΙΤ-β-R-lg solúvel pode ser formulada com materiais exerprentes, tais como cloreto de sódio, hepta-hidrato de fosfato de sódio dibàsico, fosfato de sódio monohàsico e estabilízante. Pode ser fornecido, por exemplo, em uma solução tamponada com uma concentração adequada e pode ser armazenado de 2 a 8' C.

As composições farmacêuticas podem ser de diversas formas.

Estas incluem, por exemplo, liquido, as formas farmacêuticas semi-sõlidas e sólidas, tais como soluções liquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositckios. A forma preferida pode depender do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica, Norrnaímente, as composições para os agentes descritos a seguir estão na forma de soluções injetáveis ou infusí10 ve;s

Tais composições podem ser' administradas por um modo paren teral (por exemplo, injeção por via endcvenosa, subcutãnea, intraperitoneal ou intramuscular). As frases ’'administração parenteral e administrado por via parenteral, usado aqui significa modos de administração diferentes da 15 administração tópica e por via entérica, geralmente por injeção, e Incluem, entre outros, por injeção via íntravenosa, intramuscular, intra-arterial iniratecal, íntracapsular. infraorbital intracardiac®, infradérrníca, intraperitoneal, transfraqueal, por via subcutãnea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoíde. intraspinai, epidural, intracerebral, intracraniana, intracarótída 20 e intrasternal e infusão.

A composição pode ser formulada como uma solução, micro®mulsão, dispersão, lípossomas ou outras estruturas adequadas para o armazenamento estável ern alta concentração.

As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas pela in25 corporação de um agente aqui descrito na quantidade necessária em um solvente adequado, com um ou uma combinação de ingredientes citados acima, se necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação de um agente aqui descrito em um veículo estéril que contêm um meio de dispersão de base e outros ingre30 dientes necessários diferentes daqueles enumerados acima. No caso de pôs estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e íiofilízação que produz um pó de um agente descrito aqui mais qualquer ingrediente adicionai desejado de uma solução estéril previámente filtrada. A fiuidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tais come a lecitina. pelas manutenção do tamanho de partícula necessária no caso 5 de dispersão e paio use de surfacterfi.es. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, saís de mcnoestearato e gelatina.

Em alguamas modalidades, a ΕΤ-β-R-lg solúvel pode ser prepa10 rada com um veículo que protegerá o composto contra a hberação rápida, tais como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Os biodegradáveis, polímeros blocompatíveis podem ser utilizados, tais corno acetato de etiíeno vinil, poíiantdridos, ácido polighcòíico., coíàgeno, poiiortoésters e ãcido polilático.

Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou de conhecimento gerai. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc,. New York, 1978.

A solúvel ΙΤ-β-Rdg pede ser modificada, por exemplo, com uma fração que melhora a sua estabilização e/ou manutenção em circulação, por exemplo, no sangue, soro ou outros tecidos, por exemplo, pelo menos, 1,5, 2, 5, 10 ou 50 vezes. O agente de modificação pode ser avaliado para determinar se pode chegar a sítios de inflamação (por exemplo, lesões ou esclerose), tal como pode ocorrer em uma doença desmieiinizante, soma Es25 clerose Múltipla (por exemplo, através de uma forma marcada do agente).

For exemplo, a LT-p-R-lg pode ser associada a um polímero, por exemplo, um polímero substancialmente nãu-antigèníco, tal como um óxido de polialquileno ou um óxido de polietilenc. Os polímeros adequados variarão substancialmente em relação ac peso. Os polímeros com pesos motecu30 lares médios variando de 200 a cerca de 35.000 Daltons (ou cerca de 1 ODD a cerca de 15.000 e de 2.000 a cerca de 12.500) podem ser usados.

Por exemplo, uma ΙΤ-β-R-lg solúvel pode ser conjugada com um polímero solúvel em àgua. por exemplo, um polímero hidrofiítco de polivinda, por exemplo, poliviniiatoool ou políviníipirroíidona. Uma lista nãolimitante dos polímeros incluem homopoílmeros de oxido de polialquileno, tais como o podetilenoglicol (PEG) ou polipropilenoglicóís, polióís polioxietile5 nado, seus copolímeros e seus copolímeros em bloco, desde que a volubilidade em água dos copolimeros em bloco é mantida. Qs polímeros úteis adicionais incluem polioxialquilenos como políoxietiíeno, polioxípropileno, poiioxípropileno e copolímeros em bloco de políoxíetileno e polioxípropileno (Pluronics); polimetaorilatos; carbômeros e polissacarídeos ramificados ou não10 ramificados.

Quando a ΙΤ-β-R-lg solúvel é usada em combinação com um segundo agente, os dois agentes podem ser formulados separadamente ou em conjunto. Por exemplo, as respectivas composições farmacêuticas podem ser misturadas, por exemplo, imediatamente antes da administração e 15 administrados em conjunto ou podem ser administrados separadamente, por exemplo, nos mesmos horários ou horários diferentes.

A ΙΤ-β-R-lg solúvel pode ser administrada a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, por uma variedade de métodos. Para mudas aphnaçôes, a via de administração é uma das seguintes? injeção ou infusão 20 intravenosa (IV), injeção subcutânea (SC), por via intraperitoneal (IP), ou injeção intramuscular. Em alguns casos, a administração pode ser diretamente no sistema nervoso central, por exemplo, intratecal. intracerebroventrícular (ICV), intracerebral ou intracraniana. O agente pode ser administrado como uma dose fixa ou em uma dose mgfkg.

A dose pode tombem ser escolhida para reduzir ou evitar a produção de anticorpos contra o agente.

A rota efou o modo de administração da LT-p-R-Ig solúvel também pode ser adaptada para cada caso individual, por exemplo, por determinar a localização, número ou tamanho da esclerose em um indivíduo, por 30 exemplo, usando a ressonância magnética (RM), Tomografia por emissão de Positròes (PET), Imagem pesada em difusão (DW4 ou DW-MRI), Imagem do tensor de Difusão, mielografia, transferência de magnetização. A gravidade ou a extensão de uma desordem desmíelinizante também pode ser determinada a partir da punção lomba? (por exemplo, para verificar se hâ elevação glóbulos brancos no líquido cérebro-espinhal), teste de potencial evocado como uma medida da função do nervo e/ou quaisquer outros parâmetros 5 padrões associados com uma doença desmíelinizante (por exemplo, esclerose múltipla), por exemplo, qualquer um dos critérios de avaliação aqui descritos.

Os regimes des dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada, por exemplo, uma resposta terapêutica ou um efeito tera10 peutieo combinatoric, A dosagem causará, por exemplo, um aumento na remielinização. Geralmente, uma dose de LT-fs-R-Ig solúvel opcionalmente formulada separadamente ou em conjunto com uma dose apropriada de um segundo agente terapêutico pode se? usada para fornecer a um indivíduo o LT-p-R-lg solúvel

As dosagens adequadas e/ou intervalos de dosagem de ΕΤ-β-RIg solúvel inclui uma quantidade suficiente para provocar a remieíinização aumentada em um indivíduo As dosagens adequadas podem ser qualquer uma dessas aqui descritos e incluem, por exemplo, uma dosagem de pelo menos cerca de 0,001 mg de uma LT-p-R-lg solúvel por peso corporal kg de 20 um indivíduo (par exemplo, um paciente humano).

A dose de Ι,,Τ-β-R-lg solúvel necessária para aumentar a remielinlzação pode depender de uma série de fatores, incluindo, por exemplo, a idade, sexo e peso de um indivíduo a ser tratado. Outros fatores que afetam a dose administrada ao indivíduo, incluem, por exemplo, o tipo ou a gravida25 de da doença desmielínízante. Por exemplo, um paciente com esderose múltipla aguda fulminante pode necessitar de uma administração de uma dosagem diferente de um LT-p-R-lg solúvel de um paciente com uma forma mais branda de Esclerose Múltipla. Outros fatures podem incluir, por exemple, outras doenças que afetam simultaneamente ou anteriormente que afeta 30 o paciente, a saúde geral do paciente, a predisposição genética do paciente, dista, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fãrmacos. e quaisquer outras terapêuticas adicionais que são administradas ao pacíen te. Deve ser entendido que uma dosagem especifica e regime de tratamento para cada paciente em particular dependerá do julgamento do médico. A quantidade de ingredientes ativos também vai depender do composto descrito, bem cerna a presença ou ausência e a natureza do agente anti-viral adicional na composição.

Forma de dosagem unitária ou dose fixa”, conforme usado aqui refere-se fisicamente ás unidades discretas adequadas como doses unitárias para os indivíduos a serem tratados, cada unidade contém uma quantidade predeterminada de compostos ativos calculados para produzir o efeito terapêutico desejado (por exemplo, um vinco na remielíriízaçao em um indivíduo), em associação com um veiculo farmacêutico necessário e, opcionalmente, em associação com outro agente.

Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma LT-p-R-lg solúvel aqui descrita. Tais quantidades eficazes podem ser determinadas corn base no efert-o do agente administrado ou o efeito cornbínatôrio de um agente e um agente secundário, •se mais de um agente for usado. A quantidade terapeutlcamente eficaz de um agente também pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade,, sexo e peso do indivíduo, bem como a capacidade do composto para obter uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, melhora de pelo menos um parâmetro de desordem, por exemplo, melhora de pela menos um sintoma de uma desordem autoimune. por exemplo, uma doença desmíelinizante, por exemplo, a Esderose Múltipla. Por exemplo, uma quantidade terapeutícamente eficaz de LT-p-R-lg solúvel aumentará a remielinação e também pode retardar e/ou melhorar a desmidinização. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da composição é compensado pelos efeitos terapêuticos benéficos.:

Dispositivos e Composições farmacêuticas em Kits que incluem um LT-p-R-lg solúvel podem ser administrado scom um dispositivo médico. O dispositivo pode ser projetado com características tais como a portabilidade, armazenagem à temperatura ambiente e facilidade de uso para que ele possa ser usado em situações de emergência, por exemplo, por um indivíduo inexperiente ou pelas equipes de emergência no campo, removido para instalações médicas e outros equipamentos médicos, O dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais revestimentos para armazenar preparações farmacêuticas que incluem uma LT-3-R-lg solúvel e pode ser configurado para entregar uma ou mais doses unitárias do agente.

Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada com um dispositivo de liberação franscutânea. como uma seringa, incluindo uma sersnga hipodérmica ou multicámara, Outros dssposãívos de liberação 10 adequados Incluem stents, cateteres, patches transcrdânens, microagulhas e dispositivas implantavais de liberação controlada. O dispositive (por exemplo, uma seringa) pode incluir um LT-p-R-íg solúvel na forma seca ou liquida a uma dose suficiente para causar remíelinização O dispositivo também pode ser um dispositivo de câmara dupla, onde uma câmara contém uma do15 sagem unitária de LT-^-R-lg solúvel íiofiíizado suficiente para provocar a remíelinaçào aumentada em um indivíduo e uma segunda câmara contendo um líqmda (por exemplo, liquídos) para reconstituir a dosagem unitária liohlizada de um ΙΤ-β-R-lg solúvel.

Em outros exemplos, a composição farmacêutica pode ser ad20 ministrada corn um dispositivo de injeção sem agulha hipodérmica, tais coma os dispositivos descritos nas Patentes U.S. Números 5,399.163, 5.363,851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790,824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes conhecidos e os módulos são descritos, por exemplo, U.S. 4.487.603, que revela uma bumba de micromfusão implanlável para libera25 ção de medicamentos em uma taxa controlada; U.S, 4.486,194, que revela um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; U.S. 4.447.283, que revela uma bomba de infusão de medicamentes para a liberação de medicamentos a uma taxa de infusão precisa; U.S. 4.447.224, que revela um aparelho de infusão ímpiantável de fluxo variável 30 para liberação contínua da fármaco. U.S, 4.439.196. que revela um sistema de liberação osmótica de fármaco corn compartimentos rnulti-cámara e U.S, 4.475.196, que revela um sistema de liberação osmótica de fármaco. Muitos outros, disposálvoa, implantes, sistemas de liberação e os módulos são também conhecidos.

