ES2324435A1 - Procedimiento y disposicion de analisis in vitro de mrna de genes implicados en neoplasias hematologicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento y dispositivo de análisis in vitro de mRNA de genes implicados en neoplasias hematológicas. El dispositivo, compuesto de sondas que hibridan de forma específica con genes implicados en neoplasias hematológicas, diseñadas para que su comportamiento en la hibridación sea similar, permite la evaluación del nivel de mRNA en muestras biológicas extraídas de sujetos que se sospecha que pueden padecer una neoplasia hematológica y facilita la comparación entre las distintas muestras y su agrupamiento por similitud en los patrones de expresión de los genes, especialmente cuando las sondas están dispuestas en forma de microarray. La aplicación del método de la invención para obtener y procesar datos de diferencias en expresión génica procedentes del dispositivo de la invención permite la identificación de genes significativos para distinguir muestras asociadas a neoplasias hematológicas, facilita el diagnóstico de neoplasias como la LLC y permite incluso pronosticar la evolución de la misma.
Description
Procedimiento y dispositivo de análisis in
vitro de mRNA de genes implicados en neoplasias
hematológicas.
La invención se adscribe al sector
técnico-industrial del diagnóstico in vitro,
extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante técnicas de
ingeniería genética, aplicado al diagnóstico de tipos concretos de
neoplasias a partir de sus patrones de expresión génica y/o al
pronóstico de su evolución. Más concretamente, la invención se
refiere a la identificación de neoplasias originadas a partir de
células hematopoyéticas a partir de la evaluación de los niveles de
RNA mensajeros de genes significativos en muestras biológicas como
pueden ser las muestras de sangre periférica, preferiblemente
mediante el uso de microarrays. Con ello pueden identificarse
muestras correspondientes a pacientes que padecen LLC, permitiendo
el diagnóstico de la misma y, además, pueden clasificarse muestras
de pacientes que padecen LLC en muestras que pertenecen a pacientes
en los que la LLC va a permanecer estable o en los que va a
progresar, permitiendo el pronóstico de la futura evolución de
estos pacientes.
Cada día, el cuerpo humano produce billones de
nuevas células blancas, rojas y plaquetas que reemplazan a las
células hematopoyéticas que se pierden como consecuencia de un
proceso normal de renovación, enfermedad o trauma. Al proceso
organizado de producción de células hematopoyéticas y homeostasis se
le conoce con el nombre de hematopoyesis (Weissman IL et
al., 2000; Leung AYH et al., 2005.
En el hombre la hematopoyesis está confinada a
la médula ósea (M.O.) de la mayor parte de los huesos, y de forma
gradual, con la edad, ésta es sustituida por grasa de manera que,
en el adulto, el 70% de la médula ósea se localiza en pelvis,
vértebras y esternón (Bernard et al., 1976).
Todas las células maduras de la sangre se
generan a partir de un relativo bajo número de células
hematopoyéticas conocidas como células hematopoyéticas madre o
"stem". La célula madre hematopoyética tiene dos
características que son la pluripotencialidad o capacidad de dar
origen a las distintas estirpes celulares hematopoyéticas y la
autorrenovación o propiedad de perpetuarse generando células iguales
a si misma (Weissman IL et al., 2000). Esta capacidad es
esencial para el mantenimiento de la hematopoyesis a lo largo de la
vida ya que, sin la autorrenovación, se agotaría rápidamente la
reserva de células madre disponible. Las células madre
hematopoyéticas son capaces de generar distintos tipos celulares
hematopoyéticos maduros a través de una serie de progenitores y
precursores intermedios. Estos progenitores y precursores sufren
una secuencia ordenada de sucesos que los transforman en células
maduras. A este proceso se le conoce con el nombre de
diferenciación (Lee MF et al., 2005). La diferenciación de
las células hematopoyéticas implica cambios que afectan entre otros
al tamaño y forma de la célula, a la expresión de genes, de
proteínas, respuesta a señales y localización de las células.
Las células terminalmente diferenciadas han
perdido su capacidad de división y sufren apoptosis después de un
periodo de tiempo que va desde horas para neutrófilos hasta décadas
para algunos linfocitos. Este hecho hace que la M.O. deba asegurar
constantemente el recambio celular (Datta SR et al.,
1999).
El proceso de hematopoyesis comprende una
compleja interacción entre acontecimientos genéticos intrínsecos de
las células hematopoyéticas y ambiente en el que se encuentran.
Esta interacción es la que determina si los precursores y
progenitores hematopoyéticos se deben mantener quiescentes,
proliferar, diferenciarse en una u otra línea o entrar en apoptosis
(Domen J et al., 1999). Todos los mecanismos genéticos y
ambientales que gobiernan la producción de células sanguíneas
operan alterando la balanza relativa de estos procesos celulares
fundamentales.
Los factores ambientales y genéticos son
críticos en hematopoyesis. Así por ejemplo la expresión de genes
pertenecientes a las familias Rb (Bergh et al., 1999),
ciclinas (Della Ragione F et al., 1997) o Hox (Magli MC et
al., 1997) regulan la proliferación de células hematopoyéticas
en estadios tempranas de diferenciación. Los genes de la familia de
bcl-2 regulan apoptosis en células hematopoyéticas
(O'Gorman DM et al., 2001). Una gran variedad de genes entre
los que se encuentran C/EBP (Tenen DG et al., 1997), Pax5
(Nutt SL et al., 1999) e Ikaros (Nichogiannopoulou A. et
al., 1998) parecen estar implicados en diferenciación
hematopoyética y compromiso de línea.
\vskip1.000000\baselineskip
Las neoplasias hematológicas son procesos
malignos que afectan a cualquiera de los tipos celulares implicados
en el sistema hematopoyético. Como consecuencia de esta
transformación, la célula es bloqueada en un estadio de
diferenciación y comienza a acumularse debido a una proliferación
incontrolada, a un fallo del mecanismo apoptótico o a un bloqueo de
su proceso de diferenciación.
La transformación maligna de las células
hematopoyéticas durante los diferentes estadios por los que
atraviesan en su diferenciación a células maduras origina un gran
número de neoplasias distintas (Guttmacher AE et al., 2003).
Este tipo de neoplasias es por tanto un grupo muy heterogéneo de
enfermedades que sólo tiene en común el origen hematopoyético del
tipo celular transformado.
\vskip1.000000\baselineskip
Genéricamente podrían establecerse dos grandes
grupos: las neoplasias linfoides que afectan a los distintos tipos
celulares y grados madurativos que conforman la línea linfoide
tanto B como T y el otro gran grupo lo constituyen las neoplasias
mieloides que afectan a diversos tipos celulares de la línea
mieloide. Sin embargo, esta clasificación simplista actualmente
está mas desarrollada, tal y como se detalla más abajo.
Desde el punto de vista clínico, clásicamente se
han diferenciado de manera arbitraria las leucemias de los
linfomas, señalando a las leucemias como aquellas neoplasias que
afectan a la médula ósea y tienen expresión periférica, es decir,
circulación de células anómalas en sangre, y a los linfomas como
aquellas neoplasias que permanecen localizadas en los ganglios
linfáticos u otros tejidos linfoides y que carecen, al menos de
manera inicial, de comportamiento leucémico. En el caso de las
leucemias, se ha diferenciado los procesos agudos de los crónicos
inicialmente por las características
morfo-citológicas de las células proliferantes
(inmaduras y atípicas en el primer caso y más diferenciadas en el
segundo) y a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. En la
actualidad el conocimiento de los marcadores inmunológicos y las
alteraciones genéticas que afectan a las células hematopoyéticas
ayudan a diferenciar con más precisión los diferentes procesos.
Hoy se conoce que las neoplasias hematológicas,
al igual que ocurre en otros tipos de cáncer, tienen un origen
multigénico. La gran revolución tecnológica producida en los
últimos años ha supuesto conocer las bases moleculares de varias
neoplasias. La utilización de estas técnicas permite identificar
genes relevantes en el cáncer humano, confirmar los resultados
obtenidos en investigación básica en modelos animales, establecer
patrones de susceptibilidad, clasificar de forma más precisa las
neoplasias, mejorar el diagnóstico de la enfermedad, identificar
nuevas dianas terapéuticas y mejorar la selección terapéutica para
cada paciente.
También la diversidad que existe entre los
individuos es importante y tiene su repercusión clínica, basada en
las diferencias genéticas: si somos capaces de reconocer estas
diferencias genéticas seremos también capaces de avanzar en conocer
toxicidad y diferencias en la respuesta al tratamiento. (Westbrook
CA et al., 2005).
En 1995, la Organización Mundial de la Salud
(OMS/WHO) en colaboración con la Asociación Europea de Hematología
y patólogos, clínicos y científicos de todo el mundo, inició un
proyecto con el objetivo de obtener una clasificación consensuada
de los tumores del tejido hematopoyético y órganos linfoides. Este
proyecto condujo al desarrollo de un sistema de definición,
clasificación y establecimiento de criterios diagnósticos consenso
para las neoplasias mieloides, linfoides e histiocitarias (Jaffe ES
et al., 2001). Los criterios de clasificación de la OMS son
los mismos que se utilizaron en la clasificación REAL
(Clasificación Revisada Europea-Americana de las
neoplasias Linfoides) publicada por el International Lymphoma Study
Group en 1994 (Harris NL et al., 1994). El sistema de
clasificación REAL, a diferencia de otros sistemas de clasificación
anteriores, se fundamenta en la definición de entidades
"reales" y no en subtipos morfológicos. Para el establecimiento
de estas entidades "reales" se utiliza toda la información
disponible, es decir, se combinan datos morfológicos,
inmunofenotípicos y biológicos con las características genéticas y
clínicas (Harris NL et al., 1999a).
La clasificación de la OMS, que se presentó en
1997, estratifica las entidades de acuerdo a la línea celular
afectada: mieloide, linfoide, histiocítica/dendrítica y
mastocitaria. Dentro de cada categoría, se define la enfermedad de
acuerdo a morfología, inmunofenotipo, datos genéticos y clínicos
(Harris NL et al., 1999b). En muchas neoplasias, el estadio
en el que se encuentra la célula tumoral acumulada no coincide con
el estadio en el que ha ocurrido el evento inicial transformador.
Así, muchas neoplasias hematológicas se originan en los precursores
iniciales y la alteración genética específica puede determinar que
la célula siga avanzando en su diferenciación hasta detenerse y
acumularse en estadios de diferenciación más avanzados (Shaffer AL
et al., 2002). Por el contrario otras neoplasias pueden
desarrollarse en los estadios de diferenciación mas avanzados, tal
como ocurre en las células procedentes del centro folicular en las
que las translocaciones y reordenamientos genéticos producen
activación de genes que contribuyen al desarrollo tumoral. La
nomenclatura para cada entidad refleja la mejor estimación para su
línea celular y estadio de diferenciación, reconociendo que el
conocimiento del que se dispone en la actualidad es imperfecto y
que pueden producirse cambios en la asignación a la línea celular y
en la nomenclatura según mejore el conocimiento disponible.
Los criterios actuales de diagnóstico y
clasificación de estas neoplasias están basados en una combinación
de (Braziel RM et al., 2003):
- Evaluación morfológica de la célula:
Observación al microscopio de las células implicadas. Se obtiene
información sobre el tipo de célula y grado de maduración en el que
se encuentra.
- Estudio del inmunofenotipo: Reconocimiento de
antígenos expresados en la superficie de la célula neoplásica.
Estos antígenos se expresan de distinto modo y en diferente grado
en función del linaje y del estadio en el que se encuentra la
célula. Se conoce la expresión de antígenos de superficie
característica de la línea y estadio de diferenciación en el que se
encuentra la célula, por ejemplo, la expresión de CD19 y CD20 es
típicas de células de línea B, mientras que la expresión de CD3 es
típica de línea T. El estudio de CD23 es clave a la hora de
diferenciar LNHCM de LLC (Gong JZ et al., 2001).
Desde siempre se ha intentado relacionar los
distintos tipos de neoplasias con su correspondiente población de
célula normal a través de sus características morfológicas e
inmunofenotípicas. Muchas neoplasias parecen por lo tanto
"atrapadas" en estadios de desarrollo determinados porque
presentan características morfológicas e inmunofenotípicas
similares a las que presenta la célula hematopoyética en ese
estadio de diferenciación (Shaffer AL, et al.,
2002).
2002).
- Características clínicas: Signos y síntomas
que presenta el paciente en el momento del diagnóstico.
- Determinación de marcadores moleculares:
Medición de algunas moléculas que se asocian a entidades concretas
como la presencia de PML/RARA en Leucemia promielocítica o que
confieren mejor o peor pronóstico, como por ejemplo, la expresión
de CD38 en células LLC marcador de mal pronóstico (Durig J et
al., 2002).
- Estudios citogenéticos basados en la búsqueda
de alteraciones genéticas en el DNA de las células tumorales. En
muchos casos, existen reordenamientos específicos característicos
de tipos de tumor o estadios (Mitelman F, et al., 1997). En
función de las translocaciones cromosómicas pueden establecerse
distintos grupos con significado clínico, por ejemplo, en
LLA-B, donde es frecuente la presencia de
oncoproteínas de fusión, la presencia de
t(2;21)/TEL1-AML1 y
t(1;19)/E2A-PBX1 se asocia con respuesta a
tratamiento mientras que el pronóstico para pacientes con
t(9;22)BCR-ABL y
t(4;11)/MLL-AF4 es mucho peor (Arico M et
al., 2000). También suelen realizarse búsquedas de mutaciones
puntuales, deleciones o inserciones en algún gen que se han
relacionado con pronóstico mas favorable como, por ejemplo, los
síndromes mielodisplásicos asociados a 5q- (Boultwood J et
al., 1994).
Como ya se ha comentado anteriormente, la OMS
establece cuatro grandes grupos de neoplasias hematológicas en
función de la estirpe implicada (neoplasias mieloides, linfoides,
histiocítica/dendrítica y mastocitaria). A continuación se
describen con más amplitud las neoplasias pertenecientes a la línea
mieloide y linfoide por ser las que se producen con mayor
frecuencia. Las correspondientes a las líneas
histiocítica/dendrítica y mastocitaria por el momento constituyen
entidades muy puntuales.
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Agrupan todas las neoplasias originadas en la
línea de diferenciación mieloide, la OMS distingue cuatro grandes
grupos (Vardiman JW et al., 2002).
Síndromes mieloproliferativos (SMP) son
alteraciones clonales de la célula madre hematopoyética
caracterizados por hematopoyesis efectiva que conduce a un aumento
de los niveles sanguíneos de una o más líneas hematopoyéticas y
hepatoesplenomegalia. Constituyen un grupo de entidades en las
cuales existe un incremento de los precursores de serie mieloide o
fibrosis de la médula ósea (mielofibrosis), en este grupo se
incluye también la mastocitosis sistémica. Se destacan:
- Síndromes mieloproliferativos crónicos
(SMPC). Alteración clonal de la célula madre hematopoyética.
Caracterizados por una hematopoyesis eficaz que produce aumento en
sangre periférica de una o mas líneas celulares y frecuentemente
hepatoesplenomegalia, hipercelularidad medular con maduración pero
sin displasia.
- Leucemia mieloide crónica (LMC). Es un
proceso clonal secundario a una alteración genética adquirida de la
célula pluripotente. La enfermedad se caracteriza por la
superproducción de neutrófilos y de sus precursores. Tiene tres
fases: la primera denominada fase crónica de duración no definida,
seguida de la fase de aceleración y finalmente de la crisis
blástica que realmente es una leucemia aguda secundaria.
La LMC tiene una incidencia baja de
aproximadamente un caso por 100.000 habitantes/año y aparece más
frecuentemente en la quinta y sexta década de la vida. Puede ser
considerada como una enfermedad rara.
