BRPI0719109A2 - Métodos para tratar doenças inflamatórias crônicas usando um antagonista de gm-csf - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA TRATAR DOENÇAS INFLAMATÓRIAS CRÔNICAS USANDO UM ANTAGONISTA DE GM-CSF”.

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N°. 60/860.780, depositado em 21 de Novembro de 2006; e Pedido Provisório U.S. Nc. 60/902.742, depositado em 21 de Fevereiro de 2007, cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência.

Antecedentes da Invenção

A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória tipicamente progressiva que afeta até 1% da população mundial adulta (Gabriel, Rheum Dis Clin North Am. 27:269-81, 2001). Recomendações atuais para tratamen- to de AR incluem tratamento anterior com fármacos antirreumáticos de modi- ficação de doença (DMARDs) após o diagnóstico ter sido estabelecido. Os fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs), e até recentemente, inibidores de COX-2 têm sido amplamente usados enquanto se espera a confirmação do diagnóstico ou posteriormente no andamento da doença em conjunto com DMARDs. O metotrexato é o DMARD mais amplamente usa- do, mas outros agentes, incluindo hidroxicloroquina, sulfassalazina, ouro, minociclina, e lefíunomida, são também prescritos. Os corticoesteroides po- dem ser usados em combinação com DMARDs, mas em geral, somente bai- xas doses são usadas para minimizar eventos adversos (0'Dell, New Engl. J. Med. 350:2591-2603, 2004).

Vários novos fármacos biológicos foram recentemente aprova- dos para tratamento de AR. O etanercept (Enbrel®) bloqueia o Fator de Ne- crose Tumoral alfa (TNF-α); o infliximabe e o adalimumabe (Remicade® e Humira®, respectivamente) bloqueiam TNF-α e TNF-β; e o Anakinra (Kine- ret®) é um inibidor de IL-1. Esses agentes agem rapidamente e foram mos- trados como sendo modificadores de doença (junta lenta/erosão óssea) (Ol- sen & Stein, New Engl. J. Med 350: 2167- 2179, 2004). Entretanto, alguns problemas permanecem com essas terapias. Alguns pacientes não alcan- çam uma resposta adequada aos inibidores de TNF. Ademais, em alguns * pacientes, o benefício terapêutico do inibidor de TNF é perdido pelo tempo. O bloqueio do caminho de TNF tem sido também associado com a reativa- ção de tuberculose bem como o risco aumentado de infecções graves, des- mielinação, e linfoma, embora pacientes com AR estejam em maior risco de 5 linfoma do que a população geral. Anakinra tem uma curta meiavida e preci- sa ser administrado como uma injeção diária e, portanto, é usado menos frequentemente do que os inibidores e TNF de ação mais longa como uma terapia biológica de primeira linha.

Dados recentes no uso de rituximabe (Mabthera®), um anticorpo 10 anti-CD20 monoclonal, em combinação com metotrexato em pacientes com AR têm mostrado benefício ao longo de um período estendido de tempo a- pós duas infusões do anticorpo (Edwards e outros, New Engl. J. Med 350: 2572-2581, 2004).

O metotrexato é usado como um DMARD para tratar AR e ou- 15 tras doenças artríticas inflamatórias e indicações autoimunes, incluindo pso- ríase e lúpus eritematoso sistêmico. O metotrexato é particularmente eficaz para tratar artrite psoriática e artrite idiopática juvenil. O fármaco é também usado em quimioterapia de câncer em doses mais altas do que são reco- mendadas para o tratamento de artrite inflamatória. Quando usado em qui-

- 20 mioterapía, o metotrexato pode causar supressão da medula óssea resul- tando em produção diminuída de todos os tipos de células sanguíneas, par- ticularmente quando usado em combinação com qualquer de um número de outros fármacos incluindo corticoesteroides, fármacos anti-inflamatórios não- esteroidais, ciclosporina, trimetoprima e certos antibióticos. Embora o meto- 25 trexato seja geralmente bem tolerado nos regimes de dosagem usados para

o tratamento de artrite (ou psoríase), até nessas doses mais baixas, o meto- trexato pode causar supressão da medula óssea e especialmente neutrope- nia. Por exemplo, em relatórios de casos (Sosin & Handa1 Brit. Med. J. 326: 266-267, 2003), a neutropenia foi relatada em pacientes tratados com doses 30 semanais de metotrexato entre 5 mg e 17,5 mg. Recomendações por dosa- gem de metotrexato em AR1 tal como as diretrizes da Sociedade Britânica de Reumatologia (Julho de 2000) são 7,5 mg de Metotrexato semanalmente, aumentando em 2,5 mg a cada seis semanas até uma dose máxima sema- nal de 25 mg. Assim, a neutropenia desenvolvida nesses pacientes em do- ses significativamente abaixo da dose máxima recomendada, especialmente com terapias concomitantes.

5 Em quimioterapia incluindo metotrexato, GM-CSF pode ser

prescrito para corrigir os baixos níveis de neutrófilo no sangue e, portanto reduz a duração e gravidade da neutropenia (Am. Soc. Clin. One. 2006, J. Clin. Oncol. 24: 1o de Julho de 2006). Nesse ambiente clínico, o GM-CSF é usado como um fator de crescimento hematopoiético para intensificar a pro- 10 dução de granulócitos (incluindo neutróíilos) e macrófagos. Por exemplo, a administração a curto prazo de GM-CSF em pacientes com câncer pode le- var a um rápido aumento nas contagens de neutrófilos e reduz a neutropenia em pacientes tratados com regime de quimioterapia incluindo metotrexato (Aglietta e outros, Cancer 72: 2970-2973, 1993). A eficácia estabelecida de 15 GM-CSF em tratar neutropenia devido ao metotrexato considera que o anta- gonismo de GM-CSF pode ter o efeito oposto, isto é, o antagonismo de GM- CSF pode contribuir para a neutropenia, particularmente em pacientes con- comitante ou previamente tratados com metotrexato.

A neutropenia é um efeito colateral significativo e sério de várias 20 terapias atuais para artrite inflamatória incluindo antagonistas de citoquina. O antagonista de IL-1 anakinra leva a um risco aumentado de neutropenia, ou sozinho ou particularmente quando usado em combinação com um antago- nista de TNF (Fleischmann e outros, Expert Opinion Biol Ther. 4:1333, 2004). O infliximabe também foi associado com um risco aumentado de neu- 25 tropenia.

Há aqui atualmente uma necessidade por tratamentos adicionais de AR, particularmente em pacientes recebendo compostos antifolatos tal como metotrexato. A invenção atuai aborda essa necessidade.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção fornece métodos para tratar um paciente

sofrendo de uma condição inflamatória crônica tal como uma condição artrí- tica inflamatória, por exemplo, AR, com um antagonista de GM-CSF. Em *■ modalidades típicas, o antagonista de GM-CSG é administrado em combina- ção com um composto antifolato, por exemplo, metotrexato, em quantidades que não causem neutropenia. Em algumas modalidades o antagonista de GM-CSF é produzido de forma recombinante, por exemplo, um anticorpo 5 monoclonal recombinante. Em outras modalidades, o antagonista de GM- CSF, por exemplo, anti-GM-CSF purificado de plasma humano, é purificado a partir de uma fonte natural.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um paciente sofrendo de uma doença inflamatória crônica, por exemplo, artrite 10 reumatoide, compreendendo administrar um composto antifolato, por exem- plo, metotrexato, e administrar um antagonista de GM-CSF ao paciente, on- de o composto antifolato, por exemplo, metotrexato, e o antagonista de GM- CSF são fornecidos em uma quantidade suficiente para reduzir os sintomas da doença inflamatória crônica, mas em uma quantidade que não induza à 15 neutropenia. Um antagonista de GM-CSF pode ser, por exemplo, um anti- corpo anti-GM-CSF, um anticorpo de receptor anti-GM-CSF; um receptor de GM-CSF solúvel; anticorpo mimético de citocromo b562, um adnectin, um anticorpo mimético de arcabouço de lipocalina, um anticorpo mimético de calixareno, e um anticorpo simifar à ligação peptidomimética.

‘ 20 Em muitas modalidades, o antagonista de GM-CSF é um anti-

corpo para GM-CSF, isto é, um anticorpo anti-GM-CSF. Em várias modali- dades, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclo- nal, ou um anticorpo tal como um nanocorpo ou um anticorpo camelídeo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como 25 um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv, ou um anticorpo de domínio (dAB). O anticorpo pode ser também modificado, por exemplo, para melhorara estabi- lidade. Assim, em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado em polieti- Ieno glicol.

Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma afinidade de a- proximadamente 100 pM a aproximadamente 10 nM, por exemplo, de apro- ximadamente 100 pM a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamen- te 600 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 800 pM, aproxima- damente 900 pM, ou aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM. Em modalidades adicionais, o anticorpo tem uma afinidade de aproximadamente

1 pM a aproximadamente 100 pM, por exemplo, uma afinidade de aproxima- 5 damente 1 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproxi- madamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 25 pM, a- proximadamente 30 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 80 pM, ou aproximadamente 90 pM a aproximadamente 100 pM. Em algumas 10 modalidades, o anticorpo tem uma afinidade de aproximadamente 10 a a- proximadamente 30 pM.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo neutrali- zante. EM modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo huma- 15 no. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável humana. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve humana. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada humana, tal como uma cadeia gama.

Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga ao mesmo epíto-

po como um anticorpo quimérico 19/2. O anticorpo pode, por exemplo, com- preender as regiões Vh e Vl do quimérico 19/2. O anticorpo pode também compreender uma região constante da cadeia pesada humana tal como uma região gama. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende o CDR1, CDR2 e CDR3 da região Vh do quimérico 19/2. Em modalidades adicionais,

o anticorpo compreende o CDR1, CDR2 e CDR3 da região Vl do quimérico 19/2. Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende o CDR1, CDR2 e CDR3 da região Vh e Vl do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende o CDR3 da região Vh e o CDR3 da região Vl do quimérico 19/2.

Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma meia vida de aproximadamente 7 a aproximadamente 25 dias. 1 Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o antago-

nista de GM-CSF, por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF, é administrado por injeção ou por infusão. Por exemplo, o antagonista de GM-CSF pode ser administrado de foram intravenosa ao longo de um período entre aproxima- 5 damente 15 minutos e aproximadamente 2 horas.

Em outras modalidades, o antagonista de GM-CSF é adminis- trado de forma subcutânea por injeção de bolus.

Em modalidades adicionais, o antagonista de GM-CSF é admi- nistrado de forma intramuscular.

10 Um anticorpo de GM-CSF pode, por exemplo, ser administrado

em uma dose entre aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal e aproxima- damente 10 mg/kg de peso corporal.

Em algumas modalidades, o tratamento com antagonista de GM=CSF compreende uma segunda administração do antagonista de GM- 15 CSF.