Um 1. Τ-β-R-lg solúvel pode ser fornecido em um kit. Em uma modalidade, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição que 5 inclui uma ou mais doses unitárias de ΙΤ-β-R-lg solúvel e. opcionalmente, (b) material informativo

As doses unitárias do LT-p-R-lg solúvel são suficientes para provocar um resultado desejado em um indivíduo, por exempla, retardou a progressão de uma doença ou a melhora em um indivíduo. O material informats10 vo pode ser descritivo, ínstrucíonal, marketing ou qualquer outro material que se relaciona com os métodos descritos neste documento efou a utilização de agentes de benefício terapêutico, ü kit também pude incluir as reagentes e as instruções úteis no teste (ensaio) para rernielinização. Tais métodos de ensaio para remielinação incluem, entre outros, qualquer um dos métodos 15 de ensaio descritos aqui. Em uma modalidade, u kit inclui um ou mais agentes adicionais para tratar uma doença desmlelínizante, tal como um ou mais agentes para o tratamento de esclerose múltipla. Por exemplo, o kit inclui um primeiro recipiente que contém uma composição que inclui as solúveis LT-βR-lg solúvel e um segunda recipiente que inclui um ou mais agentes adido20 nais.

Q material informativo dos kits não está limitado na sua forma.

Em uma modalidade, o material informativo pode incluir informações sobre a produção do composta, peso molecular da substância, concentração, data de validade, lote ou informação de sitio de produção a outros. Em uma mo25 dalidade, o material informativo refere-se aos métodos de administração do LT-pR -lg solúvel, em uma dose adequada, forma farmacêutica ou moda de administração (por exemplo, uma dosagem, forma de dosagem ou modo de administração aqui descritos), para tratar um indivíduo que tem uma duença desmielinízante, au que esteja em risco de desenvolvimento, ou para expe30 rimentar um episódio associado a uma desordem desmielinizante. As informações podem ser fornecidas em uma variedade de formatos, incluindo texto impresso, material legível por computador, gravação de video ou grava ção de áudio, ou uma informação que fornece um link ou endereço para o material substantivo

Alèm do agente, a composição do kit pode Incluir outros ingredientes, tais como solvente ou tampão, urn estabilizador ou um conservante. O 5 agente pode ser fornecido por qualquer forma, por exemplo, forma líquida, seca ou liofilizada, de preferência substancíaímente pura toou estéril. Quando os agentes são fornecidos em uma solução líquida, a solução liquida, de preferência, é uma solução aquosa. Quando os agentes são fornecidos como uma forma seca, a reconstituição é geralmente pela adição de um suite vente. O solvente, por exemplo, água esterilizada ou tampão, pode opcionalmente ser fornecido no kit.

O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição ou composições contendo os agentes. Em algumas modalidades, o kit contêm recipientes separados, divrsares ou compartimentos para a composição e 15 material informativo. Por exemplo, a composição pode estar contida em uma garrafa, frasco ou seringa, e o material informativo pode estar contido em uma luva plástica ou ern pacotes. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um recjpsente único, indivisível. Por exemplo, a composição está contida em uma garrafa, frasca ou seringa que 20 acompanha o respectivo material informativo na forma de um rótulo. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo,, um pacote) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de dosagem unitária (por exemplo, uma forma de dosagem aqui descrita) dos agentes. Os recipientes podem incluir uma dosagem unitária de combinação, por 25 exemplo, uma unidade que incluí tanto LT-ü-R-lg solúvel a o segunda agente, por exemplo, em uma proporção desejada. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, pacotes de papel aluminio, embalagens, ou dispositivos médicos, por exemplo, nada um contendo uma única dosagem unitária de combinação. Os recipientes dos kits podem ser herméticos, 30 à prova d'agua (por exemplo, impermeável a mudanças de umidade e evaporação) e/ou à prova de luz.

O kit inclui cpcionalmente um dispositivo adequado para a admi mstração da composição, por exemplo, uma seringa ou outro dispositivo de liberação adequado O dispositivo pode ser fornecido pré-carregado com um ou ambos os agentes ou pode estar vazio, mas adequado para o carregamento.

VIU . Métodos de T ratamento

Formulações feitas usando proteínas de fusão de LT-B-R-lg ativas purificadas de acordo com os métodos descritos aqui podem ser usadas pura tratar uma série de doenças que são tratãvais com um agente bloqueador de LT-B-R.. Exemplos dessas doenças incluam doenças autoimunes, 10 como artrite reumatolde, doenças intestinais, como a doença de Crohn e doenças neurológicas, como esclerose múltipla. Outros exemplas de doenças que podem ser tratados com composições aqui descritas são detalhados em U.S. 20.020.197.254 e U.S. 7.255.854, cada um dos quais está incorporado em sua totalidade aqui.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica que compreende as proteínas de fusão LT-p-R-lg da invenção é usada para tratar uma doença desmiehnizsnte. Como usado aqui, uma ’’doença desmieíinizante é uma doença associada com a destruição ou remoção da mielina, a bainha gorda que circunda e isola as fibras nervosas dos nervos. Doenças desmie20 hnizanles incluem, per exempla, Esclerose Múltipla (por exemplo, Esclerose Múltipla Remetente/Reourrente, Eisclerose Múltipla Progressiva Secundária, Esclerose Múltipla Progressiva Recorrente, Esclerose Múltípb Progressiva Primária e Esclerose Múltipla Fulminante Aguda), MielinôHse Pentina Cen tral, Encefalomielite Disseminada Aguda, Leucoencefalopatía Multifocal Pro25 gressiva, Panencefalite Esclerosante Subaguda; Encefalomielite Pósinfecciosa, Puiiriauropaüa Desmieiimzanto Inflamatória Crônica, Síndrome de Guillain-Barre, Leucoencefatopatia Multifocal Progressiva, Doença de Devic, Esclerose Concêntrica de Balo e fencedistrofia (por exemplo, Leucodistrufla Metacromàtica, doença de Krabbe, adrenoleucodistrofia, doença de Peiiza30 eus-Merzbacher, doença de Canavan, Ataxia Infantil com hipomielinização central, doença de Alexander, ou doença de Refsum).. Urn paciente humano com uma doença desmíeíinUante pode ter um ou mais sintomas de uma doença desmíelinizante tato como, entre outros, perturbações de visão, dormência, fraqueza nas extremidades, tremores ou espasticidade, intolerância ao calor, parda da fala, inconiinêneia urinária, tontura ou propríocepçâo prejudicada (por exemplo, equilíbrio., coordenação, sentido de posição dos 5 membros),.

Um humano (por exemplo, paciente humano) com um histórico familiar de uma doença desmieiinizante (por exemplo, uma predisposição genética para uma doença desmieiinizante), ou que apresenta sintomas leves ou pouco frequentes de uma doença desmieiinizante descritos acima 10 podem ser, para fins do método, considerados em risca de desenvolver urna doença desmielínízante (por exemplo, esoíerose múltipla) e podem ser tratados com uma composição farmacêutica como aqui descrito..

Em algumas modalidades, a ΙΤ-β-R-lg solúvel pode ser administrada ao indivíduo em quantidade, frequência e/ou por um tempo suficiente 15 para melhorar a condição de indivíduo. Em uma modalidade, a composição da invenção pode ser usada para induzir ou promover a remielinização em um indivíduo.

Em uma modalidade, o Ll-fl-R-lg solúvel e administrado ao indivíduo de uma só vez. Em outras modalidades, a LT-p-R-íg solúvel é adminis20 irada ao indivíduo mais de uma vez, por exemplo, a cada 3 a 10 dias, pelo menos duas vezes e não mais de uma vez a cada 5 a 20 dias., pelo menos duas vezes e não mais que uma vez a cada 28 a 31 dias; semanais; quinzenais; mensais; semanais ao longo de pelo menos 4 semanas, quinzenalmente ao longo de pelo menos seis semanas; mensais ao longo de pelo menos 25 três meses, ou mensalmente ao longo de pelo menos seis meses.

Em algumas modalidades, a dosagem inicial adequada de 1.1-()R-lg solúvel em ensaios para determinar a dosagem (por exemplo., a quantidade suficiente para induzir remielinaçãn em um indivíduo) é de 0,001 mg de LT-p-R lg solúvel por peso corporal kg do indivíduo. Em algumas modalida3Q des, a dosagem adequada ou dosagem iniciai é determinada por uma série de fatores subjetivos, específicos do paciente, tais como, entre outros, sexo, idade, peso, saúde física, ou qualquer outro factor aqui descrito.

Em algumas modalidades. a ΕΤ-β-R-lg solúvel è administrada a um indivíduo por via intravenosa ou parenteral (por exemplo, por via intrate·· cal, subcutânea, intramuscular, nasal ou oral).

Em algumas modalidades, a ΕΤ-β-R-lg solúvel pode ser adminis trada a um indsviduo corno monoterapia. Em algumas modalidades, a LT-βR-íg solúvel pode ser administrada a um indivíduo corno uma ierapra de combinação com outro tratamento, por exemple, outro tratamento para uma doença auioimune, por exemplo, uma doença desmielinizante (por exemplo, uma das doenças desmielinizantes aqui descritas (por exemplo, osclerose múltipla)). Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir a admimstração ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano) de um ou mais agentes adicionais que fornecem um beneficio terapêutico pana a indivíduo que tem. ou esta em risco de desenvolver, uma desordem auto-ímune, por exemplo, uma desordem desmiellnizant.e.

Em algumas modalidades, a l..T-B-R-lg solúvel e um ou mais a~ gentes adicionais são administrados ao mesmo tempo Em outras modalidades, a LT-il-R-lg solúvel è administrada pnmeíro e um ou mais agentes adicionais são administrados em um segundo momento. Em outras modalidades, um ou mais agentes adicionara são administrados primeiro e a LT-B-RIg solúvel é administrada em um segundo momento. A LT-p-R-lg suiúvel pode substituir ou aumentar uma terapia administrada anteriermente ou atualmente. Por exemplo, quando o tratamento com ΙΤ-β-R-lg, a administração de um ou mais agentes adicionais pude cessar ou diminuir, por exemplo, se administrados em níveis inferiores. Em outras modalidades, a administração da terapia anterior é mantida. Em algumas modalidades, uma terapia anterior serà mantida até que o nível de ΙΤ-β-R-lg atinja um nivei suficiente para fornecer um efeito terapêutico. As duas terapias podem ser administradas e m combinaçâo..

Em urna modalidade, um indivíduo a ser tratado para uma doença desmiellmzante usando uma composiçãofarmacêutica, conforme descrito aqui, pode ser monitorada para remielinízação. Monitoração de um indivíduo (por exemplo, um paciente humana) para remielínação. como aqui -definido, significa avaliar o indivíduo para uma mudança, por exemplo, uma melhora em um ou mais parâmetros indicativos de mmielínízação, por exemplo, pode-se acompanhar a melhora em um ou mais sintomas de uma doença desmiellnizante. Esses sintomas incluem alguns dos sintomas de uma de5 sordem desmíeíinizante aqui descrito. Remielinizacão também pede ser controlada por métodos que incluem a determinação direta do estado de mielina no indivíduo, por exemplo, pode-se medir a massa de substância branca usando imagem de ressonância magnética (MRI) ou a medida da espessura das fibras mielíníoas usando uma varredura do cérebro de espeniroscopia 10 por ressonância magnética (MRS). Em algumas modalidades, a avaliação é realizada pelo menos uma hora, por exemplo, pelo menos, 2, 4, 6, 8, 12, 24 ou 48 horas, ou pelo menos um dia, 2 dias, 4 dias, 10 dias, 13 dias . 20 dias ou mais, ou pelo menos uma semana, duas semanas, quatro semanas, dez semanas, treze semanas, vinte semanas ou mais, após uma administração, 15 de preferência, a primeira administração, de LT-S-R-lg solúvel. O indivíduo pode ser avaliado em um ou mais dos seguintes períodos: antes do inicio do tratamento, durante o tratamento, ou apòs um ou mais elementos do tratamento foi administrado. A avaliação pode incluir uma avaliação da necessidade de tratamentos adicionais, por exemplo, avaliar se a dosagem, fre20 quêncla de administração ou a duração do tratamento deve ser alterada.

