BRPI0712714A2

BRPI0712714A2 - processo para isolar poli-hidroxialcanoatos de células de produção

Info

Publication number: BRPI0712714A2
Application number: BRPI0712714-6A
Authority: BR
Inventors: Bryan Cooper; Arnold Schneller; Peter Preishuber-Pfluegl
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2012-05-22
Also published as: CN101454458A; US20100233768A1; ATE445706T1; EP2029759B1; JP2009537161A; ES2332386T3; WO2007135039A1; EP2029759A1; DE502007001748D1

Abstract

PROCESSO PARA ISOLAR POLI-HIDROXIALCANOATOS DE CéLULAS DE PRODUçãO. A invenção diz respeito a um processo para o isolamento de poli-hidroxialcanoatos de células de produção, caracterizado em que i) as células de produção são rompidas e subseqüentemente ii) os fragmentos de células são separados dos grânulos de polihidroxialcanoato por meio de um separador de bico que opera continuamente.

Description

"PROCESSO PARA ISOLAR POLI-fflDROXIALCANOATOS DE CÉLULAS DE PRODUÇÃO"

A invenção diz respeito a um processo para isolar poli- hidroxialcanoatos de uma célula de produção.

Poli-hidroxialcanoatos (PHAs), tais como poli-hidroxibutiratos (PHBs), por exemplo, podem ser sintetizados usando bactérias. Por exemplo, tais processos biotecnológicos são descritos em Biopolimer, Wiley-VCH,2002.

PHB ocorre no final da fermentação nas células bacterianas na forma de grãos que são envolvidos por um envelope de proteína (J. Biol. Chem. 1989, vol. 264(6), páginas 3286 - 3291). Para obter um PHB suficientemente puro, ele tem que ser separado das células bacterianas.

As massas brutas biotecnologicamente produzidas, além do poli-hidroxialcanoato desejado, compreendem os microrganismos os quais produziram o poli-hidroxialcanoato (células de produção, biomassa ou massa não poli-hidroxialcanoato). O poli-hidroxialcanoato pode ser isolado da biomassa a) pela dissolução a biomassa, b) por extração do poli- hidroxialcanoato em um meio de extração adequado ou c) por desintegração mecânica da biomassa (célula de produção) e separação subseqüente dos fragmentos celulares dos grãos de poli-hidroxialcanoato (PHA).

O método mais freqüente para isto é a extração dos grãos de PHA da biomassa usando um solvente. Como meios de extração adequados para poli-hidroxialcanoatos, pode-se fazer uso de compostos clorados (processo b)). Exemplos são colocados em evidência em EP 0124309 e a literatura nele citada. O uso de solventes tem inúmeras desvantagens como uma conseqüência. Torna-se necessário investir em infra-estrutura complexa e cara para manuseio e recuperação dos solventes. A biomassa extraída deve estar livre dos resíduos de solvente antes do uso subseqüente como fertilizante ou matéria-prima. Uma vez que PHB dissolve apenas insatisfatoriamente em muitos solventes, as quantidades de solvente que são exigidas são muito altas.

Para quebra e dissolução da biomassa (desenvolvimento da reação a)), pode-se fazer uso de, por exemplo, enzimas ou processos químicos. Além do mais, compostos de superfície ativa podem ser adicionados. Uma combinação de uma pluralidade de processos é possível.

EP 0145233 descreve a quebra da biomassa por enzimas.

WO 94/24302 descreve a quebra da biomassa por enzimas e peróxido de hidrogênio.

US 5110980 descreve a quebra da biomassa por hipoclorito que produz poli-hidroxialcanoatos tendo um alto peso molecular acessível.

Parâmetros diferentes tais como temperatura, tempo ou pH durante o tratamento com hipoclorito são estudados. A purificação do poli- hidroxialcanoato com ácidos diluídos não é descrita.

Foi descrito um processo adicional para liberar o poli- hidroxibutirato (PHB) formado de células geneticamente modificadas Escherichia coli (Research In Microbiology 2005, 156, páginas 865-873). Aqui, uma etapa de autólise é fornecida posteriormente. As condições exatas de autólise não são descritas. Autólise é um processo de autodissolução da células por suas próprias enzimas. Este processo de preparação tem as seguintes desvantagens. Uma vez que a autólise continua de forma incompleta e fragmentos celulares e também grãos de PHB ainda aderem um no outro, apenas aproximadamente 80% do PHB formado são liberados.

O objetivo é portanto encontrar um processo que leva a separação completa de fragmentos celulares da célula de produção dos grãos de poli-hidroxialcanoato formados.

