BRPI0813309B1

BRPI0813309B1 - Capsídeo, mistura de capsídeos e proteína quimérica

Info

Publication number: BRPI0813309B1
Application number: BRPI0813309-3A
Authority: BR
Inventors: Tadahito Kanda; Kazunari Kondo
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2020-10-06
Also published as: US9023364B2; ES2688474T3; BRPI0813309A2; CA2691745A1; EP2168977A4; JP5540329B2; RU2009148037A; KR20100029216A; MX2009014246A; US20100183648A1; NZ582271A; CA2691745C; JPWO2009001867A1; EP2168977B1; BRPI0813309B8; KR20150090285A; AU2008268014A1; CN101835796A; RU2471807C2; AU2008268014B2

Abstract

capsídeo, mistura de capsídeos, proteína quimérica, métodos para produzir o capsídeo, e para produzir a mistura de capsídeos, e, complexo de hemocianina de lapa e epítopo l2 de papilomavírus humano 16. descreve-se um antígeno de vacina capaz de induzir uma reação cruzada e anticorpo neutralizante dirigidos contra um papilomavírus humano de tipo de .alto risco. descreve-se especificamente: uma proteína quimérica compreendendo um l2-epítopo de papilomavírus humano (hpv) 10 tipo-16 inserido em uma região de laço de uma. proteína tipo l1 de. papilomavíms humano 16; e um capsídeo que é um agregado da proteína quimérica. a região de laço em- que o epítopo l2 deve ser inserido está localizada entre um resíduo de aminoácido em posição 430 e um resíduo de aminoácido em posição-433. o epítopo l2 tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das seguinte fórmulas: lyktckqagtcppdiipkveg (epítopo l2 18-32); gglgigtgsgtggrtgyipl (epítopo l2 56-75); e dpvgpldpsjvslveessfi (epítopo l2 96-115).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente JP No. 2007-167154 depositado em 26 de junho, 2007, e cuja descrição é incorporada aqui por referência.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente invenção refere-se a um antígeno de vacina induzindo reação cruzada de anticorpos neutralizantes a papilomavírus humano de grupo de alto risco. Em particular, a presente invenção refere-se a uma proteína quimérica composta de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um particular epítopo L2 de papilomavírus humano 16 inserido em um sítio particular do mesmo e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteína quimérica. O capsídeo de acordo com a presente invenção é utilizável como um antígeno para uso em uma vacina para prevenção de infecção por papilomavírus humanos que podem levar a câncer cervical.

FUNDAMENTO DA ARTE

[0003] Papilomavírus humano (HPV) (Figura 1) é a vírus de DNA pequeno, e existem 100 ou mais genótipos. Quinze genótipos (genótipos de alto risco, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, e 73) causam câncer cervical. HPV 16 é detectado em 50 a 60% de câncer cervical. HPV 18 é o próximo encontrado com frequência na Europa e nos Estados Unidos, enquanto HPV 52 e HPV 58 são os próximos encontrados no Japão. Apesar de um exame em massa ter sido realizado para diagnose antecipada no Japão, ainda se encontra um início do mesmo em 15.000 pacientes e a morte de 2.500 pacientes a cada ano.

[0004] O capsídeo de HPV tem um esqueleto icosaédrico regular consistindo de pentâmeros de proteína L1 (capsômeros72) e moléculas de proteína L2 12 ligadas ao mesmo. Ambos os terminais da proteína L2 estão localizados no capsídeo, mas parte da região N-terminal está localizada na superfície do capsídeo (região de superfície L2) (Figura 2). A expressão da proteína L1 em uma grande quantidade por técnica de DNA recombinante fornece partículas de tipo vírus (VLPs). Inoculação do VLP ou da proteína L2 de papilomavírus bovino ou de coelho doméstico toma os animais inoculados resistentes a um desafio virai. Figura 2 é uma vista em seção transversal esquemática ilustrando o HPV e o VLP.

[0005] Não existe atualmente uma linhagem de células cultivadas permitindo a proliferação do HPV. Os pseudovirus são preparados para monitorar a infecção por HPV. A introdução de um plasmídeo expressando fosfatase alcalina secretária (SEAP) tendo a origem de replicação de SV40 e um plasmídeo expressando a proteína L1 e um plasmídeo expressando a proteína L2 em célula 293 humana expressando antígeno SV40T leva à incorporação do plasmídeo expressando SEAP replicado no capsídeo L1/L2, dando um pseudovirus infeccioso (Figura 3). A atividade dos anticorpos de neutralização é determinada por medida da atividade de inibição de infecção pseudoviral (documento não de patente 1.

[0006] Cada um dos antisoros obtido por inoculação do VLP de HPV em animais tem uma atividade de neutralização específica do tipo. Merck desenvolveu uma vacina em combinação dos VLPs de HPV 16 e HPV 18 e os VLPs de HPV 6 e HPV 11, que são causas possíveis de condyloma acuminatum (benigno), enquanto GlaxoSmithKline desenvolveu uma vacina em combinação dos VLPs de HPV 16 e HPV 18 (documento não de patente 2 e 3).

[0007] Estas vacinas são mostradas em testes clínicos em larga escala como tendo uma ação de prevenção de infecção específica de tipo, e a vacina de Merck foi aprovada em 2006 por FDA e Commission of the European Communities e vendida nos Estados Unidos e países da Comunidade Européia.

[0008] Como descrito acima, a imunização do capsídeo L1 de HPV em animais leva à indução de uma resposta imune extremamente específica de tipo. Resultados preliminares em teste clínico por uso de vacina de capsídeo L1 de HPV 16 mostraram que a vacina foi efetiva na prevenção da infecção por HPV 16, mas quase não foi efetiva na prevenção de outros genótipos de HPV. Assim, para a prevenção de início de câncer cervical com vacinas, é necessário um desenvolvimento de um antígeno de vacina que seja efetivo a pelo menos todos os HPVs de alto risco.

[0009] Os inventores desenvolveram antes um antígeno de vacina, usando um epítopo de neutralização comum pra HPVs de alto risco que está presente na região de aminoácido 108-120 de proteína L2 de HPV 16. No entanto, o epitopo tem uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de cerca de 60 a 75% com proteínas L2 de alto risco, e o anticorpo assim induzido ligado a múltiplos HPVs de alto risco, mas com uma menor eficiência de ligação do que o HPV 16. Assim, existe uma demanda para um antígeno tendo uma maior comunalidade para o tipo.

