CN101969978A - 预防或治疗再狭窄的化合物和方法 - Google Patents

Abstract

一种预防或治疗再狭窄的方法，包含给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。一种治疗患者中狭窄的方法，包含进行用于治疗狭窄的介入术联合给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。一种包含用于预防或治疗再狭窄的治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的药物组合物。一种药物洗脱支架，其中药物是膜联蛋白A5或其功能类似物或变体，及制备这样的支架的方法。

Description

预防或治疗再狭窄的化合物和方法

技术领域

本发明涉及预防或治疗再狭窄的新方法和组合物，所述再狭窄如用于恢复通向缺血组织血流的旁路移植术和或经皮冠状血管或外周血管基于导管的介入术后的再狭窄。

背景技术

对本说明书中显然在先的出版资料的列表或讨论不应必然地被认为是承认该资料是公知知识技术发展水平的一部分。

缺血性心脏病(IHD)一般是冠状动脉中动脉粥样硬化的结果。动脉粥样硬化是动脉内膜的疾病，起始症状为脂质物质和炎症细胞的局部沉积。当这些载满脂质的病变进展到晚期时，它们变得狭窄(即导致血管变窄)并因此能限制通向心肌的血流。动脉粥样硬化也在其他动脉中发生并能导致特别是通向腿部、脑部和肾脏的血管的狭窄。该血流限制能导致缺血性疼痛，如心绞痛和间歇性跛行。

动脉粥样硬化的另一个后果是病变能变得不稳定并破裂，导致在破裂点形成动脉血栓。该血栓严重危害下游组织的氧供应，除非血栓被溶解，否则它将导致缺血组织的梗塞形成(心肌梗塞、中风等)。心肌梗塞和中风是世界范围内最常见的两类致死原因。

恢复缺血组织的正常血液供给是治疗缺血失调的最重要的急切目标，这可通过药物治疗或介入术获得。在患有急性动脉血栓形成事件如急性心肌梗塞的患者中，尽快恢复通向缺血组织的血流是重要的，以减少血栓形成事件的后果，并且外科干预在这种情况下是普遍的。患有不能用药物充分控制的稳定型心绞痛或其他缺血失调的患者也可进行手术治疗。

利用旁路移植术(如冠状动脉旁路移植术，CABG)或基于导管的介入术(catheter based intervention)进行外科干预(surgicalintervention)，如用于冠状动脉重建术的外科干预。在旁路移植术如CABG的情况下，将乳动脉暴露，将其末端从乳房移开并缝合入冠状动脉狭窄区段远端的位置，因此允许灌注缺血组织。假如不能使用乳动脉，或假如需要多个旁路，外科医生将使用来源于腿部的静脉(静脉移植)。在这种情况下，将静脉区段移开并按从主动脉到狭窄远端的位置进行放置。

在基于导管的介入如PCI(经皮冠状动脉介入)时，一般将气囊导管通过股动脉插入并引导入狭窄区段，在此处使气囊膨胀，因此狭窄区段被扩张。这也称为气囊血管成形术。在PCI过程中完成的其他操作可包括植入支架或进行动脉粥样硬化斑块切除术，如旋转或激光动脉粥样硬化斑块切除术(移除动脉粥样硬化斑块物质)。为了改善介入术的功效，可使用支架导管(stent catheter)来植入支架。在这种情况下，导管也放置金属支架来支撑动脉壁以维持管腔口径。

用于恢复通向缺血组织的正常血流的介入术能导致再狭窄，其由新内膜形成或新内膜变厚导致。根本原因在于血管平滑肌损伤和内皮衬里(endothelial lining)完整性的破坏。该过程的特征也在于炎症细胞的存在和活性以及患者所罹患的最后的并存病(co-morbidities)。原发性狭窄和继发性再狭窄发展过程的根本分子机理是不同的，但在二者间存在大量重叠。

旁路移植是有效的介入术，但常见的并发症为所谓的再狭窄，将导致在移植血管中形成新狭窄的新生膜的快速发展，经常导致对进行重复的血管再形成操作的需求。在静脉移植时这特别常见，其中在第一年大约有15％的移植物封闭，在10年内50％的移植血管是狭窄的(Motwani和Topol，1998)。可将静脉移植失败视为损伤诱导的炎症疾病，这包括巨噬细胞浸润和激活，以及中膜平滑肌细胞激活(Zhang等人，2004)。

PCI后再狭窄也是一个常见并发症。在PCI后进行重复的血管再形成操作比在CABG后进行重复的血管再形成操作更为常见；在第5年时的绝对比率分别为：气囊血管成形术后为46.1％，在用支架进行的PCI后为40.1％，在CABG后为9.8％(Bravata等人，2007)。

具有基质合成表型(matrix synthesising phenotype)的平滑肌细胞增殖是导致新生膜形成过程的重要因素。近期的有效减少再狭窄的发展是所谓的药物洗脱支架(DES)。这些支架用含有细胞生长抑制剂(如雷帕霉素)的聚合物涂覆，其有效抑制针对外科干预的增生性反应。在接受DES的患者中，再狭窄发生率一般低于4％。然而，DES支架并不能完全地整合入血管壁，伴随而来的是增加的血栓形成风险，该风险用药物不能有效地控制。实际上，关于再狭窄的DES的优点没有显著改善患者预后，因为增加的血栓风险抵消了该效果。实际上，现在有了谨慎使用DES的建议，还提出了增加抗血栓治疗的建议(Smith等人，2006)。

再狭窄病变是炎性病变，其至少在表面上与原发性动脉粥样硬化病变具有相似性。主要的细胞是平滑肌细胞，但也可以是巨噬细胞/泡沫细胞，并且在再狭窄病变中存在T-淋巴细胞。CABG和PCI可有效治疗狭窄，且药物方法有限制介入相关的并发症的某种优点，但有效预防再狭窄的有效治疗能进一步改善治疗。即使是在DES的情况下，如果支架能用不增加动脉血栓形成风险的有效的抗再狭窄剂涂覆将是有利的。

由上述概要明显可见，降低再狭窄形成的有效治疗是疾病状况的治疗机会，在所述疾病状况中进行了血管再形成操作，这不依赖于用于获得血管再形成的技术是有支架植入或无支架植入的旁路移植术或狭窄血管区段的气囊扩张术。

膜联蛋白A5是结合到带电荷的磷脂类如磷脂酰丝氨酸(PS)的内源性蛋白质(Cederholm和Frostegard，2007)。膜联蛋白A5是有效的抗血栓剂(Thiagarajan和Benedict，1997)，据建议，膜联蛋白A5通过结合到暴露的PS上能形成‘保护性屏障’，该保护性屏障能抑制PS对血栓形成的效应(Rand，2000)。

据显示，除了具有抗血小板效应和抗凝效应外，膜联蛋白A5和其类似物-膜联蛋白A5二聚体(二聚膜联蛋白(diannexin))在预防肝脏再灌注损伤中也是有效的(Teoh等人，2007)，且其改善了大鼠肝移植物的结果(Shen等人，2007)。有意思的是，在这两个研究中，治疗均伴随降低的肝脏内皮炎症活性，这通过降低的粘附分子表达测得，即膜联蛋白A5具有抗炎效应。据建议，二聚膜联蛋白通过引起维持通向肝脏的血液供应的抗血栓效应改善了肝脏移植物的存活率(Shen等人，2007)。更早前也已建议，膜联蛋白A5能用于稳定患者冠状动脉中的动脉粥样硬化病变，其降低了这些患者中心肌梗塞的风险(Cederholm等人，2005；WO 2005/099744)。

发明内容

本发明的第一方面提供了预防或治疗再狭窄的方法，其包含给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

本发明的第二方面提供了治疗患者中狭窄的方法，其包含进行用于狭窄治疗的介入术并联合给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

本发明的第三方面提供了包含用于预防或治疗再狭窄的治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的药物组合物。

本发明的第四方面提供了药物洗脱支架，其中药物是膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

本发明的第五方面提供了制备用于向患者递送膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的支架的方法，该方法包含将膜联蛋白A5或其功能类似物或变体整合进入支架体或整合在支架体上。

考虑了可以将此处公开的任何方法或组合物用此处公开的任何其他方法或组合物进行实施。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”联用时，单词“a”或“an”的使用可指“一”，但它也与“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。

当与下述说明和附图共同考虑时，本发明的这些具体实施方案和其他具体实施方案可以被更好地评价和理解。然而，应理解，尽管指出了本发明的多个具体实施方案和其众多的具体细节，给出下述说明仅为了例证的目的，而不是为了限制。在没有背离本发明精神的情况下，可在本发明的范围内做出许多的替换、修改、添加和/或重新整理，本发明也包括所有这样的替换、修改、添加和/或重新整理。