Uma vez que experimentos usando centrífugas convencionais foram insuficientes, observou-se surpreendentemente que fragmentos celulares poderiam ser separados muito eficientemente dos grãos de poli- hidroxialcanoato por meio de um separador a jato contínuo. A pelota compreendendo os grãos de poli-hidroxialcanoato é removida constantemente pelos jatos, embora os fragmentos celulares sejam separados continuamente de forma efetiva no transbordamento (atual "rejeitos claros reais"). Não existe nenhum esvaziamento pela abertura do tambor e em decorrência disto também nenhuma perda, vortexação e instabilidades similares que são detrimentais para separação eficiente. Ainda para atingir uma pureza ainda maior, os grãos de PHA podem ser misturados com água limpa e centrifugados novamente. Deste modo, uma suspensão aquosa de grãos de PHA de alta pureza é alcançada que pode então ser seca de uma maneira conhecida, por exemplo, por secagem por aspersão. O produto resultante é adequado para processamento adicional para dar termoplásticos. O uso de solventes não é necessário.

O processo é diferenciado conseqüentemente dos processos convencionais por alta eficiência, viabilidade econômica e capacidade de processamento excelente.

Separadores a jato também são conhecidos com o nome Westfalia Separator. Uma descrição detalhada pode ser obtida, por exemplo, de www.gea-westfalia.de. A título de exemplo, o VisCon® System pode ser colocado em evidência, no qual os jatos têm viscosidade controlada. Em decorrência disso, o casamento dos parâmetros do separador (tempos de esvaziamento) no caso de serem omitidas as condições de alimentações alteradas e, em decorrência disto, concentrações de descarga de sólidos constantes são alcançadas. No sistema VisCon®, os jatos não estão situados na borda do tambor, mas em um diâmetro menor no tambor. A introdução pela alimentação hidro-hermética e também a saída pelos jatos aumentam a atividade celular da células separadas.

O equipamento necessário é disponível tecnicamente e adaptado para escala industrial como desejado, de maneira tal que o processo pode ser aplicado sem problemas a escala industrial. Uma modalidade particular do processo inventivo desintegra mecanicamente as células de produção na etapa i) A desintegração livre de produto químico tem vantagens. Foi descrito que células de bactérias Alcaligenes eutrophus produtoras de PHB podem ser desintegradas usando um homogeneizador (Bioseparation 1991, 2, páginas 155-166). Os grãos de PHB presentes nas células foram extraídos virtualmente de forma completa das células após quatro passagens através de um homogeneizador. A suspensão de célula, neste tipo de homogeneizador, é prensada através de uma válvula. Ajustando a largura da folga entre o cone da válvula e a sede da válvula, turbulência é gerada. A suspensão que sai da válvula então colide com uma placa de aço. A pressão desta máquina é portanto restrita a 1.500 bar.

Para gerar maiores pressões, grandes quantidades de energia elétrica são requeridas. A desintegração celular usando um homogeneizador é econômica em particular quando as células são completamente desintegradas após uma passagem única. O processo descrito em Bioseparation 1991, 2, páginas 155-166, tem a desvantagem de que são exigidas quatro passagens através do homogeneizador.

Foi estabelecido recentemente de maneira surpreendente que células compreendendo PHA, em particular de Alcaligenes eutrophu, podem ser muito facilmente desintegradas usando um homogeneizador de alta pressão descrito em seguida. Neste caso, em uma passagem única através do homogeneizador de alta pressão a uma pressão de 2.000 ou mais bar, acima de 99% das células são desintegradas e o PHA é liberado virtualmente de maneira completa. Portanto, a presente invenção também diz respeito a desintegração por meio de um homogeneizador de alta pressão que opera a pressões de 2.000 ou mais atm. Por exemplo, ele compreendem os seguinte arranjo:

Exemplos de dispositivos de homogeneização adequados: a) compreende uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de saída, no espaço entre as placas de orifício, se apropriado, energia mecânica sendo introduzida ou

b) compreende uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de impacto, no espaço entre a placa de orifício e a placa de impacto, se apropriado, energia mecânica sendo introduzida.

Modalidade a)

O dispositivo de homogeneização para isolar os poli- hidroxialcanoatos compreende, por exemplo, uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de saída, os bicos sendo axialmente arranjados um no outro. Em um espaço intermediário entre as placas de orifício pode situar-se um misturador estático.

Se apropriado, em um espaço intermediário, energia mecânica é adicionalmente introduzida.

