JP2021510544A - 酵素により変性されたジェランガム - Google Patents
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Abstract
本発明は、ジェランガムを部分的に脱アシル化できるエステラーゼを用いて天然又は高アシルジェランガムを処理することを含む、部分的に脱アシル化されたジェランガムを調製するための方法に関する。
Description
本発明は、アシル置換の程度を変化させる酵素処理によりジェランガムの構造及び機能特性を変更する方法に関する。本発明は、更に、請求項に記載の方法により製造される部分的に脱アシル化されたジェランガム、並びに食品、医薬製剤、及びパーソナルケア製品における成分としての部分的に脱アシル化されたジェランガムの使用に関する。
ジェランガムは、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）（ＡＴＣＣ ３１４６１）によって合成される微生物の菌体外多糖である。ジェランガムポリマーの繰り返し単位（ＲＵ）は、Ｄ−グルコースの２つの残基と、Ｌ−ラムノースとＤ−グルクロン酸の各残基の１つとからなる四糖であり、以下の構造を有する［→３）−β−ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）−β−ｄ−ＧｌｃＡｐ（１→４）−β−ｄ−Ｇｌｃｐ（１→４）−α−ｌ−Ｒｈａｐ（１→］。天然の多糖は部分的にエステル化されており、１，３−Ｄ−Ｇｌｃ残基は、Ｃ−２でＬ−グリセレートに及び／又はＣ−６でアセテートに連結されている場合がある。Ｃ−２のグリセレートとＣ−６のアセテートの両方を有するジェランガムの繰り返し単位の化学構造の図が図１ａに示されている。
ジェランガムは非常に効果的なゲル化剤及び構造化剤であり、そのため食品業界にとって魅力的であることが分かっている。ジェランは非常に低濃度で使用され、これは冷却されるとゲル化し、細菌発酵によるその製造に起因する安定した品質と信頼できる供給量を有することが知られている。低濃度のジェランガムは、粒子の懸濁に非常に効率的な見掛け降伏応力を有する流体ゲルを形成する。加えて、高度な擬塑性流動のため、より大きい剪断速度で低い粘度が得られ、口当たりへの影響が低くなる。これらの機能の組み合わせのため、ジェランガムは、乳製品、飲料、ドレッシング、及びソースなどの用途に非常に有用である。
ジェランガム製品は、繰り返し単位当たり平均１個のグリセレート置換基と０．５個のアセテート置換基を有する、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）によって発現される天然型に類似した高アシル（ＨＡ）形態と、アシル置換基がアルカリ処理により完全に除去されている低アシル（ＬＡ）形態の、２つの形態で商業的に製造されている。
アシル基は、ゲル特性に大きな影響を及ぼす。ＨＡジェランは柔らかく、弾力性があり、脆くないゲルを生成する一方で、ＬＡジェランは硬く、弾力性がない、脆いゲルを生成する。ＬＡジェランのＸ線回折パターンは、これが３回対称の同軸二重らせんとして固体状態で存在することを示す（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＨＡジェランのらせん構造は、脱アシル化ポリマーのこの公知の固体状態の形状から推定するために、コンピューターモデリングによって最初に調査された（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。主な結論は、アセテート基は形状の変更なしでらせんの末端に存在するが、グリセレートの受け入れにはらせんの形状の変更が必要であるということである。更に、グリセレート置換基が主にジェランガムのらせん構造の安定化に関与し、ＨＡジェランの高いゲル化温度をもたらす一方で、アセテート置換基は、らせん端部にあることによりらせん間の凝集を立体的に妨げ、柔らかく弾力性のあるゲルをもたらすことが報告されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６）。
