CN101460065B - 超高性能的澄清化吉兰糖胶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及0.1％凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2，即约117g/cm2-约400g/cm2的高性能吉兰糖胶组合物。所述高性能吉兰糖胶的酰基含量低，但分子量增加。本发明的一个实施方式还涉及制备透明度高的高性能吉兰糖胶的方法。本发明还涉及包含高性能吉兰糖胶的食品和非食品工业产品。

Description

超高性能的澄清化吉兰糖胶
发明背景
发明领域
本发明涉及分子量增加并且凝胶强度增加的低酰基和部分脱酰化的高性能吉兰糖胶(gellan gum)组合物。本发明还涉及不采用常规过滤方法而制备透明度高的低酰基和部分脱酰化的高性能吉兰糖胶的方法。本发明还涉及包含低酰基和部分脱酰化高性能吉兰糖胶的食品及非食品应用工业产品。
相关领域描述
多糖(也称为树胶)主要用于增稠水溶液或使之形成凝胶。鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas)属微生物产生的多糖也称为吉兰糖胶类多糖(sphingan)。常将树胶分类成两组：增稠剂和胶凝剂。典型的增稠剂包括：淀粉、瓜尔胶、羧甲基纤维素、海藻酸盐、甲基纤维素、黄原胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶。常见的胶凝剂包括：吉兰糖胶、明胶、淀粉、海藻酸盐、果胶、角叉菜聚糖、琼脂和甲基纤维素。
胶凝剂用于食品工业的各种领域，例如糖果凝胶(confectioneryjelly)、果酱、甜食凝胶、糖霜、乳制品、饮料等。此外，可将胶凝剂用作微生物培养基的组分。胶凝剂的使用条件以及它们所形成凝胶的质地不同。凝胶的这些区别特性使得某些胶凝剂广泛用于特定产物中(例如，糖果凝胶中的淀粉；甜食凝胶中的明胶；糖霜中的琼脂；和甘椒条(pimento strip)中的海藻酸盐)。
特别有用的胶凝剂是吉兰糖胶，其是由细菌伊乐藻鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)，ACC 31461和衍生自该种的菌株产生的胞外多糖。吉兰糖胶的组成型糖是葡萄糖、葡糖醛酸和鼠李糖，其摩尔比为2∶1∶1。它们一起连接形成包含线形四糖重复单元的基础结构(O’Neill M.A等，“伊乐藻假单胞菌产生的酸性胞外胶凝多糖的结构”(Structure of the acidicextracellular gelling polysaccharide produced by Pseudomonas elodea)，Carbohydrate Res.，124(1)：123-133(1983)；“伊乐藻假单胞菌产生的酸性胞外胶凝多糖的结构”(Structure of the acidic extracellular gellingpolysaccharide produced by Pseudomonas elodea)，Carbohydrate Res..124(1)：123-133(1983)；Jansson.P.E.等，“吉兰糖胶，一种伊乐藻假单胞菌产生的胞外多糖的结构研究”(Structural studies of gellan gum.an extracellularpolysaccharide elaborated by Pseudomonas elodea)，Carbohydrate Res.，124(1)：135-139(1983))。在天然或高酰基(“HA”)形式中，存在两种酰基取代基：乙酸基(acetate)和甘油酸基(glycerate)。两种取代基均位于同一葡萄糖残基上，平均每一个重复单元有一个甘油酸基，每两个重复单元有一个乙酸基。在低酰基(“LA”)形式中，除去了大多数酰基以产生基本上不含这些基团的线形重复单元。X-射线衍射分析显示吉兰糖胶以三-折叠、左旋、平行双螺旋的形式存在(Chandraskaran，R.等，“吉兰糖胶的晶体结构”(The crystalstructure ofgellan)，Carbohydrate Res.，175(11)：1-15(1988)；Chandraskaran，R.等，“吉兰糖胶的阳离子交换：钾盐的x-射线研究”(Cation interactions ingellan：An x-ray study of the potassium salt)，Carbohydrate Res.，181：23-40(1988))。
在有促凝胶阳离子(gel-promoting cation)，优选二价阳离子，例如钙和镁存在下冷冻LA吉兰糖胶可形成凝胶。形成的凝胶是牢固而易碎的。HA吉兰糖胶形成凝胶无需有阳离子存在，形成的凝胶的结构和流变学性质明显受酰基取代基的影响。因此，HA吉兰糖胶的特性明显不同于LA吉兰糖胶的特性。HA吉兰糖胶通常软而柔韧，缺乏热滞后性(thermal hysteresis)。
在商业水平，通过在无菌条件下将伊乐藻鞘氨醇单胞菌细菌接种发酵培养基而形成吉兰糖胶。所述发酵培养基含有碳源、磷酸盐、有机和无机氮源以及适量的痕量元素。在无菌条件下，严格控制通气、搅拌、温度和pH来进行发酵。发酵完成后，先对粘性培养液施以巴斯德消毒以杀灭存活细胞，再回收吉兰糖胶。
吉兰糖胶根据从发酵培养液中的回收方法而显示不同性质。从发酵培养液中直接回收产生其天然或高酰基形式的吉兰糖胶，其由伊乐藻鞘氨醇单胞菌用乙酰基和甘油基取代基在一个葡萄糖残基上作了修饰。分离这种天然或高酰基形式的吉兰糖胶产生软的、柔韧的弹性凝胶。可以使吉兰糖胶托酰基以提供低酰基形式的吉兰糖胶。分离这种低酰基形式的吉兰糖胶产生硬的、牢固而易碎的凝胶。混合天然和低酰基吉兰糖胶产生中等质地的凝胶。
目前，在高温下用强碱处理含吉兰糖胶的发酵培养液以使之脱酰化。该方法除去吉兰糖胶的酰基取代基并使伊乐藻鞘氨醇单胞菌细胞裂解。然后通过酸处理(以中和/酸化发酵培养液)和过滤除去固体和细胞碎片，从而产生高透明度、低酰基的吉兰糖胶。然而，该方法还会导致糖胶的分子量因解聚以及脱酰化而基本上低于天然微生物所产生的。目前吉兰糖胶回收的商业方法产生最高0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度(gellan gum curdmeter gel strength)约为290g/cm2(等于0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约为113g/cm2)的凝胶。
发明概述
本发明涉及制备吉兰糖胶的方法，该方法包括在发酵培养基中发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌；任选通过化学/酶学方法澄清发酵培养液；用苛性剂(caustic agent)使经澄清化的发酵培养液脱酰化；和从发酵培养液中沉淀吉兰糖胶。优选其中所述吉兰糖胶的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2，更优选至少325g/cm2；或0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2，更优选至少约125g/cm2，更优选至少约150g/cm2，更优选至少约175g/cm2，更优选至少约200g/cm2，更优选至少约225g/cm2，更优选至少约250g/cm2，更优选至少约275g/cm2，更优选至少约300g/cm2，更优选至少约325g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约117g/cm2-约156g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约125g/cm2-约250g/cm2。
