BRPI0720297B1

BRPI0720297B1 - Gomas gelana clarificadas de altíssimo desempenho

Info

Publication number: BRPI0720297B1
Application number: BRPI0720297-0A
Authority: BR
Inventors: Ralph B. Bezanson; Daniel E. Jackson; Bradley S. Dominik; Donald Dimasi; Ronnie C. Yuan; William C. Baldwin; Andrew J. Grasela
Original assignee: Cp Kelco U.S., Inc
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2022-09-27
Also published as: WO2008076719A3; CA2671059A1; EP2117348A2; RU2009126089A; MX2009006414A; EP2117348A4; AU2007334054A1; CA2671059C; BRPI0720297A2; US8231921B2; JP5886332B2; CN101460065A; CN101460065B; JP2014129539A; US20080145505A1; JP5546249B2; WO2008076719A2; JP2010512750A; MY148379A

Abstract

GOMAS GELANA CLARIFICADAS DE ALTÍSSIMO DESEMPENHO. A invenção se refere a composições de goma gelana de alto desempenho com uma força de gel, medida com curdmeter a 0,1 %, de pelo menos cerca de 117 g/cm2, isto é, de cerca de 117 g/cm2 a cerca de 400 g/cm2. As gomas gelana de alto desempenho possuem um baixo teor de acila, mas peso molecular aumentado. Uma concretização da invenção também se refere a processos para produção de gomas gelana de alto desempenho com alta clareza. A invenção também se refere a produtos industriais alimentícios e não-alimentícios compreendendo gomas gelana de alto desempenho.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a composições de goma gelana com baixa quantidade de acila e parcialmente desacilada de alto desempenho e com maior peso molecular e maior força de gel. A invenção também se refere a processos para produzir gomas gelana com baixa quantidade de acila e parcialmente desaciladas com alta clareza sem usar o processo de filtração convencional. A invenção também se refere a produtos industriais compreendendo gomas gelana com baixa quantidade de acila e parcialmente desaciladas de alto desempenho para aplicações alimentícias e não- alimentícias.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

Os polissacarídeos, também chamados de gomas, são usados principalmente para espessar ou gelificar soluções aquosas. Os polissacarídeos que são produzidos pelos microorganismos do gênero Sphingomonas também são chamados de “esfmganos”. As gomas costumam ser classificadas em dois grupos: espessantes e agentes gelificantes. Espessantes típicos incluem amidos, goma guar, carboximetilcelulose, alginato, metilcelulose, goma xantana, goma caraia e goma tragacanto. Agentes gelificantes comuns incluem a goma gelana, gelatina, amido, alginato, pectina, carragena, agar e metilcelulose.

Os agentes gelificantes são usados na indústria alimentícias em uma variedade de aplicações, inclusive em geléias para confeitaria, geléias de frutas, géis de sobremesa, glacês, produtos de laticínios, bebidas, entre outros. Além disso, os agentes gelificantes podem ser usados como componentes de meios microbiológicos. Os agentes gelificantes diferem nas condições sob as quais eles podem ser usados e na textura dos géis que eles formam. Essas propriedades distintivas dos géis levaram ao uso abundante de certos agentes gelificantes em produtos específicos (por exemplo, amido em geléias para confeitaria; gelatina em géis de sobremesa; ágar em glacês; e alginato em fatias de pimentão).

Um agente gelificante particularmente útil é a goma gelana, que é um polissacarídeo capsular produzido pela bactéria Sphingomonas elodea, ATCC 31461, e pelas linhagens derivadas dessa espécie. Os açúcares constituintes da goma gelana são a glicose, o ácido glucurônico e a ramnose na razão molar de 2:1:1. Eles são ligados juntos para obter uma estrutura primária compreendendo uma unidade de repetição de tetrassacarídeo linear (O'Neill M. A., e col, Structure of the acidic extracellular gelling polysaccharide produced by Pseudomonas elodea, Carbohydrate Res., 124(1): 123-133 (1983); polysaccharide produced by Pseudomonas elodea.

Carbohydrate Res.. 124(1): 123-133 (1983): Jansson. P. E.. e col,. Structural studies of gellan gum, an extracellular polysaccharide elaborated by Pseudomonas elodea. Carbohydrate Res., 124(1): 135-139 (1983)). Na forma nativa ou alta quantidade de acila (“HA”), dois substituintes acil, acetato e glicerato, estão presentes. Ambos os substituintes estão localizados no mesmo resíduo de glicose, e, em média, há um glicerato por unidade de repetição e um acetato por cada duas unidades de repetição. Na forma modificada (“LA”), a maioria dos grupos acila foi removida para produzir uma unidade de repetição linear substancialmente livre de tais grupos. A análise por difração de raiox-X mostra que a goma gelana existe como uma hélice dupla paralela tripla para a esquerda (Chandraskaran, R.. e col.. The crystal structure of gellan. Carbohydrate Res., 175(11):1-15 (1988); Chandraskaran, R., e col., Cation interactions in gellan: An x- ray study of the potassium salt. Carbohydrate Res.. 181:23- 40(1988)).

As gomas gelana LA formam géis quando resfriadas na presença de cátions promotores de gel, de preferência cátions bivalentes, como cálcio e magnésio. Os géis formados são firmes e quebradiços. As gomas gelana HA não exigem a presença de cátions para formação do gel, e os géis formados têm características estruturais e reológicas que são afetadas significativamente pelos substituintes acil. Sendo assim, as propriedades das gomas gelana HA diferem significativamente das propriedades das gomas gelana LA. Os géis de goma gelana HA são geralmente macios e flexíveis, e carecem de histerese térmica.

Comercialmente, a goma gelana é formada pela inoculação de um meio de fermentação sob condições aeróbicas com as bactérias Sphingomonas elodea. O meio de fermentação contém uma fonte de carbono, fosfato, fontes de nitrogênio orgânicas e inorgânicas, e elementos vestigiais apropriados. A fermentação é realizada sob condições estéreis com controle estrito da aeração, agitação, temperatura e do pH. Ao término da fermentação, o caldo viscoso é pasteurizado para matar as células viáveis antes da recuperação da goma.

A goma gelana apresenta características diferentes, dependendo do método de recuperação do caldo de fermentação. A recuperação direta do caldo de fermentação produz gelana em sua forma nativa ou com grande quantidade de acila, que é modificada por S. elodea com substituintes acetil e gliceril em um resíduo de glicose. O isolamento da gelana nessa forma nativa ou com grande quantidade de acila produz um gel macio, flexível e elástico. A gelana pode ser desacilada para obter a gelana em sua forma com baixa quantidade de acila. O isolamento da gelana nessa forma com baixa quantidade de acila produz um gel duro, firme e quebradiço. Mesclas de gelana nativa e modificada produzem géis de textura intermediária.

Atualmente, a goma gelana é desacilada pelo tratamento do caldo de fermentação contendo a goma gelana com álcali forte sob alta temperatura. Esse processo remove os substituintes acila da gelana e provoca a lise das células de S. eloclea. Os resíduos sólidos e celulares são então removidos por tratamento ácido (para neutralizar/acidificar o caldo de fermentação) e filtração para produzir uma goma gelana de alta clareza, com baixa quantidade de acila. No entanto, esse método também resulta em um peso molecular da goma substancialmente inferior ao produzido pelo organismo nativo, devido à despolimerização, bem como à desacilação. O método comercial atual para recuperação da goma gelana produz géis com uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, de cerca de 290 g/cm (equivalente a uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de cerca de 113 g/cm2).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um processo de preparação de goma gelana compreendendo as etapas de fermentar Sphingomonas eloclea em um caldo de fermentação; opcionalmente, clarificar o caldo de fermentação por um processo químico/enzimático; desacilar brandamente o caldo de fermentação clarificado com um agente cáustico; e precipitar a goma gelana a partir do caldo de fermentação, sendo que a goma gelana tem uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, de pelo menos cerca de 300 g/cm , ou uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de pelo menos cerca de 117 g/cm .

Em uma concretização da invenção, a S. eloclea é uma linhagem deficiente em PHB. Em outra concretização da invenção, a etapa de clarificação compreende as etapas de aquecimento até uma faixa de temperatura de cerca de 30°C a cerca de 70°C; tratamento com um ou mais antioxidantes em combinação com um ou mais agentes quelantes e uma enzima lisozima; tratamento com um ou mais surfactantes; e tratamento com uma enzima protease.