天然のジェランガムは理論上は繰り返し単位当たり１個のグリセレート置換基と０．５個のアセテート置換基を含むものの、入手可能な工業用ＨＡジェラン製品はこれより少ししか含まない（ＲＵ当たり約０．８個のグリセレートと０．４５個のアセテート、３つの異なる製造業者からの２２種のジェランガム製品から計算、結果は未発表）。天然のジェランガムは、約１３重量％のグリセレート基と約５重量％のアセテート基を含むと報告されている（特許文献１を参照のこと）。ジェランの機能性に対するアシル置換基の高い効果は、ＨＡ製品のアシルの量のわずかな変動であっても、利用性能に重要である可能性があることを示唆している。
Ｃａ２＋−結合によって媒介される、いわゆるエッグボックス構造を介してゲル形成を誘発できるペクチンの脱メチルエステル化によって例示されるように、他のハイドロコロイドへの個別の構造変化が機能性に影響を与えることも周知である。ペクチンは、ブロック状の、又はよりランダムに分布しているメチル化されたガラクツロン酸を有することができ、ブロック化の程度はペクチンの機能性に大きな影響を及ぼす可能性があり、そのため食品系におけるペクチンの挙動に大きな影響を及ぼす可能性がある（Ｒｅｍｏｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
これまでに、様々な程度でジェランガムをアシル化するために、様々なアプローチが行われてきた。弱塩基を用いた処理によるジェランガムの化学的脱アシル化は、特許文献２及び特許文献３、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）及びＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）に開示されている。ジェランガムのアシル化の程度の相違は、例えば、溶存酸素分圧又は増殖培地組成の変化を利用するなど、発酵中の条件を変更することによっても実現されてきた（Ｆｉａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）及びＤｒｅｖｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６））。
特許文献１には、ジェランガムを部分的に脱アシル化して、少量（０〜１重量％）のアセテート残基を有するが、グリセレート残基の一部又は大部分（３〜１２重量％）が保持されているジェランガムを得る方法が開示されている。天然のジェランガムを製造するためのＳ．エロディア（Ｓ．ｅｌｏｄｅａ）の発酵の後、２５〜４０℃で６〜１８時間、ＫＯＨでｐＨが調整され、次いでｐＨが６〜８に下げられる。得られる部分的に脱アシル化されたジェランガムは、弾力性がある脆くないゲルを形成できると報告されている。
また、生産微生物への遺伝子変化は、ジェランのアシル化の最終的な程度を変更する戦略として採用されてきた（特許文献４及びＪａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９８））。
ＨＡとＬＡのジェランガムをブレンドすることにより、様々なゲルテクスチャーを生成することができる。しかしながら、ＨＡとＬＡの形態の混合物は、個々の成分と一致する温度で２つの別個のコンホメーション転移を示すことが実証されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。
アセテート置換基は、ジェランのらせん間の相互作用に影響を与えることが知られている。アセテートが存在する場合、これは、イオンが媒介する相互作用を立体的にブロックすることにより、らせん間の凝集を阻害する。対照的に、アセテートは個々のジェランのらせんの形成と安定性にほとんど寄与せず、これは主にグリセレートの存在の影響を受ける（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。したがって、アセテートを特異的に除去すると、個々のらせんの高い安定性を保持するジェラン中間体が得られ、グリセレートの量が変化しないことに起因して高いゲル化温度が得られるものの、熱ヒステリシスなどの特性に影響を与えるらせん間相互作用の点で低アシルジェラン特性を有する。
