BRPI0617889A2 - procedimento e dispositivo de análise in vitro de mrna de genes envolvidos em neoplasias hematológicas - Google Patents

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Abstract

<B>PROCEDIMENTO E DISPOSITIVO DE ANáLISE IN VITRO DE mRNA DE GENES ENVOLVIDOS EM NEOPLASIAS HEMATOLóGICAS.<D> Procedimento e dispositivo de análise in vitro de mRNA de genes envolvidos em neoplasias hematológicas. O dispositivo, composto de sondas que hibrideza de forma específica com genes envolvidos em neoplasias hematológicas, criadas para que seu comportamento na hibridização seja similar, permite a avaliação do nível de mRNA em amostras biológicas extraídas de indivíduos com suspeita de que possam sofrer de uma neoplasia hematológica e facilita a comparação entre as diferentes amostras e seu agrupamento por semelhança nos padrões de expressão dos genes, especialmente quando as sondas estão dispostas em forma de microarray. A aplicação do método da invenção para obter e processar dados de diferenças na expressão gónica procedentes do dispositivo da invenção permite a identificação de genes significativos para distinguir amostras associadas a neoplasias hematológicas, facilita o diagnóstico de neoplasias como a LLC e permite inclusive prognosticar a evolução da mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCEDIMENTOE DISPOSITIVO DE ANÁLISE IN VITRO DE mRNA DE GENES ENVOLVIDOSEM NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS".
Campo da Invenção
A invenção refere-se ao campo técnico-industrial de diagnósticoin vitro, extracorporal, de amostras biológicas, por meio de técnicas de en-genharia genética, aplicado ao diagnóstico de tipos concretos de neoplasiasa partir de seus (hospedeiros) padrões de expressão gênica e/ou ao prog-nóstico de sua evolução. Mais especialmente, a invenção refere-se à identi-ficação de neoplasias originadas a partir de células hematopoiéticas a partirda avaliação dos níveis de RNA mensageiros de genes significativos emamostras biológicas como podem ser as amostras de sangue periférico, dopor meio do uso microarrays. Com isso é possível identificar amostras cor-respondentes de pacientes que sofrem de LLC, permitindo o diagnóstico damesma e, além disso, é possível classificar amostras de pacientes que so-frem de LLC em amostras que pertencem a pacientes nos quais a LLC vaipermanecer estável ou nos quais ela vai progredir, permitindo o prognósticoda futura evolução destes pacientes.
Fundamentos da Invenção
Diariamente, o corpo humano produz bilhões novas célulasbrancas, vermelhas e plaquetas que substituem as células hematopoiéticasque são perdidas como conseqüência de um processo normal de renova-ção, doença ou trauma. O processo organizado de produção de célulashematopoiéticas e homeostasia é conhecido pelo nome de hematopoiese(Weissman IL et ai, 2000; Leung AYH et ai, 2005).
No homem a hematopoiese fica confinada na medula óssea(M.O.) da maior parte dos ossos, e de forma gradual, com a idade, é substi-tuída por gordura de modo que, no adulto, 70% da medula óssea fica locali-zada na pélvis, nas vértebras e no esterno (Bernard et al., 1976).
Todas as células maduras do sangue são geradas a partir deum número baixo relativo de células hematopoiéticas conhecidas como célu-las hematopoiéticas mãe ou "tronco". A célula mãe hematopoiética possuiduas características que são a pluripotencialidade ou capacidade de dar origema diferentes linhagens celulares hematopoiéticas e a auto-renovação ou pro-priedade de perpetuar-se gerando células iguais a si mesma (Weissman ILet al., 2000). Esta capacidade é essencial para a manutenção da hemato-poiese ao longo da vida já que, sem a auto-renovação, a reserva de célulasmãe disponível esgotar-se-ia rapidamente. As células mãe hematopoiéticassão capazes de gerar diferentes tipos celulares hematopoiéticos madurosatravés de uma série de progenitores e precursores intermediários. Estesprogenitores e precursores sofrem uma seqüência ordenada de eventos queos transformam em células maduras. Este processo é conhecido pelo nomede diferenciação (Lee MF et ai, 2005). A diferenciação das células hemato-poiéticas envolve mudanças que afetam entre outros o tamanho e a formada célula, a expressão de genes, de proteínas, resposta a sinais e localiza-ção das células.
As células terminalmente diferenciadas perderam sua capacida-de de divisão e sofrem apoptose depois de um período de tempo que variade horas para neutrófilos a décadas para alguns linfócitos. Este fato comque a M.O. garanta constantemente a reposição celular (Datta SR et ai,1999).
O processo de hematopoiese compreende uma complexa inte-ração entre acontecimentos genéticos intrínsecos das células hematopoiéti-cas e o ambiente em que se encontram. É esta interação que determina seos precursores e progenitores hematopoiéticos devem manter-se quiescen-tes, proliferar, diferenciar-se em uma ou outra linhagem ou entrar em apop-tose (Domen J et ai, 1999). Todos os mecanismos genéticos e ambientaisque controlam a produção de células sangüíneas funcionam alterando o e-quilíbrio relativo destes processos celulares fundamentais.
Os fatores ambientais e genéticos são críticos na hematopoie-se. Assim por exemplo a expressão de genes pertencentes às famílias Rb(Bergh et ai, 1999), ciclinas (Delia Ragione F et al., 1997) ou Hox (Magli MCet ai, 1997) regulam a proliferação de células hematopoiéticas nos primei-ros estágios de diferenciação. Os genes da família de bcl-2 regulam a a-poptose em células hematopoiéticas (0'Gorman DM et al., 2001). Umagrande variedade de genes entre os quais encontram-se C/EBP (Tenen DGet al., 1997), Pax5 (Nutt SL et al., 1999) e Ikaros (Nichogiannopoulou A. etal., 1998) parecem estar envolvidos na diferenciação hematopoiética e com-prometimento da linhagem.
Neoplasias hematolóqicas
As neoplasias hematológicas são processos malignos que afe-tam qualquer dos tipos celulares envolvidos no sistema hematopoiético.Como conseqüência desta transformação, a célula é bloqueada em um es-tágio de diferenciação e começa a acumular-se devido a uma proliferaçãodescontrolada, a uma falha do mecanismo apoptótico ou a um bloqueio deseu processo de diferenciação.
A transformação maligna das células hematopoiéticas duranteos diferentes estágios que elas atravessam em sua diferenciação para célu-Ias maduras dá origem a um grande número de neoplasias distintas (Gutt-macher AE et al., 2003). Este tipo de neoplasias é portanto um grupo muitoheterogêneo de doenças que têm em comum somente a origem hematopoi-ética do tipo celular transformado.
Classificação das neoplasias hematolóqicas
De um modo geral poderiam ser estabelecidos dois grandesgrupos: as neoplasias linfóides que afetam os diferentes tipos celulares egraus de maturação que moldam a linhagem linfóide tanto B como T e outrogrande grupo constituído pelas neoplasias mielóides que afetam diversostipos celulares da linhagem mielóide. No entanto, esta classificação simplis-ta está atualmente mais desenvolvida, tal como detalhado mais adiante.
Do ponto de vista clínico, classicamente as Ieucemias eram arbi-trariamente diferenciadas dos linfomas, as Ieucemias sendo definidas comoas neoplasias que afetam a medula óssea e têm expressão periférica, isto é,circulação de células anômalas no sangue, e os linfomas como as neoplasi-as que ficam localizadas nos gânglios linfáticos ou outros tecidos linfóides eque carecem, pelo menos inicialmente, de comportamento leucêmico. Nocaso das leucemias, os processos agudos foram diferenciados dos proces-sos crônicos inicialmente pelas características morfocitológicas das célulasproliferativas (imaturas e atípicas no primeiro caso e mais diferenciadas nosegundo) e pelas manifestações clínicas da doença. Atualmente o conhe-cimento dos marcadores imunológicos e das alterações genéticas que afe-tam as células hematopoiéticas ajudam a diferenciar os diferentes proces-sos de formas mais precisa.
Hoje em dia sabe-se que as neoplasias hematológicas, assimcomo ocorrem em outros tipos de câncer, têm origem multigênica. A granderevolução tecnológica produzida nos últimos anos acredita conhecer as ba-ses moleculares de várias neoplasias. A utilização destas técnicas permiteidentificar genes relevantes no câncer humano, confirmar os resultados ob-tidos em investigação básica em modelos animais, estabelecer padrões desusceptibilidade, classificar de forma mais precisa as neoplasias, melhorar odiagnóstico da doença, identificar novos alvos terapêuticos e melhorar a es-colha terapêutica para cada paciente.
Também a diversidade que existe entre os indivíduos é impor-tante e tem sua repercussão clínica, baseada nas diferenças genéticas: seformos capazes de reconhecer estas diferenças genéticas também seremoscapazes conhecer a toxicidade e as diferenças na resposta ao tratamento.(WestbrookCA et ai, 2005).
Em 1995, a Organização Mundial de Saúde (OMS/WHO) emcolaboração com a Associação Européia de Hematologia e patologistas,clínicos e cientistas de todo o mundo, iniciou um projeto com o objetivo deobter uma classificação consensual dos tumores do tecido hematopoiético edos órgãos linfóides. Este projeto levou ao desenvolvimento de um sistemade definição, classificação e estabelecimento de critérios diagnósticos con-sensuais para as neoplasias mielóides, linfóides e histiocitárias (Jaffe ES etai, 2001). Os critérios de classificação da OMS são os mesmos que foramutilizados na classificação REAL (Classificação Revisada Européia-Americana das neoplasias Linfóides) publicada pelo International LymphomaStudy Group em 1994 (Harris NL et ai, 1994). O sistema de classificaçãoREAL, ao contrário de outros sistemas de classificação anteriores, funda-menta-se na definição de entidades "reais" e não em subtipos morfológicos.Para o estabelecimento destas entidades "reais" são utilizadas todas as in-formações disponíveis, isto é, dados morfológicos, imunofenotípicos e bioló-gicos são combinados com as características genéticas e clínicas (Harris NLet ai, 1999a).
A classificação da OMS, que foi apresentada em 1997, estratifi-ca as entidades de acordo com a linhagem celular afetada: mielóide, linfói-de, histiocítica/dendrítica e mastocitária. Dentro de cada categoria, a doençaé definida de acordo com a morfologia, o imunofenótipo, dados genéticos eclínicos (Harris NL et ai, 1999b). Em muitas neoplasias, o estágio em quese encontra a célula tumoral acumulada não coincide com o estágio no qualocorreu o evento inicial transformador. Dessa forma, muitas neoplasias he-matológicas têm origem nos precursores iniciais e a alteração genética es-pecífica pode determinar que a célula continue avançando em sua diferenci-ação até deter-se e acumular-se em estágios de diferenciação mais avan-çados (Shaffer AL et ai, 2002). Ao contrário outras neoplasias podem de-senvolver-se nos estágios de diferenciação mais avançados, tal como ocorrenas células procedentes do centro folicular nas quais as translocações e osreordenamentos genéticos produzem ativação de genes que contribuempara o desenvolvimento tumoral. A nomenclatura para cada entidade refletea melhor estimativa para sua linhagem celular e estágio de diferenciação,reconhecendo que o conhecimento do qual dispomos atualmente é imperfei-to e que não é possível fazer mudanças na atribuição da linhagem celular ena nomenclatura que melhorem o conhecimento disponível.
Os atuais critérios de diagnóstico e classificação destas neopla-sias baseiam em uma combinação de (Braziel RM et al., 2003):
- Avaliação morfológica da célula: Observação ao microscópiodas células envolvidas. São obtidas informações sobre o tipo de célula e ograu de maturação em que se encontra.
- Estudo do imunofenótipo: Reconhecimento de antígenos ex-pressos na superfície da célula neoplásica. Estes antígenos se expressamde modo distinto e em grau diferente em função da linhagem e do estágioem que a célula se encontra. Já se conhece a expressão de antígenos desuperfície característica da linhagem e do estágio de diferenciação em que acélula se encontra, por exemplo, a expressão de CD19 e CD20 é típica decélulas da linhagem B, ao passo que a expressão de CD3 é típica da Iinha-gem Τ. O estudo de CD23 é a chave para a hora de diferenciar LNHCM deLLC (Gong JZ et ai, 2001).
Desde sempre se tenta relacionar os diferentes tipos de neopla-sias com sua população correspondente de células normais através de suascaracterísticas morfológicas e imunofenotípicas. Muitas neoplasias parecemportanto "aprisionadas" em estágios de desenvolvimento determinados por-que apresentam características morfológicas e imunofenotípicas semelhan-tes àquelas apresentadas pela célula hematopoiética nesse estágio de dife-renciação (Shaffer AL, et ai, 2002).
- Características clínicas: Sinais e sintomas apresentados pelopaciente no momento do diagnóstico.
- Determinação de marcadores moleculares: Medição de algu-mas moléculas que se associam a entidades concretas como a presença dePML/RARA na leucemia promielocítica ou que conferem um prognósticomelhor ou pior, como por exemplo, a expressão de CD38 em células LLCmarcador de mal prognóstico (Durig J et ai, 2002)
- Estudos citogenéticos baseados na procura de alterações ge-néticas no DNA das células tumorais. Em muitos casos, existem reordena-mentos específicos característicos de tipos de tumor ou estágios (MitelmanF, et ai, 1997). Em função das translocações cromossôrhicas é possívelestabelecer grupos distintos com significado clínico, por exemplo, em LLA-B,onde é freqüente a presença de oncoproteínas de fusão, a presença det(2;21 )/TEL1 -AML1 e t(1;19)/E2A-PBX1 é associada à resposta a tratamentoenquanto que o prognóstico para pacientes com t(9;22)/BCR-ABL et(4;11)/MLL-AF4 é muito pior (Arico M et ai, 2000). Também se costumaprocurar mutações pontuais, deleções ou inserções em algum gene que es-tejam associadas a um prognóstico mais favorável como, por exemplo, assíndromes mielodisplásicas associadas a 5q- (Boultwood J et ai, 1994).Como já foi dito acima, a OMS estabelece quatro grandes gru-pos de neoplasias hematológicas em função da linhagem envolvida (neopla-sias mielóides, linfóides, histiocítica/dendrítica e mastocitária). Em seguidadescrevemos de forma mais ampla as neoplasias pertencentes à linhagem mielóide e linfóide por serem as que ocorrem com maior freqüência. Aquelascorrespondentes às linhagens histiocítica/dendrítica e mastocitária no mo-mento constituem entidades muito pontuais.1. Neoplasias mielóides
Abrangem todas as neoplasias que têm origem na linhagem dediferenciação mielóide, a OMS distingue quatro grandes grupos (VardimanJW et ai, 2002).
1.1 Síndromes mieloproliferativas (SMP)
Síndromes mieloproliferativas (SMP) são alterações clonais dacélula mãe hematopoiética caracterizadas por hematopoiese efetiva queleva a um aumento dos níveis sangüíneos de uma ou mais linhagens hema-topoiéticas e hepatoesplenomegalia. Constituem um grupo de entidades nasquais há um incremento dos precursores da série mielóide ou fibrose damedula óssea (mielofibrose), neste grupo também está incluída a mastocito-se sistêmica. Destacam-se:
- Síndromes mieloproliferativas crônicas (SMPC). Alteração clo-nal da célula mãe hematopoiética. Caracterizada por uma hematopoieseeficaz que produz um aumento no sangue periférico de uma ou mais linha-gens celulares e freqüentemente hepatoesplenomegalia, hipercelularidademedular com maturação porém sem displasia.
- Leucemia mielóide crônica (LMC). É um processo clonal se-cundário a uma alteração genética adquirida da célula pluripotente. A doen-ça caracteriza-se pela superprodução de neutrófilos e de seus precursores.Tem três fases: a primeira denominada fase crônica de duração não defini-da, seguida da fase de aceleração e finalmente da crise blástica que real- mente é uma leucemia aguda secundária.
A LMC tem uma incidência baixa de aproximadamente um casopor 100.000 habitantes/ano e aparece com mais freqüência na quinta e nasexta décadas da vida. Pode ser considerada uma doença rara.
É a leucemia característica por excelência já que o termo leu-cemia foi aplicado pela primeira vez nesta entidade. 95% dos casos apre-sentam um marcador genético, o cromossoma Philadelphia, originado pelatranslocação de um fragmento do cromossoma 22 que se fica ao cromos-soma 9 ou t(9;22) (q34;q11). Esta translocação dá origem ao gene de fusãobcr-abl. A proteína codificada por este gene quimérico, BCR-ABL possuiuma atividade tirosina-quinase aumentada comparada com a atividade daproteína normal abi e age como fator de crescimento oncogênico (Pane F etal., 2002), embora na verdade os mecanismos que produzem superprodu-ção de células mielóides ainda não estejam totalmente claros. É possívelque outros proto-oncogenes como o p-53 interfiram no processo e na trans-formação de fase crônica em crise blástica. Os poucos casos nos quais nãoé detectada a presença do cromossoma Philadelphia representam quadrosmieloproliferativos atípicos e correspondem à variante de SMD conhecidacomo leucemia mielomonocítica crônica (LMMC).
O diagnóstico baseia-se nas contagens celulares elevadas paraa série branca, no aparecimento de células mielóides morfologicamentenormais e em todos os estágios de diferenciação, mas com um número ele-vado de mielócitos e neutrófilos, geralmente existe basofilia e trombocitose.Na fase de aceleração é produzido um aumento de células imaturas no san-gue periférico e na crise blástica a célula predominante é o mieloblasto(65%) ou o Iinfoblasto (35%).
- Policitemia Vera (PV). É a síndrome mieloproliferativa caracte-rizada pelo incremento da massa da série vermelha. A policitemia vera éuma doença hematológica benigna, cujo padecimento não tem influência noencurtamento da vida. No entanto, trata-se de uma doença clonal que podeevoluir em 15% dos pacientes para mielofibrose ou leucemia aguda (5%).
- Trombocitemia Essencial (TE). Síndrome mieloproliferativa ca-racterizada por uma produção plaquetária 15 vezes superior ao normal. Po-de estar associada a complicações trombóticas ou hemorrágicas secundá-rias a uma disfunção plaquetária. A idade de manifestação se dá em tornodos 60 anos, com igual incidência em ambos sexos.
- Mielofibrose (MF). É um transtorno clonal neoplásico da célulamãe pluripotente. Caracteriza-se por uma grande produção de megacarióci-tos anormais. Estas células liberam moléculas (fator de crescimento deriva-do das plaquetas, fator 4 plaquetário) que estimulam a proliferação de fibro-blastos e constróem fibras de colágeno na medula óssea. A medula é inca-paz de funcionar normalmente e as células precursoras hematopoiéticas setrasladam para o fígado e o baço, dando lugar a hematopoiese extramedu-lar. Caracterizado por fibrose de M.O a esplènomegalia. Aparece em pesso-as com mais de 50 anos e não tem preferência por sexo.
- Mastocitose. Grupo de entidades caracterizadas pela proliferação de célu-las mastocitárias em diferentes partes do organismo. A mastocitose sistêmi-ca (MS), é uma doença rara que normalmente afeta pessoas adultas, e a-presenta alterações ósseas em 70% dos pacientes (Chen CC etal., 1994).
1.2. Síndromes mielodisplásicas/mieloproliferativas (SMD/SMP)
A OMS estabeleceu uma classificação um tanto diferente, sepa-rando as SMD/SMP como entidades diferenciadas do resto de SMD, umavez que compartilham características com as SMPC que as tornam diferen-tes. Neste grupo estão incluídas três entidades: leucemia mielomonocíticacrônica, leucemia mielóide crônica atípica, leucemia mielomonocítica juvenile SMD/SMP não classificáveis.
As síndromes mielodisplásicas (SMD) são proliferações clonaisda célula mãe hematopoiética que compartilham dados clínicos, morfológi-cos e analíticos no momento do diagnóstico que se superpõem entre LAM eSMPC. Caracterizam-se pela hipercelularidade da medula óssea devida àproliferação de uma ou mais linhagens mielóides (Heaney ML, 1999). A pre-sença de displasia em pelo menos uma linhagem (mielóide, eritróide oumegacariocítica-plaquetária) é uma característica de SMD. A incidência évariável dependendo da variedade. Estima-se uma incidência de 3 casos χ100.000 habitantes com mais de 60 anos/ano. A classificação FAB estabe-lece 4 categorias diagnosticas (Bennett JM et al., 1984): anemia refratáriasimples (AR), anemia refratária com sideroblastos em anel (ARS), anemiarefratária com excesso de blastos (AREB) e anemia refratária com excessode blastos em transformação (AREB-T) e leucemia mielomonocítica crônica(LMMC).
Quanto às SMD a OMS estabelece cinco categorias diferencia-das (Harris NL, et ai, 1999): anemia refratária, citopenia refratária com dis-plasia multilinear, anemia refratária com excesso de blastos, SMD não clas-sificável e SMD associada a um defeito isolado no cromossoma 5 (dei 5q)ou síndrome 5q-.
1.3. Leucemia aguda mieloblástica (LAM)
Proliferação clonal de células imaturas da linhagem mielóide.
Podem aparecer de novo ou de forma secundária em pacientes com sín-drome mielodisplásica (SMD). A classificação elaborada pelo grupo francês-americano-britânico (FAB) considera oito variedades (M0-M7) baseadas emcritérios morfológicos e no imunofenótipo das células neoplásicas (BennettJM, et al., 1976). Apesar de esta classificação ter sido aceita durante muitosanos, a descoberta de que muitas alterações genéticas possuem caráterpreditivo e a incorporação da análise citogenética ao diagnóstico de Ieuce-mias agudas (Bene MC et al., 2001) permitiram subclassificar a doença eestabelecer um valor prognóstico, como ocorre com a translocação t(15;17)que caracteriza a leucemia aguda promielocítica variedade que se caracteri-za pela expressão de um receptor para o ácido retinóico (RAR), característi-ca que converte este tipo de leucemia em sensível a tratamento com ácidotransretinóico (ATRA) na maioria dos casos.