在本发明的另一实施方式中，伊乐藻鞘氨醇单胞菌是PHB-缺陷型菌株。在本发明的另一实施方式中，澄清步骤包括以下步骤：加热至约30℃-约70℃的温度范围；用一种或多种抗氧化剂和一种或多种螯合剂与溶菌酶联合处理；用一种或多种表面活性剂处理；和用蛋白酶处理。
在该实施方式的一个优选例中，抗氧化剂是硫酸钠。在另一个优选例中，螯合剂选自：乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、柠檬酸、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、阳离子交换树脂、二盐酸乙二胺、二乙酸乙二胺、乙二胺锂盐和二氢碘酸乙二胺。优选螯合剂是乙二胺四乙酸二钠，或优选螯合剂是柠檬酸。
在该实施方式的另一个优选例中，表面活性剂选自：十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、卵磷脂、单酸甘油酯、单酸甘油酯的酒石酸酯、磷酸化单酸甘油酯、乳酰乳酸单酸甘油酯、乙酰单酸甘油酯、琥珀酰单酸甘油酯、乙氧基化单酸甘油酯、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酰乳酸钠和丙二醇酯。优选表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
如上所述的制备吉兰糖胶的方法，优选苛性剂选自：氢氧化钾、氢氧化钠和磷酸三钠。最优选苛性剂是氢氧化钾。
本发明还涉及通过上述方法产生的吉兰糖胶。此外，本发明涉及0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2，更优选至少325g/cm2；或0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2的吉兰糖胶，更优选至少约125g/cm2，更优选至少约150g/cm2，更优选至少约175g/cm2，更优选至少约200g/cm2，更优选至少约225g/cm2，更优选至少约250g/cm2，更优选至少约275g/cm2，更优选至少约300g/cm2，更优选至少约325g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约117g/cm2-约156g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约125g/cm2-约250g/cm2。
在本发明的另一个实施方式中，公开了一种酰基总含量低于约2.0％的吉兰糖胶，其中吉兰糖胶的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2-，优选至少约325g/cm2。
在本发明的还有一个实施方式中，公开了一种酰基总含量低于约2.0％的吉兰糖胶，吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2，优选至少约125g/cm2更优选至少约150g/cm2，更优选至少约175g/cm2，更优选至少约200g/cm2，更优选至少约225g/cm2，更优选至少约250g/cm2，更优选至少约275g/cm2，更优选至少约300g/cm2，更优选至少约325g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约117g/cm2-约156g/cm2，或沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约125g/cm2-约250g/cm2；或该吉兰糖胶，在水中以1％再水合的所述吉兰糖胶的透光率大于约60％，优选大于约70％，更优选大于约80％；或该吉兰糖胶的质地概况分析硬度至少约9lb，优选至少约15lb，更优选至少约20lb，更优选至少约25lb；或该吉兰糖胶的1％吉兰糖胶.90℃热粘度至少约25cP，优选至少约75cP，更优选至少约175cP，再优选至少约300cP。
在本发明的还有一个实施方式中，公开了一种酰基总含量为约2.0％-约15％的吉兰糖胶，在水中以1％再水合的所述吉兰糖胶的透光率大于约60％，优选至少约70％，再优选至少约80％。
在本发明的一个实施方式中，在去离子水中以1％浓度再水合成的吉兰糖胶的透光率大于约60％。在本发明的另一实施方式中，吉兰糖胶的质地概况分析(Texture Profile Analysis)(“TPA”)硬度为至少约9磅(lb.)。在本发明的还有另一实施方式中，吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶90℃热粘度是至少约25厘泊(cP)。
在本发明的另一方面，公开了一种包含上述吉兰糖胶的工业产品。该产品选自：饮料、糖果、果酱和果冻、合成食品、水基凝胶、馅饼馅料、甜食凝胶、糖霜、酸奶、布丁、搅打食物、奶油、胶化牛奶和冰激淋；或该产品选自：胶化宠物食品、微生物和组织培养基、液体清洁剂、牙膏、肥皂和沐浴露、除臭凝胶、空气清新凝胶和软胶囊。
在本发明的一个优选例中，该工业产品中所述吉兰糖胶的使用浓度比目前市售可得的低酰基吉兰糖胶的使用浓度低约15％-约90％。优选低约20％-约85％，再优选低约25％-约75％，更优选低约30％-约65％，再优选低约35％-约55％。
在本发明的一个优选例中，该工业产品中的吉兰糖胶与至少一种选自下组的胶凝水胶体联用：角叉菜聚糖、豆角胶，魔芋和黄原胶。
在本发明的另一个方面，还公开了一种制备吉兰糖胶的方法，包括以下步骤：
a.在发酵培养基中发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌；
b.用苛性剂使经澄清化的发酵培养液脱酰化；
c.通过过滤澄清该发酵培养液；和
d.从经澄清化的发酵培养液中沉淀所述吉兰糖胶；
其中，吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2，优选0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度为约117g/cm2-约400g/cm2。在该方面的一个优选例中，伊乐藻鞘氨醇单胞菌是PHB-缺陷型菌株。
本发明还涉及包含本文所述新型吉兰糖胶的食品和非食品工业产品。此外，本发明涉及包含通过本文所述方法制备的吉兰糖胶的食品或非食品工业产品。用于本发明工业产品中的高性能吉兰糖胶的浓度比目前市售可得的产品
Figure GAB00000000000171105000061
所用浓度低约20％-约85％。
附图简述