酵素によるアセテート除去の高い特異性は、グリセレート含有量が対照の約１００％に保持されながらも酵素ＰＡＥ１２Ｂによってアセテートの段階的な除去が得られる本発明において示される。高温（７０℃）での処理と長いインキュベーション時間（２０時間）でのみ、グリセレートは部分的に除去される。このグリセレートの除去は、同じ条件で酵素なしでインキュベーションしたサンプルでもみられる。これは、グリセレートの除去が酵素を介して行われないことを示している。化学的脱アシル化を行う場合、アルカリ処理の特定の条件を選択すると、グリセレート又はアセテートのいずれかの除去に対する若干の特異性が得られることが示されている（特許文献５及びＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ １９９６）。しかしながら、この特異性は酵素的脱アシル化ほど完全ではない。特許文献５では、実施例２、３、及び４のアセテートが、アルカリ処理中に低温で特異的に除去されている。しかしながら、グリセレートの開始時点の量は約１１．３％であり、アルカリ処理中に約９％まで減少する。この減少は、開始時点のグリセレートの量の約２０％であり、化学的脱アシル化が本発明の酵素的方法を使用して得られるものほど特異的ではないことを示している。
本発明の目的は、単一のコンホメーション転移を有し、そのため単一の成分として挙動する製品を得るために、中間のアシルの量及び望ましい安定性を有するジェランガムを提供することである。
ペクチンに作用するエステラーゼは、ランダムな又はブロックごとの脱エステル化などの異なる作用機構を有していることが知られており、これはひいては機能特性に対して大きく異なる影響を与えるペクチンの変性をもたらす。本発明に至る研究の間に、本発明者らは、ジェランに作用するエステラーゼが、酵素的脱アシル化により得られるジェラン中間体の追加の機能特性をもたらし得る作用機構において同様のタイプの差異を有し得ると考えた。
ＨＡジェラン又はＬＡジェランとして製造されるジェランガムは、ゲルテクスチャーの２つの対照的要素であり、そのため部分的に脱アシル化されたジェランガムは、幅広い特性を有する中間的なゲルテクスチャーを提供する可能性を有し得る。アシル化の程度を制御できると、それぞれに合った設定温度とレオロジー特性を備えたジェランガムを製造することができ、理想的には全てのゲルテクスチャーのために１種のハイドロコロイドが供給される。ジェランガムの分子構造を様々な食品用途の具体的な機能的ニーズに合わせることで、本発明は様々な新規な製品を提供することができる。これらの製品は、単独で使用されてもよく、或いは様々な食品系のブレンドの中に混ぜ合わされてもよい。
中間の程度にアシル化されたジェランガムを使用すると、硬くて脆いものから柔らかくて弾力性のあるものまでの幅広いテクスチャーを得ることができ、これは１つの多用途なハイドロコロイド成分を含む食品系の多様な機能をもたらす。これの価値はＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）によって示されており、この中でゼラチンのテクスチャー特性は部分的に脱アシル化されたジェランガムとよく一致した。
中間の程度にアシル化されたジェランガムを生成するための上述した戦略に対する別のアプローチは、酵素処理を採用することである。ポリマーからアセテート基及び／又はグリセレート基を特異的に除去できるエステラーゼで処理された高アシルの天然ジェランガムを使用することにより、アシル置換の程度を変更することができる。アシル基の酵素的除去は、化学的脱アシル化と比較してより制御し易いと考えられる。例えば、アセテート基と一部のグリセレート基の両方が除去されることになる米国特許第５１９０９２７号明細書に開示されている化学処理とは異なり、酵素を適切に選択することによってアセテート基のみ又はグリセレート基のみを除去できる場合がある。更に、酵素的脱アシル化は、ブロックごとの脱アシル化など、他のタイプの脱アシル化パターンを形成する可能性がある。加えて、酵素的脱アシル化は、化学的脱アシル化の場合でみられるようなジェランガムのポリマー長への影響があまりないことが分かっている。分子量はゲルの強度とテクスチャーに重要であり、そのため酵素的アプローチは、有益な特性を備えた新しいタイプの高分子量低アシルジェランガムを生み出すことができる。
したがって、本発明は、ジェランガムを部分的に脱アシル化できるエステラーゼを用いて天然又は高アシルジェランガムを処理することを含む、部分的に脱アシル化されたジェランガムを調製するための方法に関する。
別の態様では、本発明は、天然ジェランガムの分子量と比較して１０％未満減少した分子量を有する部分的に脱アシル化されたジェランガムに関する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の酵素により変性された部分的に脱アシル化されたジェランガムを含む食品に関する。
