BRPI0711974A2 - derivados de 2-arilpirazol[l,5-alfa]pirimidin-3-il acetamida como ligantes para proteìna translocadora (18 kda) - Google Patents

Abstract

DERIVADOS DE 2-ARILPIRAZOL[L,5-alfa] PIRIMIDIN-3-IL ACETAMIDA COMO LIGANTES PARA PROTEìNA TRANSLOCADORA (18 kDa) A presente invenção refere-se a compostos da fórmula (l) radiorrotulados com ^ 18^F, ^ 123^1 ^ 76^Br, ^ 124^I ou ^ 75^Br e sais destes, e um método de imageamento de proteína transiocadora (l8kDa) (TSPO) em um paciente compreendendo administrar um composto da fórmula (l) radiorrotulada com ^ 18^F, ^ 123^I ^ 76^Br, ^ 124^I ou ^ 75^Br ou um sal farmaceuticamente aceitável destes. A invenção fornece compostos substituidos por fluoro da fórmula (II) e sais destes, e um método para tratar um distúrbio neurodegenerativo, inflamação ou ansiedade em um paciente compreendendo administrar um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOS DE 2-ARILPIRAZOL[L,5-alfa] PIRIMIDIN-3-IL ACETAMIDA COMO Ll- GANTES PARA PROTEÍNA TRANSLOCADORA (18 kDa)"

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a compostos e métodos para imageamento de expressão proteína translocadora (18 kDa) (TSPO) em um paciente. Esta invenção também refere-se aos compostos e métodos para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, inflamação ou ansiedade em um paciente.

Antecedente da Técnica

A proteína translocadora (18 kDa) (TSPO), antigamente conhe- cida como o receptor de benzodiazepina periférico (PBR), pode formar um complexo trimérico com o portador de nucleotídeo de adenina (ANC) (30 kDa) e o canal de ânion dependente de voltagem (VDAC) (32 kDa) para constituir o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP). O TSPO é distinto do receptor de benzodiazepina central (CBR) por sua es- trutura distinta, funções fisiológicas e local subcelular na membrana externa das mitocôndrias. Embora o TSPO tenha estado envolvido em numerosos processos biológicos, alguns aspectos de seu papel fisiológico permanecem obscuros. Os estudos envolvem a importância do TSPO na etapa de limita- ção de taxa de biossíntese de esteróide, imunomodulação, transporte de porfirina, homeostasia de cálcio, e morte de célula programada.

O TSPO é distribuído densamente na maioria dos órgãos perifé- ricos incluindo os pulmões, coração e rins, contudo é somente minimamente expresso no parênquima cerebral normal. Seguinte a infecção ou lesão neu- ronal, a expressão de TSPO no parênquima cerebral é dramaticamente au- mentada. A imunoistoquímica e auto-radiografia in vitro revelaram que a li- gação de TSPO elevada nesta região diretamente correlacionou-se com o aparecimento de micróglia ativada. Recentemente, o imageamento de tomo- grafia por emissão de pósitrons in vivo (PET) em pacientes que sofrem da doença de Alzheimer (AD) e esclerose múltipla (MS) confirmou que a ligação de TSPO no parênquima cerebral foi limitada às células microgliais ativadas. As micróglias são células efetoras imunes principais do sistema nervoso central (CNS). Estas células tipo macrófago imunes estão limitadas a derivar de linhagem monocítica e seu papel principal consiste em defesa de hospedeiro e vigilância imune. Elas são altamente sensíveis a mudanças em seu microambiente e rapidamente ficam ativadas com respeito a eventos patológicos. Por isto acredita-se que TSPO está associado intimamente com processos inflamatórios iniciais nas fases precoces de vários distúrbios neurodegenerativos.

Várias classes de Iigantes de TSPO foram reportadas durante as últimas décadas incluindo as benzodiazepinas (diazepam e Ro 5-4864), car- boxamidas de isoquinolina (PK 11195), indolacetamidas (FGIN-1-27), fenoxi- fenil-acetamidas (DAA1106), pirazolopirimidas (DPA-713), benzotiazepinas e imidazopiridinas. Algumas outras classes também foram desenvolvidas, po- rém, uma faixa mais extensiva de Iigantes com propriedades de ligação e atividade biológica variadas é exigida para caracterizar melhor os papéis fisiológicos e terapêuticos de TSPO, sua localização exata e a existência antecipada de subtipos de TSPO.

A carboxamida de isoquinolina [11C](R)-PK 11195 foi usada co- mo uma sonda farmacológica para estudar a função e expressão de TSPO. Vários estudos PET administrados em pacientes com AIDS, MS e atrofia multissistêmica (MSA) mostraram que a medida de TSPO in vivo com [11C](f?)-PK 11195 é possível no cérebro vivo. Embora [11C]OR)-PK 11195 seja considerado como o Iigante de TSPO PET mais amplamente usado, ele exibe uma relação fraca de sinal/ruído e demonstrou baixa permeabilidade cerebral que no final das contas diminui sua sensibilidade como um marca- dor de ativação microglial.

Em 1998, o derivado de fenoxifenil-acetamida, DAAI 106, foi re- portado como um Iigante altamente seletivo e potente para o TSPO (Chaki, S.; Funakoshi, T.; Yoshikawa, R.; Okuyama, S.; Okubo1 T., Nakazato, A.; Nagamine, M.; Tomisawa, K., European Journal of Pharmacology1 1999, 371, 197-204). Recentemente, DAAI 106 foi rotulado com carbono-11 (11HC) e usado em estudos de PET para avaliar seus cinéticos in vivo em ambos cérebros de roedor e primata (Zhang MR, Kida T, Noguchi J e outros [(11)C]DAAI 106: radiosynthesis and in vivo binding to peripheral benzodia- zepine receptors in mouse brain. Nucl Med Biol 2003;30:513-519. Maeda J1 Suhara T1 Zhang MR e outros. Novel peripheral benzodiazepine receptor Iigand [11C]DAAI 106 for PET: An imaging tool for glial cells in the brain. Sy- napse. 2004;52:283-291). A ligação de [11C]DAAI 106 foi mostrada ser qua- tro vezes maior do que [11C] (Λ) - PK 11195 no córtex ocipital de macaco, indicando sua permeabilidade cerebral superior. Um análogo de flúor-18 (18F) deste composto também foi sintetizado, isto é, [18F]FEDAAI 106, e este análogo também exibe características de ligação semelhantes em vivo para [11C]DAAI 106 (Zhang MR, Maeda J, Ogawa M e outros Development of a new radioligand, N-(5-fluoro-2-phenoxyphenyl)-N- (2-[18F]fluoroethyl-5- methoxybenzyl)acetamide, for pet imaging of peripheral benzodiazepine re- ceptor in primate brain. J Med Chem. 2004;47:2228-2235). A ligação de am- bos [11C]DAAI 106 e [18F]FEDAAI 106, porém, parece ser irreversível e, na realidade, a sua eliminação lenta do cérebro indica que eles podem não ter cinéticos adequados para análise quantitativa.

Ryu JK e outros, Neurobiology of Disease, 20 (2005) 550-561 reporta que o Iigante de TSPO PKI 1195 reduz a ativação microglial e morte neuronal em estrato de rato injetado com ácido quinolínico. Os resultados reportados neste documento sugerem que respostas inflamatórias de micró- glia ativada estejam causando lesão aos neurônios estriatais e desse modo o alvejamento farmacológico de TSPO em micróglia é provavelmente prote- ger os neurônios em distúrbios neurológicos.

Seria vantajoso identificar Iigantes de TSPO com cinéticas cere- brais melhoradas que possam ser usadas para imagem expressão de TSPO in vivo, uma vez que tais Iigantes poderiam ser utilizados para também estu- dar a cascata de eventos bioquímicos envolvidos nos estágios iniciais de vários distúrbios neurodegenerativos. Também seria vantajoso identificar ligantes de TSPO com cinéticas cerebrais melhoradas, uma vez que tais Ii- gantes têm potencial para servir tanto como ferramentas de diagnóstico quanto terapêutica para distúrbios neurodegenerativos. Descrição da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um com- posto da fórmula (I):

<formula>formula see original document page 5</formula>

em que:

R é H, halo, alquila opcionalmente substituída com halo, ou al- cóxi opcionalmente substituído com halo;

R1, R2 e R3 são cada independentemente H ou um grupo hidro- fóbico; e

R4 e R5 são cada independentemente alquila opcionalmente substituída com halo, ou alcóxi opcionalmente substituído com halo;

radiorrotulada com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br, ou um sal destes.

Como usado aqui, por um composto da fórmula (I) "radiorrotula- da" com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 7S Br1 é entendido que pelo menos um dentre R1, R2, R3, R4 ou R5 na fórmula (I) seja substituído com 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br. Tipicamente um dentre R, R1, R2 ou R3 é substituído com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 75Br.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (I) ra- diorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e um portador farmaceuticamente aceitável. Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um méto- do de imagear a proteína translocadora (18 kDa) (TSPO) em um paciente, compreendendo administrar ao paciente um composto da fórmula (I) radior- rotulado com um radioisótopo selecionado de 18F1 123I, 76Br1 124I e 75Br1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e obtendo uma imagem do local do radioisótopo no paciente.

Tipicamente, quando o composto da fórmula (I) é radiorrotulado com 18F, 76Br, 124I ou 75Br1 a imagem é obtida através de imageamento de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Tipicamente, quando o compos- to da fórmula (I) é radiorrotulado com 123I1 a imagem é obtida através de i- mageamento de tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT).

Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar um distúrbio neurodegenerativo em um paciente, compre- endendo administrar ao paciente um composto da fórmula (I) radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br, ou um sal far- maceuticamente aceitável deste, e obter uma imagem do local do radioisó- topo no paciente para avaliar a extensão da ligação de TSPO do composto ou sal do mesmo no parênquima cerebral do paciente.

Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece o uso de um composto da fórmula (I) radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F1 123I1 76Br1 124I e 75Br1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, na fabricação de um medicamento para imageamento de proteína translocadora (18 kDa) em um paciente.

Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um compos- to da fórmula (II): <formula>formula see original document page 7</formula>

em que:

R é opcionalmente alquila substituída com halo, ou alcóxi opcio- nalmente substituído com halo;

R1, R2 e R3 são cada independentemente H ou um grupo hidro- fóbico; e

R4 e R5 são cada independentemente alquila opcionalmente substituída com halo, ou alcóxi opcionalmente substituído com halo, e em que pelo menos um dentre R, R1, R2, R3; R4 ou R5 é substituído com F, ou um sal deste.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma com- posição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um portador farmaceuticamente aceitável.

Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio neurodegenerativo, inflamação ou ansiedade em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeu- ticamente efetiva de um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceutica- mente aceitável deste.

Em um nono aspecto, a presente invenção fornece o uso de um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma distúrbio neuro- degenerativo, inflamação ou ansiedade. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 é um gráfico do efeito dos Iigantes de TSPO PK11195, Ro5-4864, DPA-713 e DPA-714 no acúmulo de pregnenolona em células de rato de glioma C6. Todos os compostos foram usados na mesma concentra- ção (40 μΜ); ao término do período de incubação (2h), a quantidade de pregnenolona foi quantificada através de rádio imunoensaio (RIA). Os valo- res são a média de pelo menos três determinações.

Figura 2 é um gráfico da distribuição periférica de [18F]DPA-714 em cada um dos quatro grupos de ratos Iesionados QA descritos no Exem- plo 4; controle (injetado com radioligante somente) e os três grupos de pré- tratamento (PK 11195, DPA-713 e DPA-714).

