BRPI0908194B1

BRPI0908194B1 - Uso de uma anexina a5 recombinante, e stent de eluição de fármaco

Info

Publication number: BRPI0908194B1
Application number: BRPI0908194-1A
Authority: BR
Inventors: Knut Pettersson; Ola Camber; Johan Frostegård
Original assignee: Athera Biotechnologies Ab
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2022-01-04
Also published as: CA2715859C; BRPI0908194A2; CN101969978A; US20180140668A1; AU2009216543B2; MX2010009270A; EP2254589B1; ES2733902T3; EP3216457A1; WO2009103977A1; EP3216457B1; EP2254589A1; ES2630013T3; DK3216457T3; KR20100122501A; JP2016175946A; US20100331970A1; JP2011512393A; DK2254589T3; US20160250284A1

Abstract

anexina a5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, uso dos mesmos, composição farmacêutica, stent de eluição de fármaco, e, método para fabricar um stent. um método para a profilaxia ou o tratamento de restenose que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina a5 ou um análogo ou variante funci-onal da mesma a um paciente em necessidade de tal tratamento. um método para o tratamento de estenose em um paciente que compreende realizar uma intervenção para o tratamento de estenose em conjunção com a administração de uma quantidade terapeuti-camente eficaz de anexia a5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. uma compo-sição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexia a5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a profilaxia ou o tratamento de restenose. um stent de eluição de fármaco, em que o fármaco é anexia a5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, e um método de fabricar um tal stent.

Description

Campo da Invenção

[001] A invenção diz respeito a novos métodos e composições para a profilaxia ou o tratamento de restenose, tal como restenose a seguir do enxerto de desvio e ou intervenções com base em cateter coronário percutâneo ou periférico com o objetivo de restaurar o fluxo sanguíneo ao tecido isquêmico.

Fundamento para a invenção

[002] A listagem ou debate de um documento aparentemente publicado antes neste relatório descritivo não deve ser necessariamente interpretado como um reconhecimento de que o documento seja parte do estado da técnica de conhecimento geral comum.

[003] A doença cardíaca isquêmica (IHD) é normalmente o resultado de aterosclerose nas artérias coronárias. A aterosclerose é uma doença da íntima arterial, e começa como deposição focal de material lipídico e células inflamatórias. Quando estas lesões carregadas de lipídeo se tornam avançadas, elas se tornam estenosantes (isto é, causam o estreitamente do vaso sanguíneo) e pode assim limitar o fluxo sanguíneo a partes do miocárdio. A aterosclerose ocorre também em outras artérias e pode levar à estenose nos vasos especialmente das pernas, cérebro e rins. Esta limitação de fluxo sanguíneo pode causar dor isquêmica, tal como angina do peito e claudicação intermitente.

[004] Uma outra consequência da aterosclerose é que as lesões podem se tornar instáveis e romper, levando à formação de um trombo arterial no sítio de ruptura. Este trombo severamente compromete o fornecimento de oxigênio para os tecidos a jusante e, a menos que o trombo seja resolvido, levará à infartação do tecido isquêmico (infartação miocárdica, acidente vascular cerebral, etc.). A infartação miocárdica e o acidente vascular cerebral são as duas causas mais comuns de morte no mundo.

[005] Restaurar o fornecimento de sangue normal para o tecido isquêmico é a meta aguda mais importante para o tratamento de distúrbios isquêmicos, isto pode ser obtido pela medicação ou pela intervenção. Em pacientes com eventos trombóticos arteriais agudos tais como infartação miocárdica aguda, é importante restaurar o fluxo sanguíneo ao tecido isquêmico tão rapidamente quanto possível, de modo a reduzir as consequências do evento trombótico, e a intervenção cirúrgica é comum nesta situação. Pacientes com angina do peito estável ou outros distúrbios isquêmicos que não podem ser adequadamente controlados com drogas também podem ser tratados cirurgicamente.

[006] As intervenções cirúrgicas, tais como para a revascularização coronária, são realizados pelo enxerto de desvio (tal como enxerto de desvio da artéria coronária, CABG) ou pelas intervenções com base em cateter. No caso de cirurgia de desvio tal como CABG, uma artéria de mamífero é exposta, a sua extremidade distal removida do peito e suturada em uma posição distal ao segmento estenosado da artéria coronária, permitindo assim a perfusão do tecido isquêmico. Se a artéria de mamífero não pode ser usada, ou se desvios múltiplos são requeridos, o cirurgião usará veias das pernas (enxertos de veia). Neste caso, um segmento de veia é removido e colocado a partir da aorta para uma posição distal à estenose.

[007] Durante as intervenções com base em cateter, tais coma PCI (intervenção coronária percutânea), um cateter de balão é tipicamente inserido através de uma artéria femoral e guiada dentro do segmento estenótico, onde o balão é inflado e o segmento estenótico assim dilatado. Isto também é conhecido como angioplastia de balão. Outros procedimentos que são feitos durante a PCI podem incluir implantação de um stent, ou aterectomia, tal como aterectomia rotacional ou a laser (remoção do material de placa ateromatosa). Para melhorar a eficácia da intervenção, um cateter de stent pode ser usado para implantar um stent. Neste caso, o cateter também colocará um stent de metal para sustentar a parede arterial para manter os diâmetros internos do lúmen.

[008] As intervenções intencionadas a restaurar o fluxo sanguíneo normal ao tecido isquêmico pode resultar em restenose, causada pela formação de uma neoíntima ou espessamento neoíntimo. A causa subjacente é a lesão do músculo liso vascular e rompimento da integridade do revestimento endotelial. O processo é também caracterizado pela presença e atividade de células inflamatórias e co-morbidezes eventuais que o paciente sofra. Os mecanismos moleculares subjacentes dos processos de desenvolvimento da estenose primária e a restenose secundária são diferentes, mas existe sobreposição considerável entre as duas.

[009] Enxerto de desvio é uma intervenção eficaz, mas uma complicação comum é a chamada restenose, o desenvolvimento rápido de uma neoíntima que levará à formação de uma nova estenose no vaso enxertado, frequentemente resultando na necessidade para realizar um procedimento de revascularização repetido. Isto é especialmente comum em enxertos de veia, onde aproximadamente 15% dos enxertos fecham durante o primeiro ano, e em 10 anos 50% dos vasos enxertados são estenóticos (Motwani e Topol, 1998). A falha do enxerto de veia pode ser considerada como uma doença inflamatória induzida por lesão, incluindo infiltração e ativação de macrófago e ativação de célula do músculo liso mediana (Zhang ET AL., 2004).

[0010] Também depois da PCI é a restenose uma complicação comum. É mais comum realizar um procedimento de revascularização repetida depois da PCI do que depois de CABG; as taxas absolutas em 5 anos foram de 46,1% depois da angioplastia de balão, 40,1% depois da PCI com stents, e 9,8% depois de CABG (Bravata ET AL., 2007).

[0011] A proliferação de células de músculo liso de um fenótipo de sintetização de matriz é um fator importante no processo levando à formação da neoíntima. Um desenvolvimento recente que eficazmente reduz a restenose são os chamados stents de eluição de droga (DES). Estes stents são revestidos com polímeros que contêm agentes citostáticos (por exemplo, rapamicina), que eficazmente inibe a resposta proliferativa à intervenção cirúrgica. Em pacientes que recebem DES, a restenose ocorre tipicamente com uma incidência abaixo de 4%. Entretanto, os stents de DES não se tornam totalmente integradas na parede do vaso, e elas são associadas com um risco aumentado para a formação de trombo, que não pode ser eficazmente controlada com drogas. DE fato, a vantagem de DES em relação à restenose não leva a uma melhora significante no prognóstico para o paciente, visto que o risco aumentado para trombose neutraliza este efeito. De fato, existem agora recomendações para usar DES com cautela, e recomendações para aumentar a terapia anti-trombótica também tem sido emitidas (Smith ET AL., 2006).

[0012] As lesões restenóticas são lesões inflamatórias que pelo menos superficialmente têm similaridades com as lesões ateroscleróticas primárias. As células dominantes são células de músculo liso, mas também macrófagos/células de espuma e linfócitos T estão presentes em lesões de restenose. CABG e PCI são tratamentos eficazes para a estenose, e tem havido alguma vantagem nos métodos médicos para limitar as complicações associadas com a intervenção, mas tratamentos eficazes que previnem a restenose eficazmente melhoraria ainda mais o tratamento. Mesmo no caso de DES, seria uma vantagem se os stents fossem revestidos com um agente anti- restenótico eficaz que não levasse a um risco aumentado para a formação de trombo arterial.

[0013] A partir do sumário acima, torna-se evidente que um tratamento eficaz que reduzisse a formação de restenose é uma oportunidade terapêutica para condições de doença onde procedimentos de revascularização são realizados, independente de se a técnica usada para obter a revascularização é enxerto de desvio ou pela dilatação de balão do segmento de vaso estenosado, com ou sem colocação de stent.

[0014] Anexina A5 é uma proteína endógena que se liga aos fosfolipídeos carregados tais como fosfatidilserina (PS) (Cederholm e Frostegard, 2007). Anexina A5 é um agente anti-trombótico potente (Thiagarajan e Benedict, 1997), e é proposto que Anexina A5 pela ligação ao PS exposto pode formar um ‘invólucro protetor’ que pode inibir os efeitos de PS na formação da trombose (Rand, 2000).

[0015] Foi mostrado que além dos efeitos anti-plaqueta e anti- coagulante de Anexina A5, esta proteína e um análogo desta, o dímero da Anexina A5 dianexina, é eficaz na prevenção da lesão de reperfusão no fígado (Teoh ET AL., 2007), e melhorou o resultado de transplantes de fígado de rato (Shen ET AL., 2007). De maneira interessante, em ambos estes estudos os tratamentos foram associados com uma atividade inflamatória reduzida no endotélio hepático, medido como a expressão reduzida de moléculas de adesão, isto é Anexina A5 tem efeitos anti-inflamatórios. Foi sugerido que a dianexina melhorou a sobrevivência dos transplantes de fígado por um efeito anti-trombótico que leva ao fornecimento de sangue mantido para o fígado (Shen ET AL., 2007). Foi sugerido mais no princípio que Anexina A5 pode ser usado para estabilizar lesões ateroscleróticas em artérias coronárias em pacientes, o que deve reduzir o risco para a infartação do miocárdio nestes pacientes (Cederholm ET AL., 2005; WO 2005/099744).

Sumário da invenção

[0016] Um primeiro aspecto da invenção fornece um método para a profilaxia ou o tratamento de restenose que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma a um paciente em necessidade de tal tratamento.