また別の態様では、本発明は、本明細書に記載の酵素により変性された部分的に脱アシル化されたジェランガムを含む医薬製剤に関する。
また別の態様では、本発明は、本明細書に記載の酵素により変性された部分的に脱アシル化されたジェランガムを含むパーソナルケア製品に関する。
以下の概略図（図２）から明らかなように、低アシルジェランガム（ＬＡ）と高アシルジェランガム（ＨＡ）はゲルテクスチャーのスケールのいずれかの端に位置し、他のゲル形成ハイドロコロイドはこれらの間に位置する。本発明の方法により中間の程度にアシル化されているジェランガムを形成できることから、１種類のハイドロコロイドで全範囲のテクスチャーにわたる選択肢を提供することができ、また現行のハイドロコロイドのポートフォリオでは利用できない特有のレオロジー特性を提供することができる。
図面を参照しつつ本発明を更に詳しく説明する。
ジェランガムを脱アシル化できる酵素はこれまでに述べられていないため、そのような活性についてのスクリーニングを、一連の選択した酵素を使用して行った。候補のエステラーゼ酵素は２つの基準：多糖を脱アシル化できる及び／又は好熱性微生物から合成できることが注釈されているか又は示されている、並びに高温（約７０℃の高アシルジェランガムのゲル化温度より上の温度）で活性を有することが知られている、に基づいて選択した。
スクリーニングアッセイは複雑性を増やしながら行った。最初に、一般的なエステラーゼ基質である４−ニトロフェニルアセテートを使用してエステラーゼ活性を分析し、選択した候補酵素に最適なｐＨ及び温度を得た。次に、反応中のＨＡジェランガムのゲル化を回避するために超音波処理によって予め分解したジェランガムで酵素の活性について試験した。分析は、ＵＶ法（Ｍｅｇａｚｙｍｅｓ、Ｋ−ＡＣＥＴ）又はＮＭＲによる酢酸の定量を使用して行った。最後に、再水和した天然ジェランガムにおいて選択した酵素の活性を試験し、その際、酵素処理後に残っているアセテートとグリセレートを定量化した。結果として、ジェランガムは、選択された酵素と共に一定時間インキュベーションされ、その後、加水分解によってより小さいオリゴマーへと消化された。グリセレートとアセテートの量は、オリゴマーのＬＣ−ＭＳを使用して決定した。
スクリーニング手順で見出される適切なエステラーゼは、ジェランガムを脱アセチル化できるものであり、より具体的には、炭水化物エステラーゼファミリーのアセチルエステラーゼ、特にはペクチンアセチルエステラーゼである。
エステラーゼは、例えば好熱性微生物由来であってもよく、また約４０℃を超える温度、好ましくは約７０〜７５℃の温度などの６５℃〜８０℃の範囲の温度で酵素活性を有する。そのようなエステラーゼの例は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）由来のペクチンアセチルエステラーゼ（ＰＡＥ１２Ｂ、ｃａｔ．ｎｒ．ＣＺ００３７１、ＮＺＹｔｅｃｈ）である。
本発明の方法では、エステラーゼによる処理は、５．５〜７．５の範囲のｐＨ、好ましくは６．０〜６．５のｐＨなどの６．０〜７．０の範囲のｐＨで適切に行なうことができる。エステラーゼ処理が行われる温度は、好ましくは４０〜８０℃の範囲、より好ましくは６５〜７５℃の範囲などの６０〜７５℃の範囲である。例えば、酵素ＰＡＥ１２Ｂは８０℃より高い温度で活性を有する幅広い最適温度を有しており、そのため高アシルジェランのゲル化温度（約７０℃）よりも高い温度で使用することができる。
エステラーゼＰＡＥ１２Ｂを用いた酵素処理を使用して部分的に脱アシル化されたジェランガムを得るための最適条件の詳細な分析を行った。これにより、中間の程度のアセテート置換基を含むジェランガムサンプルを生成することができた。ＰＡＥ １２Ｂを使用した酵素的脱アセチル化に最適であることが判明した反応条件は、ｐＨ６．０〜６．５、７０〜７５℃であった。このｐＨを上回るとグリセレートの加水分解を含む化学的脱アシル化が起こり、このｐＨを下回ると酵素活性はごくわずかになった。この温度を上回ると酵素活性はごくわずかになり、この温度を下回るとＨＡジェランガムは使用した条件下で固体ゲルを形成した。