附图说明

图1.APOE*3-Leiden转基因小鼠中动脉壁中白细胞的定量，该小鼠用富胆固醇膳食喂养，并在股动脉袖套手术(femoral artery cuffsurgery)后三天及每天用载体或重组人膜联蛋白A5进行治疗。以平均值±SEM表示白细胞百分比。

图2.在APOE*3-Leiden转基因小鼠动脉壁中用AIA 31240染色的单核细胞和巨噬细胞的定量，该小鼠用富胆固醇膳食喂养，并在股动脉袖套手术后三天及每天用载体或重组人膜联蛋白A5进行治疗。以平均值±SEM表示巨噬细胞在计数的细胞(贴到内皮或浸润到中膜中)总数目中的百分比。

图3.APOE*3-Leiden转基因小鼠动脉壁中表达MCP-1的细胞的定量，该小鼠用富胆固醇膳食喂养，并在股动脉袖套手术后三天及每天用载体或重组人膜联蛋白A5进行治疗。以平均值±SEM表示表达MCP-1的细胞百分比。

图4.APOE*3-Leiden转基因小鼠的静脉移植物变厚，该小鼠用富胆固醇膳食喂养，并在静脉移植手术后28天及每天用载体或重组人或鼠膜联蛋白A5进行治疗。以平均值±SEM(mm²)表示管腔和外膜间的面积。n.s.：不显著。

图5.APOE*3-Leiden转基因小鼠静脉移植物壁中白细胞数目的定量，该小鼠用富胆固醇膳食喂养，并在静脉移植手术后28天及每天用载体、重组人或鼠膜联蛋白A5进行治疗。以平均值±SEM表示细胞数目。

具体实施方式

发明人在此显示，膜联蛋白A5能降低两种再狭窄小鼠模型中新内膜的形成。因此，膜联蛋白A5或其类似物给予了具有能降低患者中再狭窄相关并发症数目的抗再狭窄性质的新治疗方式，所述患者经历了用于缺血组织血管再形成的旁路移植术或血管成形术操作。已有报告未显示膜联蛋白A5具有抗再狭窄性质。因此，能使用膜联蛋白A5来预防再狭窄。能全身性给予膜联蛋白A5，也可以将其用作药物洗脱支架中的抗再狭窄剂。

在第一个方面，本发明提供预防或治疗再狭窄的方法，其包含给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

换言之，本发明的第一方面提供了用于预防或治疗再狭窄的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。“预防”包括预防，特别是预防再狭窄的发展，或减少再狭窄的发展(原发性预防)和继发性预防，其中再狭窄已经发生，但防止患者状况恶化，或使状况更逐渐地恶化或到降低的程度。“治疗”包括的意思是部分地或全部地逆转患者中存在的再狭窄。

患者一般为人类患者。另外，患者可以是非人动物，如家畜(如猫、犬、兔、牛、羊、猪、小鼠或其他啮齿类动物)。

再狭窄可在为了恢复通向缺血组织的正常血流而进行的介入术后发生，所述介入术如已经用于治疗血管狭窄或血管中动脉粥样硬化癍块积累的血管再形成操作。内科医生能根据本领域的已知方法诊断由于粥样斑导致的狭窄或血管梗阻。一般用冠状动脉造影术或血管内超声(IVUS)评估冠状动脉狭窄。后者也用于定量动脉癍块。Jasti等人(2004)Circulation 110：2831-2836描述了能用IVUS测量的参数，以及定量冠状动脉造影术。能用IVUS测量的合适的靶病变和参考区段的参数是：(1)最小的和最大的管腔直径(mm)；(2)最小的管腔横断面积(MLA，mm²)；(3)等于外弹力膜横截面积(EEM CSA)减MLA的癍块加中膜(media)的横断面积(CSA，mm²)；(4)横断面变窄率(CSN)，其以癍块加中膜CSA除以EEM CSA而计算；(5)参考区段，其是接近或远离狭窄的看上去正常的动脉横断面；通常，可测量接近和远离狭窄的测量值的平均值；及(6)狭窄面积(AS)，以参考-管腔CSA-病变MLA×100/参考-管腔CSA计算得。≤2.8mm的平均管腔直径(MLD)或≤5.9mm²的平均管腔面积是本研究中保证介入术的临床上显著狭窄的指征。技术人员理解，不同的甄别域(cut-off value)对不同血管中狭窄的诊断可以是恰当的。经常将管腔减少至参考区段的50％认为是临床相关的狭窄。

也已知诊断狭窄的非侵入性方法。Holte等人(2007)Cardiovascularultrasound 5：33描述了用于直接观察冠状动脉区段和评估冠状动脉流速储备(coronary velocity flow reserve，CVFR)的经胸腔多普勒超声心动描记术。利用该技术，冠状动脉狭窄一般显示了利用彩色血流多普勒获取的颜色失真(colour aliasing)表达的局部血流加速和湍流，以及穿过狭窄的加速的流速。为了评估狭窄的严重程度，可通过比较失真位点的流速和最接近的上游非加速的狭窄前流速而定量血流加速。大于2.0的最大的与狭窄前峰心脏舒张流速的比率以高灵敏性和特异性预测了显著狭窄。

狭窄不限于冠状动脉，也可发生在脑血管以及其他外周血管如肾动脉和肢体动脉中。可以以与诊断冠状动脉血管相似的方式或利用功能测试如跑台运动诊断这样的血管中的狭窄。

通常，再狭窄可以在用于恢复通向缺血组织的正常血流的介入术后数周、数月或数年内变得明显，并且，如果不予治疗，在数周、数月或数年时间内将发展。在介入术后随访的过程中可诊断或不诊断再狭窄，当其导致临床并发症如心绞痛、血栓或梗塞时可第一次被注意到。内科医生一般根据与用于诊断狭窄的方法相同的方法诊断再狭窄。通常，可以利用冠状动脉造影术、IVUS或利用非侵入性方法如经胸腔多普勒超声心动描记术评估冠状动脉再狭窄。关于诊断狭窄的上述相似临床参数也用于诊断再狭窄。利用经胸腔多普勒超声心动描记术测定的大于2.0的最大的与狭窄前峰心脏舒张流速的比率指示了再狭窄，如上述Holte等人中所描述的。Hirata等人(2006)J Amer.Soc.Echocardiography 19：165-191描述了利用经胸腔多普勒超声心动描记术在成功进行冠状动脉左前降支PCI后6个月的患者中进行的非侵入诊断再狭窄。外周血管如肾动脉或肢体动脉的再狭窄可以用类似的方法诊断，或利用功能测验如跑台运动进行诊断。

在用于预防或降低再狭窄发展的根据本发明第一方面的预防方法中，一般在用于恢复通向缺血组织的正常血流的介入术时或之前不久给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。例如，可在介入术前至少1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时或30分钟或进行介入术时给予它。通常，在外科干预后持续给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体，例如在介入术后持续至少1周、2周、1个月、2个月、6个月、1年、2年、5年或10年。可以通过合适剂量形式的重复给药，或通过控释形式，如在介入术过程中使用的药物洗脱支架的形式给药，或作为一个或更多个给药形式的组合给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。应理解，可以选择持续给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的准确时间以便与介入术后不同时间的再狭窄风险程度相吻合。例如，当在介入术过程中使用裸露金属支架时，新内膜形成一般在介入术后大约6个月时达到峰值，然后减退，然而，当使用药物洗脱支架时，再狭窄倾向于更缓慢地发展，但在介入术后持续发展多达1或2年或甚至2年以上(Ong和Serruys(2005)Curr Issues Cardiol 32：372-377)。

在本发明第一方面的其他具体实施方案中，膜联蛋白A5或其功能类似物或变体以继发性预防的形式给予，以预防或减少已发生的再狭窄的恶化；或以治疗的形式给予，以彻底地或部分地逆转已发生的再狭窄。通常，膜联蛋白A5或其功能类似物或变体在原发性血管再形成操作和随后诊断患者中再狭窄后给予。通常，以合适剂量形式的重复给药提供膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。通常，给予在诊断再狭窄后持续至少1周、2周、1个月、2个月、6个月、1年、2年、5年或10年。也想到的是，进行其他血管再形成操作治疗再狭窄，及以控释药物的形式，如在其他血管再形成操作中使用的药物洗脱支架中提供膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。提供了一个或更多个给药形式的组合。