Pode também incluir uma avaliação da necessidade de adicionar ou descartar uma modalidade terapêutica selecionada, por exemplo, adicionar ou descartar qualquer urn dos tratamentos para doenças desmielinizantes aqui descritos. Por exemplo, administração continuada do LT-pR-lg solúvel pode 25 ser feita com um ou mais agentes da tratamento adicionais quando necessário. Em uma modalidade preferida, se um resultado pré-selecionado da avaliação é obtido, uma etapa sdíoional é realizada, por exemplo, o indivíduo é administrado outro tratamento ou outra avaliação ou exame è realizado.

Por exemplo, uma punção lombar (ou seja, urna punçâo lombar) 30 pode ser realizada em um paciente para obter uma amostra do líquido caíalorraquídisno. O líquido cefalorraquidíano é então testado para a presença de, por exemplo, (i) proteínas anormais, tais como fragmentos minúsculos de mielma, (h) nivess elevados ou tipos específicos de línfocitos. ezou (ih) níveis anormais de moléculas de imunoglobulina (IgG). Outro exemplo de um teste quantitativo para uma doença desmietinizante é um teste de potencial evocado, que mede a atividade nervosa em função de quanto tempo ieva os impulsos nervosos do olho, orelha ou a pele para chegar ao cérebro. Uma doença desmielimzante também pode ser avaliada através da avaliação do tamanho e/ou número de lesões inftamatònas (por exemplo, escterose) presente no sistema nervoso central, usando qualquer uni dos diversos métodos de imagem, incluindo, entre outros, Imagem por Ressonância Magnética (MRI), Tômografia por emissão de Positrões (PET), Difusão por imagens pesadas (DW-Í, ou DW-MRl). Imagem do tensor de difusão, mielugrafia. transferência de magnetização. Os pacientes também podem ser diagnosticados usando uma variedade de avaliações serni-quantitativas ou qualitativas da sua neuropsicoíogia (por exemplo, o status de várias habilidades como memória, aritmética, atenção, julgamento e raciocínio) ou sintomas (parâmetros clínicos) apresentados pelo pacienta, incluindo, por exemplo, qualquer um dos sintomas da Esclerose Múltipla descrita acima. Além disso, a extensão ou a progressão de uma doença desrnielinízante pude ser detectada por exames da urina de um paciente para níveis elevados de material semelhante às proteínas básicas da míelina (MBPLM), que a substância torna-se elevada como dano axonal que ocorre durante a progressão da doença (ver, por exempla, Whitaker ef a/. (1995) Ann, Neural. 38 (4):635-632), Qertos testes de daltonismo podem também ser úteis no monitoramento do efeito de doenças desmielinizantes nos olhos.

Tais rnétodos de diagnósticos descritos acima também podem ser usados para avaliar a remielinaçâo aumentada em um indivíduo (por exemplo, um paciente) apôs o tratamento com um LT-p-R-lg solúvel por exemplo, remielinização pode coincidir com uma redução no tamanho ou número de esolerose presente em um paciente, determinada através da qualquer dos métodos de imagem descritos. Também a remielinaçâo em um indivíduo pode ser medida como um aumento na velocidade de transmissão de um sinal dos ouvidos, olhos ou da pele para o cérebro, como determinado através da teste de potencial evocado. Em alguns casos, a remíeiinizaçâo pode ser avaliada como um aumento no volume de substância branca (por exemplo, a massa de nervo da coluna vertebral ou o cérebro), especíalmente quando a doença desmíeíinbante resultou em atrofia do nervo.. Em alguns casos, a extensão ou a ocorrência de remielinização errs urn Indivíduo pode ser avaliada díretamente pela medição da espessura da mielina em um indivíduo, utilizando, por exemple, espectroscopia da ressonância magnética.

A presenter invenção também melar o uso des métodos e composições descritos aqui em combinação com terapias ou medicamentos que 10 podem causar condições de desmielinização. Por exemplo, a terapia antlTNF para tratamento da artrite reumaioide, como um efeito colateral, pode resultar em um tipo de condição desmielinizante. Assim, uma Ι..Τ-β-R-ig solúvel pode ser administrada (por exemplo, co-administrada) em combinação oqm uma terapia anti-INF para prevenir, atenuar nu inverter os efeitos cola15 tarais da desmielinação e promover a remielinização. As terapias anti-TNF incluem, entre outros, adalimumab (Humira), etanercept (Enbrel) ou infliximab (Remicade)

Em alguns casos, uma Ι..Τ-β-R solúvel (ex. LT-p-R-Fc) é usado como terapia de segunda linha Por exempla, um paciente que está determi20 nado a não responder a um ou mais tratamentos para uma doença desmíelinízanífô (por exemplo, esclerose múltipla) interromperá o recebimento de um ou mais tratamentos e começará o tratamento com uma ΙΤ-β-R-lg solúvel.

A descrição exposta ensina àqueles versados na técnica dos aspectos da invenção, incluindo como fazer e utilizar a invenção. Os exem25 pios a seguir destinam-se a prestar esclarecimento adicional da invenção, mas não servem como suas limitações.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir descrevem os métodos para purificar um anticorpo com base biológica, ou seja. I..T-β-R-lg, de impurezas relacionadas 30 ao produto. Três impurezas relacionadas ao produto são co-expressas com ΕΤ-β-R-lg, quando expressas em células CHO. Estas impurezas relacionadas ao produto apresentam um desafio no processo de purificação. As impu rezas incluem dois rnonornèrícos mas formas inativas estruturalmente distintas de ΙΤ-β-R-lg (denominadas “Inativo 1 e Inativo 2”) e agregados, que incluiu material dimèríco e material de maior pese molecular. Um exemplo da porcentagem de impurezas versus o produto da proteína apôs a expressão da proteína de fusão de Fc em células CHQ é de cerca da 46% do produto (ativo, proteína monomèríca), cerca de 35% total, cerca de 13% de Inativo 2, e cerca de 6% de Inativo 1.

EXEMPLO 1: DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO DE CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA DE ALTA RESOLUÇÃO GAPAZ DE REMOVER IMPUREZAS RELACIONADAS A MÚLTIPLOS PRODUTOS NO PROCESSO DE PURÍRCAÇAO DE UM ANTICORPO BIOLÓGICO (CICLO 1)

Uma etapa do processo HIC capaz de remover dois monoméré cos, mas inativos, Impurezas relacionadas com o produto de um produto com base em anticorpos foi desenvolvido para a fabricação clinica de fase 1. Durante o desenvolvimento posterior, as melhorias na capacidade e robustez foram procuradas, mantendo a resolução cromatográfiea. Estudos sobra o desenvolvimento serão descritos em que as resinas HIC alternativas e sais de ligação foram explorados e os parâmetros orifices para a eficiência da separação foram identificados através de uma abordagem de projetos da experimentos. A segunda etapa HIC com poder da resolução distinta for utilizada a jusante no mesmo processo para a remoção da terceira impureza relacionada ao produto. Serão discutidos problemas e desafios encontrados no estabelecimento de um processo robusto adequado para a produção clí nica em escala de fabricação.

O exemple a seguir descreve urn processo de cromatograna de interação hidrofóbica (HIC), que ê capaz de remover as impurezas relacionadas com o produto de um produto baseada em anticorpos, por exemplo, duas formas inativas da proteína, que foram desenvolvidas para a fabricação clínica. O exemplo a seguir descreve a resinas de butila e fenila HIC, sais de ligação e os parâmetros identificados como importantes para a eficiência de separação:

Globalmenfe, o processo seguinte (referido corno Ciclo de 1 a 1 e “Ciclo de 1 a 2“) usado uma primeira coluna de butíla HIC, por exemplo, resma 650M butila (Tosoh Bíosciences), seguido por uma segunda coluna de feníía HIC. A combinação de processos HIC resultaram em uma queda das 5 moléculas inativas e agregadas. Determinou-se que a resina butiP650M é eficaz na separação de LT-p-R-lg ativo de outras formas, ou seja, inativo 1, inativo 2 e as formas de agregação. O Ciclo 1 a 1 foi utilizado para fabricação de 2000 L de LT-jTR-lg, enquanto o aclo de 1 a 2 foi otimizado para um material de partida de titulação maior (isto é, 800 mg/mt.j. Os ciclos de 1 a 1 10 e 1 a 2, ambos incluíram a primeira separação de butila HIC e uma segunda separação de feníía HIC.

MATERIAIS. E..MÉTODOS

Resinas utilizadas neste exemplo incluíam o Toyopearl Botil 6ÔQM (Tosoh Bioscience) e Fend Sefarose 6 Fast Flow (Pharmacia). O pro15 cesso de cromatografia Butil-85GM incluiu urna etapa de lavagem e de equilíbrio com urna solução contendo 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, 1,65 M NaCI. e uma etapa de eluição com uma solução contendo 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, 0,7 M NaCI.

O efluente em coluna for monitorado pela absorbãncía de 28D 20 nrn (A^). usando detectores UV-1 Pharmacia. O FPLC AKTA da Pharmacia e versão do software 3.2.6 Unicorn foram usados para diversos experimentos:.

Exceto quando mencionado, a cromatografia foi realizada em temperaturas de 18 a 28 °C. As temperaturas da coluna foram reguladas em 25 casos específicos, utilizando Aqueoedor/Resfriador em Coluna HPLC Torrey Pines modelo C030. As temperaturas para as soluções de purificação foram controladas em alguns experimentos usando banho de água Neslab modelo RTE-211.

A análise estatística tói realizada usando o software JMP ^φ (SAS 30 Institute), versão 3 2.6 foi utilizada para planejamento experimental e análise dos resultados.

As concentrações da proteína LT-p-R-lg ao longo do relatório são baseadas em um coeficiente de extinção de 1.25.

1.1 CICLO 1-1

Ciclo 1 a 1 foi desenvolvido para remover impurezas de LT-βRlg expressais ern cultura de células de mamíferos. As impurezas que pre* 5 cisava ser removidas incluíram duas diferentes formas inativas da proteína LT--$-R-lg, ou seja, formas inativas 1 e inativas 2 bem como agregados. Um resumo do processo de delo da 1 a 1 è descrito na figura 1.

LTBR-lg foi expressa primeiro em células de ovário de hamster chinês (CHO) recornbinante através de um processo de batelada alimenta* 10 da. No Ciclo de 1 a 1, titulação foi de 300 mg/L com agregado em aproximadamente 12%, inativa 1 ern aproximadamente 5% e Inativo 2 om aproximadamente 9%. Após a expressão, a cultura de células foi colhida e centrifugada. Os meios condicionados esclarecidos foram processados em relação a uma coluna de captura de proteína A. A mistura LT-$-R-lg resultante foi pro15 cessada em relação a uma coluna de resina de butila HIC (denominada HIC1) (Butil-85GM; Tosoh Bioscience), onde a resina tinha urna capacidade de 8 g/L. A etapa HIC-1 cancelou a mistura de formas inativas 1 e 2 da ΙΤ-β-R-lg e foi otimizada para a capacidade da proteína.