エステラーゼによる処理は、ジェランガムを部分的に脱アシル化することができる十分な量のエステラーゼを、天然ジェランガムを含む発酵ブロスの中に添加することによって行うことができ、エステラーゼ処理は、ジェランガムの部分的脱アシル化を達成するのに十分な時間、例えば１０〜１４４０分間行われる。発酵ブロス１Ｌ当たり１００〜２０００単位のエステラーゼの量が、好ましくは６０分間行われる部分的脱アシル化を達成するのに十分であることが見出された。
天然ジェランガムは、炭素、窒素、及び無機塩の適切な供給源を含む適切な水性増殖培地中でのスフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）（ＡＴＣＣ ３１４６１）の菌株の好気性発酵によって製造することができる。適切な炭素源は、デンプン、フルクトース、グルコース、スクロースなどの糖である。適切な窒素源は、酵母加水分解物、大豆粕、無機窒素などである。適切な無機塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、リン酸塩、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。
酵素処理の前に、発酵ブロスは、プロテアーゼやリゾチームなどの他のタイプの酵素を用いた処理によって適切に清澄化されてもよい。
エステラーゼ処理後、部分的に脱アシル化されたジェランガムは、アルコール、例えばイソプロパノール又はエタノールなどの有機溶媒を用いた析出によって発酵ブロスから単離されてもよい。
別の実施形態では、エステラーゼ処理は、発酵ブロスからのジェランガムの単離後に行われる。この実施形態では、エステラーゼは、単離されたジェランガム１ｇ当たり１００〜２０００単位の量で添加される。
部分的な脱アセチル化は、ジェランガムのレオロジー特性に影響を与えることが分かっている。ゲル化プロファイルからの２０℃でのＧ’のプロットは、酵素で処理されていないものと比較して、酵素処理されたサンプルの粘度（Ｐａ単位）が最も長い反応時間で低いことを示している（図６参照）。これは、アセテートの選択的除去を行うと、例えばゼリー菓子、デザートゲル、ジャム及びゼリー、パンのフィリング、及び乳製品デザートなどの特定の用途で有利な場合がある、より柔らかいゲルテクスチャーが得られることを示唆している。
酵素処理の結果としての構造の変化は、酵素的脱アシル化前後のジェランガムのゲル化プロファイルを測定することによって決定されるジェランガムのゲル化温度に変化をもたらすことも見出された。ジェランのゲル化温度は、アセテート置換基の特異的な除去の間に上昇し、酵素反応の時間の長さに応じてジェランの機能特性に影響を与えることが示された（図５及び以下の実施例３を参照）。ゲル化温度が上昇すると、ゲルが形成される温度が上がるため、より高い温度での安定性につながる可能性がある。これは、最終製品におけるより高い充填温度で有利な場合がある。また、ゲル化温度が上昇した部分的に脱アシル化されたジェランガムは、低濃度で液体中で流体ゲルを形成できることが見出されたため、例えばタンパク質又は不溶性ミネラルの懸濁粒子を含む飲料を安定化するために有利に使用することができる。
本発明の部分的に脱アシル化されたジェランガムは、天然のジェランガムの分子量と比較して１０％未満減少した分子量を有する。分子量はゲルの強度とテクスチャーに重要であるため、これは利点である。タンパク質又は不溶性ミネラルなどの粒子状成分を懸濁できるネットワークを得るためにゲル形成が必要とされるため、これらの機能特性は、食品を適切に安定化させるジェランの能力に重要である。
一実施形態では、本発明は、多糖鎖の繰り返し単位の０％〜４８％がアセテート残基を含む、部分的に脱アシル化されたジェランガムに関する。好ましくは、多糖鎖の繰り返し単位の０％〜２５％、より好ましくは０％〜１０％、更に好ましくは０．５％〜５％がアセテート残基を含む。
一実施形態では、本発明は、多糖鎖の繰り返し単位の０％〜４８％がグリセレート残基とアセテート残基の両方を含む、部分的に脱アシル化されたジェランガムに関する。好ましくは、多糖鎖の繰り返し単位の０％〜２５％、より好ましくは０％〜１０％、更に好ましくは０．５％〜５％がグリセレート残基とアセテート残基の両方を含む。
一実施形態では、本発明は、多糖鎖中の繰り返し単位の５％〜５０％がアセテート残基もグリセレート残基も含まない、部分的に脱アシル化されたジェランガムに関する。好ましくは、多糖鎖の繰り返し単位の１０％〜３０％、より好ましくは２０％〜２５％がアセテート残基もグリセレート残基も含まない。