图1显示了0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度测试和0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度测试之间的线性相关性。
发明详述
本发明涉及制备凝胶强度高于现有技术低酰基吉兰糖胶的低酰基吉兰糖胶的方法，以及制备部分脱酰化的吉兰糖胶的方法。本发明还涉及低酰基和部分脱酰化的吉兰糖胶，所述吉兰糖胶再水合成水溶液时具有高透明度而无需使用常规压滤机。本发明还涉及包含这些高性能吉兰糖胶的食品和非食品工业产品，例如甜食凝胶、糖果、饮料、微生物和组织培养基、液体清洁剂等。
美国专利号5,190,927所述的高酰基(HA)吉兰糖胶的甘油酸含量为11-13％，乙酸基含量为4-5％，酰基总含量为15-18％(w/w)。据信，本文所述低酰基吉兰糖胶在聚合物主链上的甘油酸基＜1.0％，乙酸基＜1.0％，或酰基总含量＜2.0％w/w。本文所述部分脱酰化的吉兰糖胶具有中等水平的1-11％甘油酸基和1-4％乙酸基，酰基总含量为2-15％。
通过本领域普通技术人员已知的方法，在称为发酵培养基的水溶液中培育或需氧发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌ATCC31461、衍生自该菌株的突变体或其它合适的菌株。该培养基含有碳源、氮源和无机盐来源。碳水化合物(例如，葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖醇等)通常可单用或联用作为营养培养基中的可同化碳源。以培养基的重量计，碳水化合物的含量通常在约2％-4％之间不等。许多蛋白质物质在发酵工艺中通常用作有机氮源。合适的氮源包括，例如酵母水解物、大豆粉、棉籽粉、酪蛋白水解物、玉米糖浆、蒸馏可溶物(distiller’s solubles)等。以水性介质的重量计，单用或联用的氮源量在约0.05％-0.2％。掺入培养基中的无机盐包括能提供钠、钾、铵、钙、镁、磷酸根、硫酸根、氯、硝酸根、碳酸根等离子的常规盐类。还包括痕量元素，例如铁盐、锌盐、铜盐、镁盐、钴盐和钼盐。
吉兰糖胶类多糖作为荚膜多糖分泌入发酵培养基。可以利用具有所需特性的伊乐藻鞘氨醇单胞菌突变菌株。在本发明的一个实施方式中，利用不能产生聚羟基丁酸(“PHB”)的伊乐藻鞘氨醇单胞菌突变菌株，例如2005年12月2日提交的美国专利申请号11/292.366所述，该篇专利通过引用全文纳入本文。利用PHB-缺陷型菌株联同本文所述的澄清方法能获得实现低酰基吉兰糖胶或部分脱酰化的吉兰糖胶的高透明度重建吉兰糖胶。
富集后，吉兰糖胶类多糖通常澄清化并通过过滤方法与悬浮的固体，包括作为发酵培养液一部分的微生物细胞和细胞碎片相分离，从而获得澄清的吉兰糖胶类多糖。如本文所述，澄清方法可以替换为化学/酶学方法。还可采用本发明方法澄清化将分离的吉兰糖胶类多糖加入水性介质获得的溶液和部分纯化的吉兰糖胶类多糖溶液。以溶液的总重量计，用于本发明方法的含不良发酵固体的吉兰糖胶类多糖水溶液可含有约0.01％-约10％吉兰糖胶类多糖。含有任何已知吉兰糖胶类多糖的任何水溶液可用于实施本发明。
本发明的高性能低酰基吉兰糖胶的凝胶强度高于现有技术的低酰基吉兰糖胶。例如，通过日本的IIO电子有限公司(IIO Electric Co.Ltd.)的Neo测得佐治亚州亚特兰大市的CP凯尔科公司的
Figure GAB00000000000171105000072
(CPKelco.，Atlanta，GA)产品的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约为290g/cm2(等于0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约113g/cm2)。过去采用0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度测试描述低酰基吉兰糖胶的凝胶强度。该测试方法的上限是400g/cm2，而本发明的新型吉兰糖胶超过了该上限。因此，将凝胶强度测试方法修改为利用0.1％吉兰糖胶。
本发明的高性能吉兰糖胶的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2，例如至少约320g/cm2。本发明的高性能吉兰糖胶等于具有至少约117g/cm2的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度，例如至少约125g/cm2、至少约150g/cm2、至少约175g/cm2、至少约200g/cm2、至少约225g/cm2、至少约250g/cm2、至少约275g/cm2、至少约300g/cm2和至少约325g/cm2。本发明的其它实施方式的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度为约117g/cm2-约400g/cm2，例如约117g/cm2-约156g/cm2，和约125g/cm2-约250g/cm2。
与市售可得的低酰基吉兰糖胶相比，本发明的高性能低酰基吉兰糖胶的分子量增加。虽然不想局限于特定理论，但据信本发明的高性能低酰基吉兰糖胶因分子量的增加而具有新型凝胶强度特征。
此外，本发明的高性能低酰基和部分脱酰化的吉兰糖胶的透明度高，而不用过滤方法以除去细胞和细胞碎片。将用本文所述方法澄清化的吉兰糖胶类多糖再水合并溶解于水中提供基本上澄清的吉兰糖胶类多糖溶液。本发明基本上澄清的吉兰糖胶类多糖溶液(1％w/w)的透光率大于约60％，优选大于约70％，最优选大于约80％。可采用常规技术和设备(例如，市售可得的分光光度计)检测可见光谱中任何波长的透光率。通常检测约480nm-约680nm波长的透光率。
本发明的低酰基吉兰糖胶的TPA硬度至少约9磅、例如至少约15磅、至少约20磅和至少约25磅。本发明的低酰基吉兰糖胶还具有至少约25cp的1％吉兰糖胶90℃热粘度，例如至少约75cp、至少约175cp和至少约300cp。
酶法澄清化
在本发明的一个实施方式中，通过化学/酶学方法澄清吉兰糖胶类多糖水溶液，所述方法包括分步处理吉兰糖胶类多糖水溶液。发酵培养液经以下步骤处理：1)加热，2)用一种或多种抗氧化剂连同一种或多种螯合剂和溶菌酶处理，3)用一种或多种表面活性剂处理，4)用蛋白酶处理，和5)任选用纤维素酶处理。
第一步包括通过常规技术(例如在加套槽中温控、直接注蒸汽(direct steaminjection)等)将吉兰糖胶类多糖水溶液加热至蒸发温度。优选直接注蒸汽以尽可能缩短加热时间。澄清温度范围是约30℃-约70℃，优选约50℃-约60℃。将吉兰糖胶类多糖溶液加热至所需温度需要的时间长度根据待处理吉兰糖胶类多糖溶液的大小和体积而有显著不同。例如，将小体积(如50ml)吉兰糖胶类多糖溶液的温度从室温升至约60℃可能需要几分钟，而将40,000升该溶液(例如，商业加工中可能存在的)升高类似的温度可能需要几小时。