给予“治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体”指给予在预防或降低再狭窄发展、治疗再狭窄、或预防或降低已存在的再狭窄恶化中具有有益效果的量。通常，当膜联蛋白A5或其功能类似物或变体预防或降低了再狭窄发展时，在给药开始后再狭窄是不可诊断的或它变得比预期的(即，与没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体时其发展相比较)可诊断时间更晚，或在诊断后发展的更慢，或在诊断后发展到减少的程度，或是更晚的可诊断性、更慢的进展和降低的发展的任何两个或全部三个的组合。通常，再狭窄比在没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体时所预期的时间晚至少1个月、至少3个月、6个月、1年、2年、5年或10年才可诊断。其中，在诊断再狭窄后，在给予了膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的患者中再狭窄进展更慢，这通常引起对重复血管再形成操作的需求发生的时间比没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体时所预期的发生时间晚，通常，至少1个月、至少3个月、6个月、1年、2年、5年或10年。通常，当给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体来治疗再狭窄时，再狭窄症状随时间而消失，以至再狭窄在给药后10年、5年、2年、1年、6个月、3个月或1个月后不再可诊断。当给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体以预防或降低已发生再狭窄的恶化时，这通常引起对重复血管再形成操作的需求发生的时间比没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体时所预期的时间晚通常至少1个月、至少3个月、6个月、1年、2年、5年或10年。

合适地，针对再狭窄给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的有益效果(例如更晚的可诊断性、更慢的进展和/或降低的发展)可通过利用IVUS测定以下而进行鉴定：已经给予和/或正在给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的患者在进行血管再形成操作后处于再狭窄风险中或已经经历再狭窄的血管的平均管腔直径或平均管腔面积，并将其与在类似时间段之前经历相同类型血管中的相同类型血管再形成操作但没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的患者中的相同参数进行比较。合适地，在进行血管再形成操作后的时间点1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、2年、5年或10年，治疗的受试者中的平均管腔直径比没有用膜联蛋白A5或其功能类似物或变体治疗的受试者中的平均管腔直径大至少1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％、125％、150％或甚至200％，假定在血管再形成操作时或之前开始给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。另外，在上述任何时间点，治疗的受试者中的平均管腔面积比未治疗的受试者的平均管腔面积通常大至少2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、45％、55％、70％、100％、225％、300％、400％、500％、600％或甚至900％。优选地，以上纪录的平均管腔直径或面积的增加在血管再形成操作后的第6个月观察到。

技术人员将理解，其他终末点对于鉴定给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的治疗效果也可是合适的。例如，心肌梗塞和/或死亡是再狭窄的常见结局。给予了膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的受试者可经历比没有给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的受试者中预期的心肌梗塞风险降低的心肌梗塞风险，和/或存活更长时间。

可通过通常涉及数十个、数百个或数千个患者(如10、50、100、1000或10000或这些数字之间的值)的临床试验测定给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体对血管再形成操作后再狭窄可诊断性的影响。另外，可使用动物实验，如那些在下面描述的与测验膜联蛋白A5的功能类似物和变体有关的和实施例中的实验。

可受益于根据本发明第一方面的预防或治疗的受试者包括将要进行目的为恢复通向缺血组织的正常血流的介入术的受试者，或那些正在进行介入术或进行介入术后的受试者。患者可以是正在经历或已经经历了冠状动脉循环或外周血管内的血管再形成操作的受试者。这样的介入术可以是外科干预或经皮介入。例如，操作可以是旁路移植术，如冠状动脉旁路移植术，或基于导管的介入术，如有支架植入或无支架植入和进行或未进行动脉粥样硬化斑块切除术的气囊血管成形术，如经皮冠状动脉介入术或血管成形术。合适地，在本发明的第一方面中，再狭窄与旁路移植术相关。换言之，再狭窄由于旁路移植术操作已经发生，或处于发生的风险中。合适地，在本发明的第一方面中，再狭窄与基于导管的介入术有关。换言之，再狭窄由于基于导管的介入术已经发生，或处于发生的风险中。合适地，再狭窄与植入支架有关，不管该操作是否已经在外科干预如旁路移植术或基于导管的介入术的情况下进行。其他合适的受试者包括已经或将要例如通过支架移植术进行动脉瘤治疗的受试者。

膜联蛋白A5或其功能类似物或变体能与一种或更多种其他活性剂联合给予，所述活性剂如溶血栓治疗剂如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定(triclopidine)、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶或细菌酶如链激酶。膜联蛋白A5或其功能类似物或变体可以与任何一种或更多种其他活性剂共同给予，或单独、同时或连续地与这样的药剂给予。通常，使用一种或更多种这些药剂来降低血栓形成的风险，其可封闭血管，包括植入支架的血管。合适地，在涉及使用支架的血管再形成操作之前用噻氯匹定或氯吡格雷开始治疗，并在操作后持续至少3、6或甚至12个月(Ong和Serruys，上文)。通常，阿司匹林与噻氯匹定或氯吡格雷同时给予，然后持续一定时间。将阿司匹林与氯吡格雷或噻氯匹定一起使用称为二元抗血小板治疗。可在其他类型的介入术之前和之后应用相似的抗凝血药给药方案。

膜联蛋白A5或其功能类似物或变体能以胃肠外、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下或局部从药物洗脱支架的方式给予。当将支架植入受试者中时，膜联蛋白A5或其功能类似物或变体可从支架释放(即支架是药物洗脱支架)或可以用上面列出的另外途径给予受试者膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

在第二个方面，本发明提供了治疗患者中狭窄的方法，其包含进行用于治疗狭窄的介入术并联合给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。换言之，本发明的第二方面提供了和狭窄治疗联合的用于治疗狭窄的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

狭窄可发生并可如上述进行诊断。“用于治疗狭窄的介入术”指用于治疗患者中狭窄的任何介入术。本领域已知的狭窄介入术包括外科干预，如静脉移植术，包括旁路移植术如冠状动脉旁路移植术，和基于导管的介入术，如有支架植入或无支架植入的和进行或未进行动脉粥样硬化斑块切除术的气囊血管成形术，包括经皮冠状动脉介入术。

在本发明的第二方面，膜联蛋白A5或其功能类似物或变体与用于治疗狭窄的介入术联合给予。换言之，单独地、同时地或连续地进行给药和介入术。如在本发明第一方面相关部分中讨论的，可在介入术之前至少1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时或30分钟给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体，或在介入术进行时给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。通常，在外科干预后，持续给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体例如在介入术后至少1周、2周、1个月、2个月、6个月、1年、2年、5年或10年。

为了预防或降低狭窄治疗后再狭窄的发展，给予膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。因此，如以上在本发明第一方面的相关部分中所描述的，“治疗有效量的”膜联蛋白A5或其功能类似物或变体在预防或降低再狭窄发展中具有有益效果。

可受益于本发明第二方面的方法的合适受试者和患者群、合适的给药途径和剂量及合适的附加治疗如以上本发明第一部分的相关部分所述。

本发明的第三方面提供了包含用于预防或治疗再狭窄的治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的药物组合物。换言之，本发明的第三方面提供了膜联蛋白A5或其功能类似物或变体在制备用于预防或治疗再狭窄的药用产品中的用途。

预防和治疗再狭窄如本发明第一方面的相关部分所述。

因此，根据本发明第三方面的药物组合物可包含与药学上或兽医学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体，所述佐剂、稀释剂或载体一般根据目标给药途径和标准的制药实践进行选择。该组合物可以是速释、缓释或控释应用的形式。优选地，该制剂是含有活性成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的单位剂量。

短语“制药上或药理学上可接受的”指，当以适当方式将其给予动物如例如人时不产生副反应、过敏反应或其他不良反应的组合物。根据本公开制备这样的药物组合物对本领域技术人员是已知的，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990所例证的，通过引用将其并入此处。此外，对于动物(如人)给药，应理解的是，制备物的无菌度、致热源性、整体安全和纯度标准应满足FDA办公室生物制品标准的要求。

如此处所用，“药学上可接受的载体”包括本领域普通技术人员所知的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、赋形剂、崩解剂、像这样的物质及其组合。除了任何常规载体与活性成分不相容的范围外，考虑到了其在治疗组合物和制药组合物中的用途。

根据本发明的药物组合物可以或不可以用于(并且，因此以适用于以下的方式进行配方)：胃肠外、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下给药或从药物洗脱支架给药，或它们可利用灌输技术给药。可通过将合适溶剂中所需量的活性化合物与如上所列举的各种其他成分(如果需要)合并，然后通过灭菌制得无菌可注射溶液。最好以无菌水溶液的形式使用药物组合物，所述无菌水溶液可含有其他物质，如足量的盐或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。如果需要，将水溶液进行适当的缓冲(优选pH在3-9之间)。可利用本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地在无菌条件下制备合适的药物配方。