[0010] Os inventores verificaram que era possível preparar um antígeno de vacina capaz de induzir um anticorpo neutralizante comum para tipo mais potente por produção de uma proteína quimérica tendo a proteína L1 de HPV 16 e a região de aminoácido 64-81 de proteína L2 de HPV 16 inserida no mesmo e que o antígeno de vacina era um antígeno tendo uma maior comunalidade para tipo que era compatível com pelo menos com todos os HPVs de alto risco, e depositaram um pedido de patente (W02007/018049, documento de patente 1) anteriormente. Além de como descrito acima, tendo em vista o fato de que as partículas formadas da proteína quimérica composta da proteína L1 de HPV 16 e uma região de aminoácido 108-120 inserida de proteína L2 de HPV 16 inserida na proteína L2 de HPV 16, têm uma forte imunogenicidade e o potencial para induzir anticorpo neutralizante, que é comum para os HPVs de alto risco, a proteína quimérica consistindo da proteína quimérica tendo a região de aminoácido 64-81 adicional inserida por uma região de aminoácido 109-117 da proteína L2 de HPV 16 foi provida no documento de patente 1.

[0011] Documento não de patente 1: Pastrana, D.V., Buck, C.B., Pang, Y.Y., Thompson, C.D., Castle, P.E., FitzGerald, D.C., Kruger, Kjaer, S., Lowy, D.R., Schiller, J.T., 2004. Reactivity of human sera in a sensitive, high throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralizing assay for HPV 16 e HPV 18. Virology. 321: 205-216.

[0012] Documento não de patente 2: Villa, L.L., et al.: Prophylactic quadrivalent papilomavirus human (types 6, 11, 16, e 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomised double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncology 6, 271-278, 2005

[0013] Documento não de patente 3: Harper, D.M., et al.: Sustained efficacy up a 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against papillomavirus human type 16 e 18: follow up from a randomized control trial. Lancet 367 (9518), 1247-1255.

[0014] Documento de patente 1: W02007/018049

[0015] Todas as descrições dos Documentos não de patente 1 a 3 e do Documento de patente 1 acima são incorporadas aqui por referência.

[0016] As vacinas contra HPV atualmente comercialmente disponíveis são efetivas somente para HPV 16 e HPV 18 dentre os 15 HPVS de alto risco. Cada VLP induz um anticorpo neutralizante específico de tipo e, assim, um coquetel de 15 tipos de VLPs são necessários para a indução de anticorpos para todos os HPVs de alto risco, tornando difícil preparar um antígeno de vacina prático. Assim, existe uma demanda para o desenvolvimento de um antígeno de vacina que induza um anticorpo neutralizante reativo cruzado.

[0017] O antígeno descrito no documento de patente 1 é um antígeno compatível com pelo menos com todos os HPVs de alto risco que apresentam uma maior comunalidade para tipo. No entanto, existe o seguinte problema. Os pseudovírus infecciosos usados no estudo do documento de patente 1 foram somente os HPV 16 e HPV 18, e o antígeno descrito no documento de patente 1 mostrou uma atividade neutralizante favorável para estes pseudovírus infecciosos. No entanto, na experiência de neutralização subsequente por uso de pseudovírus infecciosos de HPV 31, HPV 52 e HPV 58 recentemente desenvolvidos pelos inventores, o antígeno descrito no documento de patente 1 foi menor do que a atividade de neutralização para HPV 31, HPV 52, e HPV 58.

[0018] Assim, é um objeto da presente invenção prover um antígeno de vacina capaz de induzir um anticorpo neutralizante reativo cruzado para o papilomavírus humano do grupo de risco elevado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] Um primeiro aspecto da presente invenção é um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas composto de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um epítopo L2 de HPV 16 inserido na região de laço da proteína L1 de HPV 16, em que:

[0020] a região para inserção do epítopo L2 é uma região de aminoácidos 430 a 433 e

[0021] o epítopo L2 tem uma sequência de aminoácidos representada por:

[0022] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (a seguir, referido como epítopo L2 18-38),

[0023] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou

[0024] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (a seguir, referido como epítopo L2 96-115).

[0025] O capsídeo de acordo com a presente invenção inclui as seguintes formas de realização típicas. 1) No capsídeo acima, o epítopo L2 compreende aminoácidos tendo dita sequência de aminoácidos das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados, em que os aminoácidos provêem o capsídeo com capacidade de induzir um anticorpo neutralizante cruzado similar à do HPV tendo o epítopo L2 original. 2) O agregado é um agregado formado por conjunto de capsômeros de pentâmero múltiplo, cada um dos quais composto de cinco moléculas de proteínas quiméricas. 3) O agregado formado por conjunto de capsômeros de pentâmero múltiplo tem uma estrutura de partícula. 4) O número dos capsômeros de pentâmero constituindo o agregado está na faixa de 65 a 80. 5) O número dos capsômeros de pentâmero constituindo o agregado é 72. 6) O capsídeo é usado para a produção de uma vacina de capsídeo L1.

[0026] Um segundo aspecto da presente invenção é uma mistura de capsídeos, compreendendo dois ou mais tipos de capsídeos de acordo com a presente invenção .

[0027] As misturas de capsídeo de acordo com a presente invenção incluem as seguintes formas de realização típicas, 1) A mistura de capsídeos compreende um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. 2) A mistura de capsídeos compreende um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. 3) A mistura de capsídeos compreende um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. 4) A mistura de capsídeos compreende um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2, um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2, e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. 5) A mistura de capsídeos é usada para a produção de uma vacina de capsídeo L1. 6) A mistura de capsídeos é usada para a produção de uma vacina de capsídeo L1 que pode induzir a expressão do anticorpos neutralizantes pelo menos a papilomavírus humanos 16, 18, 31,52, e 58.

[0028] Um terceiro aspecto da presente invenção é

[0029] A proteína quimérica composta de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um epítopo L2 de HPV 16 inserido na região de laço da proteína de HPV 16, em que

[0030] a região para inserção do epítopo L2 é uma região de aminoácidos 430 a 433, e

[0031] o epítopo L2 tem uma sequência de aminoácidos representada por:

[0032] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (a seguir, referido como epítopo L2 18-38),

[0033] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou

[0034] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (a seguir, referido como epítopo L2 96-115).

[0035] Em uma forma de realização típica da proteína quimérica de acordo com a presente invenção, o epítopo L2 são aminoácidos tendo dita sequência de aminoácidos acima das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados, em que os aminoácidos provêem o capsídeo constituído pela proteína quimérica com capacidade de induzir anticorpo neutralizante cruzada similar à do HPV tendo o epítopo L2 .