下一步骤包括用任选至少一种抗氧化剂、任选至少一种螯合剂和至少一种溶菌酶处理吉兰糖胶水溶液。优选用至少一种抗氧化剂、至少一种螯合剂和至少一种溶菌酶处理吉兰糖胶水溶液。一种或多种抗氧化剂的浓度范围通常是约百万分之75份(“ppm”)-约300ppm，例如约150ppm-约250ppm。加入吉兰糖胶水溶液的一种或多种螯合剂的浓度范围通常是约150ppm-约1000ppm，例如约200ppm-约500ppm。溶菌酶的浓度范围通常是约25ppm-约200ppm，例如约50ppm-约150ppm。溶液混合约1小时-约5小时，例如约1.5小时-约2.5小时，约1.5小时-约2小时。
所述抗氧化剂是抗坏血酸、异抗坏血酸钠、偏亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钾、二氧化硫、丁基化羟基苯甲醚、半胱氨酸或亚硫酸钠。
适用于本发明方法的螯合剂是通过与金属离子形成齿状络聚物(poly-dentate complexe)并与金属离子形成沉淀物或吸附金属离子而能螯合吉兰糖胶类多糖溶液中多价金属离子(例如，Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+等)的化合物或组合物。有用的螯合剂的例子包括但不限于：乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、柠檬酸、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、阳离子交换树脂、二盐酸乙二胺、二乙酸乙二胺(ethylenediamine diacetate)、乙二胺锂盐、二氢碘酸乙二胺(ethylenediamine dihydroiodide)等。本发明方法所用的螯合剂优选包括柠檬酸和乙二胺四乙酸、柠檬酸、磷酸、焦磷酸、多聚磷酸、碳酸、偏磷酸和乙二胺的盐。更具体地说，将乙二胺四乙酸二钠或柠檬酸用作螯合剂。
适用于本发明的溶菌酶包括加利福尼亚州帕洛阿尔托市吉尼欧国际公司(Geneneor International.Inc.，Palo Alto，CA)的溶菌酶或可从植物、动物或微生物来源获得的任何溶菌酶。
用一种或多种抗氧化剂、一种或多种螯合剂和溶菌酶处理吉兰糖胶类多糖溶液后，下一步骤是用至少一种表面活性剂处理该溶液。所加入的一种或多种表面活性剂的浓度范围是约50ppm-约400ppm，例如约150ppm-约300ppm。然后搅拌该溶液约0.5小时-约2小时，例如约1小时-约1.5小时。
适用于本发明方法的表面活性剂是在有亲水性和疏水性物质(固体或液体存在下)能形成水性乳液的化合物或组合物。表面活性剂优选可溶于水或水-醇中的化合物或组合物。有用的表面活性剂的例子包括但不限于：十二烷基硫酸钠(“SDS”)、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(新泽西州布里奇沃特市ICI美国公司(ICI Americas.Inc.，Bridgewater，N.J.)的吐温80)、卵磷脂、单酸甘油酯、单酸甘油酯的酒石酸酯、磷酸化单酸甘油酯(例如，单钠盐)、乳酰乳酸(lactylated)单酸甘油酯、乙酰单酸甘油酯(acetylated monoglyceride)、琥珀酰单酸甘油酯(succinylated monoglyceride)、乙氧基化单酸甘油酯(ethoxylatedmonoglyceride)、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酰乳酸钠(sodium stearoyl lactylate)、丙二醇酯等。SDS用作表面活性剂。
然后用至少一种蛋白酶处理该溶液。所加入的蛋白酶的浓度约100ppm-约3000ppm，例如约500ppm-约2000ppm，将蛋白酶与该溶液搅拌约0.5小时-约5小时，例如约1小时-约4小时。
适用于本发明方法的蛋白酶可以是细菌、真菌或植物来源的酸性、中性或碱性蛋白酶。可用于本发明方法的示范性酸性蛋白酶包括但不限于：曲霉(Aspergillus.)属微生物，例如黑曲霉(A.niger)产生的蛋白酶。可用于本发明方法的中性蛋白酶包括但不限于：诸如解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)等微生物产生的蛋白酶。可用于本发明方法的碱性蛋白酶包括但不限于：芽孢杆菌属微生物，例如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilis)产生的蛋白酶，链霉菌(Strepromyces)种，例如弗氏链霉菌(S.fradiae)、灰色链霉菌(S.griseus)和直丝链霉菌(S.rectus)产生的蛋白酶和从枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo和枯草蛋白酶Carlsberg获得的蛋白酶，包括诸如枯草杆菌肽酶和枯草杆菌肽酶B等蛋白酶。
最后，如果发酵液中含有纤维素残留物，还可加入纤维素酶。可用于本发明方法中的纤维素酶的例子包括但不限于：丹麦巴格斯瓦尔德市诺沃酶公司的
Figure GAB00000000000171105000101
BG(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)、加利福尼亚州帕洛阿尔托市吉尼欧国际公司
Figure GAB00000000000171105000111
CL、加利福尼亚州帕洛阿尔托市吉尼欧国际公司
Figure GAB00000000000171105000112
GC等。
酶处理步骤中所用的酶将固体细胞碎片降解成在回收方法中更易于除去的化合物，因而提高了吉兰糖胶类多糖产物的纯度并有助于澄清工艺，从而提高了将吉兰糖胶类似物产品重建成溶液时的透光率。
应该注意，用一种或多种螯合剂、一种或多种抗氧化剂和一种或多种表面活性剂处理吉兰糖胶类多糖溶液造成的澄清程度会影响酶浓度或完成后续酶处理所需的时间。例如，增加该方法所用一种或多种螯合剂、一种或多种抗氧化剂和一种或多种表面活性剂的用量可降低酶的用量和/或澄清吉兰糖胶类多糖溶液所需时间。
脱酰化
然后在澄清化之前或之后，可用一种或多种强或弱苛性剂，例如氢氧化钾、氢氧化钠、磷酸钠等使吉兰糖胶脱酰化。氢氧化钾是优选的苛性剂。在一个实施方式中，先澄清化，再通过化学/酶学方法脱酰化。在另一实施方式中，可先通过过滤方法澄清化，再脱酰化。
加入足够的苛性剂将发酵液的pH升至约9.5-约12.5的范围，例如约9.7-约11.7。然后将发酵液加热至约190°F-约210°F的温度进行处理。加热后，用酸溶液，例如硫酸、盐酸或磷酸，优选硫酸将pH下调至pH约3.5-约9.0，例如约4.0-约7.0。应注意，碱处理水平会影响脱酰化程度和所得吉兰糖胶产物的特性。例如，如果采用强碱处理，则吉兰糖胶会进一步脱酰化，从而产生更牢固而易碎的凝胶，其分子量会降低，例如目前市售可得产品那样。另一方面，如果采用较温和的碱处理，则分子量的降低程度较轻，在甚至更温和的碱处理水平，吉兰糖胶的酰基含量更高(即，部分脱酰化)，从而形成更柔韧的凝胶。
脱酰化后，可通过本领域熟知的方法，例如利用异丙醇或乙醇沉淀吉兰糖胶。
食品和非食品工业产品
所述吉兰糖胶可用作增稠剂，例如用于食品工业，如饮料、糖果、果酱和果冻、合成食品(fabricated food)、水基凝胶、馅饼馅料、甜食凝胶、糖霜、乳制品，如酸奶、布丁、搅打食物、奶油、胶化牛奶和冰激淋等。此外，所述胶凝剂可用于胶化宠物食品、微生物和组织培养基、液体清洁剂、牙膏、肥皂和沐浴露、除臭凝胶、空气清新凝胶、软胶囊和微生物凝胶的其它已知工业应用。
