KR20100128315A - 정제된 면역글로불린 융합 단백질 및 그의 정제 방법 - Google Patents

정제된 면역글로불린 융합 단백질 및 그의 정제 방법 Download PDF

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조나단 로메로
베르너 마이어
스티븐 노타니콜라
데이비드 에반스
리차드 맥니븐
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바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 면역글로불린 (Ig) 융합 단백질의 제조 동안에 불순물을 분리하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제거될 수 있는 불순물의 예는 상기 Ig 융합 단백질 및/또는 응집물의 불활성 형태를 포함한다.

Description

정제된 면역글로불린 융합 단백질 및 그의 정제 방법{PURIFIED IMMUNOGLOBULIN FUSION PROTEINS AND METHODS OF THEIR PURIFICATION}
승인된 치료제로서 생물제제의 증가하는 허용도를 고려할 때, 이들 종류의 약물의 세부적인 특성화가 중요하다. 예측하지 못한 생성물 고장 또는 불순물의 존재는 환자의 안전뿐만 아니라 치료 효능을 위태롭게 할 수 있다. 생물제제 제조 동안 발견되는 불순물의 예는 생성물의 응집물을 포함할 수 있다. 제약학적 조성물에서, 응집물은 이들이 면역원성일 수 있고 생체내 사용을 위한 안전성을 배려하는 한 바람직하지 않을 수 있다. 응집물은 또한 환자에게서 생산된 항체를 중화시키는 것으로 인해 생성물의 생체 내 안전성을 감소시킬 수 있다.
더욱이, 불활성 단백질이 제조 과정 중에 만들어질 수도 있다. 불활성 단백질은 제조 공정 중에 부정확한 폴딩으로부터 초래될 수 있다. 예를 들면, US 2002/0039580 (Browning et al.)는 포유동물의 세포에서 발현되는 경우 림포톡신 β 수용체 면역글로불린 (LTβR-Ig) 융합 단백질의 활성 및 불활성 형태인 2가지 형태를 기재한다. US 2002/0039580는 또한 Ig 융합 단백질 생산 중에 세포 배양 온도를 감소시킴으로써, 제조 중인 불활성 분자의 백분율이 감소될 수 있음을 교시한다. 그 공고 문헌은 리간드에 결합하는 어떠한 능력도 없는 LTβR-Ig의 단 하나의 불활성 형태를 기재하고 있다.
생물제제 제조에서, 그러한 생성물 관련된 불순물은 정제라는 도전 과제를 제시할 수 있다. 이들 불순물은 종종 관심을 끄는 치료학적 단백질의 활성 형태에 필적할 만한 특성을 갖기 때문에 식별하기 곤란하고, 그에 따라 검출하기 곤란할 수 있다. 더욱이, 그러한 불순물이 식별되는 경우조차, 약품으로부터 불순물의 분리는 난해할 수 있다. 따라서, 생물제제 생산 및 정제 공정 동안 존재할 수 있는 생성물-관련된 불순물을 식별할 뿐만 아니라, 일단 식별된 불순물을 제거하기 위한 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 포유동물의 세포 배양에서 생물제제의 발현 동안 발생되는 불순물로부터, 예 CHO 세포로부터 항체 기반 생물제제, 예, LT-β-R-Ig 융합 단백질을 정제하는 문제를 다루고, 그에 따라 결과의 조성물은 제약학적 사용을 위해, 대량의 단백질의 제조 가능성 및 순도의 견지 모두에서 적합하다.
본원에 기재된 바와 같이, 포유동물 세포에서 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 발현은 LT-β-R-Ig 및 LT-β-R-Ig 응집물의 2가지 불활성 형태를 생성한다. 그러한 불순물은 환자에게서 사용하기에 충분한 순도를 제공하기 위해 LT-β-R-Ig의 생물학적 활성 단량체로부터 분리될 수 있다. LT-β-R-Ig의 불활성 형태는 정제 공정에서 독특한 도전 과제를 제시한다. 예를 들면, 본원에 기재된 LT-β-R-Ig의 2가지 불활성 형태는 예를 들면 크기 및 전하에 관련하여 융합 단백질의 활성인 단량체 형태에 매우 닮았다. 또한, LT-β-R-Ig의 생산이 확대되어 (치료제의 제조에 요구되는 바의) 수율을 증가시키고, 높은 수율의 응집된 LT-β-R-Ig가 생산된다. 따라서, 활성인 단량체성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 임상적 용도에 필요한 충분한 농도 및 순도로 생산하기 위해, 응집화를 최소화하고, 단백질의 불활성 형태의 존재를 최소화시키고, LT-β-R-Ig 융합 단백질 손실을 최소화시키는 공정이 요구되었다. 본 발명은 이러한 복잡한 문제에 대한 해결책을 제공한다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 항체 기반 생물제제, 즉, 면역글로불린 (Ig) 융합 단백질의 정제 중에 다중 생성물 관련된 불순물을 제거할 수 있는 고 분해능 소수성 상호반응 크로마토그래피 (HIC) 공정을 제공한다. 본 발명은 단백질의 불활성 형태들로부터 림포톡신 β 수용체 면역글로불린 (LTβR-Ig)과 같이 Ig 융합 단백질의 활성 형태를 정제하는 수단을 제공한다. 본 발명의 추가의 국면은 정제된 Ig 융합 단백질 조성물 (예, 완전한 생물제제 활성을 갖지 않는 부적합하게 폴딩된 변종인 다른 단백질, 및 포유동물의 세포에서 단백질 발현으로부터 종종 초래되는 단백질 응집물와 함께 최소량의 오염물을 가짐)을 포함한다. 본 발명은 추가로 30% 이상의 불순물, 예를 들면 단백질 및/또는 단백질 응집물의 불활성 형태를 갖는 포유동물의 세포 배양 (예, 바이오리액터에서 배양액으로부터 대량의 부피의 공급 원료)으로부터 단백질 혼합물, 예 출발 공급 원료를 정제하기 위한 수단을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 50% 이상의 불순물, 예, 약 35%의 응집물 단백질 및 약 19%의 불활성 단백질을 갖는 출발 단백질 혼합물을 정제하는 수단을 제공한다.
본 발명은, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계, 및 상기 수지를, 염 구배, 예를 들면 1.6 M 내지 0.0 M의 NaCl을 포함하는 용액과 접촉시켜, 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물 및 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물을 얻는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린 (LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물은 HIC 수지를 1.5 M의 NaCl 세척액으로 세정함으로써 획득된다. 일 구체예에서, 염 구배는 일 단계 또는 연속 구배이다. 일 구체예에서, 염 구배는 0.6 M 내지 0.0 M의 Na2SO4를 포함한다. 일 구체예에서, 염 구배는 일 단계 구배 및 컬럼 스트립이 이어지는 0.4 내지 0.5 Na2SO4의 역 구배이다. 일 구체예에서, 순차적 Na2SO4 단계 구배는 먼저 불활성-1 (세척액 분획에서), 이어서 활성인 단량체성 LT-β-R-Ig (용출 분획), 이어서 불활성-2 (스트립 분획)를 제거하기 위해 사용된다. 일 구체예에서, 부틸 HIC 수지는 600 내지 750 Å의 공극도를 갖는다. 일 구체예에서, HIC 수지는 약 8 g의 단백질/수지 L의 적재 용량을 갖는다. 일 구체예에서, HIC 수지는 Na2SO4의 존재 하에 약 20 g의 단백질/수지 L의 적재 용량을 갖는다. 일 구체예에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물은 2% 미만의 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 일 구체예에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물은 1% 미만의 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
본 발명은, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을, 약 10-20 g 의 단백질/1 L의 수지의 적재 용량 및 약 30 내지 31 cm의 층 높이를 갖는 페닐 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계, 및 상기 수지를 약 50 내지 150 cm/hr(센티미터/시간)의 유속으로 용액과 접촉시켜, 생물학적으로 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물을 얻는 단계를 포함하는, 비응집된 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린 (LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 수지는 약 100 cm/hr의 유속으로 용액과 접촉한다. 일 구체예에서, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물은 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 일 구체예에서, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물은 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한, 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린 (LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법을 방법을 제공하는데, 상기 방법은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 부틸 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 상기 부틸 HIC 수지를, 염 구배를 포함하는 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계; 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 제2 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 제2 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및 상기 제2 HIC 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계를 포함하며, 이로써 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리한다. 일 구체예에서, 부틸 HIC 수지는 히드록실화된 메타크릴레이트 중합체 화학 주쇄를 포함한다.
일 구체예에서, 부틸 HIC 수지는 600 내지 750 Å의 공극도를 갖는다. 일 구체예에서, 제1 용출물은 2% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1)를 포함한다. 일 구체예에서, 제1 용출물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1)을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 용출물은 2% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2)을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 용출물은 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2)를 포함한다.
본 발명은 또한 혼합 모드(mixed mode) 수지를 사용하여 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계를 포함한다. 이 방법은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 획득하기 위해 용액으로 혼합 모드 수지로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출시키는 단계, 및 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에 제1 용출물을 소수성 상호반응 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및 마지막으로 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 획득하기 위해 용액으로 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 혼합 모드 수지는 LT-β-R-Ig의 불활성-1 형태를 분명히 하고, LT-β-R-Ig의 응집된 형태를 부분적으로 분명히 하기 위해 사용되는 전-용출 세정 단계와 접촉한다. 그러한 방법은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리한다.
본 발명은 일 구현예에서 혼합 모드 수지를 사용하여 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 방법을 추가로 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 약 30% 이상이 응집되어 있는, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계; 상기 단계 i) 의 혼합 모드 수지로부터의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용액을 사용하여 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계; 상기 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및 상기 단계 ⅲ)의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용액을 사용하여 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 혼합 모드 수지는 불활성-1 LT-β-R-Ig를 선명히 하고, LT-β-R-Ig의 응집된 형태를 부분적으로 선명히 하기 위해 사용된 전-용출 세척 단계와 접촉한다. 그러한 방법을 사용하여, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리될 수 있다.
일 구체예에서, 혼합 모드 수지는 이온 상호 반응 능력 및 소수성 상호 반응 능력 모두를 갖는 것으로서 특성화된다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 약 5.0의 pH에서 혼합 모드 수지 상에 적재된다. 훨씬 또 다른 구체예에서, 적재된 혼합 모드 수지는 단계 (i) 전에 (제1 용출 단계 전에) 약 7.0 내지 7.2의 pH를 갖는 완충액, 예, 비스 트리스 또는 시트르산 나트륨으로 세척된다.
일 구체예에서, HIC 수지는 페닐 세파로스를 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는 페닐 수지이다. 일 구체예에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 황산암모늄을 사용하여 페닐 수지로부터 용출된다. 일 구체예에서, 황산암모늄의 농도는 0.31, 0.32. 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 및 0.49 M을 포함하여 0.3 내지 0.5 M 범위이다. 일 구체예에서, 유속은 50 내지 150 cm/hr이다. 일 구체예에서, 유속은 100 cm/hr이다. 또 다른 구체예에서, 유속은 130 내지 170 cm/hr이다.
본 발명은 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물로부터 존재하는 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 적어도 97%를 제거하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 이 방법은 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 혼합물을 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계; 상기 단계 i)의 혼합 모드 수지로부터의 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용액을 사용하여 용출하여, 상기 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계; 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용액을 사용하여 용출하여, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물로부터 적어도 97%의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 제1 용출물은 25% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제1 용출물은 20% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 훨씬 또 다른 구체예에서, 제1 용출물은 15% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 더욱 또 다른 구체예에서, 제1 용출물은 약 10%의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 용출물은 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제2 용출물은 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 정제 방법은 LT-β-R-Ig 의 원하지 않는 형태 또는 세포 기반 제조로부터 수득한 다른 분순물의 존재를 최소화하는 방식으로 제조되었던 조성물 또는 정제를 용이하게 할 제제를 포함하는 조성물에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 구체예에서, 방법은 먼저 혼합물을 재조합 단백질 A (r단백질 A)과 접촉시키는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 재조합 단백질 A와 접촉된 혼합물은 포유동물 세포 배양 상청액이다. 하나의 구체예에서, 포유동물 세포 배양 상청액은 28℃에서 배양된 포유동물 세포로부터 얻는다. 하나의 구체예에서, 세포 배양 상청액은 트리톤 X-100와 같은 비이온성 계면활성제를 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 방법은, 혼합물을 혼합 모드 수지 상에 적재하기 전에, 혼합물을 음이온 교환막 흡수체와 접촉시키는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 혼합물은 바이러스 불활성화 단계 (예를 들어, 낮은 pH 바이러스 불활성화) 후에 음이온 교환막 흡수체와 접촉된다. 하나의 구체예에서, 혼합물은, 재조합 단백질 A (r단백질 A)와 접촉된 후에 음이온 교환막 흡수체와 접촉된다.
본 발명은 또한 생물학적 활성 단량체 형태 LT-β-R-Ig 융합 단백질에 대해 실질적으로 농축된 정제된 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 50% 미만의 응집물을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 감소된 양의 LT-β-R-Ig 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 40% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 30% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 20% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 10% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 7.5% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 3% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 1% 미만의 응집물을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 검출 불가능한 양의 응집물을 포함한다.
또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 감소된 양의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 20% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 10% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 7.5% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 4% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 3% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 검출 불가능한 양의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 정제된 조성물은 6% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 4% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 3% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 1% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 검출 불가능한 양의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
또 하나의 구체예에서, 본 발명의 정제된 조성물은 개시 조성물에 존재하는 것으로부터 감소된 하나 이상의 응집물 형태, 불활성-1, 및/또는 불활성-2의 레벨을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 7.5% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 7.5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 7.5% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 5% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 3% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 3% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 3% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 2% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
이들 생성물에 의한 오염의 레벨은 동일하지 않고, 상기에 기재된 예는 단지 예증되는 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 10% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 20% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 5% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 10% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 2% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 10% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제된 조성물은 5% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 5% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함한다.
하나의 구체예에서, 방법은 세포 배양 상청액을, 상기 LT-β-R-Ig-융합 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환된 포유동물 숙주세포를 포함하는 포유동물 세포 배양 시스템으로부터 얻는 단계; 상기 세포 배양 상청액을 재조합 단백질 A (r단백질 A)와 접촉시켜, LT-β-R-Ig 융합 단백질 혼합물을 얻는 단계; LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하는 조건 하에서, 상기 ⅱ)의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 혼합물을 약 5.0의 pH에서 상기 혼합 모드 수지상에 적재하는 단계; 상기 혼합 모드 수지를, 약 7.0 내지 7.2의 pH를 갖는 완충용액으로 세척하는 단계; 상기 단계 ⅲ)의 혼합 모드 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계; LT-β-R-Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 iv)의 제1 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및 상기 단계 vi)의 HIC 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 그와 같은 방법으로, 상기 제2 용출물이 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2), 및 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물을 얻는다.
하나의 구체예에서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도는 적어도 300 mg/L이다. 하나의 구체예에서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도는 적어도 800 mg/L이다. 하나의 구체예에서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도는 적어도 1350 mg/L이다.
하나의 구체예에서, 혼합물의 부피는 적어도 5000 L이다. 하나의 구체예에서, 혼합물의 부피는 적어도 10000 L이다. 하나의 구체예에서, 혼합물의 부피는 적어도 15000 L이다.
본 발명은 실질적으로 응집물이 없는 생물학적 활성 림포톡신-β-수용체 면역글로불린 (LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 하나의 구체예에서, LT-β-R-Ig 융합 단백질의 6% 미만은 생물학적 불활성이고, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 2% 미만은 응집되어 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 5% 미만은 생물학적 불활성이다. 하나의 구체예에서, LT-β-R-Ig 융합 단백질의 3% 미만은 생물학적 불활성이다. 하나의 구체예에서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 1% 미만은 생물학적 불활성이다. 하나의 구체예에서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 0.5% 미만은 생물학적 불활성이다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 1% 미만은 응집되어 있다. 하나의 구체예에서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 1% 미만은 생물학적 불활성이고, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 1% 미만은 응집되어 있다.
하나의 구체예에서, LT-β-R-Ig 융합 단백질은 IgG1 아이소타입의 Ig 불변 영역을 포함한다. 하나의 구체예에서, LT-β-R-Ig 융합 단백질은 서열 번호 1에 나타나 있는 LT-β-R의 세포외 도메인을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 단량체성이다. 본 발명의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 LTβ에 결합할 수 있고, LTβR 의 LTβ에의 결합에 의해 유도되는 세포에서 생물학적 활성을 차단할 수 있다. 하나의 구체예에서, 이는 표준 시험관내 IL-8 억제 분석에서 IL-8의 생산을 억제하고/하거나 IL-8 방출을 차단하기 위한 LT-β-R-Ig의 능력에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 세포를 발현시키는 LTβR는 LTα1β2 및 LT-β-R-Ig와 접촉되고, (적절한 대조 예를 들어, 결합 분자의 부재와 비교된 바와 같이) 세포에 의한 IL-8 방출을 억제하기 위한 LT-β-R-Ig의 능력이 측정된다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 97%의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (즉, 불활성-1, 불활성-2, 또는 모두 부족)을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 단량체성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (즉, 실질적으로 응집물 부족)을 포함하는 조성물을 포함한다. 그와 같은 조성물은 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 크론(Crohn)병, 또는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다.
도 1은 주기-1-1의 공정의 개관을 제공하는 도면을 제공이다.
도 2는 LTβR-Ig 융합 단백질의 불활성 형태 1 및 2가 용출되는 조건을 포함하여, 주기-1-1의 HIC-1 부틸 수지의 결과를 보여주는 도면이다.
도 3은 HPLC를 사용하는 공정 중간체의 개관을 기재하는 도면이다.
도 4는 부틸-650M LTβR-Ig 정제의 용출 분획 중의 활성 및 불활성-2 백분율을 그래프로 나타내는 도면 (주기 1-1)이다. 1.65 M의 NaCl의 적재 및 세척 농도에서 LTβR-Ig 정제. 컬럼은 컬럼 8 mg/mL 수지로 이중으로 적재되었다. 용출은 0.7 M의 NaCl을 사용하여 수행되었고, 용출 분획은 순차로 수집되었고 (막대 그래프는 각각의 분획으로부터 데이터를 보이고, 누적되지 않음), LTβR-Ig 형태가 측정되었다.
도 5는 주기-1-2의 공정의 개관을 제공하는 도면이다.
도 6은 주기 1-2의 단계 및 구배 세척 전략을 나타내는 도면이다.
도 7은 주기-1의 3가지 분리 방법, 즉, 단백질 A, HIC-1 (부틸), 및 HIC-2 (페닐)에 이어 불순물 분해능의 개선을 요약하는 표를 제공하는 도면이다.
도 8은 적재 효과, 층 높이, 및 유속을 포함하여, HIC-2 (페닐) 단계에 의한 응집물 간극을 기재하는 도면. 도 8A는 페닐 단계 후 응집물 및 활성 LTβR-Ig 융합 단백질의 백분율에 대한 적재 효과를 기재하는 도면. 도 8B는 주기-2 HIC (페닐) 단계의 발달로부터 활성 LTβR-Ig (활성 단량체) 수율의 백분율에 대한 층 높이 및 속도의 효과를 기재하는 도면이다.
도 9는 주기-2의 공정의 개관을 제공하는 도면이다.
도 10은 LTβR-Ig 융합 단백질의 개략도를 제공하는 도면이다.
도 11a 및 11b는 혼합 모드 컬럼을 위한 작동 조건을 기재하는 도면이다.
도 12는 주기-2의 3차 컬럼을 위한 크로마토그래피 조건을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 13은 15000 제조에서 변형된 다운스트림 공정의 주요 성능 특징을 기재하는 표를 제공하는 도면이다.
본 명세서에 기재된 본 발명을 완전히 이해하기 위해, 하기의 상세한 설명이 제공된다.
I. 정의
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "활성" 또는 "생물학적 활성"란 동족 결합 파트너 (예를 들어, 수용체를 위한 리간드)에 결합할 수 있고 세포 관련 LTβR과 LT와의 결합의 생물학적 효과를 차단할 수 있는 단백질의 형태를 의미한다. 생물학적 활성의 정의에 단백질에 대한 생물학적 또는 면역학적 반응은 포함되지 않는다. 생물학적 활성은 특성화될 단백질의 타입에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 수용체 (또는 그의 가용성 형태)인 단백질은, 각 리간드에 결합할 수 있으면, 생물학적 활성이 있는 것으로 보여질 수 있다. 다르게는, 단백질은 단백질의 활성 형태에 특이적인 항체에 의해 결합될 수 있다. 또 하나의 구체예에서, 단백질의 생물학적 효과는 세포 기반 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 그와 같은 분석 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, LTβR 활성은 표준 IL-8 억제 분석을 사용하여 측정될 수 있다).
