BRPI0719000A2 - Anticorpos agonistas de trkb e seus usos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS AGONISTAS DE TRKB E SEUS USOS".

Referência Cruzada a Pedido de Patente Relacionado

O presente pedido de patente reivindica benefício para o pedido 5 de patente provisório n° 60/858.169, depositado em 9 de novembro de 2006, que é aqui incorporado como referência em sua totalidade para todos propó- sitos.

Antecedentes da Invenção

I. TrkB

O receptor de tirosina cinase B (TrkB) pertence a uma família de

receptores tirosina cinases individuais transmembrana que inclui TrkA e TrkC. Estas tirosina cinases receptoras (trks) medeiam a atividade de neuro- trofinas. As neurotrofinas não necessárias para a sobrevivência e desenvol- vimento neuronal e regulam a transmissão sináptica via modulação da arqui- 15 tetura neuronal e plasticidade sináptica. As neurotrofinas incluem, porém sem limitações, o fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico de- rivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), e neurotrofina-4/5 (NT-4/5). (Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)). TrkB é um receptor de alta afinidade de BDNF (Minichiello, et al., Neuron 21:335-45 (1998)). A Iiga- 20 ção de neurotrofina a trk ativa o receptor que dimeriza e autofosforila resí- duos de tirosina específicos no domínio intracelular do receptor (Jing, et al. Neuron 9:1067-1079 (1992); Barbacid, J. Neurobiol. 25:1386-1403 (1994); Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18:223 253 (1995); Segal e Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19:463 489 (1996); Kaplan e Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 25 10:381 391 (2000)). Estes resíduos de fosfotirosina servem como sítios de ancoragem para elementos de cascatas de sinalização intracelular que le- vam à supressão da morte de neurônios e outros efeitos das neurotrofinas. Por exemplo, Shc, FRS-2, SH2B, rAPS e PLCy interagem com TrkB por in- termédio de resíduos de tirosina fosforilada. A associação destas moléculas 30 adaptadoras com TrkB ativado resulta na iniciação de vias sinalizadoras que incluem proteína cinase ativada por mitógenos, fosfatidilinositol 3-cinase, e vias de PLCy, mediando desta forma as ações de neurotrofinas (Lo, KY et al., J. BioL Chem., 280:41744-52 (2005)).

II. Diabetes

A concentração de glicose na corrente sanguínea humana deve ser controlada dentro de uma faixa relativamente estreita (60-120 miligramas 5 por decilitro de sangue) para manter a saúde normal. Caso a glicose sanguí- nea caia baixo demais, resulta uma condição conhecida como hipoglicemia, com sintomas tais como debilidade, fraqueza, cefaléia, confusão e mudan- ças de personalidade. Uma glicose sanguínea excessiva, ou hiperglicemia, pode causar dano tecidual devido a reações químicas entre a glicose em 10 excesso e proteínas em células, tecidos, e órgãos. Acredita-se que este da- no cause as complicações diabéticas de cegueira, insuficiência renal, impo- tência, aterosclerose, e maior vulnerabilidade à infecção.

O diabetes melito está associado com concentração sanguínea contínua e patologicamente elevada de glicose; ele é uma das principais 15 causas de morte nos Estados Unidos e é resposável por cerca de 5% de toda a mortalidade. O diabetes é dividido em duas subclasses principais: Tipo I, também conhecido como diabetes juvenil, ou Diabetes Melito Depen- dente de Insulina (IDDM), e Tipo II, também conhecido como diabetes de início em adultos, ou Diabetes Não-dependente de Insulina (NIDDM).

>■ 20 O diagnóstico de diabetes melito Tipo Il inclui a avaliação de sin-

tomas e medição de glicose na urina e sangue. A determinação do nível san- guíneo de glicose é necessária para um diagnóstico preciso. Mais especifi- camente, a determinação do nível sanguíneo de glicose em jejum é uma a- bordagem padronizada usada. Entretanto, o teste de tolerância à glicose 25 (OGTT) é considerado como sendo mais sensível do que o nível sanguíneo de glicose em jejum. O diabetes melito Tipo Il está associado à tolerância enfraquecida à glicose oral (OGT). O OGTT pode, assim, auxiliar no diag- nóstico de diabetes melito do Tipo II, embora genericamente não necessário para o diagnóstico de diabetes (Emancipator, K., Am. J. Clin. PathoL 30 112(5):665 74 (novembro de 1997); Diabetes Melito, Decision Resources, Inc., março de 2000).

Assim sendo, a tolerância enfraquecida à glicose é diagnostica- da em indivíduos que têm níveis sanguíneos de glicose em jejum menores do que aqueles necessários para um diagnóstico de diabetes melito Tipo II, mas têm resposta plasmática à glicose durante o OGTT entre normal e dia- bética. A tolerância enfraquecida à glicose é considerada uma condição pré- 5 diabética, e a tolerância enfraquecida à glicose (como definido pelo OGTT) é um forte previsor para o desenvolvimento de diabetes melito Tipo Il (Haffner,

S. M., Diabet. Med. 14 Suplemento 3:S12 8 (agosto de 1997).

O diabetes melito Tipo Il é uma doença progressiva associada à redução da função pancreática e/ou outros processos relacionados à insulina, 10 agravados por níveis plasmáticos mais altos de glicose. Assim sendo, o diabe- tes melito Tipo Il usualmente tem uma fase pré-diabética prolongada e vários mecanismos patológicos podem levar à hiperglicemia patológica e tolerância enfraquecida à glicose, por exemplo, anormalidades na utilização e eficácia de glicose, ação da insulina e/ou produção de insulina no estado pré-diabético 15 (Goldberg, R. B., Med. Gin. North Am. 82(4):805 21 (julho de 1998)).

O estado pré-diabético associado à intolerância à glicose pode estar também associado à uma predisposição à obesidade abdominal, resis- tência à insulina, hiperlipidemia, e alta pressão sanguínea (Groop, L., Fors- blom, C., Lehtovirta, M., Am. J. Hypertens. 10(9 Pt 2) (setembro de 20 1997):172S 180S; Haffner, S. M., J. Diabetes Complications 11(2):69 76 (março/abril de 1997); Beck-Nielsen, H., Henriksen, J. E., Alford, F., Hother- Nielson, O., Diabet. Med. 13 (9 Suplemento 6):S78 84) (setembro de 1996).

Uma intervenção precoce em indivíduos em risco de desenvol- ver diabetes melito Tipo II, focando ou reduzindo a hiperglicemia patológica 25 ou a tolerância enfraquecida à glicose pode prevenir ou retardar a progres- são para diabetes melito Tipo Il e complicações associadas. Portanto, tra- tando eficazmente a tolerância enfraquecida à glicose oral e/ou os níveis sanguíneos elevados de glicose, pode-se prevenir ou inibir a progressão do distúrbio para diabetes melito Tipo Il (vide, por exemplo, patente n0 US 30 7.109.174).

A insulina e sulfoniluréias (agentes terapêuticos hipoglicemiantes orais) são as duas principais classes de medicamentos para diabetes pres- critas atualmente nos Estados Unidos. A insulina é prescrita para diabetes Tipo I e também Tipo II, enquanto que as sulfoniluréias são usualmente prescritas apenas para diabetes Tipo II. As sulfoniluréias estimulam a secre- ção de insulina natural e reduzem a resistência à insulina; estes compostos 5 não substituem a função de insulina no metabolismo. Aproximadamente um terço dos pacientes que recebem sulfoniluréia fica resistente a ela. Alguns diabéticos Tipo Il não respondem à terapia com sulfoniluréia. Dos pacientes que não respondem ao tratamento inicial com sulfoniluréias, 5-10% possi- velmente experimentam uma perda de eficácia de sulfoniluréia depois de 10 cerca de dez anos (vide, por exemplo, patente n0 US 7.115.284.