与标准的市售可得低酰基吉兰糖胶相比，本文所述吉兰糖胶的高性能特征能在较低浓度提供胶凝功能。所用的吉兰糖胶的浓度比目前所用的市售可得产品
Figure GAB00000000000171105000121
的浓度低约15％-约90％，例如低约20％-约85％、低约25％-约75％、低约30％-约65％和低约35％-约55％。降低吉兰糖胶用量能降低成本并能将吉兰糖胶经济地应用于目前只能使用较低成本的胶凝剂，例如琼脂的其它领域。
可利用本发明的高性能吉兰糖胶以赋予热稳定性。在一个实施方式中，将高性能吉兰糖胶用于多层甜食凝胶中。热稳定的吉兰糖胶网络有助于在85℃巴斯德消毒期间维持具有独特设计和图案的甜食凝胶形状。可通过目测观察或流变学检测来评估吉兰糖胶提供热稳定性的有效性。
在另一实施方式中，本发明的吉兰糖胶为胶状糖果提供热稳定性。可通过检测胶状糖果的直径随其变形和融化而增加来评估在胶状糖果中的热稳定性。
在还有另一实施方式中，高性能低酰基吉兰糖胶可用作饮用果冻中的主要结构组分以提供特征性易碎凝胶网络。
本发明的另一实施方式提供了高性能吉兰糖胶连同其它胶凝水胶体(gelling hydrocolloid)，例如在水甜食凝胶系统中的应用，从而能提供理想的凝胶质地。通常与吉兰糖胶一起使用的胶凝水胶体包括但不限于：角叉菜聚糖、角叉菜聚糖/豆角胶系统，角叉菜聚糖/魔芋(konjac)系统，和黄原胶/豆角胶系统。
实施例
以下实施例说明了本发明，不应误解为以任何方式限制了本发明的范围。
实施例1
酶法澄清、产物回收和0.1％凝乳计凝胶强度分析
将伊乐藻鞘氨醇单胞菌的PHB-缺陷型菌株发酵的4500L发酵罐培养液(批号GB05662)加热至50℃并作机械搅拌。边搅拌边将200ppm亚硫酸钠、100ppm溶菌酶和250ppm EDTA二钠加入发酵罐。连续混合这些物质两小时，同时控制发酵罐温度以维持升高的温度。然后，将250ppm十二烷基硫酸钠加入发酵罐培养液中并搅拌1小时。随后将1000ppm蛋白酶加入发酵培养液中，与发酵培养液混合3小时。向培养液中加入氢氧化钾调节pH至11.34以使多糖脱酰化。
通过加热至100℃、用硫酸将pH下调至5.59并用三体积异丙醇/水共沸混合物对一体积处理的发酵培养液进行沉淀来回收培养液。用托盘干燥器干燥沉淀的纤维，将其研磨成细粉。室温下用950ml纯水重建1克干粉样品。以600rpm搅拌约2分钟以分散粉末。将含样品的烧杯置于维持在约100℃的水浴中。继续混合样品直至样品达到90℃。然后再继续搅拌10分钟。随后将10ml 61.6g/l乳酸钙加入热样品中，再搅拌1分钟。接着通过加入热的纯水将样品调整至溶液总重量1000g。样品再混合1分钟，然后倾倒入果冻杯中并塞上塞子。然后将样品置于8℃水浴中约2小时。
用ME-303型Neo
Figure GAB00000000000171105000131
检测凝胶强度。对于该检测，如Neo
Figure GAB00000000000171105000132
操作手册所述采用100克弹簧、延伸杆、5.6mm柱塞和100克负载单元重量(load cell weight)。该样品的0.1％克凝乳计凝胶强度是317g/cm2。
实施例2
酶法澄清、产物回收和质地概况分析
将伊乐藻鞘氨醇单胞菌的PHB-缺陷型菌株发酵的4500L发酵罐培养液(批号GB05443)加热至50℃并作机械搅拌。边搅拌边将200ppm亚硫酸钠、100ppm溶菌酶和250ppm EDTA二钠加入发酵罐。连续混合这些物质两小时，同时控制发酵罐温度以维持升高的温度。然后，将250ppm十二烷基硫酸钠加入发酵罐培养液中并搅拌1小时。随后将1000ppm蛋白酶加入发酵培养液中，与发酵培养液混合3小时。向培养液中加入氢氧化钾调节pH至11.13以使多糖脱酰化。
通过加热至100℃、用硫酸将pH下调至5.51并用三体积异丙醇/水共沸混合物对一体积处理的发酵培养液进行沉淀来回收培养液。用托盘干燥器干燥沉淀的纤维，将其研磨成细粉。室温下用305克去离子水重建1.5克干粉样品，并以800rpm搅拌1分钟。将混合物加热至90℃，然后撤去热源，混合物再搅拌1分钟。随后加入3ml 0.6M氯化钙原液，再搅拌1分钟。用预热的去离子水将混合物的重量调整至301g，再搅拌30秒。用勺子去除表面气泡，将溶液倒入涂了油脂的质地概况分析(“TPA”)环中，静置过夜以形成凝胶。
然后通过TPA测试凝胶(Sanderson，G.R.等，“吉兰糖胶凝胶的质地”(TheTexture of Gellan Gum Gels)，《食品工业的树胶和稳定性》(Gums andStability for the Food Industry)，4：219-227(1988))，该试验是独立凝胶(free-standing gel)的压缩测试(compression test)。以每分钟两次每次2英寸(2inches/minute twice)的速度将样品压缩至它们原始高度的20％。检测模数(modulus)、硬度、脆性和弹性。硬度检测值是第一轮压缩期间的最大作用力，代表了样品的胶凝性能(凝胶强度)。检测到TPA硬度为25.7lb。
实施例3
酶法澄清、产物回收和热粘度检测
将伊乐藻鞘氨醇单胞菌的PHB-缺陷型菌株发酵的4500L发酵罐培养液(批号GB05341)加热至50℃并作机械搅拌。边搅拌边将200ppm亚硫酸钠、100ppm溶菌酶和250ppm EDTA二钠加入发酵罐。连续混合这些物质两小时，同时控制发酵罐温度以维持升高的温度。然后，将250ppm十二烷基硫酸钠加入发酵罐培养液中并搅拌1小时。随后将1000ppm蛋白酶加入发酵培养液中，与发酵培养液混合3小时。向培养液中加入氢氧化钾调节pH至11.48以使多糖脱酰化。
通过加热至100℃、用硫酸将pH下调至5.4并用三体积异丙醇/水共沸混合物对一体积处理的发酵培养液进行沉淀来回收培养液。用托盘干燥器干燥沉淀的纤维，将其研磨成细粉。在含300ml去离子水的烧杯中缓慢3.0克干粉样品，同时在90℃的水浴中搅拌。用天平称重该热烧杯，用去离子水将溶液的内含物调节至300克，搅拌20秒。利用10ml注射器将8ml溶液注射入具有与热水浴相连的具有水套的布氏LV粘度计(Brookfield LV viscometer)的小样品适配杯中。用在水浴中预热的18号纺锤，以12rpm的粘度计转速(调节rpm使得粘度检测值位于范围内)检测1％吉兰糖胶.90℃热粘度。检测到热粘度是239cP。据信，热粘度与分子量有关，因此与多糖样品的胶凝性能有关。
实施例4
Figure GAB00000000000171105000151
和高性能吉兰糖胶的0.1％凝乳计凝胶强度比较
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌发酵培养液，但各批次之间在加入氢氧化钾后达到的脱酰化pH不同。按照实施例1的方法将处理的发酵培养液回收成干粉。如实施例1所述检测0.1％凝乳计凝胶强度。表1显示了发酵批号、脱酰化pH和0.1％凝乳计凝胶强度以及用于比较的三种市售可得的低酰基吉兰糖胶批次
Figure GAB00000000000171105000152
数据显示实验批次的0.1％凝乳计凝胶强度明显较高。
表1.