[0036] Um quarto aspecto da presente invenção é um método de produzir o capsídeo de acordo com a presente invenção, em que o capsídeo é formado por conjunto das proteínas quiméricas acima.

[0037] Um quinto aspecto da presente invenção é o método de produzir uma mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção, compreendendo preparar dois ou mais tipos de capsídeos pelo método de acordo com o método de produzir o capsídeo da presente invenção e misturar os capsídeos resultantes.

[0038] Um sexto aspecto da presente invenção é um complexo de hemocianina de lapa e um epítopo L2 de papilomavírus humano 16, o epítopo L2 tendo uma sequência de aminoácidos representada por:

[0039] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (a seguir, referido como epítopo L2 18-38),

[0040] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou

[0041] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (a seguir, referido como epítopo L2 96-115).

[0042] Em uma forma de realização típica do complexo de acordo com a presente invenção , a hemocianina de lapa e o epítopo L2 são ligados a cada outro via cisteína.

[0043] A presente invenção provê um antígeno de vacina de capsídeo L1 em que uma estrutura de partícula tem uma atividade imunoindutora forte, e o antígeno de vacina de capsídeo L1 é capaz de uma forte apresentação de antígeno do epítopo L2 de HPV, e que é também capaz de induzir um anticorpo neutralizante, em particular, induzir um anticorpo neutralizante para HPV 16, 18, 31, 52, e 58. Considerando a homologia das sequências de aminoácidos L2 nos 15 tipos de papilomavírus humanos de alto risco descrito acima, o antígeno de vacina de capsídeo L1 capaz de induzir um anticorpo neutralizante para HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 52 e HPV 58 de acordo com a presente invenção é bem provavelmente um antígeno que pode cobrir quase todos os 15 tipos dos HPVs de alto risco.

[0044] As vacinas VLP já foram comercializadas e mostram ter uma ação de prevenção de infecção específica para tipo. Os VLP quiméricos desenvolvidos pelos inventores, que é um antígeno consistindo do atual antígeno de vacina e um epítopo L2 de neutralização cruzada adicional, retém o epítopo neutralizante da vacina corrente e, assim, induz um anticorpo neutralizante específico para HPV 16 e também um anticorpo neutralizante reativo cruzada para HPV 18, HPV 31, HPV 52, e HPV 58. O VLP é composto de moléculas de proteína L1 360 e, assim, o VLP quimérico tem epítopos L2 de neutralização cruzada 360. Este é um novo antígeno de vacina em uma estrutura de partícula tendo uma forte atividade imunoindutora e apresentando o epítopo L2 de neutralização cruzado fortemente.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO (Capsídeo L1)

[0045] O capsídeo L1de acordo com a presente invenção é um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas composta de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um epítopo L2 de papilomavírus humano 16 que é inserido na região de laço da proteína L1 16.

[0046] Como descrito acima, a partícula de HPV é um capsídeo icosaédrico regular consistindo de 72 capsômeros, cada um contendo cinco molécula de proteína L1. A expressão de alto nível da proteína L1 em célula resulta no acúmulo de proteínas L1 no núcleo, formando autonomamente capsídeos. O capsídeo formado apenas com as proteínas L1 é chamado capsídeo L1 ou partícula de tipo vírus (VLP). A expressão simultânea de proteínas L1 e L2 dá um capsídeo L1/L2 (ou VLP L1/L2) contendo moléculas de proteína L2 12 no capsídeo L1. No entanto, o capsídeo L1 e o capsídeo L1/L2 capsídeo não são diferenciados um do outro por microscopia eletrônica.

[0047] O capsídeo L1 de acordo com a presente invenção é um capsídeo com base no capsídeo L1 de HPV 16. Porque existem muitos genótipos de HPV, cada capsídeo é em princípio indicado com um genotipo como HPV 16 ou HPV 58. Assim, por exemplo,o capsídeo L1 de HPV 16 é designado como capsídeo L1 de HPV 16.

[0048] O capsídeo L1 de acordo com a presente invenção é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas, cada tendo epítopos L2 de HPV 16 inseridos na proteína L1 de HPV 16. Abaixo, a proteína quimérica significa uma "proteína quimérica tendo um epítopo L2 de HPV 16 inserido em uma região de laço de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV)," e a presente invenção inclui estas proteínas quiméricas.

[0049] O epítopo L2 de HPV 16 inserido na proteína L1 para a produção da proteína quimérica de acordo com a presente invenção tem uma sequência de aminoácidos representada por:

[0050] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (epítopo L2 18-38),

[0051] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (epítopo L2 56-75) ou

[0052] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (epítopo L2 96-115).

[0053] O epítopo L2 18-38 tem 21 aminoácidos na região de aminoácidos 18-38 da proteína L2 de HPV 16. O epítopo L2 56-75 tem 20 aminoácidos na região de aminoácidos 56-75 da proteína L2 de HPV 16. O epítopo L2 96-115 tem 20 aminoácidos na região de aminoácidos 96-115 da proteína L2 de HPV 16 (em que, os 101o. e 112o. aminoácidos são substituídos respectivamente com leucina e serina).

[0054] Na presente invenção, os resíduos de aminoácido em proteína são numerados a partir do amino terminal e, por exemplo, o 50o. aminoácido é designado como aminoácido 50.

[0055] A região de superfície L2 liga a proteínas celulares múltiplas. A introdução de mutação de substituição de aminoácidos resultou em perda de infectividade, indicando que a região de superfície L2 tem uma função essencial para a infecção por HPV (Figura 4). A sequência de aminoácidos dessa região é conservada muito bem em todas as proteínas L2 de HPV de alto risco (Figura 5). Os inventores estudaram antisoro obtido por imunização de coelhos com peptídeos sintéticos tendo a sequência de aminoácidos na região de superfície 16 L2 do HPV. Os resultados serão descritos abaixo no Exemplo (Tabela 1). Os resultados na Tabela 1 mostraram que são epítopos neutralizantes cruzados nas regiões de aminoácidos 18-38, 49-75, e 96-115.

[0056] Especificamente, os resultados mostrados na Tabela 1 indicam que estes são epítopos neutralizardes cruzados para HPV 16, HPV 18, HPV 31, e HPV 58 nas regiões de aminoácido de 18-38, 56-75, e 96-115. No entanto, a reatividade cruzada para HPV 52 não foi estudada neste estágio.