Es la leucemia característica por excelencia ya
que fue aplicado el término leucemia por primera vez en esta
entidad. El 95% de los casos presenta un marcador genético, el
cromosoma Philadelphia, originado por la traslocación de un
fragmento del cromosoma 22 que se pega al cromosoma 9 o
t(9;22) (g34;g11). Esta translocación origina el gen de
fusión bcr-abl. La proteína codificada por este gen
quimérico, BCR-ABL tiene una actividad
tirosin-quinasa aumentada comparada con la
actividad de la proteína normal abl y actúa como factor de
crecimiento oncogénico (Pane F et al., 2002), aunque
realmente los mecanismos que producen la superproducción de células
mieloides no están totalmente aclarados. Es posible que otros
protooncogenes como el p-53 intervengan en el
proceso y en la transformación de fase crónica a crisis blástica.
Los pocos casos en los no se detecta la presencia del cromosoma
Philadelphia representan cuadros mieloproliferativos atípicos y
corresponden a la variante de SMD conocida como leucemia
mielomonocítica crónica (LMMC).
El diagnóstico se basa en los recuentos
celulares elevados para la serie blanca, aparición de células
mieloides normales morfológicamente y en todos los estadios de
diferenciación, pero con un numero elevado de mielocitos y
neutrófilos, generalmente existe basofilia y trombocitosis. En la
fase de aceleración se produce un aumento de células inmaduras en
sangre periférica y en la crisis blástica la célula predominante es
el mieloblasto (65%) o el linfoblasto (35%).
- Policitemia Vera (PV). Es el síndrome
mieloproliferativo caracterizado por el incremento de la masa de la
serie roja. La policitemia vera es una enfermedad hematológica
benigna, cuyo padecimiento no influye en el acortamiento de la
supervivencia. Sin embargo, se trata de una enfermedad clonal que
puede evolucionar en un 15% de los pacientes a mielofibrosis o
leucemia aguda (5%).
- Trombocitemia Esencial (TE). Síndrome
mieloproliferativo caracterizado por una producción plaquetaria 15
veces superior a lo normal. Puede asociarse a complicaciones
trombóticas o hemorrágicas secundarias a una disfunción plaquetaria.
La edad de presentación está entorno a los 60 años, con igual
incidencia en ambos sexos.
- Mielofibrosis (MF). Es un trastorno
clonal neoplásico de la célula madre pluripotente. Se caracteriza
por una gran producción de megacariocitos anormales. Estas células
liberan moléculas (factor de crecimiento derivado de las plaquetas,
factor 4 plaquetario) que estimulan la proliferación de fibroblastos
y construyen fibras de colágeno en la médula ósea. La médula es
incapaz de funcionar con normalidad y las células precursoras
hematopoyéticas se trasladan al hígado y bazo, dando lugar a
hematopoyesis extramedular. Caracterizado por fibrosis de M.O y
esplenomegalia. Aparece en mayores de 50 años y no tiene
preferencia por sexo.
- Mastocitosis. Grupo de entidades
caracterizadas por la proliferación de células mastocitarias en
diferentes partes del organismo. La mastocitosis sistémica (MS), es
una enfermedad rara que afecta habitualmente a adultos, y presenta
alteraciones óseas en el 70% de los pacientes (Chen CC et
al., 1994).
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La OMS ha establecido una clasificación algo
diferente, separando los SMD/SMP como entidades diferenciadas del
resto de SMD, ya que comparten características con los SMPC que los
hacen diferentes. En este grupo se incluyen tres entidades:
leucemia mielomonocítica crónica, leucemia mieloide crónica atípica,
leucemia mielomonocítica juvenil y SMD/SMP inclasificables.
Los síndromes mielodisplásicos (SMD) son
proliferaciones clonales de la célula madre hematopoyética que
comparten en el momento del diagnóstico datos clínicos,
morfológicos y analíticos que se superponen entre LAM y SMPC. Se
caracterizan por la hipercelularidad de la médula ósea debida a la
proliferación de una o más líneas mieloides (Heaney ML, 1999). La
presencia de displasia en al menos una línea (mieloide, eritroide o
megacariocítica-plaquetar) es una característica de
SMD. La incidencia es variable en dependencia de la variedad. Se
estima una incidencia de 3 casos x 100.000 habitantes mayores de 60
años/año. La clasificación FAB establece 4 categorías diagnósticas
(Bennett JM et al., 1984): anemia refractaria simple (AR),
anemia refractaria con sideroblastos en anillo (ARS), anemia
refractaria con exceso de blastos (AREB) y anemia refractaria con
exceso de blastos en transformación (AREB-T) y
leucemia mielomonocítica crónica (LMMC).
En cuanto a los SMD la OMS establece cinco
categorías diferenciadas (Harris NL, et al., 1999): anemia
refractaria, citopenia refractaria con displasia multilinear,
anemia refractaria con exceso de blastos, SMD inclasificable y SMD
asociado a defecto aislado en el cromosoma 5 (del 5q) ó síndrome
5q-.
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Proliferación clonal de células inmaduras de la
línea mieloide. Pueden aparecer de novo o de forma secundaria en
pacientes con síndrome mielodisplásico (SMD). La clasificación
elaborada por el grupo
francés-americano-británico (FAB)
considera ocho variedades (M0-M7) basadas en
criterios morfológicos y en el inmunofenotipo de las células
neoplásicas (Bennett JM, et al., 1976). A pesar de que esta
clasificación ha sido aceptada durante muchos años, el
descubrimiento de que muchas alteraciones genéticas tienen carácter
predictivo y la incorporación del análisis citogenético al
diagnóstico de leucemias agudas (Bene MC et al., 2001) ha
permitido subclasificar la enfermedad y establecer una valoración
pronóstica, como ocurre con la translocación t(15;17) que
caracteriza a la leucemia aguda promielocítica variedad que se
caracteriza por la expresión de un receptor para el ácido retinóico
(RAR), característica que convierte a este tipo de leucemia en
sensible a tratamiento con ácido transretinóico (ATRA) en la
mayoría de los casos.
La OMS clasifica las LAM incorporando datos
morfológicos, características inmunofenotípicas, genéticas y
clínicas para poder definir entidades biológicamente homogéneas y
con relevancia clínica. Así la LAM se clasifica en cuatro grandes
categorías: 1.- LAM con anomalías genéticas recurrentes. 2.- LAM con
displasia multilinear. 3.- LAM relacionada con tratamiento y 4.-
LAM no clasificable (ref OMS). Las tres primeras categorías
reconocen la importancia de factores biológicos que predicen la
evolución del proceso. El análisis citogenético representa el factor
pronóstico más poderoso (Roumier C, et al., 2003). Se
utiliza para identificar subgrupos de LAM con diferente pronóstico:
bajo riesgo con respuesta favorable a tratamiento (t(8;21),
t(15;17) o inv(16)), riesgo intermedio (cariotipo
normal o t(9;11) o alto riesgo (inv(3),
-5del(5q) o -7del(7q), o más de tres alteraciones).
Existe heterogeneidad molecular dentro del grupo de riesgo. En
algunos casos de pacientes con cariotipo normal, se ha encontrado
la presencia de mutaciones en el gen FLT3 (Kottaridis PD, et
al., 2001.) y MLL (Dohner K et al., 2002).
\newpage
La imagen medular en el examen microscópico del
aspirado es generalmente la de una invasión por células semejantes
entre sí, de características morfológicas inmaduras que
distorsionan la distribución celular normal constituyendo auténticas
sábanas celulares. La hiperproducción medular condiciona que zonas
de médula ósea inactivas en la edad adulta vuelvan de nuevo a
presentar focos de hematopoyesis, en este caso de células
anormales.
Aproximadamente el 80-90% de los
pacientes jóvenes con LAM, alcanzan remisión completa de la
enfermedad tras quimioterapia. Sin embargo la mayoría recae, y la
curación se produce en el 30%. El trasplante alogénico de médula
ósea ha conseguido aumentar la tasa de curaciones al 50%, pero está
limitado por la disponibilidad de donante FILA idéntico. Es por lo
tanto un grupo de neoplasias con diversas anormalidades genéticas y
respuesta a tratamiento variable (Giles FJ et al.,
2002).
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La clasificación de la OMS es un refinamiento de
la clasificación REAL (Harris NL et al. 1994). Se reconocen
tres grandes grupos de neoplasias linfoides: 1.- Neoplasias
linfoides derivadas de células B. 2.- Neoplasias linfoides derivadas
de células T y NK. 3.- Linfoma de Hodgkin. En esta clasificación se
incluyen las neoplasias sólidas y las leucemias linfoides porque en
muchas de ellas se produce una transformación de una fase a otra y
la distinción entre ellas puede ser artificial. Así, la leucemia
linfática crónica B y el LNH linfocítico están originados por la
misma célula y simplemente representan manifestaciones diferentes
de la misma neoplasia, lo mismo ocurre con el linfoma linfoblástico
y la leucemia linfoblástica.
La clasificación de la OMS divide estas
neoplasias en función del estadio de maduración en el que se
encuentran las células en neoplasias de células precursoras y
neoplasias de células maduras (WHO Classification Tumours of
Haematopoietic and lymphoid tissues. In Pathology an genetics of
tumours of Haematopoietic and lymphoid tissues. ES Jaffe, NL
Harris, H Stein, JW Vardiman. IARC Press. Lyon, 2001). Debido al
elevado número de entidades descritas, se destacan entre ellas:
- Leucemia aguda linfoblástica (LAL):
Profileración clonal de precursores linfoides. En aproximadamente
el 80% de los casos, los precursores pertenecen a la línea linfoide
B. El análisis molecular de las alteraciones genéticas de las
células leucémicas ha contribuido de forma importante al
entendimiento de la patogénesis y pronóstico de LAL (Ferrando AA
et al., 2005). A pesar de que la frecuencia de subtipos
genéticos difiere en niños y en adultos, los mecanismos generales
que llevan a LAL son consecuencia de la expresión anormal de
proto-oncogenes debido a translocaciones
cromosómicas que crean genes de fusión o a hiperploidía. Este evento
oncogénico inicial es probablemente insuficiente para producir
leucemia y se cree que son necesarias otras alteraciones que
cooperen con esta primera para alterar definitivamente la
proliferación y supervivencia de la célula transformada. Todas
estas alteraciones contribuyen a la transformación leucémica de las
células hematopoyéticas madre o de sus progenitoras porque afectan
a procesos reguladores clave, manteniendo o aumentando su capacidad
de autorenovación, escape de los controles normales de
proliferación, bloqueo de diferenciación y promoviendo resistencia
a señales apoptóticas (Hanahan D, et al., 2000).
El aspecto global de la médula ósea es similar
al descrito para la leucemia mieloide. Es importante la
investigación de enfermedad mínima residual, factor que condiciona
con su presencia la probable recaída de la enfermedad. La
clasificación FAB define 3 estadios en función de la morfología
(L1-L3).
Es la leucemia más frecuente en la infancia, y
en el curso clínico y la respuesta a tratamiento dependen del tipo
de alteración genética, por ejemplo, los pacientes con
hiperdiploidia tienen pronóstico favorable cuando se tratan con
esquemas de tratamiento que incluyen antimetabolitos pero en líneas
generales los niños se curan con quimioterapia estándar y
profilaxis del SNC y en adultos solamente un 20% tienen
supervivencia prolongada con quimioterapia, el trasplante alogénico
y autólogo es útil para los casos considerados de alto riesgo.
- Leucemia linfática crónica (LLC). La
LLC se caracteriza por la proliferación clonal y acúmulo de
linfocitos con apariencia madura y resistentes a apoptosis en M.O,
sangre y órganos linfoides (Galton DA, 1966). Cuando la
linfoadenopatía es dominante, el cuadro clínico se denomina Linfoma
linfocítico. Los linfocitos afectados son de línea B en el 95% de
los casos y el 5% de los casos se ven implicados linfocitos T.
Es la leucemia más frecuente en el mundo
occidental. La media de edad de pacientes al diagnóstico es 65 años,
sólo un 10-15% de los casos se dan por debajo de los
50 años (Jemal A et al., 2003). Es la causa de leucemia más
común en adultos de los países del mundo occidental y supone
alrededor del 25% de todas las leucemias. La incidencia es de 3
casos por cada 100.000 habitantes y año, con un predominio en
varones, con una proporción varón/mujer de 1,7:1. En los últimos
años, cada vez se diagnostica con más frecuencia en pacientes más
jóvenes. La proporción de casos diagnosticados en estadio temprano
de la enfermedad (Rai KR, et al., 1975) ha aumentado de 10 a
50%, debido probablemente a un diagnóstico precoz gracias a
recuentos linfocitarios rutinarios. La enfermedad afecta más a
hombres que a mujeres.
El pronóstico y curso clínico de la enfermedad
es extremadamente variable. Algunos pacientes tienen una evolución
rápidamente progresiva y fallecen en los 2-3 años
después del diagnóstico, mientras que en otros, el curso es
indolente y viven durante 10-20 años sin problemas
relacionados con la LLC. En la mitad de los pacientes se producen
situaciones intermedias.
Aproximadamente el 20% de los pacientes, son
asintomáticos en el momento del diagnóstico, realizándose éste como
consecuencia de un análisis de sangre rutinario. Cuando existen
síntomas, no son específicos e incluyen fatiga, debilidad y
malestar.
La clasificación Binet (Binet JL et al.,
1981) define 3 estadios de enfermedad en función de la
concentración de hemoglobina, número de plaquetas, número de
ganglios implicados y la presencia de visceromegalias. La
clasificación de Rai (Rai KR et al., 1975) utiliza los
mismos indicadores pero clasifica a los pacientes en cinco
grupos.
Esta neoplasia no se caracteriza por una única y
recurrente alteración genómica. Existen algunos marcadores que le
imprimen un pronóstico más desfavorable como la presencia de
deleciones en los cromosomas 17 y 11 y aquellos pacientes con
ausencia de mutaciones en genes IgVh (40% de los casos) y elevada
proporción de células expresando CD38 se caracterizan por un curso
clínico más agresivo y una peor respuesta a tratamiento (Hamblin TJ
et al., 1999; Durig J et al., 2002). Otro marcador
descrito recientemente es ZAP-70, marcador
pronóstico independiente cuya expresión se relaciona de forma
indirecta con el estado mutacional del gen de las cadenas pesadas
de inmunoglobulinas (Crespo M et al., 2003).
- Mieloma múltiple: (MM). El MM es una
enfermedad maligna en la que un clon de células plasmáticas
(elemento terminal de la línea linfoide B) de la médula ósea sufre
una proliferación incontrolada. Supone el 10-15% de
todas las enfermedades malignas y es característica de edades
avanzadas, solamente el 2% de los casos se diagnostica antes de los
40 años. Por razones desconocidas la incidencia de la enfermedad
esta aumentando.
Estas células producen y segregan una
inmunoglobulina monoclonal o fragmentos de inmunoglobulinas,
compuestos por una clase de cadena pesada y ligera (kappa o
lambda). Ocasionalmente el mieloma puede no secretar o no ser
detectable la proteína en suero u orina. La célula plasmática
neoplásica produce otras moléculas como IL6, factor de necrosis
tumoral o factor activador de osteoclastos que contribuyen a
producir osteolisis, hipercalcemia e insuficiencia renal,
alteraciones características de la enfermedad.
El diagnóstico puede ser casual al realizar una
analítica en pacientes sin sintomatología o enfermedad limitada
(20% de los casos). La enfermedad en estos pacientes puede
permanecer estable durante años y el tratamiento precoz en la fase
asintomática no proporciona ninguna ventaja.
Los pacientes con componente monoclonal pero que
no cumplen los criterios diagnósticos de MM se consideran
portadores de gammapatía monoclonal de significado indeterminado
(GMSI). Entre el 10 y el 20% de estos pacientes desarrolla MM en 10
años (Kyle RA, 1997; Zhan F et al., 2002). El componente
monoclonal también puede asociarse a otras enfermedades como
linfoma, neoplasias no hematológicas y enfermedades del tejido
conectivo.