一実施形態では、本発明は、６０℃〜８５℃、好ましくは７０〜８０℃のゲル化温度を示す部分的に脱アシル化されたジェランガムに関する。この実施形態による部分的に脱アシル化されたジェランガムは、低濃度で液体中で流体ゲルを形成することができ、それにより液体中に存在する粒子が懸濁されるため、飲料の安定化に特に有用であると考えられる。
部分的に脱アシル化されたジェランガムは、本明細書に開示の本発明の方法により適切に調製することができる。
完全にアシル化された又は完全に脱アシル化されたジェランガムによって得られる機能とは異なる機能を形成する能力により、食品においてジェランを使用する新しい機会がもたらされる。
そのため、本発明の部分的に脱アシル化されたジェランガムは、飲料、ジャム、ゼリー、パンのフィリング、菓子、乳製品、デザートゲル、フロスティング、アイシング、グレーズ、低脂肪スプレッド、電子レンジ対応食品、焼き菓子、プリン、ソース及びドレッシング、構造化食品、及びトッピングからなる群から選択されるような食品に、それらのテクスチャー及び粘度を調整するためのゲル化剤又はテクスチャー付与剤として添加することができる。食品中の部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度は、液体（飲料）から半固体又は固体（ゼリー及びプリン）までの望ましいテクスチャー及び粘度に応じて、０．０２重量％〜２重量％の間で様々であってもよい。特定の実施形態では、食品は、嚥下障害に悩む患者が摂取することが意図されている構造化食品又はゲル化液体である。嚥下障害は、人が飲み込みに困難を有している状態である。これは、多くの場合、特定の粘度とテクスチャーの食品を患者に提供することによって管理される。ジェランガムゲルのテクスチャーを部分的な脱アセチル化によって変化させることにより、嚥下障害の管理に適した様々なテクスチャーを形成することができる。
別の態様では、本発明の部分的に脱アシル化されたジェランガムは、ハード及びソフトカプセルのゼラチンを置き換えるための錠剤用のコーティングなどの医薬製剤に添加することができ、或いは１種以上の治療有効成分と適切な賦形剤とを含有するゲル、クリーム、及びローションの増粘剤又はゲル化剤として添加することができる。製剤中の部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度は、液体（例えばローション）から半固体（例えばクリーム）又は固体（例えば錠剤又はカプセル）までの望まれるテクスチャー及び／又は粘度に応じて、典型的には０．０２〜２重量％である。
更なる態様では、部分的に脱アシル化されたジェランガムは、練り歯磨き、液体石鹸、シャンプー、シャワージェル、クリーム、ボディローション、ボディジェル、及びデオドラントジェルなどのパーソナルケア製品に増粘剤又はゲル化剤として添加することができる。製剤中の部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度は、液体（例えば液体石鹸）から半固体（例えばクリーム、ボディローション、シャンプー、練り歯磨き）までの望まれるテクスチャー及び／又は粘度に応じて、典型的には０．０２〜２重量％である。
実施例１
ＨＡジェランガムは、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）の好気性発酵により調製し、上述した通りに単離した。
ＨＡジェランガムは、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）の好気性発酵により調製し、上述した通りに単離した。