[0057] Aqui, na região 96-115, o 101 o. S foi substituído com L, e o 112o. T com S. Isto é porque o epítopo mutante tendo L substituindo 101o. S e S substituindo 112°. T é superior na indução de anticorpo reativo cruzada para os epítopos tendo seqüência de aminoácidos de ocorrência natural.

[0058] Os resultados na Tabela 1 mostram que estes são epítopos neutralizantes cruzados para HPV 16, HPV 18, HPV 31 e HPV 58 também na região 49-68. No entanto, porque a proteína quimérica com uma região 49-75 incluindo a região 49-68 não forma uma estrutura de partícula e a homologia de L2 aminoácidos na região 49- 55 não foi elevada em 15 tipos de HPVs como mostrado em figura 5, a região 49-68 não foi estudada na presente invenção.

[0059] Assim, proteínas quiméricas e VLPs quiméricos foram preparados por inserção de epítopo neutralizante cruzado na região de aminoácidos 430 a 433 de proteína L1 e VLPs quiméricos foram produzidos com as proteínas quiméricas.

[0060] Assim, a presente invenção refere-se a uma proteína quimérica composta de uma proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV), e um epítopo L2 HPV 16 inserido na região de na região de laço da proteína L1 16 HPV, em que a região de laço para inserção de epítopo L2 é uma região de aminoácidos de 430 a 433, e

[0061] O epítopo L2 tem uma sequência de aminoácidos representada por:

[0062] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (a seguir, referido como epítopo L2 18-38),

[0063] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou

[0064] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (a seguir, referido como epítopo L2 96-115).

[0065] A presente invenção também refere-se a um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteína quimérica. O agregado é composto de capsômeros de pentâmero múltiplo, cada um dos quais composto de cinco moléculas de proteínas quiméricas, e o agregado composto das capsômeros de pentâmero múltiplo preferivelmente tem uma estrutura de partícula para a expressão de maior antigenicidade. 0 número dos capsômeros de pentâmero constituindo da partícula está, por exemplo, na faixa de 65 a 80, preferivelmente 72 que é idêntico ao número do mesmo nos vírus de ocorrência natural.

[0066] O VLP de ocorrência natural geralmente contém 360 moléculas de proteína L1 e, em tal caso, tem 360 epítopos neutralizantes cruzados na partícula (Figura 6). A proteína quimérica tendo uma sequência de aminoácidos 18 a 38, 56 a 75, ou 96 a 115 (101a. e 112o. aminoácidos substituídos respectivamente com leucina e serina) de proteína L2 de HPV 16 inserido nas regiões de aminoácidos 430 a 433 de proteína L1 de HPV 16 foi expressada em células sf9 de insetos por uso de um baculovírus recombinante, para dar um VLP quimérico, que é designado como Ch18/38, Ch56/75, ou Ch96/115 (101L, 112S), respectivamente (Figura 7). A micrografia eletrônica na Figura 7 mostra a estrutura de partícula de respectivos VLPs quiméricos. ELISA por uso destes VLPs quiméricos como antígeno mostrou uma ligação específica aos anticorpos para os epítopos inseridos para os VLPs quiméricos (como descrito abaixo na Tabela 2 do Exemplo), indicando que os epítopos foram expostos sobre a superfície de VLP.

[0067] Antisoros foram preparados por imunização de coelhos com estes VLPs quiméricos. Em ELISA por uso de um peptídeo sintético tendo a sequência idêntica ao epítopo neutralizante cruzado como um antígeno, cada antisoro reagiu especificamente com o epítopo inserido. O peptídeo 96/115 (101L, 112S) agregou facilmente, resultando em uma diminuição na quantidade ligada à placa de ELISA, e assim o título obtido foi levemente menor (como mostrado abaixo na Tabela 3 de Exemplo).

[0068] Análise da atividade neutralizante contra pseudovírus de HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 52, e HPV 58 mostrou que: o anticorpo para Ch18/38 neutralizou os HPV 16, HPV 18 e HPV 31; o anticorpo para Ch56/75, todos os tipos de HPV; e o anticorpo para Ch96/115 (101L, 112S), HPV 16, HPV 18, HPV 31 e HPV 58 (não foi observada neutralização de HPV 58 com antisoro tendo um título baixo) (como mostrado abaixo nas Tabelas 4 e 5 de Exemplo).

[0069] Todos os antisoros foram verificados como reagindo intensamente com HPV 16, o esqueleto para VLP quimérico, indicando que o epítopo neutralizante inerente ao VLP foi conservado nos VLPs quiméricos. Porque o pseudovírus infeccioso consiste de 360 moléculas de proteína L1 e 12 moléculas de proteína L2, a proteína L2 produzida excessivamente na amostra está presente como liberada em célula. Por esta razão, o título de neutralização de anticorpo anti-L2 foi obtido de um modo muito pequeno.

[0070] As experiências de papilomavírus em animais mostraram que as vacinas de VLP e vacinas de proteína L2 são quase similares em eficácia, indicando que os VLPs quiméricos acordo com a presente invenção podem ser antígenos de vacina práticos induzindo a geração de anticorpos para os epítopos neutralizantes cruzados.

[0071] O epítopo L2 pode inclui os aminoácidos tendo a sequência de aminoácidos acima, isto é, a representada por uma das SEQ ID Nos. 2 a 4, das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados, em que os aminoácidos provêem o capsídeo de acordo com a presente invenção com capacidade de indução de anticorpo neutralizante cruzada similar à do VLP tendo o epítopo L2 original (tendo a sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID Nos. 2 a 4).

[0072] Assim, o epítopo L2 18-38 pode incluir os epítopos L2 mutantes dos aminoácidos tendo a sequência de aminoácidos representada por LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID No. 2) das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados de modo a prover o capsídeo de acordo com a presente invenção com capacidade de indução de anticorpo neutralizante cruzada similar à do HPV 16 VLP tendo o epítopo L2 18-38. As capacidades de indução de um anticorpo neutralizante cruzada dos VLPs de HPV 16 tendo o epítopo L2 18-38 são mostradas em Tabela 4.

[0073] O epítopo L2 56-75 pode incluir os epítopos L2 mutantes dos aminoácidos tendo a sequência de aminoácidos representada por GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID No. 3) das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados de modo a prover o capsídeo de acordo com a presente invenção com capacidade de indução de um anticorpo neutralizante cruzado similar à do 16 VLP de HPV tendo o epítopo L2 56-75. As capacidades de indução cruzadas de um anticorpo neutralizante cruzada do VLPs de HPV 16 tendo o epítopo L2 56-75 são mostradas em Tabela 4.