Muitos agentes antidiabéticos tipicamente prescritos para o tra- tamento de diabetes melito Tipo II, por exemplo, sulfoniluréias e tiazolidino- dionas,têm um efeito colateral indesejado de aumentar o peso corporal. Um maior peso corporal em pacientes com condições pré-diabéticas ou com di- 15 abetes melito Tipo Il diagnosticado resulta em efeitos prejudiciais devido à acentuação da desregulação metabólica e endócrina, e a obesidade por si só é um fator de risco essencial para o desenvolvimento e piora progressiva do diabetes melito Tipo II. Assim sendo, é desejável ter um agente antidiabé- tico que mantém ou a baixa o peso corporal (vide, por exemplo, patente n° -20 US 7.199.174.

A obesidade é um problema de saúde pública comum e muito sério pois ele aumenta o risco para uma pessoa de inúmeras condições sé- rias, inclusive diabetes, doença cardíaca, acidente vascular cerebral, alta pressão sanguínea, e alguns tipos de cânceres. Um aumento considerável 25 no número de indivíduos durante as duas últimas décadas criou implicações profundas de saúde pública. Embora estudos tenham demonstrado que essa redução na obesidade por dieta e exercício reduz dramaticamente os fatores de risco associados, estes tratamentos são grandemente infrutíferos consi- derando que a obesidade está fortemente associada a fatores geneticamen- 30 te herdados que contribuem para apetite aumentado, preferências por ali- mentos altamente calóricos, atividade física reduzida, e metabolismo lipogê- nico aumentado (vide, por exemplo, patente n0 US 7.115.767. Assim sendo, é um objetivo da invenção superar as desvantagens dos atuais tratamentos de hiperglicemia, obesidade, e diabetes.

Breve Sumário da Invenção

A presente invenção fornece agonistas de anticorpos isolados do Receptor de Tirosina Cinase B (TrkB). Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de ca- deia única. Em algumas modalidades, o anticorpo não se liga ao Receptor de Tirosina Cinase A ou Receptor de Tirosina Cinase C.

Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao Domínio de Ligação do Ligante (LBD) de TrkB. Em algumas modalidades, o anticorpo compete com a ligação do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) a TrkB. Em algumas modalidades, o anticorpo compete pela ligação a TrkB com um anticorpo competidor que compreende uma região variável da ca- deia pesada que compreende SEQ ID NO:3 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:7 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:11 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compre- ende SEQ ID NO:15 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:16. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma re- gião variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NOs: 7, 11, e 15 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NOs: 8, 12, e 16. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que comprende SEQ ID NO:3 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:4.

Em algumas modalidades, o anticorpo não se liga ao domínio de ligação do Iigante de TrkB. Em algumas modalidades, o anticorpo não com- pete com a ligação do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) a TrkB. Em algumas modalidades, o anticorpo compete pela ligação a TrkB com um anticorpo competidor que compreende uma região variável da ca- deia pesada que compreende SEQ ID NO:1 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID 5 NO:5 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:9 e uma região variável da ca- deia leve que compreende SEQ ID N0:10. Em algumas modalidades, o anti- corpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende 10 SEQ ID NO:13 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NOs: 5, 9, e 13 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NOs: 6, 10, e 14. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável da 15 cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:1 e uma região variável da ca- deia leve que compreende SEQ ID NO:2.

A presente invenção fornece também composições fisiológicas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com a reivindicação 1; e um veículo farmacêutico. Em algumas mo-

- 20 dalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente que reduz os níveis sanguíneos de glicose em um indivíduo. Em algumas moda- lidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente que reduz o peso corporal em um indivíduo.

A presente invenção fornece também métodos para reduzir os 25 níveis sanguíneos de glicose e/ou o peso corporal em um indivíduo que ne- cessita dele. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adminis- trar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista de anticorpo do Receptor de Tirosina Cinase B (TrkB) ao indivíduo. Em algumas modalida- des, o indivíduo é pré-diabético. Em algumas modalidades, o indivíduo tem 30 diabetes Tipo I. Em algumas modalidades, o indivíduo tem diabetes Tipo II. Em algumas modalidades, o indivíduo tem sobrepeso. Em algumas modali- dades, o indivíduo é obeso. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo agente eficaz em reduzir a glicose sanguínea é admi- nistrada ao indivíduo em combinação com o agonista de anticorpo de TrkB. Em algumas modalidades, o segundo agente e o agonista de anticorpo de 5 TrkB são administrados como uma mistura. Em algumas modalidades, o se- gundo agente é administrado separadamente do agonista de anticorpo de TrkB. Em algumas modalidades, o segundo agente é selecionado no grupo que consiste em: insulina, sulfoniluréias, agentes insulinotrópicos, metformi- na, agonistas de PPARy, agonistas de PPARa, agonistas de PPARô, agonis- 10 tas duplos de PPARay, "panagonistas" de PPARayô, inibidores de alfa- glicosidase, inibidores de DPP-IV, e análogos de GLP-1/GLP-1.

Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo agente eficaz em reduzir peso ou obesidade é admi- nistrado ao indivíduo em combinação com o agonista de anticorpo de TrkB. 15 Em algumas modalidades, o segundo agente e o agonista de anticorpo de TrkB são administrados como uma mistura. Em algumas modalidades, o se- gundo agente é administrado separadamente do agonista de anticorpo de TrkB. Em algumas modalidades, o segundo agente é selecionado no grupo que consiste em inibidores de lipase, sibutramina, inibidores de CB-1, topi- 20 ramato, amilina, análogos de amilina, leptina, análogos de PYY/PYY, e aná- logos de GLP-1/GLP-1.

Definições

“Anticorpo" refere-se um polipeptídeo que compreende uma re- gião de estrutura de um gene de imunoglobulina ou fragmentos dele que se 25 liga especificamente e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, bem como a miríade de genes de região variável de imuno- globulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As ca- deias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, as 30 quais, por sua vez, definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE1 respectivamente.

As imunoglobulinas de ocorrência natural têm uma estrutura de núcleo comum na qual duas cadeias leves idênticas (cerca de 24 kD) e duas cadeias pesadas idênticas (cerca de 55 ou 70 kD) formam um tetrâmero. A parte do terminal amino de cada cadeia é conhecida como a região variável (V) e pode ser distinguida das regiões constantes (C) mais conservadas do 5 restante de cada cadeia. Dentro da região variável da cadeia leve há uma parte do terminal C conhecida como a região J. Dentro da região variável da cadeia pesada, há uma região D além da região J. A maioria das variações de seqüências de aminoácidos em imunoglobulinas fica confinada em locais separados nas regiões V conhecidas como regiões hipervariáveis ou regiões 10 determinadoras de complementaridade (CDRs) que estão envolvidas dire- tamente na ligação de antígenos. Prosseguindo a partir do terminal amino, estas regiões são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. As CDRs são mantidas no lugar por regiões de estrutura mais conservadas (FRs). Prosseguindo a partir do terminal amino, estas regiões são designa- 15 das FRI, FR2, FR3, e FR4, respectivamente. As localizações das regiões CDR e FR e um sistema de numeração foram definidos por, por exemplo, Kabat et al. (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Go- vernment Printing Office (1991)).

>■ 20 Uma unidade estrutural (anticorpo) de imunoglobulina de ocor-

rência natural exemplificativa compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é constituído de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 25 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhe- cimento de antígenos. Os termos “cadeia leve variável” (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) referem-se a estas cadeias leve e pesada respectivamente.