A invenção também fornece um método para tratar uma doença inflamatória crônica, por exemplo, artrite reumatoide, compreende adminis- trar um anticorpo anti-GM-CSF como descrito aqui em uma quantidade tera- peuticamente eficaz. Em algumas modalidades, o antagonista anti-GM-CSF,

> 20 por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF, é administrado a um paciente que tem uma doença neurodegenerativa tal como doença de Alzheimer.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

Como usado aqui, “doença inflamatória crônica” refere-se a do- 25 enças associadas com uma resposta inflamatória de duração prolongada. Em alguns casos, a resposta inflamatória pode durar semanas, meses ou até indefinidamente. A duração estendida da resposta inflamatória é frequen- temente provocada por um estímulo persistente à resposta inflamatória. A resposta inflamatória causa danos no tecido. A inflamação crônica pode ser 30 o resultado da progressão de inflamação aguda. A inflamação crônica pode também decorrer de episódios de repetição de inflamação aguda ou pode se desenvolver novamente. Um número de doenças inflamatórias revelou-se associado com infecção patogênica persistente, matéria estranha não viva irritativa que não pode ser removida por quebra enzimática ou fagocitose, ou um componente de tecido “normal” que é reconhecido como não-próprio (mais frequentemente associado com doenças autoimunes). A aparência 5 histológica de inflamação crônica frequentemente envolve um infiltrado de células inflamatórias misturadas que é mais frequentemente associado com a presença de macrófagos, linfócitos e células de plasma com polimorfos de neutrófilos e eosinófilos como os menores componentes possíveis (polimor- fos de neutrófilos e eosinófilos são associados em maiores números com 10 inflamação aguda). Os exemplos de doenças inflamatórias incluem artrite, por exemplo, AR, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite idiopática juvenil, e outras doenças inflamatórias da junta; doenças inflamatórias do intestino, por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn, síndrome de Bar- rett, ileíte, enterite, e enteropatia sensível a glúten, distúrbios inflamatórias 15 do sistema respiratório, tal como asma, síndrome da angústia respiratória adulta, rinite alérgica, silicose, doença obstrutiva crônica das vias aéreas, doenças de hipersensibilidade do pulmão, bronquiectasia; doenças inflama- tórias da pele, incluindo psoríase, escleroderma, e dermatoses inflamatórias tal como eczema, dermatite atópica, urticária, e prurite; distúrbios envolven- 20 do inflamação do sistema nervoso central e periférico, incluindo esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain- Barre, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, e doenças neuro- degenerativas tal como doença de Alzheimer. Várias outras doenças infla- matórias podem ser tratadas usando os métodos da invenção. Essas doen- 25 ças incluem lúpus eritematoso sistêmico, doença renal imunomediada, por exemplo, glomerulonefrite, e espondiloartropatias; e doenças com um com- ponente inflamatório crônico indesejável tal como esclerose sistêmica, mio- patias inflamatórias idiopáticas, síndrome de Sjogren, vasculite, sarcoidose, tiroidite, gota, otite, conjuntivite, sinusite, sarcoidose, síndrome de Behcet, 30 doenças hepatobiliares, tais como hepatite, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante; inflamação e lesão isquêmica no sistema cardiovascular tal como doença do coração isquêmico, derrame, e < aterosclerose; e rejeição a enxertos, incluindo rejeição a aloenxerto e doen- ça de enxerto x hospedeiro. Várias outras doenças inflamatórias incluem tuberculose e colecistite crônica. Doenças inflamatórias crônicas adicionais são descritas, por exemplo, em Harrison's Principies of Internai Medicine, 5 12a Edição, Wilson e outros, eds., McGraw-HiII, Inc.

O termo “artrite reumatoide” (AR) refere-se à doença inflamatória crônica que se desenvolve como um distúrbio autoimune e está associado com inflamação crônica das juntas. Frequentemente, a inflamação se espa- lha para tecidos em torno das juntas e a outros órgãos. Tipicamente, a AR é 10 uma doença progressiva que pode causar destruição das juntas e incapaci- dade funcional. A inflamação nas juntas associada ao AR causa inchaço, dor, rigidez, e vermelhidão nas juntas. A inflamação da doença reumatoide pode também ocorrer em tecidos em torno das juntas, tal como os tendões, ligamentos e músculos. Em alguns pacientes com AR, a inflamação crônica 15 leva à destruição da cartilagem, osso e ligamentos causando deformidade das juntas. O dano às juntas pode ocorrer no início da doença e pode ser progressivo. O dano progressivo às juntas não necessariamente se correla- ciona com o grau de dor, rigidez, ou inchaço presente nas juntas.

Como usado aqui, “Fator de Estímulo de Colônia de Macrófagos

* 20 e Granulócitos” (GM-CSF) refere-se a uma pequena glicoproteína ocorrendo naturalmente com ligações dissulfeto internas tendo um peso molecular de aproximadamente 23 kDa. Em seres humanos, é codificado por um gene localizado dentro do agrupamento de citoquina no cromossomo humano 5. A seqüência do gene humano e proteína é conhecida. A proteína tem uma se- 25 quência de sinal de N-terminal, e um domínio de ligação de receptor de C- terminal (Rasko e Gough em: The Cytokine Handbook, A. Thomson, e ou- tros, Academic Press, Nova Iorque (1994) páginas 349 a 369). Sua estrutura tridimensional é similar a das interleucinas, embora as seqüências de ami- noácido não sejam similares. O GM-CSF é produzido em resposta a um nú- 30 mero de mediadores inflamatórios por células mesenquimais presentes no ambiente hematopoiético e em sítios periféricos de inflamação. O GM-CSF é capaz de estimular a produção de granulócitos neutrofílicos, macrófagos, e colônias de granulócitos e macrófagos misturados de células de medula ós- sea e podem estimular a formação de colônias de eosinófilos de células pro- genitoras do fígado fetal. O GM-CSF pode também estimular algumas ativi- dades funcionais em granulócitos e macrófagos maduros.

5 O termo “receptor de fator de estímulo de colônia de macrófagos

e granulócitos (GM-CSFR)” refere-se a um receptor ligado à membrana ex- presso em células que traduz um sinal quando ligado ao fator de estímulo de colônia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF). O GM-CSFR consiste em uma cadeia de ligação de baixa afinidade de ligante específico (GM-CSFR 10 alfa) e uma segunda cadeia que é exigida para ligação de alta afinidade e transdução de sinal. Essa segunda cadeia é compartilhada pelas cadeias alfa de ligante específico para os receptores de interleucina 3 (IL-3) e de IL-5 e é, portanto, chamada beta comum (beta c). A região citoplasmática do GM- CSFR alfa consiste em uma região conservada proximal da membrana com- 15 partilhada pelas isoformas alfa 1 e alfa 2 e uma região variável de C-terminal que é divergente entre alfa 1 e alfa 2. A região citoplasmática de beta-c con- tém serina proximal de membrana e domínios ácidos que são importantes para a resposta proliferativa induzida por GM-CSF.

O termo “receptor de fator de estímulo de colônia de macrófagos e granulócitos solúvel” (sGM-CSFR) refere-se a um receptor não ligado à membrana que liga GM-CSF, mas não converte um sinal quando ligado ao ligante.

Como usado aqui, um “antagonista de GM-CSF de peptídeo” refere-se a um peptídeo que interage com o GM-CSF, ou seu receptor, para 25 reduzir ou bloquear (ou parcial ou completamente) a transdução de sinal que, de outra forma, resultaria na ligação de GM-CSF a seu receptor cogna- to expresso nas células. Os antagonistas de GM-CSF podem agir reduzindo a quantidade de ligante de GM-CSF disponível a ligar ao receptor (por e- xemplo, anticorpos que uma vez se ligam ao GM-CSF aumentam a taxa de 30 folga de GM-CSF) ou impedem que o ligante se ligue a seu receptor ou por ligação ao GM-CSF ou ao receptor (por exemplo, anticorpos neutralizantes).

O antagonista de GM-CSF pode também incluir outros inibidores de peptí- <■ deo, que podem incluir polipeptídeos que se ligam ao GM-CSF ou seu re- ceptor para parcial ou completamente inibir a sinalização. Um antagonista de GM-CSF de peptídeo pode ser, por exemplo, um anticorpo; um ligante de receptor de GM-CSF natural ou sintético que antagoniza GM-CSF, ou outros 5 polipeptídeos. Um ensaio exemplificado para detectar atividade de antago- nista de GM-CSF é fornecido no Exemplo 1. Tipicamente, o antagonista de GM-CSF de peptídeo, tal como um anticorpo neutralizante, tem um EC5O de 10nM ou menos.

Um antagonista de GM-CSF “purificado” como usado aqui se 10 refere a um antagonista de GM-CSF que é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham-no como encontrado em seu estado nativo. Por exemplo, um antagonista de GM-CSF, tal como um anticorpo anti-GM-CSF, que é purificado a partir do sangue ou plasma, é substancialmente isento de outros componentes de sangue ou plasma, tal 15 como outras moléculas de imunoglobulina. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analíticas tal como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia a líquido de alto de- sempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Tipicamente, “purificado” significa

1 20 que a proteína é ao menos 85% puro, mais preferencialmente ao menos 95% puro, e mais preferencialmente, ao menos 99% puro em relação aos componentes com os quais a proteína naturalmente ocorre.

Como usado aqui, um “anticorpo” refere-se a uma proteína fun- cionalmente definida como uma proteína de ligação e estruturalmente defini- 25 do como compreendendo uma seqüência de aminoácido que é reconhecida por um versado na técnica como sendo derivada da região de estrutura de um gene de codificação de imunoglobulina de um animal que produz anti- corpos. Um anticorpo pode consistir em um ou mais polipeptídeos substan- cialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes 30 de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kapa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como genes de região variável de imunoglobulina miríade. As cadeias leves são classificadas como ou kapa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que, por sua vez, defi- nem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamen- te.

5 Uma unidade estrutural de imunoglobulina típica (anticorpo) é

conhecida como compreendendo uma tetrâmera. Cada tetrâmera é compos- ta de dois pares idênticos de cadeias e polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (aproximadamente 25 kD) e uma cadeia “pesada” (aproxima- damente 50 a 70 kD). O término N de cada cadeia define uma região variá- 10 vel de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos ou mais primariamente res- ponsável pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) se referem a essas cadeias leve e pesa- da, respectivamente.

O termo “anticorpo”, como usado aqui, inclui fragmentos de anti- corpo que retêm especificidade de ligação. Por exemplo, há um número de fragmentos de anticorpo bem caracterizados. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfeto na região de junta para produzir F(ab)’2, um dímero de Fab que ele mesmo é uma cadeia leve unida a VH-CH1 por uma ligação dissulfeto. O F(ab)’2 pode ser reduzido sob con- dições moderadas para quebrar a ligação dissulfeto na região de junta, con- vertendo desse modo o dímero (Fab’)2 em um monômero Fab’. O monômero Fab’ é essencialmente um Fab com parte da região de junta (ver, Funda- mental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Enquanto vá- rios fragmentos de anticorpo são definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um versado na técnica apreciará que os fragmentos po- dem ser sintetizados novamente quimicamente ou utilizando metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo “anticorpo", como usado aqui também inclui fragmentos de anticorpo ou produzidos pela modificação de todos os anticorpos ou sintetizados usando metodologias de DNA recombinante.

Os anticorpos incluem dímeros tais como dímeros Vh-Vl, díme- ros VH, ou dímeros VL, incluindo anticorpos de cadeia única (anticorpos que 1 existem como uma única cadeia de polipeptídeo), tal como anticorpos Fv de cadeia única (sFv ou scFv) nos quais uma região leve variável e uma região pesada variável são unidas (diretamente ou através de um ligante de peptí- deo) para formar um polipeptídeo contínuo. O anticorpo Fv de cadeia única é

5 um heterodímero Vh-Vl covalentemente ligado que pode ser expresso a par- tir de um ácido nucléico incluindo seqüências de codificação Vh e Vl ou uni- das diretamente ou unidas por um ligante de codificação de peptídeo (por exemplo, Huston e outros, Proc. Nat. Acad. ScL USA, 85:5879-5883, 1988). Enquanto VH e VL são conectados um ao outro como uma cadeia única de 10 polipeptídeo, os domínios VH e VL se associam não covalentemente. Alter- nativamente, o anticorpo pode ser outro fragmento, tal como Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv). Outros fragmentos podem também ser gerados, inclu- indo usando técnicas recombinantes. Os anticorpos scFv e um número de outras estruturas convertendo as cadeias de polipeptídeo leve e pesada na- 15 turalmente agregadas, mas quimicamente separadas a partir de uma região de anticorpo V em uma molécula que se dobra em uma estrutura tridimensi- onal substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação de antígeno, são conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S Nos. 5.091.513, 5.132.405, e 4.956.778). Em algumas modalidades, os anti-

1 20 corpos incluem aqueles que foram exigidos em fagos ou gerados por tecno- logia recombinante usando vetores onde as cadeias são separadas como proteínas solúveis, por exemplo, scFv, Fv, Fab, (Fab’)2 ou geradas por tec- nologia recombinante usando vetores onde as cadeias são separadas como proteínas solúveis. Os anticorpos para uso na invenção podem também in- 25 cluir dianticorpos e minianticorpos.

Os anticorpos da invenção também incluem dímeros de cadeia pesada, tal como anticorpos de camelídeos. Como a região VH de um díme- ro de cadeia pesada IgG em um camelídeo não tem que fazer interações hidrofóbicas com uma cadeia leve, a região na cadeia pesada que normal- 30 mente contata uma cadeia leve é alterada para resíduos de aminoácido hi- drofílicos em um camelídeo. Os domínios VH de dímeros de cadeia pesada IgGs são chamados domínios VHH. Os anticorpos para uso na invenção a- tual incluem anticorpos de domínio único (dAbs) e nanocorpos (ver, por e- xempio, Cortez- Retamozo, e outros, Cancer Res. 64:2853-2857, 2004).

Como usado aqui, “região V” refere-se a um domínio de região variável de anticorpo compreendendo os segmentos de Estrutura 1, CDR1, 5 Estrutura 2, CDR2, e Estrutura 3, incluindo CDR3 e Estrutura 4, segmentos que são adicionados ao segmento V como uma conseqüência do rearranjo dos genes da região V de cadeia pesada e de cadeia leve durante a diferen- ciação de célula B. Um “segmento V", como usado aqui, se refere à região da região V (cadeia pesada ou leve) que é codificada por um gene V.