A invenção também se refere a gomas gelana produzidas pelos métodos acima. Além disso, a invenção se refere a gomas gelana com uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, de pelo menos cerca de 300 g/cm , ou uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de pelo menos cerca de 117 g/cm . Em uma concretização da invenção, a goma gelana reidratada em água deionizada a uma concentração de 1% tem uma transmitância de luz maior do que cerca de 60%. Em outra concretização da invenção, as gomas gelana possuem uma dureza TPA (Análise do Perfil da Textura) de pelo menos 9 libras (4 kg). Em ainda outra concretização da invenção, as gomas gelana possuem uma viscosidade a um calor de 90°C com goma gelana a 1% de pelo menos cerca de 25 centipoise (cP).

A invenção também se refere a produtos industriais alimentícios e não-alimentícios compreendendo as novas gomas gelana descritas no presente documento. Além disso, a invenção se refere a produtos industriais alimentícios ou não-alimentícios compreendendo gomas gelana preparadas pelo método descrito neste documento. A concentração de goma gelana de alto desempenho usada nos produtos industriais da presente invenção é de cerca de 20% a cerca de 85% menos do que a concentração do produto comercial atualmente disponível (Kelcogel®) utilizado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG. 1 é um gráfico ilustrando a correlação linear entre o teste de força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, e teste de força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a métodos de preparação de gomas gelana com baixa quantidade de acila tendo força de gel do que as gomas gelana com baixa quantidade de acila da técnica anterior e para a preparação de gomas gelana parcialmente desaciladas. A invenção também se refere a gomas gelana com baixa quantidade de acila e parcialmente desaciladas que possuem alta clareza sem o uso de uma filtro-prensa convencional quando reidratadas em soluções aquosas. A invenção também se refere a produtos alimentícios e não-alimentícios, como géis de sobremesa, produtos de confeitaria, bebidas, meios de cultura microbiana e tecidual, limpadores líquidos, entre outros, compreendendo essas gomas gelana de alto desempenho.

As gomas gelana de alta quantidade de acila (HA), conforme descrito na Patente U.S. 5.190.927, têm um teor de glicerato de 11 a 13% e um teor de acetato de 4 a 5%, para um teor total de acila de 15 a 18% (p/p). As gomas gelana com baixa quantidade de acila, são consideradas como tendo <1,0% glicerato e < 1,0% acetato, ou um teor total de acila de < 2,0%, p/p, na cadeia polimérica. As gomas gelana parcialmente desaciladas, como descrito neste documento, possuem os níveis intermediários de 1 a 11% glicerato ela 4% acetato, para um teor total de acila de 2 a 15%.

Sphingomonas elodea, ATCC 31461, mutantes derivados dessa linhagem, ou outras linhagens adequadas são cultivados ou fermentados aerobicamente em uma solução aquosa conhecida como um caldo de fermentação pelos métodos conhecidos pelos versados na técnica. Os meios contêm fontes de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos. Em geral, os carboidratos (p°r exemplo, glicose, frutose, maltose, sucrose, xilose, manitol, e outros) podem ser utilizados tanto sozinhos quanto em combinação como fontes de carbono assimiláveis no meio nutriente. Em geral, a quantidade de carboidrato geralmente varia entre cerca de 2% e 4%, em peso, do meio. Em geral, diversos materiais proteináceos podem ser usados como fontes de nitrogênio orgânico no processo de fermentação. Fontes de nitrogênio adequadas incluem, por exemplo, hidrolisatos de levedura, farinha de soja, farinha de semente de algodão, hidrolisatos de caseína, água de maceração de milho, solúveis de destiladores, entre outros. As fontes de nitrogênio, quer sozinhas ou em combinação, são usadas em quantidades que variam de cerca de 0,05% a 0,2% em peso do meio aquoso. Dentre os sais inorgânicos que podem ser incorporados no meio de cultura estão os sais comuns capazes de fornecer ions de sódio, potássio, amónio, cálcio, magnésio, fosfato, sulfato, cloreto, nitrato, carbonato e ions similares. Também estão incluídos microelementos, como sais de ferro, zinco, cobre, manganês, cobalto e molibdênio.

Os esfinganos são segregados como polissacarídeos capsulares no caldo de fermentação. Linhagens mutantes de S. eloclea com propriedades desejáveis podem ser usadas. Em uma concretização da invenção, utiliza-se uma linhagem mutante de S. elodea que é deficiente na produção de poliidroxibutirato (“PHB”), tal como a descrita no Pedido de Patente U.S. No. 11/292.366, depositado em 2 de dezembro de 2005, que é incorporada na íntegra para fins de referência. O uso das linhagens deficientes em PHB, junto com o processo de clarificação descrito aqui, permite obter alta clareza das gomas gelana reconstituídas tanto para gomas gelana com baixa quantidade de acila quanto gomas gelana parcialmente desaciladas.

Após a fermentação, os esfmganos são geralmente clarificados e isolados dos sólidos suspensos, inclusive as células microbianas e resíduos celulares que fazem parte do meio do caldo de fermentação, por um processo de filtração para produzir esfmganos clarificados. Como descrito aqui, o processo de clarificação pode, em vez disso, ser um processo químico / enzimático. As soluções obtidas pela adição de esfmganos isolados a meios aquosos e soluções de esfmganos parcialmente purificadas também podem ser clarificadas usando o processo da presente invenção. As soluções aquosas de esfmganos contendo sólidos de fermentação indesejáveis úteis no processo da presente invenção podem conter cerca de 0,01% a cerca de 10% de esfmganos em peso do peso total da solução. Qualquer solução aquosa contendo qualquer um dos esfmganos conhecidos pode ser usada na prática da presente invenção.

As gomas gelana com baixa quantidade de acila de alto desempenho da invenção possuem uma força de gel superior à das gomas gelana com baixa quantidade de acila da técnica anterior. Por exemplo, os produtos Kelcogel® (CP Kelco, Atlanta, GA) têm uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, máxima de cerca de 290 g/cm2 (o que equivale a uma força de gel medida com curdmeter a 0,1% de cerca de 113 g/cm2), conforme medido pelo Neo Curdmeter® (IIO Electric Co.. Ltd., Japan). A força de gel das gomas gelana com baixa quantidade de acila foram anteriormente descritas usando o teste de força de gel com curdmeter, goma gelana a 0,2%. O limite superior desse procedimento de teste é de 400 g/cm , que é ultrapassado pelas novas gomas gelana da presente invenção. Portanto, o método de teste de força de gel foi modificado para usar goma gelana a 0,1%.

As gomas gelana de alto desempenho da invenção possuem uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, de pelo menos cerca de 300 g/cm2, tal como em pelo menos cerca de 320 g/cm2. De forma equivalente, as gomas gelana de alto desempenho da invenção possuem uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de pelo menos cerca de 117 g/cm , tal como pelo menos cerca de 125 g/cm , pelo menos cerca de 150 g/cm2, pelo menos cerca de 175 g/cm2, pelo menos cerca de 200 g/cm2, pelo menos cerca de 225 g/cm2, pelo menos cerca de 250 g/cm , pelo menos cerca de 275 g/cm , pelo menos cerca de 300 g/cm e pelo menos cerca de 325 g/cm . Concretizações adicionais da presente invenção podem ter força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, s de cerca de 117 g/cm2 a cerca de 400 g/cm2, tal como de cerca de 117 g/cm2 a cerca de 156 g/cm2 e de cerca de 125 g/cm a cerca de 250 g/cm .

As gomas gelana com baixa quantidade de acila e alto desempenho da invenção possuem maior peso molecular se comparado às gomas gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis. Embora isso não se limite a uma teoria específica, acredita-se que as gomas gelana com baixa quantidade de acila e alto desempenho da presente invenção possuam características de alta força de gel devido ao aumento do peso molecular.

Além disso, as gomas gelana com baixa quantidade de acila e parcialmente desaciladas de alto desempenho da invenção podem ser maior clareza sem usar um processo de filtração para remover células e resíduos celulares. A reidratação e dissolução em água de esfmganos clarificada pelos métodos descritos nesta invenção proporciona uma solução de esfmganos substancialmente clara. Uma solução de esfmganos substancialmente clara (1% p/p), de acordo com a presente invenção, tem uma transmitância de luz maior do que cerca de 60%, de preferência, maior do que cerca de 70%, e mais preferivelmente, maior do que cerca de 80%. A transmitância de luz pode ser medida em qualquer comprimento de onda no espectro visível usando técnicas e equipamentos convencionais (por exemplo, espectrofotômetros comercialmente disponíveis). A transmitância de luz é geralmente medida em comprimentos de onda de cerca de 480 nm a cerca de 680 nm.