A OMS classifica as LAM incorporando dados morfológicos, ca-racterísticas imunofenotípicas, genéticas e clínicas para poder definir enti-dades biologicamente homogêneas e com relevância clínica. Assim a LAM éclassificada em quatro grandes categorias: 1.- LAM com anomalias genéti-cas recorrentes. 2.- LAM com displasia multilinear. 3.- LAM relacionada comtratamento e 4.- LAM não classificável (ref. OMS). As três primeiras catego-rias reconhecem a importância de fatores biológicos que prevêem a evolu-ção do processo. A análise citogenética representa o fator prognóstico maispoderoso (Roumier C, et al., 2003). Ela é utilizada para identificar subgru-pos de LAM com prognóstico diferente: baixo risco com resposta favorável atratamento (t(8;21), t(15;17) ou inv(16)), risco intermediário (cariótipo normalou t(9;11) o alto risco (inv(3), -5del(5q) ou -7del(7q), ou mais de três altera-ções). Há heterogeneidade molecular dentro do grupo de risco. Em algunscasos de pacientes com cariótipo normal, foi verificada a presença de muta-ções no gene FLT3 (Kottaridis PD, et ai, 2001.) e MLL (Dohner K et ai,2002).
A imagem medular no exame microscópico do material aspiradogeralmente é aquela de uma invasão por células semelhantes entre si, decaracterísticas morfológicas imaturas que distorcem a distribuição celularnormal constituindo autênticos lençóis celulares. A hiperprodução medularcondiciona que zonas de medula óssea inativas na idade adulta voltem aapresentar novamente focos de hematopoiese, neste caso de células anor-mais,
Aproximadamente 80-90% dos pacientes jovens com LAM, al-cançam remissão completa da doença depois de quimioterapia. No entanto,a maioria sofre recaída, e a cura ocorre em 30%. O transplante alogênicode medula óssea conseguiu aumentar o índice de cura para 50%, mas élimitado pela disponibilidade de doador HLA idêntico. Constitui portanto umgrupo de neoplasias com diversas anormalidades genéticas e resposta vari-ável a tratamento (Giles FJ et ai, 2002)
2. Neoplasias linfóides
A classificação da OMS é um aprimoramento da classificaçãoREAL (Harris NL et al. 1994). São reconhecidos três grandes grupos de ne-oplasias linfóides: 1.- Neoplasias linfóides derivadas de células B. 2,- Neo-plasias linfóides derivadas de células T e NK. 3.- Linfoma de Hodgkin. Nes-ta classificação estão incluídas as neoplasias sólidas e as Ieucemias linfói-des porque em muitas delas ocorre uma transformação de uma fase em ou-tra e a distinção entre elas pode ser artificial. Assim, a leucemia linfáticacrônica Bea LNH linfocítica são originadas pela mesma célula e simples-mente representam manifestações diferentes da mesma neoplasia, o mes-mo ocorre com o Iinfoma linfoblástico e a leucemia linfoblástica.2.1. Neoplasias derivadas de células Β, T e NK
A classificação da OMS divide estas neoplasias em função doestágio de amadurecimento em que se encontram as células em neoplasiasde células precursoras e neoplasias de células maduras (WHO Classificati-on Tumours of Haematopoietic and Iymphoid tissues. In Pathology an gene-tics of tumours of Haematopoietic and Iymphoid tissues. ES Jaffe, NL Harris,H Stein, JW Vardiman. IARC Press. Lyon, 2001). Devido ao elevado númerode entidades descritas, destacam-se entre elas:
- Leucemia aguda linfoblástica (LAL): Proliferação clonal de pre-cursores linfóides. Em aproximadamente 80% dos casos, os precursorespertencem à linhagem linfóide Β. A análise molecular das alterações genéti-cas das células leucêmicas contribuiu de forma importante para o entendi-mento da patogênese e para o prognóstico de LAL (Ferrando AA et aí.,2005). Apesar de a freqüência de subtipos genéticos diferir entre crianças eadultos, os mecanismos gerais que levam à LAL são conseqüência da ex-pressão anormal de proto-oncogenes devido a translocações cromossômi-cas que criam genes de fusão ou hiperploidia. Este evento oncogênico inici-al provavelmente é insuficiente para produzir leucemia e acredita-se quesejam necessárias outras alterações que cooperem com esta primeira paraalterar definitivamente a proliferação e a sobrevivência da célula transfor-mada. Todas estas alterações contribuem para a transformação leucêmicadas células hematopoiéticas mãe ou de suas progenitoras porque afetamprocessos reguladores chave, mantendo ou aumentando sua capacidade deauto-renovação, escape dos controles normais de proliferação, bloqueio dediferenciação e promovendo resistência a sinais apoptóticos (Hanahan D, etai, 2000).
O aspecto global da medula óssea é semelhante ao descritopara a leucemia mielóide. É importante a investigação de doença mínimaresidual, fator que condiciona com sua presença a provável recaída da do-ença. A classificação FAB define 3 estágios em função da morfologia (L1-L3).
É a leucemia mais freqüente na infância, e o curso clínico e aresposta ao tratamento dependem do tipo de alteração genética, por exem-plo, os pacientes com hiperdiploidia têm um prognóstico favorável quandosão tratados com programas de tratamento que incluem antimetabólitos masem linhas gerais as crianças são curadas com quimioterapia convencional eprofilaxia do SNC e nos adultos somente 20% conseguem uma sobrevidaprolongada com quimioterapia, o transplante alogênico e autólogo é útil pa-ra os casos considerados de alto risco.
- Leucemia linfática crônica (LLC). A LLC caracteriza-se pelaproliferação clonal e acúmulo de linfócitos com aparência madura e resisten-tes à apoptose em M.O., sangue e órgãos linfóides (Galton DA, 1966).Quando a Iinfoadenopatia é dominante, o quadro clínico denomina-se Iinfo-ma linfocítico. Os linfócitos afetados são da linhagem B em 95% dos casos eem 5% dos casos são observados linfócitos T.
É a leucemia mais freqüente no mundo ocidental. A média deidade de pacientes para diagnóstico é de 65 anos, apenas 10-15% dos ca-sos ocorrem abaixo dos 50 anos (Jemal A et ai, 2003,). É a causa de leu-cemia mais comum nos adultos dos países do mundo ocidental e acredita-se que em torno 25% de todas as leucemias. A incidência é de 3 casos porcada 100.000 habitantes por ano, sendo predominante no sexo masculino,com uma proporção homem/mulher de 1,7:1. Nos últimos anos, é diagnosti-cada cada vez com mais freqüência em pacientes mais jovens. A proporçãode casos diagnosticados em estágio prematuro da doença (Rai KR, et ai,1975) aumentou de 10 a 50%, devido provavelmente a um diagnóstico pre-coce graças a contagens de linfócitos de rotina. A doença afeta mais oshomens que as mulheres.
O prognóstico e curso clínico da doença é extremamente variá-vel. Alguns pacientes têm uma evolução rapidamente progressiva e morremem 2 - 3 anos depois do diagnóstico, ao passo que em outros, o curso é in-dolente e vivem durante 10-20 anos sem problemas relacionados com aLLC. Na metade dos pacientes ocorrem situações intermediárias.
Aproximadamente 20% dos pacientes são assintomáticos no Imomento do diagnóstico, este sendo feito como conseqüência de uma aná-lise de sangue rotineira. Quando existem sintomas, eles não são específi-cos e incluem fadiga, debilidade e mal-estar.
A classificação Binet (Binet JL et ai, 1981) define 3 estágios dedoença em função da concentração de hemoglobina, número de plaquetas,número de gânglios envolvidos e a presença de visceromegalias. A classifi-cação de Rai (Rai KR et ai, 1975,) utiliza os mesmos indicadores mas classi-fica os pacientes em cinco grupos.
Esta neoplasia não se caracteriza por uma única e recorrentealteração genômica. Existem alguns marcadores que lhe conferem umprognóstico mais desfavorável como a presença de deleções nos cromos-somas 17 e 11 e os pacientes com ausência de mutações nos genes IgVh(40% dos casos) e proporção elevada de células expressando CD38 carac-terizam-se por um curso clínico mais agressivo e resposta pior a tratamento(Hamblin TJ et ai, 1999; Durig J et ai, 2002). Outro marcador descrito re-centemente é o ZAP-70, marcador prognóstico independente cuja expres-são se relaciona de forma indireta com o estado mutacional do gene dascadeias pesadas de imunoglobulinas (Crespo M ef a/., 2003,).
- Mieloma múltiplo: MM). O MM é uma doença maligna na qualum clone de células plasmáticas (elemento terminal da linhagem linfóide B)da medula óssea sofre uma proliferação descontrolada. Presume 10-15%de todas as doenças malignas e é característica de idades avançadas, so-mente 2% dos casos são diagnosticados antes dos 40 anos. Por razõesdesconhecidas a incidência da doença está aumentando.
Estas células produzem e segregam uma imunoglobulina mono-clonal ou fragmentos de imunoglobulinas, compostos por uma classe de ca-deia pesada e leve (capa ou lambda). Ocasionalmente o mieloma pode nãosecretar ou a proteína pode ser detectável no soro ou na urina. A célulaplasmática neoplásica produz outras moléculas como IL6, fator de necrosetumoral ou fator ativador de osteoclastos que contribuem para produzir os-teólise, hipercalcemia e insuficiência renal, alterações características da do-ença.
O diagnóstico pode ser por acaso ao se realizar uma análise empacientes sem sintomatologia ou doença limitada (20% dos casos). A doen-ça nestes pacientes pode permanecer estável durante anos e o tratamentoprecoce na fase assintomática não oferece qualquer vantagem.
Os pacientes com componente monoclonal mas que não preen-chem os critérios diagnósticos de MM são considerados portadores de ga-mapatia monoclonal de significado indeterminado (GMSI). Entre 10 e 20%desses pacientes desenvolvem MM em 10 anos (Kyle RA, 1997; Zhan F etal., 2002). O componente monoclonal também pode ser associado a outrasdoenças como linfoma, neoplasias não hematológicas e doenças do tecidoconjuntivo.
- Linfoma linfoplasmocitóide e Macroglobulinemia de Waldens-trom. É a expressão clínica de uma doença Iinfoproliferativa de baixo grau,caracterizada pela infiltração de células linfoplasmocitárias anômalas namedula óssea, gânglios linfáticos e baço, acompanhada da produção mono-clonal de imunoglobulina Μ, o que condiciona um aumento da viscosidadesangüínea e o aparecimento de manifestações vasculares hemorrágicas epor dificuldade na circulação em vasos pequenos.
- Linfoma não Hodgkin (LNH). Os LNH são tumores sólidos dotecido linfóide muito mais heterogêneos que a doença de Hodgkin. A com-plexidade e a diversidade apresentadas pelos LNH quanto à morfologia, ge-nética, fenótipo e comportamento clínico deram lugar à existência de múlti-plas classificações, nenhuma delas completamente satisfatória.
É a doença hematológica mais freqüente e, em termos de anosde vida perdidos, é a quarta neoplasia mais importante do mundo ocidentale parece que sua incidência vem aumentando.
Pode aparecer em todas as idades, mas a média de manifesta-ção é 50 anos. A causa que motiva a doença ainda não está clara. Foramdescritas translocações cromossômicas específicas associadas a certos ti-pos de linfomas, que são de grande utilidade no diagnóstico (Montoto S etal., 2003). A maioria dos linfomas tipo Burkitt apresentam a translocaçãot(8;14), na qual o oncogene c-MYC do cromossoma 8 se traslada para a re-gião próxima no cromossoma 14 onde são codificadas as cadeias pesadasde imunoglobulinas. 90% dos Iinfomas foliculares caracterizam-se pelatranslocação t(14;18), onde o gene bcl-2 do cromossoma 18 se traslada pa-ra a região das cadeias pesadas de imunoglobulinas. Sabe-se que a super-expressão de bcl-2 inibe a apoptose (morte celular programada). É fácil queestes reordenamentos cromossômicos requeiram outros estímulos como porexemplo a coexpressão de um segundo proto-oncogene ou um estímuloantigênico para desenvolver a proliferação maligna. Um exemplo de combi-nação de várias causas combinadas é o Iinfoma associado a AIDS. O apa-recimento de Iinfomas extranodais agressivos é o resultado da combinaçãode imunossupressão por HIV, desregulação de um proto-oncogene (c-MYC)e uma infecção viral secundária (vírus de Epstein-Barr), o mesmo ocorre empacientes submetidos a transplante de órgãos (Harris NL et al., 2001).
A apresentação clínica da doença é mais irregular que na doen-ça de Hodgkin. Ela pode se comportar de forma indolente sem requerer tra-tamento imediato ou, ao contrário, pode se comportar de forma agressivarapidamente fatal.
A afetação nodal mais freqüente é a cervical. No que se refere àafetação extranodal, os sinais e sintomas dependem do órgão afetado. Amedula óssea aparece infiltrada com mais freqüência nos LNH de baixograu e pode dar origem à pancitopenia. A presença de células malignas nosangue periférico também é freqüente nos LNH de baixo grau, mas é deprognóstico muito ruim nos de alto grau.
O diagnóstico é feito por meio do estudo histológico do tecidolinfático. A informação adicional é obtida por meio de anticorpos monoclo-nais dirigidos contra antígenos linfocitários específicos (imunofenótipo); istoajuda a identificar o grau de maturação da célula maligna e a determinar aorigem T ou B da mesma. A presença de mutações em genes que codificama Ig nos LNH da linhagem B costuma ser utilizada para a identificação dealguns subtipos de LNH (Kuppers R etal., 1999).
2.2. Linfoma de Hodgkin (LH)
É uma doença pouco freqüente e tem preferência pelo sexomasculino em uma proporção 2/1. Caracteriza-se pela presença de umascélulas grandes, bi ou multinucleadas chamadas de Reed-Sternberg (RS) eoutras menores e mononucleadas que aparecem em pequena quantidadeno tumor, o resto das células são linfócitos, granulócitos, fibroblastos e célu-las plasmáticas. Este infiltrado inflamatório provavelmente reflete a respostaimune do hospedeiro com as células malignas. A natureza das células RS ede Hodgkin vem sendo muito estudada mas continua sendo controversa.Elas podem derivar de um estágio inicial das células linfóides.
Em alguns casos foi detectada a existência de DNA do vírus deEpstein-Barr no tumor. Uma hipótese é que a distribuição bimodal da doen-ça dever-se-ia à infecção nos indivíduos jovens e o outro pico seria provo-cado por causas ambientais.
O diagnóstico é obtido por biópsia de um nódulo linfático. Paraplanejar o tratamento é necessário determinar a extensão da doença. (Küp-pers R, 2002; Cossman J, 2001; Devilard E et ai, 2002).Problemas na classificação
A grande quantidade de células hematopoiéticas e os muitosestágios de diferenciação que elas atravessam complicam ainda mais aclassificação das neoplasias originadas a partir deste tipo de células. Apesardos esforços para estabelecer uma classificação baseada em entidades "re-ais", algumas das categorias estabelecidas são ambíguas e em muitos ca-sos contêm grupos muito heterogêneos quanto à resposta à terapia ou aocurso clínico. Esta heterogeneidade é a responsável, por um lado, pela in-cessante busca de marcadores capazes de diferenciar alguns comporta-mentos de outros e, por outro lado, pelo fato de que a controversa classifi-cação deste tipo de neoplasias seja submetida a contínuas revisões.
Um sistema de classificação ideal deve ser preciso, reproduzí-vel, fácil de usar e sobretudo deve ter significado biológico e clínico (ChanWC, et aí., 2005). Os atuais sistemas de diagnóstico e a classificação dasneoplasias hematológicas baseiam-se no reconhecimento de característicashistológicas e morfológicas, imunofenotípicas, citogenéticas e no estudo dealgum marcador molecular com valor prognóstico. Uma combinação declassificação patológica e critérios clínicos é utilizada para diferenciar tiposdistintos com diferenças prognósticas. No entanto, em algumas das catego-rias diagnosticas definidas desta maneira observa-se:
- Uma resposta à terapia marcadamente heterogênea. Dentro damesma doença são encontrados pacientes que alcançam remissão comple-ta, remissão parcial, não respondem, que sofrem uma recaída depois deuma determinada terapia. A capacidade de prever uma resposta é especi-almente importante neste tipo de neoplasias uma vez que o transplante decélulas "tronco" é uma alternativa terapêutica eficaz porém tóxica. A capaci-dade de determinar quais pacientes responderão à terapia convencionalantes de ela ser administrada pode ser vantajosa para que se possa aplicara cada paciente o tratamento mais eficaz.
- Um comportamento clínico variável. Dentro da mesma catego-ria encontram-se pacientes cuja doença vai manter-se estável durante umlongo período de tempo e que não vão precisar de terapia e outros cuja do-ença vai progredir rapidamente requerendo uma terapia agressiva.
Estas variações apontam a existência de heterogeneidade mo-lecular dentro das categorias diagnosticas, diferenças que os métodos con-vencionais de diagnóstico não são capazes de determinar e por conseguin-te, a busca de novas formas de análise que proporcionem uma maior reso-lução na caracterização deste tipo de neoplasias.
Nesta linhagem, o uso de "arrays" de expressão mostrou-se efi-caz não apenas na decifração da diversidade biológica e clínica encontradaem muitos tumores, mas também na compreensão dos processos biológicose patológicos que afetam muitos sistemas e em particular õ sistema hema-topoiético. Os "arrays" de expressão são conjuntos ordenados de seqüên-cias associadas a um suporte sólido, complementares ao mRNA ou aosseus cDNA ou cRNA correspondentes, que permitem a análise da expres-são diferencial de centenas ou milhares de genes simultaneamente. Um dossuportes aos quais estas seqüências se ligam com freqüência são fragmen-tos retangulares de vidro similares aos porta-objetos, formato ao qual fre-qüentemente aludimos pelos termos "microarray", "biochip" ou, simplesmen-te, "chip". Seu uso vem se tornando cada vez mais freqüente para o diag-nóstico de diversas doenças ou para a avaliação da susceptibilidade contraí-las.
Primeiros trabalhos de "arravs" e neoplasias hematolóqicas
No ano de 1999, o grupo de Golub publicou um dos primeirosartigos que faz referência ao papel dos "arrays" na classificação de neopla-sias hematológicas (Golub TR et ai, 1999). Foi utilizado um "array" com6817 genes representados para o estudo de perfis de expressão nas Ieuce-mias LAM e LAL. Foi selecionado um grupo de 50 genes com capacidadede predizer o tipo de leucemia ("classe predictor") que foram utilizados paraclassificar um grupo de amostras desconhecidas nas categorias corretas. Oestudo da expressão desses 50 genes é suficiente para a classificação deuma amostra de leucemia aguda em LAM ou LAL. Apesar de a distinçãoentre LAM e LAL estar bem estabelecida com os métodos atuais de diag-nóstico, o estudo revelou a existência de padrões de expressão específicosassociados a cada tipo de leucemia aguda e evidenciou o uso de perfis deexpressão na classificação de câncer.
No ano de 2000, o grupo de Alizadeh publicou um artigo no qualutilizando um "array" especializado, o "lymphochip" que contém genes ex-pressos de forma preferencial em células linfóides ou dos quais se tem co-nhecimento de alguma importância imunológica ou oncológica com 17.856seqüências (Alizadeh AA et aí., 1999). Este grupo utilizou o "lymphochip"para o estudo de padrões de expressão gênica associados a diferenças nocomportamento clínico em um Iinfoma difuso de células grandes B (LDCGB)(Alizadeh AA, et ai 2000). O LDCGB é um LNH com um comportamentomuito heterogêneo e impossível de ser distinguido pelos métodos conven-cionais de diagnóstico: 40% dos pacientes respondem bem à terapia e têmuma sobrevida prolongada ao passo que 60% morrem por causa da doença.Os autores descobriram que a expressão de genes poderia estar relaciona-da com o comportamento clínico dos tumores. Este foi um dos primeirosartigos em foi mencionado o papel dos "arrays" para a "subclassificação" deneoplasias hematológicas, isto é, o uso de perfis de expressão para a identi-ficação de dois grupos de LDCGB diferentes do ponto de vista transcricio-nal, subtipos de LDCGB com comportamento clínico impossível de ser pre-visto com os critérios convencionais de diagnóstico.
Atualmente existem diversas publicações nas quais direta ouindiretamente aparecem "arrays" aplicados não apenas à classificação esubclassificação, mas também ao estudo, diagnóstico, prognóstico, identifi-cação de novos marcadores em doenças hematológicas (Greiner TC, 2004;Alizadeh AA et ai, 2000; Bea S et ai, 2005; Dave SS et ai, 2004), assimcomo pedidos de patentes que descrevem a utilização deste tipo de disposi-tivos para a diferenciação entre diferentes tipos de neoplasias hematológi-cas. Assim, por exemplo, o pedido de patente W02003/008552 descreve autilização para fins de diagnósticos de diferenças no padrão de expressãode genes para diferenciar entre a leucemia de linhagem mista (MLL), a leu-cemia linfoblástica aguda (ALL) e a leucemia mielógena aguda (AML), rei-vindicando a possibilidade de realizar este diagnóstico diferencial com osdados obtidos da análise de amostras de pacientes acometidos por cada umdestes tipos de leucemia por meio da utilização de "chips" comerciais deAffymetrix. Embora estejam indicados genes com variações na expressãoentre os três tipos de Ieucemias que permitiriam a diferenciação entre elas,não estão mencionadas seqüências específicas diferentes das presentes nochip de Affymetrix que possam ser utilizadas para detectar esses genes pormeio de dispositivos diferentes daqueles da referida casa comercial, nem foiconsiderado o desenho de dispositivos ou métodos que permitiriam o diag-nóstico de outros tipos de Ieucemias ou, de um modo geral, de neoplasiasderivadas de células hematopoiéticas.
O pedido de patente W02005/024043, por sua vez, também selimita ao campo da análise da expressão de genes para se aprofundar noconhecimento das diferenças existentes em nível molecular entre as diferen-tes neoplasias derivadas de células hematopoiéticas, concentrando-se es-pecificamente no caso dos linfomas, para extrair dados que ajudem em seudiagnóstico ou no prognóstico de sua evolução. Na verdade, ele descreveum método para obter funções úteis para prever a evolução de indivíduosafetados por diferentes tipos de linfomas avaliando em biópsias de gângliosem que grau contribui em cada um deles aquilo que denominam padrões ouimpressões gênicas, grupos de genes que se expressam de forma coorde-nada e que estão relacionados com a origem celular da neoplasia, os dife-rentes tipos de células não malignas presentes na biópsia e os mecanismosoncogênicos responsáveis pelo câncer. Os diferentes padrões ou impres-sões gênicas também são deduzidos neste caso a partir dos dados obtidoscom chips comerciais da Affymetrix. Além disso, o pedido W02005/024043diz oferecer um microarray alternativo, composto por um número menor deseqüências que os microarrays de Affymetrix, o que permitiria igualmente aanálise de diferenças na expressão gênica entre Iinfomas e sua aplicaçãopara a dedução de funções de previsão de sobrevivência e para a diferenci-ação entre diferentes tipos de linfomas. Embora estejam indicados os ge-nes cuja análise seria possível por esse microarray, o relatório descritivo dopedido W02005/024043 não indica a seqüência das sondas que comporiamo microarray, mencionando apenas que seriam tipo cDNA e deixando dúvi-das se esse cDNA apareceria completo ou se a análise da expressão dogene correspondente seria realizada utilizando como sonda apenas umfragmento do referido cDNA, que ficaria por determinar.