[0074] Similarmente, o epítopo L2 96-115 pode incluir os epítopos L2 mutantes dos aminoácidos tendo a sequência de aminoácidos representada por DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (SEQ ID No. 4) das quais um ou mais aminoácidos são deletados ou substituídos ou aos quais um ou mais aminoácidos são adicionados de modo a prover o capsídeo de acordo com a presente invenção com capacidade de indução de um anticorpo neutralizante cruzada similar à do VLP de HPV 16 tendo o epítopo L2 96-115. As capacidades de indução de um anticorpo neutralizante cruzado dos VLPs de HPV 16 tendo o epítopo L2 96-115 são mostradas em Tabela 4. Na presente descrito, o número dos outros aminoácidos em deleção, substituição ou adição é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0075] O sítio na proteína L1 da proteína quimérica de acordo com a presente invenção onde o epítopo L2 é inserido está na região de aminoácidos 430 a 433 de uma região de laço de proteína L1. Especificamente, um epítopo L2 de 20 a 21 aminoácidos é inserido, substituindo os quatro aminoácidos 430 a 433 na proteína L1. A sequência de aminoácidos da proteína L1 de HPV 16 é mostrada como SEQ ID No. 1. A região 426-446 incluindo aminoácidos 430 a 433 é estimada como sendo uma região reconhecível como o antígeno que está localizado fora da proteína L1, dos pontos de vista de análise estrutural da proteína L1 de HPV 16, distribuição de epítopos de anticorpo neutralizante, e a posição do resíduo cisteína essencial para a formação do capsídeo etc.

[0076] O número dos epítopos L2 inseridos na proteína L1 é um para uma proteína única L1. No entanto, pelo menos dois tipos diferentes de epítopos L2 podem ser inseridos em diferentes regiões de laço em uma proteína L1 única. Por exemplo, um peptídeo exceto para os três epítopos neutralizantes cruzados pode ser inserido em um sítio exceto pelos aminoácidos 430 a 433 de proteína L1. Alternativamente um dos três epítopos neutralizantes cruzados podem ser inseridos em um sítio exceto pelos aminoácidos 430 a 433 de proteína L1.

(Preparação dos peptídeo contendo epítopo L2)

[0077] O peptídeo L2 (aminoácidos 18-38, 56-75 ou 96-115) pode ser preparado por um método em fase sólida Fmoc comum em um método em fase sólida em um sintetizador de peptídeo automático de 96 colunas. O peptídeo, que é visado na preparação de um anticorpo, é conectado a KLH (hemocianina de lapa), e um resíduo de cisteína é adicionado ao N terminal para evitar mascarar a região de peptídeo por KLH.

[0078] A presente invenção inclui o complexo de hemocianina de lapa e um epítopo L2 HPV 16. O epítopo L2 tem uma sequência de aminoácidos representada por:

[0079] LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (epítopo L2 18-38),

[0080] GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (epítopo L2 56-75) ou

[0081] DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (epítopo L2 96-115).

[0082] A hemocianina de lapa e o epítopo L2 são ligados a cada outro preferivelmente via cisteína.

[0083] (Preparação de proteínas L1 inseridas em epítopo L2 (proteínas quiméricas))

[0084] Um gene L1 quimérico foi preparado , e o gene L1 quimérico preparado foi expressado por uso de um vetor de baculovírus, para dar a proteína L1 quimérica e um capsídeo quimérico. O gene L1 quimérico é preparado por PCR. Especificamente, ele é preparado do seguinte modo. (A) Um par de iniciador tendo uma região desejavelmente inserida é preparado . (B) Conjunto de iniciador composto de iniciador tendo uma região de inserção e o iniciador 1 e o conjunto composto de outro iniciador tendo uma região de inserção e iniciador 2 são usados para amplificação por PCR em combinação . (C) Dois fragmentos de DNAs amplificados tendo um fragmento inserido em um lado são preparados. As regiões complementares respectivos são anelados para reação de extensão. (D) Um gene quimérico contendo o DNA inserido é preparado. (E) PCR é realizado por uso do DNA inserido como gabarito e os iniciadores 1 e2. (F) Assim, o DNA contendo o gene inserido é amplificado.

[0085] A presente invenção inclui um método de produzir um capsídeo incluindo a sua formação por um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas de acordo com a presente invenção. Como descrito acima, um gene L1 quimérico é preparado e expressado por uso de um vetor de baculovírus, para dar uma proteína L1 quimérica. As proteínas L1 quiméricas, uma vez produzidas, formam autonomamente um capsídeo quimérico (o capsídeo de acordo com a presente invenção). A expressão do mesmo por uso de um vetor de baculovírus pode ser realizada por um método comum, mas a condição é preferivelmente otimizada para aceleração da formulação de capsídeo quimérico autônomo.

[0086] O capsídeo de acordo com a presente invenção é usado para a produção de uma vacina de capsídeo L1. A vacina de capsídeo L1 pode ser produzida, por exemplo, por uso de um sistema de expressão de baculovírus.

[0087] A presente invenção inclui misturas de capsídeo contendo dois ou mais tipos de capsídeos de acordo com a presente invenção. Os três tipos de capsídeos de acordo com a presente invenção são diferentes de cada outro em capacidade de indução de um anticorpo neutralizante cruzado, e o uso de dois ou mais destes capsídeos diferentes em capacidade de indução de um anticorpo neutralizante cruzado em combinação dá, com vantagem, uma maior atividade neutralizante .

[0088] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, uma mistura de um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. Os dois tipos of capsídeos podem ser misturados, por exemplo, em uma relação em peso na faixa de 1:100 a 100:1. No entanto, a relação de m istura dos dois tipos de capsídeos não é limitada a estes, e pode ser modificada de acordo com a imunogenicidade e atividade neutralizante desejadas de anticorpos induzidos.

[0089] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, uma mistura de um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. Os dois tipos of capsídeos podem ser misturados, por exemplo, em uma relação em peso na faixa de 1:100 a 100:1. No entanto, a relação de m istura dos dois tipos de capsídeos não é limitada a estes, e pode ser modificada de acordo com a imunogenicidade e atividade neutralizante desejadas de anticorpos induzidos.

[0090] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, uma mistura de um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. Os dois tipos de capsídeos podem ser misturados, por exemplo, em una relação em peso na faixa de 1:100 a 100:1. No entanto, a relação de m istura dos dois tipos de capsídeos não é limitada a estes, e pode ser modificada de acordo com a imunogenicidade e atividade neutralizante desejadas de anticorpos induzidos.