As gomas gelana com baixa quantidade de acila da presente invenção possuem uma dureza TPA de pelo menos cerca de 9 1b (4 kg), tal como pelo menos cerca de 15 lb (7 kg), pelo menos cerca de 20 1b (9 kg) e pelo menos cerca de 25 lb. As gomas gelana com baixa quantidade de acila da presente invenção também possuem uma viscosidade sob calor de 90°C, goma gelana a 1%, de pelo menos cerca de 25 cP, tal como pelo menos cerca de 75 cP, pelo menos cerca de 175 cP e pelo menos cerca de 300 cP.

CLARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA

Em uma concretização da invenção, a solução aquosa de esfmganos é clarificada por um processo químico/enzimático compreendendo tratar a solução de esfmganos de forma gradativa. O caldo de fermentação é 1) aquecido, 2) tratado com um ou mais antioxidantes em combinação com um ou mais agentes quelantes e uma enzima lisozima, 3) tratado com um ou mais surfactantes, 4) tratado com uma enzima protease, e 5) opcionalmente tratado com uma enzima celulase.

A primeira etapa compreender aquecer uma solução aquosa de esfmganos até uma temperatura elevada por técnicas convencionais, tal como controle de temperatura em um tanque encamisado, injeção direta de vapor, entre outras. A injeção direta de vapor é preferida para reduzir ao mínimo o tempo de aquecimento. A temperatura de clarificação varia de cerca de 30°C a cerca de 70°C, de preferência de cerca de 50°C a cerca de 60°C. O período de tempo necessário para aquecer a solução de esfmganos até a temperatura desejada pode variar significativamente, dependendo do tamanho e do volume da solução de esfinganos a ser tratada. Por exemplo, enquanto que se pode levar apenas alguns minutos para aumentar a temperatura de um volume pequeno (por exemplo, de 50 mL) de solução de esfinganos da temperatura ambiente para cerca de 60°C, pode-se levar várias horas para aumentar similarmente a temperatura de 40.000 litros de solução (por exemplo, como pode ocorrer no processamento comercial).

A próxima etapa compreende tratar a solução aquosa de esfinganos opcionalmente com pelo menos um antioxidantes, opcionalmente pelo menos um agente quelante e pelo menos uma enzima lisozima. De preferência, a solução aquosa de esfinganos é tratada com pelo menos um antioxidante, pelo menos um agente quelante e pelo menos uma enzima lisozima. O(s) antioxidante(s) é(são) tipicamente adicionado(s) em faixas de concentração de cerca de 75 partes por milhão (“ppm”) a cerca de 300 ppm, tal como de cerca de 150 ppm a cerca de 250 ppm. Normalmente, o(s) agente(s) quelante(s) é(são) adicionado(s) à solução de esfinganos a uma concentração que varia de cerca de 150 ppm a cerca de 1000 ppm, tal como de cerca de 200 ppm a cerca de 500 ppm. A concentração típica de lisozima varia de cerca de 25 ppm a cerca de 200 ppm, tal como de cerca de 50 ppm a cerca de 150 ppm. A solução é misturada por cerca de 1 hora a cerca de 5 horas, tal como cerca de 1,5 hora a cerca de 2,5 horas, e cerca de 1,5 hora a cerca de 2 horas.

O antioxidante pode ser ácido ascórbico, eritorbato de sódio, metabisulfíto de sódio, metabisulfite de potássio, bisulfite de potássio, dióxido de enxofre, hidroxianisol butilado, cisteína ou sulfito de sódio.

Agentes quelantes adequados para uso no processo da presente invenção incluem compostos ou composições capazes de sequestrar ions metálicos multivalentes (por exemplo, Mg2+, Ca2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, etc) na solução de esfmganos formando complexos polidentados com os íons metálicos e formando um precipitado com os íons metálicos ou adsorvendo os íons metálicos. Exemplos de agentes quelantes úteis incluem, sem a isto se limitar, tetraacetato de etilenodiamina dissódico, tetraacetato de etilenodiamina dipotássico, tetraacetato de etilenodiamina tetrassódico, tetraacetato de etilenodiamina tetrapotássico, ácido cítrico, citrato de Imodium, citrato de tripotássio, hexametafosfato de sódio, hexametafosfato de potássio, polifosfato de sódio, polifosfato de potássio, pirofosfato de sódio, pirofosfato de potássio, fosfato monossódico, fosfato monopotássio, fosfato dissódico, fosfato dipotássico, fosfato trissódico, fosfato tripotássico, bicarbonate de sódio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, uma resina de troca iônica catiônica, dicloridrato de etilenodiamina, diacetato de etilenodiamina, sal de lítio de etilenodiamina,diidroiodeto de etilenodiamina, entre outros. De preferência, os agentes quelantes utilizados no processo da presente invenção incluem ácido cítrico, e sais de ácido etilenodiamina tetraacético, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido pirofosfórico, ácido polifosfórico, ácido carbônico, ácido metafosfórico, e etilenodiamina. Mais preferencialmente, como o agente quelante, utiliza-s etilenodiamina tetraacetato dissódico ou ácido cítrico como o agente quelante.

As lisozimas adequadas para uso neste processo incluem a lisozima Multifect® (Genencor International. Inc., Paio Alto, CA) ou qualquer lisozima que possa ser obtida de uma planta, animal ou origem derivada de micróbios.

Após tratar a solução de esfmganos com antioxidante(s), agente(s) quelante(s) e lisozima, a próxima etapa consiste em tratar a solução com pelo menos um surfactante. O(s) surfactante(s) é(são) adicionado(s) em uma faixa de concentração de cerca de 50 ppm a cerca de 400 ppm, tal como de cerca de 150 ppm a cerca de 300 ppm. A solução é então agitada por um período de tempo de cerca de 0,5 horas a cerca de 2 horas, tal como de cerca de 1 hora a cerca de 1,5 hora.

Surfactantes adequados para uso no processo da presente invenção incluem compostos ou composições que sejam capazes de formar emulsões aquosas na presença de substâncias hidrófilas e hidrófobas (sólidas ou líquidas). De preferência, os surfactantes são compostos ou composições solúveis em água ou água-álcool. Exemplos de surfactantes úteis incluem, sem a isto se limitar, dodecil sulfato de sódio (“SDS”) - monooleato de polioxietilenosorbitano (TWEEN 80 da ICI Americas. Inc., Bridgewater. N.J.), lecitina, monoglicerídeos, ésteres tartáricos de monoglicerídeos, monoglicerídeos fosfatados (por exemplo, como o sal monossódico), monoglicerídeos lactilados, monoglicerídeos acetilados, monoglicerídeos succinilados, monoglicerídeos etoxilados, ésteres de sorbitano, polisorbatos, ésteres de poliglicerol, ésteres de sucrose, estearoil lactilato de sódio, ésteres de propileno glicol, entre outros. Mais preferencialmente, o SDS é usado como o surfactante.

A solução é então tratada com pelo menos uma enzima protease. A enzima protease é adicionada em uma concentração de cerca de 100 ppm a cerca de 3000 ppm, tal como de cerca de 500 ppm a cerca de 2000 ppm, e é misturada com a solução por cerca de 0,5 horas a cerca de 5 horas, tal como de cerca de 1 hora a cerca de 4 horas.

As enzimas protease adequadas para uso neste processo podem ser proteases ácida, neutras ou alcalinas provenientes de origens bacterianas, fúngicas ou vegetais. Exemplos de enzimas protease ácidas úteis no processo desta invenção incluem, sem a isto se limitar, proteases produzidas por microorganismos do gênero Aspergillus, tal como A. niger. As enzimas protease neutras úteis no processo da presente invenção incluem, sem a isto se limitar, proteases produzidas por microorganismos, como Bacillus amyloliquifaciens. As enzimas protease alcalinas úteis no processo da presente invenção incluem, sem a isto se limitar, proteases alcalinas produzidas pelos microorganismos do gênero Bacillus, tal como B. subtilis, B. licheniformis e B. pumilis’, proteases elaboradas por espécies de Streptomyces, tal como S. fradiae, S. griseus e S. rectus; e proteases obtidas de subtilisinas, tal como a subtilisina Novo e a subtilisina Carisberg, incluindo proteases como a subtilopeptidase A e a subtilopeptidase B.

Finalmente, uma enzima celulase também pode ser adicionada se o meio de fermentação contiver resíduo celulósico. Exemplos de enzimas celulase para uso no processo da presente invenção incluem, mas não se limitam a Ceiluclast® BG (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). Multifect® CL (Genencor International, Inc.. Paio Alto, CA), Multifect® GC (Genencor International. Inc., Paio Alto. CA), entre outras.