용어 "불활성" 또는 "생물학적 불활성"이란 동족 결합 파트너에 결합할 수 없고, 따라서 시스템에서 생물학적 반응을 변경할 수 없거나 생물학적 반응을 야기하기 위해 불충분한 친화력으로 결합하는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 수용체 또는 그의 가용성 형태의 경우에, 수용체의 불활성 형태는 리간드에 결합할 수 없고, 이에 따라 활성 형태의 생물학적 활성을 조정할 수 없다. 또 하나의 구체예에서, 수용체의 불활성 형태는 예를 들어 감소된 친화력으로 리간드에 결합할 수 있지만, 적절한 생물학적 반응을 일으키지 않거나, 또는 (가용성 형태일 때) 수용체의 세포 기반 형태와 그의 리간드와의 결합시에 변환된 생물학적 신호를 완전히 차단하는 것을 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 문구 "활성 단량체"이란 응집되지 않고, 디설파이드 결합을 연결된 LT-β-R-Ig의 2개의 사슬을 포함하는 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 의미한다. 활성 단량체의 예는 도 11에 제공된다. 따라서, 단량체는 비응집된 2개의 사슬 Fc 융합 단백질이다.
용어 "응집물"이란 미스폴딩(misfolding)된, 경성 단백질 그루핑(grouping) 또는 고분자량 물질 (단백질의 다량체 포함)을 의미한다. 하나의 구체예에서, 응집물이란 2개 초과의 사슬 Fc 융합 단백질을 포함하는 LT-β-R-Ig 단량체의 다량체 형태, 예를 들어, 이량체 또는 고차 다량체 형태 (사량체, 오량체)를 의미한다. 응집물은 생물학적 활성 또는 불활성일 수 있다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 중립 (비전하) 형태에서 또는 염으로서, 및 글리코실화, 측쇄 산화, 또는 인산화에 의해 변경되지 않는 또는 변경된 다양한 길이의 아미노산 서열을 의미한다. 어떤 구체예에서, 아미노산 서열은 전체길이 천연 단백질이다. 다른 구체예에서, 아미노산 서열은 전체길이 단백질의 더 작은 단편이다. 다른 구체예에서, 아미노산 서열은 면역글로불린 분자의 적어도 일부 및 제2 비-면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 키메라 단백질을 코딩한다. 하나의 구체예에서, 비-면역글로불린 분자는 분자의 생물학적 활성부, 예를 들어, 리간드의 수용체 결합 부분 또는 수용체의 리간드 결합 부분, 예를 들어, TNF 수용체 또는 그의 단편을 포함한다.
용어 "융합 단백질"이란 개별 펩타이드 주쇄를 통해 공유결합에 의해 연결된, 가장 바람직하게는 단백질을 발현시키는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현을 통해 산출된 2개 이상의 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 분자를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 도메인을 포함한다.
용어 "림포톡신-β 수용체" 또는 "LTβR"이란 림포톡신 알파 및 베타 사슬의 삼량체 복합체로 이루어진 표면 림포톡신 (LT)에, 및 리간드 LIGHT(림포톡신와 동족이고, 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 HVEM에 대한 단순 포진 바이러스 글리코단백질 D와 경쟁함) 에 결합하는 수용체의 TNF 패밀리의 멤버를 의미한다 (Crowe et al, 1994). LT-β-R 는 말초 면역 시스템의 개발 및 천연 면역 시스템에서 림프절과 비장에서의 이벤트(event)의 조절과 연관된다 (Ware et al, 1995; Mackay et al, 1997; Rennert et al, 1996; Rennert et al, 1997; Chaplin 및 Fu, 1998).
하나의 구체예에서, LTβR-면역글로불린 (LT-β-R-Ig) 융합 단백질은 LTβR 및 IgG 불변 영역, 예를 들어, Ig의 Fc 부분의 세포외 도메인의 리간드-결합 부분을 포함한다. LT-β-R-Ig 융합 단백질은 여포수지 세포의 기능적 상태에 대한 중요성을 갖는 표면 LT 리간드와 LTβR 사이의 신호전달을 차단할 수 있다 (Mackay 및 Browning 1998). 이러한 차단으로 더욱이, 설치류 모델에서 자가면역 질환이 감소하게 된다 (Mackay et al, 1998, U.S. Ser. No. 08/505,606 filed Jul. 21, 1995 및 U.S. Ser. No. 60/029,060 filed Oct. 26, 1996). LTβR의 서열은 서열 번호 1에서 제공된다:
인간 LTβR SEQ. (PUBMED AAH26262 및 P36941)
Figure pct00001
하나의 구체예에서, LT-β-R-Ig 융합 단백질은 인간 LT-β-R-Ig(예를 들어, 인간 LT-β-R 의 나머지 40-200, 35-200, 40-210; 35-220, 32-225, 또는 28-225을 포함할 수 있다)의 세포외 도메인의 모두 또는 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, LT-β-R융합 단백질은 서열 번호 1의 나머지 32-225로 대표되는 바와 같이 LT-β-R 분자의 세포외 영역을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 포함될 수 있는 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 예는 하기에 나타나 있다 (서열 번호 2):
Figure pct00002
(이탤릭체의 아미노산은 신호 서열을 나타내고; 밑줄 친 아미노산은 LT-β-R의 세포외 영역으로부터 유도된 서열을 나타내고; 진한 글자의 아미노산은 IgG Fc 서열을 나타낸다. LT-β-R 서열을 IgG-Fc 서열과 연결하는 발린은 인공적이고, LT-β-R 또는 IgG-Fc 서열으로부터 유도되지 않는다. 밑줄 친 서열은 LT-β-R의 세포외 도메인의 실질적인 부분이고 서열 번호 1의 아미노산 32 내지 225에 해당한다) 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 LT-β-R 융합 단백질은 신호 서열 없이 서열 번호 2에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함한다.
"표면 LT 리간드"이란 LTβR에 특이적으로 결합할 수 있는 그의 표면 LT 복합체 또는 유도체를 의미한다.
용어 "리간드 결합 도메인" 또는 "리간드 결합 부분"란, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 천연 수용체 (예를 들어, 세포 표면 수용체) 또는 그의 영역 또는 유도체를 의미하고, 이는 적어도 양적 리간드 결합 능력, 및 바람직하게는 상응하는 천연 수용체의 생물학적 활성을 보유한다.
용어 "면역글로불린 융합 단백질"이란 면역글로불린 불변 영역의 하나 이상의 부분, 예를 들어 CH1, CH2 또는 CH3 도메인 또는 그의 조합을 갖는 폴리펩타이드 (일반적으로 세포 표면 단백질의 세포외 도메인을 포함함)의 기능 부분의 융합을 의미한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드는 수용체의 TNF 패밀리의 멤버이다. Ig 분자의 부분은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgM, IgA 등을 포함하는 다양한 면역글로불린 아이소타입 중 어떤 것으로부터 유도될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 단백질은 면역글로불린 융합 단백질이다. 예를 들어, 융합 단백질은 수용체, 또는 그의 리간드 결합 부분, 및 이량체화 도메인, 예를 들어, Fc 도메인을 포함할 수 있다.
포괄적 용어 "면역글로불린"은 생물학적으로 구별될 수 있는 항체의 5개의 뚜렷한 클래스를 포함한다. 항체의 5개의 클래스 모두는 명확히 본 발명의 범위 내이고, 하기 고찰은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 관한 것일 것이다.
문구 "수용체의 TNF 패밀리"이란, (오스테오프로테게린(osteoprotegerin)의 경우에서처럼) 결합 또는 분비된 천연 막이든지 아니든지, 정규 TNF 패밀리 시스테인 브릿징(bridging) 패턴, 또는 리간드의 TNF 패밀리의 한정된 멤버에 결합하는 어떤 수용체를 갖는 수용체를 의미한다 (예를 들어, Banner et al 1993). 다른 구체예의 청구된 발명은 본 명세서에서 고찰된 방법으로 얻은 TNF 패밀리 수용체-Ig 융합물, 및 이를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
수와 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "대략" 및 "약"은, 달리 언급되지 않거나 문맥에서 분명하지 않으면, 일반적으로 수의 방향 (그 수의 초과 또는 미만)에서 10%의 범위 내인 수를 포함한다 (그와 같은 수가 가능한 값의 100% 를 초과하는 경우는 제외).
Ⅱ. 불활성 및/또는 응집된 Ig 융합 단백질의 상이한 형태의 분리
본 발명은 불활성 형태로부터 단백질의 활성 형태를 분리하고/하거나 응집물로부터 단백질의 활성 형태를 분리하여, LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 면역글로불린 (Ig) 융합 단백질의 정제된 활성 형태를 생산하기 위한 능력에 관한 것이다.
포유동물 세포에서의 Ig 융합 단백질의 발현이 불활성 Ig 융합 단백질의 다중 형태로 귀결될 수 있다는 것은 공지되어 있지만, 오염의 정도 및 융합 단백질을 알맞게 정제하기 위한 수단은 공지되어 있지 않다. 더욱 상세하게는, LT-β-R-Ig 융합 단백질은 원숭이 코스(cos)세포 또는 차이니즈 햄스터(Chinese hamster) 난소 세포에서 2개의 형태로 발현된다는 당업계에서 가르쳤다. 하나의 형태는 고친화력의 "활성" 형태를 갖는 리간드에 결합하지만, 다른 "불활성" 형태는 리간드에 결합하지 않는 것을 가르쳤다 (US 20020039580). 그러나, 사실상 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1 및 불활성-2)의 상이한 불활성 형태가 있다는 깨달음은 이전에는 공지되어 있지 않고, 제제에서 이들 불활성 형태 (불활성-1 및 불활성-2) 모두의 존재를 최소화하기 위한 분리 방법은 이전에 개발되지 않았다. 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, LT-β-R-Ig 융합 단백질의 포유동물 발현은 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 혼합물로 귀결되고, 상기 혼합물 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (이는 "불활성-1"라 하고, 도 3의 HIC-1 적재 HIC-HPLC 패널의 주요 피크 전에 제1 숄더(shoulder)로서 보여질 수 있음), 및 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (이는 "불활성-2"라 하고, 도3의 HIC-1 적재 HIC-HPLC 패널의 주요 피크 후에 보여질 수 있음), 및 LT-β-R-Ig의 응집된 형태를 포함한다.
본 발명은 불활성 및/또는 Ig 융합 단백질, 및 단백질 응집물의 다중 형태로부터의 LT-β-R-Ig의 목적 활성의, 단량체성 형태의 분리에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 혼합물로부터 불활성 (형태 모두 포함) 및/또는 응집물 Ig 융합 단백질의 % 를 효과적으로 감소시키기 위한 상이한 타입의 크로마토그래피, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)의 조합에 관한 것이다.
본 발명은 생물학적 활성 면역글로불린 (Ig) 융합 단백질, 불활성 Ig 융합 단백질, 및 응집물을 함유하는 혼합물을 분리하는 방법에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 분리는 혼합 모드 수지를 포함하는 제1 단계, 그 다음 페닐 HIC 단계에 의해 달성된다. 본 발명의 공정에서의 제1 단계는 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 상기 혼합 모드 수지에 결합하도록 허용되는 조건 하에서, 혼합물을 혼합 모드 수지와 접촉시키는 것을 수반한다. 상기 혼합 모드 수지 결합 활성 Ig 융합 단백질에 대해 수행되는 조건이 또한 불순물 결합에 대해 수행될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 그와 같이, 세척 및 용출 조건은 생물학적 활성 Ig 융합 단백질로부터 분순물을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성 LT-β-R-Ig의 정제, 그 다음, 상기 혼합 모드 수지에 단백질 혼합물을 적재하기 위해, 어떤 예비-용출 세척 및 용출 조건은 불활성-1로부터 활성 LT-β-R-Ig을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 세척/용출 조건의 예는 하기 실시예에 제공된다. 그 다음, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질은 제1 혼합 모드 수지 단계로부터 용출되고, 이에 따라 용출물을 얻는다.
정제 공정에서의 제2 단계는, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 제1 단계의 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 활성 Ig 융합 단백질은 용출된다. 수득한 용액은 Ig 융합 단백질의 불활성 형태와 단백질 응집물 모두로부터 분리된 생물학적 활성 Ig 융합 단백질을 함유한다. 바람직한 구체예에서, HIC 수지는 페닐 수지, 예를 들어, 페닐 세파로스이다. 하기 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 페닐 단계를 사용하여 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 정제하는 것에 대하여, 생성물 (활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질), 응집물, 및 불활성-2 방식은 적재 시 페닐 컬럼에 결합하지만, 적절한 세척/용출 조건을 사용하여 분리된다. 용출 조건은 컬럼 상에 우선적으로 존재하는 응집물 및 불활성-2로 귀결될 수 있지만, LT-β-R-Ig 생성물은 순수한 형태로 용출한다.
불활성 형태 및/또는 응집물로부터 활성 Ig 융합 단백질을 분리하기 위한 하나의 방법은 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 부틸 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉시키는 것을 포함한다. 부틸 수지 결합 활성 Ig 융합 단백질에 대해 수행되는 조건이 또한 불순물 결합에 대해 수행될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 그와 같이, 세척 및 용출 조건은 생물학적 활성 Ig 융합 단백질로부터 불순물을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성 LT-β-R-Ig의 정제, 그 다음, 부틸 수지에 단백질 혼합물을 적재하는 것에 대해여, 어떤 예비-용출 세척 및 용출 조건은 불활성 형태로부터 활성 LT-β-R-Ig을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 불활성-1은 NaCl 농도를 낮게 하여 세척될 수 있다. 활성 LT-β-R-Ig 및 응집물은 NaCl 농도를 추가로 낮게 하여 용출될 수 있지만, 불활성-2은, 물 (NaCl 없음)로 분해될 때까지, 컬럼에 결합된 채로 남아 있다. 그와 같은 세척/용출 조건의 예는 하기 실시예에 기재되어 있다.
생물학적 활성 Ig 융합 단백질의 용출 다음에, 용출물은 나중에 제2 HIC 수지와 접촉되고, 이에 따라 생물학적 활성 Ig 융합 단백질은 제2 HIC 수지에 결합한다. 생물학적 활성 Ig 융합 단백질의 용출 다음에, 수득한 용액은 불활성 형태 및/또는 응집물로부터 분리된 생물학적 활성 Ig 융합 단백질을 함유한다. 하나의 구체예에서, 부틸 HIC 수지는 히드록실화된 메타크릴레이트 주쇄를 포함한다.
다르게는, 정제 본 발명의 방법은 페닐 HIC 단계의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. LT-β-R-Ig 융합 단백질에 대해, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig, 불활성 형태 (즉, 불활성-1 및 불활성-2), 및 응집물 각각은 페닐 수지에 결합한다. 그와 같이, 활성 LT-β-R-Ig은 세척 및 용출 완충용액의 적절한 조합을 사용하여 정제될 수 있다.
본 발명의 중요한 측면은 단백질의 2개의 불활성 형태, 및 단백질 응집물로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 정제이다. 그와 같은 불순물은 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 생산, 특히 포유동물 세포 배양에서의 생산으로부터 생기지만, 본 명세서에 기재된 정제 단계에 따라 감소될 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질, 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질, 및 응집물을 함유하는 혼합물을 분리하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 분리는 혼합 모드 수지를 포함하는 제1 단계, 그 다음 페닐 HIC 단계에 의해 달성된다. 공정에서의 제1 단계는, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 상기 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 혼합물을 혼합 모드 수지와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 혼합 모드 수지 결합 활성 Ig 융합 단백질에 대해 수행되는 조건이 또한 불순물 결합에 대해 수행될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 그와 같이, 세척 및 용출 조건은 생물학적 활성 Ig 융합 단백질로부터 불순물을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 그 다음, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 제1 혼합 모드 수지 단계로부터 용출되며, 이로써 용출물을 얻는다. 하나의 구체예에서, 상기 혼합 모드 수지로부터의 용출물은 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 상당히 감소된 양을 가지며, 즉, 제1 용출물은 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 함유한다. 또한, 응집물은 크로마토그래피 조건에 따라 적재에서 28%로부터 용출물에서 8%까지 감소될 수 있다. 정제 공정에서의 제2 단계는, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (이는 불순물을 또한 포함할 수 있음)이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 제1 단계의 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 용출되고, 이에 따라불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 단백질 응집물 모두는 상당히 감소된다. 하나의 구체예에서, HIC 수지로부터의 용출물은 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 상당히 감소된 양을 갖고, 즉, 제1 용출물은 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 함유한다. 수득한 용액은 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 불활성 형태 및 단백질 응집물로부터 분리된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 함유한다. 바람직한 구체예에서, HIC 수지는 페닐 수지, 예를 들어, 페닐 세파로스이다.
불활성 형태 및/또는 응집물로부터 활성 Ig 융합 단백질을 분리하기 위한 다른 방법은, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 부틸 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질은 용출되고, 제1 용출물에서 수집된다. 용출물은 나중에 제2 HIC 수지와 접촉되고, 이에 따라 생물학적 활성 Ig 융합 단백질은 제2 HIC 수지에 결합한다. 생물학적 활성 Ig 융합 단백질의 용출 다음에, 수득한 용액은 불활성 형태 및/또는 응집물로부터 분리된 생물학적 활성 Ig 융합 단백질을 함유한다. 하나의 구체예에서, 부틸 HIC 수지는 히드록실화된 메타크릴레이트 주쇄를 포함한다.
또한, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 단백질 응집물을 포함하는 혼합물로부터 단백질 응집물의 적어도 97%를 제거하는 방법은 특징으로 한다. 상기 방법은 크로마토그래피 단계의 상기 조합, 예를 들어, HIC 페닐 또는 혼합 모드/HIC 페닐을 기초로 한다. 하나의 구체예에서, 방법은, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 페닐 HIC 또는 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 혼합물을 페닐 HIC 수지 또는 혼합 모드 수지와 접촉시키고, 그 다음, 페닐 HIC 또는 혼합 모드 수지로부터 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여 제1 용출물을 얻는 것을 포함한다. 제1 용출물은 25% 미만의 단백질 응집물, 20% 미만의 단백질 응집물, 15% 미만의 단백질 응집물, 또는 약 10%의 단백질 응집물을 포함하는 단백질 응집물의 감소된 양을 갖는다. 하나의 구체예에서, 제1 HIC 단계 다음에, 용출물은, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 제2 수지, 예를 들어, 페닐 HIC와 접촉될 수 있다. 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 용출로 2% 미만의 단백질 응집물, 또는 1% 미만의 단백질 응집물을 함유하는 제2 용출물을 얻는다. 이러한 방법으로 초기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 단백질 응집물을 포함하는 혼합물로부터 단백질 응집물의 적어도 97%를 제거한다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 이점은, 개시 물질의 50%가 원하지 않는 불활성 및 응집물 종을 포함할 때, 다양한 공정들이 생성물, 예를 들어, LT-β-R-Ig 융합 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다는 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 혼합 모드 수지 (예를 들어, Capto MMC) 단계는 응집물을 28로부터 8%까지 감소시킬 수 있고, 주기-2 페닐 컬럼은 응집물을 24%로부터 <1.0% 까지 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법이다. 상기에 기재된 바와 같이, 하나의 실례가 되는 구체예에서, 상기 조성물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1 단백질), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2 단백질), 및 1% 미만의 단백질 응집물을 포함한다. 상기 방법은 불활성 Ig 융합 단백질 및 단백질 응집물의 제거를 위해 제공되는 크로마토그래피 단계의 어떤 조합을 기초로 한다. 상기 방법은 상기 LT-β-R-Ig-융합 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환된 포유동물 숙주세포를 포함하는 포유동물 세포 배양 시스템으로부터 세포 배양 상청액을을 얻는 것을 포함한다. 발현 다음에, 세포 배양 상청액은 재조합 단백질 A (r단백질 A)와 접촉하여 LT-β-R-Ig 융합 단백질 혼합물을 얻는다. LT-β-R-Ig 융합 혼합물은, 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉된다. 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 용출 다음에, 용출물은, 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 접촉된다. 하나의 구체예에서, 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 용출 다음에, 용출물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1 단백질), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2 단백질), 및 1% 미만의 단백질 응집물을 함유할 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-1 단백질), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 (불활성-2 단백질), 및 1% 미만의 단백질 응집물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 세포 배양에서 발현된 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 페닐 기초 정제는 용출 단계를 포함하며, 이로써 컬럼은 황산암모늄에서 적재되고, 0.44 M에서 용출된다. LTBR-Ig의 응집물 및 불활성-2 형태는 생성물보타 "더 늦게" 용출한다.
하나의 구체예에서, 세포 배양에서 발현된 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 부틸 기초 정제는 불활성-1 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 세척하는 것 다음, NaCl 농도를 단계적으로 감소시켜 컬럼 적재를 포함한다. 그 다음, 부틸 용출을 위해, NaCl 농도는 추가 단계적으로 감소되고, 이에 따라 생성물 (및 응집물)이 용출하게 되지만, 불활성-2는 아니다. 결국, 불활성-2은 NaCl 염 농도를 0으로 낮추어 부틸 컬럼으로부터 제거된다.