- Linfoma linfoplasmocitoide y
Macroglobulinemia de Waldenstrom. Es la expresión clínica de
una enfermedad linfoproliferativa de bajo grado, caracterizada por
la infiltración de células linfoplasmocitarias anómalas en médula
ósea, ganglios linfáticos y bazo, acompañada de la producción
monoclonal de inmunoglobulina M, lo que condiciona un aumento de la
viscosidad sanguínea y la aparición de manifestaciones vasculares
hemorrágicas y por dificultad en la circulación en pequeños
vasos.
- Linfoma no Hodgkin (LNH). Los LNH son
tumores sólidos del tejido linfoide mucho más heterogéneos que la
enfermedad de Hodgkin. La complejidad y diversidad que presentan
los LNH en cuanto a morfología, genética, fenotipo y comportamiento
clínico ha dado lugar a la existencia de múltiples clasificaciones,
ninguna de ellas completamente satisfactoria.
Es la enfermedad hematológica más frecuente y,
en términos de años de vida perdidos, es la cuarta neoplasia más
importante del mundo occidental y parece que su incidencia va en
aumento.
Puede aparecer en todas las edades, pero la
mediana de aparición es a los 50 años. La causa que motiva la
enfermedad no está clara. Se han descrito translocaciones
cromosómicas específicas asociadas a ciertos tipos de linfomas, por
lo que son de gran utilidad en el diagnóstico (Montoto S et
al., 2003). La mayoría de los linfomas tipo Burkitt presentan la
translocación t(8;14), en la cual el oncogén
c-MYC del cromosoma 8 se traslada a la región
próxima en el cromosoma 14 donde se codifican las cadenas pesadas
de inmunoglobulinas. El 90% de los linfomas foliculares se
caracterizan por la translocación t(14;18), donde el gen
bcl-2 del cromosoma 18 se traslada a la región de
las cadenas pesadas de inmunoglobulinas. Es bien conocido que la
sobreexpresión de bcl-2 inhibe la apoptosis (muerte
celular programada). Es fácil que estos reordenamientos
cromosómicos requieran otros estímulos como por ejemplo la
coexpresión de un segundo proto-oncogén o un
estímulo antigénico para desarrollar la proliferación maligna. Un
ejemplo de combinación de múltiples causas combinadas lo constituye
el linfoma asociado a SIDA. La aparición de linfomas extranodales
agresivos es el resultado de la combinación de inmunosupresión por
el VIH, desregulación de un protooncogén (c-MYC) y
una infección viral secundaria (virus de
Epstein-Barr), lo mismo ocurre en pacientes
sometidos a trasplante de órganos (Harris NL et al.,
2001).
\newpage
La presentación clínica de la enfermedad es más
irregular que en la enfermedad de Hodgkin. Puede comportarse de
forma indolente sin requerir tratamiento de inmediato o, por el
contrario, comportarse de forma agresiva rápidamente fatal.
La afectación nodal más frecuente es la
cervical. En lo referente a afectación extranodal, los signos y
síntomas dependen del órgano afectado. La médula ósea aparece
infiltrada con mayor frecuencia en los LNH de bajo grado y puede
originar pancitopenia. La presencia de células malignas en sangre
periférica es frecuente también en los LNH de bajo grado, pero es
de muy mal pronóstico en los de alto grado.
El diagnóstico se realiza mediante el estudio
histológico del tejido linfático. La información adicional se
obtiene mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra
antígenos linfocitarios específicos (inmunofenotipo); esto ayuda a
identificar el grado de maduración de la célula maligna y
determinar el origen T o B de la misma. La presencia de mutación en
genes que codifican Ig en los LNH de estirpe B suele utilizarse
para la identificación de algunos subtipos de LNH (Kuppers R et
al., 1999).
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Es una enfermedad poco frecuente y tiene
predilección por el sexo masculino en una proporción 2/1. Se
caracteriza por la presencia de unas células grandes, bi o
multinucleadas llamadas de Reed-Sternberg (RS) y
otras más pequeñas y mononucleadas que aparecen en pequeña cantidad
en el tumor, el resto de las células son linfocitos, granulocitos,
fibroblastos y células plasmáticas. Este infiltrado inflamatorio
probablemente refleja la respuesta inmune del huésped con las
células malignas. La naturaleza de las células RS y de Hodgkin ha
sido muy estudiada pero sigue siendo controvertida. Pueden
derivarse de un estadio inicial de las células linfoides.
En algunos casos se ha detectado la existencia
de DNA del virus de Epstein-Barr en el tumor. Una
hipótesis es que la distribución bimodal de la enfermedad se
debería a la infección en los sujetos jóvenes y el otro pico estaría
provocado por causas medio ambientales.
El diagnóstico se obtiene por biopsia de un
nódulo linfático. Para planificar el tratamiento es necesario
determinar la extensión de la enfermedad. (Küppers R, 2002; Cossman
J, 2001; Devilard E et al., 2002).
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La gran cantidad de células hematopoyéticas y
los muchos estadios de diferenciación por los que atraviesan
complica todavía más la clasificación de las neoplasias originadas
a partir de este tipo de células. A pesar de los esfuerzos por
establecer una clasificación basada en entidades "reales",
algunas de las categorías establecidas son ambiguas y en muchos
casos contienen grupos muy heterogéneos en cuanto a respuesta a
terapia o curso clínico. Esta heterogeneidad es la responsable, por
un lado, de la incesante búsqueda de marcadores capaces de
diferenciar unos comportamientos de otros y, por otro lado, de que
la controvertida clasificación de este tipo de neoplasias esté
sometida a continuas revisiones.
Un sistema de clasificación ideal debe ser
preciso, reproducible, fácil de usar y sobre todo debe tener
significado biológico y clínico (Chan WC, et al., 2005). Los
sistemas actuales de diagnóstico y la clasificación de las
neoplasias hematológicas se basan en el reconocimiento de
características histológicas y morfológicas, inmunofenotípicas,
citogenética y estudio de algún marcador molecular con valor
pronóstico. Una combinación de clasificación patológica y criterios
clínicos se utilizan para diferenciar distintos tipos con
diferencias pronósticas. Sin embargo, en algunas de las categorías
diagnósticas definidas de esta manera se observa:
- Una respuesta a terapia marcadamente
heterogénea. Dentro de la misma enfermedad se encuentran
pacientes que alcanzan remisión completa, remisión parcial, no
responden, que recaen tras una determinada terapia. La capacidad
para predecir respuesta es especialmente importante en este tipo de
neoplasias ya que el transplante de células "stem" es una
alternativa terapéutica efectiva pero tóxica. La capacidad para
determinar qué pacientes responderán a terapia convencional antes de
darla puede ser beneficiosa para aplicar a cada paciente el
tratamiento más efectivo.
- Un comportamiento clínico variable.
Dentro de la misma categoría se encuentran pacientes cuya
enfermedad se va a mantener estable durante largo periodo de tiempo
y que no van a requerir terapia y otros cuya enfermedad va a
progresar rápidamente requiriendo una terapia agresiva.
Estas variaciones apuntan a la existencia de
heterogeneidad molecular dentro de las categorías diagnósticas,
diferencias que los métodos convencionales de diagnóstico no son
capaces de determinar y de ahí, la búsqueda de nuevas formas de
análisis que proporcionen una mayor resolución en la caracterización
de este tipo de neoplasias.
En esta línea, el uso de "arrays" de
expresión ha demostrado ser efectivo no sólo en el desciframiento
de la diversidad biológica y clínica que se encuentra en muchos
tumores, sino en el entendimiento de los procesos biológicos y
patológicos que afectan a muchos sistemas y en particular al
sistema hematopoyético. Los "arrays" de expresión son
conjuntos ordenados de secuencias asociadas a un soporte sólido,
complementarias a mRNA o a sus correspondientes cDNA o cRNA, que
permiten el análisis de la expresión diferencial de cientos o miles
de genes simultáneamente. Uno de los soportes a los que se unen con
frecuencia estas secuencias es a fragmentos rectangulares de vidrio
similares a los portaobjetos, formato al que es frecuente aludir
mediante los términos "microarray", "biochip" o,
simplemente, "chip". Su uso se está volviendo cada vez más
frecuente para el diagnóstico de diversas enfermedades o para la
evaluación de la susceptibilidad a padecerlas.
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En el año 1999, el grupo de Golub publicó uno de
los primeros artículos en el que se hace referencia al papel de los
"arrays" en la clasificación de neoplasias hematológicas
(Golub TR et al., 1999). Se utilizó un "array" con 6817
genes representados para el estudio de perfiles de expresión en las
leucemias LAM y LAL. Se seleccionaron un grupo de 50 genes con
capacidad de predecir el tipo de leucemia ("class predictor")
y se utilizaron para clasificar un grupo de muestras desconocidas
en las categorías correctas. El estudio de la expresión de estos 50
genes es suficiente para la clasificación de una muestra de
leucemia aguda en LAM o LAL. A pesar de que la distinción entre LAM
y LAL está bien establecida con los métodos actuales de
diagnóstico, el estudio reveló la existencia de patrones de
expresión específicos asociados con cada tipo de leucemia aguda y
evidenció el uso de perfiles de expresión en la clasificación de
cáncer.
En el año 2000, el grupo de Alizadeh publicó un
artículo en el que utilizando un "array" especializado, el
"lymphochip" que contiene genes expresados de forma
preferencial en células linfoides o de los que se conoce alguna
importancia inmunológica u oncológica con 17.856 secuencias
(Alizadeh AA et al., 1999). Este grupo utilizó el
"lymphochip" para el estudio de patrones de expresión génica
asociados con diferencias en comportamiento clínico en un Linfoma
difuso de células grandes B (LDCGB) (Alizadeh AA, et al.
2000). El LDCGB es un LNH con un comportamiento muy heterogéneo e
imposible de distinguir por los métodos convencionales de
diagnóstico: el 40% de los pacientes responden bien a terapia y
tienen supervivencia prolongada mientras que el 60% muere por la
enfermedad. Los autores encontraron que la expresión de genes podía
relacionarse con el comportamiento clínico de los tumores. Este fue
uno de los primeros artículos en el que se habla del papel de los
"arrays" para la "subclasificación" de neoplasias
hematológicas, es decir, el uso de perfiles de expresión para la
identificación de dos grupos de LDCGB diferentes desde el punto de
vista transcripcional, subtipos de LDCGB con comportamiento clínico
imposible de predecir con los criterios convencionales de
diagnóstico.
En la actualidad hay múltiples publicaciones en
los que de forma directa o indirecta aparecen los "arrays"
aplicados no sólo a clasificación y subclasificación, sino también
al estudio, diagnóstico, pronóstico, identificación de nuevos
marcadores en enfermedades hematológicas (Greiner TC, 2004;
Alizadeh AA et al, 2000; Bea S et al., 2005; Dave SS
et al., 2004), así como solicitudes de patente en las que se
describe la utilización de este tipo de dispositivos para la
diferenciación entre distintos tipos de neoplasias hematológicas.
Así, por ejemplo, la solicitud de patente WO2003/008552 describe la
utilización con fines diagnósticos de diferencias en el patrón de
expresión de genes para diferenciar entre la leucemia de linaje
mixto (MLL), la leucemia linfoblástica aguda (ALL) y la leucemia
mielógena aguda (AML), defendiendo la posibilidad de realizar este
diagnóstico diferencial con los datos obtenidos tras el análisis de
muestras de pacientes aquejados de cada uno de estos tipos de
leucemia mediante la utilización de "chips" comerciales de
Affymetrix. Aunque se indican genes con variaciones en la expresión
entre los tres tipos de leucemias que permitirían la diferenciación
entre ellas, no se mencionan secuencias específicas diferentes de
las presentes en el chip de Affymetrix que se pudieran utilizar
para detectar estos genes mediante dispositivos diferentes de los de
dicha casa comercial, ni se considera el diseño de dispositivos o
métodos que permitieran el diagnóstico de otros tipos de leucemias
o, en general, neoplasias derivadas de células hematopoyéticas.
La solicitud de patente WO2005/024043, por su
parte, se enmarca también en el campo del análisis de la expresión
de genes para profundizar en el conocimiento de las diferencias
existentes a nivel molecular entre las distintas neoplasias
derivadas de células hematopoyéticas, centrándose específicamente
en el caso de los linfomas, para extraer datos que ayuden en su
diagnóstico o en el pronóstico de su evolución. En concreto, se
describe un método para obtener funciones útiles para predecir la
evolución de individuos afectados por distintos tipos de linfomas
evaluando en biopsias de ganglios en qué grado contribuye en cada
uno de ellos lo que denominan patrones o huellas génicas, grupos de
genes que se expresan de forma coordinada y que están relacionados
con el origen celular de la neoplasia, los distintos tipos de
células no malignas presentes en la biopsia y los mecanismos
oncogénicos responsables del cáncer. Los distintos patrones o
huellas génicas se deducen también en este caso a partir de los
datos obtenidos con chips comerciales de Affymetrix. Además, la
solicitud WO2005/024043 dice proporcionar un microarray alternativo,
compuesto por un número menor de secuencias que los microarrays de
Affymetrix, que permitiría igualmente el análisis de diferencias en
la expresión génica entre linfomas y su aplicación para la
deducción de funciones de predicción de supervivencia y para la
diferenciación entre distintos tipos de linfomas. Aunque se indican
los genes cuyo análisis se vería posibilitado por ese microarray, la
memoria de la solicitud WO2005/024043 no indica la secuencia de las
sondas que compondrían el microarray, mencionando sólo que serían
tipo cDNA y dejando dudas de si ese cDNA aparecería completo o el
análisis de la expresión del gen correspondiente se realizaría
utilizando como sonda sólo un fragmento de dicho cDNA, que quedaría
por determinar.
Sería interesante disponer de composiciones y
métodos que permitieran la diferenciación entre neoplasias de
origen hematopoyético en base a sus diferencias a nivel molecular,
diseñadas específicamente para este grupo de neoplasias, en las que
se evaluara la expresión de un número de genes más reducido que en
los microarrays comerciales utilizados en los estudios descritos en
las solicitudes de patente antes comentadas y que facilitaran tanto
el diagnóstico de determinadas neoplasias como la predicción de su
futura evolución, ayudando de esta manera en la prescripción de un
tratamiento adecuado para cada paciente, característica
particularmente interesante en aquellas neoplasias, como es el caso
de la LLC, en las que el pronóstico de la futura evolución del
paciente es difícil con los conocimientos y ensayos de los que se
dispone hasta ahora. Además, sería especialmente conveniente que las
sondas utilizadas para evaluar la expresión de los genes
seleccionados hubieran sido diseñadas específicamente para que,
además de ser específicas y con una secuencia perfectamente
definida, tuvieran todas ellas un comportamiento parecido, lo que
las haría apropiadas, en general, para ser utilizadas de forma
combinada en un mismo ensayo y, en particular, para formar parte de
un mismo array o conjunto ordenado asociado a un soporte sólido,
como pueden ser los denominados "chips" o "microarrays".
Las composiciones y métodos de la presente invención responden a
esta necesidad.