Figura 3 é um gráfico da distribuição cerebral de [18F]DPA-714 no estriado direito (EstriaOireito), estriado esquerdo (Estria'Esquerdo), cór- téx frontal direito (Cx Direito), córtex frontal esquerdo (Cx*Esquerdo), hipo- campo direito (HipocDireito) e hipocampo esquerdo (HipocEsquerdo) em cada um dos quatro grupos de ratos Iesionados QA descritos no Exemplo 4; controle (injetado com radioligante somente) e os três grupos de pré- tratamento (PK 11195, DPA-713 e DPA-714).

Figura 4 mostra as curvas de atividade de tempo (TACs) descre- vendo captação de [18F]DPA-714 no cérebro de babuíno inteiro durante o tempo de varredura PET de 60 min para os três estudos descritos no Exem- plo 5 (linha de base [18F]DPA-714, bloco [18F]DPA-714 + PK 11195 (1,5 mg/kg) e deslocamento [18F]DPA-714 + DPA-714 (1 mg/kg) estudo).

Descrição Detalhada da Invenção

Como usado aqui, o termo "alquila" refere-se a uma alquila mo- no- ou poli- cíclica de cadeia linear ou ramificada. Tipicamente, a alquila é uma alquila C1 a C30, por exemplo, uma alquila Ci a C6. Os exemplos de al- quila de cadeia linear e ramificada incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila, sec-pentila, 1,2- dimetilpropila, 1,1-dimetilpropila, hexila, 4-metilpentila, 1-metilpentila, 2-metil- pentila, 3-metilpentila, 1,1-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 3,3-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 1,2,2-trimetilpropila e 1,1,2-trimetilpropila. Os exemplos de alquila cíclica incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila.

Como usado aqui, o termo "alcóxi" refere-se a um grupo da fór- mula alquila. Os exemplos de alcóxi incluem metóxi, etóxi, propóxi e butóxi.

Como usado aqui, o termo "alquenila" refere-se a uma alquenila cíclico de cadeia linear ou ramificada. Tipicamente, a alquenila é uma C2 a C30 alquenila, por exemplo, uma alquenila C2 a C6. Os exemplos de alquenila incluem vinila, alila, 1-metilavinila, butenila, isobutenila, 3-metil-2-butenila, 1-pentenila, ciclopentenila, 1-metilciclopentenila, 1-hexenila, 3-hexenila, cicloexenila, 1-heptenila, 3-heptenila, 1-octenila, ciclooctenila, 1-nonenila, 2-nonenila, 3-nonenila, 1-decenila, 3-decenila, 1,3-butadienila, 1,4-penta- dienila, 1,3-ciclopentadienila, 1,3-hexadienila, 1,4-hexadienila, 1,3-cicloexa- dienila, 1,4-cicloexadienila, 1,3-cicloeptadienila, 1,3,5-cicloeptatrienila e 1,3,5,7-ciclooctatetraenila.

Como usado aqui, o termo "alquinila" refere-se a uma alquinila cíclica de cadeia linear ou ramificada. Tipicamente, a alquinila é uma C2 a C30 alquinila, por exemplo, uma C2 a C6 alquinila.

Como usado aqui, o termo "arila" refere-se a um radical de um sistema de anel heterocíclico aromático ou hidrocarboneto aromático fundido ou conjugado, polinuclear, único. Os exemplos de arila incluem fenila, naftila e furila. Quando arila compreende um sistema de anel aromático heterocícli- co, o sistema de anel aromático heterocíclico pode conter 1 a 4 heteroáto- mos independentemente selecionados de Ν, O e S.

Como usado aqui, o termo "halo" refere-se a um radical de halo- gênio, por exemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo. Como usado aqui, uma refe- rência a um grupo "opcionalmente substituído com halo" significa que o gru- po pode ser substituído com um ou mais substituintes de halogênio.

Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que os compostos da fórmula (I) radiorrotulados com um radioisótopo seleciona- do de 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br são Iigantes de TSPO seletivos, e podem ser usados como marcadores in vivo precisos de TSPO e então ativação micro- glial. Estes compostos radiorrotulados podem então ser usados para estudar eventos neuropatológicos em vários distúrbios neurodegenerativos, e podem ser usados como uma ferramenta para diagnose de tais distúrbios e para monitorar a progressão de tais distúrbios.

Várias classes de Iigantes de TSPO foram descritas na literatura.

Um composto que é efetivo como um fármaco terapêutico não é necessari- amente um composto que possa ser radiorrotulado e usado para imagea- mento. Realmente, muitos fármacos que são terapeuticamente usados não são seletivos para um alvo específico e podem interagir com vários alvos para produzir um efeito terapêutico. Além disso, muitos fármacos terapêuti- cos não têm afinidade que está na faixa de nM normalmente usada para i- mageamento, porém têm afinidade na faixa de μΜ. Além disso, o metabo- lismo e Iipofilicidade de um fármaco terapêutico, particularmente quando administrou em níveis traçadores para imageamento, podem tornar o fárma- co inadequado para uso para imageamento.

Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que o composto da fórmula (I) radiorrotulada com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I, 76Br1 124I e 75Br podem ser usados para imagear TSPO e então ati- vação de microglial em um paciente. Os compostos da fórmula (I) radiorrotu- lada com 18F1 123I, 76Br, 124I ou 75Br são Iigantes seletivos para TSPO e têm afinidade alta para TSPO.

Os compostos da fórmula (I) radiorrotulada com um radioisótopo selecionado de 18F, 1231,76Br, 124I e 75Br formam sais, e sais de tais compos- tos são abrangidos pela presente invenção. Os sais são preferivelmente farmaceuticamente aceitáveis, porém será apreciado que sais não farmaceu- ticamente aceitáveis também se incluam no escopo da presente invenção. Os exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de cátions farmaceuticamente aceitáveis tal como sódio, potássio, lítio, cálcio, magné- sio, amônio e alquilamônio; sais de adição de ácido de ácidos inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis tais como ácido clorídrico, ortofosfórico, sulfú- rico, fosfórico, nítrico, carbônico, bórico, sulfâmico e bromídricos; ou sais de ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis tais como ácido acético, pro- piônico, butírico, tartárico, maléico, hidroximaléico, fumárico, cítrico, lático, múcico, glicônico, benzóico, sucínico, oxálico, fenilacético, metanossulfônico, trialometanossulfônico, toluenossulfônico, benzenossulfônico, salicílico, sul- fanílico, aspártico, glutâmico, edético, esteárico, palmítico, oléico, láurico, pantotênico, tânico, ascórbico e valérico.

Na fórmula (I), R é tipicamente C1-6 alquila ou C1-6 alcóxi, em que a C1-6 alquila ou C1-6 alcóxi pode ser opcionalmente substituída com halo.

Tipicamente, R1 e R3 são cada um grupo diferente de H. Quando R1, R2 ou R3 é um grupo hidrofóbico, o grupo hidrofóbico pode, por exemplo, ser C1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, arila opcionalmente substituída com halo, NHC1.6 alquila opcionalmente substituída com halo, OC1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, SC1-6 alquila opcionalmen- te substituída com halo, COOR6 onde R6 é C1-6 alquila opcionalmente substi- tuída com halo, (CH2)nORe onde R6 é C1-6 alquila opcionalmente substituída com halo e η é um número inteiro (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6), ou um po- liéter opcionalmente de substituído com halo. Quando Ri, R2 ou R3 é um po- liéter opcionalmente substituído com halo, o poliéter pode, por exemplo, ser um grupo da fórmula -(0(CH2)a)b (CH2)cCH3 onde a é 1, 2 ou 3, b é 2, 3, 4 ou 5, e c é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, opcionalmente substituída com halo.

Vários compostos da fórmula (I) são descritos em Selleri e ou- tros, "2-Arylpyrazol[l,5- [alpha]]pyrimidin-3-yl acetamides. New Potent and Selective Peripheral Benzodiazepine Receptor Ligands", Bioorganic & Medi- cinal Chemistry 9 (2001) 2661-2671 (" Selleri e outros (2001)") incorporado aqui por referência. Este documento descreve a preparação de certos com- postos específicos da fórmula (I) (compostos 3f a 3y descritos neste docu- mento) e descreve que esses compostos têm afinidade e seletividade para TSPO (chamado PBR neste documento). Embora alguns dos compostos específicos descritos nesse documento tenham um pouco de afinidade para CBR, cada dos compostos 3f a 3y descritos neste documento é muito mais seletivos para TSPO do que CBR.

Como descrito em Selleri e outros (2001), as compostos da fór- mula (I) referidos naquele documento podem ser preparados em um proce- dimento de três etapas a partir da aroilacetonitrilo apropriada. No processo descrito, a aroilacetonitrilo foi reagida em meio alcalino com N,N-dietilcloro- acetamida, com o alcatrão resultante purificado por meio de cromatografia de coluna para isolar a N N-dietilbutanamida. A N,N-dietilbutanamida foi rea- gida em refluxo em etanol com hidrato de hidrazina, na presença de ácido 5 acético, para produzir a N,N-dietil-(3-amino-5-arilpirazol-4-il)acetamida cor- respondente. A N,N-dietil-(3-amino-5-arilpirazol-4-il)acetamida foi então con- densada com um reagente eletrofílico adequado (4,4-dimetóxi-2-butanona, 1,1,3,3-tetraetoxipropano, 2,4-pentanodiona, 1-trifluorometil-2,4-pentanodiona, 1,5-trifluorometila-2,4-pentanodiona, 1-fenil-1,3-butanodiona, 3-metil-2,4- pentanodiona, butanoato de etil-2-acetil-3-oxo, etil-2-acetil-3-etoxiacrilato, fenil- malondialdeído ou 1-fenil-3-dimetilamino-2-propen-1-ona) para fechar o anel de pirimidina, desse modo formando o composto relevante da fórmula (I).

Outro método de preparar vários compostos da fórmula (I) é descrito em Selleri1 S.; Grafted, P.; Costagli1 C; Bonaccini1 C; Costanzo1 A.; Melani1 F.; Guerrini1 G.; Ciciani1 G.; Costa, B.; Spinetti, F.; Martini, C; Bruni1 F. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2005, 13, 4821-4834 ("Selleri e ou- tros (2005)"), incorporados aqui por referência. No método descrito nestes documentos, benzoilacetonitrilo foi reagida em meio básico (LiOH-H2O) com ácido iodoacético ou iodoacetato de etila para produzir o ácido ou éster cor- respondente (Ia e Ib) respectivamente. Os intermediários Ia e Ib foram reagi- dos em etanol em refluxo com hidrato de hidrazina, na presença de ácido acético, para produzir os 3-amino pirazóis correspondentes (2a e 2b). Os compostos 2a e 2b foram condensados com 2,4-pentanodiona para fechar o anel de pirimidina resultante em ácido 3a e éster 3b. O ácido 3a foi converti- do para um anidrido misturado (com cloroformiato de etila) e este intermediá- rio reagiu com uma amida para produzir o composto relevante da fórmula (I).

Os compostos da fórmula (I) descritos em Selleri e outros (2001) e Selleri e outros (2005) podem ser preparados pelos processos descritos nesses documentos, ou por outros processos conhecidos por pessoas ver- sadas em síntese de química orgânica. Como será evidente para alguém versado na técnica, outras compostos da fórmula (I) podem ser preparados através de processos semelhantes aos processos descritos em Selleri e ou- tros (2001) e Selleri e outros (2005).