LT-β-R-Ig 융합 단백질의 활성 및 불활성 형태는 LT 리간드에 결합하는 것을 포함하는, 당 기술분야에서 공지된 어떤 개수의 파라미터에 따라 결정될 수 있다. 하나의 구체예에서, 결합 상호작용의 친화력이 측정될 수 있다. 또 하나의 구체예에서, 생물학적 반응을 일으키기 위해 LT-β-R 분자의 능력을 측정하는 당 기술분야에 공지된 시험관내 분석이 IL-8 억제 분석과 같은, 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 생물학적 활성을 구별하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 하나의 구체예에서, IL-8 방출 분석은, 가용성 재조합 인간 림포톡신 α1β2가 A375 세포 (인간 흑색종 세포주) 상의 세포 표면 림포톡신 베타 수용체에 결합한 후에 관찰된 IL-8의 분리를 기초로 한다. IL-8 방출 분석은, 림포톡신 베타 수용체에 결합하는 것을 방지하는 가용성 림포톡신 α1β2에 결합하여 IL-8 분비를 차단하기 위한 결합 분자 (예를 들어, LT-β-R-Ig)의 능력을 측정한다. 그 다음, 배지 상청액으로 분비된 IL-8은 ELISA 분석으로 측정된다. 결합 분자는 적절한 농도로 희석되고, 96-웰 마이크로티터 플레이트에서 실온에서 1시간 동안 가용성 재조합 인간 림포톡신 α1β2 (170ng/ml)와 함께 배양된다. 림포톡신 α1β2의 농도는 IL-8 방출의 최대량을 측정하는 적정 실험에 의해 최적화된다. 그 다음, 2만개의 A375 세포는 각 웰에 첨가되고, 플레이트는 37℃ 5% CO2 에서 17시간 동안 배양된다. 배양 기간의 끝에, 플레이트는 원심분리되고 상청액은 채취된다. 상청액은 표준 샌드위치(sandwich) ELISA 분석으로 IL-8 농도에 대해 테스트된다. IL-8 농도는 항체 농도에 대해 플롯팅되고, 및 IC50은 데이터의 4개의 곡선 피트(fit)로부터 측정된다.
일반적으로, LT-β-R-Ig 융합 단백질은, 억제율 % 가 대조군 75% 내지 135% 이면, IL-8 억제 분석에서 활성이 있는 것으로 생각된다. 다르게는, LT-β-R-Ig 융합 단백질의 활성 및 불활성 형태는 하나의 형태 또는 다른 형태에 대해 특이적인 항체를 사용하여 측정될 수 있다. LT-β-R-Ig 융합 단백질의 활성 또는 기능적 형태에 특이적인 항체 (항체 that fail to bind 불활성 형태)의 예는, 참고로 본 명세서에 참고로 통합된 US 20020197254, US 20020039580, 및 US 특허 No. 7,001,598 에 각각 기재된 AGH1 (하이브리도마 AG.H1.5.1에 의해 생산됨; ATCC 등록 No. HB11796) 및 BDA8 (마우스 항-인간 LT-β-R mAb BDA8 를 생산하는 하이브리도마 세포주 (BD.A8.AB9)는 부다페스트 조약(Budapest Treaty)의 규정에 따라 American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, Md.)에 의해 1995년 1월 12일에 기탁되었고, ATCC 등록 번호 HB11798로 배정되었다)을 포함한다. 또한, 활성 및 불활성 단백질은 본 명세서에 기재된 크로마토그래피 단계에 따라 용출 특성을 그 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 부틸 HIC 컬럼을 사용하여, 불활성-1 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 1.55 M의 NaCl의 제1 세척에서 용출된다. LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 단백질 응집물은 용출 완충용액으로서 0.7M의 NaCl을 사용하여 컬럼으로부터 용출되고, 및 불활성-2 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질은 순수한 물의 박리(strip) 세척을 사용하여 용출된다. 하기 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 유사한 정제는 염화나트륨 대신에 황산나트륨의 단계 구배를 사용하여 달성될 수 있다.
상기 방법은 대규모 제조 공정을 사용하여 수행될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 5000 L, 적어도 10000L, 적어도 15000L, 15000 L, 또는 15000 L 초과의 부피를 갖는 혼합물로부터 불순물을 효과적으로 분리하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 어떤 컬럼 파라미터는 단백질 회수를 최대로 하기 위해 조정될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 방법의 제2 HIC 단계는 25 내지 35 cm, 29 내지 30 cm, 또는 약 30 cm의 높이를 갖는 컬럼을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법으로 얻은 조성물이 또한 본 발명에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명은 생물학적 활성 Ig 융합 단백질, 예를 들어, LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 Ig 융합 단백질의 10% 미만은 생물학적 불활성이다. 또 하나의 구체예에서, Ig 융합 단백질의 5% 미만은 생물학적 불활성이고; Ig 융합 단백질의 1% 미만은 생물학적 불활성이고; 또는 Ig 융합 단백질의 0.5% 미만은 생물학적 불활성이다. 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 2% 미만의 단백질 응집물을 포함하는 조성물을 포함하는, 응집물의 감소된 레벨을 함유하는 조성물이 또한 기재되어 있다.
Ⅲ. 크로마토그래피 기술
본 발명의 분리 방법은 폴리펩타이드 (예를 들어, 원핵생물 포함체로부터 분리된 Ig 융합 단백질의 배양 상청액 또는 제제)의 비정제된 모집단에 대해 수행될 수 있다. 그와 같은 배양 상청액을 얻는 방법은 하기의 섹션 IV에 상세히 기재되어 있다. 다르게는, 본 분리 방법은 하나 이상의 초기 선택 또는 정제 단계, 예를 들어, 불활성 및 활성 형태를 포함하는 제제가 친화력 매트릭스, 예를 들어, 단백질 A로부터 용출된 후에 얻은 폴리펩타이드 혼합물에 대해 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 크로마토그래피 단계는 다른 단백질 정제 절차에 의해 부분적으로 정제된 혼합물에 적용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "부분적으로 정제된"은 관심있는 Ig 융합 단백질이 적어도 5 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 가장 바람직하게는 적어도 45중량%의 농도로 존재하는 단백질 제제를 포함한다. 초기 또는 추후 정제 단계는 예를 들어 면역글로불린 응집물, 미스폴딩(misfolding)된 종, 숙주세포 단백질, (사용될 때 단백질 A와 같은) 이전의 크로마토그래피 단계로부터 잔여 물질을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 특정 크로마토그래피 단계의 적용은 또한 전체 정제 프로토콜의 문맥에서 평가된다. 정제 전에 또눈 후에 사용될 수 있는 예시적인 정제 단계는 제어된 다공 유리에 공유 결합된 단백질 A 또는 단백질 SEPHAROSE® Fast Flow (Pharmacia) 또는 TOYOPEARL 650M 단백질 A (TosoHaas))로 이루어진 친화력 크로마토그래피 (예를 들어, PROSEP-A® (BioProcessing Ltd., U.K.)를 포함한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ3 중쇄에 대해 바람직하고, 단백질 G 는 마우스 아이소타입에 대해 바람직하다. 주쇄 ABXtm 수지가, 분자가 CH3 도메인을 포함한다면, 사용될 수 있다.
본 발명의 공정에 사용될 수 있는 크로마토그래피의 하나의 예는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 바람직한 혼합 모드 수지는 30 mS/cm에서 45 mg BSA/ml 초과의 배지의 동적 결합 용량을 가지며 다중(multimodal) 약한 양이온 교환체인 것이다. 사용될 수 있는 혼합 모드 수지의 예는 Capto MMC (GE Healthcare)이다.
사용될 수 있는 크로마토그래피의 예는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 HIC이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "HIC"란 리폴딩(refolding)된 생성물, 즉, 생물학적 활성 Ig 융합 단백질로부터 단백질의 불활성 형태 및 다른 오염물, 예컨대 응집물을 분리하기 위해 컬럼과 Ig 융합 단백질 사이의 소수성 상호작용을 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 의미한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는, 단백질이 탄화수소 스페이서 암(spacer arm)을 포함하지만 친화력 리간드가 없는 친화력 겔 상에 보유될 수 있다는 관찰에 따라 먼저 개발되었다. HIC 지지체로부터의 용출은 용매, pH, 이온 세기의 변경, 또는 혼돈유발제 또는 유기 개질제, 예컨대 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜의 첨가에 의해 영향을 받을 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일반적인 원리의 기재는 예를 들어, U. S. 특허 3,917,527 및 U. S. 특허 4,000,098에 발견될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 문맥에서의 HIC는 단일 단계 프로토콜에서 무손상 항체 분자로부터 중쇄부가 없는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2)을 분리하기 위해 사용되었다. (Morimoto, K. et al., L Biochem. Biophys. Meth. 24: 107 (1992)).
이온교환 크로마토그래피는 또한 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 음이온 또는 양이온 치환기는 크로마토그래피를 위한 음이온 또는 양이온 지지체를 형성하기 위해 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 교환 치환기는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4차 아미노에틸(QAE) 및 4차 아민(Q) 기를 포함한다. 양이온 교환 치환기는 카르복시메틸 (CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)를 포함한다. 셀룰로스 이온교환 수지, 예컨대 DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52는 Whatman Ltd.(Maidstone, Kent, U.K.)로부터 이용할 수 있다. SEPHADEX® 기반 및 낮은 가교결합 이온교환체가 또한 공지되어 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM-, 및 SP- SEPHADEX® 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-SEPHAROSE® 및 SEPHAROSE® Fast Flow 모두는 Pharmacia AB로부터 이용할 수 있다. 또한, DEAE 및 CM 모두 유도된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예컨대 TOYOPEARL DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL CM-650S 또는 M은 Toso Haas Co.(Philadelphia, Pa)로부터 이용할 수 있다.
소수성 상호작용은 높은 이온 세기에서 가장 강하고, 따라서 이러한 형태의 분리는 염 침전 또는 이온교환 절차 다음에 편리하게 수행된다. 단백질의 HIC 컬럼에의 흡착은 높은 염 농도에 의해 촉진되지만, 실제 농도는 선택된 단백질 및 특정 HIC 리간드의 본성에 따라 넓은 범위로 변할 수 있다. 다양한 이온은 소수성 상호작용 (염석 효과)을 촉진하거나 물의 구조를 분열시키는지(혼돈유발 효과)에 따라 소위 설루포빅(soluphobic) 종에서 배열될 수 있고, 이에 따라 소수성 상호작용이 약화된다. 양이온은 Ba++ ＜; Ca++ ＜; Mg++ ＜; Li+ ＜; Cs+ ＜; Na+ ＜; K+ ＜; Rb+ ＜; NH4 +로서 염석 효과를 증가시키는 것에 있어서 순위가 정해지지만, 양이온은 혼돈유발 효과 as P0--＜; S04 -- ＜; CH3COOO- ＜; Cl- ＜; Br- ＜; NO3 - ＜; ClO4 -＜; I- ＜; SCN- 로서 혼돈유발 효과를 증가시키는 것에 있어서 순위가 정해질 수 있다. HIC 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 사용될 수 있다. 다르게는, HIC는 플로우스루(flowthrough) 모드로 사용될 수 있다.
일반적으로, Na, K 또는 NH4 설페이트는 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진한다. 하기 관계에 주어진 바와 같이 상호작용의 세기에 영향을 미치는 염이 제형될 수 있다: (NH4)2SO4 ＞; Na2SO4 ＞; NaCl ＞; NH4C1 ＞; NaBr ＞; NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M의 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M의 NaCl의 염 농도가 유용하다. 하나의 구체예에서, 0.3 내지 0.6 M의 Na2SO4이 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 HIC에 결합하기 위해 사용된다. HIC로부의 N.B 용출은 도한 본 명세서에서 언급된 것보다 더 낮은 염 농도 0.3 M 미만의 Na2SO4에서 달성될 수 있다. 하나의 구체예에서, 비제한적으로 0.3 내지 0.5 M의 황산암모늄을 포함하는 0.0 내지 0.5 M의 황산암모늄은 단백질 생성물을 용출하기 위해 사용된다.
하기를 포함하지만 반드시 제한하는 것은 아닌 추가 정제 프로토콜이 포함될 수 있다: 이온교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 농축 및 동결 건조, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 SEQHAROSETM상 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), PEG 침전, 또는 황산암모늄 침전.
본 발명의 구체예에서 발견된 추가 정제 단계는 음이온 교환막 여과 (예를 들어, Q 막(membrane) 흡수체에 의한 단백질 제제의 정제)를 포함한다. 일부 구체예에서, Q 막 흡수체에 의한 단백질 정제는 6.2초과의 Ph 에서 그리고 높은 전도도의 용액에서 수행된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "높은 전도도"이란 약 50 mS/cm 이상의 전도도를 의미한다.
수많은 크로마토그래피 지지체가 컬럼의 제조에 이용될 수 있고, 가장 널리 사용된 것은 아가로스, 실리카 및 유기 중합체 또는 공중합체 수지이다. 소수성 상호작용 물질은 일반적으로 소수성 리간드 (예를 들어, 알킬 또는 아릴 기)가 커플링된 베이스 매트릭스 (예를 들어, 친수성 카보히드레이트 (예컨대, 가교결합된 아가로스) 또는 합성 공중합체 물질)이다. 하나의 구체예에서, HIC 물질은 페닐 기로 치환된 아가로스수지를 포함한다. 예시적인 HIC 물질은 하기를 포함한다: 페닐 SEPHAROSETM, 낮은 또는 높은 치환을 갖는 FAST FLOW (GE Healthcare; Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); 페닐 SEPHAROSETM 고성능 컬럼; 페닐 또는 부틸-SEPHAROSE® CL-4B, 부틸-SEPHAROSE® FF, 옥틸-SEPHAROSE® FF 및 페닐-SEPHAROSE® FF (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Sweden); FractogelTM EMD 프로필 또는 FRACTOGELTM EMC 페닐 컬럼 (E. Merck, Germany); MACROPREPTM 메틸 또는 MACRO-PREPTM t-부틸 지지체 (Bio-Rad, California); WP HI-프로필 (C3) TM 컬럼 (J.T. Baker, New Jersey).
예시적인 HIC 물질은 또한 하기로부터 이용할 수 있다: 생성물명 TOYOPEARL 에테르 650, 페닐 650, 부틸 650 (EMD Merck), 부틸 600 (EMD Merck), 에테르-5PW-HR, 또는 페닐-5PW-HR 하의 Tosoh Corporation(Tokyo, Japan); 생성물명 알킬-아가로스 하의 Miles-Yeda(Rehovot, Israel) (여기서, 상기 알킬 기는 2 내지 10개의 탄소원자를 갖는다), 및 생성물명 Bakerbond WP-HI-프로필 하의 J.T. Baker(Phillipsburg, N.J.). 종래 화학을 사용하여 목적 HIC 컬럼을 제조할 수도 있다. (참조, 예를 들어, Er-el. Z. et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 49:383 (1972) 또는 Ulbrich,V. et al Coll. Czech. Chem. Commum. 9:1466 (1964)).
특정 겔의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 단백질 및 리간드의 상호작용의 세기는 알킬 리간드의 사슬 길이와 함께 증가하지만, 약 4 내지 약 8개의 탄소원자를 갖는 리간드는 대부분의 분리를 위해 적당하다. 페닐 기는 페닐 기와 거의 동일한 소수성을 갖지만, 선택도는 단백질 상의 방향족 기와의 파아-파이 궤도의 가능성 때문에 상이할 수 있다. 선택도는 또한 지지 수의의 화학에 의해 영향을 받을 수 있다.
리간드 밀도는, 상호작용의 세기 및 특이성뿐만 아니라 컬럼의 용량에 영향을 미친다는 점에서 중요한 파라미터이다. 상업적으로 이용가능한 페닐 또는 옥틸 페닐 겔의 리간드 밀도는 약 40 pmoles/ml의 겔 베드(bed)이다. 겔 용량은 pH, 온도 및 염 타입 및 농도뿐만 아니라 문제의 특정 단백질의 함수이지만, 일반적으로 3-20 mg/ml 범위의 겔인 것으로 예상될 수 있다
일반적으로, 온도의 감소는 크로마토그래피 물질과의 상호작용을 감소시킨다. 그러나, 온도를 증가시켜서 생길 수 있는 어떤 이점은, 그와 같은 증가가 단백질의 안정성에 대해 가질 수 있는 역효과에 대해서 과중하게 되어야 한다.
하나의 구체예에서, Ig 융합 단백질은 등용매적으로 용출될 수 있다. 등용래 용출에서, 모든 화합물은 개시시에 컬럼을 통해 이동하기 시작한다. 그러나, 각각은 상이한 속도로 이동하고, 이에 따라 용출 속도는 더 빠르거나 느리게 된다.
또 하나의 구체예에서, 본 발명의 단백질은 컬럼에 결합될 수 있고, 예를 들어 단계적 용출 또는 구배 용출을 사용하여 용출될 수 있다. 용출은, 단계적 또는 구배의 형태이든지 간에, 하기의 다양한 방법으로 달성될 수 있다: (a) 염 농도를 변화시키고, (b) 용매의 극성을 변화시키고 또는 (c) 세척제를 첨가한다. 염 농도를 감소시켜서, 흡착된 단백질은 소수성를 증가시키는 순서로 용출된다. 극성의 변화는 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 또는 (이소)프로판올와 같은 용매의 첨가에 의해 영향을 받을 수 있고, 이에 따라 소수성 상호작용의 세기는 감소하게 된다. 세척제는 단백질의 여과기(displacer)로서 기능을 할 수 있고 막(membrane) 단백질의 정제와 관련하여 주로 사용될 수 있다.
분리의 수행시, 폴리펩타이드 혼합물은 예를 들어 배치식(batch) 정제 기술 또는 컬럼을 사용하여 크로마토그래피 물질과 접촉될 수 있다. 정제 전에, 예를 들어 혼합물을 전치컬럼(precolumn)에 통과시켜서 어떤 혼돈유발제 또는 초소수성 물질을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 배치식 정제에 대해, 크로마토그래피 물질은 목적 개시 완충용액에서 또는 그 용액과 평형을 유지하여 제조된다. 물질의 슬러리를 얻는다. 폴리펩타이드 용액은 슬러리와 접촉하여 크로마토그래피 물질로 분리될 적어도 하나의 폴리펩타이드를 흡착한다. 크로마토그래피 물질에 결합하지 않는 폴리펩타이드를 함유하는 용액은 예를 들어 슬러리를 침강하도록 두거나 상청액을 제거하여 슬러리로부터 분리된다. 슬러리는 하나 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다. 필요하다면, 슬러리는 저전도도의 용액과 접촉하여 HIC 물질에 결합된 폴리펩타이드를 제거할 수 있다. 결합된 폴리펩타이드를 용출하기 위해, 염 농도는 감소될 수 있다.
하나의 구체예에서, 크로마토그래피 물질은 컬럼 내에 포장될 수 있다. 분리될 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물은, 컬럼으로 제거하기 위해 적어도 하나의 폴리펩타이드가 분리되도록 하는 컬럼에 적용된다. 컬럼으로 제거되지 않는 폴리펩타이드는 통과하여 수집될 수 있다. 결합된 폴리펩타이드를 용출하기 위해, 염 농도는 결합된 물질을 차별적인 제거를 통해 제거하기 위해, 예를 들어 단계적 방식으로, 또는 연속 또는 단계 염 구배를 포함하는 염 구배를 사용하여 감소될 수 있다.
Ig 융합 단백질 및/또는 단백질 응집물의 불활성 형태를 분리하는데 효과적인 것으로 확인된 특정 크로마토그래피 조합이 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
Ⅳ. Ig 융합 단백질의 발현
본 발명의 방법은 당 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 세포 배양 기술을 사용하여 먼저 만들어진 Ig 융합 단백질의 혼합물을 정제하기 위해 사용된다.
간단히 말해서, Ig 융합 단백질을 코딩하는 핵산은, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 정제를 위한 Ig 융합 단백질을 차례로 제공하는 폴리펩타이드의 목적 양을 생산하기 위해 사용될 수 있는 숙주세포로의 도입을 위한 발현 벡터에서 전형적으로 삽입된다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"란, 명세서 및 특허청구범위를 위하여 본 명세서에 사용되는데, 세포에서 목적 유전자에 도입하고 그 유전자를 발현시키기 위한 비이클(vehicle)로서 본 발명에 따라 사용된 벡터를 의미한다. 당업자에 알려진 바와 같이, 그와 같은 벡터는 플라스미드, 파아지 (phase), 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 양립할 수 있는 벡터는 선택 마커, 목적 유전자의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위 및 진핵생물 또는 원핵생물 세포에 들어가고/가거나 그 세포에서 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적에 대해, 수많은 발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 하나의 클래스는 소 유두종(bovine papilloma) 바이러스, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 아데노바이러스, 우두(vaccinia) 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유도된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 다시스트론성(다시스트론성) 시스템의 사용을 수반한다. 또한, DNA를 염색체에 삽입시킨 세포는 트랜스펙션된 숙주세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구 숙주에 대한 광민감성, 살생물제 내성 (예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공한다. 선택가능 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나 공동형질전환(cotransformation)에 의해 동일한 세포에 도입될 수 있다. 추가 요소는 또한 mRNA의 최적의 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 요소는 신호 서열, 스플라이스(splice) 신호, 및 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기에서 고찰된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자 (바람직하게는 인간)와 함께 발현 벡터에 삽입된다. 바람직하게는, 이는 NEOSPLA (U.S. 특허 6,159,730)로 불리는 IDEC, Inc.의 독점적인 발현 벡터를 사용하여 달성된다. 이 벡터는 거대세포바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, 복제의 SV40 기원, 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 인산운반효소 엑손(exon) 1 및 엑손(exon) 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 선도 서열을 함유한다. 벡터 시스템은 또한 U.S. 특허 Nos. 5,736,137 및 5,658,570에서 가르치고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다. 이 시스템은 높은 발현 레벨, 예를 들어, > 30 pg/세포/1일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들어 U.S. 특허 6,413,777에 개시되어 있다.