[0017] Um segundo aspecto da invenção fornece um método para o tratamento de estenose em um paciente que compreende realizar uma intervenção para o tratamento de estenose em conjunção com a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma.

[0018] Um terceiro aspecto da invenção fornece composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a profilaxia ou o tratamento de restenose.

[0019] Um quarto aspecto da invenção fornece um stent de eluição de droga, em que a droga é Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma.

[0020] Um quinto aspecto da invenção fornece um método para fabricar um stent para a dispensação de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma a um paciente, o método compreendendo incorporar Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma em ou dentro de um corpo de stent.

[0021] É considerado que qualquer método ou composição aqui descrita pode ser implementada com respeito a qualquer outro método ou composição aqui descrita.

[0022] O uso das palavras “um” ou “uma” quando usadas em conjunção com o termo “que compreende” nas reivindicações e/ou no relatório descritivo podem significar “um,” mas também é compatível com o significado de “um ou mais,” “pelo menos um,” e “um ou mais do que um.”

[0023] Estas, e outras, formas de realização da invenção serão melhor avaliadas e entendidas quando consideradas em conjunção com a seguinte descrição e os desenhos anexos. Deve ser entendido, entretanto, que a seguinte descrição, embora indicando várias formas de realização da invenção e numerosos detalhes da mesma, é dada por via de ilustração e não de limitação. Muitas substituições, modificações, adições e/ou rearranjos podem ser feitos dentro do escopo da invenção sem divergir do seu espírito, e a invenção inclui todas de tais substituições, modificações, adições e/ou rearranjos.

Breve Descrição dos desenhos

[0024] Figura 1. Quantificação de leucócitos da parede arterial em camundongos transgênicos APOE*3-Leiden, alimentados com uma dieta rica em colesterol, três dias depois da cirurgia de bainha da artéria femoral e tratamento diário com veículo ou anexina A5 humana recombinante. A porcentagem de leucócitos é expressada como média ± SEM.

[0025] Figura 2. Quantificação de monócitos e macrófagos tingidos com AIA 31240 na parede arterial em camundongos transgênicos APOE*3- Leiden, alimentados com uma dieta rica em colesterol, três dias depois da cirurgia de bainha da artéria femoral e tratamento diário com veículo ou anexina A5 humana recombinante. A porcentagem de macrófagos no número total de células contadas (ligadas ao endotélio ou infiltradas no meio) é expressada como média ± SEM.

[0026] Figura 3. Quantificação de células que expressam MCP-1 na parede arterial em camundongos transgênicos APOE*3-Leiden, alimentados com uma dieta rica em colesterol, três dias depois da cirurgia de bainha da artéria femoral e tratamento diário com veículo ou anexina A5 humana recombinante. A porcentagem de células que expressam MCP-1 é expressada como média ± SEM.

[0027] Figura 4. Espessamento de enxerto de veia de camundongos transgênicos APOE*3-Leiden, alimentados com uma dieta rica em colesterol, 28 dias depois da cirurgia de enxerto de veia e tratamento diário com veículo, anexina A5 humana ou de murino recombinantes. A área entre o lúmen e a adventícia é representada como média ± SEM (mm2). n.s.: não significante.

[0028] Figura 5. Quantificação do número de leucócitos na parede do enxerto de veia em camundongos transgênicos APOE*3-Leiden, alimentados com uma dieta rica em colesterol, 28 dias depois da cirurgia de enxerto de veia e tratamento diário com veículo, anexina A5 humana ou de murino recombinantes. O número de células é expressada como média ± SEM.

Descrição detalhada da invenção

[0029] Aqui, foi mostrado que a Anexina A5 pode reduzir a formação de uma neoíntima em dois modelos de camundongo de restenose. Assim, a Anexina A5 ou análogos desta apresentam uma nova modalidade de tratamento com propriedades anti-restenóicas que pode reduzir o número de complicações relacionadas com a restenose em pacientes que passam pelo enxerto de desvio ou procedimentos de angioplastia para a revascularização de tecido isquêmico. Não existe nenhum relato anterior para mostrar que a Anexina A5 tem propriedades anti-restenóicas. A Anexina A5 portanto pode ser usada para prevenir a restenose. A anexina A5 pode ser administrada sistemicamente, e também pode ser usada como um agente anti-restenótico em stents de eluição de droga.

[0030] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método para a profilaxia ou o tratamento de restenose que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma a um paciente em necessidade de tal tratamento.

[0031] Colocado de um outro modo, o primeiro aspecto da invenção fornece Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para o uso na profilaxia ou tratamento de restenose. Por “profilaxia” incluímos prevenção, particularmente prevenção do desenvolvimento de restenose, ou redução no desenvolvimento de restenose (profilaxia primária) e profilaxia secundária, em que a restenose já ocorreu, mas o paciente é protegido contra a piora da condição, ou a condição piora mais gradualmente ou em um grau reduzido. Por “tratamento” incluímos o significado de que a restenose existente pode ser revertida, parcial ou totalmente, no paciente.

[0032] O paciente é tipicamente um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um animal não humano, tal como um animal doméstico (por exemplo, gato, cão, coelho, vaca, ovelha, porco, camundongo ou outro roedor).

[0033] A restenose pode ocorrer a seguir de uma intervenção com o objetivo de restaurar o fluxo sanguíneo normal para o tecido isquêmico, tal como um procedimento de revascularização que foi usado para tratar a estenose de um vaso sanguíneo, ou a formação de placa ateromatosa em um vaso sanguíneo. A estenose ou obstrução de vaso devido ao ateroma pode ser diagnosticada por um médico de acordo com meios conhecidos na técnica. A estenose coronária é tipicamente avaliada pela angiografia coronária ou ultrasom intravascular (IVUS). O último também é usado para quantificar a placa arterial. Jasti ET AL (2004) Circulation 110: 2831-2836 descrevem parâmetros que podem ser medidos pelo IVUS, e também angiografia coronária quantitativa. Os parâmetros adequados de uma lesão alvo e segmento de referência que pode ser medido pela IVUS são: (1) diâmetros de lúmen mínimo e máximo (mm); (2) área de seção transversal de lúmen mínima (MLA, mm2); (3) área transversal de placa mais meio (CSA, mm2) igual à área de seção transversal de membrana elástica externa (EEM CSA) menos a MLA; (4) estreitamento da seção transversal (CSN), que foi calculado como CSA de placa mais meio dividido pelo EEM CSA; (5) o segmento de referência, que foi a seção transversal da artéria de aparência normal localizada proximal ou distal à estenose; tipicamente a média de medições proximal e distal à estenose pode ser determinada; e (6) área de estenose (AS), calculada como a lesão de CSA de lúmen de referência MLAx100/CSA de lúmen de referência. O diâmetro de lúmen médio (MLD) de 2,8 mm ou a área de lúmen médio de 5,9 mm2foram indicativos de uma estenose clinicamente significante que justifica intervenção neste estudo. A pessoa habilitada avaliará que valores de corte diferentes podem ser apropriados para o diagnóstico de estenose em vasos diferentes. Uma redução do lúmen para 50% do segmento de referência é frequentemente considerada como uma estenose clinicamente relevante.

[0034] Meios não invasivos de diagnosticar a estenose também são conhecidos. Holte ET AL (2007) Cardiovascular ultrasound 5: 33 descrevem ecocardiografia Doppler transtoráxica para a visualização direta de segmentos coronários e avaliação da reserva de fluxo da velocidade coronária (CVFR). Por esta técnica, as estenoses coronárias tipicamente mostram aceleração e turbulência de fluxo local expressadas como graduação gráfica de cor pelo Doppler de fluxo colorido e velocidades de fluxo acelerados através da estenose. Para avaliar a gravidade das estenoses, a aceleração de fluxo pode ser quantificada comparando-se as velocidades de fluxo no sítio de graduação gráfica com velocidades de fluxo pré-estenótico não acelerado a montante mais próximo. Uma razão de velocidade de fluxo diastólico de pico de máxima-para-pré-estenóica maior do que 2,0 prognostica estenose significante com alta sensibilidade e especificidade.

[0035] A estenose não é limitada às artérias coronárias e pode ocorrer em vasos sanguíneos cerebrais assim como outras artérias periféricas tais como artérias renais e artérias dos membros. A estenose pode ser diagnosticada em tais vasos em uma maneira similar ao diagnóstico nos vasos coronários, ou pelo teste funcional tal como o exercício de esteira.

[0036] Tipicamente, a restenose pode tornar-se evidente dentro de semanas, meses ou anos da intervenção intencionada para restaurar normal o fluxo sanguíneo para o tecido isquêmico e, se não tratado, progride com um intervalo de tempo de semanas, meses ou anos. A restenose pode ser diagnosticada ou não durante o acompanhamento depois da intervenção, e pode ser primeiro notada quando a mesma resulta em complicações clínicas tais como angina, trombose ou infarto. A restenose é tipicamente diagnosticada por um médico de acordo com os mesmos meios usados para diagnosticar a estenose. Tipicamente, a restenose coronária pode ser avaliada pela angiografia coronária, IVUS ou por meios não invasivos tais como ecocardiografia Doppler transtoráxica. Parâmetros clínicos similares como os descritos acima em relação ao diagnóstico de estenose também são usados para o diagnóstico de restenose. Uma razão de velocidade de fluxo diastólico de pico máximo-para-pré-estenótico maior do que 2,0 determinado pela ecocardiografia de Doppler transtoráxico pode ser indicativo de restenose, como descrito em Nolte ET AL., supra. Hirata ET AL (2006) J Amer. Soc. Echocardiography 19: 165-191 descrevem diagnóstico não invasivo de restenose pela ecocardiografia Doppler transtoráxica em pacientes 6 meses depois de passar pela PCI bem sucedida da artéria coronária descendente anterior esquerda. A restenose de vasos sanguíneos periféricos, tais como as artérias renais ou de membro podem ser diagnosticadas pelos métodos similares, ou pelo teste de função tal como o exercício em esteira.

[0037] Em um método de profilaxia de acordo com o primeiro aspecto da invenção que é intencionado para prevenir ou reduzir o desenvolvimento de restenose, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma são tipicamente administrados no momento da ou imediatamente antes da intervenção intencionada para restaurar o fluxo sanguíneo normal para o tecido isquêmico. Por exemplo, a mesma pode ser administrada pelo menos 1 semana, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia, 12 horas, 8 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora ou 30 minutos antes da intervenção ou no momento da intervenção. Tipicamente, a administração da Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma é continuada depois da intervenção cirúrgica, por exemplo por pelo menos 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos depois da intervenção. A Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem ser fornecidos pela administração repetida de formas de dosagem adequadas, ou pela administração em uma forma de liberação controlada, tal como em um stent de eluição de droga posicionado durante a intervenção, ou como uma combinação de uma ou mais formas de administração. Será avaliado que a duração exata de continuação da administração da Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma pode ser escolhida para coincidir com o grau de risco de restenose em tempos diferentes depois da intervenção. Por exemplo, onde um stent de metal descoberto é posicionado durante a intervenção, a formação da neoíntima tipicamente chega ao máximo em cerca de 6 meses depois da intervenção, e depois regride, ao passo que onde um stent de eluição de droga é posicionado, a restenose tende a se desenvolver mais lentamente, mas continua a se desenvolver até 1 ou 2 anos ou mesmo mais do que 2 anos depois da intervenção (Ong e Serruys (2005) Carr Issues Cardiol 32: 372-377).