在每日剂量水平基础上用于给予患者如人类患者的治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体可以是以单个或分份剂量给予的每个成人0.01～1000mg的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体(例如，每kg患者体重约0.001～20mg，如0.01～10mg/kg，例如0.1mg/kg以上和20、10、5、4、3或2mg/kg以下，如约1mg/kg)。包括在药物洗脱支架内的合适剂量在下述的本发明第四方面的相关部分进行了讨论。

内科医生无论如何均能测定最适合任何个体患者的实际剂量，该剂量将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述的剂量是平均情况下的范例。当然，存在更高或更低的剂量范围是更为恰当的个别情况，这样的情况也落入本发明的范围。

对于兽医应用，以符合正常兽医实践的合适的可接受的配方给予本发明的化合物，兽医外科医生将决定最适于特定动物的给药方案和给药途径。

本发明的第四方面提供药物洗脱支架，其中药物是膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

支架是用于维持开放位置的血管的支架，通常在基于导管的介入术过程中使用。药物洗脱支架除了支架体外还包括至少一种药物，并且通常地，还有用于控制药物洗脱的涂层。典型的支架体是至少部分易弯曲的或是在其长度上用关节联接的(即邻近的可扩张环段用彼此联接的连接物联接)，以便于它们可通过脉管系统前进。此外，它们在扩张后应具有足够的机械强度，以机械地扩大管腔壁强度并因此维持管腔开放性。支架体通常是管形的并具有网孔结构。合适的支架体公开在US 6,602,282(Assignee Avantec Vascular Corporation)中。具有用S形连接物结合的可扩张环段和轴向柱的支架在WO 99/17680(Localmed Inc)中有描述。在美国专利5,922,020(Localmed Inc)中描述了包含包括支撑和铰链的可扩张环的支架，其中铰链配置有不同的开启力。典型的支架长度范围为约5mm～100mm，通常为约8mm～50mm。圆柱状支架的小(放射状折叠的)直径的范围一般为约0.5mm～10mm，更常见的范围为0.8mm～1.25mm。扩张的直径的范围一般为约1.5mm～50mm，优选范围为约2.5mm～30mm。

支架体可使用任何合适的材料制备，包括不锈钢、钛、镍或合金，如钴铬合金或其组合。特别合适的材料包括可锻造的金属，如300系列不锈钢，或有弹性的金属，如超弹性和形状记忆合金，如

合金，弹性不锈钢等。可能的是从这些金属的组合，或这些类型金属和其他非金属材料的组合形成本体区段。支架体也可由生物可吸收材料或生物可降解材料制得。合适的生物可降解支架体从聚酯制得，所述聚酯如Vogt等人(2004)European Heart Journal 25：1330-40中所描述的聚交酯。该支架体用作洗脱紫杉醇的平台，其能在配置后的多于两个月的时间内起作用。

通过适于在配置支架后允许膜联蛋白A5或其功能类似物或变体逐步释放的方法将膜联蛋白A5或其功能类似物或变体整合在支架体之上或之内。

Blindt等人(1999)Int J Artif Organs 22：843-853描述了从生物可吸收聚合物如聚-D-L-交酯(lactide)塑造支架的方法，他们称其为CESP(饱和聚合物的受控扩张)。CESP过程的特征为在高压下将无定形聚合物暴露于惰性气体，如二氧化碳，其具有塑化效应，使在接近室温的温度下处理聚交酯成为可能。低处理温度构成了对于热敏感聚合物而言的关键优点，并允许在塑造处理过程中加入热敏感的药物添加物。可利用材料的不同孔隙大小调节药物释放动力学。上文的Vogt等人使用了CESP方法来制备聚-D-L-交酯紫杉醇洗脱支架。

也可在支架体已经形成后通过涂覆支架体将膜联蛋白A5或其功能类似物或变体整合在支架体之上。在该具体实施方案中，支架体被涂以膜联蛋白A5或其功能类似物或变体并且一般也涂以其他物质，如适于允许膜联蛋白A5或其功能类似物或变体缓释的聚合物。通常，在该具体实施方案中，如上所述，支架体包含金属。然而，在生物可吸收或生物可降解支架体的情况下也可施用涂层，纵使这些也包括在塑造阶段整合的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

合适地，在支架体被涂覆的地方具有至少1、2、3或更多种涂层。US 2006/0083772(DeWitt等人)描述了合适的涂覆组合物及其在以允许生物活性剂在体内从涂覆物释放的方式施用生物活性剂到可植入的医疗器材如支架的表面的用途。组合物包含具有不同性质的多种相容的聚合物，所述性质允许将它们组合在一起以提供诸如耐久性、生物相容性和释放动力学的性质的最佳组合。在US 2006/0083772中描述的涂覆组合物包含一种或更多种与多种聚合物组合的生物活性剂，所述聚合物包括：(a)包含选自(i)与其他烯烃基的乙烯共聚物，(ii)聚丁烯，(iii)含芳香基的共聚物，(iv)含表氯醇的聚合物，(v)亚烷基-(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物(poly(alkylene-co-alkyl(meth)acrylates))或(vi)二烯属来源的非芳香聚合物或共聚物的聚合物的第一聚合物成分；和(b)包含选自聚(甲基)丙烯酸烷基酯或聚(甲基)丙烯酸芳香酯的一种或更多种聚合物的第二聚合物成分，其中“(甲基)”包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸形式的分子(分别对应于丙烯酸和/或甲基丙烯酸)。选择聚合物和用于测定活性剂释放速率的体外试验的标准也公开在US 2006/0083772中。此外，US 2006/0083772公开了用如硅烷和/或对氯亚二甲苯基(para-chloro-xylylene)的低分子量二聚体的聚合物(Parylene^TM C；Speciality Coating Systems(Indianapolis))的物质涂覆支架进行预处理以改善以后的聚合物层的附着性。也可包括顶涂层以改善生物相容性，防止脱层和/或降低起始药物洗脱速率以提供更长的洗脱时间。

US2005/0037052(Medtronic Vascular，Inc.)公开了具有1μm～1000μm间厚度的涂层的药物洗脱支架。在一个结构中，将包含药物的涂层直接应用到装置表面或聚合物底涂层如聚对二甲苯(parylene)上。依赖于所需的溶解速率和溶解概况，药物在聚合物基质中是完全可溶的或在各处均匀分散。存在于聚合物基质中的药物浓度范围为0.1％重量比～80％重量比。在另一个结构中，将不含药物的聚合物屏障或帽涂层(cap coat)应用于含药物的涂层之上。含药物的涂层充当储药器。通常，存在于储药器内的药物浓度范围为从约0.1％重量比至多达100％重量比。屏障涂层以至少三种方式参与控制性药物释放速率。首先，如果屏障涂层具有不同于处于下层的含药涂层的溶解度常数，药物穿过屏障涂层的扩散性以屏障涂层溶解度因子的函数被调控。药物在屏障涂层中越易溶，它从装置表面洗脱就越快，反之亦然。该涂层结构一般称为储药器涂层(reservoir coating)。其次，屏障涂层可包含多孔网状结构，其中涂层充当分子筛。孔相对于药物尺寸而言越大，药物就洗脱越快。此外，分子内相互作用也将决定洗脱速率。最后，尽管涂层厚度通常是决定整体药物释放速率和概况中的一个小因素，它仍然是能用于调节涂层的一个额外因素。基本而言，如果所有其他物理和化学因素保持不变，给定药物扩散穿过给定涂层的速率与涂层厚度成反比。可以使用US2005/0037052中描述的具有帽涂层的控释涂层。例如，US2005/0037052公开了具有应用到其裸露金属表面的聚对二甲苯底涂层的金属支架。在底涂层上应用了释放药物的聚合物涂层或聚合物混合物。在含药涂层上应用聚合物帽涂层。帽涂层可可选地充当扩散屏障以进一步控制药物释放，或提供分离的药物。帽涂层可仅是应用到支架表面以保护支架和对洗脱速率没有影响的生物相容性聚合物。US2005/0037052还公开了用多种聚合物组合物涂覆支架的方法。

当在涂层中使用聚合物时，聚合物可以是耐用聚合物或生物可降解聚合物。聚合物可选自聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、PLLA-聚羟乙酸(PGA)共聚物(PLGA)、聚己酸内酯、聚链烷酸酯(polyalkanoate)聚合物或共聚物，如聚羟基丁酸/羟基缬氨酸共聚物、聚乙烯替砒咯烷酮、聚四氟乙烯、聚2-羟乙基异丁烯酸酯、聚醚氨酯尿素、硅酮、丙烯酸酯、环氧化物、多酯、氨基甲酸乙酯、聚对二甲苯(parlenes)、聚膦腈聚合物、氟聚合物、聚酰胺、聚烯烃或其混合物。