Como usado aqui, “região de determinação de complementari-

dade (CDR)” refere-se às três regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões de “estrutura” estabelecidas pelas regiões variáveis de cadeia leve e pesada. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, numeradas seqüencialmente come- 15 çando do término N, e são também tipicamente identificadas pela cadeia na qual o CDR particular está localizado. Assim, por exemplo, uma CDR3 de Vh está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo na qual ele é encontrado, sendo que uma CDR1 de Vl é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo na qual ele é encontrado.

As seqüências das regiões de estrutura de diferentes cadeias

leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, ou seja, as regiões de estrutura combi- nadas das cadeia leve e pesada constituintes, serve para posicionar e ali- nhar as CDRs no espaço tridimensional.

As seqüências de aminoácido das CDRs e regiões de estrutura

podem ser determinadas usando várias definições bem-conhecidas na técni- ca, por exemplo, Kabat, Chothia, banco de dados internacional ImMunoGe- neTics (IMGT), e AbM (ver, por exemplo, Johnson e outros, acima; Chothia

& Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of mmuno- globulins. J Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. e outros, 1989, Conformati- ons of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. e outros, 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. * Bioi. 227, 799-817; Al-Lazikani e outros, J.MoLBioI 1997, 273(4)). As defini- ções de sítios de combinação de antígenos são também descritas no seguin- te: Ruiz e outros, IMGT, o banco de dados internacional ImMunoGeneTics. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); e Lefranc, M.-P. IMGT, o banco de 5 dados internacional ImMunoGeneTics. Nucleic Acids Res., 1 de Janeiro; 29(l): 207-9 (2001); MacCaIIum e outros, Antibody-antigen interactions: Con- tact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol, 262 (5), 732-745 (1996); e Martin e outros, Proc. Natl Acad. Sd. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin e outros, Methods Enzymol, 203, 121-153, (1991); Pedersen e outros, 10 Immunomethods, 1, 126, (1992); e Rees e outros, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

“Epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Os epítopos podem ser formado de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por 15 dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de a- minoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes desnaturantes onde os epítopos formados por dobramento terciário são tipi- camente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui ao menos 3, e mais usualmente, ao menos 5 ou 8 a 10 20 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Os métodos para de- terminar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalo- grafia por raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

Como usado aqui, “anticorpo neutralizante” refere-se a um anti-

corpo que se liga a GM-CSF e impede a sinalização pelo receptor de GM- CSF, ou inibe a ligação de GM-CSF a seu receptor.

Como usado aqui, “anticorpo quimérico” se refere a uma molécu- la de imunoglobulina na qual (a) a região constante, ou uma parte dela, é alterada, substituída ou trocada tal que o sítio de ligação de antígeno (região variável) é ligado a uma região constante de uma classe diferente ou altera- da, função efetora e/ou espécie, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma en- zima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma parte dessa, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável, ou parte dessa, tendo uma especificidade de antígeno dife- 5 rente ou alterada; ou com seqüências correspondentes de outra espécie ou de outra classe ou subclasse de anticorpo.

Como usado aqui, “anticorpo humanizado” refere-se a uma mo- lécula de imunoglobulina na qual as CDRs de um anticorpo humano receptor são substituídas por CDRs de um anticorpo doador. Os anticorpos humani- 10 zados podem também compreender resíduos de origem doadora nas se- qüências de estrutura. O anticorpo humanizado pode também compreender ao menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina humana. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas seqüências de CDR ou es- 15 trutura importadas. A humanização pode ser executada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Jones e outros, Nature 321 :522-525; 1986; Riechmann e outros, Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen e outros, Science 239:1534-1536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; Patente U.S. N°. 4.816.567), incluindo técnicas tais como anticorpos 20 “superhumanizantes” (Tan e outros, J. Immunol. 169: 1119, 2002) e “recom- posição da superfície” (e.g., Staelens e outros, Mol Immunol. 43: 1243, 2006; e Roguska e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994).

Um anticorpo “humanizado” no contexto desta invenção refere- se a um anticorpo humano elaborado tendo uma especificidade de ligação 25 de um anticorpo de referência. Um anticorpo “humanizado” para uso nesta invenção tem uma molécula de imunoglobulina que contém seqüência míni- ma derivada de imunoglobulina não humana. Tipicamente, um anticorpo é “humanizado” unindo-se uma seqüência de DNA codificando um determinan- te de especificidade de ligação (BSD) da região CDR3 da cadeia pesada do 30 anticorpo de referência à seqüência de segmento Vh humana e um BSD da CDR3 de cadeia leve do anticorpo de referência a uma seqüência de seg- mento de Vl humano. Um “BSD” refere-se a uma região CDR3-FR4, ou uma < parte dessa região que media a especificidade de iigação. Um determinante de especificidade de ligação, portanto, pode ser um CDR3-FR4, um CDR3, um determinante de especificidade de ligação essencial mínimo de um C- DR3 (que se refere a qualquer região menor do que o CDR3 que confere 5 especificidade de ligação quando presente na região V de um anticorpo), o segmento D (com relação a uma região de cadeia pesada), ou outras regi- ões de CDR3-FR4 que confere a especificidade de ligação de um anticorpo de referência. Os métodos para humanizar são fornecidos na publicação de pedido de patente U.S. N°. 2005/0255552 e publicação de pedido de patente 10 U.S. N°. 2006/0134098.

O termo “heterólogo”, quando usado com relação a partes de um ácido nucléico, indica que o ácido nucléico compreende duas ou mais sub- sequências que não são normalmente encontradas na mesma relação em natura. Por exemplo, o ácido nucléico é tipicamente produzido de forma re- 15 combinante, tendo duas ou mais seqüências, por exemplo, de genes não relacionados arranjados para produzir um novo ácido nucléico funcional. Si- milarmente, uma proteína heteróloga frequentemente se referirá a duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação em natura.

O termo “recombinante”, quando usado com relação, por exem-

* 20 pio, a uma célula, ou ácido nucléico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucléico, proteína ou vetor foi modificada pela introdução de um ácido nucléico heterólogo ou proteína ou pela alteração de um ácido nucléico nati- vo ou proteína, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, os genes de expressão de células recombinantes que 25 não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são, de outra forma, anormalmente expres- sos, subexpressos ou não expressos. Pelo termo “ácido nucléico recombi- nante” entende-se ácido nucléico, originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação de ácido nucléico, por exemplo, usando polimerases e 30 endonucleases, em uma forma não normalmente encontrada na natureza. Dessa maneira, a ligação de maneira funcional de diferentes seqüências é alcançada. Assim, um ácido nucléico isolado, e uma forma linear, ou um ve- tor de expressão formado in vitro ligando-se as moléculas de DNA que não são normalmente unidas, são ambos considerados recombinantes para os propósitos desta invenção. Entende-se que uma vez que o ácido nucléico recombinante é produzido e reintroduzido em uma célula hospedeira ou or- 5 ganismo, ele replicará de forma não recombinante, isto é, usando o maqui- nário célula in vivo da célula hospedeira ao invés de em manipulações in vitro; entretanto, tais ácidos nucléicos, uma vez produzidos de forma recom- binante, embora subsequentemente replicados de forma não recombinante, são ainda considerados recombinantes para os propósitos da invenção. Si- 10 milarmente, uma “proteína recombinante” é uma proteína produzida usando técnicas recombinantes, isto é, através da expressão de um ácido nucléico recombinante como representado acima.

A frase “especificamente (ou seletivamente) se liga” a um anti- corpo ou “especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com” , quando 15 se referindo a uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína, em uma população heterogê- nea de proteínas e outros biológicos. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligam a uma seqüência de prote- ína particular ao menos duas vezes o fundo e mais tipicamente, mais de 10 20 a 100 vezes o fundo.

A ligação específica a um anticorpo sob tais condições exige um anticorpo que é selecionado por sua especificidade para uma proteína parti- cular. Por exemplo, anticorpos policlonais elevados a uma proteína particu- lar, variantes polimórficas, alelos, ortólogos, e variantes conservativamente 25 modificadas, ou variantes Splice, ou partes desses, podem ser selecionados para obter somente aqueles anticorpos policlonais que são especificamente imunorreativos com proteína GM-CSF e não com outras proteínas. Essa se- leção pode ser alcançada subtraindo-se anticorpos que reagem cruzado com outras moléculas.

Como usado aqui, um “agente terapêutico para uma doença in-

flamatória crônica” refere-se a um agente que quando administrado a um paciente que sofre de uma doença inflamatória crônica, em uma dose tera- <■ peuticamente eficaz, curará, ou ao menos parcialmente interrompe os sinto- mas da doença e complicações associadas à doença.

Os termos “idêntico” e “identidade” percentual, no contexto de duas ou mais seqüências de polipeptídeo (ou ácido nucléico), referem-se a 5 duas ou mais seqüências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificadas de resíduos de aminoácido (ou nucleotí- deos) que são os mesmos (isto é, aproximadamente 60% de identidade, pre- ferencialmente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais alta por uma região especificada, quando 10 comparado e alinhado para máxima correspondência por uma janela de comparação ou região designada) se medido usando um algoritmo de com- paração de seqüência BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros padrão descri- tos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, o sítio da rede NCBI). Tais seqüências são então ditas como sendo “subs- 15 tancialmente idênticas”. Seqüências “substancialmente idênticas” também incluem seqüências que têm apagamentos e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições, bem como as que ocorrem naturalmente, por exem- plo, variantes polimórficas ou alélicas e as produzidas pelo homem. Como descrito abaixo, os algoritmos preferenciais podem ser responsáveis por Ia-

* 20 cunas e seus similares. Preferencialmente, a identidade de seqüência de proteína existe sobre uma região que tem comprimento de ao menos apro- ximadamente 25 aminoácidos ou mais preferencialmente, sobre uma região que tem comprimento de 50 a 100 aminoácidos, ou sobre um comprimento de uma proteína.

Uma “janela de comparação”, como usada aqui, inclui referência

a um segmento de uma do número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo que consiste tipicamente de 20 a 600, usualmente aproxima- damente 50 a aproximadamente 200, mais usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150, seqüência que pode ser comparada a uma 30 seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem-conhecidos na técnica. O alinha- mento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por e- xemplo, pelo algoritmo por homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Nee- dleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de procura por 5 similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci USA 85:2444 (1988), pelas implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por inspeção visual e alinhamento manual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecu- 10 Iar Biology (Ausubel e outros, eds. 1995 suplemento)).

Os exemplos preferenciais de algoritmos que são adequados para determinar a identidade de seqüência percentual e a similaridade de seqüência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outros, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros descritos aqui, para determinar a identidade de seqüência per- centual para os ácidos nucléicos e proteínas da invenção. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeo) usa como padrão um comprimen- to de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para seqüências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de escore BLOSUM62 (ver Henikoff & He- nikoff, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N= -4, e uma comparação de ambos os fila- mentos.

Uma indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente de reatividade cruzada com os anticorpos elevados contra o segundo polipeptídeo. Assim, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo poli- 30 peptídeo, por exemplo, onde os dois polipeptídeos diferem somente por substituições conservativas.

Os termos “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” refe- <· rem-se ao material que é substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham-no como encontrado em seu estado nativo. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas u- sando técnicas de química analítica tal como eletroforese de gel de poliacri- 5 Iamida ou cromatografia a líquido de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. O termo “purificado”, em algumas modalidades, denota que uma proteína resulta em essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Preferencialmente, significa que a proteína é ao menos 85% pura, mais pre- 10 ferencialmente, ao menos 95% pura, e mais preferencialmente ao menos 99% pura.

Os termos ‘polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados a- qui de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido nos quais um 15 ou mais resíduos de aminoácido estão em mimética química artificial de um aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como a polímeros de aminoácido ocorrendo naturalmente, aqueles contendo resíduos modifi- cados, e polímeros de aminoácido ocorrendo não naturalmente.

O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos sintéticos e os k 20 que ocorrem naturalmente, bem como análogos de aminoácido e aminoáci- dos miméticos que funcionam similarmente aos aminoácidos ocorrendo na- turalmente, os quais são codificados pelo código genético, bem como aque- les aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxi- prolina, γ - carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Os análogos de aminoácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido ocorrendo naturalmente, por exemplo, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfônio de metionina. Tais análogos podem ter grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas de peptídeo modificadas, mas retêm a mesma es- trutura química básica de um aminoácido ocorrendo naturalmente. Os ami- noácidos miméticos de referem-se a compostos químicos que têm uma es- trutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona similarmente a um aminoácido ocorrendo naturalmente.