Um composto da fórmula (I) pode ser radiorrotulado com 18F1 123I1 76Br1 124I ou 75Br por técnicas padrões conhecidas em química orgânica para modificar um composto orgânico para substituir um grupo hidrogênio ou halo η composto com 18F1123I176Br, 124I ou 75Br. Alternativamente, o compos- to da fórmula (I) radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I1 76Br1 124I e 75Br pode ser preparado incorporando 18F1 123I1 76Br1 124I ou 75Br como um substituinte em um dos materiais de partida ou em um intermediá- rio usado na síntese do composto da fórmula (I).

Um composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F1 123I1 76Br1 124I ou 75Br pode, por exemplo, ser preparado preparando um composto tendo a fórmula (I) definida acima, porém na qual um dentre Ri, R2, R3, R4 ou R5 é substituído com um grupo de saída, tal como tosilato, mesilato, Br ou I, que permite que uma reação de substituição alifática nucleofílica ocorra no grupo de saída, e então submetendo o composto às condições sob as quais uma reação de substituição alifática nucleofílica ocorre para substituir o grupo de saída com 18F, 123I1 76Br1 124I ou 75Br. Por exemplo, quando o grupo de saída for Br ou tosilato, o composto pode ser reagido com o complexo de [18F]- kryptofix-K222 em acetonitreto em cerca de 80°C durante 10 minutos para formar um composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F. Os compostos da fórmula (I) radiorrotulada com 123I, 76Br, 124I ou 75Br também podem ser for- mados formando um composto tendo a fórmula (I) definida acima, porém na qual R, R1, R2, R3, R4 ou R5 é substituído com uma estanila, silila ou halogê- nio (substituinte de halogênio é normalmente diferente do radioisótopo), e submetendo o composto a uma reação de substituição eletrofílica em meios acéticas usando um agente de oxidação tal como cloramina-T para formar um composto da fórmula (I) radiorrotulada com 123I, 76Br1 124I ou 75Br. Em al- gumas modalidades, esta reação pode ser realizada em temperatura ambi- ente, e em outras modalidades, a mistura de reação é aquecida em cerca de 80 °C a 100°C. Um composto da fórmula (I) como definido acima, porém no qual um dentre R, Ri, R2l R3, R4 ou R5 é substituído com um grupo de saída, pode ser preparado através de processos análogos aos processos para pre- parar compostos da fórmula (I) descrita em Selleri e outros (2001) ou Selleri e outros (2005), porém no qual um reagente apropriado é substituído com o grupo de saída. Alternativamente, um composto da fórmula (I) pode ser mo- dificado por reações conhecidas em química orgânica para introduzir um grupo de saída como um substituinte em um dos R1 Ri, R2, R3, R4 ou R5.

O composto da fórmula (I) pode ser radiorrotulado com 18F (meia-vida de 110 minutos), 123I (meia-vida de 13,2 horas), 76Br (meia-vida de 16,2 horas), 124I (meia-vida de 4,2 dias) ou 75Br (meia-vida de 1,6 horas). Tipicamente, o composto da fórmula (I) é radiorrotulado com 18F. Os com- postos da fórmula (I) radiorrotulada com 18F, 123I176Br, 124I ou 75Br são mais práticos em um sentido clínico para imageamento do que os compostos ra- diorrotulados com radioisótopos que têm uma meia-vida significativamente mais curta, uma vez que múltiplas varreduras podem ser realizadas em um dia. Além disso, hospitais/organizações que não têm um ciclotron no local podem usar tais radioligantes, uma vez que os radioligantes podem ser pre- parados fora do local e transportados para o hospital/organização sem perda significante de atividade durante transporte. Além disso, varreduras mais longas (por exemplo, 180 minutos) podem ser empreendidas com compos- tos rotulados com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 75Br tornando-os mais apropriadas para o estudo da maioria dos processos biológicos.

Os compostos da fórmula (I) radiorrotulados com 18F1 123I, 76Br, 124I ou 75Br têm afinidade e seletividade elevadas para TSPO, e podem ser usados para imageamento de TSPO em um paciente. Consequentemente, o composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 75Br podem ser usados para estudar TSPO em um paciente.

Em um paciente tendo um distúrbio neurodegenerativo, a ex- pressão de TSPO no parênquima cerebral é aumentada dramaticamente comparada a um paciente que não tem um distúrbio neurodegenerativo. Consequentemente, os compostos da fórmula (I) radiorrotulados com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 75Br podem ser usados para estudar distúrbios neurodege- nerativos e podem ser usados para diagnosticar e monitorar a progressão de distúrbios neurodegenerativos. Os distúrbios neurodegenerativos que podem ser estudados, diagnosticados ou monitorados usando estes compostos in- cluem a doença de Alzheimer, esclerose múltipla, doença de Parkinson, a doença de Huntington, atrofia multissistêmica, epilepsia, encefalopatia, aci- dente vascular cerebral e tumores cerebrais. Cada um destes distúrbios está associado com lesão ou infecção neuronal.

De acordo com o método do terceiro ou quarto aspecto da pre- sente invenção, um composto da fórmula (I) radiorrotulado com um radioisó- topo selecionado de 18F, 123I, 76Br1 124I e 75Br ou um sal farmaceuticamente aceitável deste é administrado ao paciente. Quando o composto da fórmula (I) é radiorrotulado com 18F, 76Br1124I ou 75Br, a imagem do local do radioisó- topo no paciente, e então o local de TSPO no paciente, pode ser obtida atra- vés de imageamento de tomografia por emissão de pósitrons (PET) que usa as técnicas convencionais conhecidas na técnica. Quando o composto é ra- diorrotulado com 123I, a imagem do local do radioisótopo no paciente pode ser obtida por imageamento de SPECT que usa técnicas convencionais co- nhecidas na técnica. Tipicamente para ambos imageamento de PET e SPECT, os dados são adquiridos usando técnicas de aquisição de modo dinâmico ou lista convencionais, começando imediatamente depois de admi- nistração do composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F3 123I1 76Br, 124I ou 75Br ou sal farmaceuticamente aceitável deste, e continuando durante cerca de 40 minutos ou por mais tempo. Na conclusão de aquisição de da- dos, os dados são tipicamente processados para fornecer uma série de tem- po de reconstruções 3D, cada descrevendo a distribuição do radioisótopo no corpo a um ponto particular no tempo.

Tipicamente, o composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F, 123|, 76gr 124| 0(J 75gr ou saj farmaceutjcamente aceitável deste é administra- do parenteralmente. Tipicamente, o composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F, 123I, 76Br, 124I ou 75Br ou sal farmaceuticamente aceitável deste é administrado parenteralmente por injeção intravenosa ou infusão. Tipica- mente o composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F, 76Br, 124I ou 75Br ou sal farmaceuticamente aceitável deste é administrado em uma dose na faixa de cerca de 5 a 20 mCi (185-740 MBq). Tipicamente, o composto da fórmula (I) radiorrotulado com 18F1 123I176Br1 124I ou 75Br ou sal farmaceuticamente aceitável deste é administra- do administrando uma composição farmacêutica que compreende o compos- to da fórmula (I) radiorrotulado com 18F1 123I1 76Br1 124I ou 75Br1 ou sal farma- ceuticamente aceitável deste, e um portador farmaceuticamente aceitável.

As preparações para administração parenteral estão tipicamente na forma de uma solução, suspensão ou emulsão aquosa ou não aquosa estéril. Os exemplos de solventes não aquosos adequados são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tal como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Os portadores aquosos ade- quados s incluem água e soluções, emulsões ou suspensões alcoóli- cas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais adequados incluem solução de cloreto de sódio.

Os presentes inventores também descobriram que o composto da fórmula (I) na qual R é alquila opcionalmente substituída com halo ou al- cóxi opcionalmente substituído com halo e que contém pelo menos um gru- po flúor, são surpreendentemente mais ativos no TSPO do que os compos- tos semelhantes que não contêm um grupo flúor.

Consequentemente, a presente invenção também fornece um composto da fórmula (II):

<formula>formula see original document page 16</formula>

em que: R é alquila opcionalmente substituída com halo, ou alcóxi opcio- nalmente substituído com halo;

R1, R2 e R3 são cada independentemente selecionado de grupos H e hidrofóbicos; e

R4 e R5 são cada independentemente selecionado de alquila opcionalmente substituída com halo e alcóxi opcionalmente substituído com halo, e

em que um ou mais dentre R, R1, R2, R3 R4e R5 é substituído com F, ou um sal deste.

Os sais dos compostos da fórmula (II) são preferível e farmaceu- ticamente aceitável, porém será apreciado que sais não farmaceuticamente aceitáveis também de incluam no escopo da presente invenção. Os sais não farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da fórmula (II) podem ser usa- dos como intermediários na preparação de sais farmaceuticamente aceitá- veis dos compostos da fórmula (II). Os exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de cátions farmaceuticamente aceitáveis tal como sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, amônio e alquilamônio; sais de adi- ção de ácido de ácidos inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis tal como ácido clorídrico, ortofosfórico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbônico, bórico, sulfâmico e bromídricos; ou sais ácidos orgânicos farmaceuticamente acei- táveis tal como ácido acético, propiônico, butírico, tartárico, maléico, hidro- ximaléico, fumárico, cítrico, lático, múcico, glicônico, benzóico, sucínico, oxá- lico, fenilacético, metanossulfônico, trialometanossulfônico, toluenossulfôni- co, benzenossulfônico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutâmico, edético, esteárico, palmítico, oléico, láurico, pantotênico, tânico, ascórbico e valérico.

Tipicamente, na fórmula (II), Ri e R3 são cada um grupo diferen- te de H.

Tipicamente, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída com ha- lo, ou C1-6 alcóxi opcionalmente substituída com halo. Em algumas modali- dades, R é C1-6 alcóxi substituído com F, por exemplo, OCH2CH2F.

Tipicamente, R1, R2 e R3 são cada independentemente selecio- nado de H, C1-6 alquila, arila, NHC1-6 alquila, OC1-6 alquila, SC1-6 alquila, COOR6 onde R6 é C1-6 alquila (por exemplo, metila, etila ou propila), (CH2)nOR6 onde R6 é de Ci.6 alquila e η é um número inteiro (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6), e poliéteres, em que quaisquer destes grupos (diferente de H) possa opcionalmente ser substituído com halo. Quando R1, R2 ou R3 é um poliéter opcionalmente substituído com halo, o poliéter pode, por exem- plo, ser um grupo da fórmula -(0(CH2)a)b (CH2)cCH3 onde a é 1, 2 ou 3, b é 2, 3, 4 ou 5, e c é O, 1, 2, 3, 4 ou 5, opcionalmente substituída com halo.

Em algumas modalidades, R4 e R5 são cada independentemente selecionado de C1-6 alquila e C1-6 alcóxi, em que a C1-6 alquila ou C1-6 alcóxi pode ser opcionalmente substituído com halo.

Em algumas modalidades, R é C1-6 alcóxi substituído com F, R1, R2 e R3 são cada independentemente selecionado de H, C1-6 alquila, arila, NHC1-6 alquila, OC1-6 alquila, SC1-6 alquila, COOR6 onde R6 é C1-6 alquila, (CH2)nOR6 onde R6 é C1-6 alquila e η é um número inteiro, e poliéteres, e R4 e R5 são independentemente cada selecionado de C1-6 alquila e C1-6 alcóxi.