能用抗血栓物质层进一步涂覆支架，所述抗血栓物质包含一种或更多种选自多糖、肝素、明胶、胶原、藻酸盐、透明质酸(hyalunic acid)、海藻酸、角叉菜胶、软骨素、果胶、壳聚糖或其衍生物或共聚物的试剂，或所述抗血栓物质由一种或更多种选自多糖、肝素、明胶、胶原、藻酸盐、透明质酸(hyalunic acid)、海藻酸、角叉菜胶、软骨素、果胶、壳聚糖或其衍生物或共聚物的药剂组成。合适地，如US 2006/0083772中描述的，可以将这些试剂整合进入生物相容的顶涂层中。

可使用上述的涂覆方法和物质制备合适的药物洗脱支架。如US2005/0037052和US 2006/0083772中描述的，可进行体外测试来评估水介质中的药物释放概况。合适地，根据本发明第四方面的药物洗脱支架应在配置后至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或甚至100天或150天的期间内释放膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。合适地，不超过60％、70％、80％或90％在支架释放膜联蛋白A5或其功能类似物或变体期间的前三分之一期间释放。

膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的合适数量范围为每cm²的装置有效表面积约1微克～约10毫克(mg)生物活性剂，一般为约5μg和约10mg间，更一般为约1μg和约1mg间。在上文的Vogt等人中，支架具有87mm²的表面积并含有170μg的紫杉醇。

本发明的第五方面提供了制备向患者递送膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的支架的方法，其包含将膜联蛋白A5或其功能类似物或变体整合在支架体之中或之上。在Blindt等人(1999)Int J Artif Organs22：843-853、US2005/0037052和US 2006/0083772中描述了适于将药物整合在支架体之中或之上的方法。

在本发明第五方面的优选具体实施方案中，方法包含a)提供具有表面的支架体，和b)在所述表面的至少一部分上施用涂层，其中所述涂层包含膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。合适地，网眼表面或穿腔表面或该两个表面都被涂覆。涂覆支架体的方法和合适的涂层组合物在US2005/0037052和US 2006/0083772中有描述。可以使用本领域已知方法如浸渍、喷雾、超声沉淀或真空沉淀来应用在合适溶剂中的物质溶液的涂层。US2005/0037052描述了可利用相分离法获得涂层中的孔隙度梯度，如通过向聚合物溶液中加入非溶剂。非溶剂的量越高，相分离程度越高并且薄层中的孔隙度也越高。紧靠支架表面的涂层可用最高量的非溶剂配制以显示最高的孔隙度。然后，相继的药物-聚合物溶液涂层可用减少量的非溶剂配制，这将提供具有渐进降低孔隙度的涂层系统。

在本发明第五方面的另一个具体实施方案中，方法包括从包含聚合物和膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的组合物塑造支架。在Blindt等人(1999)Int J Artif Organs 22：843-853中公开了从聚合物和药物化合物的混合物塑造支架的方法。

在本发明第一方面至第五方面任一方面的相关方面提及的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体可选自：

a)人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；

b)人膜联蛋白A5的哺乳动物直系同源物；

c)a)或b)的等位基因变体或遗传变体；

d)膜联蛋白的功能类似物，其是与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％、60％、70％、75％以上，如80％、85％以上，90％以上，或甚至更优选95％或99％以上的同一性的蛋白质；

e)a)、b)、c)或d)任一项的二聚体或包含a)、b)、c)或d)任一项的融合蛋白；及

f)a)、b)、c)、d)或e)任一项的PEG化变体。

在特定的具体实施方案中，根据本发明的膜联蛋白A5的功能类似物或变体与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％、60％、70％、75％以上，如80％、85％以上，90％以上，或甚至更优选95％或99％以上的同一性。

按如下方法测定两条氨基酸序列间的百分比同一性。首先，使用BLAST 2 Sequence(Bl2seq)程序将氨基酸序列与例如SEQ ID NO：1比较，所述BLAST 2Sequence程序来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLAST独立版本。该BLASTZ独立版本可从美国政府的国立生物技术信息中心网点ncbi.nlm.nih.gov获得。可在随附BLASTZ的帮助文件中找到解释如何使用Bl2seq程序的指导。Bl2seq使用BLASTP算法进行两条氨基酸序列间的比较。为了比较两条氨基酸序列，将Bl2seq的选项设置如下：-i设置到包含待比较的第一氨基酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设置到包含待比较的第二氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何目标文件名(如C:\output.txt)；并且所有其他选项保持其默认设置。例如，可使用下述命令产生含有两条氨基酸序列间比较的输出文件：C:\Bl2seq -ic:\seq1.txt-j c:\seq2.txt -p blastp-o c:\output.txt。如果两条比较的序列分享了同源性，则指定的输出文件将以比对序列的形式呈现那些同源性区域。如果两条比较的序列没有分享同源性，则指定的输出文件将不呈现比对的序列。一旦得以比对，通过计数存在于两条序列中相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目确定匹配数。

通过将匹配数除以在经鉴定的序列中所示(set forth)的序列长度，然后将产生的值乘以100确定百分比同一性。例如，如果将序列与SEQ

ID NO：1中所示的序列进行比较(SEQ ID NO：1中所示的序列长度为320)并且匹配数是288，则该序列具有相对于SEQ ID NO：1中所示的序列的90的百分比同一性(即288÷320*1000＝90)。

因此，膜联蛋白A5的功能类似物或变体可以是一种蛋白质，在该蛋白质的一个或更多个位置具有保守的或不保守的氨基酸插入、缺失或取代，只要这样的改变产生了这样的蛋白质：其以等同于膜联蛋白A5的方式起作用的基本性质未被显著改变。“显著地”在该上下文中指，本领域技术人员将会说变体的性质可能还是不同的但与原始蛋白质的性质相比不是不明显的。

“保守的取代”指组合，如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。

可使用本领域熟知的蛋白质工程和定点诱变制备这样的变体。

根据本发明的膜联蛋白A5的功能类似物或变体可以是膜联蛋白A5的二聚体(如二聚膜联蛋白A5)或其功能类似物或变体，或可以是PEG化的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。在WO 02/067857中公开了二聚膜联蛋白A5和PEG化的膜联蛋白A5。

PEG化是本领域技术人员熟知的方法，其中多肽或模拟肽(peptidomimetic)化合物(对于本发明的目的而言，膜联蛋白A5或其功能类似物或变体)被修饰以便将一个或更多个聚乙二醇(PEG)分子共价连接到一个或更多个氨基酸或其衍生物的侧链上。它是最重要的分子改变结构化学技术(molecule altering structural chemistrytechniques，MASC)之一。可使用其他MASC技术；这样的技术可改善分子的药效学性质，如延长其体内半寿期。通过首先激活PEG部分以使它与本发明的蛋白质或模拟肽化合物反应并连结而形成PEG-蛋白质共轭物。PEG部分在分子量和构象上变化相当大，早期的PEG部分(单功能PEG；mPEG)分子量为12KD或以下且呈线性，稍后的部分具有增加的分子量。PEG2是PEG技术的近期革新，涉及将30kDa(或以下)的mPEG联结到赖氨酸氨基酸(尽管PEG化能被扩展到将PEG加到其他氨基酸上)，其能够被进一步反应以形成行为像具有大得多的分子量的线性mPEG一样的分枝结构(Kozlowski等人，(2001)，Biodrugs 15，419-429)。可用于共价结合PEG分子到多肽的方法在Roberts等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev，54，459-476、Bhadra等人，(2002)Pharmazie 57，5-29、Kozlowski等人，(2001) J Control Release 72，217-224和Veronese(2001)Biomaterials 22，405-417以及在此提及的参考文献中被进一步公开。

PEG化本发明的多肽或模拟肽化合物的优点包括降低肾清除率，对于某些产物，PEG化导致了给药后的更持久的吸附以及受限的分布，可能引起更恒定和持久的血浆浓度并因此增加了临床功效(Harris等人，(2001)Clin Pharmacokinet 40，539-551)。其他优点能包括降低治疗化合物的免疫原性(Reddy，(2001)Ann Pharmacother 34，915-923)和较低的毒性(Kozlowski等人，(2001)，Biodrugs 15，419-429)。

膜联蛋白A5的功能类似物或变体可以是包含膜联蛋白A5或其变体的序列的融合蛋白。因此，例如，膜联蛋白A5或其变体能融合到一个或更多个融合配偶体多肽序列以延长分子在患者循环系统内的半寿期和/或向分子加入其他功能性。