Os aminoácidos podem ser referidos aqui ou por seu símbolo usualmente de três letras ou por símbolos de uma letra recomendados pela 5 Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, igual- mente, podem ser referidos por seus códigos de única letra usualmente acei- tos.

“Variantes conservativamente modificadas” se aplica a ambas seqüências de aminoácido e de ácido nucléico. Com relação a seqüências de ácido nucléico particulares, as variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoáci- do idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucléico não codi- fica uma seqüência de aminoácido, em seqüências essencialmente idênticas ou associadas, por exemplo, naturalmente contíguas. Por causa da degene- ração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcio- nalmente idênticos codifica a maior parte das proteínas. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam a alanina de aminoácido. As- sim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o có- don pode ser alterado para outro dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são “vari- ações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada seqüência de ácido nucléico aqui citada que codifica um polipeptídeo também descreve variações silenciosas do ácido nucléico. Um dos versados na técnica reconhecerá que em certos contextos cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Conse- quentemente, frequentemente variações silenciosas de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo estão implícitas em uma seqüência descrita com relação ao produto de expressão, mas não com relação a seqüências de prova reais.

Como para seqüências de aminoácido, um versado na técnica *· reconhecerá que substituições individuais, apagamentos ou adições a uma seqüência de ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou proteína que altera, adiciona ou apaga um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na seqüência codificada é uma “variante conservativamente 5 modificada” onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservati- va e matrizes de substituição tal como BLOSUM fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são bem-conhecidos na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são em adição e não excluem variantes po- 10 limórficos, homólogos interespécies, e alelos da invenção. Típicas substitui- ções conservativas uns dos outros incluem: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Vali- na (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treoni- 15 na (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Prote- ins (1984)).

I. Introdução

A invenção refere-se a métodos para administrar um antagonista de GM-CSF para o tratamento de pacientes diagnosticados com uma doen-

* 20 ça inflamatória crônica. Em algumas modalidades, o paciente está passando por tratamento com um composto antifolato tal como metotrexato. Em algu- mas modalidades, as doenças inflamatórias crônicas que são tratadas com um antagonista de GM-CSF, por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF, inclu- em doenças de artrite inflamatória, tal como AR, artrite psoriática, espondilite 25 anquilosante, e artrite idiopática juvenil; bem como outras doenças inflamató- rias tal como polimiosite, e lúpus eritematoso sistêmico. Os pacientes que têm tais distúrbios podem, em algumas modalidades, também passar por tratamento com um composto antifolato tal como metotrexato. Em modalida- des onde o antagonista de GM-CSF é administrado com um composto anti- 30 folato tal como metotrexato, o GM-CSF e compostos antifolato, por exemplo, metotrexato, são administrados em uma quantidade que não induz neutro- penia. Os antagonistas de GM-CSF podem incluir anticorpos anti-GM-CSF, anticorpos de receptor anti-GM-CSF, ou outros inibidores que impedem sina- lização que normalmente resulta da ligação de GM-CSF a seu receptor cog- nato.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para 5 tratar uma doença inflamatória crônica, por exemplo, artrite reumatoide, ad- ministrando-se um anticorpo anti-GM-CSF como descrito aqui. As doenças inflamatórias crônicas que podem ser tratadas com um antagonista de GM- CSF, por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF, incluem doenças neurodege- nerativas, tal como a doença de Alzheimer.

Os anticorpos, por exemplo, anticorpos de receptor anti-GM-CSF

ou anti-GM-CSF, adequados para uso com a presente invenção, podem ser monoclonais, policlonais, quiméricos, humanizados, ou humanos. Outros antagonistas de GM-CSF para uso com a presente invenção podem incluir Iigantes ocorrendo naturalmente ou sintéticos (ou fragmentos desses) que 15 competem com GM-CSF para ligar ao receptor, mas não resultam em sinali- zação quando ligados ao receptor. Os antagonistas de GM-CSF não Iimitan- tes adicionais podem incluir polipeptídeos, ácidos nucléicos, pequenas mo- léculas e seus similares que bloqueiam ou parcialmente ou completamente a sinalização que resultaria naturalmente da ligação de GM-CSF a seu recep- 20 tor na ausência do antagonista de GM-CSF.

II. Pacientes

Os pacientes típicos a serem tratados com o antagonista de GM- CSF são aqueles que têm um distúrbio inflamatório crônico que estão pas- sando por tratamento com metotrexato de acordo com diretrizes clínicas es- 25 tabelecidas e são tratados com doses semanais de metotrexato na faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg de metotrexato por semana. Para alguns pacientes, doses mais baixas de metotrexato precisam ser ade- quadas e podem incluir um regime semanal entre aproximadamente 0,1 e aproximadamente 5 mg de metotrexato. Em outras modalidades, a quanti- 30 dade de metotrexato administrada está entre aproximadamente 5 mg/semana e aproximadamente 25 mg/semana.

Em algumas modalidades, um paciente que é tratado com um *■ antagonista de GM-CSF, tai como um anticorpo anti-GM-CSF, está passan- do por tratamento com um análogo de metotrexato ou outro agente terapêu- tico antifolato. O metotrexato é estruturalmente similar ao folato e pode se ligar aos sítios ativos de um número de enzimas que normalmente usam fo- 5 lato como uma coenzima para a biossíntese dos precursores de nucleotídeo de purina e pirimidina. O metotrexato compete com o cofator de folato para sítios de ligação de enzima, inibindo, desse modo, a atividade da enzima. Um “análogo de metotrexato” é um composto tendo similaridade estrutural ao metotrexato que também tem atividade antifolato. Assim, os análogos de 10 metotrexato também se referem a derivados, e pró-fármacos que podem ser usados na prática dessa invenção. Por exemplo, os pró-fármacos podem ser usados para aumentara biodisponibilidade através da bioconversão seletiva. Os análogos de metotrexato incluem, por exemplo, derivados de 4-amino com substituição de halogênio na porção para-aminobenzóica, tal como di- 15 cloro metotrexato (ver, por exemplo, Frei e outros, Clin. Pharmacol. Therap., 6:160-71 (1965)); metotrexato substituído por 7- metil (ver, por exemplo, Ro- sowsky e outros, J. Med. Chem., 17:1308-11 (1974)); 3',5’-difluoro metotre- xato (ver, por exemplo, Tomcuf, J. Organic Chem., 26:3351 (1961)); deriva- dos 2' e 3' monofluorinados de aminopterina (ver, por exemplo, Henkin e ou-

- 20 tros, J. Med. Chem., 26:1193-1196 (1983)); e 7,8-dihidro-8-metil-metotrexato (ver, por exemplo, Chaykovsky, J. Org. Chem., 40:145-146 (1975)).

Como usado aqui, o termo “composto antifolato” refere-se a um composto tendo similaridade estruturai ao folato e atividade como um anta- gonista de folato contra uma ou mais enzimas dependentes de folato. Exem- 25 pios de compostos antifolato incluem, por exemplo, aminopterina, raltitrexed, lometrexol, antifolato multidirecionado (MTA), AQA, metotrexato, e análogos desses. A aminopterina, por exemplo, possui um hidrogênio ao invés de um grupo metila na posição N-10 comparado à estrutura de metotrexato. O Ral- titrexed (ZD1694) é um inibidor seletivo de timidilato sintase. O lometrexol 30 inibe seletivamente um ribonucleotídeo glicínamida formiltransferase, a pri- meira enzima envolvida no caminho da síntese de purina novamente. Outros compostos antifolato incluem, por exemplo, trimetrexato, edetrexato, e seus similares (ver, por exemplo, Takimoto, Oncologist 1:68-81, 1996, para uma listagem de compostos antifolato exemplificados). Em certos casos, o meto- trexato pode ser usado em uma terapia de combinação com um ou mais a- nálogos de metotrexato e/ou outros compostos antifolato e um antagonista 5 anti-GM-CSF. Os agentes antifolato são administrados em uma quantidade que não produz neutropenia. Em algumas modalidades, a quantidade é de aproximadamente 0,1, por exemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamen- te 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproxi- madamente 5, aproximadamente 7,5, aproximadamente 10, aproximada- 10 mente 12,5, aproximadamente 15, aproximadamente 20 a aproximadamente 25 mg por semana. A quantidade de composto antifolato administrado como um agente anti-inflamatório é frequentemente uma quantidade que é duas a três ordens logarítmicas mais baixa do que as quantidades de compostos antifolato usados no tratamento de câncer.

Em algumas modalidades, um paciente que sofre de uma artrite

inflamatória é tratado de acordo com os métodos da presente invenção. Tais pacientes incluem aqueles que sofrem de AR, artrite psoriática, espondilite anquilosante, ou artrite idiopática juvenil.

Os métodos bem-conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um paciente é neutropênico. A contagem de neutrófilos abso- luta (ANC) é usada para determinar se o paciente é neutropênico. Os paci- entes não são considerados neutropênicos se a contagem de neutrófilos e a contagem de leucócitos (WBCC) estão dentro da faixa normal. A faixa nor- mal para neutrófilos é entendida como sendo representada por uma conta- gem de mais de 1 x 109/1; a faixa normal para os leucócitos é entendida co- mo sendo representada por uma contagem maior que 3,5 x 109/1. A neutro- penia é considerada clinicamente significativa se a ANC é menor que 0,5 x 109/1. Em algumas modalidades, nenhuma neutropenia clinicamente signifi- cativa é induzida em pacientes tratados de acordo com os métodos da pre- sente invenção. Em algumas outras modalidades, o tratamento não causa neutropenia detectável.

Em algumas modalidades, um paciente que tem AR ativa é tra- *■ tado de acordo com os métodos da invenção. A resposta de um paciente com AR a uma terapia e/ou progressão da doença pode ser avaliada monito- rando-se quaisquer dos parâmetros clínicos associados com AR. Tipicamen- te, um paciente que exibe uma resposta terapêutica ao tratamento é deter-

5 minado por um número de parâmetros, incluindo parâmetros farmacológicos. Por exemplo, o escore do Conselho Americano de Reumatologia (ACR) para AR (ACR 20, ACR 50, e ACR 70) pode ser empregado. Os pontos finais de composto de ACR para AR incluem: rigidez matinal, contagem da junta do tendão, contagem de junta inchada, avaliação da dor do paciente, avaliação 10 global do paciente, avaliação global do médico, taxa de sedimentação de eritrócito (ESR), níveis de proteína C-reativa (CRP) no plasma, e medição do fator reumatoide. Outros marcadores farmacodinâmicos que podem ser usa- dos para avaliar a resposta do paciente incluem avaliação de níveis de neop- terina no sangue ou na urina, avaliação dos níveis de citoquinas pró- 15 inflamatórias sistemicamente (no sangue) ou localmente (por exemplo, em um sítio localizado de inflamação tal como uma junta). As citoquinas pró- inflamatórias que podem ser usadas para avaliar a resposta do paciente à terapia dessa invenção incluem, mas não estão limitados a, TNF-α, GM- CSF, lnterleuquina-1, lnterleuquina-6, e lnterleuquina-8 e 17.

A administração de antagonistas de GM-CSF com um composto

antifolato, tal como metotrexato, ao menos parcialmente interrompe a pro- gressão da doença ou reduz seus sintomas (como avaliado por parâmetros tais como parâmetros exemplificados notados acima). Assim, a administra- ção de um antagonista de GM-CSF e metotrexato pode reduzir a progressão 25 de erosão da junta. A progressão de erosão da junta pode ser avaliada u- sando técnicas conhecidas tais como autor radiografia para avaliar o osso e cartilagens nas juntas.

Em outras modalidades, um antagonista de GM-CSF é adminis- trado a um paciente que tem outra artrite inflamatória, tal como artrite psoriá- tica, artrite idiopática juvenil, ou espondilite anquilosante, que está sendo tratado com um composto antifolato tal como metotrexato. Tais pacientes podem ser avaliados para resposta a uma terapia e/ou progressão de doen- Tl ça usando métodos conhecidos tais como os usados para avaliar AR e ou- tros critérios de escore de doença apropriados. Por exemplo, para espondili- te anquilosante, a Avaliação dos Critérios de Resposta à Espondilite Anqui- Iosante (ASAS 20) pode ser usada. (ASAS é uma medida composta de me- 5 Ihoria dos sintomas de AS que incluem dor nas costas todas, avaliação do paciente da atividade da doença, inflamação e função física). Similarmente, para avaliação de artrite psoriática, o índice de Critérios de Resposta à Artri- te Psoriática (PsARC) pode ser usado.