As enzimas usadas na(s) etapa(s) de tratamento enzimático degradam o resíduo celular sólido em compostos que são removidos com mais facilidade durante o processo de recuperação, melhorando assim a pureza do produto de esfmganos e ajudando no processo de clarificação, o que melhora a transmitância do produto de esfmganos quando reconstituído em solução.

Deve-se notar que o grau de clarificação afetado pelo tratamento da solução de esfmganos com agente(s) quelante(s), antioxidante(s) e surfactante(s) pode afetar as concentrações enzimáticas ou o tempo necessário para completar os tratamentos enzimáticos subsequentes. Por exemplo, aumentar a quantidade do(s) agente(s) quelante(s), antioxidante(s) e surfactante(s) usados neste processo pode diminuir a quantidade de enzimas utilizada e/ou o tempo necessário para afetar a clarificação de uma solução de esfmganos.

DESACILAÇÂO

Antes ou depois da clarificação, a goma gelana pode então ser desacilada com um ou mais agentes cáusticos fortes ou fracos, como hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, fosfato trissódico, entre outros. O agente cáustico preferido é hidróxido de potássio. Em uma concretização, a desacilação ocorre após a clarificação por um processo químico/enzimático. Em outra concretização, a desacilação ocorre antes da clarificação por um processo de filtração.

Adiciona-se agente cáustico suficiente para aumentar o pH do fermentador até uma faixa de cerca de 9,5 a cerca de 12,5, tal como de cerca de 9,7 a cerca de 11,7. O caldo é então tratado termicamente até uma temperatura de cerca de 190°F (88°C) a cerca de 210°F (99°C). Após o aquecimento, o pH é diminuído com uma solução ácida, tal como ácido sulfúrico, ácido clorídrico ou ácido fosfórico, de preferência ácido sulfúrico, até um pH de cerca de 3,5 a cerca de 9,0, tal como de cerca de 4,0 a cerca de 7,0. Deve-se notar que o grau de desacilação e as propriedades do produto de gelana resultante são afetados pelo nível do tratamento com álcalis. Por exemplo, caso seja utilizado um tratamento forte com álcalis, então a goma gelana será adicionalmente desacilada, produzindo um gel mais firme e quebradiço,e o peso molecular será reduzido, tal como no produto comercial comercialmente disponível. Por outro lado, se utilizarmos um tratamento com álcalis mais brando, haverá menos redução no peso molecular, e mesmo em níveis de tratamento com álcalis mais brando, a goma gelana terá um teor de acila superior (isto é, parcialmente desacilada), formando um gel mais flexível.

Após a desacilação, a goma gelana pode ser precipitada por métodos bem conhecidos na técnica, tal como pelo uso de álcool isopropílico ou etílico.

PRODUTOS INDUSTRIAIS ALIMENTÍCIOS E NÃO-ALIMENTÍCIOS

As presentes gomas gelana são úteis como espessantes, por exemplo, na indústria alimentícia, tais como bebidas, confecções, geléias e gelatinas, alimentos fabricados, géis baseados em água, recheios de torta, géis de sobremesa, glacês, laticínios, como iogurtes, pudins, cremes, leites em pó, leites fermentados, sorvetes, entre outros. Além disso, os presentes agentes gelifícantes podem ser usados em alimentos para animais gelificados, meios de cultura microbiana e tecidual, limpadores líquidos, pastas de dente, sabão e sabonetes líquidos, géis desodorantes, géis purificadores de ar, cápsulas moles, e outras aplicações industriais conhecidas dos géis microbianos.

As características de alto desempenho da goma gelana aqui descrita permitem que a goma gelana ofereça funcionalidade de gelificação a concentrações menores do que o das gomas gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis convencionais. A concentração da goma gelana é de cerca de 15% a cerca de 90% menor, tal como cerca de 20% a cerca 85% menor, cerca de 25% a cerca de 75% menor, cerca de 30% a cerca de 65% menor, e cerca de 35% a cerca de 55% menor, do que a concentração do produto comercial atualmente disponível (Kelcogel®) utilizado. A quantidade reduzida de goma gelana possibilita economia de custos e permite que as gomas gelana sejam utilizadas de forma econômica em outras aplicações em que, até o presente momento, apenas agentes gelifícantes de custo inferior, como ágar, poderiam ser utilizados.

As gomas gelana de alto desempenho da presente invenção podem ser usadas para conferir estabilidade térmica. Em uma concretização, as gomas gelana de alto desempenho são usadas em géis de sobremesa multicamadas. A rede de goma gelana termicamente estável ajuda a manter o formato dos géis de sobremesa com desenhos e padrões únicos durante a pasteurização a 85°C. A eficácia da goma gelana em proporcionar estabilidade térmica pode ser avaliada por observação visual ou medição reológica.

Em outra concretização, as gomas gelana da presente invenção proporcionam estabilidade térmica para confeitos gomosos. A estabilidade térmica em confeitos gomosos pode ser avaliada medindo-se o aumento no diâmetro do confeito gomoso à medida que se deforma e derrete.

Em ainda outra concretização, gomas gelana com baixa quantidade de acila e alto desempenho são usadas como o principal componente estrutural em geléias líquidas para conferir a estrutura de gel quebradiço característica.

Outra concretização da invenção prevê o uso de gomas gelana de alto desempenho em combinação com outros hidrocolóides gelifícantes, tal como em sistemas de gel de gel de sobremesa baseado em água, para conferir uma textura de gel desejável. Os hidrocolóides gelifícantes geralmente usados com gomas gelana incluem, sem a isto se limitar, sistemas de goma alfarroba/carragena, sistemas de carragena/konjac, e sistemas de goma allfarroba/goma xantana.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir fornecem ilustrações da presente invenção e não devem ser interpretados erroneamente como uma limitação do âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1

Clarificação Enzimática, Recuperação do Produto e Análise de Força de Gel por Medidos Curdmeter a 0,1% 4500 L de caldo proveniente da fermentação (Lote No. GB05662) de uma linhagem deficiente em PHB de S. elodea foram aquecidos a uma temperatura de 50°C e misturados com agitação mecânica. Com mistura contínua, 200 ppm de sulfito de sódio, 100 ppm de Lisozima e 250 ppm de EDTA dissódico foram adicionados ao fermentador. Os reagentes foram misturados continuamente por duas horas enquanto a temperatura do fermentador foi controlada para manter a temperatura elevada. Em seguida, 250 ppm de dodecil sulfato de sódio foram adicionados ao caldo do fermentador e agitados por uma hora. Em seguida, 1000 ppm da enzima protease foram adicionados ao caldo de fermentação e misturados com o caldo de fermentação por 3 horas. Adicionou-se hidróxido de potássio ao caldo para obter um pH de 11,34 de modo a desacilar o polissacarídeo.

O caldo foi recuperado por aquecimento a 100°C, ajustando o pH para 5,59 com ácido sulfúrico e precipitando com três volumes de uma mistura azeotrópica de isopropanol/água para um volume de caldo de fermentação tratado. A fibra precipitada foi seca em um secador de bandeja e moída até um pó fino. Uma amostra de um grama do pó seco foi reconstituída em 950 mL de água purificada à temperatura ambiente. O pó foi disperso por mistura a 600 rpm por cerca de 2 minutos. O béquer contendo a amostra foi colocado em banho-maria mantido a aproximadamente 100°C. A mistura da amostra foi continuada até a amostra atingir 90°C. A agitação foi então continuada por 10 minutos adicionais. Em seguida, adicionaram-se 10 mL de lactato de cálcio 61,6 g/L à amostra quente, agitando por um minuto adicional. A amostra foi então ajustada até um peso de solução total de 1000 g pela adição de água quente purificada. A amostra foi misturada por um minuto adicional e então despejada em um copo de geléia e vedada com uma tampa. A amostra foi então colocada em banho-maria a 8°C por cerca de duas horas.

A força de gel foi medida em um Neo Curdmeter®, Modelo ME-303. Para esta medição uma mola de 100 gramas, uma vara de extensão, um êmbolo de 5,6 mm e um peso de célula de carga de 100 gramas foram utilizados conforme descrito no manual de operação do Neo Curdmeter®. Para esta amostra, a força de gel em gramas, medida pelo curdmeter a 0,1%, foi de 317 g/cm2.