膜联蛋白A5的“功能”类似物或变体能结合到生物膜上的磷酯酰丝氨酸，优选在相同条件下达到人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)所显示出的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大约100％的水平。测量膜联蛋白A5结合到生物膜上的磷脂酰丝氨酸的合适方法是本领域已知的(Vermes，I.，等人，A novelassay for apoptosis.Flow cytometric detectionof phosphatidylserineexpression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.JImmunol Methods，1995.184(1)：p.39-51)。

当在相同(即等摩尔的)剂量下用于根据本发明第一方面预防或治疗再狭窄时，膜联蛋白A5的“功能”类似物或变体可额外地或另外可选地具有人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)治疗活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大约100％。在该上下文中，与人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)相比的膜联蛋白A5的“功能”类似物或变体的治疗活性可通过以下确定：通过比较等摩尔量的功能类似物或变体和人膜联蛋白A5治疗或提供预防如上所述的再狭窄的能力，和/或通过动物实验，如通过使用在下述实施例中展示的方法学。

一个合适的试验如下：1、在外科手术前将ApoE*3Leiden小鼠用轻度高胆固醇的膳食喂养3周；2、在外科手术前一天及操作的剩余时间里，通过腹膜内注射1mg/kg bw/天的膜联蛋白A5或等摩尔量的膜联蛋白A5功能类似物或变体或单独的载体治疗小鼠；3、将非压缩性的细孔聚乙烯管套在(cuff)股静脉上；4、在置入袖套(cuff)后三天处死小鼠并检查动脉损伤内的血管组成。5、比较用膜联蛋白A5治疗的小鼠和那些用膜联蛋白A5的功能类似物或变体治疗的小鼠以及未治疗小鼠中获得的结果。相关的参数是：与未治疗组相比，用膜联蛋白A5类似物或变体治疗以降低结合到内皮的可辨认为白细胞的细胞的百分比的能力；与未治疗组相比，用膜联蛋白A5类似物或变体治疗以降低中膜内的可辨认为白细胞的细胞百分比的能力。在任一种情况中，膜联蛋白A 5类似物或变体在降低任一种这些效应或这两种效应中具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大约100％的膜联蛋白A5的功效。

另一个合适的试验如下：1、在外科手术前将ApoE*3Leiden小鼠用高脂肪膳食喂养3周；2、在外科手术前一天或外科手术当天及操作的剩余时间里，通过腹膜内注射1mg/kg bw/天的膜联蛋白A5或等摩尔量的膜联蛋白A5功能类似物或变体或单独的载体治疗小鼠；3、将来源于同窝仔畜的下腔静脉移植入颈总动脉；4、在静脉移植后28天处死小鼠并检查静脉移植物的血管组成和尺寸。5、比较用膜联蛋白A5治疗的小鼠和那些用膜联蛋白A5的功能类似物或变体治疗的小鼠以及未治疗小鼠中获得的结果。相关的参数是：与未治疗组相比，用膜联蛋白A5类似物或变体治疗以降低静脉移植物壁内的白细胞数目的能力；与未治疗组相比，用膜联蛋白A5类似物或变体治疗以降低静脉移植物加厚即纵向横断面的新内膜面积的能力。在任一种情况中，膜联蛋白A 5类似物或变体在降低任一种这些效应或这两种效应中具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大约100％的膜联蛋白A5的功效。

实施例

包括了下述实施例以证实本发明的特定具体实施方案。本领域技术人员应理解，实施例中公开的技术遵循了发明人发现的代表性技术，其在实施本发明中作用良好，因此能被认为是组成了其实施的优选方式。然而，按照本公开，本领域技术人员理解，在没有背离本发明精神和范围的情况下，在公开的特定具体实施方案中可作出许多改变且仍能获得一样的或相似的结果。

实施例1：小鼠静脉移植模型

在CABG小鼠模型中是取自供体小鼠的静脉移植物。在受体小鼠中，将颈动脉从周围组织中分离出来，通过放置两个动脉夹阻断血流。然后，将血管在两个动脉夹间横断，且缝合静脉移植物从而在两个动脉末端拟合。当该操作结束时，移除夹子并恢复血流。该方法的详细描述已经出版(Zou等人，1998)。

4周后，在静脉移植物中形成了新内膜。在处死小鼠后用组织学方法测量了新内膜的尺寸。假如使用的小鼠是高脂血的(hyperlipidemic)，例如给予高脂肪膳食的apoE(-/-)小鼠或也给予高脂肪膳食的apoE*3-Leiden小鼠，新内膜发展将比正常小鼠更快。在这样小鼠中，病变可达到如此严重的状态以至于人们能看到内皮侵蚀(endothelialerosion)、癍块内出血(intraplaque haemorrhage)和传播的证据，即在患者中能发生的相似后果。

在小鼠静脉移植物中的新内膜的尺寸能被膜联蛋白A5的治疗显著减小。每日腹膜内注射1mg膜联蛋白A5/kg bw能至少降低20％的新内膜，这显示了治疗的功效。

实施例2：小鼠血管周袖套(cuff)模型

置于小鼠股动脉周的袖套(cuff)能导致新内膜的快速发展。已经将该模型用作PCI导致的新内膜形成的模型，且已经将其用于评估抗再狭窄药物的功效(Pires等人，2006)。新内膜病变含有平滑肌细胞，但也有循环的白细胞募集到病变处，特别是如果该操作在高脂血小鼠中进行。病变发展是迅速的，显著的病变在1周内已经可见。

小鼠静脉移植物中新内膜的尺寸可被膜联蛋白A5的治疗显著降低和/或连接到内皮和/或存在于中膜内的可鉴定为白细胞的细胞(如巨噬细胞)的总数目的百分比可被显著降低。每日腹膜内注射1mg膜联蛋白A5/kg bw能降低至少20％的新内膜，这显示了治疗的功效。

总结。目的在于恢复通向缺血组织的正常血流的外科干预的不想要的影响是已经用PCI扩张的血管的再狭窄，或在用于绕过狭窄的动脉区段的移植血管中的再狭窄。在再狭窄动物模型中，令人惊奇地发现膜联蛋白A5降低了再狭窄的发展。

实施例3：小鼠血管周袖套模型-实验结果

气囊血管成形术(有支架植入或无支架植入)是用于恢复通向例如患有心绞痛或心肌梗塞的患者缺血心肌的血流的常见方法。该操作引发了扩张的血管区段内的炎症，其可以导致再狭窄，即扩张的血管区段由于所谓的新内膜的发展变得再次狭窄。假如支架未置于扩张的血管区段内，该现象可导致多达30～50％的患者在3-12个月内需要重复血管形成操作。裸露金属支架能降低再狭窄率，但仍有多达15～30％在3-12个月内仍需要血管再形成。

在小鼠股动脉周围放置血管周塑料袖套是炎症驱动的新内膜形成的实验模型，即其是再狭窄模型。我们在该模型中测试了膜联蛋白A5是否能影响新内膜形成。

实验

在实验操作前将雄性ApoE*3Leiden小鼠饲以轻度高胆固醇膳食3周，其持续到实验周期结束。在外科手术前一天，根据血浆胆固醇、甘油三酯水平和体重将小鼠随机分到治疗组之一。在放置袖套前一天开始用1mg/kg bw/天的膜联蛋白A5(腹膜内注射)进行治疗并在实验期间内每天持续进行。在第0天进行手术，即，将非压缩性的袖套置于小鼠的每条股动脉周围。在放置袖套后3天处死小鼠。

袖套放置的外科手术操作

在外科手术前通过腹膜内给予咪达唑仑(5mg/kg，Roche，Woerden，荷兰)、美托咪定(0.5mg/kg，Orion，Espoo，芬兰)和芬太尼(0.05mg/kg，Janssen，Berchem，比利时)的组合物将小鼠进行麻醉。该麻醉药的混合物给出了至少1个小时的完全麻醉。在剃掉双腿的内侧毛和用乙醇(70％)消毒外科手术区域后，在腿内侧开一纵向1cm的切口。然后，将3mm长度的股动脉从骨神经和股静脉分离开来。使用仔细操作动脉的6/0丝质结扎线(0.7米B/BRAUN，Tuttlingen，德国)将股动脉扎成环状。将非压缩性细孔聚乙烯管(Portex，Kent，UK；0.40mm内径，0.80mm外径和大约2mm的长度)纵向开口并宽松的套在股动脉周围。用两个6/0丝质结扎线结将袖套合起来。用连续的缝线将皮肤闭合。在外科手术后，用阿替美唑(Atipamezol)和氟马西尼皮下拮抗麻醉。将动物置于加热板上的清洁笼子里至少4小时。