Figure GAB00000000000171105000153
和高性能吉兰糖胶的凝胶强度比较
Figure GAB00000000000171105000154
实施例5
Figure GAB00000000000171105000155
和高性能吉兰糖胶的质地概况分析
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌发酵培养液，但各批次之间在加入氢氧化钾后达到的脱酰化pH不同。按照实施例1的方法将处理的发酵培养液回收成干粉。如实施例2所述进行质地概况分析(“TPA”)。表2显示了发酵批号、脱酰化pH和TPA硬度(lb)以及用于比较的三种市售可得的低酰基吉兰糖胶批次
Figure GAB00000000000171105000156
数据显示实验批次的TPA硬度值明显较高。
表2.和高性能吉兰糖胶的TPA比较
Figure GAB00000000000171105000158
Figure GAB00000000000171105000161
实施例6
和高性能吉兰糖胶的热粘度检测值比较
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌发酵培养液，但各批次之间在加入氢氧化钾后达到的脱酰化pH不同。按照实施例1的方法将处理的发酵培养液回收成干粉。如实施例3所述检测热粘度。表3显示了发酵批号、脱酰化pH和热粘度(厘泊)以及用于比较的三种市售可得的低酰基吉兰糖胶批次
Figure GAB00000000000171105000163
数据显示实验批次的1％吉兰糖胶，90℃热粘度值明显较高。
表3.和高性能吉兰糖胶的热粘度比较
Figure GAB00000000000171105000165
实施例7
脱酰化pH对0.1％凝乳计凝胶强度的影响
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌发酵培养液，但在通过改变氢氧化钾加入水平回收各批次期间的脱酰化pH不同。脱酰化后，按照实施例1的方法将处理的脱酰化发酵培养液回收成干粉。如实施例1所述检测0.1％凝乳计凝胶强度。表4显示了发酵批号、脱酰化pH和0.1％凝乳计凝胶强度。数据显示降低脱酰化pH得到的凝乳计凝胶强度通常较高。
表4.脱酰化pH和凝胶强度之间的相关性
Figure GAB00000000000171105000171
实施例8
脱酰化pH对TPA硬度和热粘度的影响
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌发酵培养液，但在通过改变氢氧化钾加入水平回收各批次期间的脱酰化pH不同。脱酰化后，按照实施例1的方法将处理的脱酰化发酵培养液回收成干粉。如实施例2和3所述分别检测TPA硬度和热粘度。表5显示了发酵批号、脱酰化pH、TPA硬度和热粘度。数据显示降低脱酰化pH得到的TPA硬度和1％吉兰糖胶，90℃热粘度通常较高。
表5.脱酰化pH和TPA硬度及热粘度之间的相关性
Figure GAB00000000000171105000172
Figure GAB00000000000171105000181
实施例9
通过凝胶渗透层析/多角度激光散射(“GPC/MALLS”)
制备市售可得的
Figure GAB00000000000171105000182
的水性储备稀溶液并将0.20克吉兰糖胶样品连同0.01克乙二胺四乙酸(“EDTA”)溶解于200ml去离子水中来制备本发明高性能吉兰糖胶的水性储备稀溶液。将这些溶液加热至50℃，冷却，然后用已经0.2微米滤膜过滤的25mM四甲基氯化铵稀释至所选浓度(0.033-0.050％吉兰糖胶)。
GPC/MALLS系统由沃特斯600控制器、沃特斯610HPLC泵、沃特斯717+自动进样器、连续的两根GPC柱(30cm沃特斯超水凝胶(Ultrahydrogel)2000柱和30cm沃特斯超水凝胶线性柱)、DAWN DSP激光光度计(加州圣巴巴拉市怀亚特技术公司(Wyatt Technology Corp.，Santa Barbara，CA)和沃特斯410差式折光仪(所有沃特斯产品均购自马萨诸塞州米尔福德市沃特斯公司(Waters corp.，Milford，MA))构成。然后将0.10mL样品注射入洗脱流动相(25mM四甲基氯化铵，0.50ml/分钟)，体积排阻层析柱根据分子大小对其进行分离。随着样品从柱上洗脱，通过光散射和折射率检测器测定相对分子量和浓度概况。采用0.145的折射率增量(dh/dc)来测定样品浓度(和相对分子量)与洗脱体积的函数关系。根据参考文献报道数值(参见Paoletti等，CarbohydratePolymers.15：171(1991))和水性盐溶液中多糖的典型数值选择该值。
采用8-16号光散射检测器的线性外推计算相对重均(“Mw”)和数均(“Mn”)分子量。计算三种市售可得
Figure GAB00000000000171105000183
吉兰糖胶样品的重均和数均分子量的平均值以提供对照相对分子量，将其指定为1.0。该值提供了比较实验批次与市售产品的归一化值。表6给出了相对分子量结果。通过该方法(获得)的这些结果显示市售可得
Figure GAB00000000000171105000184
样品的分子量明显低于本发明高性能低酰基吉兰糖胶的样品。该数据表明高性能低酰基吉兰糖胶样品的平均Mw是对照市售可得低酰基吉兰糖胶样品的1.83倍。
表6.通过GPC/MALLS获得的相对分子量检测值
实施例10
通过原子力显微镜(“AFM”)获得的相对分子量检测值
将0.1g吉兰糖胶在100mL去离子水中水合并加热至50℃来制备0.1％吉兰糖胶溶液。用去离子水进一步稀释这些原液用于AFM检测。利用10μL移液管吸取0.1％吉兰糖胶溶液的等份试样，用10mL或20mL去离子水稀释。将25μL这些稀释的吉兰糖胶溶液(0.5ppm和1.0ppm)喷洒到新鲜切割的云母表面，约50℃在真空烘箱中干燥30分钟。
采用纽约州伍德伯里市维科仪器公司(Vccco Instruments Inc.，Woodbury，NY)的
Figure GAB00000000000171105000192
IIIa使干燥的样品成像。利用轻扣模式蚀刻二氧化硅(tapping mode etched silica)(“TESP”)尖管以轻叩方式(间接接触方式)使用200μL“J”期(“J”stage)。收集该云母表面上各种位置的各样品连续的至少10个5μL×5μL扫描(图像)。利用至少2个代表性的5μL×5μL扫描图像计算各样品的吉兰糖胶链轮廓长度(contour length)。检测各样品的约200个分子的轮廓长度以产生相对平均分子量和分布。
通过AFM分析两种市售可得样品(批号5G3908A和5G3928A)和一种本发明高性能吉兰糖胶样品的分子量。计算两种市售可得
Figure GAB00000000000171105000194
吉兰糖胶样品的轮廓长度平均值以提供对照相对分子量，将其指定为1.0。该值提供了比较实验批次与市售产品的归一化值。表7给出了相对分子量结果。“n”列表示用于检测轮廓长度的分子数。AFM结果用作支持GPC/MALLS结果的第二种独立分子量技术，从而证实本发明的新型高性能低酰基吉兰糖胶的分子量明显高于市售可得的低酰基吉兰糖胶。
表7.通过AFM进行吉兰糖胶的相对分子量分析
Figure GAB00000000000171105000201
实施例11
高性能低酰基吉兰糖胶的透明度和酰基含量
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清多批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌PHB-缺陷型菌株的发酵培养液。用氢氧化钾使发酵培养液脱酰化，然后按照实施例1的方法将其回收成干粉。为检测透明度，按照实施例3所述方法用去离子水将3g干粉重建成1％的浓度。将重建的热凝胶倒入试管，用分光光度计检测490nm的透光率百分比。表8显示了透光率百分比。
为检测酰基含量，将1.5g干粉与15g 60％异丙醇(“IPA”)一起旋振15秒。旋振后，以5000rpm离心10分钟，倾倒除去液体。用60％IPA重复该操作5次以除去未结合的有机酸盐，最后利用15g 99％IPA以促进样品的干燥。最后一次倾倒后，将样品从离心试管中取出，在50℃真空烘箱中干燥过夜。然后，80℃在5mL去离子水中重建25mg干粉。随后于100℃在0.5M三氟乙酸(“TFA”)中水解过夜。将水解的样品稀释至25mL，经0.45μL尼龙碟型注射过滤器过滤。利用装配有
Figure GAB00000000000171105000202