A resina butil-650b1 foi escolhida por uma série de razões ern re20 laçâo ás outras resmas testadas, incluindo as seguintes características preferidas? 1) uma estrutura rígida de metacrilato, 2) 40 a 90 prn do tamanha de partícula, 3) velocidade operacional de 8 a 300 crn/h e 4) as condições de limpeza mais rigorosas possíveis, por exemplo, 1 N de NaOH, 50% de metanol. A resina butila foi capaz de remover mais de 99% das formas inativas 25 de ΙΤ-β-R-lg,

Uma série da sais foram selecionados para determinar qual era o mais eficaz na resolução do produto da proteína Ι..Τ-β-R-lg das formas inativas e agregadas. NaCl e Na^SO^ ambos foram identificados como sendo capazes de resolver as impurezas do produto LTBR-lg. As formas Inativa 1 e 30 Inativa 2 para LTBR-lg foram eiuídas da resina butíl na lavagem e retiradas das soluções de NaCI, respectivamente. A etapa de HIC-1 butila reduziu o Inativo 1 e Inativo 2 a <1,0% na fração de eluato.

co

A figura 3 descreve um intermediários do processo de análise HPLC após HlC-1, incluindo HIC-HPLC quo resolve as dues formas inativas de LT-p-R-lg do ativo LT-p-R-lg e agregados, e por exclusão de tamanho HPLC (SE. -HPLC) qua resolve agregados da proteins de fusão Ι-Τ-β-Β-Ιρ 5 ativa e monomérica.

Um resumo dos resultados após a etapa de HIC-1 butila é fornecido na figura .2. onda as duas formas inativas de LT-p-R-lg foram separadas do LT-p-R-lg ativo. Conforme descrito na figura 2, o produto ΙΤ-β-R-lg foi eluido da resina de HIC-1 butila com 0,7 M de NaCL As condições finais do 10 Ciclo de 1 a 1 para HIC-1 eram; vincular a 1,65 M de NaCI (tudo ligado), ern seguida, lavar em 1,55 M de NaCI (Inativo 1 foi lavado da coluna), então eluido em 0,7 M de NaCÍ (produto e agregado aluado), então retirado a 0 M de NaCI (Inativo 2 emergiram da coluna) (ver também figura 2).

O eluato da etapa HIC-1 fui, então, inativado vlralmente através 15 de um processo de pH baixo e, posteriormente, transformado em rima segunda coluna de cromatogmfia HIC usando funil Sefamse (Funil Sefarose 6 Fast Flow Hi Sub).

A segunda etapa de HIC (funil) resultou na purificação de agregados da proteína e resolução otimizada do eluato. Os resultados que mus20 tram a purificação de agregados pela etapa HIC-2 (funil) são descritos na figura BA, incluindo o efeito da carga.

Após a segunda etapa HIC (HIC-2), o eluato foi posteríorrnente tratado através de filtros de remoção de vírus (VF) e uítraflítíação/diafiliração (UF/DF).

1.2 CICLO 1-2

O Ciclo de 1 a 2 era uma versão modificada do Ciclo de 1 a 1 descrito acima, onde o Cicio de 1 a 2. tinha uma melhor capacidade de aumentar a capacidade (titulação da proteína no material de partida aumentado). Uma visão geral do Ciclo de 1 a 2 é fornecida na figura 5. Conforme 30 descrito abaixo, no sulfata de sódio do ciclo de 1 a 2 foi usado (em vez de cloreto de sódio) para aumentar a capacidade da coluna de Butíl de 8 a 20 g?L de resina.

Uí

Diferentes sais liotróficos foram seienionados para as duas características de capacidade aumentada e a habilidade para resolver ativo contra inativo (formas 1 e 2) de LT-lTR-íg. A triagem foi realizada para determinar cs saís e resinas que podem efeiívamente remover as formas ínati5 vas e agregadas de ίΤ-β-R-lg após o aumento da titulação. Os resultados da triagem de sais liotróficos são descritos na Tabela 1.

Tabela 1: Triagem de Sais Líotrófcas

Sal	Cone. (M)	Capacidade	Resolução: Monõmero/ínativo 1/Inativo 2
NaCI	T6	Baixa	Afa
(NH₄)_aSQ₄	........................................Ill................	Alta	Baixa
K_ÍS CHÃ PG4	1,0	Alta	Baixa
Na_sSO₄	0,6	Alta	Alta

O sulfato de sodio foi escolhida par sua capacidade de promover uma alta capacidade em uma baixa concentração de sal, è comparável em relação aa custo de NaCI e possui fádi gerenciamento de resíduas, apesar do fato que é sensível à temperatura de sulubílídsde e outros sais, e tem uma solubilidade máxima de cerna de 1,3 M à temperatura ambiente.

Os resultados da triagem de resina são apresentados na Tabela

2. Uma triagem de resinas HIC utihzandc várias sais obrigatório sugeridos 15 que a resina but.ib.2 (Tosoh Biosciences Toyopead resina But!I 600fvt) carre- gado em 0,6 M de Na^S0₄ era uma combinação otimizada para a etapa HIC1 do ciclo de 1 a 2, embora outras combinações testadas revelaram-se eficazes na solução também de impurezas. Assim, a resina butila 2 (som um tamanho de poro de 750 A) carregada em sulfata de sódio de 0,6 M mostrou 20 ser a melhor candidata.

Id.bela.2; Triagem de Resina

Resina butil-1 (850A pores)

Resina butil-2 (750A poros)

Resina

Sal de ligação

1,6 M de

NaCl

0,6 M de

Capacidade, de ligação dinâmica (g/

Resolução. Morrômero/lnallvo 1/lnativo 2 Sim I Sir

Não

Na;SO₄ '* 10% de avanço

Geralmente, as etapas dn processe do ciclo de 1 a 2 eram semelhantes aos descritos acima para u ciclo de 1 a 1 com exceção du firn de mativação viral e o use de um sulfato de sódio com base na lavagem para a etapa de buiila. LTBR-lg foi expressa primeiro em células de ovário de hamster chinês (CHO) recombinants através de um processo de batelada alimentada. A titulação de expressão celular fui de cerca de 800 mg/L de LTβ-R-lg.. incluindo 5% de LT-1 -β-R-lg inativo 1, 14% de ΙΤ-β-R-lg inativo 2 e 22 % de LT-p-R-lg agregado. Após a expressão, a cultura de células foi colhida e centrifugada. Os meios condicionados esclarecidos foram processados em relação a uma coluna de captura de proteína A e viraímente inativados usando um processo de pH baixo, A mistura LT-p-R-lg resultante foi processada em relação a uma coluna da resina de butíka HIC {denominada HIC-1) (Butil-650M; Tosoh Bíoscienoe), onde a resina tinha uma capacidade superior a 20 g/L. A etapa HIC-1 cancelou a mistura de formas inativas 1 < da ΙΤ-β-R-lg e foi otimizada para a capacidade da proteína.

Duas estratégias de lavagem foram utilizadas para determinar parametros ideais para a lavagem da resina butila para aumentar a capacidade. ou seja, a etapa de lavagem dc sulfato da sódio e uma etapa de sulfato de sódio/seguido por uma lavagem gradiente inversa. Os resultados dessas duas estratégias estão descritos na figura 6, onde a estratégia B - Etapa e Lavagem Gradiente demonstrou proporcionar uma meihor eleição resolvida. Diferentes quantidades de carga, concentração de sulfato de sódio e concentrações de solução de eluição de sulfato de sódio foram estudados. 5 como descrito abaixo rias Tabelas 3 e. 4.

Tabela 3

Fatores

Oarga	Lavagem	Fkiíçlu
fg/litm de resma)	(mM)	(ml4)
26	460	238
26	548	338
22	588	200
	488	230
18	548	178
26	468	178
18	540	238
18	458	170
28	548	178
22	588 as&lxWss (%}	208

So ;sòftw<8 aVv» «S lis ale |

Iftsíísfô Ί ssn £k«ík> | ísaíe» 2 EhVí> j

Agfegâcfe EfesO

5««4 lment&48 sm&ws aüv» m jèO.S. c«í elua&> (Renáimsk>j

0.0. sm lavs^fii

Tabela 4

Asúié» sUaSUica èteçãsflfesOí j

Ov Wiíhsb W X

Ysré^íí tawSse^wse» ísèhpã 2 VlãS 4s fetesçm θά&ν«ΐΐΛ4δ £8ígS

S&Wãeste *fe I	lsv4M> 4	Isv^t	00. sss
«mèsKSfv eu<í 55j;	atratos	w 5hãô	f

8.58 l	tU2	8.81	A88
í	4,04	I W2$	i «&W1
5.445	2,»f	i twt	i <051
6.2884	0.8S71	. tdrni	1 M540
0.5548 ί	O§M	I tç»	1 IW8

.As curvas de nível foram anahsadas para determinar os fatores críticos para a etapa de purificação HIC-1 butila do ciclo 1 a 2. 0s fatores críticos identificados para purificação· do inativo 1 incluíam uma carga da co kma (em um intervalo de 18-26 g/L) e a concentração do lavagem de Na^SO* (intervalo de 0,455-0,465 M, utiiizandu-se condutividade estreita e especificações de osmolalidade), Urn fator chave para a purificação do inativo 2 era a concentração de eluição de Na2SO4 mantida a mais de 0,22 M, Fatores que estavam determinados a não ser importante na etapa de purificação incluída o volume de carga (quando a concentração de Ns^SOd. era > 0,56 m) e o volume de eluição (quando a concentração de Na^SCE era >0,22 M. Outros fatores principais potenciaimente incluíam volume de lavagem, temperatura, consistência de lote de resina e concentração da proteína de carga

SÍNTESE DOO CICLOS 1 a 1 e 1 a 2

Assim, a purificação da proteína ΙΤ-β-R-lg Bi conseguida usando uma combinação de colunas HIC que, por sua vez. separada a proteina ΐΤ-β-R-íg ativa (medicamento) a partir de três diferentes impurezas relacionadas com o produto, ou seja, duas diferentes formas inativas da proteina ΕΤ-β-R-lg e agregados de ί..Τ-β-R-Ig (para o resumo dos resultados da figura B

A etapa de coluna HIC-1 (resina de butila) foi otimizada para maior capacidade, mantendo a resolução da proteina LTBR-lg ativa, A coluna de butila HIC foi capaz do separar a proteína LT-p-R-lg ativa das duas diferentes formas inativas da proteína, ou seja, fui capaz de espécies rnonomérícas de ΙΤ-β-R-lg de sulfurate claro mexido (Inativa 1 e Inativo 2). O rendimento do produto foi pesado versus purificação das espécies inativas de LT-^-R-íg com a etapa da coluna HIC-1. O sulfato de sódio promoveu alia capacidade cam alta resolução das espécies. Os fatores críticos na maximização de purificação das formas inativas versus o rendimento de produtos incluíam a carga da coluna e a concentração de lavagem de Na_;?SO4 (por ciclo 1 a 2).

Os dois processos também incluía a otimização de uma terceira etapa de coluna, ou seja, HIC-2 (resina de fenila), que rendeu um produto que era claro de formas de agregação da proteina LT-p-R-lg, bem como inativo 2 residual. Fatores criticas que furam identificados para a etapa de HIC- induiarn a carga da coluna, altura da cama a vazão.

.&XEMPLQ.2; PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO LT-p-R-lG ΒΙΟLOGICAMENTE ATIVAS: CICLO 2.

O exemplo a seguir descreve um processo que purifica a fusão 5 Ig biológica, ou seja, a proteina de fusão LT-p-R-lg a partir de urna matériaprima contendo uma elevada percentagem de impurezas relacionadas com o produto, ou seja, cerca de 50% de impurezas relacionadas corn o produto. Como descrito anima, a matéria-prima de LT-β-R-lg contém diferentes tipos de impurezas, ou seja, espécies agregadas e duas formas mexidas de dis10 sulfeto distintas - denominada formas Inativa 1 e Inativa 2 de ΙΤ-β-R. Como estas snpurezas estão intimamente relacionadas com LT-£-R~lg (e produto), a purificação do produto desejado é um desafio.