[0038] Em outras formas de realização do primeiro aspecto da invenção, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma são administrados como uma profilaxia secundária, para prevenir ou reduzir a piora da restenose que já ocorreu; ou como um tratamento, para reverter completa ou parcialmente a restenose que já ocorreu. Tipicamente, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma é administrada depois do procedimento de revascularização primária, e a seguir do diagnóstico de restenose no paciente. Tipicamente, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma são fornecidos pela administração repetida de formas de dosagem adequadas. Tipicamente, a administração é continuada por pelo menos 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos depois do diagnóstico de restenose. Também é considerado que um outro procedimento de revascularização pode ser empreendido como um tratamento para a restenose, e que a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem ser fornecidos como um droga de liberação controlada, tal como em um stent de eluição de droga posicionado durante o outro procedimento de revascularização. Uma combinação de uma ou mais formas de administração pode ser fornecida.

[0039] Pela administração de uma “quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma”, nós pretendemos administrar uma quantidade que tenha um efeito benéfico na prevenção ou redução do desenvolvimento de restenose, tratar a restenose, ou prevenir ou reduzir a piora da restenose existente. Onde a Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma previne ou reduz o desenvolvimento de restenose, tipicamente, a restenose não é diagnosticável a seguir do início da administração, ou ela se torna diagnosticável mais tarde do que seria esperado (isto é, comparada com seu desenvolvimento na ausência da administração de Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma), ou desenvolve menos rapidamente depois do diagnóstico, ou desenvolve a um grau reduzido depois do diagnóstico, ou existe uma combinação de qualquer dois ou todos os três de diagnosticabilidade tardia, progressão mais lenta e desenvolvimento reduzido. Tipicamente, a restenose seria diagnoticável pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos mais tarde do que seria esperado na ausência da administração de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Onde, o seguinte diagnóstico de restenose, progressão de restenose é mais lenta no paciente que foi administrado com a Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, isto tipicamente resulta na necessidade quanto a um procedimento de revascularização repetido ocorre mais tarde, tipicamente, pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos mais tarde do que seria esperado na ausência da administração de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Tipicamente, onde a Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma são administrados para tratar a restenose, os sintomas de restenose desaparecem com o tempo, tal que a restenose não é mais diagnosticável em 10 anos, em 5 anos, 2 anos, 1 ano, 6 meses, 3 meses ou em 1 mês a seguir da administração. Onde a Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma são administrados para prevenir ou reduzir a piora da restenose existente, isto tipicamente resulta na necessidade para um procedimento de revascularização repetido ocorrer mais tarde, tipicamente, pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos mais tarde do que seria esperado na ausência da administração de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma.

[0040] Adequadamente, o efeito benéfico de administrar Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma sobre a restenose (por exemplo, diagnosticabilidade tardia, progressão mais lenta e/ou desenvolvimento reduzido) pode ser identificado determinando-se pela IVUS o diâmetro de lúmen médio ou área de lúmen média do vaso sanguíneo que está em risco de ou tem passado pela restenose a seguir de um procedimento de revascularização, em um paciente que foi e/ou está sendo administrado com Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, e comparando-os ao mesmo parâmetro em um paciente que passou pelo mesmo tipo de procedimento de revascularização no mesmo tipo de vaso sanguíneo em um período similar de tempo atrás, mas que não foi administrado com Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Adequadamente, o diâmetro de lúmen médio será de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150% ou ainda 200% maior no paciente tratado do que no paciente que não foi tratado com Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, em um ponto de tempo de 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos depois que o procedimento de revascularização foi realizado, assumindo que a administração de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma foi começado no momento do ou antes do procedimento de revascularização. Alternativamente; a área de lúmen médio tipicamente será de pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 45%, 55%, 70%, 100%, 225%, 300%, 400%, 500%, 600% ou mesmo 900% maior no paciente tratado do que no não tratado em qualquer um dos pontos de tempo mencionados acima. Preferivelmente, o aumento mencionado acima no diâmetro ou área de lúmen médio é observado em 6 meses depois do procedimento de revascularização.

[0041] A pessoa habilitada avaliará que outros pontos finais podem ser apropriados para identificar um efeito terapêutico da administração de Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma. Por exemplo, infartação do miocárdio e/ou morte são consequências comuns da restenose. Os pacientes administrados com Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem experienciar um risco reduzido de infartação do miocárdio, e/ou sobreviver por tempo mais longo do que seria esperado na ausência da administração de Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma.

[0042] Um efeito de administração de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma sobre a diagnosticabilidade da restenose a seguir de um procedimento de revascularização pode ser determinado pelos testes clínicos, tipicamente envolvendo dezenas, centenas, ou milhares de pacientes (tal como 10, 50, 100, 1000 ou 10000 ou valores entre estes). Alternativamente, testes em animal podem ser usados, tais como aqueles descritos abaixo em relação ao teste de análogos funcionais e variantes de Anexina A5, e nos Exemplos.

[0043] Os pacientes que podem se beneficiar da profilaxia ou tratamento de acordo com o primeiro aspecto da invenção incluem pacientes que devam passar por uma intervenção intencionada para restaurar o fluxo sanguíneo normal para o tecido isquêmico, ou aqueles pacientes no momento da intervenção ou subsequente à intervenção. O paciente pode ser um paciente passando ou que passou por um procedimento de revascularização na circulação coronária ou em um vaso periférico. Uma tal intervenção pode ser uma intervenção cirúrgica ou uma intervenção percutânea. Por exemplo, o procedimento pode ser um enxerto de desvio, tal como enxerto de desvio da artéria coronária, ou uma intervenção com base em cateter, tal como angioplastia de balão com ou sem implantação de um stent e com ou sem aterectomia, tal como intervenção coronária percutânea ou angioplastia. Adequadamente, no primeiro aspecto da invenção, a restenose é associada a um enxerto de desvio. Em outras palavras, a restenose ocorreu, ou está em risco de ocorrer, devido a um procedimento de enxerto de desvio. Adequadamente, no primeiro aspecto da invenção, a restenose está associada a uma intervenção com base em cateter. Em outras palavras, a restenose ocorreu, ou está em risco de ocorrer, devido a uma intervenção com base em cateter. Adequadamente, a restenose está associada com a implantação de um stent, se este procedimento foi realizado ou não no contexto de uma intervenção cirúrgica tal como enxerto de desvio, ou uma intervenção com base em cateter. Outros pacientes adequados incluem pacientes que foram ou devem ser tratados quanto a um aneurisma, tal como pelo enxerto de stent.

[0044] A Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma podem ser administrados em conjunção com um ou mais outro(s) agente(s) ativo(s), tal como um produto terapêutico trombolítico tal como aspirina, clopidogrel, triclopidina, ativador de plasminogênio de tecido, urocinase, ou uma enzima bacteriana tal como estreptocinase. A Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem ser co-administrados com qualquer um dos um ou mais outros agentes ativos, ou podem ser administrados separada, simultânea ou sequencialmente com tais agentes. Tipicamente, um ou mais destes agentes são usados para reduzir o risco de trombose, que pode ocluir vasos sanguíneos, incluindo vasos sanguíneos com stent. Adequadamente, a terapia é começada com triclopidina ou clopidogrel antes de um procedimento de revascularização evolvendo a implantação de stent, e é continuada por pelo menos três, seis ou mesmo doze meses depois do procedimento (Ong e Serruys, supra). Tipicamente, aspirina é administrada concomitantemente com triclopidina ou clopidogrel e depois continuada indefinidamente. O uso de aspirina junto com clopidogrel ou triclopidina é aludido como terapia antiplaqueta dupla. Regimes similares de administração de droga antitrombótico pode ser aplicado antes e a seguir de outros tipos de intervenção.

[0045] A Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma podem ser administrados parenteral, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou localmente a partir de um stent de eluição de droga. Quando um paciente foi implantado com um stent, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem ser liberados a partir do stent (isto é, o stent é um stent de eluição de droga) ou o paciente pode ser administrado com Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma por uma outra das vias listadas acima.

[0046] Em um segundo aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de estenose em um paciente que compreende realizar uma intervenção para o tratamento de estenose em conjunção com a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Colocado de um outro modo, o segundo aspecto da invenção fornece Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para o uso no tratamento de estenose em conjunção com uma terapia para estenose.

[0047] A estenose pode ocorrer e pode ser diagnosticada como descrito acima. Por “uma intervenção para o tratamento de estenose” nós pretendemos qualquer intervenção intencionada para tratar estenose em um paciente. As intervenções contra a estenose conhecidas na técnica incluem intervenções cirúrgicas, tais como enxerto de veia, incluindo enxerto de desvio tal como enxerto de desvio da artéria coronária, e intervenções com base em cateter, tal como angioplastia de balão com ou sem implantação de um stent e com ou sem aterectomia, incluindo a intervenção coronária percutânea.

[0048] No segundo aspecto da invenção, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma são administrados em conjunção com a intervenção para o tratamento de estenose. Em outras palavras, a administração e a intervenção são realizadas separada, simultânea ou sequencialmente. Como debatido em relação ao primeiro aspecto da invenção, a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma podem ser administrados pelo menos 1 semana, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia, 12 horas, 8 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora ou 30 minutos antes da intervenção ou no momento da intervenção. Tipicamente, a administração da Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma é continuada depois da intervenção cirúrgica, por exemplo por pelo menos 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos ou 10 anos depois da intervenção.

[0049] A Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma são administrados de modo a prevenir ou reduzir o desenvolvimento da restenose a seguir do tratamento de estenose. Assim uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma tem um efeito benéfico na prevenção ou redução do desenvolvimento da restenose, como descrito acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[0050] Os pacientes e grupos de paciente adequados que podem se beneficiar do método do segundo aspecto da invenção, as vias e doses de administração adequadas, e terapias auxiliares adequadas, são como descrito acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[0051] Um terceiro aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a profilaxia ou o tratamento de restenose. Colocado de um outro modo, o terceiro aspecto da invenção fornece o uso de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a fabricação de um produto medicinal para a profilaxia ou o tratamento de restenose.