다른 바람직한 구체예에서, Ig 융합 단백질은 동시계속 U.S. 가출원 No. 60/331,481 (2001년 11월 16일 출원)에 개시되어 있고 그 전체가 본 명세서에 통합되어 있는 것과 같은 다시스트론성 제작물을 사용하여 발현될 수 있다. 이들 신규 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은, 관심있는 다중 유전자 생성물은 단일 다시스트론성 제작물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 진핵생물 숙주세포에서 본 발명의 폴리펩타이드의 비교적 높은 레벨을 제공하기 위해 내부 리보좀 진입 위치 (IRES)를 사용한다. 양립가능 IRES 서열은 본 명세서에 통합된 U.S. 특허 No. 6,193,980에 개시되어 있다. 당업자는, 그와 같은 발현 시스템이 본 출원에 개시된 전체 범위의 폴리펩타이드를 효과적으로 생산하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
더 일반적으로, Ig 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 벡터가 일단 제조되었다면, 발현 벡터는 적절한 숙주세포에 도입될 수 있다. 즉, 숙주세포는 형질전환될 수 있다. 플라스미드의 숙주세포로의 도입은 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 완수될 수 있다. 이들은 트랜스펙션 (전기영동 및 전기천공법 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로프(envelope)가 있는 DNA에 의한 세포 융합, 현미주사, 및 무손상 바이러스에 의한 감염을 비제한적으로 포함한다. 참조, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기천공법에 의한다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에서, 성장하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성을 위해 분석된다. 예시적인 분석 기술은 효소면역분석법 (ELISA), 방사선면역분석법 (RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS), 면역조직화학 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은 유전자타입을 변화시키는 수용자 숙주세포에 DNA를 도입하는 어떤 것을 의미하도록 넓은 의미로 사용될 것이고, 결과적으로, 수용자 세포에서 변화가 있다.
동일한 라인을 따라서, "숙주세포"란 재조합 DNA 기술을 사용하고 적어도 하나의 비상동 유전자를 코딩하여 제작한 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터 항체의 단리를 위한 공정의 기재에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양"은, 달리 명확하게 지정되지 않으면, 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 환언하면, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 스핀다운(spin down)된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 모두를 포함하는 세포 배양으로부터를 의미한다.
단백질 발현을 위해 사용된 숙주세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원이고; 당업자는, 목적 유전자 생성물이 발현되기에 가장 적합한 특정 숙주세포주를 우선적으로 결정하기 위한 능력으로 신뢰를 받는다. 예시적인 숙주세포주는 비제한적으로 하기를 포함한다: DG44 및 DUXB11 (차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스(minus)), HELA (인간 자궁경관 암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-1c1BPT (소(bovine) 내피세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장). CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주세포주는 전형적으로 상업적 서비스(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다.
시험관 내(in vitro) 생산은 확장(scale-up)을 하여 목적하는 폴리펩타이드를 다량으로 수득할 수 있도록 한다. 조직 배양 조건 하에서의 포유동물 세포 배양 기술은 당해 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 공기 부양(airlift) 반응기에서 또는 연속 교반 반응기 내에서의 균질 현탁 배양, 또는, 예를 들어 중공 섬유(hollow fiber), 마이크로캡슐 내에서의, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의, 고정된 또는 포획된 세포 배양을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는 또한 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 비-포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 이 점에서, 박테리아와 같은 다양한 단세포 비-포유동물 미생물 역시 형질전환될 수 있고, 즉 배양 또는 발효시 성장할 수 있음이 인식될 것이다. 형질전환에 민감함 박테리아는 에스케리키아 콜리 또는 살모넬라 균주와 같은 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae); 바실러스 서브틸리스와 같은 바실라세아에(Bacillaceae); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)의 멤버를 포함한다. 박테리아에서 발현될 때, 폴리펩타이드가 전형적으로 봉입체(inclusion body)의 일부가 된다는 것이 추가로 인식될 것이다. 폴리펩타이드는 분리되고, 정제된 다음, 기능성 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물이 또한 사용될 수 있다. 수많은 다른 균주들이 통상적으로 이용가능함에도 불구하고, 진핵 미생물 중에서 사카로마이세스 세레비시아에, 또는 통상의 제빵 효모가 가장 통상적으로 사용된다. 사카로마이세스에서의 발현을 위해, 플라스미드 YRp7, 예를 들어, (Stinchcomb 등, Nature, 282:39 (1979); Kingsman 등, Gene, 7:141 (1979); Tschemper 등, Gene, 10:157 (1980))이 통상적으로 사용된다. 이러한 플라스미드는 트립토판, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics, 85:12 (1977))에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 함유하고 있다. 효모 숙주세포 게놈의 특징으로서 trp1 손상(lesion)의 존재는 트립토판의 부재시 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 Ig 융합 단백질은 낮은 배양 온도, 즉, 통상적인 37℃ 미만 또는 28℃ 내지 32℃에서 포유동물 세포 배양을 이용하여 발현된다. Ig 융합 단백질, 특히 TNF 수용체-Ig 융합 단백질의 저온 배양은 불활성 융합 단백질의 총 백분율을 감소시킨다.
저온에서 Ig 융합 단백질을 배양하는 방법은 본 명세서에 전체가 참조로 통합되어 있는, US 20020039580(Browning 등)에 기술되어 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용한 정제를 위한 개시 물질은 재조합 Ig 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포로부터의 얻은 상청액이다. 하나의 구체예에서, 상기 CHO 세포는 약 28℃ 내지 약 32℃의 온도에서 배양된다. 하나의 구체예에서, 정제를 위한 개시 물질은 대략 20-40%의 응집된 물질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 정제를 위한 개시 물질은 대략 30%의 응집된 물질을 포함한다. 하나의 대체예에서, 개시 물질은 대략 50% 또는 50% 초과의 응집된 물질을 포함한다.
상기 방법을 이용한 정제에 앞서, 분리될 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 조성물을 바람직하게는 산성 또는 대략 중성 pH의 완충용액에 둘 수 있다. 이는, 예를 들어 농축된 완충용액을 첨가하고, 시료를 상기 완충용액에 재현탁하고, 상기 완충용액을 교환(예를 들어, 투석 또는 한외여과를 이용하여)함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로는, 시료 완충용액의 pH를 목적 범위 내로 간단히 조정할 수 있다.
V. 면역글로불린 융합 단백질
본 명세서에 기술된 방법은, 예를 들어 다수의 이황화 가교로 인한, 부적절한 폴딩(folding)을 가질 가능성이 큰 Ig 융합 단백질에 유용하다. 그러한 단백질은 불완전하거나 비정상적인 폴딩을 가질 가능성이 크며, 그 결과 크기 및 특징에서 상기 활성 단백질과 매우 유사하지만, 그럼에도 불구하고 불활성이어서 치료 용도에 적합치 않은, 상이한 형태의 불활성 단백질을 야기한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 이황화 결합을 형성하는 시스테인이 매우 많은 단백질과 같은, 복잡한 폴딩을 갖는 융합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, Ig 융합 단백질은 리간드 또는 수용체의 결합 도메인(예를 들어, 수용체의 세포외 도메인(ECD))을 적어도 하나의 중쇄 도메인 및 연결 펩타이드와 결합시킨다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질을 제조할 때, 상기 리간드의 결합 도메인 또는 수용체 도메인을 코딩하는 핵산이 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단으로 융합될 것이다. N-말단 융합 역시 가능하다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 융합은 또한 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에 이루어지거나, 중쇄의 CH1의 N-말단 또는 이에 상응하는 경쇄의 영역에 즉시 이루어질 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 리간드 또는 수용체 결합 도메인의 서열이 면역글로불린 분자의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 중쇄 불변 영역 전체를 리간드 또는 수용체 결합 도메인 서열에 융합시키는 것 또한 가능하다. 하나의 구체예에서, IgG Fc를 화학적으로 특징짓는 파파인 절단 부위(즉, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114로 하여, 잔기 216) 바로 상류의 힌지(hinge) 영역에서 시작하는 서열, 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위가 융합에 사용된다. 융합이 이뤄지는 정확한 부위는 크게 중요하지 않으며, 특정 부위들은 잘 알려져 있고 분자의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. 융합 단백질을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 하나의 구체예에서, 상기 결합 도메인을 함유하는 단백질은, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산 길이의 아미노산 링커를 통해 Fc 도메인에 연결된다. 하나의 구체예에서, TNF 수용체 및 Fc 도메인은 단일 아미노산을 통해 연결된다.
바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 정제 방법은 TNF 수용체 Ig 융합 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에 청구된 발명은 본 명세서에 논의된 방법에 의해 수득된 TNF 패밀리 수용체-Ig 융합에 관한 것 외에도, 이들을 포함하는 약제학적 조제물에 관한 것이다. TNF 수용체의 한 가지 예는 LTβR이다. 다른 예는 HVEM을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 LTβR-Ig 융합 단백질의 정제된 조성물을 달성한다.
하나의 구체예에서, LTβR-Ig 융합 단백질은 인간 LTβR의 세포외 도메인(막통과 도메인이 없는 형태) 및 면역글로불린 Fc 영역(IgG1 Fc 도메인)을 포함한다. 서열번호 1은 상기 세포외 도메인을 포함하는, 인간 LTβR의 전장 서열을 기술한다. LT-β-R-Ig 융합의 모식도가 도 10에 제공된다.
다른 융합 단백질 역시 본 발명에 포함된다. 상기 문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질은 T 세포 수용체(Gascoigne 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4(Capon 등, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker 등, Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl 등, DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); 및 Byrn 등, Nature 344:667-670 (1990)); L-셀렉틴(L-selectin)(귀소 수용체(homing receptor)(Watson 등, J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); 및 Watson 등, Nature 349:164-167 (1991)); CD44(Aruffo 등, Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 및 B7(Linsley 등, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4(Lisley 등, J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22(Stamenkovic 등, Cell 66:1133-1144 (1991)); TNF 수용체(Ashkenazi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer 등, Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); 및 Peppel 등, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); 및 IgE 수용체(Ridgway 및 Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))의 융합을 포함한다.
상기 융합 단백질에 포함될 수 있는 추가의 예시적 리간드 및 이들의 수용체는 다음을 포함한다:
사이토카인 및 사이토카인 수용체
사이토카인은 림프구의 증식, 분화 및 기능적 활성화에 다면적 효과(pleiotropic effect)를 갖는다. 다양한 사이토카인 또는 이의 수용체 결합 부분이 본 발명의 융합 단백질에 이용될 수 있다. 예시적인 사이토카인은 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, 및 IL-18), 집락 자극 인자(CFS)((예를 들어, 과립구 CSF(G-CSF), 과립구-대식세포 CSF(GM-CSF), 및 단핵세포 대식세포 CSF(M-CSF)), 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타, 및 인터페론-α, β, 또는 γ와 같은 인터페론(US 특허 제4,925,793호 및 제4,929,554호)을 포함한다. 사이토카인 수용체는 전형적으로 리간드-특이적 알파 사슬 및 통상적인 베타 사슬로 이루어진다. 예시적인 사이토카인 수용체는 GM-CSF, IL-3(US 특허 제5,639,605호), IL-4(US 특허 제5,599,905호), IL-5(US 특허 제5,453,491호), IFNγ(EP0240975), 및 수용체의 TNF 패밀리(예를 들어, TNFα(예를 들어, TNFR-1(EP 417, 563), TNFR-2(EP 417,014) 림포톡신 베타 수용체)에 대한 수용체를 포함한다.
부착 단백질
부착 분자는 세포가 다른 세포와 상호작용하게 하는 막-결합 단백질이다. 수용체 결합 부분의, 백혈구 귀소 수용체 및 세포 부착 분자를 포함하는, 다양한 부착 단백질이 본 발명의 융합 단백질에 혼입될 수 있다. 백혈구 귀소 수용체는 염증 중에 백혈구 세포 표면상에 발현되며, 세포외 기질 성분에 대한 결합을 중재하는 β-1 인테그린(예를 들어, VLF-1, 2, 3, 4, 5 및 6), 및 혈관내피세포 상의 세포 부착 분자(CAM)에 결합하는 β2-인테그린(예를 들어, LFA-1, LPAM-1, CR3, 및 CR4)을 포함한다. 예시적인 CAM은 ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, 및 MAdCAM-1을 포함한다. 다른 CAM은 E-셀렉틴, L-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 포함하는 셀렉틴 패밀리의 CAM을 포함한다.
케모카인
감염 부위 방향으로의 백혈구의 이동을 자극하는 화학주성(chemotactic) 단백질인 케모카인(chemokine)이 또한 본 발명의 융합 단백질 내에 혼입될 수 있다. 예시적인 케모카인은 대식세포 감염성 단백질(MIP-1-α 및 MIP-1-β), 호중구 화학주성 인자(neutrophil chemotactic factor), 및 RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)를 포함한다.
성장인자 및 성장인자 수용체
성장인자 또는 이들의 수용체(또는 이의 수용체 결합 또는 리간드 결합 부분)가 본 발명의 융합 단백질 내에 혼입될 수 있다. 예시적인 성장인자는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 및 이의 이형체(U.S. 특허 제5,194,596호); aFGF 및 bFGF를 포함하는, 섬유아세포 성장인자(FGF); 심방 나트륨 이뇨인자(ANF); 간세포 성장인자(HGF; US 특허 제5,227,158호 및 제6,099,841호), 뇌-유래 신경성장인자(BNDF), 뉴로트로핀(neurotrophin)-3, -4, -5 또는 6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)과 같은 신경성장인자, 또는 NGF-β 혈소판-유래 성장인자(pDGF)(U.S. 특허 제4,889,919호, 제4,845,075호, 제5,910,574호, 및 제5,877,016호)와 같은 신경성장인자; TGF-알파 및 TGF-베타(WO 90/14359)와 같은 형질전환 성장인자(TGF), 골형성 단백질(BMP)을 포함하는 골유도 인자; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II; US 특허 제6,403,764호 및 제6,506,874호); 에리스로포이에틴(Erythropoietin; EPO); 줄기-세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(c-Mpl 리간드), 및 Wnt 폴리펩타이드(US 특허 제6,159,462호)를 포함한다. 본 발명의 표적 수용체 도메인으로 사용될 수 있는 예시적인 성장인자 수용체는 EGF 수용체; VEGF 수용체(예를 들어, Flt1 또는 Flk1/KDR), PDGF 수용체(WO 90/14425); HGF 수용체(US 특허 제5,648,273호 및 제5,686,292호), 및 NGF, BNDF 및 NT-3에 결합하는 p75NTR 또는 p75로도 명명된, 저 친화성 수용체(LNGFR)를 포함하는 신경성장 수용체, 및 수용체 티로신 키나아제(예를 들어, trkA, trkB (EP 455,460), trkC (EP 522,530))의 trk 패밀리의 멤버인 고 친화성 수용체를 포함한다.
호르몬
본 발명의 융합 단백질에 사용되기 위한 예시적인 성장 호르몬은 레닌, 인간 성장 호르몬(HGH; US 특허 제5,834,598호), N-메티오닐 인간 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬(PTH); 갑상선 자극 호르몬(TSH); 티록신(thyroxine); 프로인슐린(proinsulin) 및 인슐린(US 특허 제5,157,021호 및 제6,576,608호); 난포자극호르몬(FSH), 칼시토닌, 황체형성호르몬(LH), 렙틴(leptin), 글루카곤; 봄베신(bombesin); 소마트로핀(somatropin); 뮐러관-억제 물질(mullerian-inhibiting substance); 릴랙신(relaxin) 및 프로릴랙신(prorelaxin); 성선자극호르몬(gonadotropin)-관련 펩타이드; 프로락틴; 태반젖샘자극호르몬(placental lactogen); OB 단백질; 또는 뮐러관-억제 물질을 포함한다.
응고 인자
본 발명의 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 혈액 응고 인자는 응고 인자(예를 들어, 인자 V, VII, VIII, X, IX, XI, XII 및 XIII, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)); 조직 인자(U.S. 특허 제5,346,991호, 제5,349,991호, 제5,726,147호, 및 제6,596,84); 트롬빈 및 프로트롬빈; 피브린 및 피브리노겐; 플라스민 및 플라스미노겐; 우로키나아제(urokinase) 또는 인간 소변 또는 조직-타입 플라스미노겐 활성제(t-PA)와 같은, 플라스미노겐 활성제를 포함한다.
다른 예시적인 융합 단백질은, 예를 들어, WO0069913A1 및 WO0040615A2에 교시되어 있다. 본 발명의 융합 단백질에 포함될 수 있는 또 다른 예시적인 분자는 IGSF9이다.
융합 단백질은 당해 기술분야에 널리 알려진 방법(예를 들어, US 특허 제5,116,964호 및 제5,225,538호 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 리간드 또는 리간드 결합 파트너가 가변 영역 대신에 중쇄(또는 중쇄 일부)의 불변 영역의 N-말단에 C-말단으로 융합된다. 리간드 결합 수용체의 임의의 막통과 영역이나 지질 또는 인지질 고정(anchor) 인지 서열이 바람직하게는 융합 이전에 불활성화되거나 결손된다. 리간드 또는 리간드 결합 파트너를 코딩하는 DNA는 목적하는 ORF 절편을 코딩하는 DNA의 5' 및 3' 말단에 또는 근처에 있는 제한 효소에 의해 절단된다. 그리고 나서, 상기 얻어진 DNA 단편은 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA 내로 바로 삽입된다. 융합이 이뤄지는 정확한 부위는 가용성 융합 단백질의 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 실험적으로 선택된다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 그 후 발현을 위한 숙주세포로 형질감염된다.
VI. 약제학적 조성물
불활성 및/또는 단백질 응집물이 치료요법에서 대상에 투여되는 경우 악영향을 미칠 수 있기 때문에, 본 발명의 방법 및 조성물은 약학적 제형에 사용하기 위한 Ig 융합 단백질의 정제를 위해 특히 매우 적절하다. 예를 들어, 융합 단백질의 불활성 형태 및 단백질 응집물은 Ig 융합 단백질의 효능의 상실 또는 증가된 면역원성(immunogenicity)을 야기할 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료 용도에 적합한 정제된 생물학적 단백질의 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하여 얻어진 단백질을 대상에게 제조 및 투여하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있거나 당업자에 의해 손쉽게 결정된다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 정제된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 적용된다. 가용성 LT-β-R-Ig는, 예를 들어, 자가면역 장애, 예를 들어 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)과 같은 탈수초질환(demyelinating disorder)을 치료하기 위한 대상에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 및 생리학적으로 적합한 기타 종류를 포함한다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다(예를 들어, Berge 등, J. Pharm. Sci. 66:1-19, 1977 참조).
상기 가용성 LT-β-R-Ig은 표준 방법에 따라 제형화될 수 있다. 약제학적 제형은 잘 정립되어 있는 기술분야이며, 예를 들어, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams &amp; Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel 등, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams &amp; Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); 및 Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X)에 추가로 기술되어 있다.
하나의 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 염화나트륨, 이염기성 인산나트륨칠수화물(sodium dibasic phosphate heptahydrate), 일염기성 인산나트륨(sodium monobasic phophate), 및 안정화제와 같은 부형제와 제형화될 수 있다. 이는, 예를 들어, 적절한 농도의 완충용액 중에서 제공될 수 있고, 2-8℃에서 보관될 수 있다.
약제학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어, 액상 용액(예를 들어, 주사가능하고 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제와 같은, 액상, 반-고상 및 고상 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 제제를 위한 조성물은 주사가능하거나 주입가능한 용액의 형태이다.
이러한 조성물은 비경구 방식(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사)에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 장관(enteral) 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내(intrathecal), 피막내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관(transtracheal), 피하, 피하내(subcuticular), 슬관절강내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal), 경막외(epidural), 뇌내(intracerebral), 두개내(intracranial), 경동맥내(intracarotid) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농도에서 안정적으로 보관하기에 적절한 다른 질서 구조(ordered structure)로 제형화될 수 있다.
멸균된 주사가능한 용액은 본 명세서에 기술된 제제를 필요한 양으로 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매 내로 혼입시키고, 필요한 경우 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 본 명세서에 기술된 제제를, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 운반체(vehicle) 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균된 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 용액으로부터 본 명세서에 기술된 제제 및 임의의 추가 목적 성분의 분말을 수득하게 해주는 진공 건조 및 동결-건조이다. 용액의 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 조성물, 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 포함함으로써 달성될 수 있다.
어떤 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 이식재 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같은, 속방출에 대해 화합물을 보호할 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생적합성 중합체가 사용될 수 있다.
이러한 제형의 제조를 위한 많은 방법들이 특허받았거나 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조할 것.
가용성 LT-β-R-Ig는, 예를 들어, 혈액, 혈청 또는 다른 조직에서, 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 5, 10 또는 50배까지, 예를 들어 안정성 및/또는 순환 지연을 향상시키는 부분(moiety)을 이용하여 변형될 수 있다. 상기 변형 제제는 다발성 경화증(예를 들어, 제제의 표지된 형태를 이용함으로써)과 같은 탈수초질환에서 발생할 수 있는 감염 부위(예를 들어, 병변(lesions) 또는 경화증(scleroses))에 도달할 수 있는지 여부가 평가될 수 있다.