O processo da fabricação para LT-p-R-lg foi desenvolvido inicialmente para recentes estudos ciímocs e mais tarde foi modificado para au15 mentar a produtividade a níveis suficientes para a comercialização. Para alcançar· este objetivo, a produtividade da cultura celular foi aumentada em um fator de quatro. Esta mudança, no entanto, estava associada com um aumento nas variantes do produto de 20% para aproximadamente 50% do total de proteínas relacionadas com o produto Mais notavelmente, os níveis de 20 agregados eram mais do o que o dobro, jà que aumentaram de cerca de 12% a cerca de 35% do total. O material de alimentação incluía uma titula çào de atè 1.35(1 mg/L, que incluíam cerca de 6% de inativo 1 de ΙΤ-β-R-lg, cerca de 14% de proteínas ίΓ-β-R-lg inativas 2 e cerca de 28 a 353¾ de agregados. O aumento da produção da proteína de ΙΤ β-R-lg não só aumen25 tou o LT-p-R-ig atívo(medicamento), mas também aumentou as três impurezas associadas a esta proteína de fusão.

Assim, o ciclo 2 foi projetado em resposta a um aumento da titulação da proteína de fusão LT-8-R-lg da expressão de células de mamíferos, espedalrnente no que diz respeito ao grande aumento dos agregados de 30 proteínas que constituem um desafio para a purificação. Para remover as impurezas da colheita de cultura de células, um processo otimizado foi desenvolvido e era baseado em uma separação em duas partes com uma pri72

SfcíSHoçòes iis: Pfixsísso ássík-Jísüo rom híansfejçàc PfôdUívyUs-fe * melra resina de NIC de made misto e uma segunda resina de fenila HIC.

Urna visão geral do aumento das impurezas é descrita na Tabela 5.

Tabeja.5·.

Modificações de Processo Associado com intensificação de Produtivuidade ^A

Dia de Colheita	Aumento da percentage?	n relativa ao processe não-modificado
Bíorreto?	Impurezas r ao pr	el acionadas oduto	Produto Purificado
	Volume	Litre®	.Agregados	Monômere Inativa	Massa per lote
14	750%	296%	216%	120%	1100%
16	750%	40054	250%	130%	150654

^A Apôs estudos clínioos recentes, a produtividade aumentada foi necessária para auxiliar a fabricação comercial ® Total da produto relacionado; equivalente a 260% de aumento no produto rnonornèríco ativo .no dia 16 .As impurezas associadas ao produto estavam presentes em mais de 56% da proteína total na alimentação para tratamento a jusante (46% do produto; 35% de agregado; 6% inativo 1 e 13% de inativa 2).

O Ciclo 2 foi bem-sucedido na purificação do produto, quando mais de 5654 da matéria-prima de partida consistia de variantes inativas e agregadas indesejáveis. O processo do ciclo 2 foi utilizado com sucesso para purificar a proteína de fusão de ΙΤ-β-Η -Ig biologicamente ativa em uma escala de produção de 15.000 L Enquanto inativo 1 co-purificado com o produto (LTgTR-lg ativo não agregado) em diversos modos de cromategrafia, uma separação eficaz destes duas formas da proteína β-LT-R-lg foi realizada utilizando uma resina de modo misto. Inativo 2 foi separado do produto de forma robusta, utilizando cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). A purificação do agregada inferior a 1% da substância da fãrmaco foi realizada por' um contrate preciso do mudo misto e cromatugrafía de HIC, bem como uma etapa de lavagem 1 na resina de modo misto, que foi guiada por experimentos de desenho tutorial para identificar e investigar parâmetros criticas.

No processo do cicio 2, a cromatografía em modo misto reduziu o agregado de aproximadamente 26% (na carga) para aproximadamente 10 a 24% (no eluato). A etapa fenila posterior purificou o agregado restante, eu seja, purificou o agregado de pelo rnenos 23% (na carga fenila) a <1% no eluato de fenila

Uma visão geral do Ciclo 2 ê fornecida na figura 9 e è assim τού sumida como se segue. Antes da cenlrifegação, o material biorreafor (14, 15 ou 16 dias) foi ajustado para um pH de 4,7 a 5.3 para promover a remoção de impurezas relacionadas ao processo. Apôs a eentrifugaçâo da colheita, Triton X-100 foi adicionado em 0,65% para o material da carga para a captura de proteína A para promover a inahvaçâo retroviral. A captura subsequen10 te da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg foi reakz.ada utilizando colunas da Proteína A com uma capacidade de 21 g/L. Após a captura de uma proteína, a inativação viral corn pH baixo fos realizada, seguida pelo uso de um absorvente da membrana Q para a purificação de outro parvovirus. A coluna HIC de modo misto foi então utilizada com uma capacidade de 31 g/L para purificar 15 a mistura da forma inativa 1 da LT-l-B-F-t-ig e uma parte do agregado. Após a etapa da coluna de modo misto, o eluato foi submetido a uma coluna HIC contendo fenila com uma capacidade de 15 g/L. e uma altura de leito de cerca de 30 cm*. Esta coluna HIC separada da proteína ΙΤ-β-R-lg ativa das formas de agregação e inativo 2. A coluna de fenila foi aumentada para cer20 oa de 30 cm para otimizar a purificação das impurezas. A faixa de carga ideal para esta altura era de cerna de 10 a 15 g/L

Assim, as mudanças a jusante usadas para processar a titulação da maior quantidade de protelna/matérias-prímas com alta impureza incluiam modificações para as etapas de cromatografía. Comparado com as ete25 pas do processo do ciclo 1 anteriores, o ciclo 2 foi modificado de tal forma que houve um ajuste de pH baixo do biorreater antes da colheita. Isto permitiu a precipitação aumentada e a remoção de impurezas relacionadas processo, e purifscação de DNA intensificado e alimentação hmpa para as colunas. A rápida transformação foi necessária a modificação do pH baixo de30 vido à estabilidade do produto limitada no material de colheita. A afinidade da Proteína A com alta capacidade também foi utilizada, que fornecia cerca de 140'% de aumento na capacidade e diminuíram o número de ciclos necessários para processar a matéria-prima. enquanto aumentava a produtivi dade. Um adsorvedor da membrana de troca íônica também foi acrescentado ao processo para fornecer a capacidade adicional para purificação do parvovirus. Uma segunda nova coluna (mede misto) foi adicionada ao pro5 cesso para melhorar a capacidade e eliminação de impurezas relacionadas com o produto. Essa segunda nova coluna aumentou a capacidade em mais de 380% e forneceu a remoção do inativo 1 robusto, bem como a purificação des agregados. Detalhes adicionais sobre as etapas do ciclo 2 são descritas a seguir

COLHEITA E 1NATIVAÇÀO VIRAL

Antes da purificação de Ιϊ-β-R-lg (produto) monomèrico e ativo, a profeina foi produzida em células CHO de mamíferos, colhidas e posteriormente, purificadas. Na colheita, o meio condicionado foi resfriado entre 2 a 8^Ô O e pH ajustado para 4,7 a 5,3. Os meios condicionados com pH ajusta· 15 dos foram alimentados na centrifuga empilhada em disco. As células e restos celulares foram coletados no espaço de manutenção da bacia sedimentar e removidos de forma intermitente durante a operação de colheita. O centrado livre de células purificadas cresceu até a bacia superior e fui descarregado continuamente sob pressão por uma bomba centrifuga. Após a eonclu20 são do processo de c-entrifugação, o centrado coletado fui misturado e neutralizado no pH 6,9-7,5.

Apôs a colheita e oentrifugação da mistura conferido ambos LTβ-R-lg ativos e impurezas associadas, triton X-100 foi adicionado para inativar o vírus acidental, sem danificar e produto ou gerar níveis inaceiiavelmen26 te altos de agregação. A temperatura do centrado neutralizado foi ajustada para 15 a 25*0 e Triton X-100 foi adicionado para uma concentração final de 0,05% (p/v). O centrada Triton-X ajustada foi mantido por um mínimo de duas horas antes de ser processado posteriormente.

A mistura (contendo formas ativas e inativas de L.T-0 R Ig a a30 gregados) funcionava em relação à uma coluna A de proteína recombinants.

A resina MabSelect SuRe da proteína recombinants A (rProtein A) foi escolhida para a etapa de captação, devido à elevada afinidade e especificidade /3 que esta resina apresenta para LT-p-Rdg. A purificação de ΕΤ-β-R-lg das impurezas relacionadas ao processo ocorreu nesta etapa de cromatografia ao processo e Ι.Γ-β-R-lg. Além disso, a etapa MabSelect 5uRe forneceu a purificação de possíveis aontamiaantes virei, o DNA da célula hospedeira, as 5 proteínas da célula hospedeira e reduziu o volume de processo em oito vezes. Esta etapa de cromatografia foi realizada entre 18 a 26°C.

A introdução de uma resina de cromafografia nova para a segunda etapa da coluna (muda misto) aumenta a capacidade e purificação de impurezas relacionadas com o produto, mas diminuiu a capacidade de purifi10 cação de possível parvovirus. Para restaurar a purificação em excesso de parvovirus acidental com facilidade de ajuste ideal, uma operação da unidade do Absorvente de Membrana Q fui aplicada no processo. O desenvolvimento identificou o pH ideal (cerca de pH 6_:4) e condufividade (alta condutividade) para purificação do parvovirus modelo - Minute Mouse Virus (MMV) 15 , proporcionando 100% de rendimento do produto. A membrana Q foi aplicada entre a afinidade da proteína A e a segunda etapa da coluna e forneceu Logl 8 > 3 de MMV em estudos de spiking viral em baixa escala utilizando materiais GMP.

Cada ciclo de MabSelect SuRe eíuído foi processado através de 20 inatívação viral corn pH baixo e filtração por membranas Q antes de pooling

Esta etapa foi desenvolvida para inativar o vírus pH sensível sem danifica? o produto ou gerar níveis inaceitavelmente altos de agregação. O eluato de MabSelect foi ajustado para o pH 3,5-3,3, então mantido per 2 a 2,5 horas entra 18 e 26^CC. A solução foi, então, ajustada para o pH 6,2-6,6 e tratamen25 to continuado na próxima etapa, que envolve um parmutador de âniun (Santobind (^Membrane Adsorber (QMA)) que è um adsurvente de purificação de parvovirus.

RESINA DE MODO MISTO

A resina de modo misto, ou seja, cromatografia Capto MMC 30 (GE/SaPde), era a segunda etapa da cromatografia no processo de purificação ΙΤ-β-ΕΙρ de ciclo 2 (primeira etapa sendo a proteína A). Embora a Capto MMC seja uma resina de modo misto, ela foi operado nu modo de troca ro catiôniea. A resina de moda misto foi selecionada devido a sua alta capacidade de ligação para ΙΤ-β-R Ig e sua capacidade de separar LT-B-R-lg monomérico e ativo das impurezas relacionadas corn u produto e processo. Além disso, a etapa Capto MMC forneceu purificação de proteínas da célula hospedeira, lixiviação da rProteina Ada coluna MabSelect SuRe e possíveis contaminantes virals. A cromatografia Capto MMC também reduziu as impurezas relacionadas ao produto, tais como os agregados e as espécies inativas de LTBR-lg. Esta etapa foi realizada entre 16 e 24X. As condições para a etapa Capto MMC e remoção de ambas as impurezas agregadas e inativo 1 incluídas, relação das cargas de 26 a 31 g/L com uma carga de pH de 4,8 a 5,2. Alèm disso, a primeira lavagem tinha um pH de 7,0 a 7,2, A carga de coluna e as etapas da lavagem impactaram o rendimento e a purificação total

O papel principal da segunda etapa da coluna (primeira coluna sendo a Proteína A) no processo de purificação de ΙΤ-β-R-lg cicio 1 foi para limpar o produto misturado com bissulteto relacionado à impureza, ou seja, as espécies Inativo 1, do produto Lí-p-R-lg monomérioo e ativo. No entanto, esta separação fui realizada usando resina Butil 650M Tosoh Bioscience. No entanto, a resina butil 650M era limitada, uma vez que havia relatívamente baixa capacidade de ligação e não era adequada para titulação aumentada. Assim, o desafia para o processo de desenvolvimento de ΙΤ-β-R-lg-2 de ciclo 2 era identificar as condições para aumentar a capacidade da segunda etapa de coluna (para acomodar a titulação aumentada, enquanto minimizava o ciclo da coluna), mantendo a purificação do Inativo 1 comparável àquela alcançada no ciclo 1. A alta capacidade da resina IEX foi usada e foi capaz de purificação robusta do Inativo 1 com uma etapa de lavagem intermediária,

A troca de cátioas/resina de HIC de mudo misto que foi selecionada foi o Capta MMC (GE/Healthcare). 0,66 centímetros (I.D.) x 15 (2ü crn de colunas da vidro de altura de leito (Omnrfit) foram utilizadas, e os experimentos foram realizados à temperatura ambiente (22 a 26*0).