处死动物

为了进行组织分析，在放置袖套后3天处死动物。在麻醉(咪达唑仑/美托咪定/芬太尼)和取血样后，开胸并利用左心室内的心脏穿刺用溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)内的3.7％甲醛(wt/vol)进行弱压灌注(mild pressure-perfusion)(100mmHg)5分钟。在灌注后，收集带上袖套的股动脉，在溶于PBS的3.7％甲醛(wt/vol)中过夜固定并石蜡包埋。从完整长度的带上袖套的股动脉区段取连续的横断面(5-μm厚)以进行组织学分析。

取血样

将血从尾(外科手术前一天随机取)或从腔静脉(处死)收集在K₂EDTA毛细管(Microvette，Sarstedt，德国)中。将毛细管在4℃放置半小时，然后在冷却到4℃的离心机中以6000RPM(1200G)离心10分钟。随后等分血浆用于进一步的分析。在处死时，将血浆等分在1.5ml的聚丙烯管(Eppendorf)内，一份20μl的样品用于胆固醇和甘油三酯分析，剩余的血浆用于储备分析。样品储存于-80℃。

测定外科手术前一天和处死时取的血浆样品内的胆固醇和总甘油三酯水平。用试剂盒1489437(Roche Diagnostics，Almere，荷兰)酶法测定总血浆胆固醇，用试剂盒148872(Roche Diagnostics，Almere，荷兰)测定总甘油三酯浓度。

血管组成

用关于下述套上袖套的股动脉中的细胞数目的免疫细胞化学和组织形态测定术分析血管组成：白细胞(抗CD45抗体，稀释度1∶200，Pharmingen，San Diego，美国)、单核细胞和巨噬细胞(AIA 31240巨噬细胞，染色稀释度1∶3000，Accurate Chemical，Wesbury，美国)及表达肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α，染色稀释度1∶200，BioLegend，SanDiego，CA，美国)和单核细胞趋化蛋白1(单核细胞趋化蛋白1，染色稀释度1∶100，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，美国)的细胞。

结果

套上袖套的股动脉病变的血管组成

与载体组(34.2±3.0％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，粘到内皮的鉴定为白细胞的细胞总数目的百分比被显著降低了71.3％(p＝0.015)到9.69±8.9％。与载体组(19.55±4.6％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，在中膜内的鉴定为白细胞的细胞总数目的百分比被显著降低了69.0％-(p＝0.031)到6.1±2.6％(图1)。

单核细胞和巨噬细胞

与载体组(24.5±3.5％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，粘到内皮的鉴定为巨噬细胞的细胞总数目的百分比被显著降低了51.4％(p＝0.014)到11.9±2.3％。与载体组(14.2±5.5％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，在中膜内的鉴定为巨噬细胞的细胞总数目的百分比被显著降低了87.3％(p＝0.018)到1.8±0.9％(图2)。

与载体组(49.1±2.2％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，粘到内皮的鉴定为表达MCP-1的细胞如炎性细胞和SMC的细胞总数目的百分比被显著降低了31.0％(p＝0.003)到33.9±3.1％。与载体组(31.1±1.8％)相比，在重组人膜联蛋白A5治疗组中，在中膜内的鉴定为表达MCP-1的细胞的细胞总数目的百分比被显著降低了52.7％(p＝0.001)到14.7±2.8％(图3)。与对照组相比，治疗组中表达TNFα的细胞数也被显著降低。

结论

这些实验清楚地证实了膜联蛋白A5在该炎症驱动的血管疾病模型中的抗炎功效。炎症(以血管壁内白细胞的积累进行测定)被膜联蛋白A5的治疗显著抑制。此外，膜联蛋白A5也能显著降低被激活的炎症细胞的数目，因为很少的细胞对促炎症反应的细胞因子MCP-1染色呈阳性。结果强力地支持膜联蛋白A5是预防气囊血管成形术(有支架置入或无支架置入)后的再狭窄的有效治疗方法。

实施例4：小鼠静脉移植模型-实验结果

静脉移植术、狭窄血管区段的旁通术是恢复通向缺血器官的血流的方法。最常见的应用为置入所谓的冠状动脉旁路移植物(CABG)。现在，该操作对于恢复通向患者中缺血心肌的血流是常见的，其中狭窄的位置不适合于基于导管的介入术。当将静脉移植物置于动脉循环中时，其形态将接受(adopt)动脉循环中的较高血压和血流速率。尽管该操作是有效的，并已经挽救了许多患有冠状动脉心脏病的个体，但伴随有再狭窄的风险，再狭窄是其中移植的静脉发展了将堵塞血流的新内膜的过程。我们研究了膜联蛋白A5能否影响CABG小鼠模型中新内膜的形成。在持续了28天的该实验中，我们使用了人膜联蛋白A5和鼠膜联蛋白A5二者。这是因为人蛋白质可能在小鼠中引起可能掩盖最终治疗效果的非特异性免疫反应。

实验

雄性ApoE*3 Leiden小鼠饲以富胆固醇高脂肪膳食以诱导高胆固醇血症。该膳食含有0.05％胆酸盐(为了改善肠胆固醇摄取并抑制胆汁酸合成，二者均导致增加的血浆胆固醇水平)和1％的胆固醇(以及20％的酪蛋白、1％的氯化胆碱、0.2％的甲硫氨酸、15％的可可脂、40.5％的蔗糖、10％玉蜀黍淀粉、1％的玉米油、5.1％的纤维素和5.1％矿物质混合物)。它们在外科手术前接受该膳食3周并且该膳食在整个实验中贯穿始终。给予小鼠用HCl酸化到pH 2.8的饮用水。在整个实验过程中所有动物均无限制接受食物和水。

治疗

在该研究中，用三个不同的治疗组进行实验。组如下：

-对照组，仅接受载体(磷酸盐缓冲盐水(PBS))并经历静脉移植外科手术。

-治疗组I，经历静脉移植外科手术并以1mg/kg/天的浓度经由腹膜内注射接受重组人膜联蛋白A5，在外科手术当天开始。

-治疗组II，经历静脉移植外科手术并以1mg/kg/天的浓度经由腹膜内注射接受重组鼠膜联蛋白A5，在外科手术当天开始。

静脉移植术的外科手术操作

在外科手术前通过腹膜内给予咪达唑仑、美托咪定和芬太尼的组合物以将小鼠进行麻醉。该麻醉药的混合物给出了至少1个小时的完全麻醉。在剃掉颈部区域的毛和用醇(70％)消毒外科手术区域后，在颈部的前侧开一纵向1cm的切口。将右总颈动脉从朝向近端的远端二根分叉部从其周围组织分离开来。用8.0丝质结扎线(B/BRAUN，Tuttlingen，德国)将血管结扎两次并在中间节间切开。将袖套置于两个末端之上，然后这些被翻卷在袖套之上并用8.0丝质结扎线结扎。同窝仔畜用作下腔静脉供体。仔细收集的下腔静脉暂时保存在4℃的含有100U/ml肝素的0.9％的NaCl溶液中，以阻止凝固，并插入在动脉末端之间。用8.0丝质缝线将连接物捆在一起。脉搏确证了成功的植入。在外科手术后，用阿替美唑(2.5mg/kg，Roche，Woerden，荷兰)和氟马西尼(0.5mg/kg Orion，Espoo，芬兰)皮下拮抗麻醉。将动物置于加热板上的清洁笼子里至少4小时。

处死动物

如实施例3中所述进行处死，不同的是收集、固定、切片和染色静脉移植物而不是带上袖套的动脉。

取血样

如实施例3中所述进行取血样和胆固醇及总甘油三酯的分析。

静脉移植物变厚分析

通过使用6片静脉移植物的等间距垂直切割连续切片定量静脉移植物的加厚。

白细胞

利用免疫细胞化学和组织形态测定术分析血管组成。通过与抗CD45抗体(Pharmingen，San Diego，美国)的反应性鉴定白细胞并以每高倍视野的阳性细胞数进行定量。

结果

静脉移植物加厚

为了研究膜联蛋白A5在动脉移植物变厚中的作用，向不同的组(每组n＝10只小鼠)每日经由腹膜内注射给予重组人或鼠膜联蛋白A5(1mg/kg，溶于150μl载体)。仅有载体的组用作对照组(n＝10只小鼠)。通过测量管腔和外膜间的面积定量每一个组在外科手术后28天的平均静脉移植物变厚。与载体组(0.25±0.05mm²)相比，在重组人和鼠膜联蛋白A5治疗组中，静脉移植物变厚被显著地降低了48％到0.13±0.01mm²(p＝0.006)和降低了40％到0.15±0.01mm²(p＝0.018)(图4)。