ジェランガム１グラム当たり約２０００エステラーゼ単位の量で、ｐＨ６．３且つ４０〜７０℃で、単離されたＨＡジェランガムを、単独で、又は酵素ＰＡＥ １２Ｂ（ＮＺＹｔｅｃｈ）、Ｖ２０１０（Ｓｉｇｍａ）、若しくはＲａｐｉｄａｓｅ Ｐｒｅｓｓ（ＤＳＭ）のうちの１つと組み合わせて、様々な時間インキュベーションした。処理の前後にジェランガム上に存在するアセテート及びグリセレートを上述した通りに定量化した。図１ｃに示されているように、ジェランガムには４つの異なる繰り返し単位（ＲＵ）が存在する。理論上は、ＨＡジェランは５０％のＲＵ１と５０％のＲＵ２とからなり、ＬＡジェランガムは、各ＲＵ当たり１つのグリセレート（１００％グリセレート）と１つおきのＲＵに１つのアセテート（５０％アセテート）に対応する１００％のＲＵ４からなる。棒グラフ（図３）に示されているように、この実験で使用したＨＡジェランガムには、約８０％のグリセレートと４５％のアセテートが含まれている（０時間）。酵素の不存在下、ｐＨ６．３、７０℃で１、３、及び２０時間インキュベーションした後、わずかなアルカリ性条件のためグリセレートがゆっくり除去された一方で、アセテートの量はほとんど変化しないままであった。６．３のｐＨ及び４０〜７０℃の温度でエステラーゼＰＡＥ １２Ｂと共にインキュベーションすると、アセテートの量は劇的に低下した。その効果はこのエステラーゼの最適温度と一致する７０℃で最も高かった。７０℃では、グリセレートはエステラーゼなしの対照条件と同様の速度で除去されるものの、使用した実験条件下では、アセテートの酵素的除去は化学的脱アシル化よりもはるかに速く、化学的脱アシル化が有意ではないままの状態でアセテートを酵素的に除去する最適な条件を見つけることが可能であることが観察された。結果は、エステラーゼＰＡＥ １２Ｂがジェランガムからグリセレートではなくアセテートを特異的に除去することを示している。更に、２つの異なる酵素製品、Ｖ２０１０（Ｓｉｇｍａ）とＲａｐｉｄａｓｅ Ｐｒｅｓｓ（Ｒ．Ｐｒｅｓｓ、ＤＳＭ）は、同じ条件下でＰＡＥ １２Ｂよりも遅い速度ながらもジェランガムを脱アセチル化できることが分かった。その効果は、Ｖ２０１０では４０℃で２０時間インキュベーションした後に、Ｒａｐｉｄａｓｅ Ｐｒｅｓｓでは４０℃及び７０℃で２０時間インキュベーションした後に最も大きかった（図３参照）。
実施例２
実施例１に記載の通りに調製した単離したＨＡジェランガムを、ｐＨ６．６で０〜４時間エステラーゼＰＡＥ １２Ｂと共にインキュベーションし、その後、結合アセテートと遊離アセテートの量をＮＭＲ分光法により決定した。結果は図４ａに示されており、この結果から、酵素的脱アセチル化は、使用した実験条件下で酵素の添加量を増加させるとより迅速に進行すると考えられる。図４ｂのグラフは、酵素反応時の遊離アセテートの定量を示している。アセテート除去の程度は、反応時間と酵素量を調整することにより制御することができる。
実施例１に記載の通りに調製した単離したＨＡジェランガムを、ｐＨ６．６で０〜４時間エステラーゼＰＡＥ １２Ｂと共にインキュベーションし、その後、結合アセテートと遊離アセテートの量をＮＭＲ分光法により決定した。結果は図４ａに示されており、この結果から、酵素的脱アセチル化は、使用した実験条件下で酵素の添加量を増加させるとより迅速に進行すると考えられる。図４ｂのグラフは、酵素反応時の遊離アセテートの定量を示している。アセテート除去の程度は、反応時間と酵素量を調整することにより制御することができる。
実施例３
単離したＨＡジェランガムを、実施例１及び２に記載されているものと同じ条件下でエステラーゼＰＡＥ １２Ｂと共にインキュベーションした。ＰＡＥ １２Ｂが無視できる活性を有する程度までｐＨを下げることにより、酵素反応を様々な時点で停止した。その後、ゲル化プロファイルと温度を与えるレオロジーによって溶液を分析した。結果は図５に示されている。ジェランガムを酵素処理すると、ゲル化温度が５〜１０℃上昇し、これはアセテート置換基の同時除去と相関することが分かった。これらの条件下でのグリセレートの遅い除去と相関する酵素を含まないサンプルでは、ゲル化温度がより遅くより小さく低下することが観察された。
単離したＨＡジェランガムを、実施例１及び２に記載されているものと同じ条件下でエステラーゼＰＡＥ １２Ｂと共にインキュベーションした。ＰＡＥ １２Ｂが無視できる活性を有する程度までｐＨを下げることにより、酵素反応を様々な時点で停止した。その後、ゲル化プロファイルと温度を与えるレオロジーによって溶液を分析した。結果は図５に示されている。ジェランガムを酵素処理すると、ゲル化温度が５〜１０℃上昇し、これはアセテート置換基の同時除去と相関することが分かった。これらの条件下でのグリセレートの遅い除去と相関する酵素を含まないサンプルでは、ゲル化温度がより遅くより小さく低下することが観察された。