ICE-AS1离子交换柱和电导率检测器的加州桑尼维尔市迪奥奈克斯公司(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA)的HPLC系统定量测定滤液中的有机酸。表8显示了酰基含量百分比。
表8.高性能低酰基吉兰糖胶的透明度和酰基含量
  批次/批号   ％透光率   ％甘油酸基   ％乙酸基   总％Ac
  GB05811-1   92.0   0.00   0.03   0.03
  GB05810-1   91.6   0.03   0.04   0.07
  GB05624-1   82.8   0.02   0.04   0.06
  GB06623-1   88.7   0.19   0.05   0.24
  GB06622-1   87.5   0.07   0.01   0.08
  GB06611-1   66.4   0.30   0.07   0.37
  GB06610-1   88.4   0.32   0.03   0.35
  GB06405-1   82.0   0.23   0.09   0.32
  GB06602-1   85.5   0.07   0.06   0.13
  GB05443-1   88.9   0.10   0.10   0.20
  GB05664-1   89.1   0.58   0.08   0.66
  GB05663-4   92.5   0.03   0.11   0.14
  GB05255-6   88.6   0.02   0.10   0.12
  GB05341-74   93.0   0.51   0.20   0.71
实施例12
高性能部分脱酰化吉兰糖胶的透明度和酰基含量
采用实施例1所述化学/酶学处理方法澄清两批4500升伊乐藻鞘氨醇单胞菌(利用PHB产量低的突变株)的发酵培养液。用氢氧化钾使发酵培养液温和脱酰化，然后按照实施例1的方法将其回收成干粉(批号0805341在两种不同的pH条件下脱酰化)。按照实施例3所述方法用去离子水将干粉重建成1％的浓度。将重建的热吉兰糖胶倒入试管，用分光光度计检测490nm的透光率百分比。再用去离子水中重建干粉样品，然后于100℃在0.5M TFA中水解18小时，通过HPLC检测水解吉兰糖胶中的甘油酸基和乙酸基组分。表9显示了脱酰化pH、透光率百分比和酰基含量百分比。
表9.高性能部分脱酰化吉兰糖胶的透明度和酰基含量
  批次/批号   脱酰化pH   ％透光率   ％甘油酸基   ％乙酸基   总％Ac
  GB05662-1   10.91   68.6   1.07   1.60   2.67
  GB05341-1   10.55   84.9   5.32   2.70   8.02
  GB05341-3   10.69   92.8   2.92   2.21   5.13
实施例13
利用高性能低酰基吉兰糖胶提高甜食凝胶在巴斯德消毒期间的热稳定性
利用英国伍斯特郡马尔文仪器有限公司的波林CVO流变仪(Bohlin CVORheometer，Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，United Kingdom)比较三种高性能低酰基吉兰糖胶样品(批号GB06612-8、GB06405-5和GB06622-6)和一种市售可得
Figure GAB00000000000171105000211
样品(批号5G3928A)在为甜食凝胶系统(参见表10的配方)提供热稳定性中的相对有效性。利用流变仪(4-cm 4°圆锥平板几何构造(cone and plate geometry)，0.15应力和1Hz，)检测以5℃/分钟从80℃冷却至20℃时热甜食凝胶溶液的弹性模数(“G”’)。然后检测将其以5℃/分钟从20℃再加热至90℃时凝胶的G’。以前测定到再加热期间最低5Pa的G’是甜食凝胶系统在常规巴斯德消毒过程中(85℃，30分钟)维持其完整性所必需的。各吉兰糖胶样品测试了0.0125％-0.025％之间的三种不同浓度，绘制再加热期间各样品的最低G’与吉兰糖胶浓度的函数图。采用内插法以该图测定达到5Pa G’所需的吉兰糖胶浓度。表11显示了所测试各样品提供热稳定性的相对有效性，其表示为达到5Pa G’所需的浓度。这些结果显示要向甜食凝胶系统提供相似的热稳定性，三种高性能吉兰糖胶的所需用量比
Figure GAB00000000000171105000221
的用量平均低24％。
表10.用于热稳定性评估的甜食凝胶配方
  成分   ％
  吉兰糖胶   0.0125-0.025不等
  角叉菜聚糖   0.24
  豆角胶   0.08
  魔芋粉末   0.16
  糖   20
  KCl   0.1
  0.3M CaCl2溶液   2
  1.2M pH 3.9柠檬酸缓冲液   1
  去离子水   至100
表11.吉兰糖胶样品在为甜食凝胶系统提供热稳定性中的相对有效性
Figure GAB00000000000171105000222
实施例14
高性能低酰基吉兰糖胶在饮用果冻中的应用
在饮用果冻中使用浓度在0.06％-0.1％之间的高性能吉兰糖胶(批号GB06623-7)并将其与用0.1％市售可得
Figure GAB00000000000171105000223
样品(批号5G3928A)制备的对照作比较。将吉兰糖胶和柠檬酸钠混合，在搅拌下将该混合物加入去离子水中来制备表12所示制剂。然后，将混合物加热至90℃。随后加入其余成分，90℃搅拌1分钟。然后用热的去离子水补充因蒸发而损失的水。用热溶液填充铝衬里的塑料饮用果冻袋并热封。最后，将该果冻袋在85℃水浴中经巴斯德消毒30分钟，然后用冷的流动自来水冷却至室温。
表12.饮用果冻配方
  成分   ％
  白葡萄汁浓缩液(56°白利)   25.3
  柠檬酸钠   0.3
  柠檬酸   0.25
  乳酸钙   0.05
  吉兰糖胶   从0.06-0.1不等
  去离子水   至100
室温下保存一周后评估饮用果冻的脱水收缩情况(从凝胶分离的水％)和凝胶质地(通过三成员味觉组)。根据表13所示的脱水收缩和感官评估结果，高性能吉兰糖胶浓度在0.06％-0.07％之间的样品获得与用0.1％制备的对照品相似的饮用果冻。因此，高性能吉兰糖胶的所需用量远低于目前可用的吉兰糖胶。
表13.水饮用果冻的脱水收缩和感官评估
Figure GAB00000000000171105000232
实施例15
高性能低酰基吉兰糖胶在糖果果冻中的应用
在表14所示的典型糖果果冻制剂中比较市售可得的
Figure GAB00000000000171105000233
样品(批号5G3901A)和本发明的高性能低酰基吉兰糖胶样品(批号GB06405-5)。在锅中煮沸玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和水(A)来制备制剂。干混合糖、吉兰糖胶和磷酸盐(B)，然后将其分散入所述锅中同时搅拌。将该混合物煮至沸腾同时搅拌，然后煮沸2-3分钟以确保吉兰糖胶水合。逐步加入糖(C)以避免该批(混合物)冷却并通过煮沸使之溶解。然后使混合物降低至79％的折射计可溶性固体同时搅拌。然后混合酸和柠檬酸盐溶液(D)(如果需要还可加入调味剂和色素)同时搅拌。最后，将混合物立即置于制备的淀粉模具中，在30℃-35℃(86°F-95°F)维持2-3天直至获得82％-83％的折射计可溶性固体。
表14.糖果果冻配方
Figure GAB00000000000171105000241
进行4次试验：一份对照为0.8％
Figure GAB00000000000171105000242
三份含浓度水平为0.8％、0.6％和0.4％的高性能吉兰糖胶。样品用淀粉模制成直径25mm、高10mm的碟形。测试所制备样品在70％压缩度时的TPA硬度。表15所示的报道数值是每次试验的样品平均TPA硬度，加上或减去一个标准偏差。
表15.糖果果冻的TPA评估
Figure GAB00000000000171105000243
在对照浓度(0.8％)，高性能吉兰糖胶产生的平均TPA值比
Figure GAB00000000000171105000244
吉兰糖胶高233％。此外，0.4％浓度的高性能吉兰糖胶获得的TPA硬度等于对照浓度(0.8％)的
Figure GAB00000000000171105000245
吉兰糖胶。这表明在糖果果冻中可用约不到50％的高性能吉兰糖胶替代
Figure GAB00000000000171105000246
吉兰糖胶。
实施例16
高性能低酰基吉兰糖胶在胶状糖果中提供热稳定性的应用
比较表16所示胶状糖果制剂中的市售可得
Figure GAB00000000000171105000247