Seria interessante dispor de composições e métodos que permi-tissem a diferenciação entre neoplasias de origem hematopoiética com baseem suas diferenças em nível molecular, desenhadas especificamente paraeste grupo de neoplasias, nas quais se avaliasse a expressão de um núme-ro de genes mais reduzido que nos microarrays comerciais utilizados nosestudos descritos nos pedidos de patente mencionados acima e facilitassemtanto o diagnóstico de determinadas neoplasias como a previsão de sua fu-tura evolução, desta maneira ajudando na prescrição de um tratamento a-dequado para cada paciente, característica particularmente interessante nasneoplasias, como é o caso da LLC, em que o prognóstico da futura evoluçãodo paciente é difícil com os conhecimentos e ensaios de que se dispõe atéagora. Além disso, seria especialmente conveniente que as sondas utiliza-das para avaliar a expressão dos genes selecionados fossem desenhadasespecificamente para que, além de serem específicas e com uma seqüênciaperfeitamente definida, tivessem todas elas um comportamento parecido, oque as tornaria apropriadas, em geral, para que fossem utilizadas de formacombinada em um mesmo ensaio e, em particular, para fazer parte de ummesmo array ou conjunto ordenado associado a um suporte sólido, como podem ser chamados "chips" ou "microarrays". As composições e métodosda presente invenção atendem esta necessidade.
Em vez de partir de microarrays comerciais para detectar genessignificativos para distinguir entre neoplasias ou criar funções que prevejama sobrevivência do indivíduo acometido pelas mesmas, a invenção fornecenovos oligonucleotídeos, de seqüência perfeitamente definida, capazes dedetectar de forma específica genes que foram selecionados por serem co-nhecidos por serem significativos para a biologia de células sangüíneas oupara a patologia de diferentes neoplasias, oligonucleotídeos que possuemainda a particularidade de terem sido desenhados de maneira a compartilharalgumas características comuns que fazem com apresentem um comporta-mento parecido ao serem utilizados como sondas em ensaios de hibridiza-ção, o que os torna adequados para serem utilizados em composições quecompreendem combinações dos mesmos. As referidas composições, e emespecial aquelas nas quais esses oligonucleotídeos estão dispostos de for- ma ordenada sobre um suporte sólido de fácil manipulação os vidros seme-lhantes a porta-objetos, são adequadas para realizar ensaios com os quaisé possível detectar genes estatisticamente significativos para diferenciaramostras extraídas de indivíduos que sofrem de determinados tipos de neo-plasias originadas a partir células hematopoiéticas de amostras extraídas deindivíduos que não sofrem das referidas neoplasias, por se tratarem decomposições que contêm um número de oligonucleotídeos inferior ao dosmicroarrays comerciais desenhados com um propósito mais genérico, ásgeneral, serem desenhadas especificamente para a análise de amostrasprocedentes de indivíduos que sofrem de neoplasias e serem compostas desondas de seqüência conhecida, perfeitamente reproduzível, e que alémdisso são especialmente desenhadas para serem utilizadas conjuntamenteem um mesmo ensaio por terem comportamento parecido. A inclusão adi-cional nos microarrays da invenção de oligonucleotídeos de baixa homologiacom genes humanos, mas escolhidos de modo que o resto de suas caracte-rísticas sejam similares às dos oligonucleotídeos da invenção desenhadospara agir como sondas capazes de reconhecer genes humanos com altaespecificidade, permite a utilização dos referidos microarrays para a identifi-cação de genes estatisticamente significativos na identificação de amostrasassociadas a determinadas neoplasias de origem hematopoiética por meioda utilização de ensaios nos quais é factível o estabelecimento de controlesem todas as suas fases. Tal como mostrado nos exemplos dados mais adi-ante no presente relatório, a utilização desses microarrays em combinaçãocom diversas técnicas estatísticas permite a classificação correta de diferen-tes amostras biológicas por meio de um método, preciso, reproduzível, fácilde usar e com significado biológico e clínico, por basear-se nas diferençasde expressão de genes com significado para os processos biológicos queestão sendo analisados. Em particular, o uso de um microarray da invençãoem combinação com o método da invenção permite a identificação de a-mostras sangüíneas de pacientes que sofrem de leucemia linfática crônica(alteração não considerada nos pedidos W02003/008552 eW02005/024043 e cujo diagnóstico não foi descrita por meio da utilizaçãode microarrays comerciais), distinguindo-as tanto de amostras obtidas deindivíduos saudáveis como de amostras relacionadas com outros tipos deleucemias, como são aquelas correspondentes a células Jurkat ou U937,facilitando o diagnóstico da LLC por meio da análise de níveis de expressãode genes estatisticamente significativos para tanto e permitindo ainda a ob-tenção de funções que possibilitam o cálculo matemático da probabilidadede que uma amostra desconhecida pertence a um indivíduo acometido deLLC. Além disso, a invenção permite diferenciar amostras pertencentes aindivíduos acometidos de leucemia linfática crônica estável de amostras per-tencentes a indivíduos acometidos de leucemia linfática crônica progressiva,distinção esta que ainda hoje é difícil de ser feita a priori por meio das técni-cas disponíveis, para a qual se dispõe de uma ferramenta útil e inovadorapara o prognóstico da futura evolução de indivíduos acometidos desta doen-ça, indivíduos cujo diagnóstico também pode ser feito por meio de composi-ções e métodos da invenção ou que pode ser conhecido graças à aplicaçãode um procedimento diferente, mas para os quais, por se dispor de uma fer-ramenta que permite prognosticar como vai evoluir posteriormente a LLC deque sofrem, será mais fácil decidir se será adequado submetê-los a um tra-tamento agressivo imediato ou simplesmente mantê-los em observação pa-ra verificar que seus dados de expressão de genes continuam indicando quea doença vai se manter estável durante um longo período de tempo.
Sumário da Invenção
A invenção fornece composições que incluem pelo menos umoligonucleotídeo do grupo composto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108,SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117,SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126,SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135,SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144,SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153,SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162,SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171,SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180,SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189,SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198,SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207,SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405, S G406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490, SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499,SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508,SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563, ou combinações dos mesmos.
Os referidos oligonucleotídeos foram desenhados de modo que,além de serem específicos para os genes correspondentes cuja expressãose deseja avaliar, têm um comportamento parecido, por terem comprimen-tos similares e apresentarem todos eles conteúdos de GC compreendidosno intervalo de 40% a 60%, além de corresponderem a zonas situadas amenos de 3000 nucleotídeos da extremidade 3' (poli(A)) do mRNA que sedeseja detectar e avaliar e de serem constituídos por seqüências que coin-cidem em seu sentido com a dos mRNA correspondentes. Por isso, eles sãoadequados para ser utilizados em um mesmo ensaio ou fazer parte de umacomposição que compreende combinações dos mesmos. Uma modalidadeparticular da invenção é constituída pelas composições que compreendemmisturas de vários dos referidos oligonucleotídeos. São especialmente pre-feridas as composições que compreendem misturas de oligonucleotídeosque correspondem a genes significativos para classificar uma amostra comoassociada a uma determinada neoplasia e/ou para determinar a evoluçãofutura da mesma. Constituem também modalidades especialmente preferi-das da invenção as composições que compreendem todos os oligonucleotí-deos do grupo composto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, 3681,8682,8683, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,
SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, S G252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, S G272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, S G 351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360,SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG 441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG470, SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490, SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499, SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508, SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517, SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526, SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535, SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544, SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553, SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562, SG563.
Adicionalmente, a invenção fornece oligonucleotídeos úteis pa-ra serem utilizados como controles no método da invenção. De um lado,como controles de integridade, fornecemos os pares de oligonucleotídeosSG463 e SG464 (complementares, respectivamente às extremidades 5' e 3'do gene de β-actina) e SG466 e SG467 (complementares, respectivamente,às extremidades 5' e 3' do gene GAPD). Adicionalmente, fornecemos osoligonucleotídeos SSPC1, SSPC2, SSPC3, SSPC4, SSPC5, SSPC6 eSSPC7, que podem ser utilizados como controles positivos internos exóge-nos da qualidade do processo depois de serem acrescentadas à amostraque contém o mRNA de partida moléculas de ácidos nucléicos poliadenila-dos que contenham fragmentos que em sua seqüência sejam corresponden-tes aos oligonucleotídeos (como podem ser os transcritos correspondentesaos genes dos quais os referidos oligonucleotídeos derivam) e que sejamsubmetidas ao mesmo processamento que o mRNA de partida, assim comoos oligonucleotídeos SCN2, SCN3, SCN6, SCN8, SCN11, SCN12 e SCN13,desenhados para serem utilizados como controles positivos de hibridização,e os oligonucleotídeos SCN1, SCN5, SCN7, SCN10, SC1, SC2, SC3, SC4,SC5, SC6 e SC7, desenhados para serem utilizados como controles negati-vos; todos eles satisfazem às condições de apresentar baixa homologia com genes humanos, além de satisfazer às mesmas condições dos oligonucleo-tídeos complementares a genes humanos de terem comprimentos similarese apresentarem todos eles conteúdos de GC compreendidos no intervalo de40% a 60%, corresponder a zonas situadas a menos de 3000 nucleotídeosda extremidade 3' (poli(A)) do mRNA no humano que seriam capazes de detectar e de ser constituídos por seqüências que coincidem em seu sentidocom as dos mRNA correspondentes. Qualquer composição contendo pelomenos um dos oligonucleotídeos SG463, SG464, SG466, SG467, SSPC1,SSPC2, SSPC3-, SSPC4, SSPC5, SSPC6, SSPC7, SCN2, SCN3, SCN6,SCN8, SCN11, SCN12, SCN13, SCN1, SCN5, SCN7, SCN10, SC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6 e SC7, em combinação com pelo menos um dos oli-gonucleotídeos complementares a genes humanos da invenção menciona-dos acima também é uma composição incluída no escopo da presente in-venção.
Prefere-se especialmente que os oligonucleotídeos que fazem parte de uma composição da invenção estejam presos a um suporte sólido.Em particular, são preferidas as composições nas quais a distribuição dosoligonucleotídeos sobre o suporte sólido seja de forma ordenada, que o su-porte sólido utilizado seja um vidro retangular semelhante aos porta-objetosde microscópio e que os oligonucleotídeos sejam presos ao vidro por meiode ligações covalentes; as composições que possuem tais característicassão identificadas no restante do relatório pelas palavras "microarray", "chip"ou "microchip". Entre estas composições na forma de microarray, dá-se pre-ferência especial àquelas que contêm mais de uma cópia de cada um dosoligonucleotídeos que fazem parte da mesma, preferindo-se muito especi-almente que o número de cópias de cada um dos oligonucleotídeos presen-tes seja de pelo menos 12.
Também está incluído no escopo da invenção qualquer disposi-tivo diagnóstico que compreenda uma composição da invenção. Com a ex-pressão "dispositivo diagnóstico" fazemos referência não apenas àquelesque servem para determinar se um indivíduo sofre ou não de uma doença,mas também àquelas que servem para classificar a doença de que sofre umindivíduo como pertencente a um subtipo associado a uma determinadaforma de evolução no futuro da referida doença e, portanto, também possu-em valor prognóstico da futura evolução da doença.
A invenção também fornece um método para diagnosticar umaneoplasia originada a partir de células hematopoiéticas e/ou prognosticar aevolução da mesma que compreende a detecção in vitro a partir de umaamostra biológica e a análise estatística dó nível de expressão de pelo me-nos um gene significativo para classificar a amostra como associada ou nãoà neoplasia, gene este que é selecionado do grupo composto por GABA-RAP, NPM3, ABCB1, ABCB4, ABCC3, ABCC5, ABCC6, ABHD1, ABL1,ACTN1, AF1q, AKR1A1, ALDH1A1, ALK, ANK2, ANPEP, ANXA6, ANXA7,APAF1, APEX, ARHGEF2, ARS2, ASNS, ATIC, ATM, ATP50, ΒΑΧ, BCL10,BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2LAA, BCL3, BCL6, BCL7A, BCL7b, BCR,BECN1, BIK, BIRC3, BIRC5, BLMH, BLR1, BLVRB, BMI1, BMP6, BRMS1,BST2, BTG1, BUB1, C21orf33, C5orfl3, CA12, CALD1, CANP2, CASC3,CASP1, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CAST,CATSD, CBFA2T1, CBFB, CCNA1, CCNB1, CCND1, CCND2, CCND3, CC-NE1, CCR6, CCR7, CCT6A, CD14, CD19, CD2, CD22, CD24, CD28, CD33,CD34, CD36, CD38, CD3E, CD4, CD44, CD47, CD48, CD5, CD58, CD59,CD6, CD7, CD79A, CD79B, CD8, CD81, CD83, CD86, CD9, CDA, CDC25A,CDC25B, CDK2, CDK4, CDK5R1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A,CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CDW52, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CFL1,CKMT1, CKS2, CML66, COL3A1, COL4A6, CR2, CREB1, CREBBP, CR-YAB1 CSF2, CSF3, CSRP2, CTGF, CTSB, CUZD1, CXADRj CXCL9, CX-CR3, CXCR4, CYC1, CYP1A1, CYP2A6, DAD-1, DAPK1, DCK, DDX6, DEK,DHFR, DLAD1 DNAJA1, DNMT3B, DNTT1 D0K1, DPF2, DPP4, DRG1,DRP2, E2F1, ΕΒ-1, ΕΒΙ2, EDF1, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G,EFNB1, EGFR1 EGR1, EIF2B2, EIF3S2, EIF4B, EIF4E, EIF5A, ELF1, ELF4,ΕΝΡΡ1, EphA3, EPOR, ERBB2, ERBB4, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC5,ERCC6, ETS1, ETS2, ETV6, ETV7, ΕΖΗ2, FABP5, FADD, FAIM3, FAM38A,FARP1, FAT1 FCER2, FCGR3A, FCGR3B, FGFR1, FGFR3, FGR, FHIT,FKBP9, FLI1, FLJ22169, FLT3, FN1, FNTB, FOS1 FUS, G1P2, GABPB2,GATA1, GATA2, GATA3, GCET2, GDI2, GGA3, GJA1, GLUD1, GNL3,GOT1, GRB2, GRIA3, GRK4, GSTP1, GSTT1, GUSB, GZMA, H2AFX,H3F3A, HCK, HELLS, HIF1A, HIST1H2BN, HLA-A, HLA-DPA1, HLA-DQA1,HLA-DRA, HLA-DRB3, HLF, HMMR, HNRPH3, HNRPL, ΗΟΧΑΙΟ, ΗΟΧΑ9,HOXD8, HOXD9, HRAS, HSD17B1, HSPB1, IBSP, ICAM1, ICAM3, ID2, I-ER3, IFRD1, IGFBP2, IGFBP3, IGFIR, IGLV6-57, IL10, IL15, IL1B, IL2,IL2RA, IL3, IL32, IL3RA, IL4R, IL6, IL6R, IL8, ILF2, IRF1, IRF2, IRF4, IRF8,ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1,ITGB2, JAK1, JAK2, JUNB1 KAM1 ΚΙΑΑ0247, ΚΙΑΑ0864, KIT, KLF1, KLF13,KRAS2, KRT18, LADH, LAG3, LASP1, LCK, LCP1, LEPR1 LGALS3,LGALS7, LIF, LIMS1, LM02, LOC285148, LRP, LSP1, LYL1, LYN, LYZ,MAFB, MAFK, MAGEA1, MAL, ΜΑΡ3Κ12, ΜΑΡ4Κ1, ΜΑΡΚ10, ΜΑΖ, ΜΒΡ1,MCL1, MCM3, MCM7, MDM2, MEIS1, ΜΕΝ1, MERTK, ΜΚΙ67, MLF1, MLF2,MLL1 MLLT10, MME1 ΜΜΡ2, ΜΜΡ7, ΜΜΡ8, ΜΜΡ9, MNDA1 MPL1 ΜΡΟ,MRPL37, MS4A1, MTCP1, MUC-I1 ΜΧ1, MYB, MYBL1, MYC, MYOD1,NCALD, NCAM1, NCL1 NDP52, NDRG1, NDUFA1, NDUFB, NF1, NFATC1,NFIC1 NFKB1, NFKB1A, NINJ1, ΝΡΜ1, NR3C1, NUMA1, NXF1, 0DC1,OGGI, 0LIG2, 0PRD1, p14ARF, P55CDC, PABPC1, ΡΑΧ5, ΡΑΧ6, ΡΑΧ8,ΡΒΧ1, ΡΒΧ3, PCA1, PCD1 PCNA1 PDCD1, PDGFA, PDGFRB, PDHA1,PGF, PGRMC1, PICALM, PLA2G6, PLAU, PLK1, PLP1 PLS3, PLZF1 PML1ΡΜΜ1, POLR2C, POU2F2, PPP1CC, PRAME, PRKCI, PRKCQ, PRKDC,PRL, PRTN3, PSMA5, PSMB4, PSMC5, PSMD7, ΡΤΕΝ, PTGS1, PTHLH1ΡΤΚ2, ΡΤΚ2Β, PTN, PTPRCCD, PYGΒ, RAD51, RAF1, RAG1, RARA,RARB, RBI, RBBP4, RBBP6, RBBP8, RBP4, RET, RGS1, RGS1, RIS1,RORA, RPL17, RPL23A, RPL24, RPL36A, RPL37A, RPL41, RPS3, RPS5,RPS9, RUNX1, RXRA, S100A2, S100A8, SDC1, SDHD, SELE, SELLjSEPW1, SERPINA9, SERPINB5, SERPNINA9, SFTPB, SIAT4A, SLC7A5,SNRPB, SOSTDC1, SP1, SPI1, SPN, SPRR1A, SREBF1, SSBP1, STAT1,STAT3, STAT5B, SUM01, TACSTD2, TAGLN2, TAL1, TBP, TCEB1, TCFI,TCF3, TCF7, TCL1A, TCRbeta, TEGTs TERF1, TERT, TFCP2, TFRC,THBS1, THPO, ΤΙΑ-2, ΤΙΑΜ1, ΤΚ1, TLX1, ΤΜΕΜ4, TNF, TNFRSF10C, TN-FRSF1A, TNFRSF25, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF8, TNFSF10, TNFSF5,TNFSF6, ΤΟΡ2Α, TOPORS, ΤΡ73, TRA TRADD, TRAF3, TRAP1,TRIB2,TXNRD1, UBE2C, UHRF1, UVRAGj VCAM1, VEGF, VPREB1, WBSCR20C,WNT16, WTI, XBPI, XPOe, XRCCS, XRCC5, ΖΑΡ70, ZFPL1, ZNF42,ZNFN1A1, ΖΥΧ, 18S rRNA, 28S rRNA, e cujo nível de expressão é determi-nado por meio da avaliação da concentração de seu mRNA correspondentepelo uso de pelo menos uma sonda que possui uma seqüência complemen-tar a um fragmento de um cordão do referido gene, sonda esta que é sele-cionada do grupo de oligonucleotídeos composto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108,SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117,SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126,SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135,SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144,SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153,SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SGI88, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, S G333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351, S G352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441,34
10
15
20
25
SG442, SG443SG451, SG452SG460, SG461SG473, SG474SG482, SG483SG491, SG492SG500, SG501SG509, SG510SG518, SG519SG527, SG428SG536, SG537SG545, SG546SG554, SG555
SG444, SG445SG453, SG454SG462, SG465SG475, SG476SG484, SG485SG493, SG494SG502, SG503SG511, SG512SG520, SG521SG529, SG530SG538, SG539SG547, SG548SG556, SG557
S G 446SG455SG468SG477SG486SG495SG504SG513SG522SG531SG540SG549SG558
SG447, SG448, SG449SG456, SG457, SG458SG469, SG470, SG471SG478, SG479, SG480SG487, SG488, SG489SG496, SG497, SG498SG505, SG506, SG507SG514, SG515, SG516SG523, SG524, SG525SG532, SG533, SG534SG541, SG542, SG543SG550, SG551, SG552SG559, SG560, SG561
SG450,SG459,SG472,SG481,SG490,SG499,SG508,SG517,SG526,SG535,SG544,SG553,SG562,
SG563.
Os genes que fazem parte do grupo anteriormente mencionadosão genes humanos. Por isso, a seguir sempre que foram utilizadas as pala-vras "sujeito" ou "indivíduo" elas se referem a um ser humano.