Existem anticorpos, por exemplo, como imunoglobulinas intactas ou como inúmeros fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão 30 com várias peptidases. Assim sendo, por exemplo, a pepsina digere um an- ticorpo abaixo de ligações dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab que em si é uma cadeia leve unida a Vh-Chi por uma ligação dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condições brandas para romper a ligação dissulfeto na região de dobradiça, convertendo desta forma o dímero F(ab)'2 em monômero Fab'. O monômero Fab' é essencial- mente Fab com parte da região de dobradiça (vide “Fundamental Immuno- 5 logy” (editor Pauld., 3â edição, 1993). Embora vários fragmentos de anticor- po sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, os ver- sados nessas técnicas devem avaliar que tais fragmentos podem ser sinteti- zados de novo quimicamente ou usando metodologia de DNA recombinante. Assim sendo, o termo "anticorpo", como aqui utilizado, inclui também frag- 10 mentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos integrais, ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou aqueles identificados usando bibliote- cas de apresentação de fagos (vide, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990)).

Para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonaís,

qualquer técnica conhecida nessas técnicas pode ser usada (vide, por e- xemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immu- nology Today 4:72 (1983); Cole et al., páginas 77-96 in Monoclonal Antibodi- es and Cancer Therapy (1985)). Anticorpos "monoclonais" referem-se a anti- 20 corpos derivados de um único clone. As técnicas para a produção de anti- corpos de cadeia única (patente n0 US 4.946.778) podem ser adaptadas pa- ra produzir anticorpos para os polipeptídeos desta invenção. Além disso, camundongos transgênicos, ou outros organismos tais como outros mamífe- ros, pode ser usados para expressar anticorpos humanizados. Alternativa- 25 mente, uma tecnologia de apresentação de fagos pode ser usada para iden- tificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especifica- mente a antígenos selecionados (vide, por exemplo, McCafferty et al., Natu- re 348:552-554 (1990); Marks etal., Biotechnology 10:779-783 (1992)).

Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo na qual

(a) a região constante, ou uma parte dela, é alterada, substituída ou trocada, de tal modo que o sítio de ligação de antígeno (região variável) fique ligada a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, a função efetora e/ou espécie, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades para o anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma parte dela, é alterada, substituída ou trocada por uma região variável 5 que tem uma especificidade de antígeno diferente ou alterada.

Um anticorpo A "humanizado" é um anticorpo que retém a reati- vidade de um anticorpo não-humano, e ao mesmo tempo, sendo menos i- munogênico em humanos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, retendo as regiões CDR não-humanas e substituindo as partes remanescentes do 10 anticorpo por seus equivalentes seres-humanos. Vide, por exemplo, Morri- son etal., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun.,

31 (3):169-217 (1994).

15 A frase "liga-se especificamente (ou seletivamente)" a um anti-

corpo, ou "especificamente (ou seletivamente) immunorreativo com", quando se referindo a uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína em uma população heterogê- nea de proteínas e outros materiais biológicos. Assim sendo, sob as condi-

- 20 ções designadas do imunoensaio, os anticorpos especificados se ligam a uma proteína específica pelo menos duas vezes o fundo e não se ligam substancialmente em uma quantidade significativa a outras proteínas pre- sentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo sob tais condições pode requerer um anticorpo que é selecionado quanto à sua especificidade 25 para uma proteína específica. Esta seleção pode ser realizada subtraindo os anticorpos que têm reação cruzada com, por exemplo, TrkA ou TrkC. Uma série de formatos de imunoensaio pode ser usada para selecionar anticorpos imunorreativos especificamente com uma proteína específica. Por exemplo, imunoensaios ELISA em fase sólida são usados rotineiramente para sele- 30 cionar anticorpos imunorreativos especificamente com uma proteína (vide, por exemplo, Harlow & Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” (1988), para obter uma descrição de formatos de imunoensaios e condições que podem ser usadas para determinar imunorreatividade específica). Tipicamente, uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal ou interfe- rência de fundo e mais tipicamente mais do que 10 a 100 vezes o fundo.

O termo "agonista de anticorpo" refere-se a um anticorpo capaz de ativar um receptor para induzir uma resposta completa ou parcial media- da pelo receptor. Por exemplo, um agonista de TrkB se liga a TrkB e induz sinalização mediada por TrkB. Em algumas modalidades, um agonista de anticorpo de TrkB pode ser identificado por sua capacidade de se ligar a TrkB e induzir o surgimento de neuritos quando colocado em contato com células SH-SY5Y ou como descrito aqui de outra forma. Os anticorpos ago- nistas são aqueles que ativam uma resposta de receptor pelo menos 10% acima da resposta na ausência do anticorpo. Em alguns casos, um anticorpo agonista ativa uma resposta de receptor mais do que 25%, 50%, 75%, ou 100% acima da resposta na ausência do anticorpo. Alguns agonistas de an- ticorpos ativam uma resposta de receptor de 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais acima da resposta na ausência do anticorpo.

A “atividade" de um polipeptídeo da invenção refere-se a fun- ções estruturais, reguladoras ou bioquímicas de um polipeptídeo em sua célula ou tecido nativo. Os exemplos de atividades de um polipeptídeo inclu- em atividades diretas e atividades indiretas. As atividades diretas exemplifi- cativas são o resultado de interação indireta com o polipeptídeo, incluindo ligação do ligante, tal como ligação de BDNF ao Domínio de Ligação do Li- gante (LBD) (vide, por exemplo, Naylor et al., Biochem Biophys Res Com- mun. 291(3):501-7 (2002) e SEQ ID NO:18) de TrkB, produção ou depleção de segundos mensageiros (por exemplo, cAMP, cGMP, IP3, DAG, ou Ca2+), fluxo iônico, e mudanças no nível de fosforilação ou transcrição. As ativida- des indiretas exemplificativas no contexto de TrkB são observadas como uma mudança no fenótipo ou resposta em uma célula ou tecido a uma ativi- dade direcionada do polipeptídeo, por exemplo, reduzindo os níveis sanguí- neos globais de glicose como resultado da interação do polipeptídeo com outros componentes celulares ou teciduais.

O termo "obeso", quando utilizado com referência a seres huma- nos adultos, refere-se a um indivíduo com um índice de massa corporal (IMC) de 30 ou mais. "Sobrepeso", quando utilizado com referência a seres humanos adultos, refere-se a um indivíduo com um IMC de 25 ou mais. Para crianças, são usados os gráficos do índice de Massa Corporal para a idade, 5 onde um IMC maior do que o 85° percentil é considerado "sobrepeso" e um IMC maior do que o 95° percentil é considerado "obeso". Vide, por exemplo, “Clinicai Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Over- weight and Obesity in Adult” (National Heart, Lung and Blood Institute, 17 de junho de 1998), e “Preventing and Managing the Global Epidemic of Obesity” 10 no Relatório da Organização Mundial da Saúde “Consultation of Obesity” (OMS, Geneva, junho de 1997).

Um “indivíduo pré-diabético” refere-se a um adulto com um nível sanguíneo de glicose em jejum maior do que 110 mg/dL, mas menor do que 126 mg/dL ou uma leitura de PG em 2 horas maior do que 140 mg/dL, mas 15 menor do que 200 mg/dL. O termo “indivíduo diabético”, quando utilizado para comparar com uma amostra de um paciente, refere-se a um adulto com um nível sanguíneo de glicose em jejum maior do que 126 mg/dL ou uma leitura de PB em 2 horas maior do que 200 mg/dL. O termo “jejum” refere-se a nenhuma ingestão calórica por pelo menos 8 horas. Uma “PG em 2 horas” > 20 refere-se ao nível de glicose depois de inocular um paciente com uma carga de glicose que contém o equivalente de 75 g de glicose anidra dissolvida em água. O teste global é referido genericamente como um teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Vide, por exemplo, Diabetes Care, 26(11):3160-3167 (2003).