[0052] A profilaxia e tratamento de restenose são como descritos em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[0053] Uma composição farmacêutica de acordo com o terceiro aspecto da invenção pode assim compreender Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma em mistura com um adjuvante, diluente ou carregador farmacêutica ou veterinariamente aceitáveis, que tipicamente serão selecionados com respeito à via pretendida de administração e prática farmacêutica padrão. A composição pode estar na forma de aplicações de liberação imediata, demorada ou controlada. Preferivelmente, a formulação é uma dosagem unitária contendo uma dose ou unidade diária, sub-dose diária ou uma fração desta apropriada, do ingrediente ativo.

[0054] A frase “farmacêutica ou farmacologicamente aceitável” refere-se às composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou de outro modo indesejada, quando administrada a um animal, tal como, por exemplo, um ser humano, como apropriado. A preparação de tais composições farmacêuticas é conhecida por aqueles de habilidade na técnica considerando-se a presente divulgação, como exemplificado pelo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18aEd. Mack Printing Company, 1990, aqui incorporada por referência. Além disso, para a administração animal (por exemplo, ser humano), será entendido que as preparações devem atingir padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza como requerido pelo FDA Office of Biological Standards.

[0055] Como aqui usado, “carregador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, conservantes, drogas, estabilizadores de droga, excipientes, agentes de desintegração, tais como materiais e combinações destes, como seria conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Exceto na medida em que qualquer carregador convencional é incompatível com o ingrediente ativo, os seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é considerada.

[0056] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser intencionadas, ou não, para, e, assim formuladas em uma maneira adequada para a administração parenteral, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea, ou administração de um stent de eluição de droga, ou elas podem ser administradas pelas técnicas de infusão. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela esterilização. As composições farmacêuticas podem ser melhor usadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glicose suficientes para tornar a solução isotônica com o sangue. As soluções aquosas podem ser adequadamente tamponadas (preferivelmente a um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações farmacêuticas adequadas sob condições estéreis é facilmente realizada pelas técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

[0057] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a administração a um paciente, tal como um paciente humano, com base de um nível de dosagem diária pode ser de 0,01 a 1000 mg de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma por adulto (por exemplo, de cerca de 0,001 a 20 mg por kg do peso corporal do paciente, tal como de 0,01 a 10 mg/kg, por exemplo maior do que 0,1 mg/kg e menos do que 20, 10, 5, 4, 3 ou 2 mg/kg, tal como cerca de 1 mg/kg), administrada em doses únicas ou divididas. As doses adequadas para incluir em stents de eluição de droga são debatidas abaixo em relação ao quarto aspecto da invenção.

[0058] O médico em qualquer evento determinará a dosagem real que será mais adequada para qualquer paciente individual e variará com a idade, peso e resposta do paciente particular. As dosagens acima são exemplares do caso médio. Naturalmente, podem haver casos individuais onde faixas de dosagem mais altas ou mais baixas são merecidas e tais estão dentro do escopo desta invenção.

[0059] Para o uso veterinário, um composto da invenção é administrado como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal e o cirurgião veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração que será mais apropriada para um animal particular.

[0060] Um quarto aspecto da invenção fornece um stent de eluição de droga, em que a droga é Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma.

[0061] Um stent é uma armação usada para manter um vaso sanguíneo em uma posição aberta, e é tipicamente posicionado durante intervenções com base em cateter. Os stents de eluição de droga contêm, além de um corpo de stent, pelo menos uma droga e tipicamente também um revestimento que permite a eluição controlada da droga. Os corpos de stent típicos são pelo menos parcialmente flexíveis ou articulados (isto é, segmentos de anel expansíveis adjacentes são conectados pelas ligações que articulam em relação um ao outro) em seus comprimentos de modo que possam ser avançados através da vasculatura. Além disso, eles devem ter resistência mecânica suficiente depois que eles são expandidos, de modo a aumentar mecanicamente a resistência da parede luminal e assim manter a desobstrução do lúmen. Os corpos de stent são tipicamente na forma de tubo e têm uma estrutura de malha. Os corpos de stent adequados são divulgados na US 6.602.282 (Assignee Avantec Vascular Corporation). Os stents tendo segmentos de anel expansíveis unidos pelas ligações sigmoidais e feixes axiais são descritas na WO 99/17680 (Localmed Inc). Os stents que compreendem anéis expansíveis incluindo longarinas e dobradiças onde as dobradiças são configuradas para ter forças de abertura diferentes são descritas na Pat. U.S. No 5.922.020 (Localmed Inc). Os stents típicos terão um comprimento na faixa de cerca de 5 mm a 100 mm, usualmente sendo de cerca de 8 mm a 50 mm. O diâmetro pequeno (radialmente colapsado) dos stents cilíndricos usualmente estarão na faixa de cerca de 0,5 mm a 10 mm, mais usualmente estando na faixa de 0,8 mm a 1,25 mm. O diâmetro expandido usualmente estará na faixa de cerca de 1,5 mm a 50 mm, preferivelmente estando na faixa de cerca de 2,5 mm a 30 mm.

[0062] O corpo de stent pode ser fabricado de qualquer material adequado, incluindo aço inoxidável, titânio, níquel ou ligas, tais como ligas de cobalto cromo, ou combinações destas. Os materiais particularmente adequados incluem metais maleáveis, tais como aço inoxidável da série 300, ou metais resilientes, tais como ligas superelásticas e com memória de forma, por exemplo, ligas Nitinol®, aços inoxidáveis em mola, e outros. É possível que os segmentos de corpo possam ser formados a partir de combinações destes metais, ou combinações destes tipos de metais e outros materiais não metálicos. Os corpos de stent também podem ser fabricados de um material biorreabsorvível ou biodegradável. Um corpo de stent biodegradável adequado é fabricado de um poliéster tal como polilactídeo como descrito em Vogt ET AL (2004) European Heart Journal 25: 1330-40. Este corpo de stent foi usado como a plataforma para eluir paclitaxel, que foi capaz de funcionar em um período de mais do que dois meses de implantação.

[0063] A Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma é incorporado sobre ou dentro do corpo do stent por um método adequado para permitir quanto a sua liberação gradual a seguir da implantação do stent.

[0064] Blindt ET AL (1999) Int J Artif Organs 22: 843-853 descrevem um método de moldar stents a partir de polímeros biorreabsorvíveis tais como poli-D-L-lactídeo, que eles chamam de CESP (expansão controlada de polímeros saturados). O processo CESP é caracterizado pela exposição de um polímero amorfo a um gás inerte em alta pressão, tal como dióxido de carbono, que tem um efeito plastificante, tornando possível processar polilactídeos a uma temperatura próxima da temperatura ambiente. A temperatura de processo baixa constitui uma vantagem chave para os polímeros termicamente sensíveis e permite a incorporação de aditivos farmacêuticos termicamente sensíveis durante o processo de moldagem. As cinéticas de liberação de droga podem ser reguladas pelos tamanhos de poro diferentes do material. O método CESP foi usado por Vogt ET AL, supra para fabricar um stent de eluição de paclitaxel de poli-D-L-lactídeo.

[0065] A Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma também podem ser incorporados no corpo de stent pelo revestimento do corpo de stent depois que ele foi formado. Nesta forma de realização, o corpo de stent é revestido com a Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma e tipicamente também um outro material, tal como um polímero adequado para permitir a liberação lenta da Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma. Tipicamente, nesta forma de realização, o corpo de stent compreende um metal, como descrito acima. Entretanto, um revestimento também pode ser aplicado no caso de corpos de stent bioerodíveis ou biodegradáveis, mesmo se estes também incluem Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma incorporada(o) no estágio de moldagem.

[0066] Adequadamente, onde o corpo de stent é revestido, existem pelo menos um, dois, três ou mais revestimentos. A US 2006/0083772 (DeWitt ET AL) descreve composições de revestimento adequadas e o seu uso na aplicação de um agente bioativo a uma superfície de um dispositivo médico implantável, tal como um stent, em uma maneira que permitirá que o agente bioativo seja liberado do revestimento IN VIVO. A composição compreende uma pluralidade de polímeros compatíveis tendo propriedades diferentes que podem permitir que sejam combinados entre si para fornecer uma combinação ótima de tais propriedades como durabilidade, biocompatibilidade e cinéticas de liberação. A composição de revestimento descrita na US 2006/0083772 compreende um ou mais agentes bioativos em combinação com uma pluralidade de polímeros, incluindo: (a) um primeiro componente polimérico que compreende um polímero selecionado do grupo que consiste de (i) copolímeros de etileno com outros alquilenos, (ii) polibutenos, (iii) copolímeros contendo grupo aromático, (iv) polímeros contendo epicloroidrina, (v) poli(alquileno-co-(met)acrilatos de alquila), e (vi) polímeros e copolímeros derivados de diolefina, não aromáticos; e (b) um segundo componente polimérico que compreende um ou mais polímeros selecionados do grupo que consiste de poli((met)acrilatos de alquila) e poli((met)acrilatos aromáticos), onde “(met)” inclui moléculas tais na forma acrílica e/ou metacrílica (correspondendo aos acrilatos e/ou metacrilatos, respectivamente). Os critérios para a seleção de polímeros e testes IN VITRO para determinar a taxa de liberação de um agente ativo também são divulgados na US 2006/0083772. Além disso, a US 2006/0083772 divulga pré-tratamento de stents pelo revestimento com materiais tais como silano e/ou um polímero do dímero de peso molecular baixo de para-cloro-xilileno (Parilene®C; Speciality Coatings Systems (Indianápolis)), de modo a melhorar a aderência de camadas poliméricas subsequentes. Uma camada de acabamento também podem ser incluída, para melhorar a biocompatibilidade, proteger contra a deslaminação, e/ou para reduzir as taxas de eluição de droga iniciais para fornecer tempos de eluição mais longos.