Um caso particular deste método é aquele que compreende umaetapa prévia adicional de identificação de genes significativos para a classi-ficação da amostra biológica analisada como associada ou não associada aum tipo concreto de neoplasia originada a partir de células hematopoiéticas,classificação na qual está incluído não apenas o diagnóstico da existênciada referida neoplasia no indivíduo do qual foi extraída a amostra, mas quetambém pode consistir, adicionalmente ou alternativamente, na discrimina-ção entre subtipos específicos da referida neoplasia que correspondem aformas futuras de evolução da referida neoplasia diferentes constituindo as-sim a classificação em um ou outro subtipo um prognóstico da evolução daneoplasia considerada no futuro. Neste caso particular do método da inven-ção que compreende uma etapa prévia de identificação de genes significati-vos para realizar a classificação desejada, a referida etapa prévia compre-ende as subetapas de:
a) decidir as possíveis categorias nas quais a amostra pode serclassificada;
b) obter amostras biológicas de indivíduos que foram anterior-mente classificados por um método diferente ao reivindicado em alguma daspossíveis categorias de classificação, de maneira que se tenham amostrasde cada uma das possíveis categorias;
c) obter o mRNA total de cada uma das amostras;
d) obter o cRNA total correspondente, marcado por meio de ummétodo que permite sua detecção posterior, de pelo menos uma alíquota decada uma das amostras de mRNA, alíquota à qual se acrescenta antes daobtenção do cRNA pelo menos uma seqüência de nucleotídeos poliadenilà-da de baixa homologia com genes humanos para que sirva como controlepositivo interno do processo;
e) acrescentar a cada uma das alíquotas de cRNA que será uti-lizada na etapa f) pelo menos um oligonucleotídeo de .baixa homologia comgenes humanos distinto de e não complementar a qualquer possível se-qüência de nucleotídeos que tenha sido acrescentado na etapa d), para quesirva como controle positivo de hibridização;
f) hibridizar, em condições estritas, pelo menos uma alíquota decRNA total de cada uma das amostras com pelo menos um microarráy quecompreende pelo menos duas cópias de cada um dos oligonucleotídeos dogrupo composto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108,SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117,SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243 SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405,SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414,SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423,SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432,SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441,SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450,SG451, SG452, SG453, S G454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459,SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472,SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481,SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490,SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, S G497, SG498, SG499,SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508,SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563, microarray este que compreende adicionalmente:
a. pelo menos dois pontos que correspondem as suas respecti-vas alíquotas do solvente no qual estavam os oligonucleotídeos no momentode seu depósito sobre a superfície do microarray, para que sirvam comoreferência,
b. pelo menos duas cópias de pelo menos um oligonucleotídeopara cada uma das seqüências poliadeniladas acrescentadas na etapa d),oligonucleotídeo cuja seqüência será correspondente a um fragmento, dis-tinto da zona de poliadenilação, da seqüência de nucleotídeos poliadeniladacuja evolução no processo deve ser controlada;
c. para cada um dos oligonucleotídeos acrescentados na etapa
e), pelo menos duas cópias de um oligonucleotídeo complementar ao mes-mo;
d. pelo menos duas cópias de cada membro de pelo menos umpar de oligonucleotídeos onde a seqüência de um dos membros correspon-de a uma seqüência da zona 5' e a seqüência do outro corresponde a umaseqüência da zona 3' do mRNA de um gene que é expresso de forma cons-titutiva em qualquer célula de origem hematopoiética;
e. pelo menos duas cópias de pelo menos um oligonucleotídeo5 de baixa homologia com genes humanos distinto de qualquer dos oligonu-cleotídeos definidos no item b. e distinto de qualquer dos oligonucleotídeossintéticos acrescentados de forma opcional na etapa e);
g) detectar e quantificar o sinal de cRNA hibridizado com cadauma das cópias de cada um dos oligonucleotídeos presentes no microarray,assim como o sinal correspondente aos pontos do solvente;
h) calcular o nível médio de intensidade de hibridização de cadaum dos oligonucleotídeos do microarray calculando a média das intensida-des das cópias de cada um dos oligonucleotídeos;
i) dar a hibridização por válida se satisfeitas as seguintes condi-ções:
a. a relação entre a intensidade média e o fundo médio de todosos oligonucleotídeos do microarray é maior que 10;
b. o valor do coeficiente de variação médio de todas as réplicasde oligonucleotídeos deve ser inferior a 0,3;
c. o valor médio de controle negativo deve ser inferior a 2,5 ve-zes o valor médio dos pontos correspondentes ao solvente;
d. existe sinal tanto nos controles de hibridização como nos con-troles positivos internos utilizados como controle do processo;
j)normalizar os dados;
k) eliminar os oligonucleotídeos com valores de intensidade mé-dia menos ruído de fundo médio inferiores a aproximadamente 2 vezes ovalor médio obtido com os pontos correspondentes ao solvente, assim comoos oligonucleotídeos com intervalo interquartílico de intensidade normalizadaao longo das amostras menor que 0,3;
l) realizar a análise estatística para encontrar os oligonucleotí-deos estatisticamente significativos para diferenciar entre as diferentes ca-tegorias e poder realizar a classificação de uma amostra que não tenha sidoanteriormente atribuída a nenhuma categoria, escolhendo os referidos oli-gonucleotídeos entre aqueles que não tenham sido eliminados nas etapasanteriores, até obter os "n" oligonucleotídeos que ou apresentam um valorde ρ inferior a um limite escolhido do intervalo aberto de 0 a 0,05, utilizandopara isso de preferência um método capaz de reduzir os falsos positivos, ousão os que melhor definem as categorias estabelecidas;
m) comprovar que o agrupamento das amostras segundo asdiferenças nas intensidades entre as diferentes amostras detectadas paraos oligonucleotídeos estatisticamente significativos resulta no fato de asamostras continuarem classificadas nas mesmas categorias para as quaishaviam sido atribuídas anteriormente por um método diferente.
Prefere-se que o valor médio calculado no item h) seja uma mé-dia limitada, para o qual é preferível que o microarray compreenda pelo me-nos quatro cópias de cada um dos oligonucleotídeos nele presentes.
A normalização pode ser feita por diferentes métodos. Dá-sepreferência à utilização de funções contidas nos programas de livre acessopela Internet desenhados para a manipulação, o cálculo e a representaçãográfica de dados, como os programas desenhados para a linguagem deprogramação R, disponíveis para serem baixados de CRAN (http://cran.r-proiect.org/) ou Bioconductor (http://www.bioconductor.org)· Prefere-se es-pecialmente o método "variance stabilization normalization" disponível noprograma "vsn" de R.
A identificação dos oligonucleotídeos estatisticamente significa-tivos para diferenciar entre as diferentes categorias pode ser feita por dife-rentes métodos, sendo preferíveis aqueles que determinam um valor ρ quedetermina o umbral de probabilidade abaixo do qual todos os genes cujadiferença de expressão tenha um valor menor que ρ seriam consideradossignificativos e, entre eles, aqueles que têm capacidade para efetuar corre-ções sobre o valor de p, como, por exemplo, entre outros, o método de Bon-ferroni ou o teste de Welch. O valor de ρ será escolhido no intervalo abertode O a 0,05, sendo preferíveis, quando possível, valores de ρ próximos a0,001 e com correção, o referido valor podendo ser aumentado até o máxi-mo de 0,05 (valor que não está incluído entre os possíveis) até que sejamencontrados oligonucleotídeos estatisticamente significativos para diferenci-ar entre as categorias entre as quais se desejada classificar as amostras.Uma possibilidade para fazer esses cálculos é, mais uma vez, a utilizaçãode funções contidas em programas de livre acesso pela Internet desenha-dos para a manipulação, o cálculo e a representação gráfica de dados. Naverdade, para a identificação dos oligonucleotídeos estatisticamente signifi-cativos é possível utilizar a função mt.maxT do programa multtest de R.
Outra possibilidade para a identificação de oligonucleotídeosestatisticamente significativos para poder diferenciar entre as categorias deamostras estabelecidas é a utilização do método de "nearest shrunken cen-troids", uma variação do método de "nearest centroids" (Tibshirani et ai,2002), que identifica um grupo de genes que caracteriza melhor uma classepredefinida e utiliza este grupo de genes para prever a classe à qual perten-cem novas amostras. Para tanto, é possível recorrer mais uma vez a fun-ções contidas em programas de livre acesso pela Internet, como o programa"pama" de R, onde é possível encontrar funções para realizar a chamada"Prediction Analysis for Microarrays (PAM)", que usa o método de "nearestshrunken centroids".
Uma vez identificados os genes estatisticamente significativospara distinguir entre categorias de amostras estabelecidas a partir dos oligo-nucleotídeos correspondentes, eles podem ser utilizados para classificarnovas amostras por semelhança entre o perfil de expressão desses genesna amostra analisada e o correspondente a alguma das categorias de clas-sificação. Alternativamente, quando as possíveis categorias de classificaçãosão apenas 2 (que é o normal quando se quer diagnosticar a presença ouausência de um determinado tipo de leucemia em um indivíduo), é possívelobter uma função matemática de classificação de amostras que determine ovalor da probabilidade "ρ," de que uma amostra "i" pertence a uma ou a ou-tra categoria. Para tanto, escolhe-se um subconjunto das amostras que te-nham sido anteriormente atribuídas a cada uma das possíveis categoriaspor um método diferente do método da invenção e associa-se arbitrariamen-te o valor 0 à probabilidade correspondente a cada uma das amostras deuma das categorias "a" (normalmente, a categoria de "não associado à leu-cemia que se deseja diagnosticar") de pertencer à outra possível categoria,enquanto que cada uma das amostras do subconjunto pertencente à outrapossível categoria "b" (normalmente, a categoria de "associado à leucemiaque se deseja diagnosticar") recebe arbitrariamente o valor "1" para suaprobabilidade de pertencer a sua própria categoria. Com isso, utiliza-se re-gressão logística para calcular, com ajuda dos valores de probabilidade atri-buídos a cada uma das amostras e dos valores de intensidade média redu-zida normalizada obtidos para cada uma das amostras com cada um dos "n"oligonucleotídeos que tenham sido identificados como oligonucleotídeo esta-tisticamente significativo na etapa anterior, coeficientes para cada um dosreferidos oligonucleotídeos que permitem obter uma função de probabilidadeρ, de que uma amostra "i" pertence à categoria "b", função esta que será dotipo
ρ, = 1/(1+e"xi)
e que resulta da transformação algébrica da expressão que iguala o Iogarit-mo neperiano do quociente entre a probabilidade de que ocorra um sucessoe a probabilidade de que ele não ocorra a uma função x, que inclui comovariáveis cada um dos fatores que podem ter influência no sucesso, isto é
<formula>formula see original document page 42</formula>
função χ, que, no presente caso, dependerá dos valores de intensidade obti-dos para cada um dos oligonucleotídeos estatisticamente significativos eque satisfaz a uma expressão do tipo:
<formula>formula see original document page 42</formula>
onde
coef_oligm representa o coeficiente calculado para um oligonu-cleotídeo concreto "m"Imni_Oligm representa o valor médio de intensidade normalizadaobtido na hibridização da amostra e calculado para o oligonucleotídeo "m"
"m" varia de 1 a "n"
n é o número total de oligonucleotídeos considerados significati- vos
A função ρi obtida depois do cálculo por regressão logística docoeficiente correspondente a cada oligonucleotídeo permite classificar umaamostra "i" como pertencente a uma ou outra categoria, considerando-seque os valores de p, superiores a 0,5 (e que serão menores ou iguais a 0) indicam que a amostra pertence à categoria "b", ao passo que os valores deρi inferiores a 0,5 indicam que a amostra pertence à categoria "a". A referi-da função ρi será considerada válida se, ao ser aplicada às amostras a partirdas quais ela foi deduzida, for capaz classificá-las corretamente e, ainda, aoser aplicada ao subgrupo de amostras que não foram levadas em conta pa- ra deduzir a função mas cuja categoria é conhecida por ter sido anterior-mente atribuída por um método diferente do método da invenção, tambémfor capaz de classificá-las corretamente.
Alternativamente, quando a identificação dos genes estatistica-mente significativos foi efetuada utilizando o método de "Prediction Analysis for Microarrays", o classificador pode ser obtido com as funções correspon-dentes do programa "pamr3" de R, que também parte da atribuição do valorde probabilidade 0 a um subgrupo de membros de uma das categorias e dovalor de probabilidade 1 a um subgrupo de membros da outra categoria.Mais uma vez, o cálculo de coeficientes para oligonucleotídeos estatistica- mente significativos permite o cálculo de valores de probabilidade de perti-nência a uma ou outra categoria, igualmente considerando-se que os valo-res superiores a 0,5 indicam a pertinência à categoria para cujos membrosfoi arbitrariamente atribuído o valor 1 e os valores inferiores a 0,5 indicam apertinência à outra categoria. Um caso particular do método da invenção é aquele no qual sedeseja classificar amostras como associadas ou não a algum tipo de leuce-mia. Neste caso, são preferidas as amostras de sangue, especialmente desangue periférico, como amostras biológicas para realizar in vitro o métododa invenção.
Uma vez identificados os genes estatisticamente significativospara associar uma amostra a um determinado tipo de neoplasia originada apartir de células hematopoiéticas, o método da invenção pode ser utilizadopara classificar amostras segundo o nível de expressão dos referidos genesnas referidas amostras. A neoplasia pode ser, por exemplo, um tipo concre-to de leucemia. Um caso particular desta realização do método da invençãoé constituído pela associação de uma amostra à leucemia linfática crônica,permitindo assim o diagnóstico desta doença por meio do método da inven-ção. Para isso, são considerados genes significativos cujo nível de expres-são é analisado por aplicação do método da invenção pelo menos aquelesdo grupo de CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1 e a análiseé realizada em amostras de sangue. O método pode ser aplicado incluindoadicionalmente a análise do nível de expressão pelo menos dos genes IRF8e COL3A1. De preferência, a análise do nível de expressão destes genes érealizada avaliando o nível de seus mRNA correspondentes por hibridizaçãode seu cRNA correspondente com os oligonucleotídeos SG117, SG428,SG459, SG507, SG508, SG461 e SG493, que de preferência estão âssoci-ados a um suporte sólido fazendo parte de um microarray. Quando a avalia-ção do cRNA hibridizado com cada um desses oligonucleotídeos é feita gra-ças à marcação prévia do cRNA com biotina, à coloração do microarray hi-bridizado com estreptavidina conjugada a um fluoróforo e à detecção do si-nal emitido pelo referido fluoróforo, prefere-se que o fluoróforo seja Cy3, oque permite o diagnóstico da presença de LLC no indivíduo do qual a amos-tra foi extraída por meio da classificação da amostra "i" analisada como as-sociada à LLC a partir do cálculo da probabilidade de que a referida amos-tra esteja associada à LLC a partir da fórmula p, = 1/(1 +e"*), onde x, é calcu-lado pela fórmula
Xi = -719,241486 + (2,44756372 * lmnLCD79A) + (7,38657611 * Im-ni_FAIM3) + (23,1465464 * ImniJ-ILA-DRA) + (43,6287742 * ImniJRFe) -(19,3978182 * lmni_COL3A1) - (2,80282646 * lmni_HLA-DRB3) +(49,5345672 *lmrii_HLA-DQA1)
nesta fórmula cada um dos valores denominados pela abrevia-ção "Imni" seguida da abreviação de um gene refere-se ao valor médio deintensidade normalizado obtido depois de detectar o sinal de hibridizaçãocorrespondente ao oligonucleotídeo que está sendo utilizado como sondapara avaliar a expressão do referido gene
e que permite classificar o indivíduo como indivíduo que não so-fre de LLC se o valor de pi for menor de 0,5 e como indivíduo que sofre deLLC se o valor de p, for maior de 0,5.
Alternativamente, podem ser considerados genes significativoscujo nível de expressão é analisado pela aplicação do método da invençãopara o diagnóstico da LLC pelo menos aqueles do grupo de CD79A, FAIM3,HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1, incluindo adicionalmente a análise donível de expressão pelo menos do gene CDW52. De preferência, a análisedo nível de expressão desses genes é efetuada avaliando o nível de seusmRNA correspondentes por hibridização de seu cRNA correspondente comos oligonucleotídeos SG117, SG428, SG459, SG507, SG508 e SG237, queestão de preferência associados a um suporte sólido fazendo parte de ummicroarray.
Outro caso particular da aplicação do método da invenção paraclassificar amostras como associadas a um tipo concreto de leucemia se-gundo o nível de expressão nas referidas amostras de genes estatisticamen-te significativos é constituído pela classificação de uma amostra como asso-ciada a um subtipo concreto de leucemia linfática crônica, à LLC "estável"ou à LLC "progressiva", o que permite que o método da invenção sirva paraprognosticar a futura evolução de indivíduos que tenham sido diagnostica-dos com LLC. Quando as amostras analisadas são de sangue periférico, osgenes considerados estatisticamente significativos para realizar a classifica-ção das amostras são pelo menos os genes PSMB4, FCER2 e POU2F2,podendo ser adicionalmente analisado o nível de expressão de pelo menosum gene selecionado do grupo composto por ODC1, CD79A, CD2, CD3E,CD5, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, C-ML66, PLZF, RBP4 ou todos eles.
Um aspecto adicional da invenção é constituído pelo uso de dis-positivos para avaliar o nível de expressão de pelo menos um dos genes dogrupo composto por PSMB4, FCER2, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E,CD5, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, C-ML66, PLZF, RBP4, CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1,IRF8 e COL3A1 com a finalidade de diagnosticar a presença de LLC em umindivíduo e/ou prognosticar sua evolução. Um caso particular deste aspectoda invenção é o uso de dispositivos de avaliação do nível de expressão depelo menos um gene do grupo composto por CD79A, FAIM3, HLA-DRA,HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 e COL3A1 para o diagnóstico da presença deLLC em um indivíduo, no qual prefere-se que o dispositivo avalie pelo me-nos o nível de expressão dos genes CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3,HLA-DQA1, o dispositivo podendo avaliar, adicionalmente, o nível de ex-pressão pelo menos dos genes IRF8 e COL3A1 ou ainda pelo menos dogene CDW52. Outro caso particular deste aspecto da invenção é o uso dedispositivos de avaliação do nível de expressão de pelo menos um gene dogrupo composto por PSMB4, FCER2, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E,CD5, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, C-ML66, PLZF, RBP4, CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1,IRF8 e COL3A1 para prognosticar a evolução futura da LLC em um indivíduo.
Descrição Detalhada da Invenção: desenho do dispositivo "microarrav"Genes incluídos no "microarrav"
Foi feita uma revisão da literatura científica e genes foram sele-cionados pelo seu envolvimento especial na biologia de células sangüíneasou na patologia das diferentes neoplasias. Os genes selecionados podemser incluídos nesses 4 grandes grupos:
a) Com papel importante na biologia das células hematopoiéticas:
- Genes cuja proteína é expressa ou reprimida nas diferentesetapas atravessadas por estas células em sua diferenciação até formas ma-duras.
- Genes cuja proteína é expressa de forma específica em funçãoda linhagem à qual a célula pertence.
- Genes que codificam moléculas de adesão
b) Envolvidos em diferentes tipos de neoplasias hematológicas:
- Genes cuja expressão (a nível de mRNA ou de proteína) é alte-rada em diferentes tipos de neoplasias, ou associados à resistência à quimi-oterapia
c) Relacionados com câncer:
- Genes que codificam proteínas associadas à proliferação, me-tástase ou genes cuja expressão aparece aumentada em grande número detumores.
d) Descritos em publicações relacionadas com neoplasias:
- Genes que sem ter uma relação especial com neoplasias he-matológicas nem com biologia de células sangüíneas, surgiram na literaturacientífica como estatisticamente associados a um tipo de neoplasia
As características dos genes podem ser consultadas, por exem-plo, em: www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, selecionando-se a opção "Gene"na janela que aparece e introduzindo-se o número de identificação corres-pondente (GenID) no GenBank. Os genes cuja expressão pode ser anali-sada com o microarray, seu número de identificação correspondente noGenBank, assim como os oligonucleotídeos presentes no microarray a se-rem utilizados como sondas para analisar a expressão dos referidos genesestão mostrados abaixo na Tabela 1.
Sondas de oligonucleotídeos que representam cada gene
Para cada um dos 534 genes relacionados com neoplasias he-matológicas, assim como para os genes correspondentes à β-actina, glice-raldeído-3-fosfato desidrogenase, 18S rRNA e 28S rRNA, foi procurada noGenBank (www.ncbi.hlm.nih.gov/Genbank/) a seqüência do mRNA. A partirda seqüência do GenBank foi desenhado um oligonucleotídeo (sonda) es-pecífico para cada um dos genes selecionados. Em alguns genes foram de-senhados vários oligonucleotídeos situados nas zonas 5' e 3' do gene, como objetivo de analisar a integridade dos mRNA.
Para assegurar especificidade no desenho das sondas os se-guintes critérios foram levados em conta:
- Comprimento da sonda para garantir que todas as sondastenham um comportamento parecido,
- Conteúdo de GC da sonda entre 40 e 60%. Esta caracterís-tica também foi levada em conta para assegurar que todas sondas tenhamum comportamento parecido
- Localização no gene. Foram selecionadas sondas Iocaliza-das a menos de 3000 nucleotídeos da extremidade 3' (poli(A)) da seqüênciade mRNA selecionada.
- Sentido da sonda. Foi escolhido o cordão com sentido"sense", isto é, as seqüências dos oligonucleotídeos coincidem com se-qüências de fragmentos dos mRNA correspondentes, em vez de serem se-quências complementares aos referidos fragmentos. Esta decisão implicaque o material genético marcado tem que ser anti-sentido, "antisense"(complementar a "sense").
- Especificidade da sonda. Para evitar que haja hibridizaçãoinespecífica foram selecionadas sondas que tinham uma percentagem dehomologia, calculada por meio da ferramenta BLAST (disponível na páginaweb http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), inferior a 70%.
Os dados sobre os oligonucleotídeos utilizados como sondas, onúmero de identificação de sua seqüência correspondente na listagem anexa,assim como dados (número de identificação no GenBank, abreviação usual enome) dos genes para detecção da expressão dos quais foram desenhadosos referidos oligonucleotídeos estão mostrados adiante na Tabela 1.
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados como sondas para detectar a ex-pressão de genes humanos
<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>Entre esses genes, quatro deles (ACTB, GAPD, 18S rRNA e28S rRNA), não têm uma relação uma relação especial com neoplasias eforam inicialmente incluídos no microarray porque, durante muito tempo,acreditou-se que sua expressão se mantinha constante e eram utilizados nahora de normalizar os dados de microarrays: são o tipo de genes aos quaisfazemos alusão quando falamos de genes "constitutivos" em outras partesdo relatório. Na verdade, não se acredita que existam genes cuja expressãose mantenha constante em qualquer circunstância, e por isso no presenteestudo os genes ACTB, GAPD, 18S rRNA e 28S rRNA receberam o mesmotratamento que os outros genes do microarray, exceto pelo fato de que osprimeiros foram utilizados como controles de integridade, como descritomais adiante.
Na Tabela pode-se observar que há genes que estão represen-tados por mais de um oligonucleotídeo. Isto se dá porque a existência deduas ou mais sondas por gene pode ser utilizada para medir a integridadedo cRNA sintetizado. Os genes para os quais mais de um oligonucleotídeofoi desenhado para agir como sonda, cada uma delas hibridizando com umaseqüência distinta, estão indicados a seguir na Tabela 2.