En lugar de partir de microarrays comerciales
para detectar genes significativos para distinguir entre neoplasias
o crear funciones que predigan la supervivencia del individuo que
las padezca, la invención proporciona nuevos oligonucleótidos, de
secuencia perfectamente definida, capaces de detectar de forma
específica genes que se han seleccionado por ser conocidos por ser
significativos para la biología de células sanguíneas o para la
patología de distintas neoplasias, oligonucleótidos que tienen
además la particularidad de haber sido diseñados de manera que
comparten unas características comunes que hacen que presenten un
comportamiento parecido al ser utilizados como sondas en ensayos de
hibridación, lo que les hace adecuados para ser utilizados en
composiciones que comprendan combinaciones de los mismos. Dichas
composiciones, y en especial aquellas en las que estos
oligonucleótidos se encuentran dispuestos de forma ordenada sobre un
soporte sólido de fácil manejo como los vidrios similares a
portaobjetos, son adecuadas para realizar ensayos con los que
detectar genes estadísticamente significativos para diferenciar
muestras extraídas de individuos que padecen determinados tipos de
neoplasias originadas a partir células hematopoyéticas de muestras
extraídas de individuos que no padecen dichas neoplasias, al
tratarse de composiciones que contienen un número de
oligonucleótidos inferior a los microarrays comerciales diseñados
con propósito más general, estar diseñadas específicamente para el
análisis de muestras procedentes de individuos que padecen
neoplasias y componerse de sondas de secuencia conocida,
perfectamente reproducible, que además están especialmente
diseñadas para ser utilizadas conjuntamente en un mismo ensayo por
ser de comportamiento parecido. La inclusión adicional en los
microarrays de la invención de oligonucleótidos de baja homología
con genes humanos, pero elegidos para que el resto de sus
características sean similares a las de los oligonucleótidos de la
invención diseñados para actuar como sondas capaces de reconocer
genes humanos con alta especificidad, permite la utilización de
dichos microarrays para la identificación de genes estadísticamente
significativos en la identificación de muestras asociadas a
determinadas neoplasias de origen hematopoyético mediante la
utilización de ensayos en los que es factible el establecimiento de
controles en todas sus fases. Tal como se demuestra en los ejemplos
que aparecen más adelante en la presente memoria, la utilización de
estos microarrays en combinación con diversas técnicas estadísticas
permite la correcta clasificación de distintas muestras biológicas
mediante un método, preciso, reproducible, fácil de usar y con
significado biológico y clínico, al estar basado en diferencias de
expresión de genes con significado para los procesos biológicos que
se están analizando. En particular, el uso de un microarray de la
invención en combinación con el método de la invención permite la
identificación de muestras sanguíneas de pacientes que padecen
leucemia linfática crónica (alteración no considerada en las
solicitudes WO2003/008552 y WO2005/024043 y cuyo diagnóstico no ha
sido descrito mediante la utilización de microarrays comerciales),
distinguiéndolas tanto de muestras obtenidas de individuos sanos
como de muestras relacionadas con otros tipos de leucemias, como
son las correspondientes a células Jurkat o U937, facilitando el
diagnóstico de la LLC mediante el análisis de niveles de expresión
de genes estadísticamente significativos para ello y permitiendo
incluso la obtención de funciones que posibilitan el cálculo
matemático de la probabilidad de que una muestra desconocida
pertenezca a un individuo aquejado de LLC. Además, la invención
permite diferenciar muestras pertenecientes a individuos aquejados
de leucemia linfática crónica estable de muestras pertenecientes a
individuos aquejados de leucemia linfática crónica progresiva,
distinción que ahora mismo es difícil realizar a priori
mediante las técnicas disponibles, por lo que supone una herramienta
útil y novedosa para el pronóstico de la futura evolución de
individuos aquejados de esta enfermedad, individuos cuyo
diagnóstico puede haberse realizado también mediante composiciones
y métodos de la invención o puede haberse conocido gracias a la
aplicación de un procedimiento diferente, pero para los que, al
disponerse de una herramienta que permita pronosticar cómo va a
evolucionar posteriormente la LLC que padecen, será más fácil
decidir si es adecuado someterlos a un tratamiento agresivo
inmediato o simplemente mantenerlos en observación periódica para
verificar que sus datos de expresión de genes siguen indicando que
la enfermedad va a mantenerse estable durante un largo período de
tiempo.
La invención proporciona composiciones que
incluyen al menos un oligonucleótido del grupo compuesto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9,
SG10, SG11, SG12, SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20,
SG21, SG22, SG23, SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31,
SG32, SG33, SG34, SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42,
SG43, SG44, SG45, SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53,
SG54, SG55, SG56, SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64,
SG65, SG66, SG67, SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75,
SG76, SG77, SG78, SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86,
SG87, SG88, SG89, SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97,
SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107,
SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116,
SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125,
SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134,
SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143,
SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152,
SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161,
SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170,
SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179,
SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188,
SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197,
SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206,
SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215,
SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224,
SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233,
SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242,
SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251,
SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260,
SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269,
SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278,
SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287,
SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296,
SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305,
SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314,
SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323,
SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332,
SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341,
SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350,
SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359,
SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368,
SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377,
SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386,
SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395,
SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404,
SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413,
SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422,
SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431,
SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440,
SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449,
SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458,
SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471,
SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480,
SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489,
SG490, SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498,
SG499, SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507,
SG508, SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516,
SG517, SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525,
SG526, SG527, SG528, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534,
SG535, SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543,
SG544, SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552,
SG553, SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561,
SG562, SG563, o combinaciones de los mismos.
Dichos oligonucleótidos han sido diseñados de
manera que, además de ser específicos para los correspondientes
genes cuya expresión se quiere evaluar, tengan un comportamiento
parecido, por ser de longitudes similares y presentar todos ellos
contenidos de GC comprendidos en el intervalo de 40% a 60%, además
de corresponder a zonas situadas a menos de 3000 nucleótidos del
extremo 3' (poli(A)) del mRNA que se desea detectar y
evaluar y de estar constituidos por secuencias que coinciden en su
sentido con la de los correspondientes mRNA. Por ello, son
adecuados para ser utilizados en un mismo ensayo o formar parte de
una composición que comprenda combinaciones de los mismos. Una
realización particular de la invención lo constituyen las
composiciones que comprendan mezclas de varios de dichos
oligonucleótidos. Se prefieren especialmente aquellas composiciones
que comprendan mezclas de oligonucleótidos que correspondan a genes
significativos para clasificar a una muestra como asociada a una
determinada neoplasia y/o para determinar la evolución futura de la
misma. Son también realizaciones especialmente preferidas de la
invención aquellas composiciones que comprendan la totalidad de los
oligonucleótidos del grupo compuesto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9,
SG10, SG11, SG12, SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20,
SG21, SG22, SG23, SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31,
SG32, SG33, SG34, SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42,
SG43, SG44, SG45, SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53,
SG54, SG55, SG56, SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64,
SG65, SG66, SG67, SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75,
SG76, SG77, SG78, SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86,
SG87, SG88, SG89, SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97,
SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107,
SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116,
SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125,
SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134,
SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143,
SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152,
SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161,
SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170,
SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179,
SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188,
SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197,
SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206,
SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215,
SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224,
SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233,
SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242,
SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251,
SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260,
SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269,
SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278,
SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287,
SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296,
SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305,
SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314,
SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323,
SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332,
SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341,
SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350,
SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359,
SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368,
SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377,
SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386,
SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395,
SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404,
SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413,
SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422,
SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431,
SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440,
SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449,
SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458,
SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG470, SG472, SG473,
SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480, SG481, SG482,
SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489, SG490, SG491,
SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498, SG499, SG500,
SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507, SG508, SG509,
SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516, SG517, SG518,
SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525, SG526, SG527,
SG528, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534, SG535, SG536,
SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543, SG544, SG545,
SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552, SG553, SG554,
SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561, SG562, SG563.
Adicionalmente, la invención proporciona
oligonucleótidos útiles para ser utilizados como controles en el
método de la invención. Por una parte, como controles de
integridad, se proporcionan las parejas de oligonucleótidos SG463 y
SG464 (complementarias, respectivamente a los extremos 5' y 3' del
gen de \beta-actina) y SG466 y SG467
(complementarias, respectivamente, a los extremos 5' y 3' del gen
GAPD). Adicionalmente, se proporcionan los oligonucleótidos SSPC1,
SSPC2, SSPC3, SSPC4, SSPC5, SSPC6 y SSPC7, que pueden ser
utilizados como controles positivos internos exógenos de la calidad
del proceso tras añadirse a la muestra que contiene el mRNA de
partida moléculas de ácidos nucleicos poliadenilados que contengan
fragmentos que se correspondan en su secuencia con la de estos
oligonucleótidos (como pueden ser los transcritos correspondientes a
los genes de los que dichos oligonucleótidos derivan) y que sean
sometidas al mismo procesamiento que el mRNA de partida, así como
los oligonucleótidos SCN2, SCN3, SCN6, SCN8, SCN11, SCN12 y SCN13,
diseñados para ser utilizados como controles positivos de
hibridación, y los oligonucleótidos SCN1, SCN5, SCN7, SCN10, SC1,
SC2, SC3, SC4, SC5, SC6 y SC7, diseñados para ser utilizados como
controles negativos; todos ellos cumplen las condiciones de
presentar baja homología con genes humanos, además de cumplir las
mismas condiciones de los oligonucleótidos complementarios a genes
humanos de ser de longitudes similares y presentar todos ellos
contenidos de GC comprendidos en el intervalo de 40% a 60%,
corresponder a zonas situadas a menos de 3000 nucleótidos del
extremo 3' (poli(A)) del mRNA no humano que serían capaces
de detectar y de estar constituidos por secuencias que coinciden en
su sentido con la de los correspondientes mRNA. Cualquier
composición que contenga al menos uno de los oligonucleótidos
SG463, SG464, SG466, SG467, SSPC1, SSPC2, SSPC3-, SSPC4, SSPC5,
SSPC6, SSPC7, SCN2, SCN3, SCN6, SCN8, SCN11, SCN12, SCN13, SCN1,
SCN5, SCN7, SCN10, SC1, SC2, SC3, SC4, SC5, SC6 y SC7, en
combinación con al menos uno de los oligonucleótidos
complementarios a genes humanos de la invención antes citados es
también una composición incluida dentro del alcance de la presente
invención.
Se prefiere especialmente que los
oligonucleótidos que formen parte de una composición de la
invención estén unidos a un soporte sólido. En particular, se
prefieren aquellas de tales composiciones en las que la distribución
de los oligonucleótidos sobre el soporte sólido sea de forma
ordenada, que el soporte sólido utilizado sea un vidrio rectangular
similar a los portaobjetos de microscopio y que los
oligonucleótidos estén unidos al vidrio mediante enlaces covalentes;
a las composiciones que cumplen tales características se hace
referencia en el resto de la memoria con las palabras
"microarray", "chip" o "microchip". Entre estas
composiciones en forma de microarray, se tiene una especial
preferencia por aquellas que contienen más de una copia de cada uno
de los oligonucleótidos que forman parte de ella, prefiriéndose muy
especialmente que el número de copias de cada uno de los
oligonucleótidos presente sea de al menos 12.
Está incluido también dentro del alcance de la
invención cualquier dispositivo diagnóstico que comprenda una
composición de la invención. Con la expresión "dispositivo
diagnóstico" se hace referencia no sólo a los que sirvan para
determinar si un individuo padece o no una enfermedad, sino los que
sirven para clasificar la enfermedad que padece un individuo como
perteneciente a un subtipo asociado a una determinada forma de
evolución en el futuro de dicha enfermedad y, que por lo tanto,
tienen también valor pronóstico de la futura evolución de la
enfermedad.
La invención proporciona también un método para
diagnosticar una neoplasia originada a partir de células
hematopoyéticas y/o pronosticar la evolución de la misma que
comprende la detección in vitro a partir de una muestra
biológica y el análisis estadístico del nivel de expresión de al
menos un gen significativo para clasificar la muestra como asociada
o no a dicha neoplasia, gen que se selecciona del grupo compuesto
por GABARAP, NPM3, ABCB1, ABCB4, ABCC3, ABCC5, ABCC6, ABHD1, ABL1,
ACTN1, AF1q, AKR1A1, ALDHIA1, ALK, ANK2, ANPEP, ANXA6, ANXA7,
APAF1, APEX, ARHGEF2, ARS2, ASNS, ATIC, ATM, ATP5O, BAX, BCL10,
BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2LAA, BCL3, BCL6, BCL7A, BCL7b, BCR,
BECN1, BIK, BIRC3, BIRC5, BLMH, BLR1, BLVRB, BMI1, BMP6, BRMS1,
BST2, BTG1, BUB1, C21orf33, C5orfl3, CAl2, CALD1, CANP2, CASC3,
CASP1, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CAST,
CATSD, CBFA2T1, CBFB, CCNA1, CCNB1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1,
CCR6, CCR7, CCT6A, CD14, CD19, CD2, CD22, CD24, CD28, CD33, CD34,
CD36, CD38, CD3E, CD4, CD44, CD47, CD48, CD5, CD58, CD59, CD6, CD7,
CD79A, CD79B, CD8, CD81, CD83, CD86, CD9, CDA, CDC25A, CDC25B,
CDK2, CDK4, CDK5R1, CDKNIA, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C,
CDKN3, CDW52, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CFL1, CKMT1, CKS2, CML66,
COL3A1, COL4A6, CR2, CREB1, CREBBP, CRYAB, CSF2, CSF3, CSRP2, CTGF,
CTSB, CUZD1, CXADR, CXCL9, CXCR3, CXCR4, CYC1, CYP1A1, CYP2A6,
DAD-1, DAPK1, DCK, DDX6, DEK, DHFR, DLAD, DNAJA1,
DNMT3B, DNTT, DOK1, DPF2, DPP4, DRG1, DRP2, E2F1,
EB-1, EBI2, EDF1, EEF1A1, EEF1E2, EEF1D, EEF1G,
EFNB1, EGFR, EGR1, EIF2B2, EIF3S2, EIF4B, EIF4E, EIFSA, ELF1, ELF4,
ENPP1, EphA3, EPOR, ERBB2, ERBB4, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC5,
ERCC6, ETS1, ETS2, ETV6, ETV7, EZH2, FABP5, FADD, FAIM3, FAM38A,
FARP1, FAT, FCER2, FCGR3A, FCGR3B, FGFR1, FGFR3, FGR, FHIT, FKBP9,
FLI1, FLJ22169, FLT3, FN1, FNTB, FOS, FUS, G1P2, GABPB2, GATA1,
GATA2, GATA3, GCET2, GDI2, GGA3, GJA1, GLUD1, GNL3, GOT1, GRB2,
GRIA3, GRK4, GSTP1, GSTT1, GUSB, GZMA, H2AFX, H3F3A, HCK, HELLS,
HIF1A, HIST1H2BN, HLA-A, HLA-DPA1,
HLA-DQA1, HLA-DRA,
HLA-DRB3, HLF, HMMR, HNRPH3, HNRPL, HOXA10, HOXA9,
HOXD8, HOXD9, HRAS, HSD17B1, HSPB1, IBSP, ICAM1, ICAM3, ID2, IER3,
IFRD1, IGFBP2, IGFBP3, IGFIR, IGLV6-57, IL10, IL15,
IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL3RA, IL4R, IL6, IL6R, ILB, ILF2,
IRF1, IRF2, IRF4, IRFB, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGAS, ITGA6, ITGAL,
ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, JAK1, JAK2, JUNB, KAI1, KIAA0247,
KIAA0864, KIT, KLF1, KLF13, KRAS2, KRT18, LADH, LAG3, LASP1, LCK,
LCPI, LEPR, LGALS3, LGALS7, LIF, LIMS1, LMO2, LOC285148, LRP, LSP1,
LYL1, LYN, LYZ, MAFB, MAFK, MAGEA1, MAL, MAP3K12, MAP4K1, MAPK10,
MAZ, MBP1, MCL1, MCM3, MCM7, MDM2, MEIS1, MEN1, MERTK, MKI67, MLF1,
MLF2, MLL, MLLT10, MME, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, MNDA, MPL, MPO,
MRPL37, MS4A1, MTCP1, MUC-1, MX1, MYB, MYBL1, MYC,
MYOD1, NCALD, NCAM1, NCL, NDP52, NDRG1, NDUFA1, NDUFB, NF1, NFATC1,
NFIC, NFKB1, NFKB1A, NINJ1, NPM1, NR3C1, NUMA1, NXF1, ODC1, OGGI,
OLIG2, OPRD1, p14ARF, P55CDC, PABPC1, PAX5, PAX6, PAX8, PBX1, PBX3,
PCA1, PCD, PCNA, PDCD1, PDGFA, PDGFRB, PDHA1, PGF, PGRMC1, PICALM,
PLA2G6, PLAU, PLK1, PLP, PLS3, PLZF, PML, PMM1, POLR2C, POU2F2,
PPP1CC, PRAME, PRKCI, PRKCQ, PRKDC, PRL, PRTN3, PSMA5, PSMB4,
PSMC5, PSMD7, PTEN, PTGS1, PTHLH, PTK2, PTK2B, PTN, PTPRCCD, PYGB,
RAD51, RAF1, RAG1, RARA, RARB, RB1, RBBP4, RBBP6, RBBP8, RBP4, RET,
RGS1, RGS1, RIS1, RORA, RPL17, RPL23A, RPL24, RPL36A, RPL37A,
RPL41, RPS3, RPS5, RPS9, RUNX1, RXRA, S100A2, S100A8, SDC1, SDHD,
SELE, SELL, SEPW1, SERPINA9, SERPINB5, SERPNINA9, SFTPB, SIAT4A,
SLC7A5, SNRPB, SOSTDC1, SP1, SPI1, SPN, SPRR1A, SREBF1, SSBP1,
STAT1, STAT3, STAT5B, SUMO1, TACSTD2, TAGLN2, TAL1, TBP, TCEB1,
TCF1, TCF3, TCF7, TCL1A, TCRbeta, TEGT, TERF1, TERT, TFCP2, TFRC,
THBS1, THPO, TIA-2, TIAM1, TK1, TLX1, TMEM4, TNF,
TNFRSF10C, TNFRSF1A, TNFRSF25, TNFRSFS, TNFRSF6, TNFRSF8, TNFSF10,
TNFSF5, TNFSF6, TOP2A, TOPORS, TP73, TRA@, TRADD, TRAF3,
TRAP1,TRIB2, TXNRD1, UBE2C, UHRF1, UVRAG, VCAM1, VEGF, VPREB1,
WBSCR20C, WNT16, WT1, XBP1, XPO6, XRCC3, XRCC5, ZAP70, ZFPL1,
ZNF42, ZNFNIA1, ZYX, 18S rRNA, 28S rRNA, y cuyo nivel de expresión
se determina mediante la evaluación de la concentración de su
correspondiente mRNA mediante el uso de al menos una sonda que posee
una secuencia complementaria a un fragmento de una hebra de dicho
gen, sonda que se selecciona del grupo de oligonucleótidos
compuesto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9,
SG10, SG11, SG12, SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20,
SG21, SG22, SG23, SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31,
SG32, SG33, SG34, SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42,
SG43, SG44, SG45, SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53,
SG54, SG55, SG56, SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64,
SG65, SG66, SG67, SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75,
SG76, SG77, SG78, SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86,
SG87, SG88, SG89, SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97,
SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107,
SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116,
SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125,
SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134,
SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143,
SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152,
SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161,
SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170,
SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179,
SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188,
SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197,
SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206,
SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215,
SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224,
SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233,
SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242,
SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251,
SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260,
SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269,
SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278,
SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287,
SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296,
SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305,
SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314,
SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323,
SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332,
SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341,
SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350,
SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359,
SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368,
SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377,
SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386,
SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395,
SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404,
SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413,
SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422,
SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431,
SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440,
SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449,
SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458,
SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471,
SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480,
SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489,
SG490, SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498,
SG499, SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507,
SG508, SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516,
SG517, SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525,
SG526, SG527, SG528, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534,
SG535, SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543,
SG544, SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552,
SG553, SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561,
SG562, SG563.