[0067] A US2005/0037052 (Medtronic Vascular, Inc.) divulga stents de eluição de droga tendo revestimentos entre 1 μm e 1000 μm de espessura. Em uma configuração o revestimento contendo a droga é aplicado diretamente à superfície do dispositivo ou sobre um revestimento de preparador polimérico tal como um parileno. Dependendo da taxa de solubilidade e perfil desejados, a droga é totalmente solúvel dentro da matriz polimérica, ou uniformemente dispersada por toda parte. A concentração de droga presente na matriz polimérica variam de 0,1% em peso a 80% em peso. Em uma outra configuração, uma barreira polimérica isenta de droga, ou cobertura é aplicada sobre o revestimento contendo droga. O revestimento contendo droga serve como um reservatório de droga. No geral, a concentração de droga presente no reservatório varia de cerca de 0,1% em peso a tanto quanto 100%. O revestimento de barreira participa no controle das taxas de liberação de droga em pelo menos três modos. Primeiramente, se o revestimento de barreira tem uma constante de solubilidade diferente do revestimento contendo droga subjacente, a difusividade da droga através do revestimento de barreira é regulado como uma função dos fatores de solubilidade do revestimento de barreira. Quanto mais miscível é a droga no revestimento de barreira, mais rápido o mesmo eluirá da superfície do dispositivo e visa e versa. Esta configuração de revestimento é habitualmente aludida como um revestimento de reservatório. Em segundo lugar, o revestimento de barreira pode compreender uma rede porosa onde o revestimento atua como uma peneira molecular. Quanto maiores os poros em relação ao tamanho da droga, mais rápido a droga eluirá. Além disso, as interações intramoleculares também determinarão as taxas de eluição. Finalmente, embora a espessura de revestimento no geral seja um fator menor na determinação das taxas e perfil de liberação de droga global, não obstante é um fator adicional que pode ser usado para modular os revestimentos. Basicamente, se todos os outros fatores físicos e químicos permanecem inalterados, a taxa na qual uma dada droga difunde através de um dado revestimento é inversamente proporcional à espessura do revestimento. É possível usar os revestimentos de liberação controlada descritos na US2005/0037052 com uma cobertura. Por exemplo, a US2005/0037052 divulga um stent metálico tendo um revestimento base de parilene aplicada à sua superfície de metal descoberta. Sobre o revestimento base um revestimento polimérico que libera droga ou mistura de polímeros é aplicado. Sobre o revestimento contenda droga uma cobertura polimérica é aplicada. A cobertura pode servir opcionalmente servir como uma barreira de difusão para controlar ainda mais a liberação de droga, ou fornecer uma droga separada. A cobertura pode ser meramente um polímero biocompatível aplicado à superfície do stent para proteger o stent e não tem nenhum efeito sobre as taxas de eluição. A US2005/0037052 também divulga métodos para o revestimento de um stent com as várias composições poliméricas.

[0068] Onde um polímero é usado no revestimento, o mesmo pode ser um polímero durável ou um polímero biodegradável. O polímero pode ser selecionado de poliuretanos, tereftalato de polietileno, copolímero de PLLA- ácido poli-glicólico (PGA) (PLGA), policaprolactona, polímeros e copolímeros de polialcanoato tais como copolímero de poli- (hidroxibutirato/hidroxivalerato), poli(vinil-pirrolidona), politetrafluoroetileno, poli(metacrilato de 2-hidroxietila), poli(eteruretano uréia), siliconas, acrílicos, epóxidos, poliésteres, uretanos, parlenos, polímeros de polifosfazeno, fluoropolímeros, poliamidas, poliolefinas, e misturas destes.

[0069] O stent pode ser revestido ainda com uma camada de um material antitrombótico que compreende ou que consiste de um ou mais agentes selecionados de polissacarídeos, heparina, gelatina, colágeno, alginato, ácido hialúnico, ácido algínico, carragenano, condroitina, pectina, quitosano, e seus derivados e copolímeros. Adequadamente, estes agentes podem ser incorporados em uma cobertura biocompatível, como descrito na US 2006/0083772.

[0070] Os stents de eluição de droga adequados podem ser fabricadas usando os métodos e materiais de revestimento descritos acima. Os testes IN VITRO podem ser realizados para avaliar os perfis de liberação de droga em meio aquoso, como descrito na US2005/0037052 e US 2006/0083772. Adequadamente, um stent de eluição de droga de acordo com o quarto aspecto da invenção deve liberar a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma em um período de pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 5 dias, 10 dias, 20 dias, 30 dias, 40 dias, 50 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias ou ainda 100 ou 150 dias a seguir da implantação. Adequadamente, não mais do que 60%, 70%, 80% ou 90% são liberados no primeiro terço do período em relação ao que o stent libera a Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma.

[0071] Uma quantidade adequada de Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma pode estar na faixa de cerca de um micrograma a cerca de 10 miligramas (mg) de agente bioativo por cm2da área de superfície eficaz do dispositivo, e tipicamente entre cerca de 5 μg e cerca de 10 mg, mais tipicamente entre cerca de 1 μg e cerca de 1 mg. Em Vogt ET AL, supra, o stent teve uma área de superfície de 87 mm2e conteve 170 μg de paclitaxel.

[0072] Um quinto aspecto da invenção fornece um método para fabricar um stent para a dispensação de Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma a um paciente, que compreende incorporar Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma dentro ou sobre um corpo de stent. Os métodos adequados para incorporar um droga dentro ou sobre um corpo de stent são descritos em Blindt ET AL (1999) Int J Artif Organs 22: 843-853, US2005/0037052 e US 2006/0083772.

[0073] Em uma forma de realização preferida do quinto aspecto da invenção, o método compreende a) fornecer um corpo de stent tendo uma superfície, e b) aplicar um revestimento sobre pelo menos uma porção da dita superfície, em que o dito revestimento compreende Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Adequadamente, a superfície luminal, ou a superfície transluminal ou ambas as superfícies são revestidas. Os métodos de revestimento de um corpo de stent, e as composições de revestimento adequadas são descritos na US2005/0037052 e US 2006/0083772. Os métodos conhecidos na técnica tais como imersão, pulverização, deposição ultrassônica ou a vácuo podem ser utilizados para aplicar um revestimento de uma solução de um material em um solvente adequado. A US2005/0037052 descreve que um gradiente de porosidade no revestimento pode ser atingido pela separação de fase, tal como pela adição de um não solvente à solução polimérica. Quanto mais alta a quantidade de não solvente, mais alto o grau de separação de fase e mais alta a porosidade na película. O revestimento próximo à superfície do stent pode ser formulado com a quantidade mais alta de não solvente para exibir a maior porosidade. Revestimentos sucessivos de soluções de droga-polímero podem ser depois formuladas com quantidades decrescentes de não solvente que fornecerá um sistema de revestimento com porosidade progressivamente mais baixa.

[0074] Em uma outra forma de realização do quinto aspecto da invenção, o método compreende moldar um stent a partir de uma composição que compreende um polímero e Anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma. Um método de moldar um stent a partir de uma mistura de um polímero e um composto de droga é divulgado em Blindt ET AL (1999) Int J Artif Organs 22: 843-853.

[0075] A Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma aludidos em relação a qualquer um do primeiro ao quinto aspectos da invenção podem ser selecionados de: a) Anexina A5 humana (SEQ ID NO: 1); b) um ortólogo de mamífero de Anexina A5 humana; c) uma variante alélica ou genética de a) ou b); d) um análogo funcional de Anexina que é uma proteína que é mais do que 50%, 60%, 70%, 75%, tal como mais do que 80%, 85%, mais do que 90%, ou ainda mais preferivelmente mais do que 95% ou 99% idêntica à Anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1; e) um dímero de, ou proteína de fusão que compreende, qualquer um de a), b), c) ou d); e f) uma variante PEGuilada de qualquer um de a), b), c), d) ou e).

[0076] Em formas de realização particulares, o análogo ou variante funcional de Anexina A5 de acordo com a invenção é mais do que 50%, 60%, 70%, 75%, tal como mais do que 80%, 85%, mais do que 90%, ou ainda mais preferivelmente mais do que 95% ou 99% idêntica à Anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.

[0077] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácido é determinada como segue. Primeiro, uma sequência de aminoácido é comparada com, por exemplo, a SEQ ID NO: 1 usando o programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) da versão independente de BLASTZ contendo a versão BLASTN 2.0.14 e a versão BLASTP 2.0.14. Esta versão independente de BLASTZ pode ser obtida do sítio da web do National Center for Biotechnology Informatio do Governo U.S. em ncbi.nlm.nih.gov. As instruções que explicam como usar o programa Bl2seq pode ser encontrado no arquivo readme que acompanha BLASTZ. Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências de aminoácido usando o algoritmo BLASTP. Para comparar duas sequências de aminoácido, as opções de Bl2seq são ajustadas como segue: -i é ajustado a um arquivo contendo a primeira sequência de aminoácido a ser comparada (por exemplo, C: \seql.txt); -j é ajustado a um arquivo contendo a segunda sequência de aminoácido a ser comparada (por exemplo, C: \seq2.b<t); - p é ajustado ao blastp; -o é ajustado a qualquer nome de arquivo desejado (por exemplo, C: \output.txt); e todas as outras opções são deixadas no seu ajuste padrão. Por exemplo, o seguinte comando pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre as duas sequências de aminoácido: CABI2seq c: \seq1.txt —j cAseq2.txt —p blastp —o c: \output.txt. Se as duas sequências comparadas compartilham homologia, então o arquivo de saída designado apresentará estas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se as duas sequências comparadas não compartilham homologia, então o arquivo de saída designado não apresenta as sequências alinhadas. Uma vez alinhadas, o número de emparelhamentos é determinado contando-se o número de posições onde um nucleotídeo ou resíduo de aminoácido idênticos são apresentados em ambas as sequências.

[0078] A identidade percentual é determinada dividindo-se o número de emparelhamentos pelo comprimento da sequência apresentada em uma sequência identificada seguida pela multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, se uma sequência é comparada com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 (o comprimento da sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 é 320) e o número de emparelhamentos é 288, então a sequência tem uma identidade percentual de 90 (isto é, 288 + 320 * 100 = 90) em relação à sequência apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0079] Assim, um análogo ou variante funcional de Anexina A5 pode ser uma proteína em que em uma ou mais posições existem inserções, deleções, ou substituições de aminoácido, conservativas ou não conservativas, contanto que tais mudanças resultem em uma proteína cujas propriedades básicas para funcionar em uma maneira equivalente à Anexina A5 não foram significantemente mudadas. “Significantemente” neste contexto significa que uma pessoa habilitada na técnica diria que as propriedades da variante podem ser ainda diferentes mas não seriam imediatamente evidentes em relação àquelas da proteína original.

[0080] Por “substituições conservativas” é intencionado combinações tais como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr.

[0081] Tais variantes podem ser fabricadas usando os métodos de engenheiramento de proteína e mutagênese loco-dirigida que são bem conhecidos na técnica.

[0082] O análogo ou variante funcional de Anexina A5 de acordo com a invenção podem ser um dímero de Anexina A5 (tal como Dianexina A5) ou um análogo ou variante funcional da mesma, ou pode ser uma Anexina A5 PEGuilada ou um análogo ou variante funcional da mesma. Dianexina A5 e Anexina A5 PEGuilada são divulgadas na WO 02/067857.