25 O termo "isolado", quando aplicado a um ácido nucléico ou pro-

teína, denota que o ácido nucléico ou proteína é essencialmente isenta de outros componentes celulares com a qual ela está associada no estado na- tural. Ela está, de preferência, em um estado homogêneo. Ela pode estar em uma solução seca ou aquosa. A pureza e a homogeneidade são determina- 30 das tipicamente usando técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Particularmente, um gene isolado é separado de estruturas de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam uma prote- ína que não o gene de interesse. O termo "purificado" denota que um ácido nucléico ou proteína gera essencialmente uma banda em um gel eletroforéti- 5 co. Particularmente, significa que o ácido nucléico ou proteína é pelo menos 85% pura, mais preferivelmente pelo menos 95% pura, e ainda mais preferi- velmente, pelo menos 99% pura.

O termo “ácido nucléico” ou “polinucleotídeo” refere-se a desoxir- ribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros deles na forma de fita úni- 10 ca ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo engloba ácidos nucléicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucléico referencial e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natu- ral. A menos que diferentemente indicado, uma seqüência de ácido nucléico 15 específica engloba também implicitamente suas variantes conservativamen- te modificadas (por exemplo, substituição de códons degenerados) e se- qüências de complementaridade, bem como a seqüência explicitamente in- dicada. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser realizadas gerando seqüências nas quais a terceira posição de um ou 20 mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Aeid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Os termos "ácido nucléi- co" e "polinucleotídeo" são utilizados de forma intercambiável.

Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui utili-

zados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros 30 de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de ácidos nucléicos de ocorrência não-natural. Como aqui utilizados, os termos englobam cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de compri- * mento inteiro, onde os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas covalentes.

O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de a- minoácidos que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de o- corrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codifi- cados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidróxi-prolina, γ-carbóxi-glutamato, e O- fosfosserina. O termo “análogos de aminoácidos” refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo car- boxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleuci- na, sulfóxido de metionina, metionina-metil-sulfônio. Tais análogos têm gru- pos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modifi- cadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. O termo “miméticos de aminoácidos” refere-se a compos- tos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química genérica de um aminoácido, mas que funcionam de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural. k 20 Os aminoácidos podem ser referidos aqui por símbolos de três

letras conhecidos comumente ou por símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotí- deos, similarmente, podem ser referidos por seus códigos de uma única letra aceitos comumente.

25 O termo “variantes conservativamente modificadas” apiica-se a

seqüências de aminoácidos e ácidos nucléicos. Com relação a seqüências de ácidos nucléicos específicas, “variantes conservativamente modificadas” referem-se aos ácidos nucléicos que codificam seqüências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou nas quais o ácido nucléico não 30 codifica uma seqüência de aminoácidos, para seqüências essencialmente idênticas. Por causa de degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteí- na. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU, todos, codificam o aminoácido alanina. Assim sendo, em cada posição onde uma alanina é es- pecificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado.

Tais variações de ácidos nucléicos são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada seqüência de ácidos nucléicos neste caso que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucléico. Os versados nessas técnicas devem reconhecer que cada códon em um ácido nucléico (exceto 10 AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é nor- malmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo é implícita em cada seqüência descrita.

Quanto às seqüências de aminoácidos, os versados nessas téc-

nicas devem reconhecer que substituições, deleções ou adições individuais a uma seqüência de ácidos nucléicos, peptídeos, polipeptídeos, ou proteína, alteram, adicionam ou deletem um único aminoácido ou uma porcentagem pequena de aminoácidos na seqüência codificada é uma “variante conserva- 20 tívamente modificada”, onde a alteração resulta na substituição de um ami- noácido por um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição que indicam aminoácidos funcionalmente similares são bem-conhecidas nessas técnicas. Tais variantes conservativamente modificadas são adicio- nais e não excluem variantes polimórficas, homólogos entre espécies, e ale- 25 Ios da invenção.

Os seguintes oito grupos que contêm aminoácidos que são substituições conservativas entre si:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F)1 Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S)1 Treonina (T); e

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

5 A “porcentagem de identidade de seqüências” é determinada

comparando duas seqüências otimamente alinhadas em uma janela de comparação, onde a parte da seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) em comparação com a seqüência referencial (por exemplo, um polipeptídeo da 10 invenção), que não compreende adições ou deleções, para alinhamento óti- mo das duas seqüências. A porcentagem é calculada determinando o núme- ro de posições nas quais a base de ácido nucléico ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre e ambas seqüências para produzir o número de posições equiparadas, dividindo o número de posições equiparadas pelo número total 15 de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüências.

Os termos “idênticas” ou “identidade” percentual, no contexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais seqüências ou subsequências que são as mesmas seqüências. 20 As seqüências são "substancialmente idênticas" caso duas seqüências te- nham um porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotí- deos que são iguais (isto é, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade em uma região especificada, ou quando não especificado, na seqüência inteira), em comparação com e ali- 25 nhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação, região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos para compara- ção de seqüências ou por alinhamento manual e inspeção visual, ou através da seqüência inteira quando não indicado. A invenção fornece polipeptídeos ou polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que são substancialmente 30 idênticos, ou que compreendem seqüências substancialmente idênticas aos polipeptídeos aqui exemplificados (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Esta definição refere-se também ao complemento de uma seqüência de nucleotídeos em teste. Opcionalmente, a identidade existe em uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleotí- deos de comprimento, ou mais preferivelmente em uma região que tem 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos de comprimento.

5 Para comparação de seqüências, tipicamente uma seqüência

atua como uma seqüência referencial, com a qual as seqüências em teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo para comparação de se- qüências, as seqüências em teste e referencial são inseridas em um compu- tador, as coordenadas de subsequências são designadas, caso necessário, 10 e os parâmetros do programa de algoritmos de seqüências são designados. Os parâmetros do programa de omissão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo para comparação de se- qüências calcula então as identidades percentuais de seqüências para as seqüências em teste em relação à seqüência referencial, baseado nos pa- 15 râmetros do programa.

O termo “janela de comparação”, como aqui utilizado, inclui refe- rência a um segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas no grupo que consiste em de 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150 nos quais 20 uma seqüência pode ser comparada com uma seqüência referencial com o mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências estão otimamente alinhadas. Os métodos para alinhamento de seqüências para comparação são bem-conhecidos nessas técnicas. O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algo- 25 ritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. AppL Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 85:2444, por im- plementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, 30 e TFASTA no Pacote de Software de Genética Wisconsin, Genetics Compu- ter Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por alinhamento manual e ins- peção visual (vide, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Moleeu- Iar Biology (1995 suplemento)).

Dois exemplos de algoritmos que são apropriados para determi- nar a identidade percentual de seqüências e similaridade de seqüências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al.