Los genes que forman parte del grupo
anteriormente mencionado son genes humanos. Por ello, siempre que
se utilicen en lo sucesivo las palabras "sujeto" o
"individuo" harán referencia a un ser humano.
Un caso particular de este método es aquel que
comprende una etapa previa adicional de identificación de genes
significativos para la clasificación de la muestra biológica
analizada como asociada o no asociada a un tipo concreto de
neoplasia originada a partir de células hematopoyéticas,
clasificación en la que se incluye no sólo el diagnóstico de la
existencia de dicha neoplasia en el individuo del cual se ha
extraído la muestra, sino que puede consistir también, de forma
adicional o alternativa, en la discriminación entre subtipos
específicos de dicha neoplasia que se corresponden con formas
futuras de evolución de dicha neoplasia diferentes constituyendo
así la clasificación en uno u otro subtipo un pronóstico de la
evolución de la neoplasia considerada en el futuro. En este caso
particular del método de la invención que comprende una etapa
previa de identificación de genes significativos para realizar la
clasificación deseada, dicha etapa previa comprende las subetapas
de:
a) decidir las posibles categorías en las que
puede clasificarse la muestra;
b) obtener muestras biológicas de individuos que
se han adscrito previamente por un método diferente al reivindicado
a alguna de las posibles categorías de clasificación, de manera que
se tengan muestras de cada una de las posibles categorías;
c) obtener el mRNA total de cada una de las
muestras;
d) obtener el correspondiente cRNA total,
marcado mediante un método que permita su posterior detección, de
al menos una alícuota de cada una de las muestras de mRNA, alícuota
a la que se le añade antes de la obtención del cRNA al menos una
secuencia de nucleótidos poliadenilada de baja homología con genes
humanos para que actúe como control positivo interno del
proceso;
e) añadir a cada una de las alícuotas de cRNA
que se vaya a utilizar en la etapa f) al menos un oligonucleótido
de baja homología con genes humanos distinto de y no complementario
a cualquier posible secuencia de nucleótidos que se haya añadido en
la etapa d), para que actúe como control positivo de
hibridación;
f) hibridar, en condiciones estrictas, al menos
una alícuota de cRNA total de cada una de las muestras con al menos
un microarray que comprende al menos dos copias de cada uno de los
oligonucleótidos del grupo compuesto por:
SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7, SG8, SG9,
SG10, SG11, SG12, SG13, SG14, SG15, SG16, SG17, SG18, SG19, SG20,
SG21, SG22, SG23, SG24, SG25, SG26, SG27, SG28, SG29, SG30, SG31,
SG32, SG33, SG34, SG35, SG36, SG37, SG38, SG39, SG40, SG41, SG42,
SG43, SG44, SG45, SG46, SG47, SG48, SG49, SG50, SG51, SG52, SG53,
SG54, SG55, SG56, SG57, SG58, SG59, SG60, SG61, SG62, SG63, SG64,
SG65, SG66, SG67, SG68, SG69, SG70, SG71, SG72, SG73, SG74, SG75,
SG76, SG77, SG78, SG79, SG80, SG81, SG82, SG83, SG84, SG85, SG86,
SG87, SG88, SG89, SG90, SG91, SG92, SG93, SG94, SG95, SG96, SG97,
SG98, SG99, SG100, SG101, SG102, SG103, SG104, SG105, SG106, SG107,
SG108, SG109, SG110, SG111, SG112, SG113, SG114, SG115, SG116,
SG117, SG118, SG119, SG120, SG121, SG122, SG123, SG124, SG125,
SG126, SG127, SG128, SG129, SG130, SG131, SG132, SG133, SG134,
SG135, SG136, SG137, SG138, SG139, SG140, SG141, SG142, SG143,
SG144, SG145, SG146, SG147, SG148, SG149, SG150, SG151, SG152,
SG153, SG154, SG155, SG156, SG157, SG158, SG159, SG160, SG161,
SG162, SG163, SG164, SG165, SG166, SG167, SG168, SG169, SG170,
SG171, SG172, SG173, SG174, SG175, SG176, SG177, SG178, SG179,
SG180, SG181, SG182, SG183, SG184, SG185, SG186, SG187, SG188,
SG189, SG190, SG191, SG192, SG193, SG194, SG195, SG196, SG197,
SG198, SG199, SG200, SG201, SG202, SG203, SG204, SG205, SG206,
SG207, SG208, SG209, SG210, SG211, SG212, SG213, SG214, SG215,
SG216, SG217, SG218, SG219, SG220, SG221, SG222, SG223, SG224,
SG225, SG226, SG227, SG228, SG229, SG230, SG231, SG232, SG233,
SG234, SG235, SG236, SG237, SG238, SG239, SG240, SG241, SG242,
SG243, SG244, SG245, SG246, SG247, SG248, SG249, SG250, SG251,
SG252, SG253, SG254, SG255, SG256, SG257, SG258, SG259, SG260,
SG261, SG262, SG263, SG264, SG265, SG266, SG267, SG268, SG269,
SG270, SG271, SG272, SG273, SG274, SG275, SG276, SG277, SG278,
SG279, SG280, SG281, SG282, SG283, SG284, SG285, SG286, SG287,
SG288, SG289, SG290, SG291, SG292, SG293, SG294, SG295, SG296,
SG297, SG298, SG299, SG300, SG301, SG302, SG303, SG304, SG305,
SG306, SG307, SG308, SG309, SG310, SG311, SG312, SG313, SG314,
SG315, SG316, SG317, SG318, SG319, SG320, SG321, SG322, SG323,
SG324, SG325, SG326, SG327, SG328, SG329, SG330, SG331, SG332,
SG333, SG334, SG335, SG336, SG337, SG338, SG339, SG340, SG341,
SG342, SG343, SG344, SG345, SG346, SG347, SG348, SG349, SG350,
SG351, SG352, SG353, SG354, SG355, SG356, SG357, SG358, SG359,
SG360, SG361, SG362, SG363, SG364, SG365, SG366, SG367, SG368,
SG369, SG370, SG371, SG372, SG373, SG374, SG375, SG376, SG377,
SG378, SG379, SG380, SG381, SG382, SG383, SG384, SG385, SG386,
SG387, SG388, SG389, SG390, SG391, SG392, SG393, SG394, SG395,
SG396, SG397, SG398, SG399, SG400, SG401, SG402, SG403, SG404,
SG405, SG406, SG407, SG408, SG409, SG410, SG411, SG412, SG413,
SG414, SG415, SG416, SG417, SG418, SG419, SG420, SG421, SG422,
SG423, SG424, SG425, SG426, SG427, SG428, SG429, SG430, SG431,
SG432, SG433, SG434, SG435, SG436, SG437, SG438, SG439, SG440,
SG441, SG442, SG443, SG444, SG445, SG446, SG447, SG448, SG449,
SG450, SG451, SG452, SG453, SG454, SG455, SG456, SG457, SG458,
SG459, SG460, SG461, SG462, SG465, SG468, SG469, SG470, SG471,
SG472, SG473, SG474, SG475, SG476, SG477, SG478, SG479, SG480,
SG481, SG482, SG483, SG484, SG485, SG486, SG487, SG488, SG489,
SG490, SG491, SG492, SG493, SG494, SG495, SG496, SG497, SG498,
SG499, SG500, SG501, SG502, SG503, SG504, SG505, SG506, SG507,
SG508, SG509, SG510, SG511, SG512, SG513, SG514, SG515, SG516,
SG517, SG518, SG519, SG520, SG521, SG522, SG523, SG524, SG525,
SG526, SG527, SG528, SG529, SG530, SG531, SG532, SG533, SG534,
SG535, SG536, SG537, SG538, SG539, SG540, SG541, SG542, SG543,
SG544, SG545, SG546, SG547, SG548, SG549, SG550, SG551, SG552,
SG553, SG554, SG555, SG556, SG557, SG558, SG559, SG560, SG561,
SG562, SG563,
microarray que comprende adicionalmente:
- a.
- al menos dos puntos que correspondan a sendas alícuotas del disolvente en el que se encontraban los oligonucleótidos en el momento de su depósito sobre la superficie del microarray, para que sirvan como blanco,
- b.
- al menos dos copias de al menos un oligonucleótido por cada una de las secuencias poliadeniladas añadidas en la etapa d), oligonucleótido cuya secuencia se corresponderá con un fragmento, distinto de la zona de poliadenilación, de la secuencia de nucleótidos poliadenilada cuya evolución en el proceso ha de controlar;
- c.
- por cada uno de los oligonucleótidos añadidos en la etapa e), al menos dos copias de un oligonucleótido complementario al mismo;
- d.
- al menos dos copias de cada miembro de al menos una pareja de oligonucleótidos en la que la secuencia de uno de los miembros corresponde a una secuencia de la zona 5' y la secuencia del otro corresponde a una secuencia de la zona 3' del mRNA de un gen que se exprese de forma constitutiva en cualquier célula de origen hematopoyético;
- e.
- al menos dos copias de al menos un oligonucleótido de baja homología con genes humanos distinto de cualquiera de los oligonucleótidos definidos en el apartado b. y distinto de cualquiera de los oligonucleótidos sintéticos añadidos de forma opcional en la etapa e);
g) detectar y cuantificar la señal de cRNA
hibridado con cada una de las copias de cada uno de los
oligonucleótidos presentes en el microarray, así como la señal
correspondiente a los puntos del disolvente;
h) calcular el nivel medio de intensidad de
hibridación de cada uno de los oligonucleótidos del microarray
calculando la media de las intensidades de las copias de cada uno
de los oligonucelótidos;
i) dar la hibridación por válida si se cumplen
las siguientes condiciones:
- a.
- la relación entre la intensidad media y el fondo medio de todos los oligonucleótidos del microarray es mayor que 10;
- b.
- el valor del coeficiente de variación medio de todas las réplicas de oligonucleótidos debe ser inferior a 0,3;
- c.
- el valor medio de control negativo debe ser inferior a 2,5 veces el valor medio de los puntos correspondientes al disolvente;
- d.
- existe señal tanto en los controles de hibridación como en los controles positivos internos utilizados como control del proceso;
j) normalizar los datos;
k) eliminar los oligonucleótidos con valores de
intensidad media menos ruido de fondo medio inferiores a
aproximadamente 2 veces el valor medio obtenido con los puntos
correspondientes al disolvente, así como los oligonucleótidos con un
rango intercuartílico de intensidad normalizada a lo largo de las
muestras menor que 0,3;
l) realizar el análisis estadístico para
encontrar los oligonucleótidos estadísticamente significativos para
diferenciar entre las distintas categorías y poder realizar la
clasificación de una muestra que no se haya adscrito previamente a
ninguna categoría, eligiendo dichos oligonucleótidos entre aquellos
que no hayan sido eliminados en los pasos anteriores, hasta obtener
los "n" oligonucleótidos que o bien presenten un valor de p
inferior a un límite que se elige del intervalo abierto de 0 a
0,05, utilizando para ello preferiblemente un método con capacidad
para reducir los falsos positivos, o bien sean los que mejor
definan a las categorías establecidas;
m) comprobar que el agrupamiento de las muestras
según las diferencias en las intensidades entre las distintas
muestras detectadas para los oligonucleótidos estadísticamente
significativos da lugar a que las muestras queden clasificadas en
las mismas categorías a las que habían sido adscritas previamente
por un método diferente.
Se prefiere que el valor medio calculo en el
apartado h) sea una media acotada, para lo cual es preferible que
el microarray comprende al menos cuatro copias de cada uno de los
oligonucleótidos presentes en O.
La normalización puede realizarse con distintos
métodos. Se tiene preferencia por la utilización de funciones
contenidas en paquetes de acceso libre a través de Internet
diseñados para la manipulación, cálculo y representación gráfica de
datos, como pueden ser los paquetes diseñados para el lenguaje de
programación R, disponibles para descargar desde CRAN
(http://cran.r-project.orq/) o Bioconductor
(http://www.bioconductor.org). Se prefiere especialmente el
método "variance stabilization normalization" disponible en el
paquete "vsn" de R.