EXEMPLO 2

Clarificação Enzimática, Recuperação do Produto e Análise do Perfil de Textura 4500 L de caldo proveniente da fermentação (Lote No. GB05443) de uma linhagem deficiente em PHB de S. elodea foram aquecidos a uma temperatura de 50°C e misturados com agitação mecânica. Com mistura contínua, 200 ppm de sulfito de sódio, 100 ppm de Lisozima e 250 ppm de EDTA dissódico foram adicionados ao fermentador. Os reagentes foram misturados continuamente por duas horas enquanto a temperatura do fermentador foi controlada para manter a temperatura elevada. Em seguida, 250 ppm de dodecil sulfato de sódio foram adicionados ao caldo do fermentador e agitados por uma hora. Em seguida, 1000 ppm da enzima protease foram adicionados ao caldo de fermentação e misturados com o caldo de fermentação por 3 horas. Adicionou-se hidróxido de potássio ao caldo para obter um pH de 11,13 de modo a desacilar o polissacarídeo.

O caldo foi recuperado por aquecimento a 100°C, ajustando o pH para 5,51 com ácido sulfúrico e precipitando com três volumes de uma mistura azeotrópica de isopropanol/água para um volume de caldo de fermentação tratado. A fibra precipitada foi seca em um secador de bandeja e moída até um pó fino. Uma amostra de 1,5 grama do pó seco foi reconstituída em 305 g de água deionizada e deixada misturar à temperatura ambiente com agitação a 800 rpm por um minuto. A mistura foi aquecida a 90°C, após o que a fonte de calor foi desativada, e a mistura foi agitada por um minuto. Em seguida, 3 mL de solução estoque de cloreto de cálcio a 0,6 M foram adicionados e agitados por um minuto adicional. O peso da mistura foi levado até 301 g com água deionizada pré-aquecida e agitada novamente por 30 segundos. As bolhas de ar na superfície foram removidas com uma colher, e a solução foi despejada em anéis de Análise de Perfil de Textura (“TPA”) cobertos com graxa, que foi deixado durante a noite para gelifícar-se.

O gel foi então testado por TPA (Sanderson, G.R. e col., The Texture of Gellan Gum Gels, Gums and Stability for the Food Industry, 4:219-227 (1988)), que é um teste de compressão de géis livres. As amostras foram comprimidas em 20% de sua altura original a uma taxa de 2 polegadas/minuto duas vezes. O módulo, dureza, fragilidade e elasticidade foram medidos. A medição de dureza foi a força máxima durante o primeiro ciclo de compressão e representa o desempenho de gelificação (força de gel) da amostra. Mediu-se uma dureza TPA de 25,7 lb (11,6 kg).

EXEMPLO 3

Clarificação Enzimática, Recuperação do Produto e Medição da Viscosidade Quente 4500 L de caldo proveniente da fermentação (Lote No. GB05341) de uma linhagem deficiente em PHB de S. elodea foram aquecidos a uma temperatura de 50°C e misturados com agitação mecânica. Com mistura contínua,200 ppm de sulfito de sódio, 100 ppm de Lisozima e 250 ppm de EDTA dissódico foram adicionados ao fermentador. Os reagentes foram misturados continuamente por duas horas enquanto a temperatura do fermentador foi controlada para manter a temperatura elevada. Em seguida, 250 ppm de dodecil sulfato de sódio foram adicionados ao caldo do fermentador e agitados por uma hora. Em seguida, 1000 ppm da enzima protease foram adicionados ao caldo de fermentação e misturados com o caldo de fermentação por 3 horas. Adicionou-se hidróxido de potássio ao caldo para obter um pH de 11,48 de modo a desacilar o polissacarídeo.

O caldo foi recuperado por aquecimento a 100°C, ajustando o pH para 5,4 com ácido sulfúrico e precipitando com três volumes de uma mistura azeotrópica de isopropanol/água para um volume de caldo de fermentação tratado. A fibra precipitada foi seca em um secador de bandeja e moída até um pó fino. Uma amostra de 3,0 gramas do pó seco foi lentamente reconstituída em um béquer contendo 300 mL de água deionizada, durante agitação em banho-maria a 90°C. O béquer quente foi pesado em uma balança, e o conteúdo da solução foi levado até 300 gramas com água deionizada e misturado por 20 segundos. Usando uma seringa de 10 mL, 8 mL da solução foram injetados no pequeno copo adaptador de amostra de um viscômetro Brookfield LV com uma camisa de água conectada ao banho-maria quente. Usando o fuso #18, que foi pré-aquecido no banho-maria, a viscosidade quente a 90°C da goma gelana a 1% foi medida em um viscômetro com velocidade de 12 rpm (a rpm foi ajustada de modo que a medição da viscosidade ficasse na faixa). Mediu-se uma viscosidade quente de 239 cP. Acredita-se que a viscosidade quente esteja relacionada ao peso molecular, e, portanto, ao desempenho de gelificação, da amostra de polissacarídeos.

EXEMPLO 4 Comparação da Força de Gel Medida por Curdmeter a 0,1% do Kelcogel® e das Gomas Gelana de Alto Desempenho

Uma série de lotes de fermentação de S. elodea de 4500 litros foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo 1, exceto que o pH de desacilação alcançado após a adição de hidróxido de potássio variava de lote para lote. O caldo de fermentação tratado foi recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A força de gel medida em curdmeter a 0,1% foi medida como descrito no Exemplo 1. O número do lote de fermentação, o pH de desacilação e a força de gel medida em curdmeter a 0,1% são apresentados na Tabela 1, junto com três lotes de goma gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis (Kelcogel®) para comparação. Os dados mostram que as forças de gel medidas em curdmeter a 0,1% são significativamente maiores nos lotes experimentais.Tabela 1. Comparação da Força de Gel

EXEMPLO 5 Análise do Perfil de Textura do Kelcogel®e das Gomas Gelana de Alto Desempenho

Uma série de lotes de fermentação de S. elodea de 4500 litros foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo 1, exceto que o pH de io desacilação alcançado após a adição de hidróxido de potássio variava de lote para lote. O caldo de fermentação tratado foi recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A Análise do Perfil de Textura (“TPA”) foi medida conforme descrito no Exemplo 2. O número do lote de fermentação, o pH de desacilação e a dureza TPA (1b.) são apresentados na Tabela 2, junto com três lotes de goma gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis (Kelcogel®) para comparação. Os dados mostram que os valores de dureza TPA são 5 signifícativamente maiores nos lotes experimentais.Tabela 2. Comparação da TPA do Kelcogel®e das Gomas Gelana de Alto Desempenho

EXEMPLO 6 Comparação da Medição de Viscosidade io Quente do Kelcogel® e das Gomas Gelana de Alto Desempenho

Uma série de lotes de fermentação de S. elodea de 4500 litros foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo 1, exceto que o pH de 15 desacilação alcançado após a adição de hidróxido de potássio variava de lote para lote. O caldo de fermentação tratado foi recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A viscosidade quente foi medida conforme descrito no Exemplo 3. O número do lote de fermentação, o pH de desacilação e a viscosidade quente (centipoise) são apresentados na Tabela 3, junto com três lotes de goma 5 gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis (Kelcogel®) para comparação. Os dados mostram que os valores de viscosidade quente a 90°C da goma gelana a 1% são significativamente maiores nos lotes experimentais.Tabela 3. Comparação da Viscosidade Quente do Kelcogel® e das Gomas Gelana de Alto Desempenho

EXEMPLO 7 Efeito do pH de Desacilação sobre a Força de Gel medida em Curdmeter a 0,1%

Uma série de lotes de fermentação de S. elodea de 4500 litros foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo I, exceto que o pH de desacilação variou durante a recuperação do lote por meio da 5 modificação dos níveis de adição de hidróxido de potássio. Após a desacilação, o caldo de fermentação tratado e desacilado foi recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A força de gel medida em curdmeter a 0,1% foi medida como descrito no Exemplo 1. O número do lote de io fermentação, o pH de desacilação e a força de gel medida em curdmeter a 0,1% são mostrados na Tabela 4. Os dados mostram que, geralmente, uma força de gel medida em curdmeter maior é obtida à medida que o pH de desacilação é diminuído. Tabela 4. Correlação entre o pH deDesacilação e a Força de Gel

EXEMPLO 8 Efeito do pH de Desacilação sobre a Dureza TPA e a Viscosidade Quente

Uma série de lotes de fermentação de S. elodea de 4500 litros foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo I, exceto que o pH de desacilação variou durante a recuperação do lote por meio da modificação dos níveis de adição de hidróxido de potássio. Após a desacilação, o caldo de fermentação tratado e desacilado foi recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A dureza TPA e a viscosidade quente foram medidas conforme descrito nos Exemplos 2 e 3, respectivamente. O número do lote de fermentação, o pH de desacilação, a dureza TPA e a viscosidade quente são apresentados na Tabela 5. Os dados mostram que valores de dureza TPA tipicamente maiores e viscosidades quentes a 90°C para goma gelana a 1% são alcançados à medida que o pH de desacilação é diminuído.Tabela 5. Correlação Entre o pH de Desacilação e a Dureza TPA e as Viscosidades Quentes

EXEMPLO 9 Medições de Peso Molecular Reativo por Cromatografia de Permeação em Gel/Espalhamento de Luz Laser em Ângulo Múltiplo (“GPC/MALLS”)

Soluções estoque aquosas diluídas do Kelcogel® comercialmente disponível e das gomas gelana de alto desempenho da presente invenção foram preparadas dissolvendo 0,20 grama da amostra de gelana em 200 mL de água deionizada junto com 0,01 grama de ácido etilenodiaminotetraacético (“EDTA”). As soluções foram aquecidas a 50°C, resfriadas e então diluídas até a concentração escolhida (gelana a 0,033 a 0,050%) em cloreto de tetrametil amónio a 25 mM, que foi anteriormente filtrado através de um filtro de 0,2 micron.