与载体组(0.38±0.03mm²)比较，在重组人(0.44±0.03mm²，p＝0.126)和鼠(0.41±0.04mm2，p＝0.886)膜联蛋白A5治疗组内看到了更大的管腔面积。

白细胞

静脉壁中的白细胞数目在28天后进行计数，作为炎症的标记，与载体组(53.1±6.1细胞)相比较，在重组人膜联蛋白A5治疗组中显著降低了白细胞数目45.8％(28.8±2.3细胞，p＝0.003)和在重组鼠膜联蛋白A5治疗组中显著降低了白细胞数目41.8％(30.9±3.0细胞，p＝0.025)(图5)。

结论

静脉移植物中新内膜的快速发展是导致再狭窄的临床问题，即移植的静脉管腔变小且血流受限。该研究清楚显示了使用人或鼠膜联蛋白A5的膜联蛋白A5治疗有效降低了静脉移植物中的新内膜生长，并预防了管腔变窄。新内膜的快速发展是炎症驱动的过程，膜联蛋白A5的有益效果可能与治疗的抗炎效果有关(以移植物中白细胞积累的减少可见，及如实施例3中所示)。人和鼠膜联蛋白A5均产生了相似的结果，这表明人膜联蛋白A5没有引发小鼠中任何可能已经掩盖治疗效果的非特异性免疫反应。该结果强烈支持膜联蛋白A5是预防静脉移植物再狭窄的有效治疗。

此处所公开和要求保护的所有组合物和/或方法均可根据本公开在没有进行过度实验的情况下进行制备和执行。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选的具体实施方案进行了描述，对本领域技术人员显而易见的是，可以在没有背离本发明的概念、精神和范围的情况下改变组合物和/或方法及此处描述的方法的步骤或步骤的顺序。更具体地，明显地，在化学上和生理上都相关的某些试剂可以替换此处描述的试剂而仍能获得相同或相似的结果。所有这样的对本领域技术人员是显而易见的相似替换和修改均视为落入如随附的权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

通过引用具体地将下述参考文献并入此处，引用的程度为他们提供了范例性操作或其他对本文所示那些做出补充的细节：

PCT Appln.WO 02/067857

PCT Appln.WO 2005/099744

US 6,602,282(Assignee Avantec Vascular Corporation).

WO 99/17680(Localmed Inc).

U.S.Pat.No.5,922,020(Localmed Inc).

US 2006/0083772(DeWitt et al)

US2005/0037052(Medtronic Vascular，Inc.)

Bhadra et al.，(2002)Pharmazie 57，5-29

Blindt et al(1999)Int J Artif Organs 22：843-853

Bravata et al.，Ann.Intern.Med.，147(10)：703-716，2007.

Cederholm and Frostegard，Ann.NY Acad. Sci.，1108：96-103，2007.

Cederholm et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol，25(1)：198-203，2005.

Harris et al.，(2001)Clin Pharmacokinet 40，539-551

Hirata et al(2006)J Amer.Soc.Echocardiography 19：165-191

Holte et al(2007)Cardiovascular ultrasound 5：33

Jasti et al(2004)Circulation 110：2831-2836

Kozlowski et al.，(2001)J Control Release 72，217-224

Kozlowski et al.，(2001)，Biodrugs 15，419-429

Motwani and Topol，Circulation，97：(9)：916-931，1998.

Ong and Serruys(2005)Curr Issues Cardiol32：372-377

Pires et al.，Vascul.Pharmacol.，44(5)：257-264，2006.

Rand，J.Autoimmun.，15(2)：107-111，2000.

Reddy，(2001)Ann Pharmacother 34，915-923

Roberts et al.，(2002)Adv Drug Deliv Rev，54，459-476

Shen et al.，Am.J.Transplant.，7(11)：2463-2471，2007.

Smith Jr.，et al.，J.Am.Coll Cardiol.，47(1)：216-235，2006.

Teoh et al.，Gastroenterology，133(2)：632-646，2007.

Thiagarajan and Benedict，Circulation，96(7)：2339-2347，1997.

Vermes，I.，et al.，Anovel assay for apoptosis.Flow cytometricdetection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells usingfluorescein labelled Annexin V.J Immunol Methods，1995.184(1)：p.39-51

Veronese(2001)Biomaterials 22，405-417

Vogt et al(2004)European Heart Journal25：1330-40.

Zhang et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol，24(12)：2277-2283，2004.

Zou et al.，Am.J.Pathol.，153(4)：1301-1310，1998.

Claims (19)

1.一种预防或治疗再狭窄的方法，包含给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中再狭窄与旁路移植术有关。

3.根据权利要求1所述的方法，其中再狭窄与基于导管的介入术有关。

4.根据权利要求1到3任一项所述的方法，其中再狭窄与植入支架有关。

5.一种治疗患者中再狭窄的方法，包含进行用于治疗狭窄的介入术与给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体联合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中用于治疗狭窄的介入术是外科手术干预，如旁路移植术。

7.根据权利要求5所述的方法，其中用于治疗狭窄的介入术是基于导管的介入术，如有支架植入或无支架植入及进行或未进行动脉粥样硬化斑块切除术的气囊血管成形术。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中以胃肠外、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下的方式给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体或从药物洗脱支架局部给予治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中膜联蛋白A5或其功能类似物或变体与溶血栓治疗剂如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶或细菌酶联合给予。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中膜联蛋白A5或其功能类似物或变体选自：

a)人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；

b)人膜联蛋白A5的哺乳动物直系同源物；

c)a)或b)的等位基因变体或遗传变体；

d)膜联蛋白的功能类似物，其是与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％以上，75％以上，如80％以上，90％以上，或甚至更优选95％以上的同一性的蛋白质；

e)a)、b)、c)或d)任一项的二聚体或包含a)、b)、c)或d)任一项的融合蛋白；及

f)a)、b)、c)、d)或e)任一项的PEG化的变体。

11.一种包含用于预防或治疗再狭窄的治疗有效量的膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的药物组合物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，预期用于胃肠外、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下给药或从药物洗脱支架局部给药。

13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中膜联蛋白A5或其功能类似物或变体选自：

a)人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；

b)人膜联蛋白A5的哺乳动物直系同源物；

c)a)或b)的等位基因变体或遗传变体；

d)膜联蛋白的功能类似物，其是与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％以上，75％以上，如80％以上，90％以上，或甚至更优选95％以上的同一性的蛋白质；

e)a)、b)、c)或d)任一项的二聚体或包含a)、b)、c)或d)任一项的融合蛋白；及

f)a)、b)、c)、d)或e)任一项的PEG化的变体。

14.一种药物洗脱支架，其中药物是膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

15.根据权利要求14所述的药物洗脱支架，其中膜联蛋白A5或其功能类似物或变体选自：

a)人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；

b)人膜联蛋白A5的哺乳动物直系同源物；

c)a)或b)的等位基因变体或遗传变体；

d)膜联蛋白的功能类似物，其是与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％以上，75％以上，如80％以上，90％以上，或甚至更优选95％以上的同一性的蛋白质；

e)a)、b)、c)或d)任一项的二聚体或包含a)、b)、c)或d)任一项的融合蛋白；及

f)a)、b)、c)、d)或e)任一项的PEG化的变体。

16.一种制备用于递送膜联蛋白A5或其功能类似物或变体到患者的支架的方法，该方法包含将膜联蛋白A5或其功能类似物或变体整合在支架体内或支架体之上。

17.根据权利要求16所述的方法，该方法包含：

a)提供具有表面的支架体；及

b)在所述表面的至少一个部分上应用涂层，其中所述涂层包含膜联蛋白A5或其功能类似物或变体。

18.根据权利要求16所述的方法，该方法包括从包含聚合物及膜联蛋白A5或其功能类似物或变体的组合物塑造支架。

19.根据权利要求16、17或18任一项所述的方法，其中膜联蛋白A5或其功能类似物或变体选自：

a)人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；

b)人膜联蛋白A5的哺乳动物直系同源物；

c)a)或b)的等位基因变体或遗传变体；

d)膜联蛋白的功能类似物，其是与人膜联蛋白A5，SEQ ID NO：1具有50％以上，75％以上，如80％以上，90％以上，或甚至更优选95％以上的同一性的蛋白质；

e)a)、b)、c)或d)任一项的二聚体或包含a)、b)、c)或d)任一项的融合蛋白；及

f)a)、b)、c)、d)或e)任一项的PEG化的变体。

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