Tabela 2. Genes representados por mais de um oligonucleotídeo como sonda
<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>
Estabelecimento de sondas de controle
Para diminuir a variabilidade foi incluído um grande número decontroles em cada "microarray". Acredita-se que estes controles são umamedida objetiva sobre a qualidade do processo e portanto, da qualidade dosdados obtidos. Eles são de vários tipos e procedências:
a) Sondas utilizadas como controles de integridade
Estas sondas foram 2 pares de oligonucleotídeos complementa-res nas extremidades 5' e 3' dos genes β-actina (sondas código SG463 eSG464) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (sondas código SG466 eSG467). A relação entre as intensidades da sonda localizada nas extremi-dades 3' e 5' permite comprovar a qualidade do RNA de partida e o funcio-namento da reação de marcação. Os detalhes sobre esses oligonucleotí-deos aparecem na Tabela 3.
Tabela 3.- Oligonucleotídeos utilizados como controles de integridade
<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>
b) Sondas utilizadas como controles negativos
Estas sondas são formadas em sua grande maioria por um gru-po de oligonucleotídeos de 50 nucleotídeos (50-meros) que não são com-plementares a nenhuma seqüência humana conhecida. A ferramentaBLAST foi aplicada a estas sondas e verificou-se que elas não hibridezacom nenhuma seqüência humana. Elas foram identificadas pelos códigosSC1 (SEQ ID N°:564), SC2 (SEQ ID N°:565), SC3 (SEQ ID N°:566), SC4(SEQ ID N°:567), SC5 (SEQ ID N°:568), SC6 (SEQ ID N°:569) e SC7 (SEQID N°:570) e também foram utilizados como controles negativos os oligonu-cleotídeos SCN1 (SEQ ID N°:571), SCN5 (SEQ ID N°:575), SCN7 (SEQ IDN°:577) e SCN10 (SEQ ID N°:580). Eles são utilizados para determinar ascondições ótimas de hibridização, lavagem e revelação dos "chips" ou "mi-croarrays". O aparecimento de sinal associado a eles indica a existência dehibridização inespecífica.
c) Sondas exógenas utilizadas como controles positivos internos: "Spikedcontrois"
Os "Spiked controis" são oligonucleotídeos sintéticos cuja se-qüência coincide com um fragmento de um transcrito de um gene não hu-mano ou de qualquer outra seqüência de nucleotídeos de baixa homologiacom transcritos de genes humanos que esteja poliadenilada em 3', que éutilizada como controle positivo, na determinação da qualidade do processo,na normalização de dados e para o estabelecimento do intervalo linear doprocesso (Benes V et al., 2003). Para isso, os transcritos ou seqüências po-Iiadeniladas correspondentes são adicionados ao RNA total de partida antesde começar o processo de marcação e, portanto, sofrem as mesmas rea-ções (marcação, hibridização e revelação) que o RNA total das amostras.Foram utilizados 7 "Spiked controis". Para assegurar baixa homologia comgenes humanos foram utilizados 5 transcritos de genes de Bacillus subtilis(dap, thr, trp, phe e lys) e 2 transcritos de genes do vírus de Sharka, quegeralmente é mencionado por sua denominação em inglês "Plum poxvírus"(Sppv), que é um vírus de plantas. Os detalhes sobre estos oligonucleotí-deos estão mostrados mais adiante na Tabela 4. Os números de ATCC (A-merican Type Culture Collection) que aparecem depois do nome dos genesde procedência referem-se ao número de identificação na ATCC de cepasde E. coli que contêm plasmídios recombinantes que contêm a seqüênciados genes a partir dos quais são obtidos transcritos que são adicionados aoRNA e que também foram utilizados para o desenho das seqüências dòsoligonucleotídeos correspondentes ligados ao microarray.
Tabela 4.- Oligonucleotídeos utilizados como "Spiked Controls"
<table>table see original document page 84</column></row><table>c. 1.: Preparação dos 5 "Spiked controis" de Bacillus subtilis
As bactérias de E. coli com os plasmídios recombinantes foramadquiridas no ATCC (Rockville, MD. USA). Os plasmídios (pBluescript Il-KS) continham o cDNA clonado de um gene de Bacillus subtilis, com sítiosde corte para as enzimas Notl na extremidade 5' e BamHI na extremidade3' e uma extensão poli (dA) anterior ao sítio de corte para BamHI.
Depois de reconstituir e deixar crescer as células durante todauma noite a 379C em meio LB+Ampicilina, procedeu-se à obtenção doplasmídio com o kit Midipreps (Jetstar) seguindo as recomendações do fa-bricante. 10 pg de cada um dos plasmídios foram Iinearizados por digestãocom 30U da enzima de restrição Notl, na presença do tampão 1XNE3 e1XBSA durante 3 horas a 37eC. Os plasmídios Iinearizados foram submeti-dos à extração com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Ambion), precipita-ção com 0,1 vol. de acetato de sódio 3 M (Sigma) e 2,5 vol. de etanol 100%e eliminação dos sais com etanol 80%, dé acordo com o protocolo descritoanteriormente. O DNA obtido foi ressuspendido em 10 μΙ de água livre deRNases.
Em seguida foi efetuada a síntese dos transcritos com sentido"sense" com uma reação de transcrição in vitro (I.V.T) a partir de 1 pg deplasmídio Iinearizado utilizando o kit MegaScript T3 (Ambion) e seguindo asrecomendações do fabricante. Os plasmídios obtidos foram purificados como kit RNeasy Total RNA Isolation Kit (QIAGEN), seguindo as recomenda-ções do fabricante.
Foram realizadas a quantificação, determinação da pureza, qua-lidade e tamanho dos transcritos obtidos seguindo os mesmos procedimen-tos descritos mais adiante para o RNA total.
c.2. Preparação dos 2 "Spiked controis" que representam genes de SPPV
Os plasmídios recombinantes (Progenika Biopharma) continhamo cDNA clonado dos dois genes sppvl e sspv2 inseridos entre dois sítios derestrição Pvull e Pstl. A extremidade 3' de cada inserção contém uma ex-tensão de poliadenilação.Células JM109 foram transformadas com os plasmídios quecontinham os transcritos. Às células foram deixadas crescer em placas commeio LB+ ampicilina a 37QC, e as colônias com as células transformadasforam selecionadas e cultivadas em meio líquido LB+AMP.
A recuperação dos plasmídios foi realizada com o kit MidiprepsPlasmid Purificación (Qiagen), seguindo as recomendações do fabricante.pg de cada plasmídio foram Iinearizados com 30U da enzima de restriçãoPvull. A inserção foi extraída com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Ambi-on), precipitação com 0,1 volumes de acetato de sódio 7,5 M e 2,5 volumes10 de etanol 100%. Os sais foram eliminados por meio de duas lavagens cometanol 80%. O DNA obtido foi ressuspendido em 10 μΙ de água livre deRNases.
Em seguida foi efetuada a síntese dos transcritos a partir de 1Mg de cada plasmídio Iinearizado com o kit T7 MegaScript (Ambion) e se-guindo as recomendações do fabricante. O produto da reação foi lavadocom o kit RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen).
Subseqüentemente foram realizadas a quantificação, a medidada pureza dos transcritos obtidos e a determinação de seu tamanho.
A partir dos transcritos obtidos foi preparada uma solução de"Spiked controis" com concentrações diferentes de cada um dos "spiked"(vide Tabela 3) de forma a cobrir toda a faixa de intensidades do sistema deleitura "scanner" (valores de intensidade que variam de 0 a 65.535 em uni-dades arbitrárias). Esta solução foi adicionada na mesma quantidade a 5 Mgde RNA total de partida de cada amostra antes de iniciar o processo.c.3. Desenho de sondas representativas de cada um dos transcritos:
Para que o comportamento das sondas fosse o mais parecidopossível com o comportamento das sondas desenhadas para os genes aserem estudados, com o programa Oligo 6.0 (M.B.I) foram selecionadas pa-ra cada "Spiked control" as seqüências que satisfaziam os mesmos requisi-tos estabelecidos para as sondas dos genes representados (comprimento,conteúdo GC, cordão "sense" e distância à extremidade 3') e que não for-mavam anéis estáveis (energia menor de -7 Kcal/mol). Às seqüências quesatisfaziam estes requisitos foi aplicada a ferramenta BLAST e foi escolhidaaquela de menor homologia com seqüências humanas.
Depois de depositar e imobilizar as sondas correspondentes aos"Spiked controis" sobre o cristal, foi comprovado: a) que as sondas não hi-bridizavam de forma inespecífica com as amostras a serem analisadas, b)que todas as sondas tiveram algumas características de hibridização simila-res, e c) que o sinal de intensidade obtido de cada uma delas podia ser rela-cionado com a quantidade de transcrito acrescentado ao RNA.
d) Controles de hibridização
Como controles de hibridização foram utilizados oligonucleotí-deos sintéticos de DNA de 70 nucleotídeos (70-meros) modificados em umaextremidade com uma molécula de biotina. Estas moléculas são acrescen-tadas na mesma quantidade à amostra imediatamente antes da hibridiza-ção, de forma que seu valor depende unicamente dos processos de hibridi-zação, revelação e captura de imagens do "microarray". Para cada um des-tes oligonucleotídeos 70-meros, existem no "microarray" várias cópias deum oligonucleotídeo de 50 nucleotídeos de comprimento (50-mero), com-plementar ao oligonucleotídeo 70-mero correspondente àquele que deve serhibridizado. Os oligonucleotídeos 50-meros que fazem parte do microarraye que são complementares a oligonucleotídeos 70-meros que são adiciona-dos ao cRNA antes de hibridizar são aqueles com os códigos SCN2, SCN3,SCN6, SCN8, SCN11, SCN12 e SCN13. Para assegurar baixa homologiacom seqüências humanas, as seqüências desses oligonucleotídeos foramobtidas a partir de seqüências de Arabidopsis thaliana e Tripanosoma bru-cei. Suas características aparecem na Tabela 5
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados no microarray como controles positi-vos de hibridização
<table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>Para o desenho dos oligonucleotídeos 50-meros ficou compro-vado, de forma similar ao anteriormente descrito para os "Spiked controis",que os oligonucleotídeos a serem utilizados não hibridizavam de forma ines-pecífica com as amostras a serem analisadas, que todas as sondas tinhamalgumas características de hibridização similares e que o sinal de intensida-de obtido de cada uma delas podia ser relacionado com a quantidade dooligonucleotídeo 70-mero correspondente acrescentado ao cRNA. Isto per-mitiu considerar válidos os oligonucleotídeos indicados na Tabela 5. Foi ob-servado que os oligonucleotídeos SCN4 (SEQ ID N°:574) e SCN9 (SEQ IDN°:579), desenhados em um princípio para agir como controles de hibridi-zação, produziam hibridização específica quando se hibridizava cRNA hu-mano, com o que também aparecem no microarray, como se fossem sondasque representam algum gene humano, mas não considerados como contro-les positivos de hibridização. Por sua vez, os oligonucleotídeos SCN1 (SEQID N°:571), SCN5 (SEQ ID N°:575), SCN7 (SEQ ID N°:577) e SCN10 (SEQID N°:580), que tampouco hibridizavam de forma inespecífica com as amos-tras, também estão presentes no microarray como controles negativos dehibridização, não se acrescentando ao cRNA nenhum oligonucleotídeocomplementar as mesmas.
Por sua vez, a solução de controles de hibridização que conti-nha os oligonucleotídeos 70-meros complementares aos oligonucleotídeos50-meros presentes no microarray como controles positivos de hibridizaçãofoi preparada a partir das seqüências 70-meras biotiniladas correspondentesutilizando para cada uma delas uma concentração diferente, como mostradona Tabela 6:
Tabela 6. Composição da solução de controles positivos de hibridização
<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>
Referências
Como referência foi utilizado o dimetil sulfóxido (DMSO) semqualquer sonda, porque este foi o solvente no qual estavam os oligonucleo-tídeos no momento de serem depositados na superfície do microarray.
Descrição do dispositivo "microarray"
Doze réplicas de cada sonda foram depositadas em localizaçõesdistintas sobre a superfície de um suporte sólido (vidro de forma semelhanteà dos porta-objetos de microscopia) utilizando Microgrid II Spoter (Biorobo-tics). As 12 réplicas de cada sonda foram distribuídas no suporte ao acaso:6 na área superior e 6 na área inferior. Como suporte sólido foram utilizadosvidros aminossilanizados (Corning). A umidade e a temperatura foram con-troladas durante todo o processo de impressão.
A ligação covalente das sondas aos suportes sólidos foi feita pormeio de entrecruzamento ("cross-linking") por radiação ultravioleta utilizandoo aparelho "Strataliηker" (Stratagene).
O controle de qualidade do processo de produção dos "microar-rays" foi o seguinte: a) Em cada rodada de produção um "microarray" foicolorido com brometo de etídio, o que permite analisar o tamanho e a formados pontos imprimidos, b) Outro "array" de cada rodada foi hibridizado comum cRNA já hibridizado, sendo analisado o sinal de hibridização, o ruído defundo e a reprodutibilidade das réplicas.
As características do "array" estão mostradas abaixo na Tabela 7:Tabela 7.- Características do microarray
<table>table see original document page 91</column></row><table>
Tratamento das amostrasCulturas celulares
Culturas de células Jurkat (linhagem celular procedente de leu-cemia T) e U937 (linhagem celular procedente de leucemia promonocítica)foram centrifugadas durante 10 minutos a 1200 rpm e, depois de decanta-ção do sobrenadante, o precipitado foi ressuspendido em RNAIater (Ambionlnc) e armazenado a -80-C até o momento da extração do RNA. O RNA foiextraído com TRIzoI (Gibco-BRL Carlbad, CA, USA) seguindo as recomen-dações do fabricante.
Amostras sangüíneas
As amostras de sangue foram recolhidas diretamente em tubosPAXgene Blood RNA Tubes -PreAnaIytix (Qiagen). Foram extraídos 2,5 mlde sangue em cada tubo e dois tubos por cada indivíduo. Os tubos foraminvertidos várias vezes para permitir que o sangue se misturasse com o lí-quido estabilizante contido no tubo, e estes foram guardados a -20SC até anoite anterior à extração do RNA.Extração do RNA total Os tubos com a amostra foram incubados à temperatura ambi-ente durante a noite anterior à extração de RNA. Para a extração foi utiliza-do o kit PAXgene Blood RNA kit (Qiagen) seguindo as recomendações dofabricante, incluindo a etapa intermediária de tratamento com DNase (RNa-se-Free DNase Set, Quiagen) em coluna. O RNA de cada tubo de extraçãofoi eluído em 80 μΙ de tampão BR5. O RNA dos dois tubos que correspondi-am a cada paciente foi juntado em um único tubo.Purificação do RNA total
Para garantir que o RNA obtido está livre de contaminantes quepossam interferir em reações de marcação posteriores, este foi purificado daseguinte maneira: a 160 μΙ de solução de RNA total foram adicionados 16 μΙ(0,1 vol.) de acetato de sódio 7,5 M (Sigma) e 400 μΙ (2,5 vol.) de etanol100%. A solução foi misturado em um agitador "vórtex" e foi incubada du-rante 1 hora a -20QC. Depois de 20 minutos de centrifugação a 12.000xg a4QC, o precipitado foi lavado duas vezes com 500 μΙ de etanol 80% e foi res-suspendido em 35 μΙ de água livre de RNases. Os RNAs obtidos foram ar-mazenados a -80eC até sua utilização posterior.Quantificação do RNA total
A quantificação do RNA total foi efetuada por meio da medidada absorvência a 260 nm em um espectrofotômetro (DU 65, Beckman Coul-ter). 2 μΙ da solução de RNA total foram diluídos em 98 μΙ de Tris-HCI 1 mMpH 7,5 e sua concentração foi estimada ^g/ml) considerando-se que 1 Uni-dade de Densidade Óptica a 260 nm corresponde a uma concentração deRNA de 44 μg/ml.
Determinação da pureza e qualidade do RNA O grau de pureza foi estabelecido a partir da relação de absor-vências A260/A280 (ácido nucléico/ proteínas), considerando-se que o RNAé adequado, de "boa qualidade", quando a relação A260/A280 está entre1,9 e 2,1.
A qualidade do RNA total foi determinada por visualização doRNA depois de eletroforese, 500 ng de RNA total foram submetidos à eletro-forese em gel de agarose (FMC) a 1% em tampão TAE 1x com BrEt (0,5mg/ml), sob uma diferença de potencial de 100V durante 25 minutos em cu-betas de eletroforese de corrente contínua (BioRad). Como marcador depesos moleculares foi utilizado o fago φ 29 digerido com a enzima de restri-ção BamH I. os géis foram visualizados em um transiluminador de luz ultra-violeta Gel Doc (BioRad).
Marcação da amostra
A escolha do cordão com sentido como sonda limitou a estraté-gia de marcação às aproximações que produziam produto marcado anti-sentido (complementar à sonda imobilizada sobre o suporte sólido).
Marcação a cRNA
Este tipo de marcação foi efetuada durante o transcurso de umprocesso de amplificação que consiste no uso para a síntese de cDNA mo-nocatenário, de um cevador oligo(dT) que contém um promotor para a en-zima RNA polimerase do fago 17, enzima esta que será utilizada na etapade amplificação da amostra.
a.- Síntese de cDNA: etapa na qual foi sintetizado DNA com-plementar (cDNA) ao mRNA de partida. 5 pg de RNA total foram incubadoscom 2 μl da solução de "Spiked controls" e 100 pmol de cevador T7-(dT)24(Genset Corp) em um volume final de 12 μl durante 10 minutos a 70°C emum termobloco, a mistura foi esfriada em gelo e foram adicionados 4 μΙ detampão 5X First Strand Buffer (Gibco BRL Life Technologies), 2 μl de DTT0,1 M (Gibco BRL Life Technologies), 1 μl de dNTP mix 10mM (Gibco BRLLife Technologies) e1 μl de SuperScript II RNase H RT (200 U/μl) (GibcoBRL Life Technologies). Depois de 1 hora de incubação em um banho pro-vido de termostato (SeIecta) a 42°C, a reação foi esfriada em gelo.
b.- Síntese de DNA de cordão duplo (dsDNA): um cordão duplode DNA foi sintetizado a partir do cDNA sintetizado na etapa anterior. A 20μΙ da reação anterior foram adicionados 91 μl de água livre de RNases, 30 μlde "Second Strand Reaction buffer"(Gibco BRL Life Technologies), 3 μl dedNTPs 10mM (Gibco BRL Life Technologies), 10 U de E. coli DNA Ligase(Gibco BRL Life Technologies), 40 U de E. coli DNA polimerase I (GibcoBRL Life Technologies), 2 U de E. coli RNase H (Gibco BRL Life Technolo-5 gies) em um volume final de 150 μl. A reação foi incubada em um termoblo-co a 16°C durante 2 horas. Em seguida foram adicionados 10U de T4 DNAPolimerase (Gibco BRL Life Technologies) e a mistura foi incubada duranteminutos a 16°C. Para interromper a reação, foram adicionados 10 μl deEDTA 0,5 M.
c.- Purificação do dsDNA: Para eliminar possíveis restos de pro-dutos de reação que possam interferir em reações de marcação posteriores,o DNA obtido através de extração em fenohclorofórmio e posterior purifica-ção foi purificado. A 162 μl da reação anterior foram adicionados 162 μl dasolução fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Ambion). A misturafoi centrifugada durante 2 minutos a 12.000xg em uma centrífuga à tempera;tura ambiente, e a fase superior aquosa foi recolhida. A esta fase superiorforam adicionados 0,5 volume de acetato de amônio 7, 5 M (Sigma Chemi-cal) e 2,5 volumes de etanol 100% esfriado a -20°C). Depois de agitaçãocom "vórtex" para misturar bem os componentes e uma centrifugação de 20minutos a 12000xg à temperatura ambiente, o sobrenadante foi eliminado eo precipitado foi lavado duas vezes com etanol 80%. O DNA obtido foi res-suspendido em 10 μl de água livre de RNases e concentrado em um con-centrador "Speed-Vac" até um volume de 2 μl. Este DNAse foi guardado a -205C até seu uso posterior.
d.- Síntese marcação do cRNA: Esta reação foi efetuada em umvolume de 20 μl e utilizando o kit T7 Megascript (Ambion), segundo as ins-truções do fabricante e incorporando nucleotídeos modificados com biotina,Bio-11-CTP e Bio-11 UTP (Perkin Elmer) em uma relação nucleotídeo semmodificação/nucleotídeo modificado 1:3. A reação foi incubada durante 530 horas e 15 minutos em um banho com termostato (SeIecta) a 37°C, a rea-ção sendo agitando a cada 45 minutos. Depois desta incubação 1 μl deDNAse foi adicionado e incubado por 30 minutos a 37°C.e.- Purificação do cRNA biotinilado: O cRNA biotinilado foi purifi-cado com o kit RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen) segundo as instru-ções do fabricante. Os cRNAs biotinilados obtidos foram eluídos em umvolume de 80 μl e armazenados a -809C até seu uso posterior.
A quantidade, a pureza e a qualidade do cRNA obtido foram de-terminadas seguindo os mesmos procedimentos descritos para o RNA total.
O cRNA foi armazenado a -80QC até seu uso posterior.
Fragmentação do cRNA biotinilado
10 μg de cRNA biotinilado foram fragmentados na presença detampão de fragmentação 5x (200 mM de Tris-acetato, pH 8,1, 500 mM deHOAC, 150 mM de MgOAc) durante 35 minutos a 94°C em um termobloco.Foi comprovado que a reação de fragmentação havia sido efetuada de for-ma correta por meio da visualização de 1 μL de solução de fragmentação emeletroforese sobre gel de agarose a 1 %.
Hibridização do cRNA marcado com as sondas do "microarrav"
Nesta etapa o material genético marcado foi colocado em conta-to com as sondas imobilizadas sobre o suporte sólido.
À solução de cRNA biotilinado e fragmentado foram adicionadosμL da solução de controles de hibridização e a mistura foi incubada por 3minutos a 95°C para desnaturalizar as possíveis estruturas secundárias.Depois da incubação a mistura foi imediatamente colocada em gelo paraprevenir uma possível renaturalização da amostra.