5 (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. MoL Biol. 215:403-410, respectivamente. O software para realizar análises BLAST es- tá disponível para o público através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeira- mente identificar pares de seqüências (HSPs) identificando palavras curtas 10 de comprimento W na seqüência de consulta, que eqüivalem ou satisfazem a alguma pontuação de limite com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é referida como o limite de pontuação de palavra circunvizinha (Altschul et al., supra). Estes acertos iniciais de palavra circunvizinha atuam como se- 15 mentes para iniciar buscas para descobrir HSPs mais longas que as contêm. Os acertos de palavras são estendidos em ambas direções ao longo de cada seqüência quão distante a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para se- qüências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de premiação para 20 um par de resíduos equiparados; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não equiparados; sempre < 0). Para seqüências de aminoáci- dos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulati- va. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é detida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai fora na quantidade X a partir de 25 seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontua- ção negativa; ou a extremidade de cada seqüência é alcançada. Os parâme- tros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) 30 usa como omissões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoffe Henikoff (1989) Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:10915) alina- mentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas fitas.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da

similaridade entre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin e Altschul

(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787). Uma medida de similari- dade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N))1 que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma equipara- 10 ção entre duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüên- cia referencial caso a probabilidade de menor soma em uma comparação do ácido nucléico em teste com o ácido nucléico referencial seja menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente, menor do que cerca de 0,01, e ainda 15 mais preferivelmente, menor do que cerca de 0,001.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 ilustra o efeito de BDNF em um ensaio de Anoikis.

A Figura 2 ilustra o efeito de vários anticorpos de TrkB identifica- dos em um ensaio de Anoikis.

A Figura 3 apresenta a reatividade dos anticorpos de TrkB isola-

dos.

A Figura 4 ilustra que os agonistas de anticorpos funcionais de TrkB purificados não são reativos contra TrkA ou TrkC humana.

A Figura 5 ilustra agonistas de anticorpos em um ensaio de dife- renciação SH-SY5Y.

A Figura 6 ilustra os resultados de isotopia de anticorpos funcio- nais monoclonais de TrkB.

A Figura 7 resume as informações de vários anticorpos agonis- tas identificados.

A Figura 8 ilustra que anticorpos agonistas de TrkB reduzem os

níveis séricos de glicose e promovem perda de peso profilaticamente.

A Figura 9 ilustra que anticorpos agonistas de TrkB reduzem os níveis séricos de glicose e promovem perda de peso profilática e terapeuti- camente.

A Figura 10 fornece as seqüências da região variável dos anti- corpos A10 e C20 aqui descritos. Para cada seqüência, a primeira parte sub- Iinhada é CR1, a segunda parte sublinhada é CDR2 e a terceira parte subli- nhada é CDR3.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Introdução

A presente invenção fornece anticorpos agonistas de TrkB inusi- tados. Os anticorpos agonistas de TrkB da invenção se ligam especificamen- te a TrkB e ativam TrkB. Surpreendentemente, o presente pedido de patente demonstra que os anticorpos agonistas de TrkB da invenção também redu- zem dramaticamente os níveis sanguíneos de glicose em camundongos dia- béticos in vivo. Além disso, o tratamento com os anticorpos agonistas de TrkB da invenção preveniu o ganho de peso que é normalmente observado nestes camundongos. Estes resultados demonstram que os anticorpos da invenção são específicos para TrkB e são eficazes em ativar o receptor. A- lém disso, os resultados revelam que a ativação de TrkB é útil em prevenir hiperglicemia e suas condições associadas, obesidade, pré-diabetes, e dia- betes Tipo II.

II. Anticorpos que se ligam a TrkB

1. Introdução

Quaisquer anticorpos agonistas de TrkB podem ser usados de acordo com os métodos da invenção.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas de TrkB da

invenção se ligam ao sítio de ligação do Iigante de TrkB e/ou competem com BDNF pela ligação a TrkB. Um anticorpo exemplificativo que se liga ao sítio de ligação do Iigante de TrkB é o Anticorpo A10F18.2 (também referido aqui como "A10F18" ou "A10"). A região variável da cadeia pesada do anticorpo 30 A10 está exemplificada em SEQ ID NO:1 e a região variável da cadeia leve do anticorpo A10 está exemplificada em SEQ ID NO:2. Consequentemente, a invenção fornece anticorpos agonistas que competem pela ligação a TrkB com um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:1 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, os anticorpos da in- venção compreendem pelo menos as regiões determinantes de compiemen- 5 taridade (CDRs) de SEQ ID NO:1 e/ou 2. Sem pretender limitar o âmbito da invenção, acredita-se que CDR3 desempenhe um papel significativo na liga- ção do anticorpo A10. Consequentemente, em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção compreende SEQ ID NOs: 5 e/ou 6. Entre- tanto, CDR1 e/ou CDR2 também desempenham um papel na ligação. Con- 10 sequentemente, em algumas modalidades, um anticorpo da presente inven- ção compreende SEQ ID NOs: 9 e/ou 10 ou 13 e/ou 14.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas de TrkB da invenção não se ligam ao sítio de ligação do Iigante de TrkB e/ou competem com BDNF pela ligação a TrkB. Um anticorpo exemplificativo que não se liga 15 ao sítio de ligação do Iigante de TrkB é o Anticorpo C20.Í1.1 (também referi- do aqui como "C20.i1", "C20.I1" e "C20"). A região variável da cadeia pesada do anticorpo C20 é exemplificada em SEQ ID NO:3 e a região variável da cadeia leve do anticorpo C20 é exemplificada em SEQ ID NO:4. Consequen- temente, a invenção fornece anticorpos agonistas que competem pela Iiga- 20 ção a TrkB com um anticorpo que compreende uma região variável da ca- deia pesada que compreende SEQ ID NO:3 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, os anticor- pos da invenção compreendem pelo menos as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de SEQ ID NO:3 e/ou 4. Sem pretender limitar o 25 âmbito da invenção, acredita-se que CDR3 desempenhe um papel significa- tivo na ligação do anticorpo C20. Consequentemente, em algumas modali- dades, um anticorpo da presente invenção compreende SEQ ID NOs: 7 e/ou

8. Entretanto, CDR1 e/ou CDR2 também desempenham um papel na liga- ção. Consequentemente, em algumas modalidades, um anticorpo da presen- te invenção compreende SEQ ID NOs: 11 e/ou 12 ou 15 e/ou 16.

Qualquer tipo de agonista de anticorpo pode ser usado de acor- do com os métodos da invenção. Geralmente, os anticorpos usados são an- ticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser gerados por qualquer método conhecido nessas técnicas (por exemplo, usando hibrido- mas, expressão recombinante e/ou apresentação de fagos).

2. Anticorpos Humanizados 5 Em algumas modalidades, o anticorpo usado de acordo com a

presente invenção é um anticorpo quimérico (por exemplo, camundon- go/humano) constituído de regiões de um agonista de anticorpo anti-TrkB não-humano junto com regiões de anticorpos humanos. Por exemplo, uma cadeia H quimérica pode compreender a região de ligação do antígeno da 10 região variável da cadeia pesada (por exemplo, SEQ ID NOs:1 ou 3 ou pelo menos partes delas, tais como uma CDR) do anticorpo não-humano ligado a pelo menos uma parte de uma região constante da cadeia pesada humana. Esta cadeia pesada humanizada ou quimérica pode ser combinada com uma cadeia Leve quimérica que compreende a região de ligação do antígeno da 15 região variável da cadeia leve (por exemplo, SEQ ID NOs: 2 ou 4 ou pelo menos partes dela, tal como uma CDR) do anticorpo não-humano ligado a pelo menos uma parte da região constante da cadeia leve humana. Em al- gumas modalidades, a região constante da cadeia pesada pode ser um anti- corpo de IgM ou IgA.

Os anticorpos quiméricos da invenção podem ser imunoglobuli-

nas monovalentes, imunoglobulinas bivalentes, ou polivalentes. Por exem- plo, um anticorpo quimérico monovalente é um dímero (HL) formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes dissulfeto com uma cadeia L quimérica, como assinalado acima. Um anticorpo quimérico biva- 25 lente é um tetrâmero (H2 L2) formado por dois dímeros HL associados atra- vés de pelo menos uma ponte dissulfeto. Um anticorpo quimérico polivalente baseia-se em uma agregação de cadeias.