A resina Capto MMC é composta de uma conta de agarose cruzado que foi derívatízado com um ligaste de modo misto (GE Healthcare). O ligante contém várias funcionalidades múltiplas de interação com a proteínaalvo, que incluem interações sônicas e hídrofóbicas. Assim, a resina pode ser operada tanto em modo hidmfóblco e catiônfco de cromatografia. Para o processo de purificação de ΙΤ-β-R-ig, a coluna Capto MMC foi operada no modo catiônioo. em que ΙΤ-β-R-lg foi eluldo da resina, aumentando o pH tampão e/ou condutívidade de tampão.

Os ensaios realizados durante □ desenvolvimento de Capto MMC foram HIC analítico e SEC analítico.

Além de usar OD:^ para determinar o rendimento, a recuperação de LTBR-lg também foi quantificada através do ’Tendrmento do monórnero ativo, tal corno definido na equação. (1):

Rsndimentó do Monófnero Ativo - j iisügi

Eq. (1) onde: V é o volume da solução (ml..), e OL?^ é a absorvância a 280 nm/mL

A porcentagem de monômero e a porcentagem de espécies ativas foram medidas através de HPLC-SEC e HIC analítico, respectivamente. Agregados de LT-p-R-lg incluíam tanto dlmero (definido como um multímero .contendo quatro .cadeias de moléculas ligadas da dissulfeto) e espécies de peso molecular alto.

Capacidade de ligação dinâmica (DBC) com avanço de 5% para Capto MMC foi calculado usando a Eq.. (2.):

/)«< .·. Eq. (2) onde Co é igual à concentração de proteína na carga (mgfml), Vbt é igual ao volume colocado no ponto de avanço da 5% (ml), Vb è igual ao volume total da camada de resina e V^v igual ao sistema e volume modo da coluna.

A resina Capta MMC (moda misto) foi capaz de separar efetivamente a forma inativa 1 e pareialmente separada das formas agregadas de ΕΤ-β-R-lg moúomérico e ativo (produto desejado). Capto MMC foi capaz de separar tanto a forma ativa de ΙΤ-β-R-lg, bem come uma parcela do total de

Três experimentos foram realizadas para definir as condições de funcionamento para a resina Capto MMC, bem corne analisar a sensibilidade daí resina a mudanças nas condições de operação usando a alimentação do trabalho de desenvolvimento de cultura de células recentes. Os resultados destes estudas mostraram que a performance de Capto MMC fui sensível à carga da coluna, lavagem de pH tampão e lavagem da concentração de tampão. A faixa de carga da caluna foi determinada como sendo 20 a 31 mg de resina L.TBR-lgfmL, o pH de tampão de lavagem 1 ajustado para 7,0 a 7,2 e concentração de tampão de lavagem 1 ajustado para cerca de 61) mM Bis Tris. A segunda lavagem (lavagem 2) tinha um pH de 3,5 a 3,7 (por exemplo. pH 5.6) e uma concentração de cerca de 20 a 30 mM de acetato de sódio. ΙΤ-β-R-lg foi eíuída da resina de mude misto com 50 mM de fosfata e 150 mM de NaCI (pH 7.0).

A análise fatorial das condições de cromatografia identificou que a proporção de carga da coluna e das condições de solução de lavagem foram importantes para a separação.

Durante o desenvolvimento, o aumento da titulação do biorreator foram acompanhadas por um aumento nu nivel agregada que necessita de purificação parcial du agregado pela segunda etapa da caluna de muda misto. A purificação das agregadas foi obtida através do aumento de adequação das condições de lavagem. No entanto, uma completa separação da agregado ao produtu não foi alcançada - a purificação agregada foi obtida à custa da perda parcial do produto durante a lavagem. Já que o rendimento da produto e purificação do agregado eram dependentes da proporção de carga de coluna o condições da lavagem, as faixas de funcionamento ideal foram necessárias para ambos os parâmetros.

As condições de funcionamento da coluna do mudo misto e separação de desempenho da Inativo 1 e/ou agregados são descritas na figura 11. A purificação do Inativo 1 foi robusta com alto rendimento do produto ao longo de uma vasta gama de condições de carga e de lavagem. Em contraste, a purificação agregada exigia uma condição de lavagem mais severa do que o rendimento da produto que provocou um impacto negativo sabre a dependência do rendimento e a purificação agregada da carga de coluna e as condições de lavagem, mesmo dentro da faixa ideal. Durante a fabricação das especificações de alcance ideal necessárias para a solução da lavagem revelou uma variabilidade de lote pare lote, no componentede tamponamsn5 to, exigem a revisão do registro do lote de solução,

Um resume da diminuição da formei inativa 1 de LTp-R-lg e o agregado utilizando a resina de modo misto è descrito na Tabela 6. A Tabela 6 apresenta a análise de séries diferentes da produção e purificação de LTβ-R-lg um condições semelhantes. Use da resina de modo misto diminuiu a 10 forma inativa 1 de LTBR-lg de cerca de 6% na mistura original obtida a partir do processo de cultura de células a menos de 1%, ou quantidades índetectáveís. Além disso, conforme descrito na Tabela 6, a percentagem de agregados também diminuiu de cerca de 30% (28-35%) para cerca de 10-24%.

Tabela IT Resuma do exemplo executados usando resma de modo misto 15 (Capto MMQ)

1 ......... 1'	Execu- ção 1	Execu- ção 2	Execu- ção 3	Execu-	Execu- ção 5	Execu- ção 6	Execu- ção 7
i Titula- i Ção ί inicial	> 800	820	1240	..... 1200	980	1050	1396
ί Agre- í gado 5 >'Ú/ Λ	28	29	B	35	33	28	26

i Inativo i (%)	7	............	6	6	6	6	6
i Inativo \| 2 (%)	10	9	9	14	10	7	6
			Etapa Capto MMC
1 Monô- Í mero i ativo Itili........1	75	77	' 67.........	67	75	-74	74
\| Agr&- ; gado í em i eluato liilo........	;1\|B·· *	14	23^a	19	13	21 ......................................	15

	Exeou- çao 1	Execu- ção 2	Execu- ção 3	Execu- ção 4	Execu- ção 5	Execu- ção 6	Execu- ção 7
Inativo	< L-	·< L-	< L-	< L-	< L-	< L-	< L-
íiTBI I	LOQ⁸	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ
Inativo	10	8	10	W	11	8	δ

^Λ Afio agregado - pH da lavagem 1 Capto MMC foi subsequentemente aumentado para fornecer maior purificação de agregado ⁸ < LLOQ ~ menos que o nível menor de quantificação para ensaio HICHP1.C

DESSORÇÃO DE IMPUREZAS RELACIONADAS AO PRODUTO DURANTE AS ETAPAS DE CAPTO MMC LAVAGEM 1 E ELUIÇÃO

Para investigar o comportamento oromatográfico de impurezas relacionadas com o produto durante a etapa de Capto MMC, as frações foram coletadas em todo o Capto MMC Lavagem 1 e eluição. Cada fração foi 10 analisada por absorção, SEC e HIC-HPLC e a quantidade total de cada espécie relacionada ao produto determinada. Esta analise revelou que, nas condições empregadas, as espécies de inativo 1 foram removidas de forma eficiente durante a etapa de lavagem 1 e não foi detectada na fração de eleição, Em contraste, variações de pesa molecular alto e dímero {coletivamente 15 denominados agregados) foram recuperadas nos pools de Lavagem 1 e eleição. Notavelmente, dessorçâo do agregado diminuiu antes do finai da etapa de lavagem 1 em pH 7,0 e antes do início da lavagem 2 (pH 5,6). Assim, um bules limitado de agregados emerge da coluna durante a Lavagem 1 (em 80 mM BisTris, pH 7,0). enquanto agregado ainda permanece ligado até que a 20 coluna seja eiuida com 50 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaQL pH 7,0.

do monômera Ativo e inativo 2 dessorvldo da coluna durante as etapas de lavagem 1 e eleição. Análise do pool de eluíção revelam que ela foi enriquecida por monômero ativo. Isto foi principaímente a perda preferencial de Inativo 1 e agregado durante a etapa de lavagem 1, pois a porcentagem do ína25 tive 2 no material de oarga e eluato era semelhante.

RESINA FENIL SEFAROSE

Fenil Sefarose 6 Fast Flow High Sub (Feníi Setarose) foi a cro rnatografia final (3^i:) no processo de purificação de ΙΤ-β-R-lg. Fanil Sefarose é uma resina de cromatngrafia de interação hidrofòblca escolhida como a coluna de polimento final, devido a sua alta capacidade de ligação para LTβ-R-lg e capacidade de separar o produto do processo e impurezas relacio5 nadas aos produtos, A etapa foi encontrada para remover agregados e formas inativas 2 de LT-p-R-lg. Para limpar o elevado nível de agregado presente na matéria-prima, o poder do resolução da terceira coluna HIC fei aumentado através da extensão da altura do leito de 20 cm a 30 cm. Além disso, a etapa de feniia forneceu ainda a purificação do DNA da célula hospe10 delra, proteínas da célula hospedeira, líxiviação da rProtein A da coluna

MahSeiect SuRe e possíveis oontamínantes virais. A análise tatorial das condições de cromatografia, combinada com a avaliação de risco, identificou que a carga de coluna e lote de resina (densidade de iigante) eram fatores importantes para a separação, conforme desanfo na figura 12. Apôs o ajuste 15 de carga com sulfato de amònio, o pool do eluato de Capto MMC foi carregado na coluna Feníi Sefarose (Funil Sefarose 6 Fast Flow (hi sub); Ο,δβ centímetros (ID) x 20 a 40 cm de colunas de vidro de altura do leito). A variação de carga e altura do leito foram otimizados para a purificação dos agregados e inativo 2, onde a percentagem de agregados foi <1% e inativo 2 20 foi <I..LGQ.

Os ensaios utilizados durante a seleção HIC e desenvolvimento das etapas de cromatografia da Feníi Sefarose FF eram HIC analítico e SEC analítico.

Alèrn de usar OD^ para determinar o rendimento, a recupera23 ção de LTBR-lg também foi quantificada através do rendimento do monomero ativo, íai como definido na equação, (1):

Bradrerolu do ívocíwvu atbn ~ (1) onde- V é o volume da solução (ml)_: e OD280 é a absorvância a 280 nm/mL,

A porcentagem de monômero e a porcentagem de espécies ati30 vas foram medidas através de HPLC-SEC e HIC analítico, respectivamente.

éspecies agregadas de ΙΤ-β-R-lg incluídas tanto no dimero e espécies de alto pesa moiecular

A fim de examinar o efeito da altura do leito na purificação de agregados, Fenil Sefarose foi embalado em três alturas de Insto (20, 30 e 40 cm), LT-B-R-lg carregados na coluna de Feníl Sefarose a um alvo de aproximadamente 15 mg de resins LT ^-R Ig/mL e depois lavados com 3 CV de solução de equilíbrio. A coluna foi lavada e ΙΤ-β-R-lg foi eluído utilizando um tampão da sulfato de amônio. As frações furam coletadas durante a eluição e analisadas para a produção e teor de monõmero. A carga da coluna e recuperação de produto foram determinadas por medição da absorvância (OD280).