Os compostos da fórmula (II) são seletivos para TSPO e TSPO ativo. A ativação de TSPO está relacionada com a síntese aumentada de neuroesteróides. A ativação de TSPO pode então aumentar a concentração de neuroesteróides no cérebro. Estes neuroesteróides, incluindo progestero- na e deidroepiandrosterona e seus metabólitos, modulam positivamente a neurotransmissão de ácido γ-aminobutírico (GABA) levando aos efeitos an- siolíticos não sedativos que são de benefício terapêutico em distúrbios rela- cionados com memória e estresse. Os compostos da fórmula (II) também podem ser usados como agentes neuroprotetores para o tratamento de dis- túrbios neurodegenerativos, tal como agentes antiinflamatórios, e tal como agentes ansiolíticos.

Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção forne- ce um método para tratar distúrbios neurodegenerativos, inflamação ou ansie- dade em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantida- de terapeuticamente efetiva de um composto da fórmula (II) ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste. Os distúrbios neurodegenerativos que podem ser tratados pelo método incluem a doença de Alzheimer1 esclerose múltipla, doen- ça de Parkinson1 a doença de Huntington, atrofia multissistêmica, epilepsia, encefalopatia, acidente vascular cerebral e tumores cerebrais. O composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável deste é tipicamente administra- do administrando uma composição farmacêutica que compreende o composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável deste.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (II) ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste e um portador farmaceuticamente aceitável.

A composição do sétimo aspecto de presente invenção compre- ende pelo menos um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste junto com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitá- veis e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos. As composições ade- quadas incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parenteral (incluindo subcu- tânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As composições podem ser apresentadas convenientemente na forma de dosagem de unidade e podem ser bem preparadas por métodos conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de levar o ingrediente ativo em associação com o portador que constitui um ou mais ingredientes adicionais. Em geral, as composições são preparadas uniformemente e intimamente levando em associação o composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável deste com portadores líquidos, diluente, excipientes e/ou adjuvantes ou por- tadores sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, mol- dando o produto.

O termo "paciente" como usado aqui refere-se a qualquer ani- mal. O paciente pode ser um mamífero, por exemplo, um humano. Em al- gumas modalidades, o paciente é um animal de companhia tal como um ca- chorro ou gato, um animal doméstico tal como um cavalo, pônei, burro, mula, lhama, alpaca, porco, vaca ou ovelha, ou um animal de jardim zoológico tal como um primata, felino, canino, bovídeo ou ungulado.

Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente efeti- va" refere-se a uma quantidade de um composto efetiva para produzir uma resposta terapêutica desejada. A "quantidade terapeuticamente efetiva" es- pecífica variará com tais fatores como a condição particular sendo tratada, a condição física do paciente, o tipo de paciente que é tratado, a duração do tratamento, a natureza de terapia simultânea (se alguma), e a formulação específica empregada, e o clínico atendente poderá determinar uma quanti- dade terapeuticamente efetiva apropriada. Por exemplo, o clínico atendente pode determinar uma quantidade terapeuticamente apropriada efetiva de um composto da fórmula (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste le- vando em consideração as dosagens convencionais de outros compostos neurologicamente ativos ou os resultados de experiências de animais. Em algumas modalidades, o composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável destes pode ser administrado a uma dosagem de cerca de 1 a cer- ca de 20 mg/kg de peso corpóreo/dia.

Como usado aqui, um "portador farmaceuticamente aceitável" é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou veículo para liberar um composto a um paciente. O portador pode ser líquido ou só- lido e é selecionado com a maneira planejada de administração em mente. O portador é "farmaceuticamente aceitável" no sentido de não ser biologi- camente ou de outro modo indesejável, isto é, o portador pode ser adminis- trado a um paciente junto com o ingrediente ativo sem causar qualquer ou uma reação adversa significativa.

O composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável deste pode ser administrado oralmente, topicamente ou parenteralmente (por exemplo, por injeção subcutânea, por administração de aerossol aos pulmões ou cavidade nasal, ou através de técnicas de injeção intravenosa, intramuscular, intratecal ou intracraniana ou infusão) em uma Formulação de unidade de dosagem que contém portadores farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais.

O composto da fórmula (II) ou sal farmaceuticamente aceitável deste pode ser administrado oralmente como comprimidos, suspensões a- quosas ou oleosas, pastilhas, trociscos, pós, grânulos, emulsões, cápsulas, xaropes ou elixires. Uma composição para uso oral pode conter um ou mais agentes selecionados do grupo de agentes adoçantes, agentes flavorizan- tes, agentes corantes, agentes desintegrantes, lubrificantes, agentes de re- tardamento e agentes preservativos para produzir preparações farmaceuti- camente elegantes e saborosas. Os adoçantes adequados incluem sacaro- se, lactose, glicose, aspartame ou sacarina. Os agentes desintegrantes ade- quados incluem amido de milho, metilcelulose, polivinilpirrolidona, goma xan- tam, bentonita, ácido algínico ou ágar. Os agentes flavorizantes adequados incluem óleo de hortelã, óleo de flavorizante de gaultéria, cereja, laranja ou framboesa. Os preservativos adequados incluem benzoato de sódio, vitami- na E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metil parabeno, propil parabeno ou bi- sulfito de sódio. Os lubrificantes adequados s incluem estearato de magné- sio, ácido esteárico, oleato de sódio, cloreto de sódio ou talco. Os agentes de retardamento adequados incluem monoestearato de glicerila ou diestea- rato de glicerila.

As preparações para administração parenteral estão tipicamente na forma de uma solução, suspensão ou emulsão aquosa ou não aquosa estéril. Os exemplos de solventes não aquosos adequados são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tal como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Os portadores aquosos ade- quados incluem água e soluções, emulsões ou suspensões alcoóli- cas/aquosas, incluindo meios tamponados e salinos. Os veículos parenterais adequados incluem solução de cloreto de sódio. Preservativos e outros aditi- vos também podem estar presentes tal como, por exemplo, antimicrobianos, anti-oxidantes, agentes de quelação, fatores de crescimento, gases inertes, e similares.

Geralmente, o termo " tratar", " tratamento" e similares são usa- dos aqui para significar afetar um paciente para obter um efeito farmacológi- co e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de com- pletamente ou parcialmente prevenir uma doença ou distúrbio ou sinal ou sintoma desta, e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença ou distúrbio. "Tratar" como usado aqui abrange qualquer tratamento, ou prevenção de doença ou distúrbios em um verte- brado, um mamífero, particularmente um humano, e inclui: (a) prevenir a do- ença ou distúrbio de ocorrer em um paciente que possa ser predisposto à doença ou distúrbio, porém que não tenha sido ainda diagnosticado como tendo a doença ou distúrbio; (b) inibir a doença ou distúrbio, isto é, impedir o desenvolvimento da doença ou distúrbio; ou (c) aliviar ou melhorar os efeitos da doença ou distúrbio, isto é, causar a regressão dos efeitos da doença ou distúrbio.

EXEMPLOS

As modalidades da invenção são descritas abaixo por referência aos seguintes exemplos não limitados.

EXEMPLO 1 - Síntese de DPA-714 e [18F]DPA-714

1. Síntese de DPA-714

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Esquema 1. Síntese de Iigante de PBR DPA-714 e seus precur- sores de tosila 8; (i) acetonitrilo, metóxido de sódio; (ii)N,N-dietilcloro- acetamida, iodeto de sódio, NaOH/80% de EtOH; (iii) hidrato de hidrazina, EtOH, ácido acético; (iv) 2,4-pentadiona, EtOH. (Selleri e outros, 2001); (v) 48% de HBr/PTC; (vi) 7, trifenilfosfina, DIAD; (vii) trifenilfosfina, 2- fluoroetanol, DMF, DIAD.

3-(4-Metóxi-fenil)-3-oxo-propionitrilo (2)

Uma mistura de 4-metoxibenzoato de metila (30 g, 181 mmols) e metóxido de sódio (9,75 g, 181 mmols) foi aquecida a 80°C sob uma atmos- fera de argônio com agitação contínua até ficar homogênea. Acetonitrilo (16,5 ml, 313 mmols) e clorobenzeno (19 ml) foi adicionado em gotas à mis- tura. A reação foi aquecida a 90-1OO0C durante 24 horas com agitação con- tínua. Depois da mistura ter sido esfriada - 0°C e tratada com água gelada (~50 ml) e éter de dietila (~200 ml), ela foi agitada até que o material sólido dissolvesse. A camada aquosa foi separada da camada orgânica e acidifica- da para pH 2 com H2SO4 diluído. Seguinte a adição de éter de dietila, a ca- mada orgânica foi, seca em Na2SO4 anidroso e evaporada para secagem. O sólido amarelo resultante foi dissolvido em CHCl3 e lavado com solução a- quosa de NaHCO3 saturado (5 χ 100 ml) para remover ácido benzóico. A camada orgânica foi seca em NaSO4 anidroso e evaporada para secagem. O sólido foi' purificado lavando com éter de petróleo que produziu 2 (2,91 g, 9%) como cristais amarelos claros, finos; ponto de fusão: 132-137°C; 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ 3,89 (s, 3H, OCH3), 4,03 (s, 2H, CH2), 6,97 (d, J = 9,0, 2H, Ph), 7,90 (d, J = 9,0, 2H, Ph). 3-Ciano-A/,/V-dietil-4-(4-metóxi-fenil)-4-oxo-butiramida (3)

Uma mistura de 2 (2,0 g, 11,4 mmols), N,N-dietilcloroacetamida (1,7 g, 11,4 mmols) e Nal (5,1 g, 34 mmols) foram adicionados a uma solu- ção de NaOH (0,5 g, 12,5 mmols) em 80% de EtOH (80 ml) enquanto sendo agitado continuamente. A mistura foi agitada a temperatura ambiente duran- te 7 horas e monitorada por t.l.c. Uma vez que a reação foi completa ela foi permitida esfriar e foi filtrada para remover o material inorgânico. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna (CH2CI2 como eluente) para produzir 3 (2,1 g, 64%) como um óleo amarelo escuro; 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ 1,06-1,30 (m, 6H, N(CH2CH3)2), 2,85 (dd, J = 4,5, 16,2 Hz, 1H, CH2), 3,21-3,43 (m, 5H: 4H, N(CH2CH3)2: 1H, CH2), 3,90 (s, 3H, OCH3), 4,89-5,02 (m, 1H, CH), 6,98 (d, J = 8,7, 2H, Ph), 8,05 (d, J = 9,0, 2H, Ph). Espectro de massa: Cl, m/z 289 (M + 1). 2-13-Amino-5-(4-metóxi-fenil)-1H-pirazol-4-il1-N,N-dietilacetamida (4)

Hidrato de hidrazina (0,73 g, 14,6 mmols) e ácido acético (0,73 ml) foram adicionado a uma solução 3 (2,1 g, 7,3 mmols) em EtOH (37 ml). A mistura foi aquecida em refluxo durante 4 horas e monitorada por t.l.c. Uma vez que a reação foi completa, ela foi permitida esfriar em temperatura ambiente. A solução foi evaporada para secagem e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (CH2CbZMeOH, 10:1 v/v, como eluente). O produto purificado foi re-dissolvido em CH2CI2 e lavado com solução aquosa de NaHCCh saturada (4 χ 20 ml) para remover ácido acético. Isto proporcionou 4 (1,52 g, 68%) como cristais amarelos; ponto de fusão: 154,5-157,5°C; 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ 0,90-1,10 (m, 6H, N(CH2CH3)2), 3,04-3,33 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 3,50 (s, 2H, CH2), 3,85 (s, 3H, OCH3), 6,98 (d, J = 8,7, 2H, Ph), 7,32 (d, J = 9,0, 2H, Ph).