As seqüências de DNA dos anticorpos da invenção podem ser identificadas, isoladas, clonadas, e transferidas para uma célula procariótica ou eucariótica para expressão por pocedimentos bem-conhecidos nessas técnicas. Tais procedimentos estão descritos genericamente em Sabrook et al., supra, bem como em “Current Protocols in Molecular Biology” (Au- subel et al., editores, 1989). Os vetores de expressão e células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpos recombinantes e anticorpos humanizados em particular, são bem-conhecidos nessas técnicas. As se- guintes referências são representativas de métodos e vetores apropriados 5 para a expressão de imunoglobulinas recombinantes que podem ser utiliza- dos para conduzir a presente invenção: Weidle et al., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai et al., J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738- 1745 (1989); Wood et al., J. Immunol., 145(a):3011-3016 (1990); Bulens et 10 al., Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al., Biol. Techno- logy, 10:169 (1992); King et al., Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 2:64 (1991); King et al., Biochem. J., 290:723-729

(1993); Chaudary et al., Nature, 339:394-397 (1989); Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar

et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:12051-12055 (1994); Singer et al., J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3):215-219

(1994); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992). Além disso, os vetores apropriados para a ex-

pressão de anticorpos recombinantes estão disponíveis comercialmente.

As células hospedeiras capazes de expressar imunoglobulinas funcionais incluem, por exemplo, células de mamíferos, tais como células do Ovário do Hamster Chinês (CHO); células COS; células de mieloma, tais co- mo células NSO e SP2/Os; bactérias tais como Escherichia coli; células de leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae; e outras células hospedeiras.

3. Anticorpos de Cadeia Única

Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são Fvs de cadeia única (scFvs). As regiões Vh e Vl (por exemplo, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4) de um anticorpo scFv compreen- 30 dem uma única cadeia que é dobrada para criar um sítio de ligação de antí- geno similar àquele encontrado em anticorpos com duas cadeias. Uma vez dobrada, interações não-covalentes estabilizam o anticorpo de cadeia única. Embora as regiões Vh e Vl das mesmas modalidades de anticorpos possam ser unidas entre si diretamente, os versados nessas técnicas devem avaliar que as regiões podem ser separadas por um Iigante peptídico que consiste em um ou mais aminoácidos. Os Iigantes peptídicos e seu uso são bem- 5 conhecidos nessas técnicas. Vide, por exemplo, Huston et ai, Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 8:5879 (1988); Bird et al., Science 242:4236 (1988); Glock- shuber et al., Biochemistry 29:1362 (1990); patente n0 US 4.946.778, patente n0 US 5.132.405 e Stemmer et al., Biotechniques 14:256-265 (1993). Geral- mente, o Iigante peptídico não terá qualquer atividade biológica específica 10 que não a de unir as regiões ou para preservar alguma distância mínima ou outra relação espacial entre Vh e VL. Entretanto, os aminoácidos constituin- tes do Iigante peptídico podem ser selecionados para influenciar alguma pro- priedade da molécula, tal como a dobragem, carga líquida, ou caráter hidro- fóbico. Os anticorpos Fv de cadeia única (scFv) incluem opcionalmente um 15 Iigante peptídico de não mais do que 50 aminoácidos, geralmente não mais do que 40 aminoácidos, de preferência não mais do que 30 aminoácidos, e mais preferivelmente não mais do que 20 aminoácidos de comprimento.

Os métodos para fabricar anticorpos scFv foram descritos. Vide, por exemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et.ai, Nature

1 20 341:544-546 (1989); e Vaughan et ai, Nature Biotech. 14:309-314 (1996). Resumidamente, o RNAm de células B de um animal imunizado é isolado e o DNAc é preparado. O DNAc é ampliado usando iniciadores específicos para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas. Os produtos da PCR são purificados e as seqüências de ácidos nucléicos são 25 unidas. Caso um peptídeo Iigante seja desejado, as seqüências de ácidos nucléicos que codificam o peptídeo são inseridas entre as seqüências de ácidos nucléicos das cadeia pesada e leve. O ácido nucléico que codifica o scFv é inserido dentro de um vetor e expresso na célula hospedeira apropri- ada. O scFv que se liga especificamente ao antígeno desejado é tipicamente 30 tipicamente encontrado percorrendo uma biblioteca de apresentação de fa- gos. O percurso pode ser realizado por qualquer um dos vários métodos. O percurso pode ser realizado convenientemente usando células que expres- sam o antígeno desejado sobre sua superfície ou usando uma superfície sólida revestida com o antígeno desejado. Convenientemente, a superfície pode ser um leito magnético. Os fagos não ligados são lavados e removidos da superfície sólida e os fagos ligados são eluídos.

5 Descobrir o anticorpo com a afinidade mais alta é ditado pela

eficiência do processo de seleção e depende do número de clones que pode ser triado e da severidade com a qual ele é feito. Tipicamente, uma severi- dade mais alta corresponde a um percurso mais seletivo. Caso as condições sejam severas demais, entretanto, os fagos não se ligarão. Depois de uma 10 rodada de percurso, os fagos que se ligam a placas revestidas com TrkB ou a células que expressam TrkB sobre sua superfície são expandidas em E. coli e submetidas a outra rodada de percurso. Desta maneira, um enriqueci- mento de muitas vezes ocorre em 3 rodadas de percurso. Assim sendo, mesmo quando o enriquecimento em cada rodada é baixo, múltiplas rodadas 15 de percurso levarão ao isolamento do fago raro e o material genético ficará contido dentro do qual codifica o scFv com a afinidade mais alta ou um que é melhor expresso em fago.

Independentemente do método de percurso escolhido, a ligação física entre genótipo e fenótipo proporcionada pela apresentação de fagos torna possível testar cada membro de uma biblioteca de DNAc para ligar o antígeno, mesmo com grandes bibliotecas de clones.

4. Anticorpos Humanos

Em algumas modalidades, os anticorpos humanos são usados de acordo com a presente invenção. Os anticorpos humanos são fabricados 25 por uma série de métodos conhecidos nessas técnicas, incluindo usando métodos de apresentação de fagos que usam bibliotecas de anticorpos deri- vados de seqüências de imunoglobulinas humanas. Vide, por exemplo, Lon- berg e Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995), patentes n0- US 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT n°- WO 98/46645, WO 98/50433, 30 WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91 /10741; sendo cada uma delas aqui incorporada como referência em sua totalidade.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são gerados usando apresentação de fagos. Por exemplo, domínios de anti- corpos funcionais são apresentados sobre a superfície de partículas de fa- gos que carregam as seqüências de polinucleotídeos que as codificam. Tais fagos podem ser utilizados para apresentar domínio de ligação de antígeno 5 expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, seres humanos ou murinos). Os fagos que expressam um domínio de ligação de antígeno que se liga a TrkB podem ser selecionados ou identificados com TrkB, por exemplo, usando TrkB marcado. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos que incluem 10 domínio de ligação de fd e M13 expressos a partir de fagos com Fab, Fv ou domínios de anticorpos Fv estabilizados com dissulfeto fundidos de forma recombinante ao gene do fago Ill ou gene Vlll de proteína. Os exemplos de métodos de apresentação de fagos que podem ser usados para fabricar os anticorpos da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkman et 15 al., J. Immunol. Métodos 182:41-50 (1995); Ames etal., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958

(1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Im- munology 57:191-280 (1994); PCT application No. PCT/GB91/01134; PCT publications WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 20 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e patentes n0§ US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; sendo cada uma delas aqui incorporada como referência em sua totalidade.