Em modalidades adicionais da invenção, os pacientes com lúpus 10 eritematoso sistêmico que estão recebendo um composto antifolato tal como metotrexato para tratamento são também tratados com um antagonista de GM-CSF. A resposta à terapia e/ou progressão da doença pode ser medida, por exemplo, usando critérios estabelecidos (por exemplo, Hochberg, Arthri- tis Rheum 40:1725, 1997; Tan, e outros, Arthritis Rheum 25:1271-7, 1982) 15 para avaliar o índice de Atividade da Doença Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLEDAI) de um paciente sendo tratado com os métodos da invenção.

Em algumas modalidades, um paciente sofrendo de uma doença inflamatória crônica tal como artrite reumatoide, artrite psoriática, artrite idio- pática juvenil, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistêmico, ou uma 20 doença neurodegenerativa tal como doença de Alzheimer, é tratado com um antagonista de GM-CSF sem também receber terapia com antifolato. Fre- quentemente, o antagonista de GM-CSF administrado a tais pacientes é um anticorpo anti-GM-CSF.

III. Antagonistas de GM-CSF Como notado acima, a invenção fornece métodos para tratar

uma doença inflamatória crônica, por exemplo, AR, administrando-se um antagonista de GM-CSF e metotrexato a um paciente que sofre da doença. Os antagonistas de GM-CSF para uso na invenção interferem seletivamente na indução de sinalização pelo receptor de GM-CSF causando a redução na 30 ligação de GM-CSF ao receptor. Tais antagonistas podem incluir anticorpos que se ligam ao receptor de GM-CSF, anticorpos que se ligam a GM-CSF, e outras proteínas ou pequenas moléculas que competem para ligação de 1 GM-CSF a seu receptor ou inibem a sinalização que normalmente resulta da ligação do Iigante ao receptor.

Em muitas modalidades, o antagonista de GM-CSF usado na invenção é uma proteína, por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF, um anti- 5 corpo de receptor anti-GM-CSF, um receptor de GM-CSF solúvel, ou um polipeptídeo de GM-CSF modificado que compete para ligar com GM-CSF a um receptor, mas está inativo. Tais proteínas são frequentemente produzi- das usando tecnologia de expressão recombínante. Tais métodos são am- plamente conhecidos na técnica. Os métodos de biologia molecular gerais, 10 incluindo métodos de expressão, podem ser encontrados, por exemplo, em manuais de instrução, tais como, Sambrook e Russell (2001) Molecular Clo- ning: A Iaboratory manual 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cur- rent Protocols in Molecular Biology (2006) John Wiley e Filhos ISBN: 0-471- 50338-X.

15 Uma variedade de sistemas de expressão de proteína baseados

em procarióticos e/ou eucarióticos podem ser empregados para produzir uma proteína antagonista de GM-CSF. Muitos tais sistemas são amplamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Esses incluem ambos os sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos.

' 20 Anticorpos de GM-CSF

Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF é um anti- corpo que se liga a GM-CSF ou um anticorpo que se liga à subunidade α ou β do receptor de GM-CSF. Os anticorpos podem ser elevados contra proteí- nas de GM-CSF (ou receptor de GM-CSF), ou fragmentos, ou produzidos de 25 forma recombínante. Os anticorpos para GM-CSF para uso na invenção po- dem ser neutralizantes ou podem ser anticorpos não neutralizantes que se ligam a GM-CSF e aumentam a taxa de folga in vivo de GM-CSF tal que o nível de GM-CSF na circulação seja reduzido. Frequentemente, o anticorpo de GM-CSF é um anticorpo neutralizante.

30 Os métodos para preparar anticorpos policlonais são conhecidos

pelo versado na técnica (por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Labora- tory manual (1988); Methods in Immunology). Os anticorpos policlonais po- dem ser elevados em um mamífero por uma ou mais injeções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. O agente imunizante inclui um GM-CSF ou proteína de receptor de GM-CSF, por exemplo, um GM-CSF humano ou proteína de receptor de GM-CSF, ou fragmento desses.

5 Em alguma modalidade, um anticorpo de GM-CSF para uso na

invenção é purificado a partir de plasma humano. Em tais modalidades, o anticorpo de GM-CSF é tipicamente um anticorpo policlonal que é isolado de outros anticorpos presentes no plasma humano. Tal procedimento de isola- mento pode ser executado, por exemplo, usando técnicas conhecidas, tal como cromatografia por afinidade.

Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF é um anti- corpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usan- do métodos de hibridoma, tal como aqueles descritos por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975). Em um método de hibridoma, um rato, hamster, ou 15 outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agen- te imunizante, tal como GM-CSF humano, para produzir linfócitos que pro- duzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamen- te ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imuniza- dos in vitro. O agente imunizante preferencialmente inclui proteína de GM- 20 CSF humana, fragmentos dessa, ou proteína de fusão dessa.

Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos u- sando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibi- ção de fagos (Hoogenboom & Winter, J. Mol Biol. 227:381 (1991); Marks e outros, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). As técnicas de Cole e outros, e Boerner 25 e outros estão também disponíveis para a preparação de anticorpos mono- clonais humanos (Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer The- rapy, pág. 77 (1985) e Boerner e outros, J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)). Similarmente, os anticorpos humanos podem ser produzidos introduzindo-se Ioci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, ratos 30 nos quais os genes de imunoglobulina humana foram parcial ou completa- mente desativados. Mediante desafio, a produção de anticorpos humanos é observada, que lembra muito aquela vista em seres humanos em todos os < aspectos, incluindo redisposição de genes, união, e repertório de anticorpos. Essa abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, e nas seguintes pu- blicações científicas: Marks e outros, B io/Tech no Iogy 10: 779 a 783 (1992);

5 Lonberg e outros, Nature 368: 856 a 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812 a 813 (1994); Fishwild e outros, Nature Biotechnoiogy 14: 845 a 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93 (1995).

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-GM-CSF são anti- 10 corpos monoclonais quiméricos ou humanizados. Como notado anteriormen- te, as formas humanizadas de anticorpos são imunoglobulinas quiméricas nas quais resíduos de uma região determinante complementar (CDR) do anticorpo humano são substituídas por resíduos de uma CDR de uma espé- cie não humana tal como um rato, camundongo ou coelho tendo a especifi- 15 cidade desejada, afinidade e capacidade.

Um anticorpo que é empregado na invenção pode ser em qual- quer formato. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo completo incluindo uma região constante, por exemplo, uma região constante humana, ou pode ser um fragmento ou derivado de um an- 20 ticorpo completo, por exemplo, um fragmento Fd, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, ou um anticorpo de domínio único, tal como um nanocorpo ou um anti- corpo de camelídeo. Tais anticorpos podem adicionalmente ser elaborados de forma recombínante por métodos bem-conhecidos pelos versados na técnica. Como notado acima, tais anticorpos podem ser produzidos usando 25 técnicas conhecidas.

Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo é adicional- mente elaborado para imunogenicidade reduzida, por exemplo, tal que o an- ticorpo seja adequado para repetir a administração. Os métodos para gerar anticorpos com imunogenicidade reduzida incluem procedimentos de huma- 30 nização e técnicas de modificação tal como desimunização, nos quais um anticorpo é adicionalmente elaborado, por exemplo, em uma ou mais regiões da estrutura, para remover os epítopos de célula T. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humani- zado. Um anticorpo humanizado é um anticorpo humano elaborado tendo uma especificidade de ligação de um anticorpo de referência, obtido unindo- se uma seqüência de DNA codificando um determinante de especificidade 5 de ligação (BSD) da região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo de refe- rência em seqüência de segmento VH humano e uma BSD de CDR3 de ca- deia leve do anticorpo de referência em uma seqüência de segmento de VL humano. Os métodos para humanizar são fornecidos na publicação de pedi- do de Patente U.S. N°. 2005/0255552 e publicação de pedido de patente 10 U.S. N°. 2006/0134098.

Um anticorpo pode adicionalmente ser desimunizado para remo- ver um ou mais epítopos de célula T da região V de um anticorpo. Tais pro- cedimentos são descritos, por exemplo, em WO 00/34317.

Em algumas modalidades, a região variável é composta de se- 15 quências de gene V humanos. Por exemplo, uma seqüência de região variá- vel pode ter ao menos 80% de identidade, ou ao menos 85% de identidade, ao menos 90% de identidade, ao menos 95% de identidade, ao menos 96% de identidade, ao menos 97% de identidade, ao menos 98% de identidade, ou ao menos 99% de identidade, ou mais, com uma seqüência de gene V da 20 linha germinativa humana.

Um anticorpo usado na invenção pode incluir uma região cons- tante humana. A região constante da cadeia leve pode ser uma região cons- tante kapa ou Iambda humana. A região constante de cadeia pesada é fre- quentemente uma região constante de cadeia gama, por exemplo, região constante gama-1, gama-2, gama-3, ou gama-4.

Em algumas modalidades, por exemplo, onde o anticorpo é um fragmento, o anticorpo pode ser conjugado em outra molécula, por exemplo, para fornecer uma meia vida estendida in vivo tal como um polietileno glicol (peguilação) ou albumina de soro. Exemplos de PEGuilação de fragmentos 30 de anticorpos são fornecidos em Knight e outros (2004) Platelets 15: 409 (para abciximabe); Pedley e outros (1994) Br. J. Cancer 70: 1126 (para um anticorpo anti-CEA) Chapman e outros (1999) Nature Biotech. 17: 780. * Especificidade de Anticorpos

Um anticorpo para uso na invenção se liga a GM-CSF ou recep- tor de GM-CSF. Qualquer número de técnicas pode ser usado para determi- nar a especificidade de ligação de anticorpos. Ver, por exemplo, Harlow & 5 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) para uma descrição de forma- tos e condições de imunoensaios que podem ser usados para determinar a imunorreatividade específica de um anticorpo.

Um anticorpo exemplificado adequado para uso com a presente invenção é c19/2. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal que 10 compete para se ligar ao mesmo epítopo de c19/2, ou que se liga ao mesmo epítopo de c19/2, é usado. A capacidade de um anticorpo particular reco- nhecer o mesmo epítopo de outro anticorpo é tipicamente determinada pela capacidade do primeiro anticorpo inibir competitivamente a ligação do se- gundo anticorpo ao antígeno. Qualquer de um número de ensaios de ligação 15 competitivos pode ser usado para medir a competição entre dois anticorpos para o mesmo antígeno. Por exemplo, um ensaio ELISA em sanduíche pode ser usado para esse propósito. Isso é executado usando-se um anticorpo de captura para revestir a superfície de uma cavidade. Uma concentração sub- saturada de antígeno identificado é então adicionada à superfície de captura.

1 20 Essa proteína será ligada ao anticorpo através de uma interação anticor- po:epítopo específica. Após a lavagem de um segundo anticorpo, que foi covalentemente ligado a uma porção detectável (por exemplo, HRP, com o anticorpo rotulado sendo definido como o anticorpo de detecção) é adiciona- do ao ensaio ELISA. Se esse anticorpo reconhece o mesmo epítopo do anti- 25 corpo de captura, ele será incapaz de se ligar à proteína alvo à medida que esse epítopo particular não mais estará disponível para ligação. Se, entre- tanto, esse segundo anticorpo reconhecer um epítopo diferente na proteína alvo, ele será capaz de se ligar e essa ligação pode ser detectada quantífi- cando-se o nível de atividade (e, portanto, ligado ao anticorpo) usando um 30 substrato relevante. O plano de fundo é definido usando um único anticorpo como ambos anticorpo de captura e detecção, onde o sinal máximo pode ser estabelecido capturando com um anticorpo específico de antígeno e detec- tando com um anticorpo para identificar o antígeno. Usando-se o plano de fundo e sinais máximos como referências, os anticorpos podem ser avalia- dos de uma maneira emparelhada para determinar a especificidade do epí- topo.

5 Um primeiro anticorpo é considerado para inibir competitivamen-

te a ligação de um segundo anticorpo, se a ligação do segundo anticorpo ao antígeno é reduzida em ao menos 30%, usualmente ao menos 40%, 50%, 60%, ou 75%, e frequentemente em ao menos aproximadamente 90%, na presença do primeiro anticorpo usando quaisquer dos ensaios descritos a- cima.