O sistema GPC/MALLS consistia de um controlador Waters 600, uma bomba HPLC Water 610, um autoamostrador Waters 717+, uma série de duas colunas GPC (uma coluna Waters Ultrahydrogel 2000 de cm e uma coluna Linear Waters Ultrahydrogel de 30 cm), um fotômetro a laser DAWN DSP (Wyatt Technology Corp.. Santa Barbara, CA) e um refratômetro diferencial Waters 410 (todos os produtos Waters são da Waters Corp,, Milford, MA). Em seguida, 0,10 mL das amostras foi injetado no fluxo eluente (cloreto de tetrametilamônio 25 mM a 0,50 mL/min) e foi separado com base no tamanho molecular pelas colunas de cromatografia por exclusão de tamanho. A medida que a amostra foi eluída da coluna, o peso molecular relativo e os perfis de concentração foram determinados pelos detectores de espalhamento de luz e índice refrativo. Um índice de incremento de refração (dn/dc) de 0,145 foi utilizado para determinar a concentração da amostra (e o peso molecular relativo) em função do volume de eluição. Esse valor foi escolhido com base nos valores relatados na literatura (vide Paoletti e coli., Carbohydrate Polymers. 15:171 (1991)) e que são típico para polissacarídeos em soluções salinas aquosas.

Os pesos moleculares peso médio relativo (“Mw”) e número médio (“Mn”) foram calculados usando uma extrapolação linear dos detectores de espalhamento de luz #8 a 16. Os pesos moleculares peso médio e número médio das três amostras de goma gelana Kelcogel® comercial tiveram sua média calculada para fornecer o peso molecular relativo de controle, ao qual foi atribuído um valor de 1,0. Isso forneceu valores normalizados para comparar os lotes experimentais com o produto comercial. Os resultados do peso molecular relativo são apresentados na Tabela 6. Os resultados mostram que, por essa metodologia, as amostras de Kelcogel® comercialmente disponíveis possuem pesos moleculares significativamente inferiores às amostras das gomas gelana com baixa quantidade de acila de alto desempenho da presente invenção. Os dados indicam que a média Mw das amostras de goma gelana de baixa quantidade de acila de baixo desempenho foi de 1,83 vezes a média das amostras de goma gelana de baixa quantidade de acila comercialmente disponíveis usadas como controle. Tabela 6. Medições dos Pesos Moleculares Relativos por GPC/MALLS

EXEMPLO 10 Medições do Peso Molecular Relativo por Microscopia de Força Atômica (“AFM”)

Soluções de goma gelana a 0,1% foram preparadas hidratando 0,1 g de gelana em 100 mL de água 15 deionizada e aquecendo-a a 50°C. Essas soluções estoque foram diluídas adicionalmente com água deionizada para medições AFM. Alíquotas das soluções de gelana a 0,1% foram retiradas usando uma pipeta de 10 μm e diluídas ou com 10 mL ou 20 mL de água deionizada. 25 μ dessas soluções de gelana diluídas (0,5 ppm e 1,0 ppm) foram borrifadas sobre superfícies de mica recém-clivadas e secos em estufa a vácuo a aproximadamente 50°C por 30 minutos.

As amostras secas foram representadas em imagem usando um Nanoscope® Ilia (Vceco Instruments Inc., Woodbury. NI). Um estágio “J” de 200 μL foi usado no Modo Intermitente (modo de contato intermitente) com uma ponta de sílica causticada no modo intermitente (“TESP”). Uma série de pelo menos dez varreduras de 5 μL por 5 μL foi coletada para cada amostra em várias localizações por toda a superfície da mica. Os comprimentos de contorno da cadeia de gelana foram medidos para cada amostra usando pelo menos duas imagens de varredura representativas de 5 μL por 5 μL. Os comprimentos de contorno de aproximadamente 200 moléculas foram medidos para cada amostra para gerar médias e distribuições de peso molecular relativo.

Duas amostras de Kelcogel® comercialmente disponíveis (Lotes N° 5G3908A e 5G3928A) e uma amostra da goma gelana de alto desempenho da presente invenção (Lote N~ GB05810-3) foram analizados quanto ao peso molecular por AFM. Os comprimentos de contorno das duas amostras de goma gelana Kelcogel® comerciais tiveram sua média calculada para obter o peso molecular relativo do controle, ao qual foi atribuído um valor de 1,0. Isso forneceu valores normalizados para comparar os lotes experimentais com o produto comercial. Os resultados do peso molecular relativo são apresentados na Tabela 7. A coluna “n” se refere ao número de moléculas utilizadas para medir o comprimento de contorno. Os resultados da AFM servem como uma segunda técnica de peso molecular independente que reforça os resultados da GPC/MALLS, confirmando que a nova goma gelana com baixa quantidade de acila de alto desempenho da presente invenção tem um peso molecular significativamente maior do que a goma gelana com baixa quantidade de acila comercialmente disponível.Tabela 7 Análise do Peso Molecular Relativo das Gomas Gelanas por AFM

EXEMPLO 11 Clareza e Teor de Acilas das Gomas Gelana com Baixa Quantidade de Acilas de Alto Desempenho.

Uma série de lotes de fermentação de 4500 litros de uma linhagem deficiente em PHB de S. elodea foram clarificadas usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo I. O caldo de fermentação foi desacilado com hidróxido de potássio e então recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo I. Para medir a clareza, 3 g de pó seco foram reconstituídos até uma concentração de 1% de água deionizada de acordo com o procedimento no Exemplo 3. O gel quente reconstituído foi despejado em um tubo, e o percentual de transmitância foi medido em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 490 nm. O percentual de transmitância é apresentado na Tabela 8.

Para medir o teor de acilas, 1,5 g do pó seco foi agitado em vórtice por 15 segundos com 15 g de álcool isopropílico a 60% (“IPA”). Após a agitação em vórtice, o líquido foi removido por centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos e decantação. Isso foi repetido cinco vezes com IP A 60% para remover sais ácidos orgânicos livres e, finalmente, com 15 g de IPA 99% para facilitar a secagem da amostra. Após a decantação final, a amostra foi recuperada do tubo centrífugo e seca durante a noite em uma estufa a vácuo a 50°C. Em seguida, 25 mg de pó seco foram reconstituídos em 5 mL água deionizadora a 80°C. A amostra foi então hidrolizada em ácido trifluoroacético a 0,5 M (“TFA”) durante a noite a 100°C. A amostra hidrolizada foi diluída em 25 mL e filtrada através de um filtro de seringa do tipo disco de náilon 0,45 μL. Os ácidos orgânicos no líquido filtrado foram quantificados usando um sistema HPLC da Dionex Corporation (Sunnyvale, CA) equipado com uma coluna de exclusão iônica ionPac® ICE-AS1 e um detector de condutividade. O percentual do teor de acilas é apresentado na Tabela 8.Tabela 8. Clareza e Teor de Acilas das Gomas Gelana de Baixa Quantidade de Acila de AltoDesempenho

EXEMPLO 12 Clareza e Teor de Acilas das GomasGelana Parcialmente Desaciladas de Alto Desempenho.