5. Geração de Anticorpos Agonistas

Os anticorpos agonistas podem ser identificados gerando anti- corpos anti-TrkB e depois testando cada anticorpo quanto à capacidade de disparar episódios mediados por TrkB, por exemplo, iniciando a diferencia- ção e/ou dendrificação de células SH-SY5Y, medindo Anoikis (apoptose re- 30 sultante da perda de interações célula-matriz) em resposta ao tratamento de células com agonista potencial de TrkB, ou usando um ensaio de prolifera- ção de células BaF3/TrkB. Os ensaios com SH-SY5Y envolvem plaquear células SH-SY5Y e tratar as células com ácido retinoico com ou sem anticorpos agonistas po- tenciais e/ou BDNF e subsequentemente medindo o surgimento de neuritos. Geralmente, o ácido retinoico isoladamente induzirá uma pequena quantida- 5 de de surgimento de neuritos. BDNF isoladamente não deve induzir surgi- mento significativo de neuritos e anticorpo isoladamente não deve induzir surgimento significativo de neuritos. Entretanto, as células tratadas com áci- do retinoico, BDNF, e anticorpo devem apresentar surgimento extensivo de neuritos. Um ensaio com SH-SY5Y exemplificativo está descrito em Kaplan 10 DR, et al., Neuron 11:321-331 (1993).

Os ensaios de proliferação de células BaF3/TrkB envolvem me- dir a proliferação de células estimuladas pelo agonismo do receptor TrkB. Por exemplo, as células BaF3 são desenvolvidas em meio RPMI completo com I IL-3 e infectadas com retrovírus de TrkB. As células são lavadas na 15 ausência de IL-3 e plaqueadas. Os anticorpos agonistas potenciais e a so- brevivência das células são medidas (por exemplo, usando reagente de de- tecção de viabilidade de células luminescente, tal como Cell-Titer Glo® de- pois de uma incubação apropriada. As células do controle positivo são incu- badas com rhBDNF.

Os ensaios Anoikis envolvem recolocar as células RIE/TrkB em

suspensão (por exemplo, em meio DMEM) e colocar as células, opcional- mente em recipientes com múltiplos poços, em contato com um agonista de anticorpo potencial (por exemplo, 2,5 x 104 células 10 μΙ_ de 1-20 μg/ml de anticorpo). As misturas são incubadas na presença ou ausência de um con- 25 trole de hBDNF e depois medidas quanto à viabilidade celular (por exemplo, usando reagente de detecção de viabilidade de células luminescente, tal como Cell-Titer Glo®). Um ensaio Anoikis exemplificativo está descrito em Douma et al., Nature 430:1034-1039(2004).

Agonistas de TrkB podem ser avaliados também em células SH- SY5Y quanto à sua capacidade de proteger as células contra toxicidade de vinblastina e cisplatina. Este ensaio foi descrito, por exemplo, em Scala et al., Cancer Res. 56(16):3737-42 (1996); e Jaboin et al., Cancer Res. 62(22):6756-63 (2002).

IN. Usos de Anticorpos

Os anticorpos agonistas de TrkB da invenção podem ser usados para tratar ou melhorar quaisquer doenças ou condições que se beneficiam 5 da maior atividade de TrkB.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas de TrkB da invenção são usados para tratar ou aliviar hiperglicemia e/ou diabetes ou seus sintomas em um indivíduo. Alternativamente, ou em combinação, os anticorpos da invenção podem ser usados para reduzir peso em um indiví- 10 duo que necessita disto. Em algumas modalidades, os anticorpos são usa- dos para aliviar obesidade. Isto pode ser particularmente útil pois os indiví- duos obesos são mais suscetíveis à resistência à insulina e diabetes Tipo II.

A presente invenção fornece também métodos de tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas ou do sistema nervoso central 15 (SNC) pela administração dos anticorpos agonistas de TrkB da invenção a um indivíduo que dela necessita. As doenças do SNC exemplificativas inclu- em, por exemplo, as doenças de Alzheimer, de Parkinson, de Huntington ou ALS.

O aumento da ativação de TrkB foi implicado também no alívio 20 de abuso de substâncias. Vide, por exemplo, patente n0 US 2005/0203011. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para aliviar abuso e dependência de substância (por exemplo, álcool, nicotina e/ou narcóticos) administrando os anticorpos agonistas de TrkB da invenção a um indivíduo que deles necessita.

Os anticorpos e agentes da invenção podem ser administrados

diretamente ao indivíduo mamífero que deles necessita. A administração das composições da presente invenção é por qualquer uma das vias normalmen- te usadas para introduzir produtos farmacêuticos, incluindo anticorpos, em contato final com o tecido a ser tratado. Os anticorpos são administrados de 30 qualquer maneira apropriada, opcionalmente com veículos farmaceutica- mente aceitáveis. Os métodos apropriados para administrar tais anticorpos e agentes estão disponíveis e são conhecidos pelos versados nessas técni- cas, e, embora mais do que uma via possa ser usada para administrar uma composição específica, uma via específica pode frequentemente proporcio- nar uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em 5 parte pela composição específica que está sendo administrada, bem como pelo método específico usado para administrar a composição. Consequen- temente, há uma ampla série de formulações e composições farmacêuticas apropriadas da presente invenção (vide, por exemplo, Remington1S Pharma- ceutical Sciences, 11- edição, 1985)).

Os anticorpos isoladamente ou em combinação com outros

componentes apropriados podem ser fabricados em formulações de aeros- sol (isto é, eles podem ser "nebulizados") para serem administrados por in- termédio de inalação. As formulações de aerossóis podem ser colocadas dentro de propelentes aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluorme- tano, propano, nitrogênio, e similares.

As formulações apropriadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antio- xidantes, tampões, bacteriostáticos, e solutos que tornam a formulação isotôni- ca, e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes 20 de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores, e con- servantes. Na prática desta invenção, as composições podem ser administra- das, por exemplo, por via oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intravesical ou intratecal. Opcionalmente, as composições são administradas por via nasal. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes veda- 25 dos com dose unitária ou múltiplas doses, tais como ampolas e frascos. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós, grânulos, e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente. Os moduladores podem ser administrados também como parte de um alimento ou fármaco preparado. Os compostos da presente invenção podem ser usados também eficazmente 30 em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais (por exemplo, qui- mioterápicos) dependendo da terapia ou efeito desejado.

A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta benéfica no indiví- duo no decorrer do tempo. A dose será determinada pela eficácia dos anti- corpos e reagentes específicos empregados e da condição do indivíduo, bem como o peso corporal ou área superficial da área a ser tratada. O tama- 5 nho da dose também será determinado pela existência, natureza, e grau de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um composto ou vetor específico em um indivíduo específico. A administra- ção pode ser realizada por intermédio de doses únicas ou divididas.

O agonista de anticorpo de TrkB pode ser usado em combinação com agentes que reconhecidamente são benéficos para reduzir peso, redu- zir níveis sanguíneos de glicose, tratar diabetes ou aliviar sintomas diabéti- cos, tratar doenças neurodegenerativas ou reduzir abuso de substâncias. Os agentes exemplificativos usados para tratar diabetes incluem, por exemplo, insulina; sulfoniluréias (por exemplo Glipizide e Amaril) a agentes insulino- trópicos (por exemplo, nateglinida e repaglinida); metformin; agonistas de PPAR-gama (por exemplo, rosiglitizona e píoglitazona), bem como agonistas duplos de PPAR-alfa, PPAR-delta, PPAR-alfa/gama e "panagonistas" ("pas agonists)" de PPAR-alfa/gama/delta; inibidores de alfa-glicosidase (por e- xemplo, Acarbose); inibidores de DPP-IV (por exemplo, vildagliptina); e aná- Iogos de GLP-1/GLP-1 (por exemplo, exenatida). Os agentes exemplificati- vos usados para tratar obesidade incluem, por exemplo, inibidores de Iipase (por exemplo, orlistat); síbutramina; inibidores de CB-1 (por exemplo, rimo- nabant); topiramato; amilina/análogos de amilina (por exemplo, pranlintida), leptina, análogos de PYY/PYY; e análogos de GLP-1/GLP-1 (por exemplo, exenatida).