[0091] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, uma mistura de um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 18-38 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2, um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 56-75 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2, e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto das 96-115 proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2. Os três tipos de capsídeos podem ser misturados, por exemplo, em um relação em peso entre os respectivos dois tipos de capsídeos na faixa de 1:100 a 100:1. No entanto, a relação de mistura dos três tipos de capsídeos não é limitada a estes, e pode ser modificada de acordo com a imunogenicidade e atividade neutralizante desejadas de anticorpos induzidos.

[0092] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção é também usada para a produção da vacina de capsídeo L1. O método de produzir uma vacina por uso de uma mistura de capsídeos é igual ao descrito acima.

[0093] A mistura de capsídeos de acordo com a presente invenção é usada para a produção de uma vacina de capsídeo L1 que pode induzir a expressão de anticorpos neutralizantes para HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 52 e HPV 58.

EXEMPLOS

[0094] A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos.

Exemplo 1

[0095] Preparação de anti-soro de peptídeo de coelho

[0096] Dois coelhos brancos japoneses (2.5 kg a 3.0 kg) foram imunizados. O antígeno usado foi um conjugado de um peptídeo quimicamente preparado e KLH (hemocianina de lapa). Na primeira sensibilização, 0.5 mg do antígeno foi administrado subcutaneamente, com adjuvante de Freund completo. Após duas semanas da primeira administração , 0.25 mg do antígeno foi administrado subcutaneamente com o adjuvante de Freund completo. Os coelhos foram sensibilizados similarmente (0,25 mg) adicionalmente após 2, 4, e 6 semanas, cumulativamente cinco vezes. Após uma semana da sensibilização final, o sangue total foi coletado para dar uma amostra de soro (A preparação foi realizada por Scrum Inc. sob contrato).

[0097] Um coelho foi imunizado com um peptídeo sintético tendo a sequência de aminoácidos da região de superfície L2 16 do HPV e o antisoro resultante foi analisado na experiência de neutralização mostrada abaixo. Os resultados são resumidos na Tabela 1. Os resultados mostrados na Tabela 1 mostram que existem epítopos neutralizantes cruzados nas regiões de aminoácidos 18-38, 49-75, e 96-115. Experiência de Neutralização 1. Células 293FT (adquiridas de Invitrogen) foram inoculadas em uma placa de cultura de células de 96 cavidades a uma concentração de 10,000 células/ cavidade, um dia antes da experiência de neutralização. 2. O soro foi diluído com um tampão de neutralização (meio DMEM sem vermelho fenol, contendo adicionados 10% FCS, 1% aminoácidos não essenciais, 1% ácido L-glutamina, e 10 mM HEPES) e misturados com um estoque de um pseudovirus infeccioso, e a mistura foi deixada reagir a 4°C durante uma hora e então adicionada às células 293FT inoculadas no dia anterior. 3. Após uma cultura durante cerca de 72 horas, 20 pl do sobrenadante foram coletados e a atividade de fosfatase alcalina foi determinada de acordo com o método por Roden et al., (ver http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColonmetricSEAP.htm). [Tabela 1] Atividade neutralizante de anticorpos de anti-L 2 peptide o

Exemplo 2

[0098] Método preparativo de antígeno de capsídeo

[0099] Os genes 16L1 e 16L1/L2 foram expressados em um sistema de baculovírus recombinante. Um vírus recombinante foi preparado em um sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac (GIBCO-BRL Inc., New York, NY), e expressado em células Sf9 (células derivadas de Mamestra brassicae). O gene 16L1 foi clonado em vetor pFastbad, para dar pFastbad/16L1. O gene 16L1/L2 foi clonado em vetor dual pFastbac para dar pFastbac dual/16L1/L2. Então, cada pFastbac clonado foi introduzido em DH10BAC E. coli (célula competente de eficiência máxima contendo DNA baculovírus e plasmídeo ajudante, GIBCO BRL), para dar Bacmid. O DNA Bacmid foi introduzido nas células sf-9 usando um reagente de transfecção Effectene (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), para dar baculovírus recombinante expressando proteína capsídeo.

[0100] O baculovírus recombinante foi infectado em células sf-9, e as células foram coletadas após incubação durante 72 h. As células infectadas foram colocadas em suspensão em 0,5% solução NP40; a mistura foi ainda deixada durante 10 min em temperatura ambiente, e centrifugada (9000 rpm, 15 minutos, 4°C), para separação de sua fração nuclear (precipitado) a partir da fração citoplásmica. A fração nuclear foi recolocada em suspensão em 1,28 g/ml cloreto de césio- solução de PBS, ultrassonicada para destruição das células (em Sonifier 250, Branson) e ultracentrifugada (34.000 rpm, 20 horas, 20°C) usando um rotor SW50.1 (Beckman Coulter Inc., Fulleron, CA). A proteína em uma densidade aparente cerca de 1,28 g/ml em gradiente de cloreto de césio foi coletada e dialisada contra 0,5 M NaCI-PBS, para dar uma solução de proteína capsídeo.

[0101] As sequências de aminoácidos 18 a 38 da proteína L2 de HPV 16, 56 a 75, e 96 a 115 (101a e 112a aminoácidos substituídos respectivamente com leucina e serina) foram inseridas na região de aminoácidos 430 a 433 de proteína L1 de HPV 16 por uso do método de preparação de um antígeno de capsídeo, e a resultante proteína quimérica foi expressada em células sf9 de insetos por uso de um baculovírus recombinante, para dar VLPs quiméricos, que foram designados respectivamente como Ch18/38, Ch56/75, e Ch96/115 (101L, 112S). A micrografia eletrônica na Figura 7 mostra as partículas de VLPs quiméricos. ELISA por uso destes VLPs quiméricos como antígeno mostrou uma ligação específica dos anticorpos para os epítopos inseridos, indicando que os epítopos foram expostos sobre a superfície dos VLPs.