N,N-dietil-2-[2-(4-metóxi-fenil)-5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-aceta- mida (5)

2,4-Pentanodiona (0,4 g, 4 mmols) foi adicionada a uma solução 4 (1,2 g, 4 mmols) em EtOH (20 ml). A mistura foi aquecida em refluxo du- rante 12 horas. A mistura de reação foi permitida esfriar e o solvente foi eva- porado para secagem. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (CHCI3/MeOH, 40:1 v/v como eluente) que produziu 5 (1,37 g, 93%) como cristais amarelos claros; ponto de fusão: 120,5-123,5°C; 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ 1,09-1,22 (m, 6H, N(CH2CH3)2), 2,54 (s, 3H, 5- CH3), 2,74 (s, 3H, 7-CH3), 3,39-3,51 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 3,85 (s, 3H, O- CH3), 3,91 (s, 2H, CH2), 6,51 (s, 1H, H-6), 6,98 (d, J = 9,0, 2H, Ph), 7,76 (d, J = 9,0, 2H, Ph).

N.N-dietil-2-[2-(4-hidróxi-fenil)-5,7-dimetil-pirazol[1.5-a]pirimidin-3-il]-aceta- mida (6)

Uma solução 5 (0,43 g, 1,16 mmol), brometo de fosfônio de tri- butila de hexadecila (0,06 g, 0,116 mmol) e 45% de HBr (6 ml) foi aquecida a 100°C durante 7 horas sob agitação constante. A mistura de reação foi basi- ficada para pH 8-9 usando NaHCO3 e extraída com CH2CI2. A camada orgâ- nica foi coletada e seca em NaS04 anidroso. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna (CH- CI3/MeOH, 40:1 v/v como eluente) para produzir 6 (220 mg, 54%) como cris- tais marfim; ponto de fusão: 242,5-247°C; 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ 1,06-1,18 (m, 6Η, N(CH2CH3)2), 2,54 (s, 3Η, 5-CH3), 2,73 (s, 3H, 7-CH3), 3,34-3,51 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 3,96 (s, 2H, CH2), 6,49 (s, 1H, H-6), 6,79- 6,82 (d, J = 8,7, 2H, Ph), 7,61-7,64 (d, J = 8,4, 2H, Ph); (Encontrado: C, 66,35; H, 6,71; N1 15,38. C20H24N4O2.1/2H20 requer C, 68,16; H, 6,86; N, 15,90%). Espectro de massa: Cl, m/z 353 (M + 1). Éster de 2-hidróxi-etila de ácido tolueno-4-sulfônico (7)

Óxido de prata fresco (350 mg, 1,5 mmol), cloreto de p- toluenossulfonila (210 mg, 1,1 mmol) e iodeto de potássio (33 mg, 0,2 mmol) foram adicionados a uma solução agitada de 1,2-etanodiol (62 mg, 1 mmol) em diclorometano (10 ml). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, foi filtrada por uma almofada pequena de celita e foi lavada com acetato de etila. O solvente foi removido e o produto bruto foi purificado através de cromatografia de coluna (CH2CI2MeOH, 40:1 v/v como eluente) para produzir o produto de monotosilato 7 como óleo transpa- rente em 46% de Produção. 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ: 7,81 (d, 2H, J = 8,1), 7,36 (d, 2H, J = 8,1), 4,15 (d, 2H, J = 9,0), 3,82 (d, 2H, J = 9,0), 2,46 (s, 3H).

Éster de 2-[4-(3-dietilcarbamoilmetil-5,7-dimetil-pirazolf1.5-alpirimidin-2-il)- fenóxil-etila de ácido tolueno-4-sulfônico (8)

Azodicarboxilato de diisopropila (DIAD, 0,48 ml, 2,4 mmols) foi adicionado a uma solução 6 (400 mg, 1,1 mmol) trifenilfosfina (637 mg, 2,4 mmols) e tosilato de 2-hidroxietila (525 mg, 2,4 mmols) em THF seco (10 ml). A mistura de reação foi agitada durante 20 horas a temperatura am- biente e evaporada para secagem. O resíduo foi purificado através de cro- matografia de coluna de sílica gel (CHCI3/MeOH, 80:1 v/v como eluente) pa- ra produzir 8 como cristais amarelos claros em 85% de Produção. 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) a: 7,83 (d, 2H, J = 8,1), 7,74 (d, 2H, J = 9,0), 7,35 (d, 2H, J = 8,1), 6,86 (d, 2H, J = 9,0), 6,52 (s, 1H), 4,37 (d, 2H, J = 4,8), 4,19 (d, 2H, J = 4,8), 3,92 (s, 2H), 3,39-3,52 (m, 4H), 2,74 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 1,08-1,23 (m, 6H); (Encontrado, C, 63,37; H, 5,96; N, 9,89. Espectro de massa: Cl, m/z 551 (M + 1). N,N-dietil-2-(2-r4-(2-fluoretóxi)-fenil]-5,7-dimetil-pirazol[1,5-α]pirimidn-3-il}- acetamida (DPA-714)

Azodicarboxilato de diisopropila (DIAD, 190 mg, 0,94 mmol) foi adicionado a uma solução 6 (150 mg, 0,43 mmol), trifenilfosfina (274 mg, 0,94 mmol) e 2-fluoroetanol (60 mg, 0,94 mmol) em DMF seco (6 ml). A mis- tura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 48 horas e en- tão evaporada durante 48 horas e então evaporada para secagem. O resí- duo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (CH- CI3ZMeOH, 80:1 v/v como eluente) para produzir DPA-714 como cristais amarelos claros em 47% de Produção. 1H r.m.n. (CDCI3, 300 MHz) δ: 7,78 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 6,52 (s, 1H), 7,01 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 4,78 (dt, 2H, J = 4, 47 Hz), 4,26 (dt, 2H, J = 4, 28 Hz), 3,93 (s, 2H), 3,39-3,51 (m, 4H), 2,75 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 1,09-1,27 (m, 6H); (Encontrado, C, 66,70; H, 6,60; N, 13,14. Espectro de massa: Cl, m/z 399 (M + 1).

2. Radiossintese de Í1F1DPA-714

<formula>formula see original document page 26</formula>

Esquema 2. Radiossíntese de [l0F]DPA-714

Produção de Radioisótopo. Nenhum íon de fluoreto [18F] adi- cionado ao portador foi produzido em um ciclotron de PETtrace (GE Health- Care, Suécia), por irradiação de um alvo de água de 0,8 mL usando um feixe de próton de 16,5 MeV em 95% de [180]-H20 enriquecido pela reação nucle- ar de [180(p,n)18F].

Preparação de [18F]-kryptofix-K222. [18FJFIuoreto em H2O enri- quecido com [18O] foi transferido para o sintetizador GE TRACERIab MXfdg e passado através de uma resina de troca de ânion (cartucho Sep-Pak Wa- ters Accell® Light QMA na forma de carbonato, preparado lavando com 10 mL de 0,5 M de K2CO3 e então enxaguado com 10 mL de água) sob vácuo. Os íons [18F]fluoreto apanhados foram então eluídos do cartucho Sep-Pak e transferidos para o recipiente de reator usando uma solução de eluente que contém K2CO3 (7 mg em 300 pL de água pura), 300 pL de acetonitrilo e 22 mg de Kryptofix 222 (K222: 4,7, 13,16,2 1,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo [8.8.8] hexacosan). As alíquotas de acetonitrilo foram adicionadas e a mistu- ra de reação evaporada para secagem depois de cada adição. (3 vezes: 80 pL, cada tempo). A evaporação foi realizada em 95°C sob fluxo de nitrogênio e vácuo.

Preparação e Formulação de [18F]DPA-714. Precursorde Tosi- lato (7) foi dissolvido em 3 ml_ de acetonitrilo e adicionado ao complexo [18F]- kryptofix-K222 seco. A mistura foi permitida reagir em 85°C durante 5 minu- tos. Ao concluir a mistura de reação foi diluída com água para injeção Wa- ters for Injections BP (WFI BP) e passada através de um cartucho tC-18 Sep-Pak. O recipiente de reator foi enxaguado com WFI e novamente pas- sado através do cartucho tC18 Sep-Pak. O produto radiorrotulado apanhado por tC18 foi enxaguado umas três vezes adicionais com WFI (40mL total). O produto foi então eluído para o cartucho tCI 8 Sep-Pak com EtOH (2mL) e WFI (3mL). A solução resultante foi passada através de um filtro estéril não pirogênico CATHIVEX de 0,22 pm de Milliporo para remover o material parti- culado antes de purificação de HPLC. A mistura bruta foi então injetada so- bre uma coluna de fase reversa semi-preparativa (7,8 χ 300 mm) de 10 pm C-18 HPLC Waters XTerra RP. Usando uma fase móvel de 0,1 M de NH4Ac: CH3CN (pH=10): (60/40, v:v), e com uma taxa de fluxo de 4,0 mL/min, tempo de retenção (tR) de [18F]DPA-714 foi 12,42 min. A fração radioativa que cor- responde [18F]DPA-714 foi coletada e evaporada sob vácuo. O resíduo foi reconstituído em WFI BP (4 ml_) e filtrado por um filtro de 0,22 pm Millipore GV de 13 mm estéril em um frasco evacuado livre de pirogênio estéril. Isto proporcionou [18F]DPA-714 em 10% (n=6) de produção radioquímica corrigi- da não desintegrada.

Controle de qualidade de [18F] DPA-714. Para determinação de radioatividade específica e pureza radioquímica, uma alíquota da solução final de radioatividade e volume conhecido foi injetada sobre uma coluna de HPLC analítica de fase invertida (Waters XTerra Cl 8 5pm (4,6 χ 150 mm). Uma fase móvel de 0,1 M de NH4Ac: CH3CN (pH=10): (50:50; v:v) em uma taxa de fluxo de 2,0 mL/min foi usada para eluir [18F]DPA-714 com um tempo de retenção (tR) de 2,23 min. A área do pico de absorbância de UV medida em 254 nm que corresponde ao produto portador foi medida (integrada) no cromatograma de HPLC e comparada a uma massa relativa de curva padrão para absorbância de UV. A pureza radioquímica e química foi maior do que 98% e a atividade específica foi 1680 GBq/pmol.