A hibridização foi efetuada durante 6 horas a 42°C na estaçãoautomática de hibridização Ventana Discovery (Ventana Medicai Systems).Os tampões de hibridização e de lavagem foram fornecidos por VentanaMedicai System. Os "microarrays" foram coloridos automaticamente na pró-pria estação de hibridização com estreptavidina conjugada com Cy3 (Amer-sham Biosciences) utilizando as recomendações do fabricante.Captura de imagens e quantificação dos "microarrays"Depois de hibridização e revelação, as imagens dos "microar-rays" foram identificadas e analisadas por meio do "scanner" fluorescenteconfocal ScanArray 4000 (Perkin Elmer) equipado com um laser para verde(543 nm para excitar o fluoróforo Cy3). O "software" utilizado foi ScanArray3.1. O uso do programa informático QuantArray 3.0 (Perkin Elmer) forneceuos valores absolutos da intensidade de hibridização e ruído de fundo emfunção da luz emitida pelo Cy3 em cada sonda no formato Excel.
Análise de dados: Processamento preliminar
Em primeiro lugar, dos valores absolutos de intensidade de to-dos os oligonucleotídeos foi subtraído o valor do ruído de fundo. Para tanto,foram utilizados os valores de intensidade absolutos e os valores de ruídode fundo que o programa utilizado para converter os sinais do fluoróforo for-nece, de forma automática, para cada um dos pontos de microarray: o valorde intensidade correspondente é obtido da zona que foi definida como pontoe o valor do ruído de fundo é obtido da zona situada em torno do ponto.
Em seguida foi calculado o nível médio de intensidade de hibri-dização de cada um dos oligonucleotídeos do microarray a partir da médiaencontrada das intensidades das 12 réplicas de cada um dos oligonucleotí-deos. Para tanto, antes do cálculo da médio, foram eliminados os valoressuperiores e os valores inferiores da distribuição de pontos de valores desinal de hibridização obtidos com cada uma das réplicas de um mesmo oli-gonucleotídeo. O cálculo foi efetuado utilizando o programa Excel de Micro-soft e, concretamente, a função MEDIA.ACOTADA do mesmo, na que o pa-râmetro "percentagem" foi fixado em 0,2, o que implica fixar a percentagemeliminada de valores em 20% dos valores superiores e em 20% dos valoresinferiores; a função arredonda o número de pontos de dados excluídos aomúltiplo de 2 mais próximo.
Em último lugar e para poder determinar a validade de uma hi-bridização, é necessário que seja cumprida uma série de critérios estabele-cidos: 1) a relação entre a intensidade média e o fundo médio de todos osoligonucleotídeos do chip deve ser maior que 10; 2) o valor do coeficiente devariação médio (desvio padrão das réplicas em relação à média das répli-cas) de todas as réplicas de oligonucleotídeos do chip deve ser inferior a0,3; 3) o valor médio do controle negativo deve ser inferior a 2,5 vezes o va-lor do DMSO médio; 4) deve-se obter sinal tanto nos controles de hibridiza-ção como nos controles positivos internos exógenos (Spiked controis).
A análise dos dados foi efetuada em R, versão 1.9.1. R é umalinguagem de programação na qual é possível aplicar técnicas estatísticastanto clássicas como modernas (R Developmental Core Team, 2004;http://www.R-project.org), que dispõe de uma série de funções armazenadasem programas para a manipulação, o cálculo e a representação gráfica de da-dos (Venables et aí., 2004). Existem centenas de programas escritos por dife-rentes autores para R, com funções estatísticas especiais ou que permitem oacesso e a manipulação de dados e podem ser baixados das páginas web deCRAN (http://cran.r-proiect.org/) ou Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Em alguns casos concretos, também foi utilizado o software comercialde análise estatístico SPSS (Chicago, EE.UU.).Exemplos
EXEMPLO 1.- RESULTADOS OBTIDOS COM O USO DO DISPOSITIVO"MICROARRAY" COM AMOSTRAS DE CÉLULAS U937 VS. CÉLULASJURKAT
Com o objetivo de saber se o dispositivo permite diferenciar du-as linhagens celulares foram hibridizadas em 10 microchips: 5 amostras decRNAs biotinilados sintetizados segundo o protocolo de trabalho otimizado,obtidos a partir de RNA de células U937 (linhagem celular procedente deleucemia promonocítica) e 5 amostras de cRNAs biotinilados obtidos a partirde RNA de células Jurkat (linhagem celular procedente de leucemia T).
Foram realizadas as etapas iniciais de processamento preliminardos dados e validação da hibridização mencionadas anteriormente na seçãode "Análise de dados: Processamento preliminar" e, em seguida foi efetuadaa normalização e filtragem de dados:
- Normalização de dados. Foi utilizado o método "variance stabi-Iization normalization", disponível no programa "vsn" de R. Existem diferen-tes de programas disponíveis na Internet para R, com funções estatísticasespeciais ou que permitem o acesso e a manipulação de dados e podem serbaixados de CRAN (http://cran.r-proiect.org/) ou Bioconductor(http://www.bioconductor.org)- Filtragem de dados. Foram realizadas duas operações de fil-tragem com a função "Fiíterfun" do programa "Genefilter" de R. os genesque não passaram por algum dos dois filtros não foram utilizados na análisede dados. Os filtros levados a cabo foram:
- Filtragem para excluir genes com um valor de intensidadepróximo ao DMSO. Este filtro permitiu trabalhar com genes com valor deintensidade menos ruído de fundo médio maior de 550 unidades arbitrárias(aproximadamente 2 vezes o valor do DMSO).
- Filtragem para excluir genes com variação de intensidademínima ao longo das amostras. Trabalhamos com genes com faixa intér-quartílica de intensidade normalizada ao longo das amostras maior que 0,3.
A filtragem de dados deixou 83 sondas que constituíram a listade trabalho. Com elas foi efetuado um agrupamento das amostras não su-pervisionado, que são aqueles agrupamentos onde não se conhece a estru-tura dos dados de antemão, depreendendo-se do sistema como estão dis-tribuídos os dados entre classes com base em uma função de distância.
Com o agrupamento foi obtida uma árvore ou agrupamento hierárquico,onde as amostras ficam agrupadas em função de sua semelhança na ex-pressão de alguns genes determinados, os correspondentes aos oligonucle-otídeos da lista de trabalho, de forma que as amostras mais próximas sãoaquelas que têm um perfil de expressão parecido. O agrupamento foi efetu-ado com a função hclustdo programa stats de R. A análise não supervisadadas 10 amostras produziu sua separação em dois grupos ou ramos princi-pais em função do tipo celular ao qual as amostras pertencem: um grupocontém as 5 hibridizações realizadas a partir de células U937 e o outro gru-po contém as 5 hibridizações realizadas a partir de células Jurkat. A árvoreresultante deste agrupamento não supervisado está mostrada na parte A da Figura 1.
Em seguida, para saber se haviam diferenças estatisticamentesignificativas entre os dois grupos de amostras, foi utilizado o método "Step-down maxT multiple testing procedures" (maxT), que é uma aplicação dafunção mt.maxT do programa multtest do software R de Bioconductor, queaplica um teste estatístico e realiza um forte controle sobre a taxa de falsospositivos. Para esta função é necessário fornecer:
a) Valores sobre os quais se deseja aplicar o teste esta-tístico, neste caso, sobre os valores normalizados dos 83 oligonucleotídeosque passaram pelos filtros
b) Grupos dos quais se deseja encontrar diferenças, nes-te caso as 5 amostras de células Jurkat em relação às 5 amostras de célu-las U937
c) Número de permutações que se deseja realizar. Neste caso foram realizadas 100.000 permutações.
d) Por falta, foi escolhido o teste de Welch para especificar aferramenta estatística a ser utilizada para provar a hipótese de não associa-ção entre as variáveis e as etiquetas de classe
A aplicação desta análise com um valor de p<0,001 forneceu uma lista de 69 sondas estatisticamente significativas entre os dois grupos,que são as seguintes:
SG12, SG20, SG23, SG24, SG38, SG39, SG45, SG49, SG53, SG59,SG60, SG62, SG76, SG78, SG89, SG92, SG94 , SG102, SG474, SG478,SG487, SG114, SG120, SG140, SG142, SG145, SG150, SG154, SG158, SG174, SG175, SG194, SG195, SG2Í1, SG230, SG231, SG235, SG260,SG264,
SG266, SG268, SG270, SG272, SG282, SG294 , SG308, SG311, SG330,SG332,
SG333, SG339, SG344, SG364, SG403, SG423, SG434, SG456, SG506, SG513, SG514, SG515, SG524, SG533, SG538, SG541, SG559
Uma vez conhecidos os genes estatisticamente significativospara distinguir entre os dois grupos de amostras (que seriam os genes cor-respondentes às sondas identificadas como estatisticamente significativas)foi feito o agrupamento supervisionado das amostras em função da intensi- dade do sinal das 69 sondas estatisticamente significativas obtidas. O ter-mo "supervisionado", aplicado a um agrupamento, refere-se ao fato de quea estrutura dos dados é conhecida de antemão, o que permite utilização ainformação prévia; com isso, depois de um processo de treinamento quepermite ao sistema aprender a distinguir entre classes, a rede pode ser utili-zada para designar novos membros para as classes predefinidas. Nestecaso, o agrupamento supervisionado das amostras em função da intensida-de de sinal obtida com as 69 sondas estatisticamente significativas obtidas,volta a ser uma árvore que se divide em dois ramos principais em função dotipo qual ao qual as amostras pertencem. A arvore obtida com o agrupa-mento supervisionado está mostrada na parte B da Figura 1.
EXEMPLO 2.- RESULTADOS OBTIDOS COM A UTILIZAÇÃO DO DISPO-SITIVO "ARRAY" COM AMOSTRAS DE INDIVÍDUOS SAUDÁVEIS VS. CÉ-LULAS U937e JURKAT
A expressão de 5 amostras de células U937 e de 5 amostras decélulas Jurkat foi comparada com a expressão de 10 amostras provenientesde sangue total de indivíduos saudáveis. De forma semelhante àquela des-crita no Exemplo 1, foram efetuadas as etapas de processamento inicial dosdados, validação das hibridizações, normalização e filtragem. Um total de180 genes passaram pelos processos de filtragem. O agrupamento não su-pervisionado das amostras (realizado com a função hclust do programastats de R aplicando a correlação de Pearson) em função da expressão dos180 genes forneceu uma árvore com dois ramos principais: um ramo contémtodas as amostras procedentes de culturas celulares e o outro ramo contémtodas as amostras procedentes de sangue total de indivíduos saudáveis,com o que fica demonstrado que a ferramenta é capaz de encontrar diferen-ças de expressão. A árvore obtida depois de realizar este agrupamento nãosupervisionado está mostrada na parte A da Figura 2.
Foi realizada a prova maxT (p<0,001) para procurar genes comdiferenças estatisticamente significativas entre as amostras procedentes deculturas celulares U937 e Jurkart e as 10 amostras procedentes de sanguetotal de indivíduos saudáveis. A análise estatística forneceu uma lista de 131sondas com diferenças estatisticamente significativas entre ambos gruposde amostras. São elas as seguintes:
SG1, SG4, SG7, SG8, SG10, SG13, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19,SG20, SG26, SG29, SG30, SG34, SG36, SG39, SG42, SG44, SG49,SG51, SG52, SG58, SG64, SG65 , SG67, SG76, SG77, SG80, SG84,SG86, SG89, SG92, SG93, SG94, SG98, SG99, SG101, SG102, SG107,SG463, SG464 , SG474, SG475, SG485, SG487, SG466, SG467, SG471,SG472, SG473, SG120, SG129, SG138, SG141, SG144, SG145, SG147,SG158, SG163, SG164 , SG176, SG185, SG186, SG197, SG207, SG208,SG217, SG227, SG231, SG265, SG266, SG277, SG278, SG283, SG285,SG299, SG307, SG308, SG311.SG313, SG318, SG319, SG328, SG333,SG336, SG342, SG344, SG357, SG361, SG376, SG384, SG389, SG395,SG398, SG403, SG404, SG407, SG416, SG420, SG423, SG430, SG436,SG446, SG455, SG461, SG489, SG491, SG492, SG493, SG498, SG500,SG504, SG505, SG506, SG514, SG516, SG517, SG520, SG526, SG530,SG533, SG538, SG545, SG547, SG554, SG555, SG558.
O agrupamento das 20 amostras em função da expressão dassondas estatisticamente significativas encontradas mais uma vez deu lugara uma árvore com dois ramos principais, um correspondente às amostrasprocedentes de culturas celulares e outro correspondente às amostras pro-cedentes de indivíduos saudáveis. O referido agrupamento aparece na par-te B da Figura 2.
EXEMPLO 3.- RESULTADOS OBTIDOS COM AMOSTRAS DE PACIEN-TES COM LEUCEMIA LINFÁTICA CRÔNICA (LLC) VS. CÉLULAS U937 E JURKAT
Os perfis de expressão de amostras procedentes de culturascelulares U937 e Jurkats foram comparados com 26 amostras procedentesde sangue total de indivíduos com LLC.
As amostras foram submetidas a um processamento preliminardos dados, foram normalizadas e filtradas de forma análoga àquela utilizadanos Exemplos 1 e 2 e um total de 236 sondas passaram pelos filtros. O a-grupamento não supervisionado das amostras em função da expressão dassondas que passaram pelos filtros mostrou uma árvore com dois ramosprincipais: um que continha as amostras de culturas celulares e o outro asamostras LLC. A referida árvore está mostrada na parte A da Figura 3.Foi realizada a prova maxT (p<0,001) para procurar genes comdiferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos de amostras.Esta análise forneceu uma lista de 120 sondas. São elas as seguintes:SG2, SG4, SG8, SG10, SG13, SG15, SG16, SG19, SG20, SG23, SG26,SG28, SG31, SG34, SG36, SG39, SG48, SG58, SG60, SG65, SG76, SG77,SG84, SG89, SG94, SG9, SG97, SG99, SG102, SG106, SG107, SG463,SG464, SG474, SG475, SG481, SG465, SG485, SG487, SG466, SG467,SG471, SG473, SG115, SG116, SG117, SG120, SG129, SG134, SG135,SG138, SG139, SG141, SG145, SG158, SG161, SG163, SG176, SG178,SG185, SG207, SG208, SG210, SG217, SG227, SG231, SG237, SG264,SG272, SG277, SG281, SG283, SG286, SG294, SG298, SG299, SG307,SG308, SG319, SG328, SG330, SG333, SG336, SG342, SG344, SG345,SG347, SG361, SG384, SG389, SG395, SG404, SG407, SG416, SG423,SG428, SG430, SG432, SG434, SG444, SG446, SG453, SG458, SG459,SG491, SG498, SG507, SG508, SG511, SG517, SG518, SG522, SG526,SG530, SG533, SG538, SG541, SG554, SG558, SG561.
O agrupamento das 30 amostras em função da expressão das120 sondas estatisticamente significativas mais uma vez deu lugar a umaárvore com dois ramos principais, um correspondente às amostras de cultu-ras celulares e o outro correspondente às amostras extraídas de indivíduosque sofrem de LLC. Esta árvore está mostrado no lado B da Figura 3.
EXEMPLO 4: RESULTADOS OBTIDOS COM AMOSTRAS DE INDIVÍDUOSSAUDÁVEIS VS. PACIENTES COM LEUCEMIA LINFÁTICA CRÔNICA (L-LC)
68 hibridizaçõès que satisfizeram os critérios de qualidade pro-venientes de 68 amostras de diferentes indivíduos saudáveis e com diag-nóstico clínico de LLC foram divididas em 2 grupos: grupo de treinamentoutilizado para obter as funções do classificador e grupo de prova, utilizadopara provar o classificador obtido. O grupo de treinamento era compostopor 30 amostras (10 de indivíduos saudáveis e 20 de indivíduos com LLC) eo grupo de prova era composto por 38 amostras (5 amostras de indivíduossaudáveis e 33 amostras de indivíduos com LLC).Para obter a função de classificação trabalhamos com os resul-tados obtidos das hibridizações do grupo de treinamento. As etapas reali-zadas para a função de classificação foram:
- Normalização de dados. Foi utilizado o método "variance stabi-lization normalization", disponível no programa "vsn" de R.
- Filtragem de dados. Foram realizadas duas operações de fil-tragem com função "Filtèrfun" do programa "Genefilter" de R. Os genes quenão passaram algum dos dois filtros não foram utilizados na análise de da-dos. Dos 588 oligonucleotídeos do chip, 224 passaram pelos 2 filtros e cons-tituíram a lista de trabalho.
1. Filtragem para excluir genes com um valor de intensidadepróximo ao DMSO. Este filtro permitiu trabalhar com genes com valor deintensidade menos ruído de fundo médio maior de 550 unidades arbitrárias(aproximadamente 2 vezes o valor do DMSO) em mais de 25% das 30 a -mostras (7 amostras) que compõem o grupo de treinamento.
2. Filtragem para excluir genes com variação de intensidademínima ao longo das amostras. Trabalhamos com genes com faixa inter-quartílica de intensidade normalizada ao longo das amostras maior que 0,3.
Foram utilizados dois sistemas de classificação:
4.1.- Construção de um sistema de classificação com PAM.
Para identificar grupos de genes que melhor caracterizam cadatipo de amostra e comprovar a taxa de classificação desses grupos de ge-nes foi utilizado o Prediction Analysis for Microarrays (PAM) disponível comoprograma "pamr9" de R. Esta é uma técnica estatística que identifica umgrupo de genes que melhor caracteriza uma classe predefinida e utiliza estegrupo de genes para prever a classe a qual pertencem novas amostras.PAM utiliza uma versão modificada do método de classificação "nearestcentroids" (Tibshirani et ai, 2002) denominada "Nearest Shrunken Cen-troids". Foi efetuada uma validação denominada "10 fold cross validation"que consiste em construir o modelo com 90% das amostras e tenta-se pre-ver a classe dos 10% das amostras que não interferiam na construção domodelo. Este procedimento é repetido 10 vezes e o erro de classificaçãodos 10% das amostras é juntado para calcular o erro global. Este erro refleteo número de amostras mal classificadas (Bullinger etal., 2005).
4.1.1. Construção do modelo. A partir dos dados filtrados e normalizadosdas 30 amostras que compõem o grupo de treinamento, atribuindo-se deforma arbitrária o grupo de saudáveis ao grupo Oeo grupo de LLC ao grupo1, realizando as 10 validações cruzadas e com um valor de umbral de Delta3,1. O modelo obtido foi formado pelos seguintes oligonucleotídeos: SG459,SG428, SG507, SG508, SG117, SG237. Os coeficientes do classificadorcorrespondentes a cada um desses oligonucleotídeos estão mostrados a-baixo na Tabela 8:
Tabela 8- Coeficientes do classificador PAM
<table>table see original document page 104</column></row><table>
4.1.2. Validação do classificador PAM. A validação cruzada das amostrasque compõem o grupo de treinamento classificou corretamente 28 das 30amostras.
A partir dos dados filtrados e normalizados das 38 amostras quecompõem o grupo de prova, foram obtidos valores de probabilidade ρ per-tencentes ao grupo 0 (grupo saudável) ou ao grupo 1 (grupo com LLC).
Quanto maior o valor de p, maior a probabilidade de pertencer a esse grupo.
Foi considerado que os valores maiores de 0,5 indicam pertinência a essegrupo. Os valores de ρ obtidos para cada amostra estão indicados na Tabela 9.Tabela 9. Valores de probabilidade obtidos com o classificador PAMpara o grupo de prova
<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>
LLC175 única amostra mal classificada
Com este modelo foram classificadas corretamente 37 das 38amostras do grupo de prova: todas as amostras correspondentes a indiví-duos saudáveis (aquelas cuja denominação é iniciada pela letra "S") apre-sentam uma probabilidade maior que 0,5 de pertencer ao grupo 0, ao passoque todas as amostras correspondentes a indivíduos que sofrem de LLC(que são as amostras cuja denominação começa pelas letras "LLC") menosuma apresentam uma probabilidade maior que 0,5 de pertencer ao grupo 1.4.2.- Construção de um sistema de classificação com regressão logística.4.2.1.- Seleção de genes com diferenças estatisticamente significativas en-tre saudáveis e LLC (grupo de treinamento). A partir de dados normalizadose filtrados da maneira descrita anteriormente, para a seleção de genes comdiferenças significativas foi utilizado o método "Step-down maxT multipletesting procedures" (maxT), que é uma aplicação da função mt.maxT doprograma multtest do software R da Bioconductor, que aplica um teste esta-tístico e realiza um forte controle sobre a taxa de falsos positivos. A aplica-ção deste teste estatístico, com um valor de p<0,001, aos 224 oligonucleotí-deos que passaram pelos filtros produziu uma lista de 7 oligonucleotídeos:SG117, SG428, SG459, SG461, SG493, SG507, SG508.
As etapas utilizadas para obter a lista de 7 genes significativosentre saudáveis e LLC foram:Método que faz permutações e vai ajustando os valores de ρresT<-mt.maxT(exprs(224 oligonucleotídeos que passaram pelos filtros eforam normalizados do grupo de treinamento),Tipos de amostras no grupode treinamento, teste="t",B=100000): função mt.maxT que através de per-mutações vai ajustando os valores de probabilidade (significação), o quesugere um forte controle da taxa de falsos positivos.
Para esta função é necessário fornecer
1.- Genes sobre os quais se deseja aplicar o teste estatístico,neste caso, sobre os valores normalizados dos 224 oligonucleotídeos quepassaram pelos filtros de todas as amostras incluídas no grupo de treina-mento
2.- Grupos dos quais se deseja encontrar diferenças, neste casoamostras de saudáveis e 20 amostras de LLC. Deseja-se encontrar dife-renças entre saudáveis e LLC
3.- Número de permutações que se deseja realizar. Neste casoforam realizadas 100.000 permutações.
A- Por falta, foi escolhido o teste de Welch como teste estatísti-co
Os genes estatisticamente significativos em um nível de p<0,001foram selecionados por este teste e foi obtido um número de 7
4.2.2,- Obtenção da função de classificação com SPSS. Por regressão logís-tica a partir dos valores normalizados dos 7 oligonucleotídeos estatistica-mente significativos obtidos das 30 amostras que compõem o grupo de trei-namento e atribuindo de forma arbitrária o grupo 0 às amostras saudáveis eo grupo 1 às amostras com LLC, foram obtidos os valores da função declassificação. Os coeficientes correspondentes a cada oligonucleotídeo fo-ram aquelas mostrados abaixo na Tabela 10:Tabela 10.- Coeficientes da função de classificação calculada por regressãologistica
<table>table see original document page 108</column></row><table>
A partir destes coeficientes, para cada amostra i um valor x, écalculado da seguinte forma:
Xi= Constante+(Coef ohle0009*lmni SG117)+(Coef SG428* Im-ni, SG428)+ (Coef SG459* Imni SG459)+ (Coef SG461* Imni SG461)+ (CoefSG493* Imni SG493)+ (Coef SG507* Imni SG507)+ (Coef SG508* ImniSG508).
onde Imnj é o valor médio de intensidade normalizada da amostra i.