[0102] Método de medida de ELISA do capsídeo 1. cada antígeno de capsídeo foi adicionado em uma quantidade de 1 pg/100 pl/cavidade e a mistura foi deixada a 4°C durante a noite. 2. Após remoção da solução de antígeno, 350 pl de solução de bloqueio (5% leite desnatado em PBS) foram adicionados, e a placa de cavidades foi deixada ainda a 37°C durante 2 horas. 3. Após remoção da solução de bloqueio, cada cavidade foi lavada com uma solução de lavagem 0.05% Teen20/0.05% NP40 em PBS) três vezes. . 4. 50 pl do antisoro diluído 500 vezes com a solução de bloqueio foram adicionados a cada cavidade e a solução foi deixada ainda em temperatura ambiente durante 1 hora. 5. Após remoção da amostra de soro, a cavidade foi lavada nove vezes e um anticorpo de IgG anti-coelho ligado a HRP diluído 2000 vezes foi adicionado a cada cavidade em uma quantidade de 50 pl. A solução é deixada ainda em temperatura ambiente durante 30 minutos, e a cavidade foi lavada com a solução de lavagem seis vezes após a remoção da solução. 6. Cinquenta pl de uma solução de substrato (24 mg de o-fenileno diamina dissolvidos em 12 ml de uma solução tampão de citrato-fosfato a pH5.0, contendo 1.2 pl de H2O2) foi adicionada ao mesmos e após a revelação de cor durante 15 minutos, a intensidade de luz em um comprimento de onda de 450 nm foi determinada usando uma leitora Immuno.

[0103] Usando o método preparativo para antígeno do capsídeo (Exemplo 2), as proteínas quiméricas, cada uma tendo as sequências dos aminoácidos 18 a 38, 56 a 75, ou 96 a 115 (101° e 112° aminoácidos substituídos respectivamente com leucina e serina) de proteína L2 de HPV 16 inserido na região dos aminoácidos 430 a 433 de proteína L1 de HPV 16 foram expressados em células sf9 de insetos por uso de baculovírus recombinante, para dar VLPs quiméricos, que foram designados respectivamente como Ch18/38, Ch56/75, e Ch96/115 (101L, 112S). As micrografias eletrônicas na Figura 7 mostram as partículas de VLPs quiméricos. ELISA por uso destes VLPs quiméricos como antígeno mostraram ligação específica a anticorpos para os epítopos inseridos nos VLPs quiméricos, indicando que os epítopos foram expostos sobre a superfície dos VLPs. Resultados são resumidos na Tabela 2. [Tabela 2] UgilfSo <le anticorpos anti- L2 peptídeo paia XTF quimérico

[0104] Os anti-soros foram preparados por imunização de coelhos com estes VLPS quiméricos. Os anti-soros foram preparados em um modo similar a Exemplo 1. (No entanto, a dosagem do capsídeo quimérico foi 50 pg, e o adjuvante usado foi TiterMax (fabricado por TiterMax, U.S.). Em ELISA por uso de um peptídeo sintético tendo a sequência idêntica com a do epítopo neutralizante cruzado como um antígeno, cada antisoro reagiu especificamente com o epítopo inserido. Resultados são resumidos na Tabela 3. O peptídeo 96/115 (101L, 112S) agregou facilmente, resultando em diminuição na quantidade ligada à placa de ELISA e, assim, o título obtido foi levemente menor do que o obtido com os outros dois peptídeos. [Tabela 3]

[0105] Ligação de anticorpos para VLP anti-quiméricos (soro) a peptídeo L2

(Absorbância em ELISA com soro diluído a 1 a 500 para os antígenos de peptídeo e a 1 a 2000 para HPV16VLP) *indica o segundo resultado de teste

[0106] Parênteses indicam o primeiro resultado de teste.

Exemplo 3

[0107] Preparação de pseudovírus infeccioso 1. Um plasmídeo expressando proteína L1 de HPV 16, um plasmídeo expressando proteína 16 L2 de HPV e um plasmídeo expressando fosfatase alcalina secretária foram transfectados para as células 293TT células usando Fugene HD. As células foram coletados 72 horas após a transfecção. 2. As células coletadas foram colocadas em suspensão em um tampão detergente (0.5% Briji58, 0.5% Benzonase e 1 % exonuclease segura de plasmídeo dependente de ATP C em D-PBS (CaCI2: 1 mM, MgCI2: 10 mM)) e a suspensão foi deixada ainda a 37°C durante a noite. 3. Então, a suspensão foi deixada ainda a 4°C durante 10 minutos, e 5 M NaCI foi adicionado a isto a uma concentração final de NaCI de 850 mM. 4. A suspensão de células foi centrifugada a 1.500g durante 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado. 5. O sobrenadante coletado foi colocado em camadas em solução Optiprep (fabricado por AXIS-SHIELD PoC AS) a 27%, 33%, ou 39% (diluído com PBS), e a solução foi ultracentrifugada a 50,000rpm durante 3 horas a 16°C. 6. Após a ultracentrifugação, cada fração da face de fundo em uma quantidade de cerca de 300 pl foi coletada, e a fração tendo o maior título foi usada como a fração de pseudovírus infecciosa em uma experiência de infecção.

[0108] Experimento de neutralização 1. células 293FT (adquiridas de Invitrogen) foram inoculadas em uma placa de cultura de células de 96 cavidades a uma concentração de 10,000 células/ cavidade um dia antes da experiência de neutralização. 2. Um soro foi diluído com um tampão de neutralização (meio DMEM sem vermelho fenol, contendo adicionados 10% FCS, 1% aminoácidos não essenciais, 1% ácido L-glutamina, e 10 mM HEPES) e misturados com um estoque de um pseudovírus infeccioso, e a mistura foi deixada reagir a 4°C durante uma hora e então adicionada às células 293FT inoculadas no dia anterior. 3. Após uma cultura durante cerca de 72 horas, 20 pl do sobrenadante foram coletados e a atividade de fosfatase alcalina foi determinada de acordo com o método por Roden et al., (ver http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColonmetricSEAP.htm).

[0109] As atividades neutralizantes dos anticorpos VLP anti-quiméricos contra os pseudovírus de HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 35, HPV 52, e HPV 58 foram estudadas por uso do método acima . Resultados são resumidos na Tabela 4. O anticorpo para Ch18/38 neutralizou os pseudovírus de HPV 16, HPV 18 e HPV 31. O anticorpo para Ch56/75 neutralizou todos os seis tipos de pseudovírus. O anticorpo para Ch96/115 (101L, 112S) neutralizou os pseudovírus de HPV 16, HPV 18, HPV 31 e HPV 58 (neutralização de anti-soro de baixo título não foi observado com o pseudovírus de HPV 58). O VLP anti-HPV 16 para comparação neutralizou o pseudovírus de HPV 16, HPV 31 e HPV 35. [Tabela 4] Neutralização de pseudovírus de HPV 16, HPV 18 e HPV 31, HPV 52, e HPV 58 por soro VLP anti-quimérico Título neutralizante