예를 들어, LT-β-R-Ig는 중합체, 예를 들어, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 실질적으로 비-항원성 중합체와 회합될 수 있다. 적절한 중합체는 실질적으로 중량에 따라 달라질 것이다. 약 200 내지 약 35,000 달톤(또는 약 1,000 내지 약 15,000, 및 2,000 내지 약 12,500) 범위의 수 평균 분자량을 갖는 중합체가 사용될 수 있다.
예를 들어, 가용성 LT-β-R-Ig는 수용성 중합체, 예를 들어, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들어, 폴리비닐알콜 또는 폴리비닐피롤리돈에 결합될 수 있다. 이러한 중합체의 비-제한적인 목록은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥사이드 호모중합체(homopolymer), 폴리옥시에틸레네이티드 폴리올, 이의 공중합체 및 블록 공중합체의 수용성이 유지되는 한 이의 블록 공중합체가 포함된다. 추가의 유용한 중합체는 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체(Pluronics)와 같은 폴리옥시알킬렌; 폴리메타크릴레이트; 카보머; 및 분지형 또는 비분지형 다당류를 포함한다.
상기 가용성 LT-β-T-Ig가 제2 제제와 조합되어 사용될 때, 상기 두 가지 제제들은 각각 또는 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 각각의 약제학적 조성물은, 예를 들어 투여 바로 전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 같은 시간에 또는 다른 시간에, 함께 투여되거나 각각 투여될 수 있다.
가용성 LT-β-T-Ig는 대상, 예를 들어, 인간 대상에게 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 많은 적용에 있어, 투여 경로는 하기 중 하나이다: 정맥내 주사 또는 주입(IV), 피하 주사(SC), 복강내(IP), 또는 근육 내 주사 중 하나이다. 일부 경우, CNS, 예를 들어, 경막내, 측뇌실내(intracerebroventricular, ICV), 뇌내 또는 두개내로 직접 투여될 수 있다. 상기 제제는 고정 투여량으로, 또는 mg/kg 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 투여량은 제제에 대한 항체의 생성을 감소시키거나 피할 수 있도록 선택될 수 있다.
가용성 LT-β-R-Ig의 투여 경로 및/또는 방식은 또한, 예를 들어, 자기공명영상(MRI) 스캔, 양전자 방사 단층 촬영(PET) 스캔, 확산 강조 영상(DW-I 또는 DW-MRI), 확산 텐더 영상(Diffusion Tensor Imaging), 척수조영술(Myelography), 자화전이(Magnetization Transfer)를 이용하여, 예를 들어, 대상에서의 경화증의 위치, 수 또는 크기를 결정함으로써, 개별 사례에 맞춰 조정될 수 있다. 탈수초질환의 중증도 또는 정도는 요추전자(lumbar puncture)(예를 들어, 뇌척수액에서 증가된 백혈구를 확인하는 것), 신경 기능의 측정 수단으로서의 유발 전위 검사(evoked potential testing), 및/또는 탈수초질환(예를 들어, 다발성 경화증)과 관련된 임의의 기타 표준 변수들, 예를 들어 본 명세서에 기재된 평가 항목 중 어느 하나로부터 또한 결정될 수도 있다.
투여용법(dosage regimen)은 목적 반응, 예를 들어, 치료 반응 또는 조합 치료 효과를 제공하기 위해 조절된다. 상기 투여용법은, 예를 들어, 재수초화의 증가를 야기할 것이다. 일반적으로, 임의로 개별적으로 제형화되거나 적절한 투여량의 제2 치료 제제와 함께 제형화된 가용성 LT-β-R-Ig의 투여량이 대상에게 가용성 LT-β-R-Ig를 제공하는데 사용될 수 있다.
상기 가용성 LT-β-R-Ig에 대한 적당한 투여량 및/또는 투여 범위는 대상에서 재수초화의 증가를 야기하기에 충분한 양을 포함한다. 적당한 투여량은 본 명세서에 기술된 것 중 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 대상(예를 들어, 인간 환자)의 kg 체중 당 적어도 약 0.001 mg의 가용성 LT-β-R-Ig의 투여량을 포함한다.
재수초화를 증가시키는데 요구되는 가용성 LT-β-R-Ig의 투여량은, 예를 들어, 치료되는 대상의 연령, 성별 및 체중을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 대상에 투여되는 투여량에 영향을 미치는 다른 인자들은, 예를 들어, 탈수초화 질환의 타입 또는 중증도를 포함한다. 예를 들어, 급성 전격성(Acute Fulminant) 다발성 경화증을 갖는 환자는 보다 가벼운 형태의 다발성 경화증을 갖는 환자보다 상이한 투여량의 LT-β-R-Ig의 투여를 필요로 할 수 있다. 다른 인자들은, 예를 들어, 동시에 또는 이전에 환자에게 영향을 미치는 다른 장애, 환자의 일반적인 건강, 환자의 유전적 소인(genetic disposition), 투여 시간, 배설속도, 약물 조합, 및 환자에게 투여되는 임의의 기타 추가의 치료를 포함한다. 어떤 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료계획(treatment regimen)이 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 것임을 또한 인식되어야 한다. 활성 성분들의 양은 특정 기술된 화합물 및 조성물 내 추가의 항-바이러스 제제의 존재 또는 부존재 및 특성에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에 사용된 투여 단위 형태 또는 "고정 투여량(fixed dose)"은 치료되는 대상에게 단일 투여로서 적당한 물리적으로 구분되는 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합되고 임의로 다른 제제와 회합되어, 목적하는 치료 효과(예를 들어, 대상에서의 재수초화의 증가)를 나타내도록 계산된, 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 가용성 LT-β-R-Ig을 포함할 수 있다. 그러한 치료적 유효량은 투여되는 제제의 효과, 또는 하나의 제제를 초과하여 사용되는 경우 제제 및 제2 제제의 조합 효과에 근거하여 결정될 수 있다. 제제의 치료적 유효량은 또한 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 목적하는 반응을 도출하는 화합물의 능력, 예를 들어, 적어도 하나의 장애 변수의 개선, 예를 들어, 자가면역 장애, 예를 들어, 탈수초화 질환, 예를 들어, 다발성 경화증의 적어도 하나의 증상의 개선과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 가용성 LT-β-R-Ig의 치료적 유효량은 재수초화를 증가시킬 것이며, 또한 재수초화를 더디게 하고/하거나 개선시킬 수 있다. 치료적 유효량은 또한 조성물의 어떤 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 압도되는 것이다.
Ⅶ. 장치 및 키트
가용성 LT-β-R-Ig를 포함하는 약제학적 조성물은 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어, 훈련받지 않은 대상에 의해 또는 현장에서의 응급 의료진에 의해, 의료 설비 및 다른 의료 장비가 없는 응급 상황에 사용될 수 있도록, 휴대성, 실온 보관, 및 사용 편의와 같은 특징을 갖도록 고안될 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어 가용성 LT-β-R-Ig를 포함하는 약제학적 조제물의 보관을 위한 하나 이상의 하우징(housing)을 포함할 수 있고, 제제의 하나 이상의 단위 투여량을 전달할 수 있도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 피하 주사기 또는 멀티챔버 주사기를 포함하는, 주사기와 같은 경피 전달 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 다른 적당한 전달 장치는 스텐트, 카테터, 경피 패치, 미세바늘(microneedle) 및 이식가능한 제어 방출 장치를 포함한다. 상기 장치(예를 들어, 주사기)는 재수초화를 야기하기에 충분한 투여량으로 분말 또는 액상 형태의 가용성 LT-β-R-Ig를 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 듀얼 챔버 장치일 수 있고, 이때 하나의 챔버는 대상에서 재수초화의 증가를 야기하기에 충분한 단위 투여량의 동결건조된 가용성 LT-β-R-Ig를 함유하며, 제2 챔버는 동결건조된 단위 투여량의 가용성 LT-β-R-Ig를 재구성하기 위한 액체(예를 들어, 완충용액)를 함유한다.
다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 기술된 장치와 같은, 바늘이 없는 피하 주사 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 잘 알려진 이식재 및 모듈(module)은, 예를 들어, 제어된 속도로 약물을 분사하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시하는 US 4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프를 개시하는 US 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유량 이식가능한 주입 기구를 개시하는 US 4,447,224; 다중-챔버 부분을 갖는 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는, US 4,439,196; 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는 US 4,475,196에 기술되어 있다.
가용성 LT-β-R-Ig는 키트 내에 제공될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 키트는 (a) 하나 이상의 단위 투여량의 가용성 LT-β-R-Ig를 포함하는 조성물을 함유하는 용기 및 선택적으로 (b) 정보 물질(informational material)을 포함한다.
가용성 LT-β-R-Ig의 단위 투여량은 대상에 목적하는 결과, 예를 들어 대상에서의 장애 진행의 감소 또는 개선을 야기하기에 충분하다. 상기 정보 물질은 본 명세서에 기술된 방법 및/또는 치료적 이득을 위한 제제의 용도와 관련된, 설명, 지시, 마케팅 또는 다른 물질일 수 있다. 상기 키트는 또한 재수초화 시험(분석)에 유용한 시약 및 설명을 포함할 수 있다. 상기 재수초화를 분석하는 방법은 본 명세서에 기술된 시험 방법 중 어느 하나를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 상기 키트는 다발성 경화증을 치료하기 위한 하나 이상의 제제와 같은, 재수초화 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는 가용성 LT-β-R-Ig를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기, 및 하나 이상의 추가 제제를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
키트의 정보 물질은 그 형태가 제한되지 않는다. 하나의 구체예에서, 정보 물질은 화합물의 제조, 화합물의 분자량, 농도, 유효 기간, 배치(batch) 또는 제조 위치 정보 등에 관한 정보를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 정보 물질은 재수초화 질환을 가지고 있거나, 발전될 위험성이 있거나, 재수초화 질환과 관련된 사건을 겪을 위험성이 있는 대상을 치료하기 위한 가용성 LT-β-R-Ig의 투여 방법, 예를 들어, 적절한 투여량, 투여형태, 또는 투여방식(예를 들어, 본 명세서에 기술된 투여량, 투여형태 또는 투여방식)과 관련된다. 상기 정보는 인쇄된 문헌, 컴퓨터로 읽을 수 있는 물질, 비디오 녹화, 또는 오디오 녹음, 또는 실질적 물질에 대한 링크 또는 주소를 제공하는 정보를 포함하는, 다양한 포맷으로 제공될 수 있다.
제제 외에, 키트 내의 조성물은 용매 또는 완충용액, 안정화제 또는 보존제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 제제는 임의의 형태, 예를 들어, 액상, 건조 또는 동결건조된 형태, 바람직하게는 실질적으로 순수하고/하거나 멸균된 것으로 제공될 수 있다. 제제가 액상 용액으로 제공되는 경우, 액상 용액은 바람직하게는 수용액이다. 물질이 건조 형태로 제공되는 경우, 재구성은 일반적으로 적절한 용매에 의한다. 용매, 예를 들어, 멸균수 또는 완충용액이 선택적으로 키트 내에 제공될 수 있다.
키트는 조성물 또는 제제를 함유하는 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 키트는 조성물 및 정보 물질을 위한 분리된 용기, 분배기 또는 부분을 함유한다. 예를 들어, 조성물은 병, 바이알, 또는 주사기 내에 함유될 수 있고, 정보 물질은 플라스틱 슬리브 또는 패킷에 함유될 수 있다. 다른 구체예에서, 키트의 분리된 요소는 단일의, 분배되지 않은 용기 내에 함유된다. 예를 들어, 상기 조성물은 라벨의 형태로 정보 물질이 부착된 병, 바이알, 또는 주사기 내에 함유된다. 몇 가지 구체예에서, 키트는 다수의 개별 용기(예를 들어, 팩)를 포함하고, 각각은 제제의 하나 이상의 단위 투여 형태(예를 들어, 본 명세서에 기술된 투여 형태)를 함유한다. 용기는 조합 단위 투여, 예를 들어, 가용성 LT-β-R-Ig 및 제2 제제 양쪽을, 예를 들어, 목적하는 비율로 포함하는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 다수의 주사기, 앰풀, 호일 패킷, 블리스터 팩, 또는 의료 장치를 포함하며, 예를 들어, 각각은 단일 조합 단위 투여량을 함유한다. 키트의 용기는 공기가 통하지 않고, 방수(예를 들어, 습기 또는 증발의 변화에 대해 불투과성)이고/이거나 빛이 통하지 않을 수 있다.
키트는 선택적으로 조성물의 투여에 적절한 장치, 예를 들어, 주사기 또는 다른 적절한 전달 장치를 포함한다. 상기 장치는 제제의 하나 또는 모두가 미리 로딩되어 제공되거나, 비어있지만 로딩하기에 적절하게 제공될 수 있다.
Ⅷ. 치료 방법
본원에 기재된 방법에 따라 정제된 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 사용하여 제조된 제형은 LT-β-R 봉쇄제로 치료할 수 있는 다수의 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 질병의 예는 류머티스성 관절염과 같은 자가면역 질환, 크론병과 같은 장 질환, 및 다발성 경화증과 같은 신경학적 질환을 포함한다. 본원에 기재된 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 질병의 다른 예는 US 20020197254 및 US 7,255,854에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 그의 전문으로 인용된다.
일 구체예에서, 본 발명의 정제된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물은 탈수초성 질환을 치료하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바의, "탈수초성 질환"은 신경으로부터 신경 섬유를 포위하고 절연시키는 지방 수초인 미엘린의 파괴 또는 제거와 연관된 임의의 질병이다. 탈수초성 질환은 예를 들면, 다발성 경화증 (예, 재발성/이장성 다발성 경화증, 2차 진행성 다발성 경화증, 진행성 재발성 다발성 경화증, 1차 진행성 다발성 경화증, 및 급성 전격성 다발성 경화증), 중심성 뇌교 수초용해, 급성 산재성 뇌척수염, 진행성 다병소 백질뇌증; 아급성 경화성 전뇌염, 감염후 뇌척수염, 만성 염증 탈수초성 다발성신경병증, 길랑-바레 증후군, 진행성 다병소 백질뇌병증, 데빅병, 발로 동심성 경화증, 및 백질이영양증 (예, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 아드레노백질이영양증, 펠리제우스-메르츠바하병, 카나반병, 중추 저수초화에 의한 유년기 실조증, 알렉산더병, 또는 레프섬병)을 포함한다. 탈수초성 질환을 갖는 인간 환자는 시력 손상, 무감각, 사지의 약화, 미세 떨림 또는 경직, 열불내성, 언어 장애, 실금, 현기증, 또는 손상된 고유 수용성 감각 (예, 균형, 조정력, 팔다리의 위치 감각)를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 탈수초성 질환의 1개 이상의 증상을 가질 수 있다.
탈수초성 질환 (예, 탈수초성 질환에 대한 유전적 성향)의 가족 병력을 갖거나, 또는 상기 탈수초성 질환의 가볍거나 드문 증상을 보이는 인간 (예, 인간 환자)는 본 발명의 목적상 탈수초성 질환 (예, 다발성 경화증)이 발전할 위험에서 고려될 수 있고 본원에 기재되는 바의 제약학적 조성물에 의해 치료될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자의 상태를 개선시키기에 충분한 양, 빈도로, 및/또는 시간 동안 피검자에게 투여될 수 있다. 　일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 피검자에서 재수초화를 유도하거나 또는 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자에게 1회 투여된다. 다른 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자에게 1회 이상 예, 3-10일마다 1회; 5-20일마다 적어도 2회 및 1회 미만; 28-31일마다 적어도 2회 및 1회 이하; 매주; 격주; 매달; 적어도 4주의 과정에 걸쳐 매주; 적어도 6주의 과정에 걸쳐 격주; 적어도 3개월의 과정에 걸쳐 매월; 또는 적어도 6개월의 과정에 걸쳐 매월 투여된다.
몇몇 구체예에서, 복용량을 결정하기 위해 시험중인 가용성 LT-β-R-Ig의 적합한 시작 용량 (예, 피검자에서 재수초화를 유도하기에 충분한 양)은 피검자의 체중당 0.001 mg의 가용성 LT-β-R-Ig이다. 　몇몇 구체예에서, 적합한 용량 및 시작 용량은 성별, 연령, 체중, 신체적 건강, 또는 본원에 기재된 다른 인자들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 다수의 주관적인 환자-특이적 인자에 의해 결정된다.
몇몇 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자에게 정맥 내로 또는 비경구로 (예, 척수 강내로, 피하로, 근육내로, 비강내로, 또는 구강내로) 투여된다.
몇몇 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자에게 단일 요법으로서 투여될 수 있다. 　몇몇 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 피검자에게 또 다른 치료법, 예, 자가 면역 질환을 위한 또 다른 치료법, 예를 들면, 탈수초성 질환 (예, 본원에 기재된 임의의 탈수초성 질환 (예, 다발성 경화증))과의 병용 요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 자가 면역 질환, 예, 탈수초성 질환을 가지고 있거나, 또는 그를 발병시킬 위험이 있는 피검자에게 유리한 치료를 제공하는 1개 이상의 추가의 작용제를 피검자 (예, 인간 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig 및 1개 이상의 추가의 작용제는 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 가용성 LT-β-R-Ig는 먼저 시간에 맞춰 투여되고, 1개 이상의 추가의 작용제가 2차로 시간에 맞춰 투여된다. 몇몇 구체예에서, 1개 이상의 추가의 작용제가 먼저 시간에 맞춰 투여되고 가용성 LT-β-R-Ig가 2차고 시간에 맞춰 투여된다. 가용성 LT-β-R-Ig는 선행 또는 현재 투여된 요법을 대체하거나 또는 논쟁의 여지가 있을 수 있다. 예를 들면, LT-β-R-Ig로 치료함에 따라, 1개 이상의 추가의 작용제의 투여는 중지되거나 또는 감소될 수 있고 예를 들어 낮은 수준으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 선행 요법의 투여가 유지된다. 몇몇 구체예에서, 선행 요법은 LT-β-R-Ig의 수준이 치료 효과를 제공하기에 충분한 레벨에 도달할 때까지 유지될 것이다. 2가지 요법이 조합하여 투여될 수 있다.
일 구체예에서, 본원에 기재된 바의 제약학적 조성물을 사용하여 탈수초성 질환을 위해 치료 중인 피검자는 재수초화를 위해 모니터링될 수 있다. 본원에 정의된 바의, 재수초화를 위한 피검자 (예, 인간 환자)를 모니터링하는 것은 변화, 예, 재수초화를 지시하는 1개 이상의 파라메터에서 개선에 대해 피검자를 평가하는 것을 의미하고, 예를 들면, 탈수초성 질환의 1개 이상의 증상에 있어서 개선을 누구나 모니터링할 수 있다. 그러한 증상은 본원에 기재된 탈수초성 질환의 임의의 증상을 포함한다. 재수초화는 또한 피검자에서 미엘린의 상태의 직접적인 결정을 포함하는 방법에 의해 모니터링될 수도 있고, 예를 들면, 누구나 자기 공명 영상화 (MRI)를 사용하여 백질 덩어리를 측정하거나 또는 자기 공명 분석 (MRS) 뇌 스캔을 사용하여 미엘린 섬유의 두께를 측정할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 평가는 가용성 LT-β-R-Ig의 투여 후, 바람직하게는 최초의 투여 후 적어도 1시간, 예, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 24, 또는 48시간, 또는 적어도 1일, 2일, 4일, 10일, 13일, 20일 또는 그 이상, 또는 적어도 1주, 2주, 4주, 10주, 13주, 20주 또는 그 이상 수행된다. 피검자는 다음 기간들 중의 1개 이상: 즉, 치료를 시작하기 전; 치료 도중; 또는 치료의 1개 이상의 요소들이 투여된 후에 평가될 수 있다. 평가는 추가의 치료법에 대한 수요를 평가하는 것, 예를 들면, 복용량, 투여 빈도, 또는 치료 기간이 변경되어야 하는지 여부를 평가하는 것을 포함한다. 그것은 또한 선택된 치료 양상을 부가하거나 또는 누락시킬 필요성을 평가하는 것, 예를 들면, 본원에 기재된 탈수초성 질환에 대한 치료법들 중의 임의의 것을 부가하거나 또는 누락시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 가용성 LT-β-R-Ig의 연속 투여는 필요할 경우 1개 이상의 추가의 치료법 작용제에 의해 행해질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 평가의 미리 선택된 결과가 수득되는 경우, 추가의 단계가 취해지고, 예를 들어, 피검자는 또 다른 치료법을 투여받거나 또는 또 다른 평가 또는 시험이 수행된다.