Os agentes ativos que podem ser administrados juntos em uma mistura com o anticorpo agonista de TrkB ou cada um pode ser administrado separadamente. O agente anticorpo e outro agente ativo pode, porém não necessariamente, ser administrado concomitantemente.

Exemplos Exemplo 1

Este exemplo discute a identificação e caracterização de agonis- tas de anticorpos de TrkB.

Camundongos foram imunizados com receptor de trkB humano e sobrenadantes de hibridomas, a partir de camundongos IgG soropositivos foram triados quanto à reatividade para TrkB por ELISA. Os anticorpos resul- 5 tantes foram triados quanto à sua capacidade de ativar TrkB testando a ca- pacidade dos anticorpos para resgatar células RIE/TrkB de Anoikas. BDNF reconhecidamente resgata células RIE/TrkB a partir de Anoikas, e portanto, este ensaio é uma boa medida da capacidade de um anticorpo para ativar TrkB. Vide Figura 1. Múltiplos agonistas de anticorpos de TrkB foram identifi- 10 cados que imitam a atividade de BDNF em um ensaio Anoikis, como ilustra- do na Figura 2. Agonistas de anticorpos positivos foram purificados a partir de meio com baixo teor de IgG.

Os agonistas de anticorpos foram triados quanto à reatividade com TrkB, muTrkB, e domínio de ligação do Iigante de TrkB (LBD), como 15 ilustrado na Figura 3. A maioria dos agonistas não se ligou ao LBD. Particu- larmente, descobriu-se que C20 é reativo com TrkB do camundongo e hu- mano. A10 é reativo com TrkB do camundongo e humano e se liga ao epíto- po do domínio de ligação do ligante. Como ilustrado na Figura 4, muitos dos anticorpos funcionais demonstraram ser reativos contra TrkB do camundon- 20 go, mas não se ligam a TrkA, ou TrkC.

Os agonistas de anticorpos foram confirmados em um cresci- mento de neuritos em modelo in vitro. Os resultados indicaram que os ago- nistas de anticorpos de TrkB estimulam o crescimento de neuritos similar a BDNF.

Os anticorpos funcionais foram isotipados como ilustrado na Fi-

gura 6. Demonstrou-se ainda que anticorpos funcionais demonstraram ligam a TrkB humano superexpressado em células RIE por western blots. A Figura 7 resume as informações para vários anticorpos agonistas identificados. Exemplo 2

Este exemplo mostra que os anticorpos agonistas de TrkB redu-

zem eficazmente a glicose sanguínea e o peso em camundongos.

Os dois agonistas mais potentes, Al 0 e C20 (cujas regiões vari- áveis estão apresentadas em SEQ ID NOs:3 e 4 e SEQ ID NOs: 1 e 2, res- pectivamente), foram testados em um modelo de camundongos db/db de diabetes Tipo II. Como ilustrado nas Figuras 8 e 9, ambos anticorpos parece- ram reduzir os níveis séricos de glicose e promovem perda de peso profiláti- 5 ca e terapeuticamente.

Como ilustrado no gráfico do topo da Figura 9, os camundongos suscetíveis a altos níveis sanguíneos de glicose não tiveram níveis sanguí- neos de glicose aumentados quando os anticorpos A10 ou C20 foram admi- nistrados, enquanto que os camundongos do controle tiveram níveis eleva- 10 dos. Este resultado indica que os anticorpos têm um efeito profilático. Trinta e dois dias dentro do estudo, os animais do controle hiperglicêmicos, obe- sos(8) foram divididos em 2 grupos. Um grupo foi tratado com o anticorpo A10 e o outro foi tratado com PBS. O tratamento reverteu a hiperglicemia dentro de 1 semena e reduziu o peso em 25%. Os animais tratados originais 15 foram deixados não-tratados por mais 4 semanas. O grupo tratado com C20 teve níveis de glicose aumentados e ganho de peso aumentado. O grupo de A10 manteve glicose normal e apresentou um pequeno aumento de peso. Estes resultados estão indicados nos quadros do topo e do fundo da Figura

9. Um estudo de PK revelou que o anticorpo A10 teve uma meia-vida sérica muito melhor, que corresponde aos efeitos observados in vivo.

Embora a invenção tivesse sido descrita com algum detalhe a título ilustrativo e exemplificativo com o propósito de clareza da compreen- são, deve ficar prontamente evidente para os versados nessas técnicas à Iuz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações po- 25 dem ser feitas nela sem fugir do espírito ou âmbito das reivindicações em anexo.

Todas as publicações, bases de dados, seqüências do Genbank, patentes,e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui in- corporados como referência como se cada um fosse específica e individual- mente indicado para ser incorporado como referência. Listagenx de Seqüência

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Claims (25)

1. Anticorpo agonista isolado, que é do Receptor de Tirosina Ci- nase B (TrkB).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo é um anticorpo de cadeia única.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo não se liga ao Receptor de Tirosina Cinase A ou ao Receptor de Tirosina Cinase C.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo se liga ao Domínio de Ligação do Ligante (LBD) de TrkB.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo compete com o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) para TrkB.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:7; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:8.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, onde o anticorpo compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, e SEQ ID NO:15; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, e SEQ ID NO:16.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, onde o anticorpo compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:3; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:4.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, anticorpo não se liga ao LBD de TrkB.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, anticorpo não compete com a ligação de BDNF a TrkB.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:5; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:6.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, onde o anticor- po compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, e SEQ ID NO:13; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:10, e SEQ ID NO:14.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 13, onde o anticor- po compreende: i. uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID ΝΟ.Ί; e ii. uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:2.

15. Composição farmacêutica que compreende: i. uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como definido na reivindicaçãol; e ii. um veículo farmacêutico.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, onde o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: i. um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:5 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:6; e ii. um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:7 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:8.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, onde a composição farmacêutica compreende ainda um agente que re- duz os níveis sanguíneos de glicose e/ou o peso corporal em um indivíduo.

18. Método para reduzir os níveis sanguíneos de glicose e/ou o peso corporal em um indivíduo que dele necessita, sendo que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anti- corpo, como definido na reivindicação 1 ao indivíduo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde o indivíduo tem uma condição selecionada do grupo que consiste em: pré-diabetes, dia- betes Tipo I, diabetes Tipo II, estando com sobrepeso e obesidade.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um segundo agente eficaz em reduzir a glicose sanguínea e/ou o peso corporal é administrada ao indivíduo em combinação com o anticorpo como definido na reivindicação 1.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde o segundo agente e o anticorpo como definido na reivindicação 1 são administrados como uma mistura.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde o segundo agente é administrado separadamente do anticorpo como definido na reivin- dicação 1.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde o segundo agente é selecionado do grupo que consiste em: insulina, sulfoniluréias, a- gentes insulinotrópicos, metformina, agonistas de PPARy, agonistas de PPARa, agonistas de PPARô, agonistas duplos de PPARay, "panagonistas" de PPARayô, inibidores de alfa-glicosidase, inibidores de DPP-IV, inibidores de lipase, sibutramina, inibidores de CB-1, topiramato, amilina, análogos de amilina, leptina, análogos de PYY/PYY, e análogos de GLP-1/GLP-1.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado.

25. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: i. um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:5 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:6; e ii. um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:7 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO:8.