EXEMPLO 2 - Afinidade de ligação in vitro de DPA-714

Para estudos de ligação, mitocôndrias foram preparadas como previamente descrito (Trapani G, Franco M, Ricciardi L, e outros, Synthesis and binding affinity of 2-phenylimidazo[l,2-alphajpyridine derivatives for both central and peripheral benzodiazepine receptors. A new series of high-affinity and selective Iigands for the peripheral type. Journal of Medicinal Chemistry. 1997;40:3109-3118 and Campiani G, Nacci V, Fiorini I, e outros, Synthesis, Biological Activity, e SARs of Pyrrolobenzoxazepine Derivatives, a New Class of Specific "Peripheral-Type" Benzodiazepine Receptor Ligands. Jour- nal of Medicinal Chemistry. 1996;39:3435-3450) com modificações menores como descrito abaixo, de rins de ratos Wistar machos mortos por deslocação cervical. Os rins foram homogeneizados em 20 volumes de 50 mM de Tris/HCI congelado, pH 7,4, 0,32 M de sacarose e 1 mM de EDTA (tampão

A), contendo inibidores de protease (160 pg/mL de benzamidina, 200 μg /mL de bacitracina e 20 Mg/mL de inibidor de tripsina de soja) com um pilão de Teflon em um homogenizador de vidro e centrifugados em 600g durante 10 min em 4°C. O sobrenadante resultante foi centrifugado em 10.OOOg durante 10 min em 4°C. O pélete foi então re-suspenso em 20 volumes de tampão A gelado, e centrifugado novamente em 10.OOOg durante 10 min em 4°C. O pélete mitocondrial bruto foi congelado em -20°C até a hora do ensaio ou incubado com 0,6 nM [3H]PK11195 em 50 mM de Tris/HCI, pH 7,4 (tampão

B), com uma faixa de concentrações dos compostos testados (0,1 nM a 10 μΜ) em um volume total de 0,5 mL durante 90 min em 4°C. A incubação foi terminada por diluição para 5 mL com tampão B gelado, seguido imediata- mente por filtração rápida por filtros de fibra de vidro Whatman GF/C. Os filtros foram então lavados (2 5 mL) com tampão Bea quantidade de radioatividade retida nos filtros foi determinada por contador de cintilação líquida Packard 1600 TR em 66% de eficiência. A ligação não específica foi calculada em ca- da caso na presença, respectivamente, de 1 μΜ de PK 11195 não rotulado.

Os valores de IC5o foram determinados e os valores de Ki foram derivados de acordo com a equação de Cheng e Prusoff (Cheng Y-C1 Prusoff WH. Relação entre a inibição constante (Kl) e a concentração de inibidor que causa 50 por cento de inibição (I50) de uma reação enzimática. Biochemical Pharmacology. 1973;22:3099-3108). A concentração de proteína foi calculada pelo método de Lowry e outros (Lcwxy OH, Rosebrough NJ1 Fair AL, Randall RJ. Protein me- asurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 1951; 193:265-275) com soro bovino como padrão.

A afinidade de DPA-714 para o TSPO foi avaliada por ensaio de ligação de membrana usando [3H]PK 11195 como o radioligante e tecido de rim de rato como a fonte de receptor. Para assegurar a seletividade de DPA- 714, sua ligação ao CBR foi avaliada usando [3H]Ro 15-1788 e tecido cere- bral de rato. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Como mostrado na Tabela 1, a afinidade de DPA-714, Ki = 7,0 nM, não foi tão alto quanto DPA- 713, Kj = 4,7 nM, ainda foi comparavelmente mais elevada do que PK 11195, Ki = 9,3 nM no mesmo ensaio. Todos três Iigantes de TSPO, DPA-714, DPA- 713 e PK 11195 exibiram afinidades desprezíveis para o CBR. Tabela 1. Afinidades de Iigantes para TSPO e CBR usando [3HJPK 11195 e [3H]Ro 15-1788 como o radioligante e membranas de rim de rato e tecido cerebral de rato como fonte de receptor respectivamente. Os valores de Iog

D para cada Iigante foram determinados por HPLC.

<table>table see original document page 29</column></row><table> EXEMPLO 3 - Estimulação de produção de neuroesteróide

Neste exemplo, DPA-714 foi avaliado quanto a sua capacidade de aumentar síntese de pregnenolona usando um ensaio esteroidogênico bem desenvolvido (Selleri S1 Bruni F, Costagli C, e outros, 2-Arylpyrazol[l ,5- a]pyrimidin-3-yl acetamides. New potent and selective peripheral benzodia- zepine receptor ligands. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2001;9:2661- 2671).

Os resultados do ensaio de pregnenolona (mostrados na Figura 1) demonstram que DPA-714 estimula produção de esteróide com uma po- tência notavelmente maior comparada a DPA-713 e os Iigantes de PBR am- plamente usados, PKI 1195 e Ro5-4864.

Cultura de Célula

As células C6 de glioma de rato foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de FBS, 2 mM de l- glutamina, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. As culturas foram mantidas em uma atmosfera umedecida de 5% de C02/95% de ar em 37°C.

Ensaio de Biossíntese Esteróide

As células C6 foram semeadas em placas de 24 cavidades a uma densidade de ~1 χ 106 células/cavidade em um volume final de 1 ml. Antes de medição de produção de pregnenolona as células foram lavadas três vezes com um meio de sais simples que consiste em 140 nM de NaCI1 5 mM de KCI, 1,8 mM de CaCI2, 1 mM de MgSO4, 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES/NaOH, pH 7,4, mais 0,1% de BSA. Durante as experiências, as células foram incubadas com este meio de sais simples em uma incubadora de ar a 37°C. Para medir a pregnenolona segregada no meio, seu metabo- lismo adicional foi bloqueado pela adição de trilostano (25 μΜ) e SU 10603 (10 μΜ) (inibidores de 3P-hidroxiesteróide desidrogenase e 17a-hidroxilase, respectivamente) ao meio de sais simples, como previamente descrito (Campiani B5 Nacci V, Fiorini I, e outros, Synthesis, Biological, Actwily and SARs of Pyrrolobenzoxazepine Derivatives, a New Class of Specific "Peri- pheral-Type" Benzodiazepine Receptor Ligands, Journal of Medicinal Chemistry 1996; 39:3435-3450). A adição dos novos compostos e de PK 11195, Ro 5-4864, ou clonazepam às células C6 foi feita pela mudança completa do meio de sais simples para um meio contendo a concentração apropriada (40 μΜ) do composto. A concentração final de etanol foi constan- te para todas as cavidades dentro de cada experiência e não excedeu 0,5% (v/v), uma concentração que em si própria não teve nenhum efeito em pro- dução esteróide. No término do período de incubação (duas horas) o meio de célula foi retido e centrifugado a 1500g durante 10 min. A quantidade de pregnenolona segregada no meio foi quantificada através de rádio imunoen- saio (RIA), usando um anticorpo obtido de ICN Inc. Biochemical, CA, E.U.A., sob condições recomendadas pelo fornecedor. A concentração dè proteína de célula foi medida de acordo com um método previamente descrito (Lowry OH, Rosenbrough NJ1 Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193; 265-275).

Os resultados são mostrados na Figura 1. Como mostrado na Figura 1, DPA-714 estimulou síntese de pregnenolona em níveis de 80% acima da linha de base, exibindo potência significativamente maior do que PK 11195 e Ro 5-4864. DPA-713 não mostrou nenhum efeito em esteroido- gênese no mesmo ensaio.

EXEMPLO 4 - Estudos de Roedor de f18F!DPA-714 ex Vivo

Ratos Wistar machos adulto pesando 300-320 g (Janvier, Le Genest-St-lsle, França) foram usados para experiências ex vivo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o European Community Council Directive 86/609/EEC para o cuidado de animais de laboratório. Os animais foram mantidos em um ciclo de luz/escuridão de 12-hora (tempera- tura 22,4 + 0,5°C; higrometria 40,3 + 7,2%) e água e comida ficaram livre- mente disponíveis.

Lesões de Ácido Quinolônico (QA): Ratos foram anestesiados com isoflurano (4%, 500 mL/min), colocados em um aparelho estereotáxico (Stoelting, Phymep, Paris, França) e foram mantidos sob isoflurano 2% (500 mL/min) durante a cirurgia. O crânio foi exposto e foram feitos buracos pe- quenos com uso de uma broca dental. Os animais foram unilateralmente injetados no estriado direito nas seguintes coordenadas: A, 0,7; L1 -3; P, -5,5 mm de bregma (Paxinos e Watson, 1986). Uma cânula (25 gauge, Hamilton, Massy, França) foi inserida e uma solução QA (300 nmol em 2 μΙ_ de tampão de fosfato, pH 7,4) foi infundida a uma taxa de fluxo de 0,5 μί./ιτπη. A seringa foi deixada no lugar durante 4 minutos antes de ser removida para evitar contrafluxo de QA. O osso foi preenchido com cera e o couro cabeludo foi então suturado.

Estudo de Biodistribuição: Os estudos de biodistribuição ex vivo foram realizados com [18F]DPA-714 seis dias depois da lesão estriatal unila- teral com QA. Os ratos foram injetados pela veia do pênis com 20-37 MBq de [18F]DPA-714 em uma mistura de água e EtOH (85/15) ou seguinte uma pré-injeção ou de PK 11195 (n = 5, 5mg/kg), DPA-714 (n = 2, 1 mg/kg) ou DPA-713 (n = 2; 1 mg/kg) 15 minutos antes do radioligante. Os ratos que foram somente injetados com o radioligante ([18F]DPA-714) e nenhuma pré- injeção foram o grupo de controle (n = 6). Os animais foram sacrificados 60 min depois de injeção de [18F]DPA-714. As amostras de tecido periférico, isto é, sangue, músculo, osso, fígado, coração, adrenal e várias áreas do cérebro (cerebelo, estriado direito e esquerdo, córtex frontal direito e es- querdo, hipocampo direito e esquerdo) foram removidas, pesadas e sua ra- dioatividade medida usando um (a completer Denis). Para tecido periférico, os resultados foram expressos como a relação (% de ID/g de tecido)/(% de ID/g de sangue) + SEM. Para cérebro, resultados foram expressos como a relação (% de ID/g de região cerebral)/(% de ID/g de cerebelo) + SEM. O teste t Student foi realizado quando o número de dados foi > 5. A signifi- cância estatística foi considerada para ρ < 0,05. Resultados

Biodistribuição Periférica: Figura 2 mostra a distribuição periféri- ca de [18F]DPA-714 em cada um dos quatro grupos de rato lesionado QA; controle (injetado com radioligante somente) e três grupos de pré-tratamento (PK 11195, DPA-713 e DPA-714). Os resultados do grupo de controle mos- tram que o acúmulo mais elevado de [18F]DPA-714 ficou nos adrenais (71,62+ 35,06) e coração (59,26+ 29,06), considerando que houve somente acúmulo mínimo no osso (6,30+ 0,97), fígado (3,36+ 0,16) e músculo (2,11 + 1,13). Os ratos pré-tratados com PK 11195 (5 mg/kg) demonstraram inibição significante de captação de radioligante no coração, osso e fígado, porém não nos adrenais e músculo. Em contraste, o pré-tratamento com DPA-714 (1 mg/kg) ou DPA-713 (1 mg/kg) foi capaz de bloquear o acúmulo de [FJDPA-714 em todos os tecidos periféricos.

Biodistribuição Cerebral: Figura 3 mostra a distribuição cerebral de [18F]DPA-714 em cada um dos quatro grupos de rato Iesionado QA. Os resultados do grupo de controle, demonstram um aumento estatisticamente significante em captação de [18F]DPA-714 no lado direito (Iesionado) do es- friado (4,81+ 0,47 vs 0,61+0,14; ρ < 0,05) e córtex frontal (1,92 +0,86 vs 0,68+0,13, ρ < 0,05) comparado à sua contraparte não Iesionada correspon- dente. Isto não foi observado no hipocampo (0,74+0,13 vs 0,77+0,29). No estriado direito e córtex frontal, o acúmulo de [18F]DPA-714 foi diminuído significantemente por pré-injeção de PK 11195 (1,90+0,59 e 1,18+0,16, res- pectivamente, ρ < 0,05). Uma diminuição visível também foi vista nestas mesmas regiões seguinte pré-injeção de DPA-714 (2,00+0,23 e 1,28+0,17, respectivamente) ou DPA-713 (1,08+0,08 e 1,06+0,05, respectivamente). De forma interessante, houve um aumento de acúmulo de [18F]DPA-714 no gru- po de pré-tratamento de PK 11195 comparado com controle, no estriado es- querdo (1,25+0,48), córtex frontal esquerdo (0,99+0,04), hipocampo direito (1,19+0,14) e hipocampo esquerdo (1,09+0,10). Uma tendência semelhante foi observada após pré-injeção de DPA-714 como também DPA-713.