예를 들면, 요추 천자 (즉, 즉 척수 탭) 뇌척수액의 샘플을 수득하기 위해 환자에서 수행될 수 있다. 이어서, 뇌척수액은 예, (i) 미엘린의 작은 단편과 같은 비정상 단백질, (ⅱ) 특이한 유형의 임파구의 상승된 레벨, 및/또는 (ⅲ) 면역글로불린 (IgG) 분자들의 비정상적 레벨의 존재에 대해 시험된다. 탈수초성 질환에 대한 정량적 시험의 또 다른 예는 유발 가능성이 있는 시험으로, 눈, 귀 또는 피부로부터 뇌에 도달하는 신경 임펄스를 취하는데 얼마나 걸리는지의 함수로서 신경 활성을 측정한다. 탈수초성 질환은 또한 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔, 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 스캔, 확산-가중 영상화 (DW-I, 또는 DW-MRI), 확산 텐서 영상화, 척수촬영법, 자화 전이를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 여러 가지 영상화 방법들 중의 임의의 것을 사용하여 중추 신경계에 존재하는 염증 병변 (즉, 경화증)의 크기 및/또는 수를 평가함으로써 시험될 수 있다. 환자들은 또한 그들의 신경 심리학의 각종 반-정량적 또는 정성적 평가 (예, 기억력, 연산, 주의력, 판단 및 논증 등의 여러 가지 능력의 상태) 또는 예를 들면 상기 다발성 경화증의 증상들 중의 임의의 것을 포함하여 환자에 의해 나타나는 증상을 사용하여 진단될 수 있다. 추가로, 탈수초성 질환의 진행 정도는 미엘린 기본 단백질-유사 물질 (MBPLM)의 상승된 레벨에 대해 환자의 소변을 검사함으로써 검출될 수 있고, 그의 기질은 축색 돌기 손상이 질병 진행 중에 발생함에 따라 상승하게 된다 (예를 들면, Whitaker et al. (1995) Ann. Neural. 38(4):635-632 참조). 색맹에 대한 특정 시험은 또한 눈에 대한 탈수초성 질환의 영향을 트래킹하는데 유용할 수 있다.
그러한 상기 진단 방법은 또한 가용성 LT-β-R-Ig에 의한 치료에 이어 증가된 피검자 (예, 환자)에서 재수초화를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 재수초화는 본원에 기재된 영상화 방법들 중의 임의의 것을 통해 결정된 바와 같이 환자에게 존재하는 경화증의 크기 또는 수의 감소와 일치할 수 있다. 또한, 피검자에서 재수초화는 유발될 가능성이 있는 시험을 통해 결정되는 바와 같이, 귀, 눈, 또는 피부로부터 뇌까지 신호의 전파 속도의 증가로서 측정될 수 있다. 몇몇 경우에, 재수초화는 백질 부피 (예, 척수 또는 뇌에서 신경 덩어리)의 증가로서 평가될 수 있고, 특히 탈수초성 질환이 신경 위축을 초래하였다. 몇몇 경우에, 피검자에서 재수초화의 정도 또는 발생률은 예를 들면, 자기 공명 분광 스캔을 사용하여 피검자에서 미엘린의 두께를 직접적으로 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 탈수초성 증상을 유발할 수 있는 요법 또는 의약과 조합하여 본원에 기재된 방법 및 조성물의 사용을 포함한다. 예를 들면, 류머티스성 관절염의 치료를 위한 항-TNF 요법은 부작용으로서, 탈수초성 상태의 하나의 유형을 초래할 수 있다. 따라서, 가용성 LT-β-R-Ig는 탈수초화 부작용을 방지하거나, 완화시키거나, 또는 역전시키기 위해서 및 재수초화를 촉진시키기 위해 항--TNF 요법과 조합하여 투여(예, 동시-투여)될 수 있다. 항-TNF 요법은 아달리무맙 (히무라), 이타너셉트 (엔브렐), 또는 인플릭시맙 (레미케이드)를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
몇몇 경우에, 가용성 LT-β-R (예, LT-β-R-Fc)은 차선적 요법으로서 사용된다. 예를 들면, 탈수초성 질환 (예, 다발성 경화증)에 대한 1개 이상의 요법에 미반응성인 것으로 결정된 환자는 1개 이상의 치료법을 수용하는 것을 중단하고 가용성 LT-β-R-Ig에 의한 치료를 시작할 것이다.
다음 개시 내용은 본 발명의 제법 및 사용법을 포함하여 본 발명의 국면들을 당업계의 숙련자들에게 교시한다. 다음 실시예들은 본 발명을 더욱 명확하게 하는 것을 의미하고, 그것을 제한함을 의미하지 않는다.
실시예
다음 실시예들은 항체 기재 생물제제, 즉, LT-β-R-Ig를 생성물 관련된 불순물로부터 정제하는 방법을 기재한다. 3가지 생성물 관련된 불순물은 CHO 세포에서 발현되는 경우 LT-β-R-Ig에 의해 동시-발현된다. 이들 생성물 관련된 불순물은 정제 공정에서 도전 과제를 제시한다. 불순물은 LT-β-R-Ig의 2가지 단량체성이지만 구조적으로-독특한 불활성 형태들 ("불활성-1" 및 "불활성-2"라 칭함) 및 이량체성 및 고분자량 물질을 포함한 응집물을 포함한다. CHO 세포에서 Fc 융합 단백질의 발현 후 불순물 대 단백질 생성물의 백분율의 예는 약 46% 생성물 (활성, 단량체성 단백질), 약 35%의 응집물, 약 13%의 불활성-2, 및 약 6%의 불활성-1이다.
실시예 1: 항체 기재 생물제제의 정제 동안 다중 생성물 관련된 불순물을 제거할 수 있는 고 분해능 소수성 상호반응 크로마토그래피 공정의 개발(주기 1)
2개의 단량체성이지만, 불활성인, 생성물-관련된 불순물을 항체 기반 생성물으로부터 제거할 수 있는 HIC 공정이 상 1 임상 제조를 위해 개발되었다. 후속 개발 동안, 크로마토그래피 분해능을 유지하면서 용량 및 견고성의 개선이 구해졌다. 대체 HIC 수지 및 결합 염이 탐구되고, 분리 효율에 대해 임계적인 파라메터들이 실험중 디자인 시도에 의해 확인된 개발 연구가 기재될 것이다. 독특한 분해 능력을 갖는 제2 HIC 단계가 제3 생성물-관련된 불순물을 제거하기 위해 동일한 공정의 하류에 사용되었다. 제조 규모의 임상적 생산에 적합한 견고한 공정의 확립에서 직면한 쟁점 및 도전 과제가 고찰될 것이다.
다음 실시예는 생성물-관련된 불순물을 항체 기반 생성물, 예, 임상적 제조를 위해 개발된 단백질의 2가지 불활성 형태로부터 제거할 수 있는 소수성 상호반응 크로마토그래피 (HIC) 공정을 기재한다. 다음 실시예는 HIC 부틸 및 페닐 수지, 결합 염, 및 분리 효율에 대해 중요한 것으로서 확인된 파라메터들을 기재한다.
전체적으로, 다음 공정 ("주기 1-1" 및 "주기 1-2"이라 칭함)은 제1 HIC 부틸 컬럼, 예, 부틸-650M 수지 (Tosoh Biosciences)에 이어 제2 HIC 페닐 컬럼을 사용하였다. HIC 공정의 조합은 불활성 및 응집된 분자들의 감소를 초래하였다. 부틸-650M 수지는 활성 LT-β-R-Ig를 다른 형태들, 즉, 불활성-1, 불활성-2, 및 응집물 형태들로부터 분리하는데 있어서 효과적인 것으로 측정되었다. 주기 1-1은 LT-β-R-Ig의 2000 L 제조를 위해 사용된 한편, 주기 1-2는 고급 적정 출발 물질 (즉, 800 mg/mL)에 대해 최적화되었다. 주기 1-1 및 1-2 모두는 제1 부틸 HIC 분리 및 제2 페닐 HIC 분리를 포함하였다.
재료 및 방법
이 실시예에 사용된 수지는 토요펄 부틸-650M (Tosoh Bioscience) 및 페닐 세파로스 6 고속 플로우 (Pharmacia)를 포함하였다. 부틸-650M 크로마토그래피 공정은 평형 및 20 mM Na 포스페이트, pH 7.5, 1.65 M의 NaCl을 포함하는 용액을 사용한 세척 단계, 및 20 mM Na 포스페이트, pH 7.5, 0.7 M의 NaCl을 포함하는 용액을 사용한 용출 단계를 포함하였다.
컬럼 용출물은 Pharmacia UV-1 검출기를 사용하여 흡광도 280 nm (A280)로 모니터링되었다. Pharmacia 및 Unicorn 소프트웨어 버전 3.2.6으로부터 AKTA FPLC이 여러 실험을 위해 사용되었다.
여기서 주지된 것을 제외하고, 크로마토그래피는 18 - 28℃ 범위의 온도에서 수행되었다. 컬럼 온도는 Torrey Pines Scientific HPLC 컬럼 냉각기/히터 모델 C030을 사용하여 특이적인 경우에 조절되었다. 정제 용액을 위한 온도는 Neslab 수조 모델 RTE-211을 사용하여 몇몇 실험에서 조절되었다.
JMP® 소프트웨어 (SAS Institute) 버전 3.2.6을 사용하여 수행된 통계학적 분석은 실험 디자인 및 결과 분석을 위해 이용되었다.
본 명세서 전반의 LT-β-R-Ig 단백질 농도는 1.25의 멸종 계수에 기초한다.
1.1 주기 1-1
주기 1-1은 포유동물의 세포 배양액 중에서 발현된 LT-β-R-Ig로부터 불순물을 제거하기 위해 개발되었다. 제거될 필요가 있는 불순물은 LT-β-R-Ig 단백질의 2가지 상이한 불활성 형태, 즉, 불활성-1 및 불활성-2 형태 뿐만 아니라 응집물을 포함하였다. 주기 1-1의 공정에 대한 요약은 도 1에 기재된다.
LTβR-Ig은 먼저 먹이-배치 공정을 사용하여 재조합 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되었다. 주기-1-1에서, 역가는 약 300 mg/L였고 응집물은 약 12%, 불활성-1은 약 5% 및 불활성-2는 약 9%였다. 발현 후, 세포 배양액이 수확되고 원심분리되었다. 명확해진 조건 배지는 단백질-A 캡처 컬럼 상으로 수행되었다. 결과의 LT-β-R-Ig 혼합물은 부틸 수지 HIC 컬럼 (HIC-1이라 칭함) (부틸-650M; Tosoh Bioscience) 상에서 수행되었고, 여기서 수지는 8 g/L의 용량을 가졌다. HIC-1 단계는 LT-β-R-Ig의 불활성 형태 1 및 2의 혼합물을 분명히 하였고, 단백질 용량에 대해 최적화되었다.
부틸-650M 수지는 다음의 바람직한 특성들: 즉, 1) 강성의 메타크릴레이트 주쇄; 2) 40 - 90 ㎛ 입도; 3) 80 - 300 cm/hr의 오퍼레이팅 속도; 및 4) 가능한 엄격한 세정 조건, 예, 1 N NaOH, 50% 메탄올을 포함하여 다른 시험된 수지들에 비해 수많은 이유로 선택되었다. 부틸 수지는 LT-β-R-Ig의 불활성 형태의 99% 이상을 제거할 수 있다.
많은 염들이 LT-β-R-Ig 단백질 생성물을 불활성 및 응집물 형태로부터 용해하는데 가장 효과적인 것을 결정하기 위해 선별되었다. NaCl 및 Na2SO4는 모두 불순물을 LTβR-Ig 생성물으로부터 용해시킬 수 있는 것으로서 확인되었다. LTβR-Ig에 대한 불활성-1 및 불활성-2 형태는 부틸 수지로부터 각각 세척 및 스트립 NaCl 용액 중에서 용출되었다. 부틸 HIC-1 단계는 불활성-1 및 불활성-2를 용출물 분획 중에서 < 1.0 %로 감소시켰다.
도 3은 활성 LT-β-R-Ig로부터 LT-β-R-Ig의 양 불활성 형태 및 응집물을 용해하는 HIC-HLPC, 및 응집물을 활성의 단량체성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 용해시키는 크기 배제 HPLC (SE-HPLC)를 포함하여, HIC-1에 이어 공정 중간체의 HPLC 분석을 기재한다.
HIC-1 부틸 단계 후 결과의 요약이 도 2에 제공되고, 여기서 LT-β-R-Ig의 2가지 불활성 형태는 활성 LT-β-R-Ig로부터 분리되었다. 도 2에 기재된 바와 같이, LT-β-R-Ig 생성물은 HIC-1 부틸 수지로부터 0.7 M의 NaCl을 사용하여 용출되었다. HIC-1에 대한 최종 주기-1-1 조건은 다음과 같고: 즉, 1.65 M의 NaCl에서 결합하고 (모두 결합됨), 1.55 M의 NaCl에서 세척하고 (불활성-1은 컬럼에서 완전히 세척됨) 0.7 M의 NaCl에서 용출되고 (생성물 및 응집물이 용출됨), 0 M의 NaCl에서 스트립된다 (불활성-2는 컬럼로부터 돌출함) (또한 도 2 참조).
이어서, HIC-1 단계로부터 용출물은 낮은 pH 공정을 사용하여 바이러스 볼활성화되었고, 페닐 세파로스 (페닐 세파로스 6 고속 유동 하이 서브)를 사용하여 제2 HIC 크로마토그래피 컬럼 상에서 순차로 처리되었다.
제2 HIC 단계 (페닐)는 단백질 응집물 클리어런스를 초래하였고, 용출물의 용해를 최적화하였다. HIC-2 (페닐) 단계에 의한 응집물 클리어런스를 보여주는 결과는 적재 효과를 포함하여, 도 8A에 기재된다.
제2 HIC (HIC-2) 단계 후, 용출물은 바이러스 제거 필터 (VF) 및 한외여과/정용여과 (UF/DF)를 통해 추가로 처리되었다.
1.2 주기 1-2
주기 1-2는 상기 주기 1-1의 변형된 버전이고, 여기서 주기 1-2는 용량을 증가시키는 개선된 능력을 가졌다 (출발 물질에서 단백질 역가가 증가됨). 주기 1-2의 개관이 도 5에 제공된다. 아래 기재된 바와 같이, 주기 1-2에서 부틸 컬럼 상에서 8 내지 20 g/L의 수지로부터 용량을 증가시키기 위해 (염화나트륨 대신에) 황산 나트륨이 사용되었다.
상이한 리오트로픽 염들이 개선된 용량 특성 및 LT-β-R-Ig의 LT-β-R-Ig의 활성 대 불활성 (형태 1 및 2)를 용해시키는 능력 모두에 대해 선별되었다. 선별은 역가의 증가 후 LT-β-R-Ig의 불활성 및 응집된 형태를 효과적으로 제거할 수 있는 염 및 수지를 측정하기 위해 수행되었다. 리오트로픽 염의 선별 결과는 표 1에 기재된다.
Figure pct00003
황산 나트륨이 저 염 농도에서 고 용량을 촉진시키는 그의 능력에 대해 선택되었고, 이는 비용 면에서 NaCl에 필적하고 그것이 온도 및 다른 염에 민감한 용해도를 갖는다는 사실에도 불구하고 폐기물-관리에 친화적이고, 주변 온도에서 약 1.3 M의 최대 용해도를 갖는다.
수지 선별 결과는 표 2에 제공된다. 여러 가지 결합 염을 사용한 HIC 수지의 선별은 0.6 M의 Na2SO4에서 적재된 부틸 수지-2 (Tosoh Biosciences 토요펄 부틸 600M 수지)가 주기 1-2의 HIC-1 단계에 대한 최적화된 조합이었지만, 다른 조합이 마찬가지로 불순물을 용해시키는데 효과적인 것으로 입증되었음을 시사하였다. 따라서, 0.6M 황산 나트륨에서 적재된 부틸 수지-2 (750 Å의 공극도를 가짐)가 최상의 후보인 것으로 입증되었다.
Figure pct00004
일반적으로, 주기 1-2의 공정 단계는 바이러스 불활성화 순서 및 부틸 단계를 위한 황산 나트륨 기재 세척액의 사용을 제외하고는 주기 1-1에 대해 상기한 것들과 유사하였다. LT-β-R-Ig는 먼저 먹이-배치 공정을 사용하여 재조합 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되었다. 세포 발현으로부터 역가는 5%의 불활성-1 LT-β-R-Ig, 14%의 불활성-2 LT-β-R-Ig, 및 22% LT-β-R-Ig 응집물을 포함하여 약 800 mg/L의 LT-β-R-Ig였다. 발현 후, 세포 배양액이 수확되고 원심분리되었다. 명확해진 조건 배지는 단백질-A 캡처 컬럼 상으로 수행되었고 저 pH 공정을 사용하여 바이러스 불활성화되었다. 결과의 LT-β-R-Ig 혼합물은 부틸 수지 HIC 컬럼 (HIC-1이라 칭함) (부틸-650M; Tosoh Bioscience) 상에서 수행되었고, 여기서 수지는 20 g/L 이상의 용량을 가졌다. HIC-1 단계는 LT-β-R-Ig의 불활성 형태 1 및 2의 혼합물을 분명히 하였고, 단백질 용량에 대해 최적화되었다.
2가지 세척 전략이 용량을 증가시키기 위해 부틸 수지를 세척하기 위한 최적의 파라메터들, 즉, 황산 나트륨 단계 세척액 및 황산 나트륨 단계/이어서 역 구배 세척액을 결정하기 위해 사용되었다. 이들 2가지 전략의 결과가 도 6에 기재되고, 여기서 전략 B - 단계 및 구배 세척액은 더 잘 용해된 용출을 제공하는 것으로 입증되었다. 상이한 적재량, 황산 나트륨 세척액 농도, 및 황산 나트륨 용출 용액 농도가 아래 표 3 및 4에 기재된 바와 같이 연구되었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
등고선 플롯들이 주기 1-2의 HIC-1 부틸 정제 단계를 위한 임계적 인자를 결정하기 위해 분석되었다. 불활성-1 클리어런스에 대해 확인된 임계적 인자는 컬럼 적재 (18-26 g/L의 범위) 및 Na2SO4 세척액 농도 (0.455-0.465 M의 범위, 좁은 도전성 및 삼투압 규격을 사용함)를 포함하였다. 불활성-2 클리어런스에 대한 주요 인자는 0.22 M 초과로 유지된 Na2SO4 용출 농도였다. 정제 단계에서 중요하지 않은 것으로 결정된 인자들은 적재 부피 (Na2SO4 농도가 > 0.56 M인 경우) 및 용출 부피 (Na2SO4 농도가 > 0.22 M인 경우)를 포함하였다. 다른 잠재적으로 중요한 인자들은 세척액 부피, 온도, 수지 할당 일관성, 및 적재 단백질 농도를 포함하였다.
주기 1-1 및 1-2의 요약
따라서, LT-β-R-Ig 단백질의 정제는 3가지 상이한 생성물-관련된 불순물, 즉, LT-β-R-Ig 단백질의 2가지 상이한 불활성 형태 및 LT-β-R-Ig의 응집물로부터 활성 LT-β-R-Ig 단백질 (약품)을 다시 분리한 HIC 컬럼의 조합을 사용하여 달성되었다 (결과의 요약을 위해, 도 7 참조).
HIC-1 컬럼 단계 (부틸 수지)는 활성 LTβR-Ig 단백질의 분해능을 유지하면서 증가된 용량에 대해 최적화되었다. 부틸 HIC 컬럼은 활성 LT-β-R-Ig 단백질을 이 단백질의 2가지 상이한 불활성 형태로부터 분리할 수 있었고, 즉, LT-β-R-Ig (불활성-1 및 불활성-2)의 이황화물 스크램블된 단량체성 종들은 분명히 할 수 있었다. 생성물 수율은 HIC-1 컬럼 단계에 의해 LT-β-R-Ig의 불활성 종들의 클리어런스에 대해 가중되었다. 황산 나트륨은 종들의 고 분해능에 의해 고 용량을 촉진시켰다. 불활성 형태 대 생성물 수율의 클리어런스를 최대화시키는 임계 인자들은 컬럼 적재 및 Na2SO4의 세척액 농도 (주기 1-2에 대해)를 포함하였다.
2가지 공정은 또한 제3-컬럼 단계, 즉, HIC-2 (페닐 수지)의 최적화를 포함하였고, 이는 LT-β-R-Ig 단백질의 응집물 형태, 뿐만 아니라 잔류 불활성-2가 분명한 생성물을 생성하였다. HIC-2 단계에 대해 확인된 임계적 인자들은 컬럼 적재, 층 높이, 및 유속을 포함하였다.
실시예 2: 생물학적 활성 LT-β-R-IG 융합 단백질의 정제: 주기 2
다음 실시예는 Ig-융합 생물제제, 즉, LT-β-R-Ig 융합 단백질을 높은 백분율의 생성물-관련된 불순물, 즉, 약 50%의 생성물-관련된 불순물을 함유하는 공급 원료로부터 정제하는 공정을 기재한다. 상기한 바와 같이, LT-β-R-Ig의 공급 원료는 상이한 유형의 불순물, 즉, 응집된 종들 및 생성물의 2가지 독특한 이황화물-스크램블된 형태 (- LT-β-R의 불활성-1 및 불활성-2 형태로 명명됨)를 함유한다. 이들 불순물이 LT-β-R-Ig (생성물)과 밀접하게 관련됨에 따라, 목적하는 생성물의 정제는 도전 과제를 제시한다.