A partir do valor x, calcula-se um valor de probabilidade (p,).Quanto mais perto de Oestivgr o valor de p, maior a probabilidade de que aamostra pertença ao grupo de indivíduos saudáveis (designados como gru-po 0) e quanto^mais perto de 1 estiver o valor de p, maior a probabilidade deque a amostra pertença ao grupo de indivíduos com LLC (designados comogrupo 1). A fórmula utilizada para determinar o valor de ρ é:
Pi = 1/(1+e"xi).
Como mostrado na Tabela 11, a função obtida classificou deforma correta as 30 amostras pertencentes ao grupo de treinamento. Quan-to mais perto de 0 maior a probabilidade de que seja saudável e quantomais perto de 1 maior a probabilidade de LLC.<table>table see original document page 109</column></row><table>a· El valor de corte es ,500
4.2.3. Validação do sistema classificador.- A partir dos valores filtrados enormalizados tal como detalhado anteriormente foram obtidos os valoresImni dos 7 oligonucleotídeos que compõem o classificador de cada uma das38 amostras que compõem o grupo de prova.
Resultados da validação do sistema classificador. Abaixo mos-tramos algumas tabelas onde detalhamos o valor Imni de cada um dos 7oligonucleotídeos incluídos no classificador e os valores de x, e pi calcula-dos de acordo com as fórmulas descritas anteriormente, obtidos para cadauma das 38 amostras do grupo de prova. As amostras que começam com Scorrespondem a indivíduos saudáveis e as amostras que começam comLLC são provenientes de indivíduos com LLC. 37 das 38 amostras foramclassificadas de forma correta. Exceto a amostra LLC175, para a qual foiobtido um vâlor de pi =0, foi classificada de forma incorreta.
Tabela 12.- Resultados obtidos com o grupo de prova pela função de classi-ficação obtida por regressão logística
<table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><formula>formula see original document page 111</formula>
Foi formado um terceiro grupo de 40 amostras. Para isto foramutilizadas réplicas de hibridização ou de marcação (as amostras cuja deno-minação começa com S e Strans são amostras de pessoas consideradassaudáveis e as que começam com LLC amostras procedentes de pacientescom leucemia linfática crônica). Este grupo de amostras foi utilizado para avalidação do sistema de classificação. Os dados foram normalizados damaneira descrita anteriormente. Os resultados da classificação estão mos-trados na Tabela 13. 40 das 40 amostras foram classificadas corretamente.
Tabela 13.- Resultados obtidos na validação da função de classificação ob-tida por regressão logística
<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table>EXEMPLO 5: RESULTADOS OBTIDOS COM AMOSTRAS LLC "ESTÁ-VEIS" EM RELAÇÃO A AMOSTRAS LLC "PROGRESSIVAS"
Foram consideradas amostras "LLC-estáveis tipo" (E) as amos-tras de pacientes que levam mais de 5 anos com LLC estável e amostras"LLC-progressivas tipo" (P) "progressivas tipo" as amostras de pacientesclassificadas como estáveis no momento do diagnóstico e cuja doença pro-grediu em menos de um ano.
No total foram analisadas 6 amostras E e 6 amostras P. As 12amostras foram coletadas no momento do diagnóstico, não havia diferençasclínicas entre elas, mas ao fim de ano, 6 desses pacientes haviam progredi-do. As 12 hibridizações foram aprovadas nos critérios de qualidade deta-lhados anteriormente.
Amostras Estáveis: E142R, E148, E156, E163, E164, E193Amostras Progressivas: P111, P105, P177, P158, P157 e P197.
Toda a análise de dados foi efetuada em R versão 1.9.1.Normalização de dados. Neste caso, e para evitar que os ge-nes significativos obtidos sejam devidos a uma verdadeira diferença entreamostras e não a um efeito de normalização, os dados foram normalizadosde duas formas diferentes ("variance stabilization normalization" (vsn) e porquantis robustos) e com cada uma das normalizações foi efetuada a mesmaanálise estatística.
- Análise estatística com dados normalizados por "variance sta-bilization normalization". A lista de genes estatisticamente significativos foiobtida a partir de um teste de Welch com a função mt.maxT do programamulttest de R, com um valor de p<0,05 sem ajuste, isto é, sem realizar qual-quer controle sobre os falsos positivos, e produziu uma lista de 29 genescom diferenças estatisticamente significativas entre o grupo LLC-estáveistipo e LLC-progressivas tipo.
Os oligonucleotídeos estatisticamente significativos obtidos fo-ram:
SG26, SG31, SG70, SG98, SG177, SG194, SG195, SG208, SG213,SG216, SG272, SG293, SG301, SG309, SG321, SG333, SG343, SG352,SG357, SG366, SG368, SG405, SG426, SG439, SG447, SG452, SG521,SG555, SG556.
Foi então efetuado o agrupamento das amostras, que foi reali-zado com a função hclust do programa stats de R aplicando correlações dePearson. A árvore obtida está mostrada na parte A da Figura 4.
O agrupamento hierárquico das 12 amostras em função da ex-pressão dos 29 genes estatisticamente significativos obtidos agrupava asamostras de forma correta: a árvore contém dois grandes ramos, dos quaiso ramo da direita contém as 6 amostras estáveis e o ramo da esquerda con-tém as 6 amostras progressivas.
Análise estatística com dados normalizados por quantis robustos. A listade genes estatisticamente significativos foi obtida a partir de um teste deWelch com a função mt.maxT do programa multtest de R com os valores deρ sem ajuste, isto é, se exercer qualquer controle sobre a taxa de falsos po-sitivos, com um valor de p<0,05, e produziu uma lista de 19 genes com dife-renças estatisticamente significativas entre o grupo LLC-estáveis tipo e LLC-progressivas tipo:
SG26, SG31, SG177, SG194, SG195, SG197, SG213, SG216, SG293,SG301, SG309, SG333, SG343, SG357, SG366, SG439, SG452, SG555,SG556.
O agrupamento supervisionado das 12 amostras em Junção daexpressão dos 19 genes estatisticamente significativos obtidos deu lugar àárvore que aparece na parte B da Figura 4, onde as amostras aparecemagrupadas igualmente de forma correta.
Foram selecionados 18 oligonucleotídeos comuns a ambas aslistas de genes estatisticamente significativos e foi calculada a média de in-tensidade de cada um deles no grupo de amostras estáveis e no grupo deamostras progressivas, assim como a variação de intensidade média entreo grupo de estáveis e progressivos. Os valores obtidos estão mostrados naTabela 14.Tabela 14,- Valores correspondentes à intensidade de 18 oligonucleotídeossignificativos para distinguir entre LLC-estável e LLC-progressiva
<table>table see original document page 116</column></row><table>
Para validar os resultados obtidos com o microarray, foram sele-cionadas 5 das sondas estatisticamente significativas comuns obtidas aocomparar dados de expressão de indivíduos LLC estáveis em relação a indi-víduos LLC progressivos e procedeu-se ao estudo da expressão com RT-PCR dos genes representados por essas sondas. Os critérios utilizados paraa seleção das 5 sondas foram: intensidade de hibridização, mudança deintensidade entre grupo de estáveis e progressivos e valor de significaçãoestatística. Desta forma foram selecionadas 5 sondas que representam osgenes PSMB4, CD23A, LÇP1, ABCC5 e POU2F2. A expressão destes 5genes foi determinada em 11 das 12 amostras LLC tipo, já que não se dis-punha de RNA total da amostra 105. Com os valores de expressão dos ge-nes em cada amostra, foi determinada a taxa de mudança o entre o grupode estáveis e progressivos e o valor de significação desta variação foi com-parado com os resultados obtidos com os microarrays.
La técnica utilizada para a validação foi RT-PCR ou PCR emtempo real utilizando um LightCycIer. Esta técnica é a técnica de escolha paravalidar dados de chips e assim como os microarrays, mede o nível de mRNA.
Foram desenhados cevadores para cada um dos 5 genes cujooligonucleotídeo representativo foi selecionado. Os detalhes dos mesmosestão mostrados abaixo na Tabela 15.
Tabela 15,- Cevadores e produtos de amplificação dos genes selecionadospara sua validação por RT-PCR
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A Figura 5 mostra a distribuição dos dados de expressão obtidospor RT-PCR (gráficos do lado esquerdo) e pelo microarray (gráficos do ladodireito). A parte A corresponde ao gene PSMB4, a parte B ao gene CD23Ae a parte C ao gene POU2F2.
A seguir, na Tabela 16, estão detalhados os resultados obtidoscom o microarray e com RT-PCR dos valores de mudança dos 5 genes se-lecionados no grupo de amostras estáveis em relação ao grupo de amostrasprogressivas obtidas como o significação da mudança. Em 3 dos 5 genesselecionados (PSMB4, CD23A e POU2F2) os valores de mudança, o senti-do da mudança e os valores de significação obtidos com RT-PCR coincidemcom aqueles obtidos com o microarray, com o que esses 3 genes são con-siderados validados, isto é, que os resultados obtidos para esses 3 genescom o microarray coincidem com os resultados obtidos por outra técnica quetambém mede o nível de mRNA.
Tabela 16 - Valores de mudança e significação na mudança obtidos com omicroarray e por meio de RT-PCR
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A Figura 1 mostra o agrupamento de amostras de células U937em relação a células Jurkat em função de diferenças na expressão de genesentre as amostras. A parte A corresponde ao agrupamento não supervisio-nado; a parte B corresponde ao agrupamento supervisionado.
A Figura 2 mostra o agrupamento de amostras de indivíduossaudáveis em relação a células U937 e células Jurkat em função de diferen-ças na expressão de genes entre as amostras. A parte A corresponde aoagrupamento não supervisionado; a parte B corresponde ao agrupamentosupervisionado.
A Figura 3 mostra o agrupamento de amostras de pacientescom leucemia linfática crônica em relação a células U937 e células Jurkatem função de diferenças na expressão de genes entre as amostras. A parteA corresponde ao agrupamento não supervisionado; a parte B correspondeao agrupamento supervisionado.
A Figura 4 mostra o agrupamento de amostras de pacientescom leucemia linfática crônica "estável" em relação a amostras de pacientescom leucemia linfática crônica "progressiva" em função diferenças na ex-pressão de genes. A parte A corresponde ao agrupamento em função dosgenes identificados como significativos depois de normalização com "vsn" eutilização da função mt.maxT de R; a parte B corresponde ao agrupamentoem função dos genes identificados como significativos depois da normaliza-ção por quantis robustos e utilização da função mt.maxT de R.
A Figura 5 mostra a distribuição dos dados de expressão obtidospor meio de RT-PCR (gráficos do lado esquerdo) e a partir dos valores deintensidade obtidos do microarray (gráficos do lado direito) para os genesPSMB4 (parte A: gráficos superiores), CD23A (parte B: gráficos intermediá-rios) e POU2F2 (parte C: gráficos inferiores) em amostras de pacientes comleucemia linfática crônica "estável" (barras marcadas com "E") e em amos-tras de pacientes com leucemia linfática crônica "progressiva" (barras mar-cadas com "P").

Claims (61)

1. Composição que compreende pelo menos um oligonucle-otídeo do grupo composto por:SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SGI91, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279,SG280, SG281, SG282, SG283, SG289, SG290, SG291, SG292, SG298, SG299, SG300, SG301, SG307, SG308, SG309, SG310, SG316, SG317, SG318, SG319, SG325, SG326, SG327, SG328, SG334, SG335, SG336, SG337, S G343, SG344, SG345, SG346, SG352, SG353, SG354, SG355, SG361, SG362, SG363, SG364, SG370, SG371, SG372, SG373, SG379, SG380, SG381, SG382, SG388, SG389, SG390, SG391, SG397, SG398, SG399, SG400, SG406, SG407, SG408, SG409, SG415, SG416, SG417, SG418, SG424, SG425, SG426, SG427, SG433, SG434, SG435, SG436, SG442, SG443, SG444, SG445, SG451, SG452, SG453, SG454, SG460, SG461, SG462, SG465, SG473, SG474, SG475, SG476, SG482, SG483, SG484, SG485, SG491, SG492, SG493, SG494, SG500, SG501, SG502, SG503, SG509, SG510, SG511, SG512, SG518, SG519, SG520, SG521, SG527, SG428, SG529, SG530, SG536, SG537, SG538, SG539, SG545, SG546, SG547, SG548, SG554, SG555, SG556, SG557, SG563, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306,SG311, SG312, SG313, SG314, SG315,SG320, SG321, SG322, SG323, SG324,SG329, SG330, SG331, SG332, SG333,SG338, SG339, SG340, SG341, SG342,SG347, SG348, SG349, SG350, SG351,SG356, SG357, SG358, SG359, SG360,SG365, SG366, SG367, SG368, SG369,SG374, SG375, SG376, SG377, SG378,SG383, SG384, SG385, SG386, SG387,SG392, SG393, SG394, SG395, SG396,SG401, SG402, SG403, SG404, SG405,SG410, SG411, SG412, SG413, SG414,SG419, SG420, SG421, SG422, SG423,SG428, SG429, SG430, SG431, SG432,SG437, SG438, SG439, SG440, SG441,SG446, SG447, SG448, SG449, SG450,SG455, SG456, SG457, SG458, SG459,SG468, SG469, SG470, SG471, SG472,SG477, SG478, SG479, SG480, SG481,SG486, SG487, SG488, SG489, SG490,SG495, SG496, SG497, SG498, SG499,SG504, SG505, SG506, SG507, SG508,SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,ou combinações dos mesmos, para ser utilizado como sonda na determina-ção do nível de expressão de um gene que possui uma seqüência comple-mentar ao referido oligonucleotídeo mediante a valorização do nível de mFI-NA correspondente a esse gene, de aplicação no diagnóstico in vitro de ne-oplasias originadas a partir de células hematopoiéticas e/ou no prognósticoin vitro da evolução da referida doença.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, que compre-ende pelo menos os oligonucleotídeos SG117, SG428, SG459, SG507,SG508.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, que compre-ende adicionalmente pelo menos os oligonucleotídeos SG461 e SG493.
4. Composição de acordo com a reivindicação 2, que compre-ende adicionalmente pelo menos o oligonucleotídeo SG237.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, que compre-ende adicionalmente pelo menos um oligonucleotídeo selecionado do grupode SG2, SG4, SG8, SG10, SG13, SG15, SG16, SG19, SG20, SG23, SG26,SG28, SG31, SG34, SG36, SG39, SG48, SG58, SG60, SG65, SG76, SG77,SG84, SG89, SG94, SG9, SG97, SG99, SG102, SG106, SG107, SG463,SG115, SG116, SG120, SG129, SG134, SG135, SG138, SG139, SG141,SG145, SG158, SG161, SG163, SG176, SG178, SG185, SG207, SG208,SG210, SG217, SG227, SG231, SG237, SG264, SG272, SG277, SG281,SG283, SG286, SG294, SG298, SG299, SG307, SG308, SG319, SG328,SG330, SG333, SG336, SG342, SG344, SG345, SG347, SG361, SG384,SG389, SG395, SG404, SG407, SG416, SG423, SG430, SG432, SG434,SG444, SG446, SG453, SG458, SG464, SG465, SG466, SG467, SG471,SG473, SG474, SG475, SG481, SG485, SG487, SG491, SG498, SG511,SG517, SG518, SG522, SG526, SG530, SG533, SG538, SG541, SG554,SG558, SG561 ou combinações dos mesmos.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-2 a 5, para ser utilizada no diagnóstico in vitro de leucemia linfática crônica.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, que compre-ende pelo menos os oligonucleotídeos SG26, SG216, SG366.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, que compre-ende adicionalmente pelo menos um oligonucleotídeo selecionado do grupode SG31, SG177, SG194, SG195, SG197, SG213, SG293, SG301, SG309,SG333, SG343, SG357, SG439, SG452, SG555, SG556.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-7 ou 8, para ser utilizada no prognóstico in vitro da futura evolução da doen-ça em um paciente que sofre de leucemia linfática crônica.
10. Composição de acordo com a reivindicação 1, que compre-ende todos os nucleotídeos do grupo composto por:SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225,SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, S G332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490, SG491, SG492, SG493, S G494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499, SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508, SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, caracterizada porque adicionalmente compreende pelo menosum oligonucleotídeo selecionado do grupo composto por SG463, SG464,SG466, SG467, SSPC1, SSPC2, SSPC3, SSPC4, SSPC5, SSPC6, SSPC7,SCN1, SCN2, SCN3, SCN5, SCN6, SCN7, SCN8, SCN10, SCN11, SCN12,SCN13, SC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6 e SC7.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, que com-preende todos os oligonucleotídeos do grupo composto por SG463, SG464,SG466, SG467, SSPC1, SSPC2, SSPC3, SSPC4, SSPC5, SSPC6, SSPC7,SCN1, SCN2, SCN3, SCN5, SCN6, SCN7, SCN8, SCN10, SCN11, SCN12,SCN13, SC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6 e SC7.
13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, onde os oligonucleotídeos estão dispostos sobre um suportesólido.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13, onde os oli-gonucleotídeos estão dispostos de forma ordenada sobre um suporte sólidoque é um vidro semelhante a um porta-objetos ao qual os oligonucleotídeosestão unidos mediante ligações covalentes, formando um microarray.
15. Composição na forma de microarray de acordo com a reivin-dicação 14, que compreende todos os oligonucleotídeos do grupo compostoporSG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351,SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360,SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369,SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378,SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387,SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396,SG397, SG398, SG399, SG400, SG4G1, SG402, SG403, SG404, SG405,SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414,SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423,SG424, SG425, SG426, SG427, S G428, SG429, SG430, SG431, SG432,SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441,SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450,SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459,SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472,SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481,SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490,SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499,SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508,SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563.
16. Composição na forma de microarray de acordo com a reivin-dicação 15, que compreende adicionalmente pelo menos um par de oligo-nucleotídeos selecionado entre aquele composto pelos oligonucleotídeosSG463 e SG464 e aquele composto pelos oligonucleotídeos SG466 eSG467, pelo menos um oligonucleotídeo do grupo composto por SSPC1,SSPC2, SSPC3, SSPC4, SSPC5, SSPC6 e SSPC7, pelo menos um oligo-nucleotídeo do grupo composto por SCN2, SCN3, SCN6, SCN8, SCN11,SCN12 e SCN13 e pelo menos um oligonucleotídeo do grupo composto porSC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6, SC7, SCN1, SCN5, SCN7 e SCN10.
17. Composição na forma de microarray de acordo com a reivin-dicação 16, que compreende todos os oligonucleotídeos do grupo compostopor SG463, SG464, SG466, SG467, SSPC1, SSPC2, SSPC3, SSPC4,SSPC5, SSPC6, SSPC7, SCN2, SCN3, SCN6, SCN8, SCN11, SCN12,SCN13, SC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6, SC7, SCN1, SCN5, SCN7 eSCN10.
18. Composição na forma de microarray de acordo com a reivin-dicação 17, que compreende adicionalmente pontos carentes de oligonucle-otídeos nos quais está unido ao vidro o solvente no qual estavam os oligo-nucleotídeos ao serem depositados sobre o referido vidro.
19. Composição na forma de microarray de acordo com a reivin-dicação 18, que compreende pelo menos doze cópias de cada um dos dife-rentes oligonucleotídeos presentes, assim como pelo menos doze pontoscarentes de oligonucleotídeos nos quais está unido ao vidro o solvente noqual estavam os oligonucleotídeos ao serem depositados sobre o referidovidro.
20. Composição na forma de microarray de acordo com qual-quer uma das reivindicações 18 a 19, onde nos pontos carentes de oligonu-cleotídeos está unido ao vidro o solvente DMSO.
21. Composição na forma de microarray de acordo com qual-quer uma das reivindicações 15 a 20 para ser utilizada no diagnóstico in vi-tro de leucemia linfática crônica e/ou para o prognóstico in vitro da evoluçãoda referida doença.
22. Um dispositivo para el diagnóstico in vitro de uma neoplasiaoriginada a partir de células hematopoiéticas e/ou para o prognóstico in vitroda evolução da mesma, que compreende uma composição de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 20.
23. Dispositivo para o diagnóstico in vitro de uma neoplasia ori-ginada a partir de células hematopoiéticas e/ou para o prognóstico in vitroda evolução da mesma de acordo com a reivindicação 22, que compreendeuma composição em forma de microarray de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 20.
24. Dispositivo para o diagnóstico in vitro de uma neoplasia ori-ginada a partir de células hematopoiéticas e/ou para o prognóstico in vitroda evolução da mesma de acordo com a reivindicação 22, que compreendeuma composição em forma de microarray de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 ou 20.
25. Dispositivo para o diagnóstico in vitro de uma neoplasia ori-ginada a partir de células hematopoiéticas e/ou para o prognóstico in vitroda evolução da mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações 23ou 24, onde a neoplasia que diagnosticada ou cuja evolução prognosticadaé leucemia linfática crônica.