EXEMPLO 5 - Estudos PET de Babuíno de [18F1DPA-714 In Vivo

Um babuíno Papio hamadryas macho normal de 13 anos e pe- sando 23,1 kg foi selecionado para varredura PET. O babuíno foi mantido e controlado de acordo com o código de National Health and Medicai Resear- ch Council (NHMRC) de prática para o cuidado e uso de primatas não hu- manos para propósitos científicos. A aplicação de projeto foi aprovada pelo Sydney South West Area Health Service (SSWAHS) Animal Ethics Commit- tee. As doses de radioligante injetadas foram 100 MBq para [18F]DPA-714.

Todos os dados PET foram adquiridos usando um escâner PET- CT Siemens Biograph LSO no Departamento de PET e Medicina Nuclear em Royal Prince Alfred Hospital, Austrália. Este dispositivo de modalidade dual tem um escâner PET completamente 3D com 24 anéis de cristal e um escâ- ner de CT de porção dual no mesmo canteiro. Ele produz uma resolução espacial PET reconstruída de 6,3 mm de largura completa em metade má- xima (FWHM) no centro do campo de visão. O babuíno era inicialmente a- nestesiado com cetamina (8 mg/kg, im). Anestesia foi mantida com o uso de uma infusão iv de cetamina (Parnell Laboratory, Austrália) em salina em uma taxa de dose de 0,2 mg de cetamina/kg/min. O babuíno também recebeu MgSO4 (2 mL iv) dado durante meia hora mais atropina (1 mg im) mais ma- xalon (5 mg im). A cabeça do babuíno foi imobilizada com fita plástica para minimizar artefatos de movimento. Uma varredura de CT da cabeça foi con- cluída antes da injeção de radioligante. A aquisição dos dados de PET em modo de lista foi iniciada antes da injeção de radioligante e continuou duran- te um período de 60 min. O estudo de bloqueio envolveu pré-tratamento com PK 11195 (1,5 mg/kg) 5 minutos antes de injeção de radioligante conside- rando que no estudo de deslocamento, DPA-714 frio (1 mg/kg) foi adminis- trado em 20 minutos pós-injeção de [18F]DPA-714. Na conclusão de cada estudo os dados de modo de lista foram classificados em uma varredura di- nâmica que compreende 54 estruturas (20 χ 30 s, 30 χ 60 s e 4 χ 300 s). Os sinogramas PET 3-D dinâmicos foram rearmazenados usando Fourier Re- binning (FORE) e reconstruídos com projeção por trás filtrada e correções com base em dados de CT para dispersão e atenuação de fóton em 47 por- ções transaxiais, cada compreendendo 128 χ 128 voxéis. As dimensões de voxel reconstruídas foram 0,206 χ 0,206 χ 0,337 cm. A captação de radioli- gante foi convertida a unidades de percentual de dose injetada por volume de tecido cerebral (% de dose/mL) e plotado contra tempo. Um algoritmo de registro 3D automatizado foi usado para corregistrar as duas varreduras re- construídas antes de definição de ROI (Eberl S, Kanno I, Fulton RR, Ryan A, Hutton BF, Fulham MJ. 1996. Automated interstudy image registration tech- nique for SPECT and PET. JNucI Med 37(1): 137-145).

As curvas de atividade de tempo corrigidas de desintegração representando a variação em concentração de Iigante vs. tempo foram cons- truídas de porções selecionadas para regiões de interesse sobre o tálamo, cerebelo, estriado, córtex, crânio e cérebro inteiro. Após a aquisição de mo- do de lista, uma varredura PET-CT de tamanho natural foi realizada, 2 minu- tos em cada uma das seis posições de leito, para determinar outros sítios de captação de radioligante. Resultados

Um estudo de linha de base foi realizado no qual o imageamento cerebral PET dinâmico começou alguns minutos precedendo administração i.v. de [18F]DPA-714 (100 MBq em 2 ml de salina, atividade específica 270 GBq/pmol) e foi terminado 60 minutos pós-injeção. Isto foi seguido por aqui- sição de tamanho natural durante 2 minutos em cada das seis posições de leito. Estas imagens de adição PET de porções cerebrais transaxiais obtidas no estudo de linha de base demonstrou que [18F]DPA-714 é capaz de pene- trar a barreira hematoencefálica com acúmulo considerável no cérebro. Ne- nhuma captação foi observada no crânio de babuíno.

Para determinar a especificidade de ligação de [1SF]DPA-714, um estudo de bloqueio foi realizado, envolvendo pré-tratamento com Iigante de TSPO PKI 1195 (1,5 mg/kg). As imagens de adição PET de porções ce- rebrais transaxiais obtidas neste estudo demonstraram que PKI 1195 efeti- vamente bloqueou a captação de [18F]DPA-714 no cérebro. Ultimamente, um estudo de deslocamento, no qual DPA-714 frio (1 mg/kg) foi administrado 20 minutos pós injeção de [18F]DPA-714, foi administrado para avaliar a rever- sabilidade de ligação de radioligante.

Figura 4 mostra as curvas de atividade de tempo (TAC) repre- sentando a captação de [18F]DPA-714 no cérebro de babuíno inteiro em ca- da um dos três estudos PET (estudo de linha de base, o estudo de bloqueio e o estudo de deslocamento). No estudo de linha de base, [18F]DPA-714 al- cançou uma captação máxima dentro de dez minutos e permaneceu aproxi- madamente no mesmo nível de captação para os seguintes 50 minutos. O estudo de deslocamento pareceu análogo ao estudo de linha de base du- rante os primeiros 20 minutos, porém, após a injeção de DPA-714 frio, a cur- va subiu em um pico agudo seguido por solapamento completo do radioli- gante. Em contraste, pré-tratamento com o PK 11195 de Iigante específico de TSPO, resultou em um aumento inicial em captação de [18F]DPA-714, seguido por declínio rápido a nível de solapamento, idêntico àquele visto no estudo de deslocamento.

As imagens de tamanho natural também foram diretamente adqui- ridas seguinte o imageamento cerebral para investigar outros locais de capta- ção de radioligante. Estas demonstraram a captação alta de [18F]DPA-714 no coração, adrenais e glândulas salivais. A injeção de DPA-714 frio em 20 minu- tos após administração de radioligante levou ao deslocamento completo de [18F]DPA-714 de ligação nestas regiões periféricas (dados não mostrados). EXEMPLO 6 - r18F!DPA-714 como um tracador PET para TSPO: Uma com- paração com f11C1PK11195 em um modelo de rato e encefalite de HSV

Muitas doenças neurológicas, incluindo doença de Parkinson e encefalite de herpes simples (HSE), estão associadas com neuroinflamação.

A expressão do receptor de benzodiazepina periférico (PBR) é aumentada durante neuroinflamação e pode ser visualizada através de tomografia por emissão de pósitrons (PET) com [11C]PKI 1195. Porém, [11C]PKI 1195 mos- tra baixa captação cerebral e ligação não específica elevada e pode não ser 20 sensível bastante para visualizar inflamação moderada. Neste estudo, [18F]DPA-714 foram avaliados em um modelo de rato de HSE e comparados com [11CJPKI 1195 no mesmo modelo.

Experimental: [18F]DPA-714 foi preparado reagindo o precursor de tosilato correspondente com K 18F/kryptofix. A estabilidade de [18FjDPA- 714 foi testada por TLC. Os ratos de Wistar machos foram intranasalmente inoculados com o vírus do herpes simples tipo-1 (107 PFU em 1001 PBS) ou PBS (controle). Dentro de uma semana seguinte à inoculação, os vírus de replicação migraram no cérebro e induziram neuroinflamação. No dia 6 ou 7 após a inoculação os ratos receberam uma injeção i.v. de [18F]DPA-714 (559 MBq) ou [11CjPKI 1195 (7822 MBq) e varreduras PET dinâmicas (MicroPET Focus 220) foram realizadas respectivamente durante 2 h e 1 h, seguido por biodistribuição ex vivo. Resultados e Descrições: [18F]DPA-714 foi obtido em 20+5% de produção radioquímica, com uma atividade específica de 10428 MBq/nmol e uma pureza radioquímica >99%. [F]DPA-714 in vivo, foi conver- tido lentamente em metabólitos mais polares, com 78+1% da radioatividade em plasma de rato que consiste no composto origem em duas horas pós- injeção traçadora. As imagens de PET de [18F] DPA-714 mostraram uma baixa captação de traçador em ratos de controle (n=3), que foi significante- mente mais baixa do que captação de [11C]PKI 1195 (n=5) a 1 h (p=0,01), e uma liberação de traçador lenta do cérebro (T1/2>100 min.). A captação de [18F]DPA-714 em ratos HSE foi aumentada (90-150%) em áreas cerebrais olfatórias e retrógradas onde HSV-I de acumula. Nestas áreas, a captação de [11C]PKI 1195 não foi aumentada significantemente.

Conclusão: Estes resultados demonstram que [18F]DPA-714 é um traçador útil para visualizar neuroinflamação, e é mais sensível do que [11C]PKI 1195 por causa de um contraste melhor entre áreas inflamadas e não inflamadas.

EXEMPLO 7 - Estudo de Toxicidade para DPA-714

Neste estudo, a possível toxicidade de DPA-714 foi avaliada após uma única administração pela rotina intravenosa no rato.

O estudo envolveu 2 grupos de 20 ratos Sprague-Dawley SPF (cada um de 5 machos e 5 fêmeas), 7 semanas de idade e pesando entre 193,1 g e 215 g para machos e entre 160,6 g e 180,1 g para fêmeas no dia de aleatorização. Os animais foram comprados de Charles River Laboratori- es França (Domaine des Oncins - 69592 L'Arbresle Cedex, França).

Os grupos foram como segue:

- Grupo 1: dosado com o veículo (isto é, 0,9% de NaCI/etanol (9/1, (peso/peso).

- Grupo 2: dosado com DPA-714 em 5 mL/kg

O item de teste DPA-714 diluiu em 1/10 em seu veículo (isto é, 0,9% de NaCI/etanol 9/1, (v/v)) ou o veículo foi administrado depois de filtra- ção com filtro de 0,2 pm a animais através de rotina intravenosa como um bolo durante aproximadamente 30 segundos em um volume de 5 mL/kg. Os animais foram pesados no dia de aleatorizalção, em D7, D 14 e D 15 (dia de necropsia).

As observações gerais foram realizadas em D1, 60 minutos + 30 minutos depois de dosagem, novamente entre 3 e 4 horas pós-dose e então uma vez por dia durante 14 dias. Os testes funcionais e neurocomportamen- tais também foram avaliados em D1, 60 minutos + 30 minutos após a dosa- gem e então no D7 e D 14. A mortalidade foi registrada duas vezes por dia durante 14 dias. Todos os animais que sobreviveram no final do período de 14 dias foram submetidos à necropsia bruta.