La identificación de los oligonucleótidos
estadísticamente significativos para diferenciar entre las
distintas categorías puede realizarse por distintos métodos,
teniéndose preferencia por aquellos en los que se determina un valor
p que determina el umbral de probabilidad por debajo del cual todos
los genes cuya diferencia de expresión tenga un valor menor a p
serían considerados significativos y, entre estos, los que tienen
capacidad para efectuar correcciones sobre el valor de p_{i} como
pueden ser, entre otros, el método de Bonferroni o el test de
Welch. El valor de p se elegirá del intervalo abierto de 0 a 0,05,
prefiriéndose, cuando sea posible, valores de p próximos a 0,001 y
con corrección, pudiendo aumentarse dicho valor como máximo hasta
0,05 (valor que no está incluido entre los posibles) hasta que se
encuentren oligonucleótidos estadísticamente significativos para
diferenciar entre las categorías entre las que se desea clasificar
las muestras. Una posibilidad para realizar estos cálculos es, de
nuevo, la utilización de funciones contenidas en paquetes de acceso
libre a través de Internet diseñados para la manipulación, cálculo y
representación gráfica de datos. En concreto, para la
identificación de los oligonucleótidos estadísticamente
significativos puede utilizarse la función mt.maxT del paquete
multtest de R.
Otra posibilidad para la identificación de
oligonuclétidos estadísticamente significativos para poder
diferenciar entre las categorías de muestras establecidas es la
utilización del método de "nearest shrunken centroids", una
variación del método de "nearest centroids" (Tibshirani et
al., 2002), que identifica un grupo de genes que mejor
caracteriza a una clase predefinida y utiliza este grupo de genes
para predecir la clase a la que pertenecen nuevas muestras. Para
ello, puede recurrirse de nuevo a funciones contenidas en paquetes
de libre acceso en Internet, como puede ser el paquete
"pam^{a}" de R, en el que pueden encontrarse funciones para
efectuar el llamado "Prediction Analysis for Microarrays
(PAM)", que hace uso del método de "nearest shrunken
centroids".
Una vez identificados los genes estadísticamente
significativos para distinguir entre categorías de muestras
establecidas a partir de los oligonucleótidos correspondientes,
pueden utilizarse para clasificar nuevas muestras por similitud
entre el perfil de expresión de esos genes en la muestra analizada
y el correspondiente a cada alguna de las categorías de
clasificación. Alternativamente, cuando las posibles categorías de
clasificación sean sólo 2 (que será lo normal cuando se quiera
diagnosticar la presencia o ausencia de un determinado tipo de
leucemia en un individuo), puede obtenerse una función matemática
de clasificación de muestras que determine el valor de la
probabilidad "p_{i}" de que una muestra "i" pertenezca a
una o a otra categoría. Para ello, se elige un subconjunto de las
muestras que han sido adscritas previamente a cada una de las
posibles categorías mediante un método distinto al de la invención
y se asocia arbitrariamente el valor 0 a la probabilidad
correspondiente a cada una de las muestras de una de las categorías
"a" (habitualmente, la categoría de "no asociado a la
leucemia que se quiere diagnosticar") de pertenecer a la otra
posible categoría, mientras que cada una de las muestras del
subconjunto perteneciente a la otra posible categoría "b"
(habitualmente, la categoría de "asociado a la leucemia que se
quiere diagnosticar") recibe arbitrariamente el valor "1"
para su probabilidad de pertenecer a su propia categoría. Con ello,
se utiliza regresión logística para calcular, con ayuda de los
valores de probabilidad asignados a cada una de las muestras y los
valores de intensidad media acotada normalizada obtenidos para cada
una de las muestras con cada uno de los "n" oligonucleótidos
que haya sido identificado como oligonucleótido estadísticamente
significativo en la etapa anterior, coeficientes para cada uno de
dichos oligonucleótidos que permitan obtener una función de
probabilidad p_{i} de que una muestra "i" pertenezca a la
categoría "b", función que será del tipo
p_{i} =
1/(1+e^{-xi})
y que resulta de la transformación
algebraica de la expresión que iguala el logaritmo neperiano del
cociente entre la probabilidad de que un suceso ocurra y la
probabilidad de que no ocurra a una función x_{i} que incluye
como variables cada uno de los factores que pueden influir en el
suceso, es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
función x_{i} que, en el presente
caso, dependerá de los valores de intensidad obtenidos para cada
uno de los oligonucleótidos estadísticamente significativos y que
responde a una expresión del
tipo:
donde
- coef_olig_{m}
- representa el coeficiente calculado para un oligonucleótido concreto "m"
- Imn_{i}_olig_{m}
- representa el valor medio de intensidad normalizada obtenido en la hibridación de la muestra i calculado para el oligonucleótido "m"
"m" varía desde 1 hasta "n"
n es el número total de oligonucléotidos
considerados significativos.
La función p_{i} obtenida tras calcular
mediante regresión logística el coeficiente correspondiente a cada
oligonucleótido permite clasificar una muestra "i" como
perteneciente a una u otra categoría, considerándose que los valores
de p_{i} superiores a 0,5 (y que serán menores o iguales a 0)
indican que la muestra pertenece a la categoría "b", mientras
que los valores de p_{i} inferiores a 0,5 indican que la muestra
pertenece a la categoría "a". Dicha función p_{i} se
considerará válida si, al ser aplicada a las muestras a partir de
las cuales se ha deducido, es capaz de clasificarlas correctamente
y, además, al ser aplicada al subgrupo de muestras que no habían
sido tenidas en cuenta para deducir la función pero cuya categoría
se conoce por haber sido previamente asignada mediante un método
diferente al de la invención, es capaz también de clasificarlas
correctamente.
Alternativamente, cuando la identificación de
los genes estadísticamente significativos se haya realizado
utilizando el método de "Prediction Analysis for Microarrays",
el clasificador puede obtenerse con las correspondientes funciones
del paquete "pamr^{a}" de R, que parte también de la
asignación del valor de probabilidad 0 a un subgrupo de miembros de
una de las categorías y el valor de probabilidad 1 a un subgrupo de
miembros de la otra categoría. De nuevo, el cálculo de coeficientes
para oligonucleótidos estadísticamente significativos permite el
cálculo de valores de probabilidad de pertenencia a una u otra
categoría, considerándose igualmente que los valores superiores a
0,5 indican la pertenencia a la categoría a cuyos miembros se les
asignó arbitrariamente el valor 1 y los valores inferiores a 0,5
indican la pertenencia a la otra categoría.
Un caso particular del método de la invención es
aquel en el que se desea clasificar muestras como asociadas o no a
algún tipo de leucemia. En ese caso, se prefieren las muestras de
sangre, especialmente las de sangre periférica, como muestras
biológicas para llevar a cabo in vitro el método de la
invención.
Una vez identificados los genes estadísticamente
significativos para asociar una muestra a un determinado tipo de
neoplasia originada a partir de células hematopoyéticas, el método
de la invención puede utilizarse para clasificar muestras según el
nivel de expresión de dichos genes en dichas muestras. La neoplasia
puede ser, por ejemplo, un tipo concreto de leucemia. Un caso
particular de esta realización del método de la invención lo
constituye la asociación de una muestra a la leucemia linfática
crónica, permitiendo de esta manera el diagnóstico de esta
enfermedad mediante el método de la invención. Para ello, se
consideran como genes significativos cuyo nivel de expresión se
analiza al aplicar el método de la invención al menos los del grupo
de CD79A, FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3,
HLA-DQA1 y el análisis se realiza en muestras de
sangre. El método puede aplicarse incluyendo adicionalmente el
análisis del nivel de expresión de al menos los genes IRF8 y
COL3A1. Preferiblemente, el análisis del nivel de expresión de estos
genes se realiza evaluando el nivel de sus correspondientes mRNA
por hibridación de su correspondiente cRNA con los oligonucleótidos
SG117, SG428, SG459, SG507, SG508, SG461 y SG493, los cuales se
prefiere que estén asociados a un soporte sólido formando parte de
un microarray. Cuando la evaluación del cRNA hibridado con cada uno
de esos oligonucleótidos se realiza gracias al marcaje previo del
cRNA con biotina, la tinción del microarray hibridado con
estreptavidina conjugada con un fluróforo y la detección de la
señal emitida por dicho fluoróforo, se prefiere que el fluoróforo
sea Cy3, lo que permite el diagnóstico de la presencia de LLC en el
sujeto del que se ha extraído la muestra mediante la clasificación
de la muestra "i" analizada como asociada a LLC a partir del
cálculo de la probabilidad de que dicha muestra esté asociada a LLC
a partir de la fórmula p_{i} = 1/(1+e^{-xi}), en la que x_{i}
se calcula mediante la
fórmula
fórmula
- x_{i} =
- -719,241486 + (2,44756372 * Imn_{i}_CD79A) + (7,38657611 * Imn_{i}_FAIM3) + (23,1465464 * Imn_{i}_HLA-DRA) + (43,6287742 * Imn_{i}_IRF8) - (19,3978182 * Imn_{i}_COL3A1) - (2,80282646 * Imn_{i}_HLA-DRB3) + (49,5345672 *Imn_{i}_HLA-DQA1)
- \quad
- fórmula en la que cada uno de los valores denominados mediante la abreviatura "Imn_{i}" seguida de la abreviatura de un gen hace referencia al valor medio de intensidad normalizado obtenido tras detectar la señal de hibridación correspondiente al oligonucleótido que se está utilizando como sonda para evaluar la expresión de dicho gen
y que permite clasificar al sujeto
como sujeto que no padece LLC si el valor de p_{i} es menor de
0,5 y como sujeto que padece LLC si el valor de p_{i} es mayor de
0,5.
Alternativamente, pueden considerarse genes
significativos cuyo nivel de expresión se analiza al aplicar el
método de la invención para el diagnóstico de la LLC al menos los
del grupo de CD79A, FAIM3, HLA-DRA,
HLA-DRB3, HLA-DQA1, incluyendo
adicionalmente el análisis del nivel de expresión de al menos el gen
CDW52. Preferiblemente, el análisis del nivel de expresión de estos
genes se realiza evaluando el nivel de sus correspondientes mRNA
por hibridación de su correspondiente cRNA con los oligonucleótidos
SG117, SG428, SG459, SG507, SG508 y SG237, los cuales se prefiere
que estén asociados a un soporte sólido formando parte de un
microarray.
Otro caso particular de la aplicación del método
de la invención para clasificar muestras como asociadas a un tipo
concreto de leucemia según el nivel de expresión en dichas muestras
de genes estadisticamente significativos lo constituye la
clasificación de una muestra como asociada a un subtipo concreto de
leucemia linfática crónica, la LLC "estable" o la LLC
"progresiva", lo que permite que el método de la invención
sirva para pronosticar la futura evolución de sujetos a los que se
les ha diagnosticado LLC. Cuando las muestras analizadas son de
sangre periférica, los genes considerados estadísticamente
significativos para realizar la clasificación de las muestras son
al menos los genes PSMB4, FCER2 y POU2F2, pudiendo analizarse
adicionalmente el nivel de expresión de al menos un gen
seleccionado el grupo compuesto por ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CD5,
MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF,
RBP4 o la totalidad de ellos.
Un aspecto adicional de la invención lo
constituye el uso de dispositivos para evaluar el nivel de
expresión de al menos uno de los genes del grupo compuesto por
PSMB4, FCER2, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CDS, MS4A1, EIF4E,
FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF, RBP4, CD79A,
FAIM3, HLA-DRA, HLA-DRB3,
HLA-DQA1, IRF8 y COL3A1 con el fin de diagnosticar
la presencia de LLC en un individuo y/o pronosticar su evolución. Un
caso particular de este aspecto de la invención es el uso de
dispositivos de evaluación del nivel de expresión de al menos un
gen del grupo compuesto por CD79A, FAIM3, HLA-DRA,
HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 y COL3A1
para el diagnóstico de la presencia de LLC en un individuo, en el
que se prefiere que el dispositivo evalúe al menos el nivel de
expresión de los genes CD79A, FAIM3, HLA-DRA,
HLA-DRB3, HLA-DQA1, pudiendo
evaluar el dispositivo, adicionalmente, el nivel de expresión de al
menos los genes IRF8 y COL3A1 o bien de al menos el gen CDW52. Otro
caso particular de este aspecto de la invención es el uso de
dispositivos de evaluación del nivel de expresión de al menos un
gen del grupo compuesto por PSMB4, FCER2, POU2F2, ODC1, CD79A, CD2,
CD3E, CDS, MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3,
CML66, PLZF, RBP4, CD79A, FAIM3, HLA-DRA,
HLA-DRB3, HLA-DQA1, IRF8 y COL3A1
para pronosticar la evolución futura de la LLC en un individuo.
La Figura 1 muestra el agrupamiento de muestras
de células U937 frente a células Jurkat en función de diferencias
en la expresión de genes entre las muestras. La parte A corresponde
al agrupamiento no supervisado; la parte B corresponde al
agrupamiento supervisado.
La Figura 2 muestra el agrupamiento de muestras
de sujetos sanos frente a células U937 y células Jurkat en función
de diferencias en la expresión de genes entre las muestras. La
parte A corresponde al agrupamiento no supervisado; la parte B
corresponde al agrupamiento supervisado.
La Figura 3 muestra el agrupamiento de muestras
de pacientes con leucemia linfática crónica frente a células U937 y
células Jurkat en función de diferencias en la expresión de genes
entre las muestras. La parte A corresponde al agrupamiento no
supervisado; la parte B corresponde al agrupamiento supervisado.
La Figura 4 muestra el agrupamiento de muestras
de pacientes con leucemia linfática crónica "estable" frente a
muestras de pacientes con leucemia linfática crónica
"progresiva" en función diferencias en la expresión de genes.
La parte A corresponde al agrupamiento en función de los genes
identificados como significativos tras normalización con "vsn"
y utilización de la función mt.maxT de R; la parte B corresponde al
agrupamiento en función de los genes identificados como
significativos tras normalización por cuantiles robustos y
utilización de la función mt.maxT de R.
La Figura 5 muestra la distribución de los datos
de expresión obtenidos mediante RT-PCR (gráficos de
la parte izquierda) y a partir de las valores de intensidad
obtenidos del microarray (gráficos de la parte derecha) para los
genes PSMB4 (parte A: gráficos superiores), CD23A (parte B:
gráficos intermedios) y POU2F2 (parte C: gráficos inferiores) en
muestras de pacientes con leucemia linfática crónica "estable"
(barras marcadas con "E") y en muestras de pacientes con
leucemia linfática crónica "progresiva" (barras marcadas con
"P").
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada de la
invención: Diseño del dispositivo
"microarray"
Se realizó una revisión de la literatura
científica y se seleccionaron genes por su especial implicación en
la biología de células sanguíneas o en la patología de las
distintas neoplasias. Los genes seleccionados pueden incluirse
dentro de estos 4 grandes grupos:
- Genes cuya proteína se expresa o reprime en
las diferentes etapas por las que atraviesan estas células en su
diferenciación a formas maduras.
\global\parskip0.900000\baselineskip
- Genes cuya proteína se expresa de forma
específica en función del linaje al que pertenece la célula.
- Genes que codifican moléculas de adhesión.
- Genes cuya expresión (a nivel de mRNA o de
proteína) se ve alterada en distintos tipos de neoplasias, o
asociados con resistencia a quimioterapia.
- Genes que codifican proteínas asociadas con
proliferación, metástasis o genes cuya expresión se encuentra
aumentada en gran número de tumores.
- Genes que sin tener una especial relación con
neoplasias hematológicas ni con biología de células sanguíneas, han
aparecido en la literatura científica como estadísticamente
asociados a un tipo de neoplasia.
Las características de los genes pueden
consultarse, por ejemplo, en: www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank,
seleccionando la opción "Gene" en el desplegable que aparece e
introduciendo el correspondiente número de identificación (GenID) en
el GenBank. Los genes cuya expresión puede analizarse con el
microarray, su correspondiente número de identificación en el
GenBank, así como los oligonucleótidos presentes en el microarray
para ser utilizados como sondas para analizar la expresión de
dichos genes aparecen posteriormente en la Tabla 1.