LT-β-R-Ig를 위한 제조 공정은 초기에 조기 임상적 연구를 위해 개발되었고, 이후에 상용화에 충분한 수준으로 생산성을 증가시키기 위해 변형되었다. 이를 달성하기 위해, 세포 배양 생산성은 4가지 인자에 의해 증가되었다. 그러나, 이러한 변화는 20% 내지 대략적으로 50%의 전체 생성물-관련된 단백질로부터 생성물 변종의 증가와 연관되었다. 가장 현저하게는, 응집물 레벨은 이들이 전체의 약 12%에서 약 35%로 증가함에 따라 2배 이상이었다. 원료 물질은 1350 mg/L에 이르는 역가를 포함하였고, 이는 약 6%의 불활성-1 LT-β-R-Ig, 약 14%의 불활성-2 LT-β-R-Ig 단백질, 및 약 28 내지 35%의 응집물을 포함하였다. LT-β-R-Ig 단백질 생산의 증가는 활성 LT-β-R-Ig (약품)을 증가시켰을 뿐만 아니라 이러한 융합 단백질과 연관된 3가지 불순물을 증가시켰다.
따라서, 주기-2는 포유동물의 세포 발현으로부터, 특히 정제를 위한 도전 과제를 제시하는 단백질 응집물에서 큰 증가와 관련하여 LT-β-R-Ig 융합 단백질 역가의 증가에 대한 반응으로 고안되었다. 세포 배양 수확물로부터 이들 불순물을 제거하기 위해, 최적화된 공정이 개발되었고, 제1 혼합 모드 HIC 수지 및 제2 페닐 HIC 수지를 사용한 2가지 부분 분리에 기초하였다. 불순물의 증가에 대한 개관이 아래 표 5에 기재된다.
Figure pct00007
생성물 관련된 불순물이 하류 처리를 위한 원료에서 전체 단백질의 50% 이상에 존재하였다 (46%의 생성물; 35%의 응집물; 6%의 불활성-1; 및 13%의 불활성-2).
주기 2는 출발 공급 원료의 50% 이상이 바람직하지 않은 불활성 및 응집된 변종으로 구성된 경우에 생성물을 정제하는데 성공적이었다. 주기-2 공정은 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 15000 L의 제조 규모로 성공적으로 정제하기 위해 사용되었다. 불활성-1은 생성물 (비응집된 활성 LT-β-R-Ig)과 여러 크로마토그래피 모드로 동시-정제되었지만, LT-β-R-Ig 단백질의 이들 2가지 형태의 효율적인 분리는 혼합 모드 수지를 사용하여 달성되었다. 불활성-2는 생성물으로부터 강력한 방식으로 소수성 상호반응 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 분리되었다. 약물 기질에서 1% 이하에 대한 응집물의 클리어런스는 혼합 모드 및 HIC 크로마토그래피, 뿐만 아니라 혼합 모드 수지에 대한 세척-1 단계의 정확한 조절에 의해 달성되었고, 이는 중요 파라메터들을 식별하고 조사하기 위한 요소 설계 실험에 의해 안내되었다.
주기-2 공정에서, 혼합 모드 크로마토그래피는 응집물을 약 28% (적재 중)에서 약 10-24%로 (용출물에서) 감소시켰다. 순차적 페닐 단계는 나머지 응집물을 분명히 하였고, 즉, 응집물을 적어도 23% (페닐 적재 중)에서 페닐 용출물 중에서 <1%로 분명히 하였다.
주기-2의 개관이 도 9에 제공되고, 다음과 같이 요약된다. 원심 분리에 앞서, 바이오리액터 물질은 (14, 15, 또는 16일) 공정 관련된 불순물의 제거를 촉진시키기 위해 4.7 내지 5.3의 pH로 조절되었다. 수확 원심 분리 후, 트리톤 X-100이 레트로바이러스 불활성화를 촉진시키기 위해 단백질 A 캡처에 대한 적재 물질에 0.05%로 첨가되었다. LT-β-R-Ig 융합 단백질의 후속 캡처는 단백질 A 컬럼을 사용하여 용량 21 g/L로 수행되었다. 단백질 A 캡처 후, 저 pH 바이러스 불활성화가 수행되었고, 이어서 추가의 파보바이러스 클리어런스를 위해 Q 멤브레인 흡착기가 사용되었다. 이어서, 혼합 모드 HIC 컬럼이 LT-β-R-Ig의 불활성-1 형태 및 응집물의 일부의 혼합물을 분명히 하기 위해 31 g/L의 용량으로 사용되었다. 혼합 모드 컬럼 단계에 이어서, 용출물은 페닐을 함유하는 HIC 컬럼에 15 g/L의 용량 및 약 30 cm+의 층 높이에 적용되었다. 이 HIC 컬럼은 활성 LT-β-R-Ig 단백질을 응집물 및 불활성-2 형태로부터 분리하였다. 페닐 컬럼은 불순물의 클리어런스를 최적화시키기 위해 약 30 cm로 증가되었다. 이러한 높이에 대한 최적의 적재 범위는 약 10-15 g/L였다.
따라서, 더 높은 단백질 역가/고 불순물 공급 원료를 처리하기 위해 사용된 하류 변화는 크로마토그래피 단계에 대한 변형을 포함하였다. 선행된 주기-1 공정 단계에 비교하여, 주기-2는 변형됨으로써 수확에 앞서 바이오리액터의 낮은 pH 조절이 있었다. 이는 공정 관련된 불순물의 개선된 침전 및 제거를 허용하였고 증진된 DNA 클리어런스 및 컬럼에 대한 "깨끗한" 공급물을 제공하였다. 수확 물질의 제한된 생성물 안정성으로 인해 낮은 pH 변조에 의한 고속 처리가 요구되었다. 고 용량 단백질-친화도 수지가 역시 사용되었고, 이는 생산성을 증가시키면서 공급 원료를 처리하는데 요구되는 주기의 수의 감소 및 용량의 약 140%의 증가를 제공하였다. 이온 교환 흡착기 역시 파보바이러스 클리어런스에 대한 여분의 능력을 제공하기 위해 공정에 첨가되었다. 새로운 제2 컬럼 (혼합된 양상)이 생성물-관련된 불순물의 용량 및 클리어런스를 개선시키기 위해 공정에 첨가되었다. 이러한 새로운 제2 컬럼은 용량을 380% 초과로 증가시키고 강력한 불활성-1 제거 뿐만 아니라 응집물의 클리어런스를 제공하였다. 주기-2 단계에 대한 추가의 세부 사향은 아래 기재된다.
수확 및 바이러스 불활성화
단량체성 활성 LT-β-R-Ig (생성물)의 정제에 앞서, 단백질은 포유동물의 CHO 세포에서 생산되었고, 수확되었고, 순차적으로 명백해졌다. 수확 시에, 조건화된 배지는 2 - 8℃로 냉각되었고 pH 4.7 - 5.3으로 조절되었다. pH 조절된 조건화된 배지는 디스크 스택 원심분리 볼에 공급되었다. 세포 및 세포 파편이 볼 침전물 유지 공간에서 수집되고, 수확 오퍼레이션 동안 간헐적으로 제거되었다. 명시된 세포-없는 농축물이 볼 상단에 발생하였고, 원심 분리 펌프에 의한 압력 하에 연속적으로 배출되었다. 원심 분리 공정이 완료됨에 따라, 수집된 농축물은 혼합되고, pH 6.9 - 7.5로 중화되었다.
활성 LT-β-R-Ig 및 연관된 불순물 모두를 함유하는 혼합물의 수확 및 원심 분리 후, 트리톤 X-100은 생성물을 손상시킴 없이 또는 허용되지 않은 높은 수준의 응집물을 발생시킴 없이 불활성의 우발적인 바이러스에 첨가되었다. 중화된 농축물의 온도는 15 - 25℃로 조절되었고, 트리톤 X-100가 0.05% (w/v)의 최종 농도까지 첨가되었다. 농축물을 조절한 트리톤-X는 추가로 처리되기 전에 최소 2시간 동안 유지되었다.
혼합물 (LT-β-R-Ig의 불활성 및 활성 형태 및 응집물을 함유함)은 재조합 단백질 A 컬럼 상에서 처리되었다. 재조합 단백질 A (r단백질 A) MabSelect SuRe 수지는 이 수지가 LT-β-R-Ig에 대해 나타내는 높은 결합 친화도 및 특이성으로 인해 캡처 단계를 위해 선택되었다. LT-β-R-Ig의 공정 관련된 불순물로부터의 정제는 LT-β-R-Ig 및 공정의 이러한 크로마토그래피 단계에서 발생하였다. 또한, MabSelect SuRe 단계는 잠재적인 바이러스 오염물, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질의 클리어런스를 제공하였고, 공정 부피를 8배 만큼 감소시켰다. 이러한 크로마토그래피 단계는 18 - 26℃에서 작동되었다.
2차-컬럼 단계 (혼합 모드)를 위해 신규 크로마토그래피 수지를 도입함으로써 생성물-관련된 불순물의 용량 및 클리어런스를 개선하였지만, 잠재적인 파보바이러스의 클리어런스에 대한 능력을 감소시켰다. 최적의 시설-적합성을 갖는 우발적 파보바이러스의 과다한 클리어런스를 복구하기 위해, Q 멤브레인 흡착기 유니트 오퍼레이션이 공정에서 구현되었다. 개발은 약 100% 생성물 수율을 제공하면서 모델 파보바이러스 - MMV (Mouse Minute Virus)의 클리어런스에 대한 최적의 pH (약 pH 6.4) 및 전도도 (고 전도도)를 확인하였다. Q 멤브레인은 단백질 A 친화도와 2차-컬럼 단계 사이에서 구현되었고, GMP 물질을 사용한 규모-축소 바이러스-스파이킹 연구에서 MMV의 > 3 Log10로 제공되었다.
MabSelect SuRe 용출물의 각각의 주기는 푸울링 전에 낮은 pH 바이러스 불활성화 및 Q 멤브레인 여과를 통해 처리되었다. 이 단계는 생성물을 손상시킴 없이 또는 허용될 수 없는 높은 수준의 응집물을 발생시킴 없이 pH 민감성 바이러스를 불활성화시키도록 고안되었다. MabSelect 용출물은 pH 3.5 - 3.9로 조절되었고, 이어서 18 - 26℃에서 2 - 2.5시간 동안 유지되었다. 이어서, 이 용액은 pH 6.2 - 6.6으로 조절되었고 파보바이러스 클리어런스에 대한 흡착기인 음이온 교환기 (Sartobind Q-멤브레인 흡착기 (QMA))를 포함하여, 다음 단계로 공정이 계속되었다.
혼합 모드 수지
혼합 모드 수지, 즉, 캡토 MMC 크로마토그래피 (GE/Healthcare)는 주기-2의 LT-β-R-Ig 정제 공정에서 제2 크로마토그래피 단계였다 (제1 단계는 단백질 A임). 캡토 MMC는 혼합 모드 수지이지만, 그것은 양이온-교환 모드로 작동되었다. 혼합 모드 수지는 LT-β-R-Ig에 대한 그의 고 결합 용량 및 활성인 단량체성 LT-β-R-Ig를 공정- 및 생성물-관련된 불순물로부터 분리하는 그의 능력으로 인해 선택되었다. 또한, 캡토 MMC 단계는 숙주 세포 단백질, MabSelect SuRe 컬럼 r단백질 A 침출수, 및 잠재적인 바이러스 오염물의 클리어런스를 제공하였다. 캡토 MMC 크로마토그래피는 또한 LTβR-Ig의 응집물 및 불활성 종들과 같은 생성물 관련된 불순물을 제거하였다. 이러한 단계는 16 - 24℃에서 수행되었다. 캡토 MMC 단계 및 불활성-1 및 응집물 불순물 모두의 제거를 위한 조건들은 다음을 포함하였다: 4.8-5.2의 적재 pH를 갖는 26-31 g/L의 적재 속도. 또한, 제1 세척액은 7.0 내지 7.2의 pH를 가졌다. 컬럼 적재 및 세척 단계는 수율 및 응집물 클리어런스에 영향을 미쳤다.
주기-1 LT-β-R-Ig 정제 공정에서 제2 컬럼 단계의 주요 역할 (제1 컬럼은 단백질 A였음)은 이황화물-스크램블된 생성물 관련된 불순물, 즉, 불활성-1 종들을 활성인 단량체성 LT-β-R-Ig 생성물으로부터 분명히 하는 것이었다. 주기-1에서, 이러한 분리는 Tosoh Bioscience 부틸 650M 수지를 사용하여 수행되었다. 그러나 부틸 650M 수지는 그것이 비교적 낮은 결합 용량을 갖고 증가된 역가에 대해 적합하지 않았다는 점에서 제한되었다. 따라서, LT-β-R-Ig 주기-2 공정 개발에 대한 도전 과제는 주기-1에서 달성된 것에 필적하는 불활성-1 클리어런스를 유지하면서 제2 컬럼 단계의 용량을 증가시키는 (컬럼 주기링을 최소화하면서 증가된 역가를 수용하는) 조건들을 확인하는 것이었다. 고 용량 IEX 수지가 사용되었고 중간 세척 단계를 사용하는 강력한 불활성-1 클리어런스가 가능할 수 있었다.
선택된 양이온 교환/HIC 혼합 모드 수지는 캡토 MMC (GE/Healthcare)였다. 0.66 cm (I.D.) x 15-20 cm 층 높이 유리 컬럼 (Omnifit)이 사용되었고, 실험은 실온 (22-26℃)에서 수행되었다.
캡토 MMC 수지는 혼합 모드 리간드 (GE Healthcare)로 유도체화된 가교된 아가로서 비드로 구성되어 있다. 이 리간드는 타겟 단백질과의 상호 반응을 위한 여러 가지 다중 기능성을 함유하고, 이는 이온성 및 소수성-타입의 상호 반응을 포함한다. 따라서, 이 수지는 크로마토그래피의 소수성 및 양이온성 모드 양쪽으로 작동될 수 있다. LT-β-R-Ig 정제 공정을 위해, 캡토 MMC 컬럼은 양이온 모드로 작동되었고, 여기서 LT-β-R-Ig는 완충액 pH 및/또는 완충액 전도도를 증가시킴으로써 수지로부터 용출되었다.
캡토 MMC 개발 중에 수행된 분석은 분석적 HIC 및 분석적 SEC였다.
수율을 결정하기 위해 OD280을 사용하는 것 외에, LTβR-Ig 회복은 또한 방정식 (1)에 정의된 바와 같이, "활성 단량체 수율"을 사용하여 정량화되었다:
Figure pct00008
여기서: V는 용액 부피 (mL)이고, OD280은 280 nm/mL에서 흡광도이다. % 단량체 및 % "활성" 종들은 각각 HPLC-SEC 및 분석적-HIC를 사용하여 측정되었다. LT-β-R-Ig 응집물은 이량체 (이황화물 결합된 분자의 4개의 사슬을 함유하는 멀티머로서 정의됨) 및 고분자량 종들 모두를 포함하였다.
캡토 MMC에 대해 5% 브레이크쓰루에서 동적 결합 용량 (DBC)은 방정식 (2)를 사용하여 계산되었다:
Figure pct00009
방정식 (2)
여기서 Co는 적재 (mg/mL)된 단백질의 농도와 동일하고, VBT는 5% 브레이크쓰루 (mL) 지점에서 적재된 부피와 동일하고, VB는 수지 층의 전체 부피와 동일하고, VDV는 시스템 및 데드 컬럼 부피와 동일하다.
캡토 MMC 수지 (혼합 모드)는 활성의 단량체성 LT-β-R-Ig (목적한 생성물)로부터 불활성-1 형태를 효과적으로 분리할 수 있고, 응집된 형태를 부분적으로 분리할 수 있었다. 캡토 MMC는 LT-β-R-Ig의 양쪽 활성 형태 뿐만 아니라 응집물 종들의 일부를 분리할 수 있었다.
3가지 실험은 캡토 MMC 수지에 대한 작동 조건을 정의할 뿐만 아니라, 조기 세포 배양 개발 작업을 사용하는 작동 조건에서 변화에 대한 수지의 민감성을 조사하기 위해 수행되었다. 이들 연구 결과는 캡토 MMC의 성능이 컬럼 적재, 세척 완충액 pH, 및 세척 완충액 농도에 민감하였음을 보였다. 컬럼 적재 범위는 20-31 mg LTβR-Ig/mL 수지인 것으로 결정되었고, 세척-1 완충액 pH는 pH 7.0-7.2로 설정되고 세척-1 완충액 농도는 약 80 mM 비스 트리스로 설정되었다. 제2 세척액 (세척-2)은 5.5-5.7의 pH (예, pH 5.6) 및 약 20-30 mM 아세트산나트륨의 농도를 가졌다. LT-β-R-Ig는 50 mM 포스페이트 및 150 mM NaCl (pH 7.0)을 사용하여 혼합 모드 수지로부터 용출되었다.
크로마토그래피 조건의 요인 변량 분석은 컬럼 적재 비율 및 세척액 조건이 분리를 위해 중요하였음을 확인하였다.
개발 중에, 바이오리액터 역가의 증가에는 혼합 모드 2차-컬럼 단계에 의해 응집물의 부분적 클리어런스를 필요로 하는 응집물 수준의 증가가 수반되었다. 응집물 클리어런스는 세척 조건의 엄격성을 증가시킴으로써 획득되었다. 그러나 생성물으로부터 응집물의 완전한 분리는 달성되지 않았고 - 응집물 클리어런스는 세척하는 동안 부분적 생성물 손실의 비용으로 획득되었다. 생성물 수율 및 응집물 클리어런스는 컬럼 적재 속도 및 세척 조건에 의존하였고, 최적의 작동 범위가 두 파라메터에 대해 요구되었다.
불활성-1 및/또는 응집물을 분리하는 혼합 모드 컬럼 오퍼레이팅 조건 및 성능은 도 11에 기재된다. 불활성-1 클리어런스는 광범위한 적재 범위 및 세척 조건에 걸쳐 높은 생성물 수율로 강력하였다. 이와 대조적으로, 응집물 클리어런스는 생성물 수율에 부정적으로 영향을 미치고 최적의 범위 내에서조차 컬럼 적재 및 세척 조건에 대한 수율 및 응집물 클리어런스의 의존성을 유발하는 더욱 엄격한 세척 조건을 요구하였다. 제조하는 동안, 세척액을 위해 요구되는 최적 범위 규격은 완충 성분에서 로트-투-로트 변화를 드러냈고, 용액 로트 기록의 개정을 필요로 한다.
혼합 모드 수지를 사용하는 LT-β-R-Ig의 불활성-1 형태 및 응집물의 감소에 대한 요약은 아래 표 6에 기재된다. 표 6은 유사한 조건 하에서, LT-β-R-Ig 생산 및 정제의 다양한 실행의 분석을 제공한다. 혼합 모드 수지의 사용은 LTβR-Ig의 불활성-1 형태를 세포 배양 공정으로부터 획득된 원래 혼합물 중의 약 6%에서 1% 이하로, 또는 검출할 수 없는 양으로 감소시켰다. 또한, 표 6에 기재된 바와 같이, 응집물의 백분율은 또한 약 30% (28-35%)에서 약 10-24%로 감소하였다.
Figure pct00010
캡토 MMC 세척액-1 및 용출 단계 동안 생성물 관련된 불순물의 흡수제 제거
캡토 MMC 단계 동안 생성물-관련된 불순물의 크로마토그래피 작용을 연구하기 위해, 분획들이 캡토 MMC 세척액-1 및 용출 전반에 수집되었다. 각각의 분획은 흡광도, SEC- 및 HIC-HPLC, 및 측정된 각각의 개별 생성물-관련된 종들의 총량에 의해 분석되었다. 이 분석은 사용된 조건 하에 불활성-1 종들 세척액-1 단계 동안 효율적으로 제거되었고 용출 분획 중에서 검출할 수 없었음을 드러냈다. 이와 대조적으로, 고 분자량 변이체 및 이량체 (총체적으로 응집물라 칭함)는 세척액-1 및 용출 푸울에서 회수되었다. 현저하게는, 응집물의 흡수제 제거는 세척액-1 단계의 종료 전에 pH 7.0에서 및 세척액-2 (pH 5.6)의 개시 전에 감소하였다. 따라서, 응집물의 제한된 볼루스는 세척액-1 (80 mM 비스-트리스 중에서, pH 7.0) 동안 컬럼으로부터 나타나는 한편, 컬럼이 pH 7.0에서 50 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl에 의해 용출될 때까지, 추가의 응집물은 결합된 상태로 남겨진다. 활성 단량체 및 불활성-2는 세척액-1 및 용출 단계 동안 컬럼으로부터 흡수제 제거되었다. 용출 푸울의 분석은 그것이 활성 단량체에 대해 농축되었음을 드러낸다. 이는 주로 세척액-1 단계 동안 불활성-1 및 응집물의 우선적 손실에 대한 것이었고, 적재 물질 및 용출물 푸울에서 불활성-2 %는 유사하였기 때문이다.