As placas de orifício que podem ser usadas de acordo com o processo inventivo têm pelos menos um orifício, que é pelo menos um bico. As duas placas de orifício podem ter cada qual qualquer número desejado de orifícios, mas preferivelmente não mais que 5 orifícios em cada caso, particularmente de maneira preferível não mais que três orifícios em cada caso, muito particularmente de maneira preferível não mais que dois orifícios em cada caso, e em particular preferivelmente não mais que um orifício em cada caso. Ambas as placa de orifícios podem ter um número diferente ou o mesmo número de orifícios, preferivelmente ambas as placa de orifícios têm o mesmo número de orifícios. Em geral, as placas de orifício são placas perfuradas tendo cada qual pelo menos um orifício.

Em uma outra modalidade deste processo inventivo, a segunda placa de orifício é substituída por uma peneira, ou seja, a segunda placa de orifício tem uma multiplicidade de orifícios ou bicos. As peneiras que podem ser usadas podem cobrir uma ampla faixa de tamanhos de poro, em geral os tamanhos de poro estão entre 0,1 e 250 μπι, preferivelmente entre 0,2 e 200 μηι, particularmente de maneira preferível entre 0,3 e 150 μιτι, e em particular entre 0,5 e 100 μm.

Os orifícios ou bicos podem ter qualquer forma geométrica concebível, eles podem, por exemplo, ser circular, oval, poligonal com qualquer número desejado de bordas, que se apropriado, podem ser também arredondados ou senão em forma de estrela. Preferivelmente, os orifícios têm uma forma circular.

Os orifícios da placa de orifício de entrada em geral têm um diâmetro de 0,05 mm a 1 cm, preferivelmente de 0,08 mm a 0,8 mm, particularmente de maneira preferível de 0,1 a 0,5 mm, e em particular de 0,2 a 0,4 mm. Os orifícios da placa de orifício de saída em geral tem um diâmetro de 0,5 mm a 1 cm, preferivelmente de 5 mm a 50 mm, particularmente de maneira preferível de 10 a 20 mm.

As duas placas de orifício são construídas preferivelmente de uma maneira tal que os orifícios ou bicos fiquem arranjados axialmente um no outro. Arranjo axial deve significar que a direção de fluxo gerado pela geometria do orifício do bico é idêntica para as duas placas de orifício. As direções do orifício do bico de entrada e bico de saída para isto não estão dispostas em uma linha, elas também podem ser deslocadas em paralelo, como se vê pelas declarações anteriores. Preferivelmente, as placas de orifício são direcionadas em paralelo.

Entretanto, outras geometrias são possíveis, em particular, placas de orifício não paralelo, ou direções diferentes de orifício dos bicos de entrada e saída. No sistema placa com dois orifícios (placa de orifício de entrada e placa de orifício de saída), apresentado anteriormente, o bico de saída tem orifícios maiores. Em decorrência disso, a turbulência é acalmada. Uma placa de impacto não é necessária neste caso. A espessura das placas de orifício pode ser como desejada. Preferivelmente, as placas de orifício têm uma espessura na faixa de 0,1 a 100 mm, preferivelmente de 0,5 a 30 mm, e particularmente de maneira preferível de 1 a 10 mm. A espessura (1) das placas de orifício é selecionada de uma maneira tal que o quociente do diâmetro (d) dos orifícios pela espessura (1) fique na faixa de 1:1, preferivelmente 1:1,5, e particularmente de maneira preferível 1:2.

O espaço intermediário entre as duas placas de orifício pode ser tão distante quanto desejado, em geral, o comprimento do espaço intermediário é 1 a 500 mm, preferivelmente 10 a 300 mm, e particularmente de maneira preferível 20 a 100 mm.

No espaço entre as placas de orifício pode estar situado um misturador estático que pode encher completa ou parcialmente a seção entre as duas placas de orifício. Preferivelmente, o misturador estático estende-se por todo o comprimento total do espaço intermediário entre as duas placas de orifício. Misturadores estáticos são conhecidos pelos versados na técnica. Um misturador estático pode ser, por exemplo, um misturador de válvula, ou um misturador estático tendo furos, um feito de lamela estriada ou um feito de nervuras de encaixe. Além do mais, ele pode ser um misturador estático na forma espiral ou em uma forma N, ou um com elementos de mistura aqueciveis ou resfriáveis.

Além do misturador estático, em um espaço intermediário entre as duas placas de orifício, energia mecânica pode ser introduzida. A energia pode ser introduzida, por exemplo, na forma de vibrações mecânicas, energia de ultra-som ou rotacional. Em decorrência disso, é produzido um fluxo turbulento que tem o efeito que as partículas não se aglomeram no espaço intermediário.