Para cada uno de los 534 genes relacionados con
neoplasias hematológicas, así como para los genes correspondientes
a la \beta-actina,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, 18S rRNA y 28S rRNA, se buscó en GenBank
(www.ncbi.hlm.nih.gov/Genbankn la secuencia del mRNA. A partir de la
secuencia de GenBank se diseñó un oligonucleótido (sonda)
específico para cada uno de los genes seleccionados. En algunos
genes se diseñaron varios oligonucleótidos situados en las zonas 5'
y 3' del gen, con objeto de analizar la integridad de los mRNA.
Para asegurar especificidad en el diseño de las
sondas se tuvieron en cuenta los siguientes criterios:
- -
- Longitud de la sonda para garantizar que todas las sondas van a tener un comportamiento parecido,
- -
- Contenido en GC de la sonda entre el 40 y el 60% Esta característica también se tuvo en cuenta para asegurar que todas las sondas van a tener un comportamiento parecido.
- -
- Localización en el gen. Se seleccionaron sondas localizadas a menos de 3000 nucleótidos del extremo 3' (poli(A)) de la secuencia de mRNA seleccionada.
- -
- Sentido de la sonda. Se eligió hebra con sentido "sense", es decir, las secuencias de los oligonucleótidos coinciden con secuencias de fragmentos de los correspondientes mRNA, en lugar de ser secuencias complementarias a dichos fragmentos. Esta decisión implica que el material genético marcado tiene que ser antisentido, "antisense" (complementario a "sense").
- -
- Especificidad de la sonda. Para evitar que haya hibridación inespecífica se seleccionaron sondas que tenían un porcentaje de homología, calculado mediante la herramienta BLAST (disponible en la página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), inferior a 70%.
Los datos sobre los oligonucleótidos utilizados
como sondas, el número de identificación de su correspondiente
secuencia en el listado adjunto, así como datos (número de
identificación en GenBank, abreviatura usual y nombre) de los genes
para la detección de cuya expresión han sido diseñados dichos
oligonucleótidos se muestran a continuación en la Tabla 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De entre estos genes, cuatro de ellos (ACTB,
GAPD, 18S rRNA y 28S rRNA), no tienen una relación especial con
neoplasias y se incluyeron inicialmente en el microarray porque,
durante mucho tiempo, se creyó que su expresión se mantenía
constante y se utilizaban a la hora de normalizar los datos de
microarrays: son el tipo de genes a los que se alude al hablar de
genes "constitutivos" en otros puntos de la memoria. En la
actualidad, no se cree que existan gen cuya expresión se mantiene
constante en cualquier circunstancia, por lo que en el presente
estudio los genes ACTB, GAPD, 18S rRNA y 28S rRNA han recibido el
mismo tratamiento que el resto de los genes del microarray, salvo
por el hecho de que los dos primeros han sido utilizados como
controles de integridad, como se describe más
adelante.
adelante.
En la Tabla 1 puede observarse que hay genes que
están representados por más de un oligonucleótido. Esto es así
porque la existencia de dos o más sondas por gen puede utilizarse
para medir la integridad del cRNA sintetizado. Los genes para los
cuales se diseñó más de un oligonucleótido para actuar como sonda,
cada una de las cuales hibrida con una secuencia distinta, se
indican a continuación en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Para disminuir la variabilidad se incluyeron un
gran número de controles en cada "microarray". Estos controles
suponen una medida objetiva sobre la calidad del proceso y por lo
tanto, de la calidad de los datos obtenidos. Son de varios tipos y
procedencias:
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Estas sondas fueron 2 parejas de
oligonucleótidos complementarios a los extremos 5' y 3' de los
genes \beta-actina (sondas código SG463 y SG464) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (sondas código SG466 y SG467). La relación entre las
intensidades de la sonda localizada en el extremo 3'y 5' permite
comprobar la calidad del RNA de partida y el funcionamiento de la
reacción de marcaje. Los detalles sobre estos oligonucleótidos
aparecen en la
Tabla 3.
Tabla 3.
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Estas sondas están formadas la gran mayoría por
un grupo de oligonucleótidos de 50 nucleótidos
(50-meros) que no son complementarias a ninguna
secuencia humana conocida. Para ellos se aplicó la herramienta
BLAST a estas sondas y se vio que no hibridaban con ninguna
secuencia humana. Se identifican con los códigos SC1 (SEQ ID
NO:564), SC2 (SEQ ID NO:565), SC3 (SEQ ID NO:566), SC4 (SEQ ID
NO:567), SC5 (SEQ ID NO:568), SC6 (SEQ ID NO:569) y SC7 (SEQ ID
NO:570) y también se utilizaron como controles negativos los
oligonucleótidos SCN1 (SEQ ID NO:571), SCN5 (SEQ ID NO:575), SCN7
(SEQ ID NO:577) y SCN10 (SEQ ID NO:580). Son utilizados para
determinar las condiciones óptimas de hibridación, lavado y
revelado de los "chips" o "microarrays". La aparición de
señal asociada a ellos indica la existencia de hibridación
inespecífica.
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Los "Spiked controls" son oligonucleótidos
sintéticos cuya secuencia coincide con un fragmento de un
transcrito de un gen no humano o de cualquier otra secuencia de
nucleótidos de baja homología con transcritos de genes humano que
esté poliadenilada en 3', que se utilizan como control positivo, en
la determinación de la calidad del proceso, en la normalización de
datos y para el establecimiento del rango lineal del proceso (Benes
V et al., 2003). Para ello, los transcritos o secuencias
poliadeniladas correspondientes se añaden al RNA total de partida
antes de comenzar el proceso de marcaje y, por lo tanto, sufren las
mismas reacciones (marcaje, hibridación y revelado) que el RNA
total de las muestras.
Se utilizaron 7 "Spiked controls". Para
asegurar baja homología con genes humanos se utilizaron 5
transcritos de genes de Bacillus subtilis (dap, thr, trp, phe
y lys) y 2 transcritos de genes del virus de la Sharka, al que se
hace referencia con frecuencia por su denominación en inglés
"Plum poxvirus" (Sppv), que es un virus de plantas. Los
detalles sobre estos oligonucleótidos se muestran a continuación en
la Tabla 4. Los números de ATCC (American Type Culture
Collection) que aparecen tras el nombre de los genes de
procedencia se refieren al número de identificación en la ATCC de
cepas de E. coli que contienen plásmidos recombinantes que
contienen la secuencia de los genes a partir de los cuales se
obtienen los transcritos que se añaden al RNA y que fueron
utilizados también para el diseño de las secuencias de los
correspondientes oligonucleótidos unidos al microarray.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las bacterias de E. coli con los
plásmidos recombinantes fueron adquiridos a ATCC (Rockville, MD.
USA) Los plásmidos (pBluescript II-KS) contenían el
cDNA clonado de un gen de Bacillus subtilis, con sitios de
corte para las enzimas NotI en el extremo 5' y BamHI en el extremo
3' y una extensión poli (dA) anterior al sitio de corte para
BamHI.
Tras reconstituir y dejar crecer las células
durante toda una noche a 37ºC en medio LB+Ampicilina, se procedió a
la obtención del plásmido con el kit Midipreps (Jetstar) siguiendo
las recomendaciones del fabricante. 10 \mug de cada uno de los
plásmidos se linealizaron por digestión con 30U de enzima de
restricción NotI, en presencia de tampón 1XNE3 y 1XBSA durante 3
horas a 37ºC. Los plásmidos linealizados se sometieron a extracción
con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (Ambion), precipitación con
0,1 vol de acetato de sodio 3M (Sigma) y 2,5 vol de Etanol 100% y
eliminación de sales con Etanol 80%, siguiendo el protocolo descrito
anteriormente. El DNA obtenido se resuspendió en 10 \mul de agua
libre de RNasas.
A continuación se procedió a la síntesis de los
transcritos con sentido "sense" con una reacción de
Transcripción in vitro (I.V.T) a partir de 1 \mug de
plásmido linealizado utilizando el kit MegaScript T3 (Ambion) y
siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los plásmidos
obtenidos fueron purificados con el kit RNeasy Total RNA Isolation
Kit (QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Se procedió a la cuantificación, determinación
de la pureza, calidad y tamaño de los transcritos obtenidos
siguiendo los mismos procedimientos que se describen posteriormente
para el RNA total.
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Los plásmidos recombinantes (Progenika
Biopharma) contenían el cDNA clonado de los dos genes sppv1 y sspv2
insertados entre dos sitios de restricción PvuII y PstI. El extremo
3' de cada inserto contiene una extensión de poliadenilación.
Células JM109 se transformaron con los plásmidos que contenían los
transcritos. Se dejaron crecer las células en placas con medio LB+
Ampicilina a 37ºC, se seleccionaron las colonias con las células
transformadas y se crecieron en medio líquido LB+AMP.
La recuperación de los plásmidos se realizó con
el kit Midipreps Plasmid Purificación (Qiagen), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. 10 \mug de cada plásmido se
linealizaron con 30U de las enzima de restricción PvuII. El inserto
se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (Ambion),
precipitación con 0,1 volúmenes de acetato de sodio 7,5 M y 2,5
volúmenes de etanol 100%. Se eliminaron las sales mediante dos
lavados con etanol 80%. El DNA obtenido se resuspendió en 10 \mul
de agua libre de RNasas.
A continuación se procedió a la síntesis de los
transcritos a partir de 1 \mug de cada plásmido linealizado con
el kit T7 MegaScript (Ambion) y siguiendo las recomendaciones del
fabricante. El producto de la reacción se limpió con el kit RNeasy
Total RNA Isolation Kit (Qiagen).
Seguidamente se procedió a la cuantificación,
medida de la pureza de los transcritos obtenidos y comprobación de
su tamaño.
A partir de los transcritos obtenidos se preparó
una solución de "Spiked controls" con distintas
concentraciones de cada uno de los "spiked" (véase la Tabla
4), de forma que cubrieran todo el rango de intensidades del sistema
de lectura "escáner" (valores de intensidad que van desde 0 a
65.535 en unidades arbitrarias). Esta solución se añadió en la
misma cantidad a 5 \mug de RNA total de partida de cada muestra
antes de comenzar el proceso.
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Para que el comportamiento de las sondas fuera
lo más parecido al comportamiento de las sondas diseñadas para los
genes a estudiar, con el programa Oligo 6.0 (M.B.I) se
seleccionaron para cada "Spiked control" aquellas secuencias
que cumplieran los mismos requisitos establecidos para las sondas de
los genes representados (longitud, contenido GC, hebra "sense"
y distancia al extremo 3') y que no formaran rizos estables
(energía menor de -7 Kcal/mol). Sobre las secuencias que cumplieron
estos requisitos se aplicó la herramienta BLAST y se eligió aquella
de menor homología con secuencias humanas.
Tras depositar e inmovilizar las sondas
correspondientes a los "Spiked controls" sobre el cristal, se
comprobó: a) que las sondas no hibridaban de forma inespecífica con
las muestras a analizar, b) que todas las sondas tuvieran unas
características de hibridación similares, y c) que la señal de
intensidad obtenida de cada una de ellas se pudiera relacionar con
la cantidad de trascrito añadido al RNA.
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Como controles de hibridación se utilizaron
oligonucleótidos sintéticos de DNA de 70 nucleótidos
(70-meros) modificadas en un extremo con una
molécula de biotina. Estas moléculas se añaden en la misma cantidad
a la muestra justo antes de la hibridación, de forma que su valor
depende únicamente de los procesos de hibridación, revelado y
captura de imágenes del "microarray". Para cada uno de estos
oligonucléotidos 70-meros, existen sobre el
"microarray" varias copias de un oligonucleótido de 50
nucleótidos de longitud (50-mero), complementario al
correspondiente oligonucleótido 70-mero con el que
debe hibridar. Los oligonucleótidos 50-meros que
forman parte del microarray y que son complementarios a
oligonucleótidos 70-meros que se añaden al cRNA
antes de hibridar son los de los códigos SCN2, SCN3, SCN6, SCN8,
SCN11, SCN12 y SCN13. Para asegurar baja homología con secuencias
humanas, las secuencias de estos oligonucleótidos se obtuvieron a
partir de secuencias de Arabidopsis thaliana y
Tripanosoma brucei. Sus características aparecen en la Tabla
5.
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Para el diseño de los oligonucleótidos
50-meros se comprobó, de forma similar a lo
anteriormente descrito para los "Spiked controls", que los
oligonucleótidos a utilizar no hibridaban de forma inespecífica con
las muestras a analizar, que todas las sondas tenían unas
características de hibridación similares y que la señal de
intensidad obtenida de cada una de ellas se podía relacionar con la
cantidad del correspondiente oligonucleótido 70-mero
añadido al cRNA. Ello permitió dar por válidos los oligonucleótidos
indicados en la Tabla 5. Los oligonucleótidos SCN4 (SEQ ID NO:574)
y SCN9 (SEQ ID NO:579), diseñados en un principio para actuar como
controles de hibridación, se vio que producían hibridación
específica cuando se hibridaba cRNA humano, por lo que se aparecen
también en el microarray, como si fueran sondas que representan a
algún gen humano, pero no se tienen en cuenta como controles
positivos de hibridación. Por su parte, los oligonucleótidos SCN1
(SEQ ID NO:571), SCN5 (SEQ ID NO:575), SCN7 (SEQ ID NO:577) y SCN10
(SEQ ID NO:580), que tampoco hibridaban de forma inespecífica con
las muestras, están presentes también en el microarray como
controles negativos de hibridación, al no añadirse al cRNA ningún
oligonucleótido complementario a las mismas.
\newpage
Por su parte, la solución de controles de
hibridación que contenía los oligonucleótidos
70-meros complementarios a los oligonucleótidos
50-meros presentes en el microarray como controles
positivos de hibridación de preparó a partir de las
correspondientes secuencias 70-meras biotiniladas
utilizando para cada una de ellas una concentración diferente,
según se muestra en la Tabla 6:
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Se utilizó como blanco el dimetilsulfóxido
(DMSO) sin ninguna sonda, por ser este el disolvente en el seno del
cual se encontraban los oligonucleótidos en el momento de ser
depositados sobre la superficie del microarray.
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Doce réplicas de cada sonda se depositan en
distintas localizaciones sobre la superficie de un soporte sólido
(vidrio de forma similar a la de los portabjetos de microscopía)
utilizando Microgrid II Spoter (Biorobotics). Las 12 réplicas de
cada sonda se distribuyeron sobre el soporte al azar: 6 en área
superior y 6 en área inferior Como soporte sólido se utilizaron
vidrios aminosilanizados (Corning). La humedad y la temperatura
fueron controladas durante todo el proceso de impresión.
La unión covalente de las sondas a los soportes
sólidos se llevó a cabo mediante entrecruzamiento
("cross-linking") por radiación ultravioleta
utilizando el aparato "Stratalinker" (Stratagene).
El control de calidad del proceso de producción
de los "microarrays" fue el siguiente: a) En cada tanda de
producción se tiñó un "microarray" con Bromuro de Etidio, lo
que permite analizar tamaño y forma de los puntos imprimidos. b)
Otro "array" de cada tanda se hibridó con un cRNA ya
hibridado, analizándose la señal de hibridación, el ruido de fondo
y la reproducibilidad de las réplicas.