A Tabela 7 mostra o efeito da altura do leito e a velocidade de funcionamento na remoção e recuperação do agregado de Ι..Τ-β-R. (Alimentação: 15% de agregado,. 9% de Inativo 2: Carregamento da coluna, 15 mg de resina ΙΤ-β-R/ml, concentração do tampão de eluição do sulfato de amônio: 0,325 M, Volume de eluição: 6 CV). Parâmetros que previam a resolução ideal da Ι..Ι-β-Rdg e proteínas agregadas íncíuídam uma altura de leito d.e 30 cm (versus 20 cm na altura do ieito de tenil ciclo 1) e uma vazão de 50 cm/h. Além disso, a faixa de carga ideal com esses parâmetros foi de 10 a. 2.0 g/L de resina. Altematsvamente, uma vazão de 100 cm/h e uma solução de eluição de 0,44 M de sulfato de amônlo (intervalo do 0,3 a 0,5) também foi determinada por ser eficaz.

Tabela 7

Altura do leito (cm)	Velocidade Tempo de de operação residência (cm/h) (min)	Recuperação OD_?íí;; de I..TSR (%)	Renduimersto . , do Monõmero 9re?a<to ativo () ¹	Inativo- 2 {%)
30	100	ts	^7	75 0,88	0
•£0	50	24	50	69 0,82	0
40	50	48	47	64 0.63	c
20	33 38	4?'	65 6.56	c
30	50	36	59	83 0.58	Á

Como pude ser observado na Tabela 7, aumentando a altura do leito da cohjna de fenil aumenta o rendimento total du ΙΤ-β-R-lg ativo (acima referido como 'manõmero ativo’*) e diminuição da percentagem de agregadas...

Já que o rendimento e a purificação total foram fortemente de5 pendentes da densidade do ligante da resina e carga da coluna, os intervalos de funcionamento ideal foram necessários para os parâmetros (descrito em mais detalhes abaixo). A dificuldade da separação (remoção de > 20% de agregados) revelaram uma variabilidade de lote para lote, no desempenho de resina que foi correlacionado corn a especificação da densidade do 10 ligante.

Geralmente, a etapa feriria fui realizada á temperatura ambiente e com uma altura de leito de 30 cm. Após o carregamento, a coluna foi lavada com 2.6 mM de ácido acético, 1,0 M de sulfato de amônio, 50 mM dea cetatu, pH 5,8 (Lavagem 1), LT-β-R-lg foi posteriormenfe eluída apôs as la15 vagens com 2,6 mM de ácido acético, 0,44 M de sulfato de amônio, 50 mM de acetato. pH 5.8,

Um resumo da diminuição na forma de impureza de agregado de ΙΤ-β-R-lg usando a resina fenila é descrito na Tabela 8, que fornece uma análise de execuções diferentes da produção e purificação de LT-3-R-lg em 20 condições semelhantes.

T.ab.ela.3·. Resumo de execuções du exempla usando resina fenila (Fenil Sefarose)

ii : : ........ ))	Execu- ção 1	Execu- ção 2	Execu- ção 3	Execu- ção 4	Execu- ção 5	Execu- ção 6	Execu- Ϊ ção 7 \|
i Titula- 1 çáo iníí ciai	> 800	820	1240	1200	980	1050	13® 1
1 Agre- 1 gado ill).................j	28	29	33	35	33	28	26 \|
1 Inativo 11)011))	7	6	6	δ	a	a	6 \|
1 Inativo L^z.3i..........	10	9	9 ..........................	14	10	7	a \|

	Execu- ção 1	Execu- ção 2	Execu- ção 3	Execu- ção 4	Execu- ção 5	Execu- ção 6	Execução?
		Etapa funil Sefaroso
Monô- mero ativo /till'................	W	99	98	98	99	97	99.....
Agregado em eluato (%)	3*	2*	0,4	0,6	0,4	0,4 2	/iü................
inativa	<L·.	<L-	< L-	< L-	< L-	<L-	< L-
llllll.........	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ
Inativo	2.3	< L-	< L ·	< L-	< L-	< L-	< L--
2 (%)		LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ	LOQ

“ Alto agregado, Para PT subsequente de iota de resina e concentração do sulfato de amõnío da solução de eluiçào foram harmonizados (questão de variabilidade do lote de resina)

Em resumo, o uso da etapa HIC fenila diminuiu a percentagem de agregadas com menos de 1%. A etapa HIC fenila também diminuiu a forma inativa 2. do LTBR-lg para menos de 1%.

O cicio 2 foi utilizado com sucesso em larga escala, ou seja, 15.000 L, para purificar LTBR-lg de impurezas Indesejáveis, incluindo agregados e duas formas inativas da proteina. Apôs a transferência inicial de escala de 15.000 L , o processo fci operado de maneira conservadora para minimizar os riscas para a qualidade do produto. A colheita ocorreu no dia 14 cu 15 e continha 30% de agregado no bicrreater. O ciclo 2 incluiu uma elevada carga na segunda coluna para promover o Inativo 1 e purificação do agregado e uma baixa carga na terceira coluna para promover a agregação a purificação do inativo 2.

Baseado no desempenho do processo ern lotes de 1 a 3, o processo foi posteriormente operado sob condições de maiores rendimentos (Lotes 07/04), onde a colheita acorreu no dia 16 e continha 353* de agregados no biorreator. Alta carga na terceira coluna foi realizada para promover o alto rendimento. figura 13 apresenta urn resumo das características principais de desempenho do processo a jusante modificado de 15k de fabricação.

Resumo

Para resumir todo o processo, a clarificação da colheita da cultura celular era com centrifugação de empilhamento em disco. Triton X-100 foi adicionado aos meios cortoicíonados daífteadcs para a inativaçâo viral Os meios condicionados clarificados foram processados em relação a uma proteína recornbínante A (rProteín A), coluna de cromatografla MabSeled. SuRe para capturar o produto. A inativaçâo viral com pH baixo foi realizada em seguida. O eluato de MabSelect da rFkoteína A inativada viral foi, então, filhado através de um adsorvedor de membrana Q Sartobind (QMA) para a purificação de parvovirus acidental O produto foi postenormente purificado por cromatografia de modo misto Capto MMC seguido por cramatogratia de interação hidrofõbica usando Fenil Sefarose β F^:ast Flow Hi Sub (Fenil Safarose), O eluato de Fenil Sefarcse foi, então, filtrado através de filtros de remoção de virus Planova 15N. então concentrado e difiltrado por ultrafiitração (UF). Q retentado UF posteriormente é formulado pano o tampão de formulação final em uma concentração de produto de 100 g.T e armazenado a -70 ¹⁵C

O processo do ciclo 2 (nomeadamente, modo misto seguido por HlC feníla) provou ser eficaz para aumentar a produção e purificação de LTβ-R-lg para a fabricação, por exemplo, escala de 15000 L. Um resumo das percentagens de redução de inativo 1. inativo 2 e as percentagens de agregados utilizando o processo de ciclo 2 é fornecido na Tabela 9.

1................iili............	Mistura após colheita e cultura celular	Após a coluna da proteína A	Após coluna HlC do modo misto	Após coluna HlC fenila
Ag regado	30-3591	- 28%	8-24%	< 1 %
Inativo 1	-6%	-6%	< 1 %	<1%
Inativo 2	- 13%	- 13%	- 13%	<1%

^ouivalenies

A presente invenção fornece, entre outras coisas, melhores métodos e composições relacionadas para as formas purificadas, ativas de proteínas IG de fusão, incluindo fusões LT-p-R-Fc. Embora modalidades especificas da invenção sejam discutidas, a especificação acima è ilustrativa e 5 não restritiva. Muitas variações da invenção ficarão evidentes para aqueles versados na técnica após a revisão deste relatório. O escopo completo da invenção deve ser determinado para referência às reivindicações, juntamente com seu escopo completo de equivalentes, e as especificações, juntamente com ta?s variações

Iodas as publicações e patentes mencionadas neste documento são incorporadas para referência, na sua totalidade, come se cada publicação individual ou patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada para referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 Composição compreendendo proteínas de fusão de ,munoglobulina do receptor de linfotoxina P (LT-P-R-lg) racterizada pelo fato de que menos que 6% das protemas de fusão de _R.|g são biologicamente inativas, inclusive da primeira forma .nat,va da pre. teina de fusão LT-P-R-lg (.natbra-D e a segunda forma a pr^ fusão LT-p-R-lg (lnativa-
2), e menos que 2% das protemas de fusão ,^R.'_g são agre^_ao , _—θ _ή pelo fato de que menos que 5% das proteínas de fusão de LT-β R10 *>° bLogicamente inativas, preferenciaimente menos que _1% das protemas e fusão de LT-p-R-lg são bioiogicamente inativase. mais preference θ que 0 5,0 das proteínas de fusão de LT-p-R-lg são bioíog.camente inativas.
3 Composição de acordo com qualquer a reivindicação 1 ou 2, caracterizada peio tato de que compreende menos que 2,o das nar fusão de LT-p-R-lg agregadas, e preterenciaimente, menos que t /. pro teínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas.
4 Composição de acordo com qualquer uma das reMnd.caço t _a 3 caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de LT-P-R-lg com preende uma região constante Ig de um isotipo IgGt.
6 Composição de acordo com qualquer uma das reivmd.caço 4 _a 4, caracterizada peio fato de que a proteína de fusão de L^R-lg compreende a sequência de aminoãcido apresentada na SEQ D NC . Z

6 Composição de acorde com qualquer uma das re.v.nd.caço t a 5, caracterizada peio fato de que as proteínas de fusão de LT-P-R-> logicamente ativas podem inibir a liberação de IL-8 em um ensa.o de .n.b.çao de IL-8 in vitro padrão.
7 Composição farmacêutica caracteriza a p compreende a composição como definida em qualquer uma das ..vnd,cações 1 a 6 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica de acordo com a re.v.nd.caçao 7, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma desordem au-
9 composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8. caracterizada pelo fato de que a desordem autoimune é esclerose múltipla.
10 Composição farmacêutica dê acordo com a reiv.nd.caçao . caracterizada pelo fato de que a desordem autoimune é escierose mOlnpla progressiva secundária ou esclerose múltipla remetente, recorrente.
11. Método para separar proteínas de fusão de imunoglobuirna de receptor de linfotoxina β (LT-P-R-lg) biologicamente ativas de protanas de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente inativas, inclusive da, pnmeira orm ——^de XX—3“ da proteína de fusão ίΤ-β-R-lg (mativa-2). caractenzao co^mPree^de _{aplicar carrega}r uma mistura compreendendo proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas e proteínas de fusão de LT-P-R- g K> o gicamente inativas sobre uma resina de cromatografia de interação de butiia _h,drofobica(HIQe^^ _{oom uma m} gradiente de sal para obter um primeiro eluato compreendendo prote.nas e fusão de LT-_P-R-lg biologicamente ativas e um segundo eluato compreendendo proteínas de fusao de LT-_P-R-lg biologicamente ativas.

Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza
12.

Io fato de que:

(a) o gradiente de sal é uma etapa ou gradiente continuo.