[0083] A PEGuilação é um método bem conhecido por aqueles habilitados na técnica em que um polipeptídeo ou composto peptidomimético (para os propósitos da presente invenção, a Anexina A5 ou o análogo ou variante funcional) é modificado tal que uma ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG) são covalentemente ligadas à cadeia lateral de um ou mais aminoácidos ou derivados destes. Esta é uma das mais importantes técnicas químicas estruturais de alterar molécula (MASC). Outras técnicas MASC podem ser usadas; tais técnicas podem melhorar as propriedades farmacodinâmicas da molécula, por exemplo estendendo a sua meia vida IN VIVO. Um conjugado de PEG-proteína é formado ativando-se primeiro a porção de PEG de modo que a mesma reagirá com, e ligar-se-á com, a proteína ou composto peptidomimético da invenção. As porções de PEG variam consideravelmente em peso molecular e conformação, com as porções iniciais (PEGs monofuncionais; mPEGs) sendo lineares com pesos moleculares de 12 kDa ou menos, e as porções posteriores sendo de pesos moleculares aumentados. PEG2, uma inovação recente em tecnologia de PEG, envolve a ligação de um mPEG de 30 kDa (ou menos) a um aminoácido de lisina (embora a PEGuilação possa ser estendida para a adição de PEG a outros aminoácidos) que é reagido ainda para formar uma estrutura ramificada que se comporta como um mPEG linear de peso molecular muito maior (Kozlowski ET AL., (2001), Biodrugs 15, 419 - 429). Os métodos que podem ser usados para ligar covalentemente as moléculas de PEG aos polipeptídeos são descritas ainda em Roberts ET AL., (2002) Adv Drug Deliv Rev, 54, 459 - 476, Bhadra ET AL., (2002) Pharmazie 57, 5 - 29, Kozlowski ET AL., (2001) J Control Release 72, 217 - 224, e Veronese (2001) Biomaterials 22, 405 - 417 e referências aludidas nestas.

[0084] As vantagens da PEGuilação para o polipeptídeo ou composto peptidomimético da invenção incluem a depuração renal reduzida que, para alguns produtos, resulta em uma absorção mais prolongada depois da administração assim como distribuição restrita, possivelmente levando a uma concentração plasmática mais constante e prolongada e consequentemente um aumento na eficácia clínica (Harris ET AL., (2001) Clin Pharmacokinet 40, 539 - 551). Outras vantagens podem incluir imunogenicidade reduzida do composto terapêutico (Reddy, (2001) Ann Pharmacother. 34, 915 - 923), e toxicidade baixa (Kozlowski ET AL., (2001), Biodrugs 15, 419 - 429).

[0085] O análogo ou variante funcional de Anexina A5 pode ser uma proteína de fusão que compreende a sequência de Anexina A5 ou uma variante desta. Assim, por exemplo, a Anexina A5 ou uma variante desta podem ser fundidas a um ou mais sequências de polipeptídeo parceiras de fusão de modo a prolongar a meia-vida da molécula dentro de um sistema circulatório do paciente e/ou adicionar outra funcionalidade à molécula.

[0086] Um análogo “funcional” ou variante de Anexina A5 pode ser capaz de ligar à fosfatidilserina em uma membrana biológica, preferivelmente a um nível que seja de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou cerca de 100% daquela demonstrada pela Anexina A5 humana (SEQ ID NO: 1) sob as mesmas condições. Um método adequado para medir a ligação da Anexina A5 à fosfatidilserina em uma membrana biológica é conhecido na técnica (Vermes, I., ET AL., A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Anexina V. J Immunol Methods, 1995. 184(1): p. 39-51).

[0087] Um análogo ou variante “funcionais” de Anexina A5, adicional ou alternativamente, podem possuir pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou cerca de 100% da atividade terapêutica da Anexina A5 humana (SEQ ID NO: 1) quando usada na mesma dosagem (isto é, equivalente molar), para a profilaxia ou o tratamento de restenose de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Neste contexto, a atividade terapêutica de um análogo ou variante “funcionais” de Anexina A5 pode ser determinada, comparada com aquela da Anexina A5 humana (SEQ ID NO: 1), pela comparação da capacidade de uma quantidade equivalente molar do análogo ou variante funcional e de Anexina A5 humana para tratar ou fornecer profilaxia para a restenose como descrito acima, e/ou pelos testes de animal, tal como usando a metodologia apresentada nos seguintes exemplos.

[0088] Um teste adequado é como segue: 1. Manter camundongos ApoE*3 Leiden em uma dieta brandamente hipercolesterolêmica por 3 semanas antes da cirurgia; 2. um dia antes da cirurgia e durante o resto do procedimento, tratar os camundongos pela injeção intraperitoneal de 1 mg/kg peso corporal/dia de Anexina A5, ou uma quantidade equivalente molar do análogo ou variante funcional de Anexina A5, ou veículo sozinho; 3. Formar uma bainha circundante da veia femoral com tubo de polietileno de diâmetro fino não constritivo; 4. Sacrificar os camundongos três dias depois da colocação de bainha, e examinar a composição vascular na lesão arterial. 5. Comparar os resultados obtidos nos camundongos tratados pela Anexina A5 com aqueles tratados com o análogo ou variante funcional de Anexina A5, e os camundongos não tratados. Os parâmetros relevantes são: A capacidade de tratamento com o análogo ou variante de Anexina A5 para reduzir a porcentagem de células ligadas ao endotélio identificável como leucócitos, comparada ao grupo não tratado; a capacidade de tratamento com o análogo ou variante de Anexina A5 para reduzir a porcentagem de células no meio identificável como leucócitos, comparada ao grupo não tratado. Em cada caso, o análogo ou variante de Anexina A5 podem ter pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou cerca de 100% do efeito da Anexina A5 em reduzir cada um ou ambos destes efeitos.

[0089] Um outro teste adequado é como segue: 1. Manter os camundongos ApoE*3 Leiden em uma dieta de alta gordura por 3 semanas antes da cirurgia; 2. Um dia antes da cirurgia, ou no dia da cirurgia, e durante o resto do procedimento, tratar os camundongos pela injeção intraperitoneal de 1 mg/kg de peso corporal/dia de Anexina A5, ou uma quantidade equivalente molar do análogo ou variante funcional de Anexina A5, ou veículo sozinho; 3. Enxertar a veia cava inferior de um cria da mesma ninhada na artéria carótida comum; 4. Sacrificar os camundongos 28 dias depois do enxerto de veia, e examinar a composição vascular e as dimensões do enxerto de veia. 5. Comparar os resultados obtidos nos camundongos tratados pela Anexina A5 com aqueles tratados com o análogo ou variante funcional de Anexina A5, e os camundongos não tratados. Os parâmetros relevantes são: a capacidade de tratamento com o análogo ou variante de Anexina A5 para reduzir o número de leucócitos na parede do enxerto de veia, comparada com o grupo não tratado; a capacidade de tratamento com o análogo ou variante de Anexina A5 para reduzir o espessamento de enxerto de veia isto é, a área da neoíntima de seção transversal longitudinal, comparada com o grupo não tratado. Em cada caso, o análogo ou variante de Anexina A5 podem ter pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou cerca de 100% do efeito da Anexina A5 na redução de cada um ou de ambos destes efeitos.

Exemplos

[0090] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar formas de realização particulares da invenção. Deve ser avaliado por aqueles de habilidade na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas constituir os modos preferidos para a sua prática. Entretanto, aqueles de habilidade na técnica devem, considerando a presente divulgação, avaliar que muitas mudanças podem ser feitas nas formas de realização específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado equivalente ou similar sem divergir do seu espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1: Modelo de enxerto de veia de camundongo

[0091] Em um modelo de camundongo de CABG é um enxerto de veia tomado de um camundongo doador. Em um camundongo receptor, uma artéria carótida é liberada do tecido circundante, e o fluxo sanguíneo é interrompido pela colocação de dois grampos de artéria. O vaso é depois secionado entre os dois grampos de artéria, e o enxerto de veia é suturado para encaixar entre as duas extremidades de artéria. Quando este procedimento é acabado, os grampos são removidos e o fluxo sanguíneo é restaurado. Uma descrição detalhada do método é publicada (Zou ET AL., 1998)

[0092] Quando 4 semanas se passaram, uma neoíntima formou-se no enxerto de veia. A dimensão da neoíntima é medida histologicamente depois da morte dos camundongos. Se os camundongos usados são hiperlipidêmicos, por exemplo, camundongos apoE (-/-) que são administrados com uma dieta de alta gordura ou camundongos apoE*3-Leiden que também são administrados com uma dieta de alta gordura, a neoíntima desenvolver-se-á mais rapidamente do que nos camundongos normais. Em tais camundongos, as lesões podem atingir um estado tão severo que pode-se observar evidência de erosão endotelial, hemorragia intraplaca e disseminação, isto é, consequências similares àquelas podem acontecer em pacientes.

[0093] As dimensões da neoíntima em enxertos de veia em camundongo podem ser significantemente reduzidas pelo tratamento com Anexina A5. Uma injeção diária de 1 mg Anexina A5 / kg de peso corporal intraperitonealmente reduzirá a neoíntima em pelo menos 20%, mostrando a eficácia do tratamento.

Exemplo 2: Modelo de bainha perivascular de camundongo

[0094] Uma bainha colocada em torno da artéria femoral de um camundongo levará ao desenvolvimento rápido de uma neoíntima. Este modelo foi usado como um modelo da formação de neoíntima causada pela PCI, e foi usado para avaliar os efeitos de drogas anti-restenóticas (Pires ET AL., 2006). As lesões neoíntimas conterão células de músculo liso, mas haverá também o recrutamento de glóbulos brancos circulantes nas lesões, especialmente se o procedimento é realizado em camundongos que são hiperlipidêmicos. O desenvolvimento das lesões é rápido, e uma lesão significante é observada já dentro de 1 semana.

[0095] As dimensões da neoíntima em enxertos de veia de camundongo podem ser significantemente reduzidas pelo tratamento com Anexina A5, e/ou a porcentagem do número total de células ligadas ao endotélio e/ou presentes no meio que são identificáveis como leucócitos, tais como macrófagos, pode ser significantemente diminuída. Uma injeção diária de 1 mg de Anexina A5 / kg de peso corporal intraperitonealmente pode reduzir a neoíntima em pelo menos 20%, mostrando a eficácia do tratamento.

[0096] Sumário. Um efeito não desejado de intervenções cirúrgicas com o objetivo de restaurar O fluxo sanguíneo normal para o tecido isquêmico é a restenose do vaso que foi dilatado pela PCI ou nos vasos de enxerto usados para desviar o segmento arterial estenosado. Em modelos de animal de restenose, foi surpreendentemente descoberto que a Anexina A5 reduziu o desenvolvimento da restenose.