26. Método para diagnosticar in vitro uma neoplasia originada apartir de células hematopoiéticas e/ou prognosticar in vitro a evolução damesma que compreende detecção in vitro a partir de uma amostra biológicae a análise estatística do nível de expressão de pelo menos um gene signifi-cativo para classificar a amostra como associada ou não à referida neopla-sia, gene este que é selecionado do grupo composto por GABARAP, NPM3,ABCB1, ABCB4, ABCC3, ABCC5, ABCC6, ABHD1, ABL1, ACTN1, AF1q,AKR1A1, ALDH1A1, ALK, ANK2, ANPEP, ANXA6, ANXA7, APAF1, APEX,ARHGEF2, ARS2, ASNS, ATIC, ATM, ATP50, ΒΑΧ, BCL10, BCL2, B-CL2A1, BCL2L1, BCL2LAA, BCL3, BCL6, BCL7A, BCL7b, BCR, BECN1,BIK, BIRC3, BIRC5, BLMH, BLR1, BLVRB, BMM, BMP6, BRMS1, BST2,BTG1, BUB1, C21orf33, C5orfl3, CA12, CALD1, CANP2, CASC3, CASP1,CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CAST, CATSD,CBFA2T1, CBFB1 CCNA1, CCNB1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, C-CR6, CCR7, CCT6A, CD14, CD19, CD2, CD22, CD24, CD28, CD33, CD34,CD36, CD38, CD3E, CD4, CD44, CD47, CD48, CD5, CD58, CD59, CD6,CD7, CD79A, CD79B, CD8, CD81, CD83, CD86, CD9, CDA, CDC25A,CDC25B, CDK2, CDK4, CDK5R1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A,CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CDW52, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CFL1,CKMT1, CKS2, CML66, COL3A1, COL4A6, CR2, CREB1, CREBBP, CR-YAB, CSF2, CSF3, CSRP2, CTGF, CTSB, CUZD1, CXADR, CXCL9, CX-CR3, CXCR4, CYC1, CYP1A1, CYP2A6, DAD-1, DAPK1, DCK, DDX6, DEKDHFR1 DLAD, DNAJA1, DNMT3B, DNTT1 D0K1, DPF2, DPP4, DRG1DRP2, E2F1, EB-1, EBI2, EDF1, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1GEFNB1, EGFR, EGR1, EIF2B2, EIF3S2, EIF4B, EIF4E, EIF5A, ELF1, ELF4ENPP1, EphA3, EPOR, ERBB2, ERBB4, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC5ERCC6, ETS1, ETS2, ETV6, ETV7, EZH2, FABP5, FADD1 FAIM3, FAM38AFARP1, FAT1 FCER2, FCGR3A, FCGR3B, FGFR1, FGFR3, FGR, FHITFKBP9, FLM1 FLJ22169, FLT3, FN1, FNTB1 FOS, FUS1 G1P2, GABPB2GATA1, GATA2, GATA3, GCET2, GDI2, GGA3, GJA1, GLUD1, GNL3GOT1, GRB2, GRIA3, GRK4, GSTP1, GSTT1, GUSB, GZMA, H2AFXH3F3A, HCK1 HELLS, HIF1A, HIST1H2BN, HLA-A1 HLA-DPA1, HLA-DQA1HLA-DRA, HLA-DRB3, HLF1 HMMR1 HNRPH3, HNRPL, HOXA10, HOXA9HOXD8, HOXD9, HRAS1 HSD17B1, HSPB1, IBSP, ICAM1, ICAM3, ID2, I-ER3, IFRD1, IGFBP2, IGFBP3, IGFIR, IGLV6-57, IL10, IL15, IL1B, IL2IL2RA, IL3, IL32, IL3RA, IL4R, IL6, IL6R, IL8, ILF2, IRF1, IRF2, IRF4, IRF8ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAL1 ITGAM, ITGAX1 ITGB1ITGB2, JAK1, JAK2, JUNB1 KAM, KIAA0247, KIAA0864, KIT, KLF1, KLF13KRAS2, KRT18, LADH, LAG3, LASP1, LCK, LCP1, LEPR, LGALS3LGALS7, LIF1 LIMS1, LM02, LOC285148, LRP, LSP1, LYL1, LYN, LYZMAFB, MAFK1 MAGEA1, MAL, MAP3K12, MAP4K1, MAPK10, MAZ, MBP1MCL1, MCM3, MCM7, MDM2, MEIS1, MEN1, MERTK1 MKI67, MLF1, MLF2MLL1 MLLT10, MME1 MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, MNDA, MPL1 MPOMRPL37, MS4A1, MTCP1, MUC-1, MX1, MYB1 MYBL1, MYC, MYOD1NCALD, NCAM1, NCL1 NDP52, NDRG1, NDUFA1, NDUFB, NF1, NFATC1NFIC, NFKB1, NFKB1A1 NINJ1, NPM1, NR3C1, NUMA1, NXF1, ODC1OGGI1- OLIG2, OPRD1, p14ARF, P55CDC, PABPC1, PAX5, PAX6, PAX8PBX1, PBX3, PCA1, PCD, PCNA, PDCD1, PDGFA, PDGFRB, PDHA1PGF, PGRMC1, PICALM, PLA2G6, PLAU, PLK1, PLP, PLS3, PLZF, PMLPMM1, P0LR2C, POU2F2, PPP1CC, PRAME, PRKCI, PRKCQ, PRKDCPRL1 PRTN3, PSMA5, PSMB4, PSMC5, PSMD7, PTEN, PTGS1, PTHLHPTK2, PTK2B, PTN, PTPRCCD, PYGB, RAD51, RAF1, RAG1, RARARARB, RB1, RBBP4, RBBP6, RBBP8, RBP4, RET1 RGS1, RGS1, RIS1RORA, RPL17, RPL23A, RPL24, RPL36A, RPL37A, RPL41, RPS3, RPS5,RPS9, RUNX1, RXRA1 S100A2, S100A8, SDC1, SDHD, SELE, SELL,SEPW1, SERPINA9, SERPINB5, SERPNINA9, SFTPB, SIAT4A, SLC7A5,SNRPB, SOSTDC1, SP1, SPM1 SPN, SPRR1 A, SREBF1, SSBP1, STAT1,STAT3, STAT5B, SUM01, TACSTD2, TAGLN2, TAL1, TBP, TCEB1, TCF1,TCF3, TCF7, TCL1A, TCRbeta1 TEGT1 TERF1, TERT1 TFCP2, TFRC1THBS1, THPO1 TIA-2, TIAM1, TK1, TLX1, TMEM4, TNF1 TNFRSF1OC1 TN-FRSF1A, TNFRSF25, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF8, TNFSF10, TNFSF5,TNFSF6, T0P2A, TOPORS, TP73, TRA TRADD1 TRAF3, TRAP1 ,TRIB2,TXNRD1, UBE2C, UHRF1, UVRAG, VCAM1, VEGF1 VPREB1, WBSCR20C,WNT16, WT1, XBP1, XP06, XRCC3, XRCC5, ZAP70, ZFPL1, ZNF42,ZNFN1A1, ZYX1 18S rRNA, 28S rRNA e cujo nível de expressão é determi-nado mediante a avaliação da concentração de seu mRNA correspondentemediante o uso de pelo menos uma sonda que possui uma seqüência com-plementar a um fragmento de um cordão do referido gene, sonda esta que éselecionada do grupo de oligonucleotídeos composto por:SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108,SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117,SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126,SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135,SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144,SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153,SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162,SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, S G342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395, SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450,SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459,SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472,SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481,SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490,SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499,SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508,SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563, ou combinações dos mesmos.
27. Método para diagnosticar in vitro uma neoplasia originada apartir de células hematopoiéticas e/ou prognosticar in vitro a evolução damesma de acordo com a reivindicação 26, que compreende adicionalmenteuma etapa prévia opcional de identificação de genes significativos para aclassificação de uma amostra como associada ou não a um tipo concreto deneoplasia originada a partir de células hematopoiéticas, etapa prévia estaque compreende as subetapas de:a) decidir as possíveis categorias nas quais a amostra pode serclassificada;b) obter amostras biológicas de indivíduos que foram anterior-mente classificados por um método diferente ao reivindicado em alguma daspossíveis categorias de classificação, de maneira que se tenham amostrasde cada uma das possíveis categorias;c) obter o mRNA total de cada uma das amostras;d) obter o cRNA total correspondente, marcado por meio de ummétodo que permite sua detecção posterior, de pelo menos uma alíquota decada uma das amostras de mRNA, alíquota à qual se acrescenta antes daobtenção do cRNA pelo menos uma seqüência de nucleotídeos poliadenila-da de baixa homologia com genes humanos para que sirva como controlepositivo interno do processo;e) acrescentar a cada uma das alíquotas de cRNA que será utili-zada na etapa f) pelo menos um oligonucleotídeo de baixa homologia comgenes humanos distinto de e não complementar a qualquer possível se-quência de nucleotídeos que tenha sido acrescentada na etapa d), para quesirva como controle positivo de hibridização;f) hibridizar, em condições estritas, pelo menos uma alíquota decRNA total de cada uma das amostras com pelo menos um microarray quecompreende pelo menos duas cópias de cada um dos oligonucleotídeos dogrupo composto por:SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9, SG10, SG11, SG12,SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20, SG21, SG22, SG23,SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31, SG32, SG33, SG34,SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42, SG43, SG44, SG45,SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, SG55, SG56,SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64, SG65, SG66, SG67,SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75, SG76, SG77, SG78,SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86, SG87, SG88, SG89,SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97, SG98, SG99,SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107, SG108,SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116, SG117,SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125, SG126,SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134, SG135,SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143, SG144,SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152, SG153,SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161, SG162,SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170, SG171,SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179, SG180,SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188, SG189,SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197, SG198,SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206, SG207,SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215, SG216,SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224, SG225 SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233, SG234 SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242, SG243 SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251, SG252 SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260, SG261 SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269, SG270 SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278, SG279 SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287, SG288 SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296, SG297 SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305, SG306 SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314, SG315 SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323, SG324 SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332, SG333 SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341, SG342 SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350, SG351 SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359, SG360 SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368, SG369 SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377, SG378 SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386, SG387 SG388, SG389, SG390, SG391, S G392, SG393, SG394, SG395, SG396 SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404, SG405 SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413, SG414 SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422, SG423 SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431, SG432 SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440, SG441 SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449, SG450 SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458, SG459 SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471, SG472 SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481 SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490 SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499 SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517,SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526,SG527, SG428, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535,SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544,SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553,SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562,SG563, microarray este que compreende adicionalmente:a. pelo menos dois pontos que correspondem as suas respecti-vas alíquotas do solvente no qual estavam os oligonucleotídeos no momentode seu depósito sobre a superfície do microarray, para que sirvam comoreferência,b. pelo menos duas cópias de pelo menos um oligonucleotídeopara cada uma das seqüências poliadeniladas acrescentadas na etapa d),oligonucleotídeo cuja seqüência será correspondente a um fragmento, dis-tinto da zona de poliadenilação, da seqüência de nucleotídeos poliadeniladacuja evolução no processo deve ser controlada;c. para cada um dos oligonucleotídeos acrescentados na etapae), pelo menos duas cópias de um oligonucleotídeo complementar ao mes-mo;d. pelo menos duas cópias de cada membro de pelo menos umpar de oligonucleotídeos onde a seqüência de um dos membros correspon-de a uma seqüência da zona 5' e a seqüência do outro corresponde a umaseqüência da zona 3' do mRNA de um gene que é expresso de forma cons-titutiva em qualquer célula de origem hematopoiética;e. pelo menos duas cópias de pelo menos um oligonucleotídeode baixa homologia com genes humanos distinto de qualquer dos oligonu-cleotídeos definidos no item b. e distinto de qualquer dos oligonucleotídeossintéticos acrescentados de forma opcional na etapa e);g) detectar e quantificar o sinal de cRNA hibridizado com cadauma das cópias de cada um dos oligonucleotídeos presentes no microarray,assim como o sinal correspondente aos pontos do solvente;h) calcular o nível médio de intensidade de hibridização de cadaum dos oligonucleotídeos do microarray calculando a média das intensida-des das cópias de cada um dos oligonucleotídeos;i) dar a hibridização por válida se satisfeitas as seguintes condi-ções:a. a relação entre a intensidade média e o fundo médio de todosos oligonucleotídeos do microarray é maior que 10;b. o valor do coeficiente de variação médio de todas Ias réplicasde oligonucleotídeos deve ser inferior a 0,3;c. o valor médio de controle negativo deve ser inferior a 2,5 ve-zes o valor médio dos pontos correspondentes ao solvente;d. existe sinaí tanto nos controles de hibridização como nos con-troles positivos internos utilizados como controle do processo;j) normalizar os dados;k) eliminar os oligonucleotídeos com valores de intensidade mé-dia menos ruído de fundo médio inferiores a aproximadamente 2 vezes ovalor médio obtido com os pontos correspondentes ao solvente, assim comoos oligonucleotídeos com intervalo interquartílico de intensidade normalizadaao longo das amostras menor que 0,3;l) realizar a análise estatística para encontrar os oligonucleotí-deos estatisticamente significativos para diferenciar entre as diferentes ca-tegorias e poder realizar a classificação de uma amostra que não tenha sidoanteriormente atribuída a nenhuma categoria, escolhendo os referidos oli-gonucleotídeos entre aqueles que não tenham sido eliminados nas etapasanteriores, até obter os "n" oligonucleotídeos que ou apresentam um valorde ρ inferior a um limite escolhido do intervalo aberto de 0 a 0,05, utilizandopara isso de preferência um método capaz de reduzir os falsos positivos, ousão os que melhor definem as categorias estabelecidas;m) comprovar que o agrupamento das amostras segundo asdiferenças nas intensidades entre as diferentes amostras detectadas paraos oligonucleotídeos estatisticamente significativos resulta no fato de asamostras continuarem classificadas nas mesmas categorias para as quaishaviam sido atribuídas anteriormente por um método diferente.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, onde o microar-ray compreende pelo menos quatro cópias de cada um dos oligonucleotí-deos presentes no mesmo e a média das intensidades das cópias de cadaum dos oligonucleotídeos calculada no item h) é uma média delimitada.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, onde a normali-zação é feita utilizando o método "variância estabilização normalização" dis-ponível no programa "vsn" de R.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27a 29, onde a análise estatística para encontrar os oligonucleotídeos estatis-ticamente significativos para diferenciar entre as diferentes categorias é efe-tuado utilizando a função mt.maxT do programa multtest de R.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27a 30, onde é utilizado um dispositivo diagnóstico de acordo com a reivindi-cação 24.
32. Método de acordo com as reivindicações 27 a 31, que com-preende uma etapa opcional de obtenção de uma função de classificaçãopara cada amostra pela atribuição arbitrária do valor 0 a uma das possíveiscategorias "a" e do valor 1 à outra possível categoria "b" nas quais a amos-tra pode ser classificada e a obtenção por regressão logística de um coefici-ente para cada um dos oligonucleotídeos que permitem calcular um valor Xipara cada amostra por meio de uma função do tipo:<formula>formula see original document page 144</formula>ondecoef_oligm representa o coeficiente calculado para um oligonu-cleotídeo concreto "m"lmni_oligm representa o valor médio de intensidade normalizadaobtido na hibridização da amostra i calculado para o oligonucleotídeo "m""m" varia de 1 a "n"η é o número total de oligonucleotídeos considerados significativosvalor Xi a partir do qual é calculada a probabilidade "Pi" de queuma amostra "i" pertence a uma ou outra categoria utilizando a fórmula Pi =-1/(1 +e-xi) e classificando I amostra como pertencente à categoria "a" o "b" seseu valor Pi correspondente está mais perto de 0 ou 1, respectivamente.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27a 29, onde a análise estatística para encontrar os oligonucleotídeos signifi-cativos para diferenciar entre as diferentes categorias é efetuada utilizandoo método de "Nearest Shrunken Centroids".
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27a 33, onde as amostras biológicas analisadas in vitro são amostras de san-gue periférico.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, onde é diagnosti-cada in vitro uma leucemia ou é prognosticada a evolução da mesma.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, onde é diagnosti-cado in vitro se um indivíduo sofre de leucemia linfática crônica.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, onde a evoluçãoda leucemia linfática crônica em um indivíduo é prognosticada in vitro porclassificação de uma amostra de sangue extraída do mesmo como "associ-ada à leucemia linfática crônica estável" ou como "associada à leucemialinfática crônica progressiva".
38. Método para diagnosticar in vitro uma neoplasia originada apartir de células hematopoiéticas e/ou prognosticar in vitro a evolução damesma que compreende a detecção in vitro e a análise estatística do nívelde expressão de pelo menos um gene significativo para classificar a amos-tra como pertencente a um indivíduo saudável ou associá-la a algum tipo deneoplasia originada a partir de células hematopoiéticas de acordo com areivindicação 26, onde a neoplasia diagnosticada e/ou cuja evolução éprognostica é uma leucemia.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, onde é diagnosti-cada e/ou prognosticada a evolução da leucemia linfática crônica.
40. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicae/ou prognosticar in vitro sua evolução de acordo com a reivindicação 39,onde a detecção in vitro do nível de expressão de pelo menos um gene sig-nificativo é efetuada a partir de amostras de sangue periférico.
41. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 40, onde os indivíduos dos quais foram extra-idas as amostras de sangue correspondentes são classificado na categoriade indivíduo que não tem LLC ou na categoria de indivíduo que tem LLC.
42. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 41, onde a classificação dos indivíduos é efe-tuada depois da detecção in vitro e da análise estatística do nível de expres-são nas amostras de sangue correspondentes pelo menos dos genesCD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1.
43. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 42, onde a classificação dos indivíduos é efe-tuada depois da detecção in vitro e da análise estatística do nível de expres-são nas amostras de sangue correspondentes adicionalmente dos genesIRF8 e COL3A1.
44. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 43, onde a detecção in vitro e a análise esta-tística do nível de expressão dos genes CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 e COL3A1 é efetuada por meio da avaliação domRNA correspondente por hibridização de seu cRNA correspondente utili-zando como sondas os oligonucleotídeos SG117, SG428, SG459, SG507,SG508, SG461 e SG493.
45. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 44, onde os oligonucleotídeos fazem parte deuma composição em forma de microarray.
46. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 45, onde a avaliação do cRNA hibridizado éefetuada graças à marcação prévia de cRNA com biotina, à coloração domicroarray hibridizado com estreptavidina conjugada com um fluoróforo e àdetecção do sinal emitido pelo referido fluoróforo.
47. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 46, onde fluoróforo é Cy3.
48. Método para diagnosticar in vitro leucemia linfática crônicade acordo com a reivindicação 47, onde a classificação de um indivíduo doqual foi extraída a amostra i analisada na categoria de indivíduo que nãotem LLC ou na categoria de indivíduo que tem LLC é efetuada calculandopara o referido indivíduo um valor de probabilidade p, = 1/(1 +e"xl) depois deobter seu valor correspondente de x, pela fórmulaXi = -719,241486 + (2,44756372 * lmni_CD79A) + (7,38657611 *lmni_FAIM3) + (23,1465464 * ImniJHLA-DRA) + (43,6287742 * ImnuIRFe) -(19,3978182 * lmni_COL3A1) - (2,80282646 * lmni_HLA-DRB3) +(49,5345672 iImniJHLA-DQA1) fórmula onde cada um dos valores denomi-nados pela abreviação "Imnj" seguida da abreviação de um gene refere-seao valor médio de intensidade normalizado obtido depois de detectar o sinalde hibridização correspondente ao oligonucleotídeo que está sendo utilizadocomo sonda para avaliar a expressão do referido gene e classificando o in-divíduo como indivíduo que não tem LLC se o valor de Pi for menor que 0,5e como indivíduo que tem LLC se o valor de p, for maior que 0,5.
49. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 40, onde os indivíduos dos quais foram extraídas as amostras desangue correspondente são classificados na categoria de indivíduo com LLCestável ou na categoria de indivíduo com LLC progressiva.
50. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 49, onde a classificação dos indivíduos é efetuada depois da detec-ção in vitro e da análise estatística do nível de expressão nas amostras desangue correspondentes pelo menos dos genes PSMB4, FCER2 e
51. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 50, onde a classificação dos indivíduos é efetuada depois da detec-ção in vitro e da análise estatística do nível de expressão nas amostras desangue correspondentes adicionalmente de pelo menos um gene seleciona-do do grupo composto por ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CD5, MS4A1,EIF4E, FHIT1 NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF,RBP4.
52. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 51, onde a classificação dos indivíduos é efetuada depois da detec-ção in vitro e da análise estatística do nível de expressão nas amostras desangue correspondentes pelo menos dos genes do grupo composto porPSMB4, FCER2, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CD5, MS4A1,EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF,RBP4.
53. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com qualqueruma das reivindicações 51 ou 52, onde a detecção in vitro e da análise esta-tística do nível de expressão dos genes examinados é efetuada por meio daavaliação do mRNA correspondente por hibridização de seu cRNA corres-pondente utilizando como sondas os oligonucleotídeos correspondentes se-lecionados de grupo composto por SG26, SG216, SG366, SG31, SG177,SG194, SG195, SG197, SG213, SG293, SG301, SG309, SG33, SG343,SG357, SG439, SG452, SG555, SG556.
54. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 53, onde os oligonucleotídeos fazem parte de uma composição emforma de microarray.
55. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 54, onde a avaliação do mRNA correspondente da amostra analisa-da por meio da detecção do cRNA correspondente hibridizado para o oligo-nucleotídeo correspondente é efetuada graças à marcação prévia do cRNAcom biotina, à coloração do microarray hibridizado com estreptavidina con-jugada com um fluoróforo e à detecção do sinal emitido pelo referido fluoró-foro.
56. Método para prognosticar in vitro a evolução da doença emum indivíduo que sofre de leucemia linfática crônica de acordo com a reivin-dicação 55, onde o fluoróforo é Cy3.
57. Uso de um dispositivo de avaliação do nível de expressão depelo menos um gene do grupo composto por PSMB4, FCER2, POU2F2,ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CD5, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1,MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF, RBP4, CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 e COL3A1 para o diagnóstico in vitro daexistência de leucemia linfática crônica em um indivíduo e/ou para o prog-nóstico in vitro da evolução da leucemia linfática crônica em um indivíduo.
58. Uso de um dispositivo de avaliação do nível de expressão degenes de acordo com a reivindicação 57, onde é avaliado o nível de expres-são de pelo menos um gene do grupo composto por CD79A, FAIM3, HLA- DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 e COL3A1 para o diagnóstico in vitro daexistência de leucemia linfática crônica em um indivíduo.
59. Uso de um dispositivo de avaliação do nível de expressão degenes de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 e 58, onde é ava-liado o nível de expressão de pelo menos os genes CD79A, FAIM3, HLA- DRA, HLA-DRB3, HLA-DQA1 para o diagnóstico in vitro da existência deleucemia linfática crônica em um indivíduo.
60. Uso de um dispositivo de avaliação do nível de expressão degenes de acordo com a reivindicação 59, onde é adicionalmente avaliado onível de expressão pelo menos dos genes IRF8 e COL3A1 para o diagnósti-co in vitro da existência de leucemia linfática crônica em um indivíduo.
61. Uso de um dispositivo de avaliação do nível de expressão degenes de acordo com a reivindicação 57, onde é avaliado o nível de expres-são de pelo menos um gene do grupo composto por PSMB4, FCER2,POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CD5, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF, RBP4, para prognosticarin vitro a evolução da doença em um indivíduo que sofre de leucemia linfáti-ca crônica.
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