Modalidade b)

Alternativamente a esta primeira variante, o dispositivo de mistura pode compreender uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de impacto, no espaço entre a placa de orifício e a placa de impacto, se apropriado, um misturador estático sendo situado. Alternativamente, ou além do misturador estático, energia mecânica pode ser introduzida no espaço intermediário.

O que foi dito aplica-se à placa de orifício tendo bico de entrada, o espaço intermediário tendo um misturador estático e introdução de energia mecânica.

Nesta variante, a segunda placa de orifício é substituída por uma placa de impacto. A placa de impacto em geral tem um diâmetro que é 0,5 a 20%, preferivelmente 1 a 10%, menor que o diâmetro tubular no ponto em que a placa de impacto está instalada.

Em geral, a placa de impacto pode ter qualquer forma geométrica, preferivelmente na forma de um disco redondo, de maneira tal que, em vista frontal, uma folga de anel possa ser vista. A forma de uma fenda ou um canal, por exemplo, também é concebível.

A placa de impacto, de uma maneira similar à segunda placa de orifício na variante anteriormente descrita, pode estar fixa em diferentes distâncias com relação à primeira placa de orifício. Em decorrência disso, o espaço entre a placa de orifício e a placa de impacto pode ser de qualquer comprimento desejado; em geral, o comprimento do espaço intermediário é 1 a 500 mm, preferivelmente 10 a 300 mm, e particularmente de maneira preferível 20 a 100 mm.

O processo inventivo tem algumas vantagens sobre os processos conhecidos da tecnologia anterior, uma vez que rendimentos particularmente altos do poli-hidroxialcanoato de alto peso molecular são obtidos. Em particular, poli-hidroxialcanoatos com Mn de 50.000 a 2.000.000, e em particular de 100.000 a 200.000, podem ser alcançados por esta variante desenvolvida. A temperatura na qual a emulsão bruta é emulsificada para dar a emulsão dividida finamente pelo processo inventivo é em geral 0 a 150°C, preferivelmente 5 a 80°C, particularmente de maneira preferível 20 a 40°C. Neste caso todas as unidades de homogeneização usadas no dispositivo podem ser aquecidas/resfriadas.

A homogeneização é em geral realizada a pressões acima da pressão atmosférica, ou seja, ≥ 1 bar. Neste caso, entretanto, as pressões não excedem um valor de 10.000 bar, de maneira tal que são estabelecidas pressões de homogeneização preferivelmente ≥ 1 bar a 10.000 bar, preferivelmente 5 a 2.500 bar, e particularmente de maneira preferível de 100 a 2.000 bar.

As concentrações de célula de produção usadas no processo inventivo são cerca 20 a 300 g/L, preferivelmente 50-220 g/L.

Qualquer tipo de célula ou camada de célula neste caso é denominada célula de produção; em particular aquelas células de origem animal, vegetal ou microbiana. De maneira igualmente preferível, células de produção são organismos recombinantes. Células de produção de forma particular altamente adequadas são procariotas (incluindo o Archaea) ou eucariotas, particularmente bactérias, incluindo halobactérias e Methanococcus, fungos, células de insetos, células de vegetais e células de mamíferos, particularmente de maneira preferível Alcaligenes eutrophus, Eseheriehia eoli, Baeillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Piehia pastoris, espécies de Pseudomonas, Laetobaeillen, Hansenula polimorpha, Triehoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas). Particularmente de maneira preferível, o microrganismo é Alealigenes eutrophus.

A célula de produção pode ser usada no processo inventivo diretamente após o cultivo (por exemplo, fermentação); mas também é possível primeiro matar a célula de produção, por exemplo, por esterilização e, se apropriado, enriquecer a massa celular por filtração do meio de cultura.

Poli-hidroxialcanoatos devem significar polímeros biotecnologicamente produzidos. Em particular, estes devem significar o seguinte: poli(3-hidroxibutirato) (P-3HB), poli(3-hidroxibutirato)/co-3- hidroxivalerato (P-3HB-co-3HV), poli(3-hidroxibutirato)/co-4-hidroxibutirato (P-3HB-co-4HB), poli(3-hidroxibutirato)/co-3-hidroxiexanoato (P-3HB-co- 3HHx) e poli(3-hidroxibutirato)/co-3-hidroxioctanoato (P-3HB-co-3HO).