Dois lotes de fermentação de 4500 litros de S.elodea (usando um mutante com baixa produção de PHB) foram clarificados usando o processo de tratamento químico/enzimático do Exemplo 1. O caldo de fermentação foi suavemente desacilado com hidróxido de potássio e então recuperado em pó seco de acordo com o procedimento do Exemplo 1 (Lote No. GB05341 foi desacilado em duas condições de pH diferentes). O pó seco foram reconstituído até uma concentração de 1% em água deionizada de acordo com o procedimento no Exemplo 3. A solução de goma gelana 5 quente reconstituída foi despejada em um tubo, e o percentual de transmitância foi medido em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 490 nm. Uma amostra de pó seco também foi reconstituída em água deionizada, hidrolizada em TFA 0,5 M a uma temperatura de 10 100°C por 18 horas, e os constituintes glicerato e acetato da goma hidrolizada foram medidas por HPLC. O pH de desacilação, o percentual de transmitância e o percentual do teor de acilas são apresentados na Tabela 9.Tabela 9. Clareza e Teor de Acilas das 15 Gomas Gelana Parcialmente Desaciladas de Alto Desempenho.

EXEMPLO 13 Uso da Goma Gelana com Baixa Quantidade de Acilas de Alto Desempenho para Melhorar a Estabilidade Térmica dos Géis de Sobremesa Durante a Pasteurização.

A eficácia relativa de três amostras de goma gelana de baixa quantidade de acila de alto desempenho (Lotes N- GB06612-8, GB06405-5 e GB06622-6) e uma amostra de Kelcogel® comercial (Lote N° 5G3928A) em oferecer estabilidade térmica a um sistema de gel de sobremesa (vide a formulação na Tabela 10) foi comparada usando um Reômetro Bohlin CVO (Malvern Instruments Ltd.. Worcestershire, Reino Unido). O módulo elástico (“G”’) de uma solução de gel de sobremesa quente foi medida usando o reômetro com uma geometria de cone e placa de 4 cm 4o sob deformação de 0,15 e 1 Hz à medida que foi sendo resfriada de 80 °C para 20 °C a 5°C/min. O G’ do gel foi então medido enquanto estava sendo reaquecido de 20°C param 90°C a 5°C/min. Um G’ mínimo de 5 Pa durante a fase de reaquecimento foi anteriormente determinado como necessário para que o sistema de gel de sobremesa mantenha sua integridade durante um processo de pasteurização comercial (85 °C por 30 min). Cada amostra de goma gelana foi testada a três concentrações diferentes entre 0,0125% e 0,025%, e o G’ mínimo durante o reaquecimento de cada amostra foi traçado graficamente em função da concentração de gelana. O gráfico foi então usado para determinar a concentração de gelana necessária para obter um G’ de 5 Pa usando interpolação. A eficácia relativa em proporcionar estabilidade térmica, conforme expressa como a concentração necessária para obter um G’ de 5 Pa, para cada amostra testada, é ilustrada na Tabela 11. Os resultados indicaram que as três gomas gelana de alto desempenho, na média, necessitavam de cerca de 24% menos do que a quantidade de Kelcogel® 5 para conferir estabilidade térmica similar ao sistema de gel de sobremesa.Tabela 10. Formulação de Gel de Sobremesa para Avaliação da Estabilidade Térmica

Tabela 11. Eficácia Relativa das Amostras de Goma Gelana em Proporcionar Estabilidade Térmica a um Sistema de Gel de Sobremesa

EXEMPLO 14 Uso da Goma Gelana com Baixa Quantidade de Acila de Alto Desempenho em Geléias Líquidas

Uma amostra de goma gelana de alto desempenho (Lote N~ GB06623-7) foi usada a concentrações entre 0,6% e 0,1% em uma geléia líquida e comparada com um controle feito com 0,1% de uma amostra de Kelcogel® comercial (Lote N° 5G3928A). A formulação apresentada na Tabela 12 foi preparada combinando a goma gelana e citrato de sódio e adicionando a mistura combinada a água Dl sob agitação. Em seguida, a mistura foi aquecida a 90°C. Em seguida, os ingredientes restantes foram adicionados e misturados por 1 minuto a 90°C. Em seguida, a mistura foi ajustada para a perda de água devido à evaporação com água Dl quente. Sacos plásticos de geléia líquida revestidos com alumínio foram preenchidos com solução quente e selados. Finalmente, os sacos de geléia foram pasteurizados em banho-maria a 85°C por 30 minutos e então resfriados à temperatura ambiente com água corrente fria corrente de torneira.Tabela 12 Formulação da Geléia Líquida

A geléia líquida foi avaliada quanto à sinerese (% de água separada do gel) e textura do gel (por um quadro de degustação composto por três membros) após 1 semana de estocagem à temperatura ambiente. Baseado na sinerese e nos resultados de avaliação sensorial apresentados na Tabela 13, uma amostra com uma concentração de goma 5 gelana de alto desempenho entre 0,06% e 0,07% resultaria numa geléia líquida similar ao controle formado com Kelcogel® 0,1%. Portanto, seria necessária uma quantidade muito menor da goma gelana de alto desempenho se comparado à goma gelana atualmente disponível.Tabela 13. Sinerese e Avaliação Sensorial da Geléia Líquida Aquosa

EXEMPLO 15 Uso da Goma Gelana com Baixa Quantidade de Acila de Alto Desempenho em uma Geléia 15 de Confeito

Uma amostra de Kelcogel® comercialmente disponível (Lote N~ 5G3901A) e uma amostra da goma gelana de baixa quantidade de acila e alto desempenho da presente invenção (Lote n° GB06405-5) foram comparadas em uma formulação de confeito típica, que é apresentada na Tabela 14. A formulação foi preparada fervendo xarope de milho, xarope de milho com alto teor de frutose e água (A) em uma caldeira. Açúcar, goma gelana e fosfatos (B) foram mesclados a seco e então dispersos na caldeira enquanto misturando-os. A mistura foi levada a um recipiente enquanto misturando-a e então fervida por 2 a 3 minutos para assegurar a hidratação da goma. Adicionou-se açúcar (C) gradualmente para evitar resfriar o lote, dissolvendo-o por fervura. A mistura foi então reduzida a solúveis com refratômetro de 79% enquanto misturando-a. Em seguida, soluções de ácido e citrato (D) foram combinadas (sabor e cor também poderiam ter sido adicionados, se desejado) enquanto misturando-as. Finalmente, a mistura foi imediatamente depositada em moldes de amido preparados e mantidos a 30°C a 35°C (86°F a 95°F) por 2 a 3 dias até atingir 82% a 83% de sólidos medido no refratômetro.Tabela 14. Formulação da Geléia de Confeito

Quatro ensaios foram realizados: um controle em Kelcogel® a 0,8% e três com gomas gelana de alto desempenho a níveis de concentração a 0,8%.0,6% e 0,4%. As amostras foram moldadas com amido na forma de discos com diâmetro de 25 mm e altura de 10 mm. As amostras acabadas foram testadas quanto à dureza TPA sob 70% de compressão. Os valores relatados são a dureza TPA média de 5 amostras por ensaio, mais ou menos um desvio padrão, e são ilustrado na Tabela 15.Tabela 15. Avaliação TPA da Geléia de Confeito

Na concentração controle (0,8%), a goma gelana de alto desempenho produziu um valor de dureza TPA médio 233% maior do que o da goma gelana Kelcogel®. Além disso, a goma gelana de alto desempenho a uma concentração de 0,4% atinge uma dureza TPA equivalente à da concentração controle (0,8%) de goma gelana Kelcogel®. Isso indica que a goma gelana Kelcogel® pode ser substituída por cerca de 50% menos da goma gelana de alto desempenho em geléias de confeito.