Exemplo 3: Modelo de bainha perivascular de camundongo - resultados experimentais

[0097] A angioplastia de balão (com ou sem colocação de stent) é um modo comum para restaurar o fluxo sanguíneo para por exemplo, miocárdio isquêmico em pacientes com angina do peito ou infartação do miocárdio. O procedimento deflagra uma inflamação no segmento de vaso dilatado, que pode levar à restenose, isto é, o segmento de vaso dilatado se torna novamente estenótico devido ao desenvolvimento de uma chamada neoíntima. Este fenômeno pode levar a uma necessidade quanto a um procedimento de vascularização repetido em tantos quanto 30 a 50% dos pacientes dentro de 3 a 12 meses se um stent não é colocado no segmento de vaso dilatado. Um stent metálico verificado pode reduzir a taxa de restenose, mas em tantos quanto 15 a 30% podem necessitar ainda de revascularização dentro de 3 a 12 meses.

[0098] A colocação de uma bainha plástica perivascular em torno da artéria femoral em um camundongo é um modelo experimental de uma formação de neoíntima induzida pela inflamação, isto é, é um modelo de restenose. Nós testamos se a anexina A5 afetaria a formação da neoíntima neste modelo.

Experimental

[0099] Camundongos ApoE*3 Leiden machos foram alimentados com uma dieta brandamente hipercolesterolêmica por 3 semanas antes do procedimento experimental, que continuou até o final do período experimental. Um dia antes da cirurgia os camundongos foram randomizados em um dos grupo de tratamento com base nos níveis de colesterol plasmático, níveis de triglicerídeos e peso corporal. O tratamento com 1 mg/kg de peso corporal/dia de anexina A5 (injeção intraperitoneal) foi iniciada um dia antes da colocação de bainha e continuou diariamente durante o período experimental. No dia 0 a cirurgia foi realizada, isto é, uma bainha não constritiva foi colocada em torno de cada artéria femoral dos camundongos. Os camundongos foram sacrificados 3 dias depois da colocação de bainha.

Procedimento cirúrgico de colocação de bainha

[00100] Os camundongos foram anestesiados antes da cirurgia pela administração intraperitoneal de uma combinação de Midazolam (5 mg/kg, Roche, Woerden, Países Baixos), Medetomidina (0,5 mg/kg, Orion, Espoo, Finlândia) e Fentanil (0,05 mg/kg, Janssen, Berchem, Bélgica). Este coquetel de anestésicos dá narcose completa por pelo menos uma hora. Depois de raspar o lado interno de ambas as pernas e desinfetara área de cirurgia com álcool (70%) uma incisão de 1 cm longitudinal foi feita no lado interno da perna. Em seguida, um comprimento de 3 mm da artéria femoral foi dissecado livre do nervo femoral e veia femoral. A artéria femoral foi laçada com uma ligadura de seda 6/0 (0,7 métrica B/BRAUN, Tuttlingen, Alemanha) para manipulação cuidadosa da artéria. Um tubo de polietileno de diâmetro fino não constritivo (Portex, Kent, UK; 0,40 mm de diâmetro interno, 0,80 mm de diâmetro interno e um comprimento aproximado de 2 mm) foi longitudinalmente aberto e provido com mangas em torno da artéria femoral. A bainha foi fechada com dois nós de ligadura de seda 6/0. A pele foi fechada com uma sutura contínua. Depois da cirurgia, a anestesia foi antagonizada subcutaneamente com Atipamezol e Flumazenil. Os animais foram colocados em uma gaiola limpa no topo de uma almofada de aquecimento por pelo menos 4 horas.

Sacrifício dos animais

[00101] Para a análise histológica, os animais foram sacrificados 3 dias depois da colocação de bainha. Depois da anestesia (Midazolam / Medetomidine / Fentanil) e amostragem de sangue, o tórax foi aberto e uma pressão-perfusão branda (100 mmHg) com 3,7% de formaldeído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (peso/vol) foi realizada por 5 minutos pela punção cardíaca no ventrículo esquerdo. Depois da perfusão, a artéria femoral provida de bainha colhida, fixada durante a noite em 3,7% de formaldeído em PBS (peso/vol) e embutido em parafina. Seções transversais em série (5 μm de espessura) foram tomadas do comprimento inteiro do segmento de artéria femoral provida com bainha para a analise histológica.

Amostragem de sangue

[00102] Sangue foi coletado em tubos capilares de K2EDTA (Microvette, Sarstedt, Alemanha) a partir da cauda (um dia antes da cirurgia para randomização) ou pela veia cava (sacrifício). Os tubos capilares foram mantidos frios a 4° C por meia hora seguida pela centrifugação a 6000 RPM (1200 G) por 10 minutos em uma centrífuga a 4° C esfriada. O plasma foi subsequentemente aliquotado para outra análise. No sacrifício, o plasma foi aliquotado em tubos de polipropileno de 1,5 ml (Eppendorf), uma amostra de 20 μl para as análises de colesterol e triglicerídeos e o plasma remanescente para análise reserva. As amostras foram armazenadas a - 80° C.

[00103] Os níveis de colesterol e triglicerídeos totais foram determinados nas amostras plasmáticas tiradas um dia antes da cirurgia e no sacrifício. O colesterol plasmático total foi medido enzimaticamente com o kit 1489437 (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos) e as concentrações de triglicerídeos totais foram medidas com o kit 148872 (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos).

Composição Vascular

[00104] A composição vascular foi analisada pela imunocitoquímica e análise histomorfométrica com respeito ao número de leucócitos (anticorpos anti-CD45 diluição 1:200, Pharmingen, San Diego, USA), monócitos e macrófagos (AIA 31240 tingimento de macrófago diluição 1:3000, Accurate Chemical, Wesbury, USA) e as células que expressam o fator alfa de necrose de tumor (tingimento do fator alfa de necrose de tumor diluição 1:200, BioLegend, San Diego, CA, USA) e proteína-1 quimiotática monocítica (tingimento de proteína-1 quimiotática monocítica diluição 1:100, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) nas artérias femorais provida de bainha.

Resultados Composição vascular de lesões da artéria femoral provida de bainha

[00105] A porcentagem do número total de células ligadas ao endotélio identificadas como leucócitos foi significantemente diminuída em 71,3% (p = 0,015) para 9,69 ± 8,9% no grupo tratado com a anexina A5 humana recombinante em comparação com o grupo de veículo (34,2 ± 3,0%). A porcentagem do número total de células no meio identificadas como leucócitos foi significantemente diminuída em 69,0% (p = 0,031) para 6,1 ± 2,6% no grupo tratado com anexina A5 humana recombinante em comparação com o grupo de veículo (19,55 ± 4,6%) (Figura 1).

Monócitos e macrófagos

[00106] A porcentagem do número total de células ligadas ao endotélio identificadas como macrófagos foi significantemente diminuída em 51,4% (p = 0,014) para 11,9 ± 2,3% no grupo tratado com anexina A5 humana recombinante em comparação ao grupo de veículo (24,5 ± 3,5%). A porcentagem do número total de células no meio identificadas como macrófagos foi significantemente diminuída em 87,3% (p = 0,018) para 1,8 ± 0,9% no grupo tratado com anexina A5 humana recombinante em comparação ao grupo de veículo (14,2 ± 5,5%) (Figura 2).

[00107] A porcentagem do número total de células ligadas ao endotélio identificadas como células que expressam MCP-1 tais como células inflamatórias e SMCs foi significantemente diminuída em 31,0% (p = 0,003) para 33,9 ± 3,1% no grupo tratado com anexina A5 humana recombinante em comparação ao grupo de veículo (49,1 ± 2,2%). A porcentagem do número total de células no meio identificado como células que expressam MCP-1 foi significantemente diminuída em 52,7% (p = 0,001) para 14,7 ± 2,8% no grupo tratado com anexina A5 humana recombinante em comparação ao grupo de veículo (31,1 ± 1,8%) (Figura 3). O número de células que expressam TNFα também foi significantemente reduzido no grupo de tratamento quando comparado com o grupo de controle.

Conclusão

[00108] Estes experimentos demonstram claramente os efeitos anti- inflamatórios da anexina A5 neste modelo de doença vascular induzida pela inflamação. A inflamação (medida como acúmulo de leucócitos na parede do vaso) foi acentuadamente inibida pelo tratamento com anexina A5. Além disso, a anexina A5 também pôde reduzir significantemente o número de células inflamatórias que foram ativadas, visto que menos células foram tingidas positivas para a citocima pró-inflamatória MCP-1. Os resultados fortemente sustentam que a anexina A5 é um tratamento eficaz para a prevenção de restenose a seguir da angioplastia de balão (com ou sem colocação de stent).

Exemplo 4: Modelo de enxerto de veia de camundongo - resultados experimentais

[00109] O enxerto de veia, o desvio de um segmento vascular estenosado, é um método para restaurar o fluxo sanguíneo a um órgão que se tornou isquêmico. A aplicação mais comum é a colocação de um chamado desvio de enxerto de artéria coronária (CABG). Atualmente este procedimento é comum para restaurar o fluxo sanguíneo ao miocárdio isquêmico em pacientes onde a localização da estenose não é adequada para a intervenção com base em cateter. Quando um enxerto de veia é colocado na circulação arterial, a sua morfologia adotará a pressão sanguínea e taxas de fluxo sanguíneo mais altas na circulação arterial. Embora este procedimento seja eficaz, e tenha salvado muitos indivíduos com doença cardíaca coronária, o mesmo está associado com um risco de restenose, um processo onde a veia enxertada desenvolve uma neoíntima que obstruirá o fluxo sanguíneo. Nós investigamos se a anexina A5 pode afetar a formação da neoíntima em um modelo de camundongo de CABG. Neste experimento, que teve uma duração de 28 dias, nós usamos anexina A5 tanto de ser humano quanto de murino. Isto é porque uma proteína humana pode dar origem a uma reação imune não específica em camundongos que poderia mascarar um eventual efeito de tratamento.

Experimental

[00110] Camundongos ApoE*3 Leiden machos foram alimentados com uma dieta de gordura alta rica em colesterol para induzir a hipercolesterolemia. A dieta conteve 0,05% de colato (para melhorar a captação do colesterol intestinal e suprimir a síntese de ácido biliar, ambos levando a níveis de colesterol plasmático aumentado) e 1% de colesterol (assim como 20% de caseína, 1% de cloreto de colina, 0,2% de metionina, 15% de manteiga de cacau, 40,5% de sacarose, 10% de amido de milho, 1% de óleo de milho, 5,1% de celulose e 5,1% de mistura mineral). Eles receberam a dieta três semanas antes da cirurgia e a dieta foi continuada por todo o experimento inteiro. Aos camundongos foi dada água de beber que foi acidificada ao pH 2,8 com HCl. Todos os animais receberam alimento e água AD LIBITUM durante o experimento inteiro.