样品(批号6A5307A)和本发明高性能吉兰糖胶的样品(批号GB06622-8)。可通过首先配制水和明胶(A)的前溶液(presolution)，然后将该溶液在60℃(140°F)维持3-4天小时以溶解来制备该制剂。同时，在锅中煮沸玉米糖浆、水和柠檬酸钠溶液(B)。然后干混合糖和吉兰糖胶(C)，并将其分散入所述锅中同时搅拌。将该混合物煮至沸腾同时搅拌，并煮沸2-3分钟以确保吉兰糖胶水合。随后，逐步加入糖(D)以避免该批次冷却并通过煮沸使之溶解。然后使混合物降低至85％-86％的折射计可溶性固体同时搅拌。然后加入明胶前溶液(A)并充分搅拌。接着加入酸(E)和调味剂及色素(如果需要的话)同时搅拌。该混合物的折射计可溶性固体约77％。最后，将混合物立即置于制备的淀粉模具中，在25℃-30℃(77°F-86°F)维持2-3天直至获得81％-82％的折射计可溶性固体。
表16.胶状果糖配方
Figure GAB00000000000171105000251
进行5次试验：一份包含吉兰糖胶(“明胶对照”)，两份含
Figure GAB00000000000171105000252
(0.24％和0.12％)，两份含高性能吉兰糖胶(0.12％和0.06％)。样品用淀粉模制成直径25mm、高10mm的碟形。将完成的各样品包装在蒸汽不可透过定向聚丙烯热密封袋中，在45℃的实验室烘箱中测试其热稳定性。随着样品在此渐升温度下变形及融化，它们的直径增加。8小时后，检测样品的平均直径，计算样品平均直径的的增量。表17显示了检测值。
表17.胶状糖果的热稳定性评估
Figure GAB00000000000171105000253
Figure GAB00000000000171105000261
与明胶对照相比，评估的任何类型、任何浓度的吉兰糖胶明显降低了平均直径的增加量，然而，通过观察判断的直径平均增加10％是认为样品热稳定性可接受所允许的最高水平。0.24％
Figure GAB00000000000171105000262
样品获得足够的热稳定性(即，直径平均增加≤10％)。通过比较，高性能吉兰糖胶仅在0.06％的浓度即获得足够的热稳定性。通过该热稳定性检测，在胶状糖果中可用约75％浓度的高性能吉兰糖胶替代
Figure GAB00000000000171105000263
实施例17
高性能低酰基吉兰糖胶作为质地改性剂在水甜食凝胶中的应用
制备两种甜食凝胶：凝胶A包含
Figure GAB00000000000171105000264
凝胶B包含高性能低酰基吉兰糖胶，二者均还包含黄原胶和豆角胶。表18提供了甜食凝胶配方。虽然凝胶A的吉兰糖胶含量高于凝胶B，但凝胶A和凝胶B均具有相似的质地和食用价值(eating quality)。因此，高性能低酰基吉兰糖胶达到与
Figure GAB00000000000171105000265
吉兰糖胶相同效果的用量较低。
表18.比较含有
Figure GAB00000000000171105000266
或高性能低酰基吉兰糖胶的水甜食凝胶
虽然上文描述了目前认为的本发明优选实施方式，但应该知道本发明不限于上述实施方式。相反，本发明应该覆盖包含在随附权利要求书的构思和范围内的各种改进和等效配置。

Claims (27)

1.一种制备吉兰糖胶的方法，所述方法包括以下步骤：
a.在发酵培养基中发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌；
b.通过化学/酶学方法澄清该发酵培养液；
c.用苛性剂使经澄清化的发酵培养液脱酰化；
d.从该发酵培养液中沉淀所述吉兰糖胶，所述沉淀的吉兰糖胶的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀的吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度约117g/cm2-约400g/cm2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述伊乐藻鞘氨醇单胞菌是PHB-缺陷型菌株。
5.如权利要求1或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述澄清步骤包括以下步骤：
a.加热至约30℃-约70℃；
b.用一种或多种抗氧化剂连同一种或多种螯合剂及溶菌酶处理；
c.用一种或多种表面活性剂处理；和
d.用蛋白酶处理。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂是硫酸钠。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述螯合剂选自：乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、柠檬酸、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、阳离子交换树脂、二盐酸乙二胺、二乙酸乙二胺、乙二胺锂盐和二氢碘酸乙二胺。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述螯合剂是乙二胺四乙酸二钠。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述螯合剂是柠檬酸。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自：十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、卵磷脂、单酸甘油酯、单酸甘油酯的酒石酸酯、磷酸化单酸甘油酯、乳酰乳酸单酸甘油酯、乙酰单酸甘油酯、琥珀酰单酸甘油酯、乙氧基化单酸甘油酯、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酰乳酸钠和丙二醇酯。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
12.如权利要求1或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述苛性剂选自：氢氧化钾、氢氧化钠和磷酸三钠。
13.如权利要求1或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述苛性剂是氢氧化钾。
14.一种通过权利要求1或权利要求4所述方法制备的吉兰糖胶。
15.一种酰基总含量低于约2.0％的吉兰糖胶，其中所述吉兰糖胶的0.2％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约300g/cm2。
16.如权利要求15所述的吉兰糖胶，所述吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2。
17.如权利要求16所述的吉兰糖胶，其特征在于，所述吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2-约400g/cm2。
18.如权利要求16所述的吉兰糖胶，其特征在于，在水中以1％再水合的所述吉兰糖胶的透光率大于约60％。
19.如权利要求16所述的吉兰糖胶，其特征在于，所述吉兰糖胶的质地概况分析硬度至少约91b。
20.如权利要求16所述的吉兰糖胶，其特征在于，所述吉兰糖胶的1％吉兰糖胶.90℃热粘度至少约25cP。
21.如权利要求15所述的吉兰糖胶，其特征在于，在水中以1％再水合的所述吉兰糖胶的透光率大于约60％。
22.一种包含如权利要求14或权利要求16所述吉兰糖胶的工业产品。
23.如权利要求22所述的工业产品，其特征在于，所述产品选自：饮料、糖果、果酱和果冻、合成食品、水基凝胶、馅饼馅料、甜食凝胶、糖霜、酸奶、布丁、搅打食物、奶油、胶化牛奶和冰激淋。
24.如权利要求22所述工业产品，其特征在于，所述产品选自：胶化宠物食品、微生物和组织培养基、液体清洁剂、牙膏、肥皂和沐浴露、除臭凝胶、空气清新凝胶和软胶囊。
25.如权利要求22所述的工业产品，其特征在于，所述工业产品中所述吉兰糖胶的使用浓度比目前市售可得的低酰基吉兰糖胶的使用浓度低约15％-约90％。
26.如权利要求22所述的工业产品，其特征在于，所述吉兰糖胶与至少一种选自下组的胶凝水胶体联用：角叉菜聚糖、豆角胶，魔芋和黄原胶。
27.一种制备低酰基吉兰糖胶的方法，所述方法包括以下步骤：
a.在发酵培养基中发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌；
b.用苛性剂使经澄清化的发酵培养液脱酰化；
c.通过过滤澄清该发酵培养液；和
d.从经澄清化的发酵培养液中沉淀所述吉兰糖胶；
其中，所述吉兰糖胶的0.1％吉兰糖胶凝乳计凝胶强度至少约117g/cm2。
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