EXEMPLO 16 Uso da Goma Gelana com Baixa Quantidade de Acila de Alto Desempenho para Proporcionar Estabilidade Térmica em um Confeito Gomoso

Uma amostra de Kelcogel® comercialmente disponível (Lote N° 6A5307A) e uma amostra da goma gelana de alto desempenho da presente invenção (Lote n° GB06622-8) foram comparadas em uma formulação de confeito gomosa típica, apresentada na Tabela 16. A formulação foi preparada primeiramente formando uma pré- solução de gelatina de água e gelatina (a) e então mantendo a solução a 60°C (140°F) por 3 a 4 horas para se dissolver. Enquanto isso, xarope de milho, água e solução de citrato de sódio (B) foram fervidas em uma caldeira. Em seguida, açúcar e goma gelana (C) foram mesclados a seco e dispersos na caldeira enquanto misturando-os. A mistura foi levada a um recipiente enquanto misturando-a e fervida por 2 a 3 minutos para assegurar a hidratação da goma. Em seguida, adicionou-se açúcar (D) gradualmente para evitar resfriar o lote, dissolvendo-o por fervura. A mistura foi então reduzida a 5 sólidos solúveis em refratômetro a 85%-86% enquanto misturando-a. Em seguida, a pré-solução de gelatina (A) foi adicionada e misturada vigorosamente. Em seguida, o ácido (E) com sabor e cor (conforme desejado) foi adicionado enquanto misturando-o. A mistura continha cerca de 77% io sólidos solúveis em refratômetro. Finalmente, a mistura foi imediatamente depositada em moldes de amido preparados e mantidos a 25°C a 30°C (77°F a 86°F) por 2 a 3 dias até atingir 81% a 82% de sólidos solúveis em refratômetro.Tabela 16. Formulação de Confeito Gomoso

Cinco ensaios foram realizados: um sem nenhuma goma gelana (o “controle gelatina”), dois com Kelcogel® (0,24% e 0,12%), e dois com goma gelana de alto desempenho (0,12% e 0,06%). As amostras foram moldadas 5 com amido na forma de discos com diâmetro de 25 mm e altura de 10 mm. As amostras individuais acabadas foram acondicionadas em sacos de polipropileno selados a quente orientados impermeáveis a vapor e testadas quanto à estabilidade térmica em uma estufa de laboratório a 45°C. A io medida que as amostras se deformavam e fundiam nesta temperatura elevada, seu diâmetro aumentava. Após 8 horas, os diâmetros médios das amostras foram medidos, e o aumento nos diâmetros médios das amostras foi calculado.Os resultados são apresentados na Tabela 17.Tabela 17. Avaliação da Estabilidade Térmica dos Confeitos Gomosos

Comparado com o controle gelatina, a goma gelana de qualquer um dos tipos e a qualquer concentração avaliada reduziu a quantidade do aumento do diâmetro médio significativamente; no entanto, um aumento do diâmetro médio de 10% foi considerado, por observação, como sendo o nível máximo permissível para considerar a amostra termicamente estável de maneira aceitável. Uma amostra de Kelcogel® a 0,24% atingiu estabilidade térmica adequada (isto é, um aumento de diâmetro médio de <10%). A goma gelana de alto desempenho, em comparação, atingiu estabilidade térmica adequada a uma concentração de apenas 0,06%. Por essa medição da estabilidade térmica, o Kelcogel® pode ser substituído pela goma gelana de alto desempenho a uma concentração cerca de 75% inferior em confeitos gomosos.

EXEMPLO 17 Uso da Goma Gelana com Baixa Concentração de Acila de Alto Desempenho como Modificador de Textura em Géis de Sobremesa Aquosos

Dois géis de sobremesa são formados: O Gel A compreende Kelcogel® e o Gel B compreende goma gelana de baixa quantidade de acila de alto desempenho. Ambos adicionalmente compreendem goma xantana e goma alfarroba. As formulações de gel de sobremesa são apresentadas na Tabela 18. Embora o Gel A tenha uma quantidade maior de goma gelana do que o Gel B, tanto o Gel A quanto o Gel B possuem texturas de gel muito 5 similares e qualidades alimentícias. Dessa forma, utiliza-se menos da goma gelana de baixa quantidade de acila de alto desempenho para obter o mesmo efeito que a goma gelana Kelcogel®.Tabela 18. Comparação dos Géis de io Sobremesa Aquosos Contendo Kelcogel®

Embora a presente invenção seja descrita acima em relação ao que é considerado atualmente como sendo suas concretizações preferidas, deve-se entender que a invenção não se limita ao que foi descrito acima. Em vez 15 disso, a invenção pretende abranger várias modificações e configurações equivalentes incluídas dentro do espírito e escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Processo para preparação de uma goma gelana com baixo teor de acila caracterizado por compreender as etapas de: a. fermentar uma cepa de Sphingomonas elodea deficiente em PHB em um caldo de fermentação; b. clarificar o caldo de fermentação por um processo químico/enzimático compreendendo as etapas de: i. aquecer o caldo de fermentação a uma temperatura de cerca de 30°C a cerca de 70°C; ii. tratar o caldo de fermentação com ácido ascórbico, eritorbato de sódio, metabisulfito de sódio, metabisulfito de potássio, bisulfito de potássio, dióxido de enxofre, hidroxianisol butilado, cisteína ou sulfito de sódio em combinação com um ou mais agentes quelantes e uma enzima lisozima; iii. tratar o caldo de fermentação da etapa ii com um ou mais surfactantes; e iv. tratar o caldo de fermentação da etapa iii com uma enzima protease para obter um caldo de fermentação clarificado; c. desacilar o caldo de fermentação clarificado com um agente cáustico para obter uma goma gelana tendo um teor total de acila de 2,0% ou menos; e d. precipitar a goma gelana do caldo de fermentação, sendo que a goma gelana precipitada tem uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,2%, de pelo menos cerca de 300 g/cm2.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da goma gelana precipitada ter uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de pelo menos cerca de 117 g/cm2.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da goma gelana precipitada ter uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de cerca de 117 g/cm2 a cerca de 400 g/cm2.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do antioxidante ser sulfito de sódio.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do agente quelante ser selecionado do grupo que consiste em tetraacetato de etilenodiamina dissódico, tetraacetato de etilenodiamina dipotássico, tetraacetato de etilenodiamina tetrassódico, tetraacetato de etilenodiamina tetrapotássico, ácido cítrico, citrato trissódico, citrato tripotássico, hexametafosfato de sódio, hexametafosfato de potássio, polifosfato de sódio, polifosfato de potássio, pirofosfato de sódio, pirofosfato de potássio, fosfato monossódico, fosfato monopotássico, fosfato dissódico, fosfato dipotássico, fosfato trissódico, fosfato tripotássico, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, uma resina catiônica de troca iônica, dicloridrato de etilenodiamina, diacetato de etilenodiamina, sal de lítio de etilenodiamina e diidroiodeto de etilenodiamina.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do agente quelante ser tetraacetato de etilenodiamina dissódico.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do agente quelante ser ácido cítrico.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do tensoativo ser selecionado do grupo que consiste em dodecil sulfato de sódio, monooleato de polioxietilenosorbitano, lecitina, monoglicerídeos, ésteres tartáricos de monoglicerídeos, monoglicerídeos fosfatados, monoglicerídeos lactilados, monoglicerídeos acetilados, monoglicerídeos succinilados, monoglicerídeos etoxilados, ésteres de sorbitano, polisorbatos, ésteres de poliglicerol, ésteres de sacarose, estearoil lactilato de sódio e ésteres de propileno glicol.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do tensoativo ser dodecil sulfato de sódio.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do agente cáustico ser selecionado do grupo que consiste em hidróxido de potássio, hidróxido de sódio e fosfato trissódico.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do agente cáustico ser hidróxido de potássio.

12. Goma gelana com baixo teor de acila caracterizada por ser preparada pelo processo conforme definido na reivindicação 1.

13. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender um teor total de acila de menos de cerca de 2,0%, sendo que a goma gelana tem uma força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, de pelo menos cerca de 117 g/cm2.

14. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato da força de gel medida com curdmeter, goma gelana a 0,1%, ser de cerca de 117 g/cm2 a cerca de 400 g/cm2.

15. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato da goma gelana reidratada a 1% em água ter uma transmitância de luz maior do que cerca de 60%.

16. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ter uma dureza, segundo Análise do Perfil de Textura, de pelo menos cerca de 4 kg (9 lb).

17. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ter uma viscosidade quente a 90°C, goma gelana a 1%, de pelo menos cerca de 25 cP.

18. Goma gelana com baixo teor de acila, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato da goma gelana reidratada a 1% em água ter uma transmitância de luz de pelo menos cerca de 60%.

19. Produto industrial caracterizado por compreender a goma gelana conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12, 13 e 18.

20. Produto industrial, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em bebidas, confeitos, gomas e geleias, alimentos fabricados, géis à base de água, recheios de torta, géis de sobremesa, glacês, iogurtes, pudins, cremes, leites gelificados e sorvetes.

21. Produto industrial, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em alimentos gelificados para animais de estimação, meios de cultura microbiana e tecidual, limpadores líquidos, pastas de dente, sabões e sabonetes líquidos, géis desodorantes, géis purificadores de ar e cápsulas macias.

22. Produto industrial, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato da goma gelana ser usada em uma concentração de cerca de 15% a cerca de 90% menor do que uma concentração de uma goma gelana com baixo teor de acila comercialmente disponível utilizada no produto industrial.

23. Produto industrial, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato da goma gelana ser utilizada em combinação com pelo menos um hidrocolóide gelificante selecionado do grupo que consiste em carragenina, goma de alfarroba, konjac e goma xantana.