Mapeamento de Epítopo

Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo é empre- gado, o qual se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo conhecido, por e- xemplo, c19/2. Os métodos de mapear os epítopos são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, uma abordagem à localização de regiões funcional- mente ativas de fator de estímulo de colônia de granulócitos e macrófagos humano (hGM-CSF) é mapear os epítopos reconhecidos neutralizando os anticorpos monoclonais anti-hGM-CSF. Por exemplo, o epítopo ao qual c19/2 (que tem as mesmas regiões variáveis do anticorpo neutralizante LMM102) se liga foi definido usando fragmentos proteolíticos obtidos por digestão enzimática de gGM-CSF baterialmente sintetizado (Dempsey, e outros, Hybridoma 9:545-558, 1990). O fracionamento RP-HPLC de uma digestão tríptica resultou na identificação de um peptídeo com “núcleo trípti- co” contendo 66 aminoácidos (52% da proteína). A digestão adicional desse “núcleo tríptico” com protease V8 de S. aureus produziu um produto hGM- CSF imunorreativo exclusivo compreendendo dois peptídeos, resíduos 86 a 93 e 112 a 127, ligado por uma ligação dissulfeto entre os resíduos 88 e 121. Os peptídeos individuais não foram reconhecidos pelo anticorpo. Determinação da Afinidade de Ligação Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para uso

com a presente invenção têm uma ligação de alta afinidade para GM-CSF ou receptor de GM-CSF. A ligação de alta afinidade entre um anticorpo e um < antígeno existe se a constante de desassociação (Kd) do anticorpo é < 1 nM, e preferencialmente <100 pM. Uma variedade de métodos pode ser usada para determinar a afinidade de ligação de um anticorpo por seu antígeno alvo, tal como ensaios de ressonância plasmônica de superfície, ensaios de 5 saturação, ou imunoensaios tal como ELISA ou RIA, como são bem- conhecidos pelos versados na técnica. Um método exemplificado para de- terminar a afinidade de ligação é por análise de ressonância plasmônica de superfície em um instrumento BIAcore™ 2000 (Biacore AB, Freiburg, Ale- manha) usando chips sensores CM5, como descrito por Krinner e outros, 10 (2007) Mol. Immunol. Feb; 44(5):916-25. (Epub, 11 de Maio de 2006)). Ensaio de Proliferação Celular para IdentificarAnticorpos Neutralizantes

Em algumas modalidades, os antagonistas de GM-CSF são an- ticorpos neutralizantes para GM-CSF, ou seu receptor, que se liga de uma maneira que interfere com a ligação de GM-CSF. Os anticorpos neutralizan- tes e outros antagonistas de GM-CSF podem ser identificados usando qual- quer número de ensaios que avaliam a função de GM-CSF. Por exemplo, os ensaios baseados em célula para sinalização de receptor de GM-CSF, tal como ensaios que determinam a taxa de proliferação de uma linhagem celu- lar dependente de GM-CSF em resposta a uma quantidade Iimitante de GM- 1 20 CSF, são convenientemente usados. A linhagem celular de TF-1 humano é adequada para uso em tal ensaio. Ver, Krinner e outros, (2007) Mol. Immu- nol. Em algumas modalidades, os anticorpos neutralizantes da invenção ini- bem a proliferação celular de TF-1 estimulada por GM-CSF em ao menos 50% quando uma concentração de GM-CSF é usada, a qual estimula a proli- feração máxima célula de TF-1 de 90%. Em outras modalidades, os anticor- pos neutralizantes inibem a proliferação estimulada por GM-CSF em ao me- nos 90%. Assim, tipicamente, um anticorpo neutralizante, ou outro antago- nista de GM-CSF para uso na invenção, tem um EC50 de menos de 10 nM (por exemplo, Tabela 1). Os ensaios adicionais adequados para uso em i- dentificar anticorpos neutralizantes adequados para uso com a presente in- venção será bem-conhecido pelos versados na técnica.

Anticorpos Exemplificados Os anticorpos para uso na invenção são conhecidos na técnica e podem ser produzidos usando técnicas de rotina. Os anticorpos exemplifica- dos são descritos. Entende-se que os anticorpos exemplificados podem ser elaborados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica e resu- 5 midos aqui para produzir fragmentos de anticorpos, quimeras, e seus simila- res ou por tecnologia química ou recombínante.

Um anticorpo quimérico exemplificado adequado para uso como um antagonista de GM-CSF é c19/2. O anticorpo c19/2 se liga a GM-CSF com uma afinidade de ligação monovalente de aproximadamente 10 pM co- 10 mo determinado pela análise de ressonância plasmônica de superfície. Os SEQ ID NOs 1 e 2 mostram a seqüência de região variável de cadeia pesa- da e de cadeia leve de c19/2 (por exemplo, WO 03/068920). As CDRs, como definidas de acordo com Kabat, são:

CDRH1 DYNIH 15 CDRH2 YIAPYSGGTGYNQEFKN CDRH3 RDRFPYYFDY CDRL1 KASQNVGSNVA CDRL2SASYRSG CDRL3 QQFNRSPLT.

As CDRs podem também ser determinadas usando outras defi-

nições bem-conhecidas na técnica, por exemplo, Clothia, banco de dados internacional ImMunoGeneTics (IMGT), e AbM.

Em algumas modalidades, um anticorpo usado na invenção compete para ligação, ou se liga, ao mesmo epítopo de c19/2. O epítopo de 25 GM-CSF reconhecido por c19/2 foi identificado como um produto que tem dois peptídeos, resíduos 86 a 93 e resíduos 112 a 127, ligados por uma liga- ção dissulfeto entre os resíduos 88 e 121. O anticorpo c19/2 inibe a prolife- ração dependente de GM-CSF de uma linhagem celular de leucemia de TF- 1 humano com um EC5O de 30 pM quando as células são estimuladas com 30 0,5 ng/ml de GM-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo usado na in- venção se liga ao mesmo epítopo de c19/2.

Um anticorpo para administração, tal como c19/2, pode ser adi- <· cionalmente humanizado. Por exemplo, o anticorpo c19/2 pode ser elabora- do para conter segmentos de gene V humano.

Outro anticorpo anti-GM-CSF neutralizante exemplificado é o anticorpo E10 descrito em Li e outros, (2006) PNAS 103(10):3557-3562. E10 5 é um anticorpo da classe IgG que tem uma afinidade de ligação de 870 pM para GM-CSF. O anticorpo é específico para ligar a GM-CSF humano como mostrado em um ensaio ELISA, e mostra forte atividade neutralizante como avaliado com um ensaio de proliferação de célula TF1.

Um anticorpo anti-GM-CSF neutralizante exemplificado adicional 10 é o anticorpo MT203 descrito por Krinner e outros, (Mol Immunol. 44:916-25, 2007; Epub 2006 11 de Maio de 2006). MT203 é um anticorpo da classe IgGI que se liga a GM-CSF com afinidade picomolar. O anticorpo mostra potente atividade inibidora como avaliado por ensaio de proliferação de célu- la TF-1 e sua capacidade de bloquear a produção de IL-8 em células U937. 15 Os anticorpos adicionais adequados para uso com a presente

invenção serão conhecidos pelos versados na técnica.

Os antagonistas de GM-CSF que são anticorpos de receptor an- ti-GM-CSF podem também ser empregados na invenção. Tais antagonistas de GM-CSF incluem anticorpos para a cadeia alfa e beta de receptor de GM- 20 CSF. Um anticorpo de receptor anti-GM-CSF empregado na invenção pode estar em qualquer formato de anticorpo como explicado acima, por exemplo, intacto, quimérico, monoclonal, policlonal, fragmento de anticorpo, humani- zado, e seus similares. Exemplos de anticorpos de receptor anti-GM-CSF, por exemplo, anticorpos neutralizantes, de alta afinidade, adequados para 25 uso na invenção são mostrados (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.747.032 e Nicola e outros, Blood 82: 1724, 1993).

Antagonistas de GM-CSF não Anticorpo

Outras proteínas que podem interferir com a interação produtiva de GM-CSF com seu receptor incluem proteínas de GM-CSF mutantes e proteínas segregadas compreendendo ao menos parte da parte extracelular de uma ou ambas as cadeias de receptor de GM-CSF que se liga a GM-CSF e competem com ligação ao receptor de superfície celular. Por exemplo, um antagonista de receptor de GM-CSF solúvel pode ser preparado fundindo-se a região de codificação do sGM-CSFR alfa com as regiões CH2-CH3 de lgG2a de ratos. Um receptor de GM-CSF solúvel exemplificado é descrito por Raines e outros, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 8203. Um exem- 5 pio de uma proteína de fusão GM-CSFRaIfa-Fc é fornecido, por exemplo, em Brown e outros (1995) Blood 85: 1488. Em algumas modalidades, o compo- nente Fc de tal fusão pode ser elaborado para modular a ligação, por exem- plo, para aumentar a ligação, ao receptor Fe.

Outro antagonista de GM-CSF inclui GM-CSF mutantes. Por e- 10 xemplo, GM-CSF tendo uma mutação de resíduo de aminoácido 21 de GM- CSF para Arginina ou Lisina (E21R ou E221K) descrito por Hercus e outros, Proc. Natl. Acad. Sd USA 91:5838, 1994 foi mostrado como tendo atividade in vivo em impedir a disseminação de células de leucemia dependentes de GM-CSF em modelos xenográficos de ratos (Iversen e outros, Blood 15 90:4910, 1997). Como apreciado por um versado na técnica, tais antagonis- tas podem incluir variantes conservativamente modificados de GM-CSF que têm substituições, tal como a substituição notada no resíduo de aminoácido

21, ou variantes de GM-CSF que têm, por exemplo, análogos de aminoácido para prolongar a meia vida.

Em outras modalidades, o antagonista de GM-CSF é um “anti-

corpo mimético” que direciona e se liga ao antígeno de uma maneira similar a anticorpos. Certos desses “anticorpos miméticos” usam arcabouços de proteína não imunoglobulina como estruturas de proteína alternativas para as regiões variáveis de anticorpos. Por exemplo, Ku e outros (Proc. Natl. 25 Acad. ScL U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995)) descreve uma alternativa a anti- corpos baseados em citocromo b562 no qual dois dos laços do citocromo b562 foram randomizados e selecionados para ligação contra albumina de soro bovino. Os mutantes individuais revelaram-se ligar seletivamente com BSA similarmente com anticorpos anti-BSA.

As Patentes U.S. Nos. 6.818.418 e 7.115.396 descrevem um an-

ticorpo mimético caracterizando uma fibronectina ou arcabouço de proteína similar à fibronectina e ao menos um laço variável. Conhecidos como Adnec- <■ tins, esses anticorpos miméticos baseados em fibronectina exibem muitas das características de anticorpos naturais ou elaborados, incluindo alta afini- dade e especificidade por qualquer Iigante direcionado. A estrutura desses anticorpos miméticos à base de fibronectina é similar à estrutura da região variável da cadeia pesada IgG. Portanto, essa mimética exibe propriedades de ligação com antígeno similares em natura e afinidade com aqueles de anticorpos nativos. Ademais, esses anticorpos miméticos à base de fibronec- tina exibem certos benefícios sobre os anticorpos e fragmentos de anticor- pos. Por exemplo, esses anticorpos miméticos não contam com ligações dissulfeto para estabilidade de dobramento nativo, e são, portanto, estáveis sob condições que normalmente separariam os anticorpos. Em adição, des- de que a estrutura desses anticorpos miméticos à base de fibronectina é si- milar àquela da cadeia pesada IgG, o processo para randomização e emba- ralhamento de laço pode ser empregado in vitro que é similar ao processo de maturação de afinidade de anticorpos in vivo.

Beste e outros (Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A. 96(5):1898-1903 (1999)) descrevem um anticorpo mimético baseado em um arcabouço de Iipocalina (Anticalin®). As Iipocalinas são compostas de um barril β com qua- tro laços hipervariáveis no término da proteína. Os laços foram submetidos a 1 20 mutagênese aleatória e selecionados para ligação com, por exemplo, fluo- resceína. Três variantes exibiram ligação específica com fluoresceína, com outra variante mostrando ligação similar a de um anticorpo antifluoresceína. Análise adicional revelou que todas as posições aleatórias são variáveis, indicando que Anticalin® seria adequado para ser usado como uma alterna- 25 tiva a anticorpos. Assim, Anticalins® são peptídeos de cadeia única peque- na, tipicamente entre 160 e 180 resíduos, que fornece várias vantagens so- bre os anticorpos, incluindo custo diminuído de produção, estabilidade au- mentada em armazenamento e reação imunológica diminuída.