Sob as condições experimentais adotadas, os animais dosados com o veículo (isto é 0,9% de NaCl/etanol 9/1, v/v)) não exibiram qualquer sinal significante e o ganho de peso corpóreo foi normal. Nenhuma anorma- lidade atribuída ao veículo foi notada em órgãos examinados na necropsia.

DPA-714 diluído em 1/10 no veículo (isto é, concentração final de 0,05 mg/mL) e administrado pela rotina intravenosa em 5 mL/kg não in- duziu nenhuma mortalidade. Nenhum efeito em ganho de peso corpóreo de machos e fêmeas foi visto quando comparado com o grupo de controle. Ne- nhum sinal clínico relevante foi observado em animais aos quais foi dado DPA-714 diluído em 1/10 no veículo pela rotina intravenosa em 5 mL/kg. Nenhuma lesão total foi observada na necropsia.

Sob as condições experimentais adotadas, DPA-714 (grupo N0 140306) administrado uma vez pela rotina intravenosa no rato Sprague- Dawley em 5 mL/kg não induz nenhum sinal de toxicidade.

Então, o LD50 de DPA-714 (batelada N0 140306) é mais elevado do que 5 mL/kg em rato Sprague-Dawley macho e fêmea quando adminis- trado pela rotina intravenosa.

Comentários

Os estudos de ligação in vitro usando membranas de rim de rato e [3H]PK 11195 (Exemplo 2) especificamente demonstraram que DPA-714 liga o TSPO com afinidade elevada. Os estudos de biodistribuição usando microPET em ambos ratos normais e Iesionados (Exemplo 4) mostraram que [18F]DPA-714 é um radioligante altamente sensível e preciso para detectar regiões de expressão de TSPO alterada. Estes estudos de rato também pro- varam que [18F]DPA-714 tem cinéticos favoráveis e estabilidade in vivo.

Imageamento de PET em cérebro de babuíno normal (Exemplo 5) reafirmou os resultados observados nos estudos de rato. Os resultados do Exemplo 5 mostram que [18F]DPA-714 especificamente e seletivamente se liga ao TSPO e não mostram nenhuma dependência de espécies em ligação de TSPO. Uma característica nova de DPA-714 é sua atividade funcional acentuada no ensaio esteroidogênico de pregnenolona (Exemplo 3). Na rea- lidade, DPA-714 é duas vezes mais ativo na síntese de neuroesteróide esti- mulante do que PK 11195, o Iigante de TSPO mais amplamente usado, no mesmo ensaio.

Além disso, DPA-714 tem uma afinidade de ligação mais eleva- da (Ki = 7,0 nM) comparada com PK 11195 (Ki =9,3 nM) (Exemplo 2). Esta afinidade de ligação mais elevada, junto com os cinética in vivo superiores e lipofilicidade mais baixa de DPA-714, significa que [18F]DPA-714 pode me- lhor rotular o TSPO.

[18F]DPA-714 pode, então, ser usado como um marcador in vivo preciso de ativação microglial. Mais especificamente, [18F]DPA-714 pode ser usado junto com PET como um meio de detectar eventos neuropatológicos iniciais em várias distúrbios neurodegenerativos. Este radioligante também pode ser usado como uma ferramenta para estudar a progressão da doença e efetividade de tratamento. Os tipos de doenças para que [18F]DPA-714 possa ser usado como uma ferramenta para estudar progressão de doença e efetividade de tratamento incluem a doença de Alzheimer (DC), doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington, esclerose múltipla (MS), atrofia multissistêmica (MSA), epilepsia, encefalopatia, acidente vascular cerebral e tumores cerebrais. A ligação específica elevada e seletividade elevada de [18F]DPA-714 ao longo de lado de seus cinéticos favoráveis in vivo tornam isto adequado para esta aplicação.

Aqueles versados na técnica apreciarão que a invenção descrita aqui seja suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especifi- camente descritas. Todas tais variações e modificações serão consideradas dentro do escopo da invenção a natureza da qual será determinada a partir da descrição precedente.

Nas reivindicações que seguem e na descrição precedente da invenção, exceto onde o contexto requer de outro modo devido ao idioma expresso ou implicação necessária, a palavra "compreender" ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo" é usado em um sentido inclusi- vo, isto é, para especificar a presença das características declaradas, porém não impedir a presença ou adição de características adicionais em várias modalidades da invenção.

Claims (26)

1. Composto da fórmula (I) <formula>formula see original document page 41</formula> em que: R é H, halo, alquila opcionalmente substituída com halo, ou al- cóxi opcionalmente substituída com halo; R1, R2 e R3 são cada independentemente H ou um grupo hidro- fóbico; e R4 e R5 são cada independentemente alquila opcionalmente substituída com halo, ou alcóxi opcionalmente substituído com halo, radiorro- tulado com um radioisótopo selecionado de 18F, 123I1 76Br, 124I e 75Br, ou um sal destes.

2. Composto radiorrotulado de acordo com a reivindicação 1, ou um sal deste, em que na fórmula (I), R é C1-6 alquila opcionalmente substitu- ída com halo ou C1-6 alcóxi opcionalmente substituído com halo.

3. Composto radiorrotulado de acordo com a reivindicação 1 ou -2, ou um sal deste, em que na fórmula (I), R1, R2 e R3 são cada independen- temente selecionado de H, C1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, arila opcionalmente substituída com halo, NHCi^ alquila opcionalmente substi-tuída com halo, OC1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, SC 1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, COOR6 onde R6 é C1-6 alquila opcionalmente substituída com halo, (CH2)nOR6 onde R6 é C1-6alquila opcionalmente substituída com halo, e η é um número inteiro, e poliéteres opcionalmente substituídos com halo.

4. Composto radiorrotulado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um sal deste, em que na fórmula (I), R4 e R5 são independentemente cada selecionado de C1-6 alquila opcionalmente substi- tuído com halo e C1-6 alcóxi opcionalmente substituído com halo.

5. Composição farmacêutica que compreende um composto ra- diorrotulado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável, e um portador farmaceuticamente aceitável.

6. Método de imageamento de proteína translocadora (18 kDa) (TSPO) em um paciente, compreendendo administrar ao paciente um com- posto da fórmula (I), como definido na reivindicação 1, radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F, 1231, 76Br, 124I e 75Br, ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste, e obtendo uma imagem do local do radioisóto- po no paciente.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o composto da fórmula (I) é radiorrotulado com F, Br, eu ou 75Br e a imagem é obtida através de imageamento de tomografia por emissões de pósitrons (PET).

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o composto da fórmula (I) é radiorrotulado com 123I e a imagem é obtida através de ima- geamento SPECT.

9. Método para diagnosticar um distúrbio neurodegenerativo em um paciente, compreendendo administrar ao paciente um composto da fór- mula (I) de acordo com a reivindicação 1, radiorrotulado com um radioisóto- po selecionado de 18F, 123I, 76Br, 124I e 75Br, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e obter uma imagem do local do radioisótopo no paciente para avaliar a extensão de ligação de TSPO do composto ou sal do mesmo no parênquima cerebral do paciente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, a doen- ça de Huntington, esclerose múltipla, atrofia multissistêmica, epilepsia, ence- falopatia, acidente vascular cerebral ou tumor cerebral.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que o paciente é um humano.

12. Uso de um composto da fórmula (I)1 como definido na reivin- dicação 1, radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 18F1 123I1 76Br1 -124I e 75Br1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, na fabricação de um medicamento para imageamento de proteína translocadora (18 kDa) em um paciente.

13. Composto da fórmula (II) <formula>formula see original document page 43</formula> em que: R é alquila opcionalmente substituída com halo, ou alcóxi opcio- nalmente substituído com halo; R1 e R3 são cada independentemente H1 etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila, sec-pentila, 1,2- dimetilpropila, em que um dentre, R1 R1, R2, R3, R4 ou R5 é substituído com um grupo de saída que pode permitir que uma reação de substituição nucleofílica alifática ocorra no grupo de saída.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, ou um sal des- te, em que R é OCH2CH2F.

15. Composição farmacêutica que compreende um composto, como definido na reivindicação 13 ou 14, ou um sal farmaceuticamente acei- tável deste e um portador farmaceuticamente aceitável.

16. Método para tratar um distúrbio neurodegenerativo, inflama- ção ou ansiedade em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto, como definido na reivindicação 13 ou 14, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o pacien- te é um humano.

18. Uso de um composto da fórmula (II) como definido na reivin- dicação 13, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio neurodegenerativo, inflamação ou ansiedade.

19. Composto de fórmula (I), como definido na reivindicação 1, rotulado com 18F, ou um sal do mesmo, formado a partir de um composto da seguinte fórmula <formula>formula see original document page 44</formula> em que R é H, halogênio, alquila, opcionalmente substituída com halogênio ou alcóxi, opcionalmente substituído com halogênio R1, R2, R3 são cada um independentemente, H ou um grupo hidrofóbico, e R4 e R5 são, cada um, independentemente substituído com halo ou alcóxi, opcionalmente substituí- do com halogênio, ou um sal do mesmo; em que um de R, R1, R2, R3, R4 e R5 é substituído com um grupo de saída que permite uma reação de substi- tuição nucleofílica alifática aconteça em um grupo de saída

20. Composto da seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 44</formula> em que R é Η, halogênio, alquila opcionalmente substituída com halogê- nio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halogênio; R1, R2 e R3 são cada um independentemente H ou um grupo hidrofóbico; e R4 e R5 são, cada um independentemente alquila, opcionalmente substituída com halogênio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halo- gênio, ou um sal do mesmo; em que um de R, Ri, R2, R3, R4 e R5 é substituído com um grupo de saída que pode permitir que uma reação de substituição nucleofílica alifática acon- teça em um grupo de saída

21. Composto de acordo com a reivindicação 20, ou um sal do mesmo, em que o grupo de saída, é selecionado a partir de tosilato, mesiato, Bre I.

22. Composto de acordo com a reivindicação 21, ou um sal des- te, onde o grupo de saída é tosilato.

23. Composto, da seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 45</formula> ou um sal deste.

24. Composto da fórmula (I) como definido na reivindicação 1, radiorrotulado com um radioisótopo selecionado de 123I, 76Br1 124I e 75Br, ou um sal deste, formado de um composto da seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 46</formula> em que R é Η, halogênio, alquila opcionalmente substituída com halogê- nio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halogênio; R1, R2 e R3 são cada um independentemente, é H ou um grupo hidrofóbico; e R4 e R5 são, cada um independentemente alquila, opcionalmente substituída com halogênio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halo- gênio, ou um sal do mesmo; em que um de R, R1, R2, R3, R4 e R5 é substituído com um grupo de saída que pode permitir que uma reação de substituição eletrofílica aconteça em um grupo de saída.

25. Composto da seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 46</formula> em que R é H, halogênio, alquila opcionalmente substituída com halogê- nio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halogênio; R1, R2 e R3 são cada um independentemente H ou um grupo hidrofóbico; e R4 e R5 são, cada um independentemente alquila, opcionalmente substituída com halogênio, ou alcóxi, opcionalmente substituído com halo- gênio, ou um sal do mesmo; em que um de R, R1, R2, R3, R4 e R5 é substituído com um grupo de saída que pode permitir que uma reação de substituição eletrofílica aconteça com o grupo de saída

26. Composto de acordo com a reivindicação 25, em que o gru- po de saída é selecionado de estanila, silila e halogênio.