(b) (C) gradiente de sal compreende NaCI de 1,6M a 0.0 M;

eluato compreendendo proteínas de fusao de LTé obtido pela lavagem da resina HIC com uma ο

ο segundo β-R-lg biologicamente ativas é obtido pe_ia .avay— ---------lavaaem de NaCI a 1,5 M, (d) o gradiente de sal compreende Na₂SO₄ de 0,6 Ma , (e) o gradiente de sal é uma etapa de gradiente compreendendo aumentos de Na₂SO₄ variando de 0,6 M a 0.0 M.
13. Método de acordo com qualquer a reivmdicaç caracterizado pelo fato de que:

(·,) a resina de butila HIC tem um tamanho de poro de 600 a

A;

_{(ii) a} resina de butila HIC tem uma capacidade de carga de cerca de 8 mg a cerca de 20 mg de proteína/L de resina; _ _(iii) o segundo eluato compreendendo proteínas de fusão de LTp-R-lg biologicamente ativas compreende menos que 2% de proteínas e fimão de LT-p-R-lg biologicamente inativas;

) o segundo eiuato compreendendo proteínas de fusão de LTp-R-lg biologicamente ativas compreende menos que 1% de proteínas de fusão de LT-B-R-lg biologicamente inativas.
14. Método para separar proteínas de fusão de imunoglobul.n de receptor de linfotoxina p (LT-P-R-lg) biologicamente ativas, nao agregade recepror aoreqadas, caracterizado pelo fato das, de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregaoa , de que compreende:

aplicar carregar uma mistura compreendendo proteínas de fusão _de LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e proteínas de fusão de X ig agregadas sobre uma resina de cromatografia de ínteragao e fenila hidrofóbica (HIC), em que a resina tem uma capacidade de carga en cerca de 10-20g de proteína/L de resina e uma ^{3 31 Cm}' ' pôr em contato a resina com uma soiução a uma taxa de fluxo de cerca de 50 a 150 cm/h para obter um primeiro eluato compreen proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e u segundo eluato compreendendo proteínas de fusão de LT-p-R-lg agrega f 5. Método de acordo com a reivindicação 14. caractenzado peto fato de quer* θ _compreendendo proteínas de fusão de LTp-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, compreende menos que . de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas; ou _(b) o primeiro eluato compreendendo proteínas de fusão LTp-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, compreende menos que o altura de leito de cerca de 30 _de proteínas de fusão de LT-P-R-lg agregadas.

₁₆ Método para separar proteínas de fusão «nu 9 . _R z_LT B R-lg) biologicamente ativas de proteína ha rpceotor de Imfotoxina β (Ll-|5 k ig; y f ão de LT R-R-lg biologicamente inativas, inclusive da primei de fusão de LT β Ig b θ _{a segunda forma} in at .va inativa da proteína ^e usao da proteína de fusão LT-p-R-lg (mauva _hpelo fato ^de compreendendo proteínas de fusão de LTmente inativas sobre uma resina „_rntPÍnas de fusão de drofóbica (HIC) sob condições que permitem que as pro ^LW“ — — P—o um gradiente de sal P— “^maXX:ZXe:toda^i.)_So.eumas_{X:: na} HIC sob condições que permitem que as proteínas de fusão de bioiogicamente_{reslna Hl}C _com uma solução para obter um segundo eiuato adiciona.mente enriquecido com a presença proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas oara separar, deste modo, as proteínas de fusão ^P de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas das proteínas biologicamente inativas.

17.

Io fato de que:

(a) nuo; ou

Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado peo gradiente de sai (ü) ou é uma etapa ou um gradiente conti(b) a resina de butila HIC compreende uma estrutura de metacnlato hidroxilado. 16 ou 17, caracteri- ₁₈. Método de acordo com a reivind.caçao 16 zado pelo fato de que.

A;

_fl) a resina de butita HIC tem um tamanho de poro de 600 a 750 _(li) o primeiro eiuato compreende menos que 2% de uma primeira forma da proteína de fusão de LT-P-R->₈ inativa (Inativa-U (iii) o primeiro eiuato compreende menos que 1 A de um P . ' ri_o fncão de LT-B-R-lg inativa (lnativa-1), XC: lo compreende menos que ,A de uma segunda forma da proteína de fusão de LT-p-R-lg inatwa> (Inatwa).

_M o segundo eiuato compreende menos que 1 A de gunda forma da proteína de fusão de LT-p-R-lg mat™ _n
19. Método de acordo com qualquer uma das rey nd.c g _{a 18}, caractedzado peio fato de que a — dede LT-P-R-lg na mistura é de pelo menos 300 mg/L. pe ou pelo menos 1350rmgrt- _{re|Vindlcaç6es} 11 _a 19 caracterizado pelo fato de que o volume da mistura é de pelo menos 5000 L, pelo menos 10000 L, ou pelo menos 15000 L.
21. Método para separar prote.nas de fusão de L μ 9 “··“· »X·· -— mente inafvas sobre um _biologicamente ativas se liguem tem que as proteínas de fusão de U P X « à resina de modo misto; _a„ _LT β-R-lg biologicamente ativas in eluir as proteínas de fusão de LI-p κ'9 ^u a da resina de modo misto da efapa í) com uma soíuç₌ obter ° P- _ eiuato enriquecido pela presença de prote.nas de fusão de P gicamente ativas; _{sobre uma resina de} iiil aolicar o primeiro eluato da etapa ) cromatografia de interação hidrofébíca (HIC) sob condições que perm, em que as proteínas de fusão de LT-6-R-lg biologicamente ativas se liguem à resina HIC; e iv) eluir as proteínas de fusão de ΕΤ-β-R-lg biologicamente ativas da etapa iii) com uma solução para obter um segundo eluato adicionalmente enriquecido com a presença de proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, separando, desse modo, proteínas de fusão de LT-p-RIg biologicamente ativas das proteínas de fusão de LT-8-R-lg biologicamente inativas.
22. Método para separar proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, de proteínas de fusão de LT-P-R-lg agregadas, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de:

i) aplicar uma mistura compreendendo proteínas de fusão de LTβ-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e proteínas de fusão de LT-βR-lg agregadas, em que mais do que cerca de 30% ou cerca de 30% das proteínas de fusão de LT-p-R-lg na mistura são agregadas, sobre uma resina de modo misto sob condições que permitem que as proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas se liguem à resina de modo misto;

ii) eluir as proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas da resina de modo misto da etapa i), empregando uma solução para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteínas de fusão de LTβ-R-lg biologicamente ativas;

iii) aplicar o primeiro eluato da etapa ii) sobre uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão Ig biologicamente ativas se liguem à resina HIC; e iv) eluir as proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas da etapa iii), empregando uma solução para obter um segundo eluato adicionalmente enriquecido com a presença de proteínas de fusão de LT-βR-lg biologicamente ativas, separando, desse modo, as proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, das proteínas de fusão de ίΤ-β-R-lg agregadas.
23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a resina de modo misto é caracterizada por ter tanto capacidade de interação iônica quanto capacidade de interação hidrofóbica.
24. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a mistura é aplicada sobre a resina de modo misto a um pH de cerca de 5,0.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a resina de modo misto aplicada é lavada com um tampão tendo um pH de cerca de 7,0 a 7,2 antes da etapa (ii).
26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o tampão é Bis Tris.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que a resina HIC é uma resina de fenila.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de quei (a) a resina de fenila é fenil sefarose;

(b) a LT-p-R-lg biologicamente ativa é eluída a partir da resina de fenila com sulfato de amônio, e preferencialmente com sulfato de amônio de 0,3 a 0,5 M; ou (c) a taxa de fluxo da resina de fenila é de 50 a 150 cm/h, e preferencialmente cerca de 100 cm/h.
29. Método para remover pelo menos 97% de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas de uma mistura compreendendo proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as etapas de:

i) aplicar a mistura sobre uma resina de modo misto sob condições que permitem que as proteínas de fusão de ΤΤ-β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, se liguem à resina de modo misto;

ii) eluir as proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, a partir da resina de modo misto da etapa i) com uma solução para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteínas de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativas, não agregadas;

iii) aplicar o primeiro eluato da etapa ii) sobre uma resina de cromatografia de interação hídrofôbica (HIC) sob condições que permitem que as proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, se liguem à resina HIC; e iv) eluir as proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, da etapa iii) com uma solução para obter um segundo eluato adicionalmente enriquecido com a presença de proteínas de fusão de LT-P-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, para remover, desse modo, pelo menos 97% de proteínas de fusão de LT-P-R-lg agregadas da mistura compreendendo proteínas de fusão de LT-p-R-lg biologicamente ativas, não agregadas, e proteínas de fusão de LT-P-R-lg agregadas.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o primeiro eluato compreende menos que 25%, menos que 20%, menos que 15%, ou cerca de 10% de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas.
31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o segundo eluato compreende menos que 2% de proteínas de fusão de LT-P-R-lg agregadas ou menos que 1% de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, pôr em contato a mistura com a proteína A recombinante (rProteína A) antes da etapa (i).
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a mistura posta em contato com a Proteína A recombinante é um sobrenadante da cultura de célula de mamífero.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que:

(a) o sobrenadante da cultura de célula de mamífero é obtido de células mamíferas cultivadas a 28°C; ou (b) o sobrenadante de cultura de célula compreende um tensoativo não iônico, e preferencialmente o tensoativo não iônico é Triton X-100.
35. Método para preparar uma composição compreendendo pro teínas de fusão de Ι-ΊΓ-β-R-lg biologicamente ativas, caracterizado pelo fato de que a composição compreende menos que 1% de uma primeira forma inativa da proteína de fusão de LT-p-R-lg (lnativa-1), menos que 1% de uma segunda forma inativa da proteína de fusão de LT-3-R-lg (lnativa-2), e menos que 1% de proteínas de fusão de LT-p-R-lg agregadas, o referido método compreendendo as etapas de:

i) obter um sobrenadante de cultura de célula de um sistema de cultura de célula de mamífero compreendendo uma célula hospedeira de mamífero transformada com DNA codificando a proteína de fusão de LT-βR-ig;

ii) pôr em contato o sobrenadante de cultura de célula com Proteína A recombinante (rProteína A) para obter uma mistura de proteína de fusão de ΡΤ-β-R-lg;

iii) aplicar a mistura de proteína de fusão de ίΤ-β-R-lg de ii) sobre uma resina de modo misto em um pH de cerca de 5,0 sob condições tais que as proteínas de fusão de ΕΤ-β-R-lg se liguem à resina de modo misto;

iv) lavar a resina de modo misto com um tampão tendo um pH de cerca de 7,0 a 7,2;

v) pôr em contato a resina de modo misto da etapa iii) com uma solução para obter um primeiro eluato enriquecido com a presença de proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg biologicamente ativa;

vi) aplicar o primeiro eluato da etapa iv) sobre uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) sob condições que permitem que a proteína de fusão de ΙΤ-β-R-lg se ligue à resina (HIC); e vii) pôr em contato a resina HIC da etapa vi) com uma solução para obter um segundo eluato adicionalmente enriquecido com a presença de proteína de fusão de Ι-Τ-β-R-lg biologicamente ativa, em que o segundo eluato compreende menos que 1% da primeira forma inativa da proteína de fusão de ίΤ-β-R-lg (lnativa-1), menos que 1% da segunda forma inativa da proteína de fusão de LT^-R-lg (lnativa-2), e menos que 1% de proteínas de fusão de LT^-R-lg agregadas.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pôr em contato a mistura com um adsorvente de membrana de troca de ânion antes da etapa (i).
37. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 97% de proteína de fusão de ίΤ-β-R-lg biologicamente ativa e 3% ou menos da proteína de fusão de Ι-Τ-β-R-lg biologicamente inativa, inclusive da primeira forma inativa da proteína de fusão ΙΤ-β-R-lg (inativa-1) e a segunda forma inativa da proteína de fusão LT-p-R-lg (inativa-2), preparada por qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações 11 a 35.
38. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma desordem autoimune em um indivíduo
39. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a desordem autoimune é esclerose múltipla.
40. Uso de proteínas de fusão de imunoglobulina do receptor de linfotoxina β (LT-p-R-lg) biologicamente ativas, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma desordem autoimune.
41. Uso de proteína de fusão Ι,Τ-β-R-lg biologicamente ativa, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para tratar uma desordem autoimune em um indivíduo.