A Patente U.S. N0. 5.770.380 descreve um anticorpo mimético sintético usando o arcabouço orgânico não peptídeo rígido de calixareno, conectado com múltiplos laços de peptídeos variáveis usados como sítios de ligação. Os laços de peptídeos se projetam a partir da mesma lateral geome- tricamente a partir do calixareno, com relação uns ao outros. Por causa des- sa confirmação geométrica, todos os laços são disponíveis para ligação, aumentando a afinidade de ligação a um ligante. Entretanto, em comparação a outros anticorpos miméticos, o anticorpo mimético baseado em calixareno 5 não consiste exclusivamente em um peptídeo, e, portanto, é menos vulnerá- vel ao ataque por enzimas de protease. Nem o arcabouço consiste puramen- te em um peptídeo, DNA ou RNA, significando que esse anticorpo mimético é relativamente estável em condições ambientais extremas e tem uma longa expectativa de vida. Ademais, como o anticorpo mimético baseado em cali- 10 xareno é relativamente pequeno, ele é menos provável de produzir uma res- posta imunogênica.

Murali e outros (Cell Mol Biol 49(2):209-216 (2003)) descrevem uma metodologia para reduzir anticorpos em peptimiméticos menores, eles são chamados “peptidomiméticos de ligação similares a anticorpos” (ABiP) que podem também ser úteis como uma alternativa a anticorpos.

Em adição a estruturas de proteína não imunoglobulina, as pro- priedades dos anticorpos foram também imitadas em compostos compreen- dendo moléculas de RNA e oligômeros não naturais (por exemplo, inibidores de protease, benzodiazepinas, derivados de purina e miméticas beta-turn). 20 Consequentemente, antagonistas GM-CSG não anticorpo podem também incluir tais compostos.

III. Administração Terapêutica

Os métodos da invenção tipicamente compreendem administrar metotrexato e um antagonista de GM-CSF (por exemplo, um anticorpo anti- 25 GM-CSF) como uma composição farmacêutica a um paciente tendo uma doença inflamatória crônica, por exemplo, AR, em uma quantidade terapeu- ticamente eficaz usando um regime de dosagem adequado para o tratamen- to da doença.

Em algumas modalidades da presente invenção, pacientes que sofrem de uma doença inflamatória crônica, por exemplo, AR, são tratados com metotrexato em uma dose semanal de até aproximadamente 25 mg e um antagonista de GM-CSF, por exemplo, um anticorpo específico para GM- < CSF, em uma dose que não induz neutropenia clinicamente significativa e leva a uma otimização em um ou mais marcadores de inflamação. Em algu- mas modalidades, a resposta do paciente ao tratamento é determinada mos- trando uma redução significativa na taxa de sedimentação de eritrócito 5 (ESR) dentro da faixa normal. A faixa de ESR normal é dependente da idade e do sexo. Para homens, a ESR normal pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula: 0,5 x (idade em anos + 10) (Wallach J. Interpretation of LaboratoryTests, 6a Edição. Little Brown and Company. 1996).

A composição pode ser formulada para uso em uma variedade 10 de sistemas de liberação de fármaco. Um ou mais excipientes ou veículos fisiologicamente aceitáveis podem também ser incluídos nas composições para formulação apropriada. As formulações adequadas para uso na presen- te invenção são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a Ed. (1985). Para uma bre- 15 ve revisão dos métodos para liberação de fármacos, ver, Langer, Science 249:1527-1533(1990).

O antagonista de GM-CSF para uso nos métodos da invenção é fornecido em uma solução adequada para injeção no paciente tal como uma solução aquosa isotônica estéril para injeção. O antagonista de GM-CSF é 1 20 dissolvido ou suspenso em uma concentração adequada em um veículo a- ceitável. Em algumas modalidades, o veículo é aquoso, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, e seus similares. As composições podem conter substâncias farmacêuticas auxiliares como exi- gido para condições fisiológicas aproximadas, tal como agentes de ajusta- 25 mento de pH e tamponagem, agentes de ajustamento de tonicidade e seus similares.

As composições farmacêuticas da invenção são administradas a um paciente sofrendo de uma doença inflamatória crônica, por exemplo, AR, em uma quantidade suficiente para curar ou ao menos parcialmente inter- 30 romper a doença ou sintomas da doença e suas complicações. Uma quanti- dade adequada para executar isso é definida como uma “dose terapeutica- mente eficaz”. Uma dose terapeuticamente eficaz é determinada monitoran- do-se a resposta de um paciente à terapia. Testes de desempenho típicos indicativos de uma dose terapeuticamente eficaz são conhecidos na técnica, dependendo da doença. Por exemplo, para AR, testes de desempenho in- cluem níveis de plasma de CRP, ESR, sangue ou níveis de urina de neopte- 5 rina, níveis de citoquinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α, GM-CSF, lnterleuquina-1, lnterleuquina-6 e Interieuquinas 8 e 17) ou mudanças nos níveis de outros marcadores farmacodinâmicos. Outros critérios para avaliar uma resposta terapêutica podem também ser usados, por exemplo, avalian- do o número e/ou gravidade de desconforto e inchaço das juntas, níveis de 10 dor, e seus similares.

As quantidades que são administradas, que são eficazes depen- derão da gravidade da doença e do estado geral da saúde do paciente, in- cluindo outros fatores tal como idade, peso, sexo, via de administração, etc. Administração única ou múltiplas administrações do antagonista podem ser 15 administradas dependendo da dosagem e frequência exigidas e toleradas pelo paciente. Em qualquer caso, os métodos fornecem uma quantidade su- ficiente de antagonista de GM-CSF em conjunto com metotrexato para tratar eficazmente o paciente.

Em outra modalidade da invenção, o antagonista anti-GM-CSF usado para tratar um paciente sofrendo de uma doença inflamatória crônica, tal como RA, é fornecido em terapia de combinação com metotrexato e um ou mais agentes adicionais, por exemplo, um agente anti-inflamatório não esteroidal. Assim, os pacientes podem receber terapias adicionais de modo a tratar sua doença. Tais terapias incluem, mas não estão limitadas a, hidro- xicloroquinona, sulfassalazina, ouro, minociciina, leflunomida, corticoesteroi- des, antagonistas de TNF (por exemplo, etanercept, infliximabe ou adalimu- mabe), antagonistas de IL-1 (por exemplo, como anakinra) ou anticorpos anti-CD20 (por exemplo, rituximabe). Os pacientes podem receber um ou mais agentes terapêuticos adicionais como terapia concomitante. Alternati- vãmente, os pacientes podem ser tratados seqüencialmente com agentes terapêuticos adicionais.

Em algumas modalidades, um paciente tendo uma doença in- <· flamatória crônica, tal como AR, é tratado com um componente antifolato além de metotrexato em conjunto com tratamento com um antagonista de GM-CSF. O composto antifolato e antagonista de GM-CSF são administra- dos em quantidades que não induzem neutropenia clinicamente significativo usando um regime de dosagem adequado para o tratamento da doença.

A. Administração

A invenção fornece métodos para o tratamento de pacientes com doença inflamatória crônica, tal como AR, administrando-se um antago- nista de GM-CSF em combinação com metotrexato. Em algumas modalida- 10 des, o antagonista de GM-CSF é administrado por injeção ou infusão através de qualquer via adequada, mas não limitada a vias intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. Em uma modalidade exemplificada, o anta- gonista de GM-CSF é diluída em solução salina fisiológica para injeção an- tes de administração ao paciente. Tal antagonista é administrado, por exem- 15 pio, por infusão intravenosa ao longo de um período entre 15 minutos e 2 horas. Em ainda outras modalidades, o procedimento de administração é via injeção subcutânea ou intramuscular.

O antagonista de GM-CSF é administrado enquanto o paciente está sendo tratado com metotrexato. No contexto dessa invenção, um paci-

1 20 ente “sendo tratado com metotrexato” ou “passando por tratamento com me- totrexato” significa que a um paciente foi prescrito metotrexato e está, por- tanto, recebendo, ou recebeu recentemente, uma dose de metotrexato. Tipi- camente, o metotrexato é tomado uma vez por semana. Assim, por exemplo, um antagonista de GM-CSF pode ser administrado em qualquer período de 25 tempo durante a semana entre as doses. Em algumas modalidades, o anta- gonista de GM-CSF pode ser administrado após um paciente ter recebido uma dose de metotrexato, mas ainda não tomou a próxima dose, por exem- plo, ao longo de uma semana após a última dose de metotrexato. Tal paci- ente é ainda considerado como passando por um tratamento com metotrexa- 30 to se a terapia com metotrexato está ainda sendo prescrita para o paciente.

B. Dosagem

A dose de antagonista de GM-CSF é escolhida de modo a for- necer terapia eficaz para um paciente que tem uma doença inflamatória crô- nica. A dose é tipicamente na faixa de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal ou na faixa de apro- ximadamente 1 mg a aproximadamente 2 g por paciente. A dose está fre- quentemente na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg ou aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1000 mg/paciente. A dose pode ser repetida em uma frequência apropriada que pode estar na faixa de uma vez por dia a uma vez a cada três meses, dependendo da farmacociné- tica dos antagonistas (por exemplo, meia vida do anticorpo na circulação) e a resposta farmacodinâmica (por exemplo, a duração do efeito terapêutico do anticorpo). Em algumas modalidades onde o antagonista é um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado, a meia vida in vivo entre aproxima- damente 7 e aproximadamente 25 dias e a dosagem de anticorpo é repetida entre uma vez por semana e uma vez a cada 3 meses. Em outras modalida- des, o anticorpo é administrado aproximadamente uma vez por mês.

Os protocolos de tratamento e doses para administrar metotre- xato são conhecidos na técnica. Por exemplo, as recomendações para do- sagem de metotrexato em AR, tal como as diretrizes da Sociedade Britânica de Reumatologia (julho de 2000) são 7,5 mg de Metotrexato semanalmente, 20 aumentando em 2,5 mg a cada seis semanas a uma dose máxima semanal de 25 mg. A dosagem para outros compostos antifolato pode também ser determinada usando métodos bem-conhecidos.

O composto antifolato, por exemplo, metotrexato, e antagonista de GM-CSF são administrados em uma faixa que não induz neutropenia. Por exemplo, os pacientes recebem metotrexato em uma dose de até aproxima- damente 25 mg/semana e de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 10 mg/kg de antagonista de GM-CSF.

Exemplos

Exemplo 1 - Anticorpos humanizados exemplificados para GM-CSF Um painel de moléculas Fab’ humanizadas com a especificidade

de c19/2 foi gerado a partir de bibliotecas de segmento V humano focado em epítopo como descrito no pedido de patente U.S. 2006/0134098. 1 Os fragmentos Fab’ foram expressos a partir de E. coli. Células

foram cultivadas em meio 2xYT para um OD6OO de 0,6. A expressão foi in- duzida usando IPTG por 3 horas a 33°C. Fab’ reunido foi obtido a partir de frações periplásmicas e purificadas por cromatografia por afinidade usando 5 Proteína G Estreptocócica (colunas HP de Proteína G HiTrap; GE Healthca- re) de acordo com os métodos padrão. Fab’s foram eluídos em tampão de pH 2,0, imediatamente ajustado para pH 7,0 e dialisados contra PBS de pH 7,4.

As cinéticas de ligação foram analisadas por ressonância plas- 10 mônica de superfície (SPR). O antígeno de GM-CSF humano recombínante foi biotinilado e imobilizado em um chip sensor CM5 de estreptavidina. As amostras de Fab foram diluídas em uma concentração de partida de 3 nM e executadas em uma série de diluição de 3 vezes. Ensaios foram executados em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0,1 mg/mL de BSA e 0,005% de 15 p20 em pH 7,4 e 37°C. Cada concentração foi testada duas vezes. Os en- saios de ligação de Fab’ foram executados em duas superfícies de densida- de de antígeno fornecendo conjuntos de dados em duplicata. A afinidade média (KD) para cada um dos 6 clones de Fab anti-GM-CSF humanizados, calculada usando um modelo de ligação de Langmuir 1:1, é mostrada na

* 20 Tabelai.

Os Fabs foram testados para neutralização de GM-CSF usando um ensaio de proliferação de célula TF-1. A proliferação dependente de GM- CSF de células TF-1 humanas foi medida após incubação por 4 dias com 0,5 ng/ml de GM-CSF usando um ensaio MTS (concentração de célula 96, Pro- 25 mega) para determinar células viáveis. Todos os Fabs inibiram a proliferação celular nesse ensaio indicando que esses são anticorpos neutralizantes. Há uma boa correlação entre afinidades relativas dos Fabs anti-GM-CSF e EC50 no ensaio baseado em célula. Os anticorpos anti-GM-CSF com afinidades monovalentes na faixa de 18 pM a 104 pM demonstram neutralização eficaz 30 de GM-CSF no ensaio baseado em célula.