Tratamento

[00111] Neste estudo os experimentos foram realizados com três grupos de tratamento diferentes. Os grupos foram como segue: - Grupo de controle, que recebe apenas veículo (solução salina tamponada com fosfato (PBS)) e que passam pela cirurgia de enxerto de veia. - Grupo de tratamento I, que passa pela cirurgia de enxerto de veia e que recebe anexina A5 humana recombinante em uma concentração de 1 mg/kg/dia via injeção intraperitoneal, começando no dia da cirurgia. - Grupo de tratamento II, que passam pela cirurgia de enxerto de veia e que recebem anexina A5 de murino recombinante em uma concentração de 1 mg/kg/dia via injeção intraperitoneal, começando no dia da cirurgia.

Procedimento cirúrgico de enxerto de veia

[00112] Os camundongos foram anestesiados antes da cirurgia pela administração intraperitoneal de uma combinação de Midazolam, Medetomidine e Fentanil. Este coquetel de anestésicos dá narcose completa por pelo menos uma hora. Depois de raspar a área do pescoço e desinfetar a área de cirurgia com álcool (70%) uma incisão de 1 cm longitudinal foi feita no lado frontal do pescoço. A artéria carótida direita comum foi dissecada livre dos seus circundantes da bifurcação até a extremidade distal na direção da extremidade proximal. O vaso foi ligado duas vezes com uma ligadura de seda de 8,0 (B/BRAUN, Tuttlingen, Alemanha) e dissecada entre as ligaduras centrais. Uma bainha foi colocada em ambas as extremidades depois que estas foram viradas do avesso em relação às bainhas e ligadas com uma ligadura de seda 8,0. Crias da mesma ninhada foram usadas como doador para a veia cava inferior. A colheita cuidadosa da veia cava inferior foi temporariamente preservada em uma solução a 0,9% de NaCl, contendo 100 U/ml de heparina a 4° C, para prevenir a coagulação e foi interposta entre as extremidades da artéria. As conexões foram ligadas entre si com uma sutura de seda 8,0. As pulsações confirmaram o enxerto bem sucedido. Depois da cirurgia, a anestesia foi antagonizada subcutaneamente com Atipamezol (2,5 mg/kg, Roche, Woerden, Países Baixos) e Flumazenil (0,5 mg/kg Orion, Espoo, Finlândia). Os animais foram colocados em uma gaiola limpa no topo de uma almofada de aquecimento por pelo menos 4 horas.

Sacrifício dos animais

[00113] O sacrifício foi realizado como descrito no Exemplo 3, exceto que o enxerto de veia, ao invés da artéria provida de bainha, foi colhida, fixada, secionada e tingida.

Amostragem de sangue

[00114] A amostragem de sangue e as análise de colesterol e triglicerídeo total foram realizadas como descrito no Exemplo 3.

Análise de espessamento do enxerto de veia

[00115] O espessamento de enxerto de veia foi quantificado usando 6 seções em série de corte perpendicular igualmente espaçada do enxerto de veia.

Leucócitos

[00116] A composição vascular foi analisada pela imunocitoquímica e análise histomorfométrica. Os leucócitos foram identificados pela reatividade aos anticorpos anti-CD45 (Pharmingen, San Diego, USA) e foram quantificados como número de células positivas por campo de alto alcance.

Resultados Espessamento de enxerto de veia

[00117] Para estudar o papel da anexina A5 sobre o espessamento de enxerto de veia, a anexina A5 humana ou de murino recombinantes (1 mg/kg, dissolvida em 150 μl de veículo) foi administrada diariamente via injeção intraperitoneal aos grupos diferentes (n = 10 camundongos por grupo). Um grupo de apenas veículo foi usado como o grupo de controle (n = 10 camundongos). Os espessamento de enxerto de veia médio, pela medição da área entre o lúmen e adventícia, foi quantificado para cada grupo de 28 dias depois da cirurgia. O espessamento de enxerto de veia foi significantemente diminuído em 48% para 0,13 ± 0,01 mm2(p = 0,006) e em 40% para 0,15 ± 0,01 mm2(p = 0,018) em grupos tratados com anexina A5 humana e de murino recombinantes, em comparação ao grupo de veículo (0,25 ± 0,05 mm2) (Figura 4).

[00118] Uma área luminal maior foi observada nos grupos tratados com anexina A5 humana recombinante (0,44 ± 0,03 mm2, p = 0,126) e de murino (0,41 ± 0,04 mm2, p = 0,886), em comparação ao grupo de veículo (0,38 ± 0,03 mm2).

Leucócitos

[00119] O número de leucócitos na parede de enxerto de veia foi contado depois de 28 dias como um marcador de inflamação e resultou em uma diminuição significante no número de leucócitos de 45,8% em grupos tratados com anexina A5 humana recombinante (28,8 ± 2,3 células, p = 0,003) e de 41,8% nos grupos tratados com anexina A5 de murino recombinante (30,9 ± 3,0 células, p = 0,025) em comparação ao grupo de veículo (53,1 ± 6,1 células) (Figura 5).

Conclusão

[00120] O desenvolvimento rápido de uma neoíntima em enxertos de veia é um problema clínico que resulta na restenose, isto é, o lúmen da veia enxertada torna-se reduzido e o fluxo sanguíneo restringido. Este estudo claramente mostra que o tratamento com a anexina A5, usando anexina A5 humana ou de murino, eficazmente reduziu o crescimento de neoíntima nos enxertos de veia, e impediu o estreitamente de lúmen. O desenvolvimento rápido de uma neoíntima é um processo induzido pela inflamação, e é provável que os efeitos benéficos da anexina A5 foram ligados aos efeitos anti-inflamatórios do tratamento (observado como uma redução no acúmulo de leucócito nos enxertos, e como mostrado no exemplo 3). A anexina A5 tanto humana quanto de murino produziram resultados similares, mostrando que a Anexina A5 humana não deflagra nenhuma reação imune não específica nos camundongos que poderia ter mascarado os efeitos do tratamento. Os resultados fortemente sustentam que a anexina A5 é um tratamento eficaz para a prevenção da restenose de enxerto de veia.

[00121] Todas as composições e/ou métodos aqui divulgados e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação considerando-se a presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de formas de realização preferidas, estará evidente àqueles habilitados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, estará evidente que certos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos embora os mesmos resultados ou similares possam ser obtidos. Todos de tais substitutos similares e modificações evidentes a aqueles habilitados na técnica são julgados como estado dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reações anexas.

Referência

[00122] As seguintes referências, até o grau em que elas fornecem procedimento exemplar ou outros detalhes suplementares a aqueles aqui apresentados, são aqui especificamente incorporadas por referência: Pedido PCT WO 02/067857 Pedido PCT WO 2005/099744 US 6.602.282 (Assignee Avantec Vascular Corporation). WO 99/17680 (Localmed Inc). Pat. U.S. No 5.922.020 (Localmed Inc). US 2006/0083772 (DeWitt ET AL) US2005/0037052 (Medtronic Vascular, Inc.) Bhadra ET AL., (2002) Pharmazie 57, 5 - 29 Blindt ET AL (1999) Int J Artif Organs 22: 843-853 Bravata ET AL., Ann. Intern. Med., 147(10): 703-716, 2007. Cederholm e Frostegard, Ann. NY Acad. Sci., 1108: 96-103, 2007. Cederholm ET AL., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 25(1): 198-203, 2005. Harris ET AL., (2001) Clin Pharmacokinet 40, 539 - 551 Hirata ET AL (2006) J Amer. Soc. Echocardiography 19: 165191 Nolte ET AL (2007) Cardiovascular ultrasound 5: 33 Jasti ET AL (2004) Circulation 110: 2831-2836 Kozlowski ET AL., (2001) J Control Release 72, 217 - 224 Kozlowski ET AL., (2001), Biodrugs 15, 419 - 429 Motwani e Topol, Circulation, 97: (9): 916-931, 1998. Ong and Serruys (2005) Curr Issues Cardiol 32: 372-377 Pires ET AL, Vascul. Pharmacol., 44(5): 257-264, 2006. Rand, J. Autoimmun., 15(2): 107-111, 2000. Reddy, (2001) Ann Pharmacother 34, 915 - 923 Roberts ET AL., (2002) Adv Drug Deliv Rev, 54, 459 - 476 Shen ET AL., Am. J. Transplant., 7(11): 2463-2471, 2007. Smith Jr., ET AL., J. Am. Coll. Cardiol., 47(1): 216-235, 2006. Teoh ET AL., Gastroenterology, 133(2): 632-646, 2007. Thiagarajan e Benedict, Circulation, 96(7): 2339-2347, 1997. Vermes, I., ET AL., A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods, 1995. 184(1): p. 39-51 Veronese (2001) Biomaterials 22, 405 - 417 Vogt ET AL., (2004) European Heart Journal 25: 1330-40. Zhang ET AL., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 24(12): 2277-2283, 2004. Zou ET AL., Am. J. Pathol., 153(4): 1301-1310, 1998.

Claims

1. Uso de uma Anexina A5 recombinante, caracterizadopelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para a profilaxia ou tratamento de restenose em um paciente em necessidade de tal tratamento.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a restenose está associada a um enxerto de desvio, a uma intervenção com base em cateter ou com a implantação de um stent.

3. Uso de uma Anexina A5 recombinante, caracterizadopelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para o tratamento de estenose em um paciente que é, será ou foi sujeito a uma intervenção para o tratamento de estenose.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que o medicamento é para administração em conjunção com a intervenção.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a intervenção para o tratamento de estenose é selecionada de: uma intervenção cirúrgica, tal como enxerto de desvio; e uma intervenção com base em cateter, tal como angioplastia de balão com ou sem implantação de um stent e com ou sem aterectomia.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadopelo fato de que o medicamento é para administração parenteral, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou é para administração local a partir de um stent de eluição de fármaco.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelo fato de que o paciente é um paciente que é, será ou foi tratado com um agente terapêutico trombolítico, tal como aspirina, clopidogrel, triclopidina, ativador de plasminogênio de tecido, urocinase ou uma enzima bacteriana.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento também compreende um agente terapêutico trombolítico, tal como aspirina, clopidogrel, triclopidina, ativador de plasminogênio de tecido, urocinase ou uma enzima bacteriana.

9. Stent de eluição de fármaco, caracterizado pelo fato de que o fármaco é uma Anexina A5 recombinante.