部分的な脱アセチル化はジェランガムのレオロジー特性にも影響を与えることが示されている。ゲル化プロファイルからの２０℃でのＧ’のプロットは、酵素で処理されていないサンプルと比較して、最も長い反応時間で酵素処理されたサンプルがより低い粘度（Ｐａ単位）を有することを示している（図６参照）。これは、アセテートを選択的に除去すると、より柔らかいゲルのテクスチャーになることを示している。
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Claims (16)
- ジェランガムを部分的に脱アシル化できるエステラーゼで天然又は高アシルジェランガムを処理すること、及び前記エステラーゼ処理後に発酵ブロスから部分的に脱アシル化されたジェランガムを単離することを含む、部分的に脱アシル化されたジェランガムの調製方法。
- 前記エステラーゼが炭水化物エステラーゼファミリーのアセチルエステラーゼ又はペクチンアセチルエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記エステラーゼがクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）由来のペクチンアセチルエステラーゼ１２Ｂである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記エステラーゼ処理が、５．５〜７．５の範囲のｐＨ、好ましくは６．０〜６．５のｐＨなどの６．０〜７．０の範囲のｐＨで行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エステラーゼ処理が、４０〜８０℃の範囲、好ましくは６５〜７５℃などの６０〜７５℃の範囲の温度で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エステラーゼの量が発酵ブロス１Ｌ当たり１００〜２０００単位である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エステラーゼ処理が１０〜１４４０分間行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 天然ジェランガムの分子量と比較して１０％未満減少した分子量を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により製造される部分的に脱アシル化されたジェランガムであって、多糖鎖の繰り返し単位の０％〜４８％がアセテート残基を含む、部分的に脱アシル化されたジェランガム。
- 前記繰り返し単位の０％〜２５％、好ましくは０．５％〜５％がアセテート残基を含む、請求項８に記載の部分的に脱アシル化されたジェランガム。
- ６０〜８５℃、好ましくは７０〜８０℃のゲル化温度を示す、請求項８又は９に記載の部分的に脱アシル化されたジェランガム。
- 飲料、ジャム、ゼリー、パンのフィリング、菓子、乳製品、デザートゲル、フロスティング、アイシング、グレーズ、低脂肪スプレッド、電子レンジ対応食品、焼き菓子、プリン、ソース及びドレッシング、構造化食品、及びトッピングからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の部分的に脱アシル化されたジェランガムを含む食品。
- 前記部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度が０．０２〜２重量％である、請求項１１に記載の食品。
- 錠剤、カプセル、ゲル、クリーム、及びローションからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の部分的に脱アシル化されたジェランガムを含む医薬製剤。
- 前記部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度が０．０２〜２重量％である、請求項１３に記載の医薬製剤。
- 練り歯磨き、液体石鹸、シャンプー、シャワージェル、クリーム、ボディローション、ボディジェル、及びデオドラントジェルからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の部分的に脱アシル化されたジェランガムを含むパーソナルケア製品。
- 前記部分的に脱アシル化されたジェランガムの濃度が０．０２〜２重量％である、請求項１５に記載のパーソナルケア製品。
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