Equipamento usado:

No exemplo, como homogeneizador de alta pressão para desintegrar as células de produção, o seguinte arranjo I foi selecionado. Como bico de entrada, foi feito o uso de uma placa de orifício tendo furos de 14 χ 0,2 mm de largura. O caldo de fermentação foi uma suspensão e foi forçado através da placa de orifício a uma pressão de aproximadamente 2.000 atm. Em um espaço intermediário (15 mm de comprimento e 8 mm em diâmetro), a suspensão foi vortexada antes de ela encontrar com a segunda placa de orifício que funcionou como bico de saída. A suspensão de célula passou através de um furo cônico para a placa de orifício de saída e então saiu do bloco da placa de orifício de um furo único (diâmetro de 1,5 mm). A placa de orifício de saída foi arranjada centralmente comparada com os furos do bico de entrada.

Como um separador a jato, foi feito o uso de um instrumento da companhia GEA Westfalia tipo HFC-15.

Exemplo 1- Isolamento de 3-hidroxipoli-hidroxibutirato (3-PHB) de células de produção de Alcalisenes eutrophus

i) Fermentação de 3-hidroxipoli-hidroxibutirato em células de produção de

Alcaligenes eutrophus:

A fermentação foi realizada de acordo com Kim, Lee, Lee, Chang, Chang e Woo em Biotechnology and Bioengineering, vol. 43, páginas 892-898 (1994). ii) Desintegração das células e separação dos grãos de 3-PHB:

3.300 litros de caldo de fermentação de Alcaligenes eutrophus tendo um conteúdo de 90 g/L de peso seco, dele 80% de PHB, após conclusão da fermentação, foram resinados a 2°C no fermentador. O caldo foi então passado através de um homogeneizador de alta pressão I a pressão de 2.000 bar. Uma vez que a pressão primeiro teve que aumentar, os primeiros litros de caldo foram coletados separadamente e recirculados no fermentador. O caldo de fermentação passou totalmente através do homogeneizador de alta pressão.

A efetividade de desintegração celular foi medida plaqueando o caldo de fermentação em um ágar nutriente adequado antes e após a desintegração. A contagem de células viáveis antes da desintegração foi 5 χ 10^10 cfu/ml (= 100%). Após a desintegração celular, a contagem de células viáveis foi determinada do mesmo modo. Ela foi 5 χ IO6 cfu/ml. Isto corresponde a uma efetividade de desintegração de alta pressão de 99,99%.

O homogenado celular passou então através de um separador a jato tipo HFC-15 da GEA Westfalia. O material que foi depositado pela força centrífuga (concentrado) foi coletado separadamente dos fragmentos celulares que não foram depositados (transbordamento). A concentração total de material seco e PHB foi cada qual determinada (ver tabela a seguir para os resultados). O concentrado foi diluído com água desmineralizada no volume de partida original e novamente centrifugado. O processo foi repetido mais uma vez.

iii) Secagem dos grãos de 3-PHB

A suspensão de 3-PHB obtida de ii) foi seca por aspersão em um secador por aspersão convencional. O gás de secagem foi nitrogênio tendo uma temperatura de entrada de gás de 200°C, temperatura de saída de gás de 90°C. A suspensão de PHB foi atomizada usando um bico de dois fluidos. O produto seco foi descarregado da corrente de gás por meio uma trava tipo roda estrela. Os resultados experimentais estão listados na tabela a seguir. <table>table see original document page 13</column></row><table>

Claims

1. Processo para isolar poli-hidroxialcanoatos de células de produção, caracterizado pelo fato de que compreende: i) desintegrar as células de produção e, subseqüentemente, ii) separar os fragmentos celulares dos grãos de poli- hidroxialcanoato por meio de um separador a jato contínuo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de produção são desintegradas na etapa i) por meios de um dispositivo de homogeneização de alta pressão.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de homogeneização: a) compreende uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de saída, no espaço entre as placas de orifício, se apropriado, energia mecânica sendo adicionalmente introduzida, ou; b) compreende uma placa de orifício tendo pelo menos um bico de entrada e uma placa de impacto, no espaço entre a placa de orifício e a placa de impacto, se apropriado, energia mecânica sendo adicionalmente introduzida.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de produção é um organismo recombinante.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o poli-hidroxialcanoato é um poli(3-hidroxibutirato) (P- 3HB), poli(3-hidroxibutirato)/co-3-hidroxivalerato (P-3HB-co-3HV), poli(3- hidroxibutirato)/co-4-hidroxibutirato(P-3HB-co-4HB),poli(3- hidroxibutirato)/co-3-hidroxiexanoato (P-3HB-co-3HHx) ou poli(3- hidroxibutirato)/co-3-hidroxioctanoato (P-3HB-co-3HO).

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de produção é morta antes da homogeneização.