Tabela 1: Afinidade de Fabs anti-GM-CSF determinada por aná- lise de ressonância plasmônica de superfície em comparação com a ativida- de (EC50) em um ensaio de proliferação de célula TF-1 dependente de GM- CSF

Fab Afinidade de ligação EC5O (pM) em ensaio de monovalente determina¬ proliferação de célula da por SPR (pM) TF-1 94 18 165 104 19 239 77 29 404 92 58 539 42 104 3200 44 81 7000 Exemplo 2 - Protocolo clínico Exemplificado para liberação de anticorpo an- ti-GM-CSF

Um anticorpo anti-GM-CSF é armazenado em 10 mg/ml de solu-

ção salina aquosa isotônica estéril para injeção a 4°C e é diluído em ou 100 ml ou 200 mi de cloreto de sódio a 0,9% para injeção antes de administração ao paciente. O anticorpo é administrado a um paciente tendo AR por infusão intravenosa pelo curso de 1 hora em uma dose entre 0,2 e 10 mg/kg.

Os pacientes para inclusão nesse protocolo de tratamento são

escolhidos com base nos seguintes critérios: o paciente mostra sinais de AR ativa, os pacientes estão atualmente recebendo tratamento com metotrexa- to, sendo que os pacientes têm recebido doses estáveis de DMARDs por ao menos 6 semanas. Ademais, os pacientes incluídos nesse estudo exibiram 15 os seguintes sintomas: contagem de juntas inchadas de ao menos 6 (usando 66 contagens de juntas), contagem de juntas sensíveis de ao menos 6 (u- sando 68 contagens de juntas). Ao menos dois dos critérios seguintes são também incluídos nos critérios de inclusão: ESR > 90 mm/h, CRP >15 mg/l, rigidez de manhã cedo de > 45 minutos.

Os pacientes recebem ou placebo (cloreto de sódio a 0,9% para

injeção) ou anticorpo anti-GM-CSF por infusão intravenosa no Dia 1 em uma das seguintes doses: 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg. Os paci- entes são monitorados por 29 dias. Todos os pacientes continuam a receber <■ DMARDs, metotrexato em uma dose até 25 mg/semana, prednisolona até 10 mg/dia, e NSAIDs como clinicamente apropriado junto com medicação para quaisquer outras condições médicas. Por toda a duração do estudo os se- guintes testes são executados como uma avaliação de segurança do estudo: 5 exame físico, medição dos sinais vitais, eletrocardiograma de 12 derivações (ECG), testes de laboratório incluindo hematologia, bioquímica e urinálise, testes de função pulmonar e incontinência e intensidade de eventos adver- sos (EAs).

A eficácia do tratamento é avaliada em dois estágios. A avalia- 10 ção primária envolve uma resposta a ACR20 em qualquer tempo antes ou no Dia 29 do tratamento. A avaliação secundária inclui tempo de medição para ACR20, proporção de pacientes que alcançam uma resposta a ACR 50 e 70 e ESR e CRP medidos nos Dias 8, 15 e 29.

Eventos adversos, sérios eventos adversos e anormalidades de 15 laboratório são tabulados por grupo de tratamento e comparados com aque- les do grupo de placebo acumulado. A eficácia do anticorpo anti-GM-CSF é analisada calculando-se as respostas a ACR 20/50/70 para intenção de tra- tar usando um procedimento de teste fechado. Os grupos ativos acumulados são comparados com os pacientes tratados com placebo.

Exemplo 3 - Tratamento de um paciente com metotrexato e anticorpo anti- GM-CSF

Um paciente que tem uma AR ativa foi tratado com metotrexato e um anticorpo anti-GM-CSF de acordo com o protocolo clínico descrito no Exemplo 2. O paciente recebeu 0,2 mg/kg de anticorpo anti-GM-CSF. O pa- ciente passou também por tratamento com 25 mg/semana de metotrexato.

As contagens de células sanguíneas foram determinadas por métodos padrão e incluíram determinação dos números de: hemoglobinal (HGB), glóbulos brancos totais (WBCC), plaquetas (PLT), neutrófilos (Neut, também chamados contagem de neutrófilos ANC), linfócitos (LYMPH), mo- 30 nócitos (MONO), eosinófilos (EOSIN), basófilos (BASO), hematócritos (HCT). Em adição, a taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR) e a proteína C-reativa (CRP) foram determinadas. As contagens de células sanguíneas ESR e CRP antes, durante o tratamento e até duas semanas após o trata- mento são mostradas na Tabela 2. Como se pode ver, após duas semanas, o ESR caiu de um valor anormal de 40 para 18, que está dentro da faixa normal para um indivíduo do mesmo sexo e idade do paciente tratado, en- 5 quanto a contagem de neutrófilos permaneceu inalterada. Consequentemen- te, uma terapia de combinação compreendendo tratamento com metotrexato e tratamento com um antagonista anti-GM-CSF, nesse caso um anticorpo anti-GM-CSF, forneceu um benefício terapêutico para o tratamento de artrite reumatoide.

10 O dia “1” na Tabela 2 indica quando o antagonista anti-GM-CSF

foi administrado. O paciente foi previamente tratado com metotrexato e con- tinuou recebendo tratamento com metotrexato com o tratamento com anta- gonista anti-GM-CSF.

Tabela 2 - Contagens de Células Sanguíneas e ESR a partir de um paciente tratado com doses semanais de metotrexato e administrada uma única dose de anticorpo anti-GM-CSF no Dia 1. Os números das várias células (plaquetas, neutrófilos, linfócitos, etc.) são x 109/L. O ESR é expres- so em mm/h.

Dias HGB WBCC PLT NEUT LYMPH HCT MO¬ EO- BASE ESR pós NO SIN trata¬ men¬ to -2 133 5,0 202 3,04 1,26 0,4 0,52 0,16 0,02 40 1 127 4,4 208 2,64 1,23 0,38 0,36 0,15 0,03 8 129 5,4 189 3,01 1,41 0,39 0,76 0,17 0,04 23 131 4,8 193 2,76 1,39 0,39 0,46 0,15 0,04 18 28 130 5,0 180 2,79 1,71 0,4 0,25 0,21 0,04 20 Os exemplos acima são fornecidos a título de ilustração somente e não a título de limitação. Os versados na técnica reconhecerão prontamen- te uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente similares.

Todas as publicações, pedidos de patente, números de acesso, e outras referências citadas neste relatório descritivo são aqui incorporados a título de referência como se cada publicação individual ou pedido de pa- tente fosse especificamente e individualmente indicado como estando incor- porado a título de referência. Listagem de Seqüências

SEQ ID N°. 1: seqüência de aminoácido para região variável de cadeia pesada 19/2 de ratos

Met Glu Leu He Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His 5 Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn He His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp He Gly Tyr He Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 10 Tyr Met GIu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Aspj Ser Ala VaI Tyr Tyr

Cys Ala Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Arg Val Ser Ser Val Ser Gly Ser

SEQ ID NO 2: seqüência de aminoácido para região variável de cadeia leve 19/2 de ratos

Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln He Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser GlyVal Asp Glv Asp He Val Met He Gln Ser Gln Lys Phe Val Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Glv Gln Ser Pro Lys Thr Leu He Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly 20 Arg Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr He Thr Thr Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Gl\i Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser He Phe Pro Pro Ser Ser Lys Gly Glu Phe

Claims (49)

1. Método para tratar um paciente que sofre de uma doença in- flamatória crônica, compreendendo administrar um composto antifolato e administrar um antagonista de GM-CSF ao paciente, em que o composto antifolato e o antagonista de GM-CSF são fornecidos em uma quantidade suficiente para reduzir os sintomas da doença inflamatória crônica, mas em uma quantidade que não induza à neutropenia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto antifolato é metotrexato.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a doença inflamatória crônica é a artrite reumatoide.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o antago- nista de GM-CSF é um anticorpo anti-GM-CSF.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv, ouumdAB.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o fragmento de anticorpo é conjugado a polietileno glicol.

9. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo tem uma faixa de afinidade de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 50 pM.

10. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po é um anticorpo neutralizante.

11. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po é um anticorpo recombínante ou quimérico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po é um anticorpo humano.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende uma região variável humana.

14. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende uma região constante da cadeia leve humana.

15. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende uma região constante da cadeia pesada humana.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a região constante da cadeia pesada humana é uma cadeia gama.

17. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po se liga ao mesmo epítopo do quimérico 19/2.

18. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende as regiões Vh e o Vl do quimérico 19/2.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o anti- corpo compreende uma região constante da cadeia pesada humana.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que a região constante da cadeia pesada humana é uma região gama.

21. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende CDR1, CDR2, e CDR3 da região Vh e Vl do quimérico 19/2.

22. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o anticor- po compreende CDR3 da região Vh e CDR3 da região Vl do quimérico 19/2.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o antago- nista de GM-CSF é selecionado a partir do grupo que consiste em um anti- corpo anti-receptor de GM-CSF, um receptor de GM-CSF solúvel, um anti- corpo mimético de citocromo b562, um adnectin, um anticorpo mimético de arcabouço de lipocalina, um anticorpo mimético de calixareno, e um anticor- po similar à ligação peptidomimética.

24. Método para tratar um paciente que sofre de artrite reuma- toide, compreendendo administrar o metotrexato e administrar uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-GM-CSF, em que o anti- corpo anti-GM-CSF compreende um Fab’ humanizado com a especificidade de ligação de quimérico 19/2 e tem uma afinidade na faixa de aproximada- mente 5 a aproximadamente 50 pM.

25. Método para tratar um paciente que sofre de doença de Al- zheimer, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efi- caz de anticorpo anti-GM-CSF ao paciente.

26. Uso de um anticorpo anti-GM-CSF em uma quantidade tera- peuticamente eficaz para a preparação de um medicamento para o trata- mento de doença inflamatória crônica em um paciente que passa por trata- mento com um composto de antifolato, em que a quantidade terapeutica- mente eficaz é suficiente para reduzir os sintomas de doença inflamatória crônica, mas não induz à neutropenia.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, em que o composto de antifolato é o metotrexato.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que o anti- corpo é um anticorpo monoclonal.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que o anticorpo é um anticorpo recombínante ou quimérico.

30. Uso1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, em que o anticorpo compreende uma região variável humana.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, em que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve humana.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, em que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada humana.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, em que a região constante da cadeia pesada humana é uma região gama.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 33, em que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo do quimérico 19/2.

35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o anticorpo compreende o CDR3 da região Vh e o CDR3 da re- gião Vl do quimérico 19/2.

36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 35, em que o anticorpo compreende CDR1, CDR2, e CDR3 da região Vh e da região Vl do quimérico 19/2.

37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 36,em que o anticorpo compreende as regiões Vh e Vl do quimérico 19/2.

38. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 37, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um scFv, ou um dAB.

39. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 38, em que o anticorpo tem uma afinidade na faixa de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 50 pM.

40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o anticorpo é um anticorpo humano.

41.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 40, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal.

42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 41, em que o anticorpo é anticorpo neutralizante.

43. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo anti-GM-CSF que compreende um Fab’ humanizado com uma especi- ficidade de ligação de quimérico 19/2 que tem uma afinidade na faixa de a- proximadamente 5 a aproximadamente 50 pM para a preparação de um me- dicamento para o tratamento de uma doença inflamatória crônica em um paciente que passa por um tratamento com metotrexato, em que a quantida- de terapeuticamente eficaz é suficiente para reduzir os sintomas de doença inflamatória crônica, mas não induz à neutropenia.

44. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 43, em que o anticorpo é conjugado ao polietileno glicol.

45. Uso de um antagonista de GM-CSF em uma quantidade te- rapeuticamente eficaz para a preparação de um medicamento para o trata- mento de doença inflamatória crônica em um paciente que passa por um tratamento com um composto de antifolato, em que a quantidade terapeuti- camente eficaz é suficiente para reduzir os sintomas de doença inflamatória crônica, mas não induz à neutropenia.

46. Uso, de acordo com a reivindicação 45, em que o composto de antifolato é o metotrexato.

47. Uso1 de acordo com a reivindicação 45 ou 46, em que o an- tagonista de GM-CSF é selecionado a partir de um anticorpo receptor anti- GM-CSF, um receptor de GM-CSF solúvel, um anticorpo mimético de cito- cromo b562; uma adnectina, um anticorpo mimético de arcabouço de Iipoca- lina; um anticorpo mimético de calixareno, ou um anticorpo similar à ligação peptidomimética.

48. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 47, em que a doença inflamatória crônica é a artrite reumatoide.

49. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo anti-GM-CSF para a preparação de um medicamento para o tratamen- to de um paciente que sofre de doença de Alzheimer.