페닐 세파로스 수지
페닐 세파로스 6 고속 유동 하이 서브 (페닐 세파로스)는 LT-β-R-Ig 정제 공정에서 최종 (3차) 크로마토그래피 단계였다. 페닐 세파로스는 LT-β-R-Ig에 대한 그의 높은 결합 용량 및 공정으로부터 생성물 및 생성물 관련된 불순물을 분리하는 능력으로 인해 최종 연마 컬럼으로서 선택된 소수성 상호반응 크로마토그래피 수지이다. 이 단계는 LT-β-R-Ig의 응집된 불활성-2 형태를 제거하는 것으로 밝혀졌다. 공급 원료 중에 존재하는 높은 수준의 응집물을 분명히 하기 위해, HIC 3차 컬럼의 분해력은 층 높이를 20 cm에서 30 cm로 확장시킴으로써 증가되었다. 추가로, 페닐 단계는 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, MabSelect SuRe 컬럼 r단백질 A 침출수, 및 잠재적인 바이러스 오염물의 추가의 클리어런스를 제공하였다. 크로마토그래피 조건의 요인 변량 분석은, 위험 평가와 조합하여, 컬럼 적재 및 수지 로트 (리간드 밀도)가 도 12에 기재된 바와 같이 분리를 위한 중요한 인자들이었음을 확인하였다. 황산암모늄에 의한 적재 조절 후, 캡토 MMC 용출물 푸울은 페닐 세파로스 컬럼 (페닐 세파로스 6 고속 유동 (하이 서브); 0.66 cm (I.D.) x 20-40 cm 층 높이 유리 컬럼) 상으로 적재되었다. 적재 범위 및 층 높이는 응집물 및 불활성-2의 클리어런스에 대해 최적화되었고, 여기서 응집물 백분율은 < 1%였고 불활성-2는 < LLOQ였다.
HIC 선별 및 페닐 세파로스 F.F. 크로마토그래피 단계의 발달 동안 사용된 분석은 분석적 HIC 및 분석적 SEC였다.
수율을 측정하기 위해 OD280을 사용하는 것 외에, LTβR-Ig 회복은 또한 방정식 (1)에 정의된 바와 같이, "활성 단량체 수율"을 사용하여 정량화되었다:
Figure pct00011
여기서: V는 용액 부피 (mL)이고, OD280은 280 nm/mL에서 흡광도이다.
% 단량체 및 % "활성" 종들은 각각 HPLC-SEC 및 분석적-HIC를 사용하여 측정되었다. LT-β-R-Ig 응집물 종들은 이량체 및 고분자량 종들 모두를 포함하였다.
응집물 클리어런스에 대한 층 높이의 효과를 조사하기 위해, 페닐 세파로스는 3개의 층 높이 (20, 30 및 40 cm)에서 충전되었다. LT-β-R-Ig는 페닐 세파로스 컬럼 상에 대략적으로 15 mg LT-β-R-Ig/mL 수지의 표적까지 적재되었고, 이어서 3 CV의 평형 용액으로 세척되었다. 이 컬럼이 세척되었고 LT-β-R-Ig는 황산 암모늄 완충액을 사용하여 용출되었다. 분획들은 용출하는 동안 수집되었고 수율 및 단량체 함량에 대해 분석되었다. 컬럼 적재 및 생성물 회수는 흡광도 (OD280)를 측정함으로써 결정되었다.
표 7은 LT-β-R 응집물 제거 및 회수에 대한 층 높이 및 작동 속도의 효과를 보여준다. (공급 원료: 15%의 응집물, 9%의 불활성-2; 컬럼 적재: 15 mg LT-β-R/mL 수지, 황산암모늄 용출 완충액 농도: 0.325 M, 용출 부피: 6 CV). LT-β-R-Ig 및 응집물 단백질의 최적의 분해능을 제공하는 파라메터들은 30 cm의 층 높이 (주기-1에서 20 cm의 페닐 층 높이에 대하여) 및 50 cm/h의 유속을 포함하였다. 또한, 이들 파라메터들이 갖는 최적의 적재는 10 내지 20 g/L의 수지였다. 대안으로, 100 cm/hr의 유속 및 0.44 M 황산 암모늄의 용출 용액 (0.3 내지 0.5 범위)이 또한 효과적인 것으로 결정되었다.
Figure pct00012
표 7에 나타낸 바와 같이, 페닐 컬럼에서 층 높이의 증가는 활성 LT-β-R-Ig (위에서 "활성 단량체"라 칭함)의 전체적인 수율을 개선시키고 응집물 백분율을 감소시켰다.
수율 및 응집물 클리어런스는 컬럼 적재 및 수지 리간드 밀도에 강력하게 의존하였기 때문에, 최적 작동 범위가 그들 파라메터 (아래 더욱 상세히 기재됨)에 대해 요구되었다. 분리의 난해성 (>20%의 응집물의 제거)은 리간드 밀도 규격과 상관되는 수지 성능의 로트-투-로트 변화를 드러냈다.
일반적으로, 페닐 단계는 실온에서 30 cm의 충전된 층 높이로 수행되었다. 적재 후, 컬럼은 pH 5.8에서 2.6 mM 아세트산, 1.0 M 황산암모늄, 50 mM 아세테이트 (세척액-1)로 세척되었다. LT-β-R-Ig는 pH 5.8에서 2.6 mM 아세트산, 0.44 M 황산암모늄, 50 mM 아세테이트를 사용하여 세척한 후 순차로 용출되었다.
페닐 수지를 사용하는 LT-β-R-Ig의 응집물 불순물 형태의 감소의 요약은 표 8에 기재되어 있고, 이는 유사한 조건 하에 LT-β-R-Ig 생산 및 정제의 여러 실행의 분석을 제공한다.
Figure pct00013
요컨대, 페닐 HIC 단계의 사용은 응집물의 백분율을 1% 이하로 감소시켰다. 페닐 HIC 단계는 또한 LTβR-Ig의 불활성-2 형태를 1% 미만으로 감소시켰다.
15,000 L S규모를 위한 주기-2의 사용
주기-2는 단백질의 응집물 및 2가지 불활성 형태를 포함하는 원치 않는 불순물로부터 LTβR-Ig를 정제하기 위해 대규모, 즉, 15,000 L로 성공적으로 사용되었다. 15,000 L 규모로 초기 전이됨에 따라, 공정은 생성물 품질의 위험을 최소화하기 위해 신중하게 작동되었다. 수확은 14일 또는 15일에 발생하였고, 바이오리액터 중에서 30%의 응집물을 함유하였다. 주기-2는 2차 컬럼 상에서 불활성-1 및 응집물 클리어런스를 촉진시키기 위해 고 적재 및 3차 컬럼 상에서 응집물 및 불활성-2 클리어런스를 촉진시키기 위해 저 적재를 포함하였다.
배치 1-3에서 공정 성능에 기초하여, 공정은 더 높은 수율 조건 (배치 4-7) 하에 순차적으로 작동되었고, 여기서 수확은 16일에 발생하였고 바이오리액터 중에서 35%의 응집물을 함유하였다. 3차 컬럼 상의 고 적재는 높은 수율을 촉진시키기 위해 수행되었다. 도 13은 15k 제조에서 변형된 하류 공정의 주요 성능 특징의 요약을 제공한다.
요약
전체적인 공정을 요약하자면, 세포 배양 수확의 설명은 디스크 스택 원심 분리에 의한 것이다. 트리톤 X-100은 바이러스 불활성화를 위해 설명된 조건 배지에 부가되었다. 설명된 조건 배지는 재조합 단백질 A (r단백질 A), MabSelect SuRe 크로마토그래피 컬럼 상에서 처리되어 생성물을 획득하였다. 낮은 pH 바이러스 불활성화가 다음으로 수행되었다. 이어서, 바이러스 불활성화된 r단백질 A MabSelect 용출물이 우발적 파보바이러스 클리어런스를 위해 Sartobind Q 멤브레인 흡착기 (QMA)를 통해 여과되었다. 생성물은 캡토 MMC 혼합 모드 크로마토그래피에 이어 페닐 세파로스 6 고속 유동 하이 서브 (페닐 세파로스)를 사용한 소수성 상호반응 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다. 이어서, 페닐 세파로스 용출물은 플라노바 15N 바이러스 제거 필터를 통해 여과되었고, 다음으로 한외 여과 (UF)에 의해 농축 및 디아 필터링되었다. UF 투석물은 100 g/L의 생성물 농도로 최종 제형 완충액 내로 순차로 제형되고 -70℃에서 저장되었다.
주기 2 공정 (특히, 페닐 HIC에 이어서 혼합 모드)은 제조 목적으로 LT-β-R-Ig의 대규모 생산 및 정제를 위해, 예, 15000 L 규모에 효과적인 것으로 입증되었다. 주기-2 공정을 사용하여 불활성-1, 불활성-2, 및 응집물 백분율을 감소시키기 위한 백분율의 요약이 아래 표 9에 제공된다.
Figure pct00014
등가물
본 발명은 무엇보다도 LT-β-R-Fc 융합을 포함하여 Ig 융합 단백질의 정제된, 활성 형태에 관한 개선된 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 구체예들이 고찰되었지만, 상기 설명은 예시적인 것으로 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변화가 본 명세서를 검토함에 따라 당업계의 숙련자들에게 명백해질 것이다. 본 발명의 완전한 범위는 그들의 완전한 등가물의 범위와 함께, 특허 청구의 범위 및 그러한 변화와 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.
본원에 기재된 모든 공고 및 특허는 각각의 개별적인 공고 또는 특허가 참고 문헌으로서 인용되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 경우 이에 참고 문헌으로서 그들의 전문으로서 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN IDEC MA INC. <120> PURIFIED IMMUNOGLOBULIN FUSION PROTEINS AND METHODS OF THEIR PURIFICATION <130> BGN-784PC <140> PCT/US2009/035581 <141> 2009-02-27 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human LTBR sequence <400> 1 Met Leu Leu Pro Trp Ala Thr Ser Ala Pro Gly Leu Ala Trp Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Ala Ala Ser Gln Pro Gln Ala 20 25 30 Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys Arg Asp Gln Glu Lys 35 40 45 Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys Cys Ser Arg Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile Arg Asp Thr Val Cys 65 70 75 80 Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn Tyr Leu Thr 85 90 95 Ile Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val Met Gly Leu Glu Glu 100 105 110 Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln Cys Arg Cys Gln Pro 115 120 125 Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr His Cys Glu Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Val 145 150 155 160 Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys Ala Gly His Phe Gln 165 170 175 Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro His Thr Arg Cys Glu 180 185 190 Asn Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr Ala Gln Ser Asp Thr 195 200 205 Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro Glu Met Ser Gly Thr 210 215 220 Met Leu Met Leu Ala Val Leu Leu Pro Leu Ala Phe Phe Leu Leu Leu 225 230 235 240 Ala Thr Val Phe Ser Cys Ile Trp Lys Ser His Pro Ser Leu Cys Arg 245 250 255 Lys Leu Gly Ser Leu Leu Lys Arg Arg Pro Gln Gly Glu Gly Pro Asn 260 265 270 Pro Val Ala Gly Ser Trp Glu Pro Pro Lys Ala His Pro Tyr Phe Pro 275 280 285 Asp Leu Val Gln Pro Leu Leu Pro Ile Ser Gly Asp Val Ser Pro Val 290 295 300 Ser Thr Gly Leu Pro Ala Ala Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Pro Gln 305 310 315 320 Gln Gln Ser Pro Leu Asp Leu Thr Arg Glu Pro Gln Leu Glu Pro Gly 325 330 335 Glu Gln Ser Gln Val Ala His Gly Thr Asn Gly Ile His Val Thr Gly 340 345 350 Gly Ser Met Thr Ile Thr Gly Asn Ile Tyr Ile Tyr Asn Gly Pro Val 355 360 365 Leu Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Asp Leu Pro Ala Thr Pro Glu Pro 370 375 380 Pro Tyr Pro Ile Pro Glu Glu Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Leu Ser 385 390 395 400 Thr Pro His Gln Glu Asp Gly Lys Ala Trp His Leu Ala Glu Thr Glu 405 410 415 His Cys Gly Ala Thr Pro Ser Asn Arg Gly Pro Arg Asn Gln Phe Ile 420 425 430 Thr His Asp 435 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LTBR-Ig fusion protein <400> 2 Met Leu Leu Pro Trp Ala Thr Ser Ala Pro Gly Leu Ala Trp Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Ala Ala Ala Val Pro Pro Tyr 20 25 30 Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu 35 40 45 Pro Gln His Arg Ile Cys Cys Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val 50 55 60 Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile Arg Asp Thr Val Cys Ala Thr Cys Ala 65 70 75 80 Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn Tyr Leu Thr Ile Cys Gln Leu 85 90 95 Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val Met Gly Leu Glu Glu Ile Ala Pro Cys 100 105 110 Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln Cys Arg Cys Gln Pro Gly Met Phe Cys 115 120 125 Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr His Cys Glu Leu Leu Ser Asp Cys 130 135 140 Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Val Gly Lys Gly Asn 145 150 155 160 Asn His Cys Val Pro Cys Lys Ala Gly His Phe Gln Asn Thr Ser Ser 165 170 175 Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro His Thr Arg Cys Glu Asn Gln Gly Leu 180 185 190 Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr Ala Gln Ser Asp Thr Thr Cys Lys Asn 195 200 205 Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro Glu Met Ser Gly Thr Met Val Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Claims (69)

  1. 생물학적 활성 림포톡신-β-수용체 면역글로불린(LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 6% 미만이 생물학적 불활성이고, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 2% 미만이 응집되어 있는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 5% 미만이 생물학적 불활성인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 1% 미만이 생물학적 불활성인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 0.5% 미만이 생물학적 불활성인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 IgG1 아이소타입의 Ig 불변 영역을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 서열 번호 2에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 표준 시험관내 IL-8 억제 분석에서 IL-8 방출을 억제할 수 있는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항의 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는 자가면역 장애의 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 다발성 경화증인 치료 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 2차 진행성 다발성 경화증 또는 재발 이장성 다발성 경화증인 치료 방법.
  14. 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린(LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법으로서,
    생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및
    상기 수지를, 염 구배를 포함하는 용액과 접촉시켜, 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물 및 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 염 구배가 단계 구배 또는 연속 구배인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 염 구배가 1.6 M 내지 0.0 M의 NaCl을 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 상기 제2 용출물은 HIC 수지를 1.5 M의 NaCl 세척제로 세척하여 얻는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 염 구배가 0.6 M 내지 0.0 M의 Na2SO4를 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 단계 구배가 0.6 M 내지 0.0 M 범위의 Na2SO4의 증분을 포함하는 것인 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 부틸 HIC 수지가 600 내지 750 Å의 공극 크기를 갖는 것인 방법.
  21. 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 HIC 수지가 수지 1 L당 약 8 mg 내지 약 20 mg 단백질의 적재 용량을 갖는 것인 방법.
  22. 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 상기 제2 용출물이 2% 미만의 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  23. 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 상기 제2 용출물이 1% 미만의 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  24. 비응집된 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린(LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법으로서,
    비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을, 수지 1 L당 약 10 내지 20 g 단백질의 적재 용량 및 약 30 내지 31 cm의 층 높이를 갖는 페닐 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지 상에 적재하는 단계; 및
    상기 수지를 약 50 내지 150 cm/hr의 유속으로 용액과 접촉시켜, 생물학적으로 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제1 용출물 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 상기 제1 용출물이 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 상기 제1 용출물이 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  27. 생물학적 활성 림포톡신-β 수용체 면역글로불린(LT-β-R-Ig) 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 방법으로서,
    i) 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 상기 부틸 수지 상에 적재하는 단계;
    ⅱ) 상기 부틸 HIC 수지를, 염 구배를 포함하는 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계;
    ⅲ) 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 제2 HIC 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 제2 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및
    iv) 상기 제2 HIC 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하며, 이로써 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 분리하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 ⅱ)의 염 구배가 단계 구배 또는 연속 구배인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 부틸 HIC 수지가 히드록실화된 메타크릴레이트 주쇄를 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 부틸 HIC 수지가 600 내지 750 Å의 공극 크기를 갖는 것인 방법.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 용출물이 2% 미만의 제1 형태의 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-1)을 포함하는 것인 방법.
  32. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 용출물이 1% 미만의 제1 형태의 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-1)을 포함하는 것인 방법.
  33. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 용출물이 2% 미만의 제2 형태의 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-2)을 포함하는 것인 방법.
  34. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 용출물이 1% 미만의 제2 형태의 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-2)을 포함하는 것인 방법.
  35. 제14항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도가 300 mg/L 이상인 방법.
  36. 제14항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도가 800 mg/L 이상인 방법.
  37. 제14항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 농도가 1350 mg/L 이상인 방법.
  38. 제14항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물의 부피가 5000 L 이상인 방법.
  39. 제14항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물의 부피가 10000 L 이상인 방법.
  40. 제14항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혼합물의 부피가 15000 L 이상인 방법.
  41. 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 방법으로서,
    i) 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계;
    ⅱ) 용액을 사용하여 상기 단계 i)의 혼합 모드 수지로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계;
    ⅲ) 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 상기 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및
    iv) 용액을 사용하여 상기 단계 ⅲ)의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하며, 이로써 생물학적 불활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 것인 방법.
  42. 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 방법으로서,
    i) 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물로서, 이 혼합물 중 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 약 30% 이상이 응집되어 있는 혼합물을 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계;
    ⅱ) 용액을 사용하여 상기 단계 i)의 혼합 모드 수지로부터 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계;
    ⅲ) 상기 생물학적 활성 Ig 융합 단백질이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 상기 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및
    iv) 용액을 사용하여 상기 단계 ⅲ)의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하며, 이로써 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질로부터 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 분리하는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 이온성 상호작용 능력 및 소수성 상호작용 능력 모두를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 혼합물을 pH 약 5.0에서 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 적재된 혼합 모드 수지를 단계 ⅱ) 전에 pH가 약 7.0 내지 7.2인 완충용액으로 세척하는 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 완충용액이 비스 트리스(Bis Tris)인 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 HIC 수지가 페닐 수지인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 페닐 수지가 페닐 세파로스인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig를 황산암모늄에 의해 페닐 수지로부터 용출하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 생물학적 활성 LT-β-R-Ig를 0.3 내지 0.5 M의 황산암모늄에 의해 페닐 수지로부터 용출하는 것인 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 페닐 수지의 유속이 50 내지 150 cm/hr인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 유속이 약 100 cm/hr인 방법.
  53. 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물로부터 97% 이상의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 제거하는 방법으로서,
    i) 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 혼합물을 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계;
    ⅱ) 용액을 사용하여 상기 단계 i)의 혼합 모드 수지로부터 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계;
    ⅲ) 상기 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 ⅱ)의 제1 용출물을 상기 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및
    iv) 용액을 사용하여 상기 단계 ⅲ)의 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 용출하여, 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하며, 이로써 비응집된 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질 및 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 혼합물로부터 97% 이상의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 제거하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 제1 용출물이 25% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 제1 용출물이 20% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 제1 용출물이 15% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 상기 제1 용출물이 약 10%의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  58. 제53항에 있어서, 상기 제2 용출물이 2% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  59. 제53항에 있어서, 상기 제2 용출물이 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 i) 전에 혼합물을 재조합 단백질 A(r단백질 A)와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 재조합 단백질 A와 접촉되는 상기 혼합물이 포유동물 세포 배양 상청액인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양 상청액은 28℃에서 배양된 포유동물 세포로부터 얻는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액이 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 트리톤 X-100인 방법.
  65. 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 조성물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-1), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-2) 및 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하고, 상기 방법은,
    i) 상기 LT-β-R-Ig-융합 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환된 포유동물 숙주세포를 포함하는 포유동물 세포 배양 시스템으로부터 세포 배양 상청액을 얻는 단계;
    ⅱ) 상기 세포 배양 상청액을 재조합 단백질 A(r단백질 A)와 접촉시켜, LT-β-R-Ig 융합 단백질 혼합물을 얻는 단계;
    ⅲ) LT-β-R-Ig 융합 단백질이 혼합 모드 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 ⅱ)의 LT-β-R-Ig 융합 단백질 혼합물을 pH 약 5.0에서 상기 혼합 모드 수지 상에 적재하는 단계;
    iv) 상기 혼합 모드 수지를 pH가 약 7.0 내지 7.2인 완충용액으로 세척하는 단계;
    v) 상기 단계 ⅲ)의 혼합 모드 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 농축된 제1 용출물을 얻는 단계;
    vi) LT-β-R-Ig 융합 단백질이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 단계 v)의 제1 용출물을 상기 HIC 수지 상에 적재하는 단계; 및
    ⅶ) 상기 단계 vi)의 HIC 수지를 용액과 접촉시켜, 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질의 존재에 대해 추가로 농축된 제2 용출물을 얻는 단계
    를 포함하며, 상기 제2 용출물은 1% 미만의 제1 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-1), 1% 미만의 제2 불활성 형태의 LT-β-R-Ig 융합 단백질(불활성-2) 및 1% 미만의 응집된 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  66. 제14항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 제조한 97% 이상의 생물학적 활성 LT-β-R-Ig 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  67. 제67항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 자가면역 장애의 치료 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 다발성 경화증인 치료 방법.
  69. 제53항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 i) 전에 상기 혼합물을 음이온 교환막 흡수체와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
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