[0110] Além disso, as atividades neutralizantes das misturas de anticorpo (relação de peso: 1:1) para os pseudovírus de HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 52, e HPV 58 foram estudadas. Resultados são resumidos na Tabela 5. A mistura dos anticorpos para Ch18/38 e Ch56/75 e a mistura dos anticorpos para Ch56/75 e Ch96/115 (101L, 112S) neutralizaram todos os cinco tipos de pseudovírus. A mistura dos anticorpos para Ch18/38 e Ch96/115 (101L, 112S) neutralizaram pseudovírus de HPV 16, HPV 18, HPV 31 e HPV 58. [Tabela 5] Atividade neutralizante de anticorpos VLP anti-quiméricos

[0111] Deve ser feita referência às seguintes literaturas ao realizar as experiências nos Exemplos da presente descrição. As seguintes referências na literatura e todas as descrições aqui são incorporadas por referência. Literatura de referência 1) Matsumoto. K, etal.: Antibodies to human papillomavirus 16, 18, 58, and 6b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. Cancer Res., 88, 369-375, 1997. 2) Xiaojiang S. Chen, et al.: Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., 5, 557-567, 2000. 3) Jean-Remy Sadeyen, et al.: Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003. 4) Ishii. Y, et al.: Mutational analysis of human papillomavirus type 16 major capsid protein L1: the cysteines affecting the intermolecular bonding and structure of L1 capsids. Virology., 308, 128-136, 2003.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0112] O capsídeo de acordo com a presente invenção é um antígeno de VLP de HPV 16 tendo um epítopo L2 de tipo comum adicional. O capsídeo contém 360 novos epítopos adicionais em uma partícula, enquanto retendo sua antigenicidade de vacinas correntes. Após os testes de verificação da atividade de prevenção de infecção com o anticorpo anti-L2 ele pode ser usado como um antígeno de vacina que pode possivelmente evitar a infecção de todos os HPVs carcinogênicos. É possivelmente um antígeno de HPV de segunda geração de vacina que pode evitar a infecção de doenças relacionadas com HPV de alto risco, como câncer cervical, que chega a cerca de 11% dos tumores malignos femininos no mundo (450 milhares de pacientes).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0113] Figura 1 é uma ilustração para explicação de partículas de papilomavírus humanos. Genoma: DNA de filamento duplo circular. Partícula: icosaédrico regular (55 nm). Vários mamíferos são persistentemente infectados com papilomavírus específico para cada uma das espécies. Existem 100 ou mais tipos de HPV, e infecção de 15 tipos do mesmo (em grupo de alto risco) causa o início de câncer cervical.

[0114] Figura 2 são vistas explicando a partícula de tipo de vírus (VLP). Não existe praticamente uma linhagem de células cultivada mostrando a proliferação do HPV. Expressão da proteína L1 por exemplo com um baculovírus recombinante resultou em conjunto da mesma no núcleo, formando VLPs. As vacinas de primeira geração contém um VLP de tipo 16 ou 18 como um antígeno. A antigenicidade de VLPs é altamente específica do tipo.

[0115] Figura 3 é um desenho explicando o método preparativo para um pseudovírus infeccioso.

[0116] Figura 4 é um desenho explicando a região de superfície L2. A sequência de aminoácidos na região de superfície L2 de HPV carcinogênico HPV, altamente homólogos em seqüências de aminoácidos, desempenha um papel essencial em infectividade de HPV.

[0117] Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos da região de superfície L2 de HPV 16.

[0118] Figura 6 é um desenho explicando o VLP quimérico preparado por inserção de um epítopo neutralizante cruzado na proteína L1. O VLP quimérico tem 360 epítopos L2 neutralizantes cruzados. A antigenicidade e a estabilidade do VLP foram verificadas.

[0119] Figura 7 inclui desenhos explicando VLPs quiméricos, Ch18/38, Ch56/75 e Ch96/115 (101L, 112S) (incluindo sequências de aminoácidos) e fotografias das partículas. WT-VLP L1 16 é uma fotografia de partículas de VLP não quiméricas.

Claims

1. Capsídeo, caracterizado pelo fato de que é um agregado formado por conjunto de proteína quimérica composto de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um epítopo L-2 de HPV 16 na região de laço da proteína L1 de HPV 16, em que a região para inserção do epítopo L2 é uma região de aminoácidos correspondendo a 430 a 433 da SEQ ID No. 1 e o epítopo L2 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por: LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID No. 2) (a seguir, referido como epítopo L2 18-38), GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID No. 3) (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (SEQ ID No. 4) (a seguir, referido como 96- 115 epítopo L2).

2. Capsídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo L2 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID No. 3) (a seguir, referido como 56-75 epítopo L2).

3. Capsídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agregado é um agregado formado por conjunto de capsômeros de pentâmero múltiplo, cada um dos quais composto de cinco moléculas de proteínas quiméricas.

4. Capsídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agregado formado por conjunto de capsômeros de pentâmero múltiplo tem uma estrutura de partícula.

5. Capsídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o número dos capsômeros de pentâmero constituindo o agregado está na faixa de 65 a 80.

6. Capsídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o número dos capsômeros de pentâmero constituindo o agregado é 72.

7. Capsídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser usado para a produção de uma vacina de capsídeo L1.

8. Mistura de capsídeos, caracterizada pelo fato de compreender dois ou mais tipos de capsídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Mistura de capsídeos de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 3.

10. Mistura de capsídeos de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 SEQ ID No. 2 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 4.

11. Mistura de capsídeos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 3 e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 4.

12. Mistura de capsídeos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 2, um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 3, e um capsídeo que é um agregado formado por conjunto de proteínas quiméricas inseridas em epítopo L2 de SEQ ID No. 4.

13. Mistura de capsídeos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizada pelo fato de ser usada para a produção de uma vacina de capsídeo L1.

14. Proteína quimérica, caracterizadapelo fato de que é composta de proteína L1 de papilomavírus humano 16 (HPV) e um epítopo L2 de HPV 16 inserido na região de laço da proteína L1 de HPV 16, em que a região de laço para inserção do epítopo L2 é uma região de aminoácidos correspondendo a 430 a 433 da SEQ ID No. 1, e o epítopo L2 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por: LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID No. 2) (a seguir, referido como epítopo L2 18-38), GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID No. 3) (a seguir, referido como epítopo L2 56-75) ou DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (SEQ ID No. 4) (a seguir, referido como epítopo L2 96-115).

15. Proteína quimérica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o epítopo L2 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID No. 3) (a seguir, referido como 56-75 epítopo L2).