\newpage
Las características del "array" se muestran
a continuación en la Tabla 7:
Cultivos de células Jurkat (línea celular
procedente de Leucemia T) y U937 (línea celular procedente de
Leucemia promonocítica) se centrifugaron durante 10 minutos a 1200
rpm y, tras decantar el sobrenadante, se resuspendió el precipitado
en RNAlater (Ambion Inc) y se almacenó a -80ºC hasta el momento de
la extracción del RNA. El RNA se extrajo con TRIzol
(Gibco-BRL Carlbad, CA, USA) siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
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Las muestras de sangre se recogieron
directamente sobre tubos PAXgene Blood RNA Tubes -PreAnalytix
(Qiagen). Se extrajeron 2,5 ml de sangre en cada tubo y dos tubos
por cada individuo. Los tubos se invirtieron varias veces para
permitir que la sangre se mezclara con el líquido estabilizador que
contiene el tubo, y se guardaron a -20ºC hasta la noche anterior a
la extracción del RNA
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos con la muestra fueron incubados a
temperatura ambiente durante la noche anterior a la extracción de
RNA. Para la extracción se utilizó el kit PAXgene Blood RNA kit
(Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante, incluyendo el
paso intermedio de tratamiento con DNasa
(RNase-Free DNase Set, Quiagen) en columna. El RNA
de cada tubo de extracción se eluyó en 80 \mul de tampón BR5. El
RNA de los dos tubos que correspondían a cada paciente se juntó en
un único tubo.
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Para asegurar que el RNA obtenido está libre de
contaminantes que puedan interferir en reacciones posteriores de
marcaje, este se purificó de la siguiente manera: a 160 \mul de
solución de RNA total se le añadieron 16 \mul (0,1 vol) de acetato
de sódico 7,5 M (Sigma) y 400 \mul (2,5 vol) de etanol 100%. La
solución se mezcló en un agitador "vórtex" y se incubó durante
1 hora a -20ºC. Tras 20 minutos de centrifugación a 12.000xg a 4ºC,
el precipitado se lavó dos veces con 500 \mul de etanol 80% y se
resuspendió en 35 \mul de agua libre de RNasas. Los RNAs obtenidos
fueron almacenados a -80ºC hasta su posterior utilización.
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La cuantificación del RNA total se llevó a cabo
mediante la medida de la absorbancia a 260 nm en un
espectrofotómetro (DU 65, Beckman Coulter). 2 \mul de la solución
de RNA total se diluyeron en 98 \mul de Tris-HCl 1
mM pH 7,5 y se estimó la concentración (\mug/ml) teniendo en
cuenta que 1 Unidad de Densidad Óptica a 260 nm corresponde con una
concentración de RNA de 44 \mug/ml.
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El grado de pureza se estableció a partir de la
relación de absorbancias A260/A280 (ácido nucleico/proteínas),
considerándose que el RNA es adecuado, de "buena calidad",
cuando la relación A260/A280 se encuentra entre 1,9 y 2,1.
La calidad del RNA total se determinó por
visualización del RNA tras electroforesis. 500 ng de RNA total
fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa (FMC) al 1% en
tampón TAE 1x con BrEt (0,5 mg/ml), bajo una diferencia de
potencial de 100 V durante 25 minutos en cubetas de electroforesis
de corriente continua (BioRad). Como marcador de pesos moleculares
se utilizó el fago \phi 29 digerido con la enzima de restricción
BamH I. Los geles se visualizaron en un transiluminador de luz
ultravioleta Gel Doc (BioRad).
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La elección de la hebra con sentido como sonda
limitó la estrategia de marcaje a aquellas aproximaciones que
rendían producto marcado antisentido (complementario a la sonda
inmovilizada sobre el soporte sólido).
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Este tipo de marcaje se realizó durante el
transcurso de un proceso de amplificación que consiste en el uso
para la síntesis de cDNA monocatenario, de un cebador
oligo(dT) que contiene un promotor para la enzima RNA
polimerasa del fago T7, enzima que se utilizará en la etapa de
amplificación de la muestra.
a.- Síntesis de cDNA: etapa en la que se
sintetizó DNA complementario (cDNA) al mRNA de partida. Se incubó 5
\mug de RNAtotal con 2 \mul de la solución de"Spiked
controls" y 100 pmol de cebador T7-(dT)24 (Genset Corp) en
un volumen final de 12 \mul durante 10 minutos a 70ºC en un
termobloque, la mezcla se enfrió sobre hielo y se le añadieron 4
\mul de buffer 5X First Strand Buffer (Gibco BRL Life
Technologies), 2 \mul DTT O,1M (Gibco BRL Life Technologies), 1
\mul dNTP mix 10 mM (Gibco BRL Life Technologies) y 1 \mul de
SuperScript II RNase H RT (200 U/\mul) (Gibco BRL Life
Technologies). Tras 1 hora de incubación en un baño provisto de
termostato (Selecta) a 42ºC, la reacción se enfrió sobre hielo.
b.- Síntesis de DNA de doble cadena
(dsDNA): se sintetizó una doble cadena de DNA a partir del cDNA
sintetizado en la etapa anterior. A los 20 pi de reacción anterior
se le añadieron 91 \mul de agua libre de RNasas, 30 \mul de
"Second Strand Reaction buffer"(Gibco BRL Life Technologies),
3 \mul dNTPs 10 mM (Gibco BRL Life Technologies), 10 U E.
coli DNA Ligasa (Gibco BRL Life Technologies), 40 U E.
coli DNA polimerasa I (Gibco BRL Life Technologies), 2 U E.
coli RNase H (Gibco BRL Life Technologies) en un volumen final
de 150 \mul. La reacción se incubó en un termobloque a 16ºC
durante 2 horas. A continuación se añadieron 10 U de T4 DNA
Polymerase (Gibco BRL Life Technologies) y se incubó la mezcla
durante 5 minutos a 16ºC. Para detener la reacción, se añadieron 10
0 de 0,5 M EDTA.
c.- Purificación del dsDNA: Para eliminar
posibles restos de productos de reacciones que puedan interferir en
reacciones posteriores de marcaje, se purificó el DNA obtenido a
través de extracción fenol/cloroformo y posterior precipitación. A
los 162 \mul de reacción anterior se le añadieron 162 \mul de
solución fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) (Ambion).
Se centrifugó durante 2 min a 12.000xg en una centrífuga a
temperatura ambiente, se recogió la fase superior acuosa. A esta
fase superior se le añadieron 0,5 volúmenes de Acetato de amonio
7,5M (Sigma Chemical) y 2,5 volúmenes de Etanol 100% enfriado a
-20ºC). Tras agitar con "vórtex" para mezclar bien los
componentes y una centrifugación de 20 minutos a 12000xg a
temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y se lavó el
precipitado dos veces con etanol 80%. El DNA obtenido se
resuspendió en 10 \mul de agua libre de RNasas y se concentró en
un concentrador "Speed-Vac" hasta un volumen de
2 \mul. Este DNAse guardó a -20ºC hasta su posterior
uso.
uso.
d.- Síntesis y marcaje del cRNA: Esta
reacción se llevó a cabo en un volumen de 20 \mul y utilizando el
kit T7 Megascript (Ambion), siguiendo las instrucciones del
fabricante e incorporando nucleótidos modificados con biotina,
Bio-11-CTP y Bio-11
UTP (Perkin Elmer) en una relación nucleótido sin
modificar/nucleótido modificado 1:3. La reacción se incubó durante
5 h y 15 minutos en un baño con termostato (Selecta) a 37ºC,
agitando la reacción cada 45 minutos. Tras esta incubación se
añadió 1 \mul de DNAsa y se incubó 30 min a 37ºC.
e.- Purificación del cRNA biotinilado: El
cRNA biotinilado se purificó con el kit RNeasy Total RNA Isolation
Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cRNAs
biotinilados obtenidos se eluyeron en un volumen de 80 \mul y se
almacenaron a -80ºC hasta su posterior uso.
La cantidad, pureza y calidad del cRNA obtenido
se determinaron siguiendo los mismos procedimientos que se han
descrito para el RNA total.
El cRNA se almacenó a -80ºC hasta su posterior
uso.
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10 \mug de cRNA biotinilado se fragmentaron en
presencia de tampón de fragmentación 5x (200 mM
Tris-acetato, pH 8,1, 500 mM HOAC, 150 mM MgOAc)
durante 35 minutos a 94ºC en un termobloque. Se comprobó que la
reacción de fragmentación se había llevado a cabo de forma correcta
a mediante la visualización de 1 \mul de solución de
fragmentación en electroforesis sobre gel de agarosa al 1%.
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En esta etapa se puso en contacto el material
genético marcado con las sondas inmovilizadas sobre el soporte
sólido.
A la solución de cRNA biotilinado y fragmentado
se le añadieron 10 \mul de la solución de controles de
hibridación y la mezcla se incubó 3 min a 95ºC para desnaturalizar
las posibles estructuras secundarias. Tras la incubación se llevó
inmediatamente la mezcla a hielo para prevenir una posible
renaturalización de la muestra.
La hibridación se llevó a cabo durante 6 horas a
42ºC en la estación automática de hibridación Ventana Discovery
(Ventana Medical Systems). Los tampones de hibridación y de lavado
fueron suministrados por Ventana Medical System. Los
"microarrays" fueron teñidos automáticamente en la propia
estación de hibridación con estreptavidina conjugada con Cy3
(Amersham Biosciences) utilizando las recomendaciones del
fabricante.
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Tras la hibridación y revelado, las imágenes de
los "microarrays" fueron identificadas y analizadas mediante
el "escáner" fluorescente confocal ScanArray 4000 (Perkin
Elmer) equipado con un láser para el verde (543 nm para excitar al
fluoróforo Cy3). El "software" utilizado fue ScanArray 3.1. El
uso del programa informático QuantArray 3.0 (Perkin Elmer)
proporcionó los valores absolutos de la intensidad de hibridación y
ruido de fondo en función de la luz emitida por el Cy3 en cada
sonda en un formato Excel.
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En primer lugar, a los valores absolutos de
intensidad de todos los oligonucleótidos se les restó el valor del
ruido de fondo. Para ello, se utilizaron los valores de intensidad
absolutos y los valores de ruido de fondo que el programa utilizado
para convertir las señales del fluoróforo devuelve, de forma
automática, para cada uno de los puntos de microarray: el
correspondiente valor de intensidad se obtiene de la zona que se ha
definido como punto y el valor del ruido de fondo se obtiene de la
zona situada alrededor del punto.
A continuación se calculó el nivel medio de
intensidad de hibridación de cada uno de los oligonucleótidos del
microarray a partir de la media acotada de las intensidades de las
12 réplicas de cada uno de los oligonucleótidos. Para ello, se han
de eliminar, antes de calcular la media, los valores superiores y
los valores inferiores de la distribución de puntos de valores de
señal de hibridación obtenidos con cada una de las réplicas de un
mismo oligonucleótido. El cálculo se realizó utilizando el programa
Excel de Microsoft y, concretamente, la función MEDIA.ACOTADA del
mismo, en la que el parámetro "porcentaje" se fijó en 0,2, lo
que supone fijar el porcentaje de valores eliminado en el 20% de
los valores superiores y el 20% de los valores inferiores; la
función redondea el número de puntos de datos excluidos al múltiple
de 2 más próximo.
En último lugar y para poder determinar la
validez de una hibridación, es necesario que se cumplan una serie
de criterios establecidos: 1) la relación entre la intensidad media
y el fondo medio de todos los oligonucleótidos del chip sea mayor
de 10; 2) el valor del coeficiente de variación medio (desviación
estándar de las réplicas frente a la media de las réplicas) de
todas las réplicas de oligonucleótidos del chip debe ser inferior a
0,3; 3) el valor medio del control negativo debe ser inferior a 2,5
veces el valor del DMSO medio; 4) se debe obtener señal tanto en los
controles de hibridación como en los controles positivos internos
exógenos (Spiked controls).
El análisis de los datos se realizó en R,
versión 1.9.1. R es un lenguaje de programación en el que se pueden
aplicar técnicas estadísticas tanto clásicas como modernas (R
Developmental Core Team, 2004;
http://www.R-project.org), que dispone de una serie
de funciones almacenadas en paquetes para la manipulación, cálculo
y representación gráfica de datos (Venables et al., 2004).
Existen cientos de paquetes escritos por diferentes autores para R,
con funciones estadísticas especiales o que permiten el acceso y
manipulación de datos y están disponibles para descargar desde las
páginas web de CRAN
(http://cran.r-project.org/) o Bioconductor
(http://www.bioconductor.org). En algunos casos concretos, se
utilizó también el software comercial de análisis estadístico SPSS
(Chicago, EE.UU.).
Ejemplo
1
Con objeto de saber si el dispositivo permite
diferenciar dos líneas celulares se hibridaron en 10 microchips: 5
muestras de cRNAs biotinilados sintetizados siguiendo el protocolo
de trabajo optimizado, obtenidos a partir de RNA de células U937
(línea celular procedente de Leucemia promonocítica) y 5 muestras de
cRNAs biotinilados obtenidos a partir de RNA de células Jurkat
(línea celular procedente de Leucemia T).
Se realizaron los pasos iniciales de
procesamiento preliminar de los datos y validación de la
hibridación mencionados anteriormente en el apartado de "Análisis
de datos: Procesamiento preliminar" y, a continuación se procedió
la normalización y filtrado de datos:
- Normalización de datos. Se utilizó el
método "variance stabilization normalization", disponible en
el paquete "vsn" de R. Existen diferentes de paquetes
disponibles en Internet para R, con funciones estadísticas
especiales o que permiten el acceso y manipulación de datos y están
disponibles para descargar desde CRAN
(http://cran.r-project.org/) o Bioconductor
(http://www.bioconductor.org).
- Filtrado de datos. Se han realizado dos
operaciones de filtrado con la función "Filterfun" del paquete
"Genefilter" de R. Los genes que no superaron alguno de los
dos filtros no fueron utilizados en el análisis de datos. Los
filtros llevados a cabo fueron:
- -
- Filtrado para excluir genes con un valor de intensidad próximo al DMSO. Este filtro permitió trabajar con genes con valor de intensidad menos ruido de fondo media mayor de 550 unidades arbitrarias (aproximadamente 2 veces el valor del DMSO).
- -
- Filtrado para excluir genes con mínima variación de intensidad a lo largo de las muestras. Se trabajó con genes con rango intercuartílico de intensidad normalizada a lo largo de las muestras mayor de 0,3.
El filtrado de datos dejó 83 sondas que
constituyeron la lista de trabajo. Con ellas se llevó a cabo un
agrupamiento de las muestras no supervisado, que son aquellos
agrupamientos en los que no se conoce la estructura de los datos de
antemano, aprendiendo el sistema cómo están distribuidos los datos
entre clases basándose en una función de distancia. Con el
agrupamiento se obtuvo un árbol o agrupamiento jerárquico, en el
que las muestras quedan agrupadas en función de su similitud en la
expresión de unos genes determinados, los correspondientes a los
oligonucleótidos de la lista de trabajo, de forma que las muestras
más próximas son las que tienen un perfil de expresión parecido. El
agrupamiento se realizó con la función hclust del paquete
stats de R. El análisis no supervisado de las 10 muestras
produjo su separación en dos grupos o ramas principales en función
del tipo celular al que pertenecen las muestras: un grupo contiene
las 5 hibridaciones realizadas a partir de células U937 y el otro
grupo contiene las 5 hibridaciones realizadas a partir de células
Jurkat. El árbol resultante de este agrupamiento no supervisado se
muestra en la parte A de la Figura 1.
A continuación, para conocer si existían
diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de
muestras, se utilizó el método "Step-down maxT
multiple testing procedures" (maxT), que es una aplicación de la
función mt.maxT del paquete multtest del software R de
Bioconductor, que aplica un test estadístico y realiza un fuerte
control sobre la tasa de falsos positivos. A esta función hay que
proporcionarle:
a) Valores sobre los que se quiere aplicar el
test estadístico, en este caso, sobre los valores normalizados de
los 83 oligonucleótidos que superaron los filtros.
b) Grupos de los que se quiere buscar
diferencias, en este caso las 5 muestras de células Jurkat frente a
las 5 muestras de células U937.
c) Número de permutaciones que se quiere
realizar. En este caso se realizaron 100.000 permutaciones.
d) Por defecto, se eligió el test de Welch para
especificar la herramienta estadística a utilizar para probar la
hipótesis de no asociación entre las variables y las etiquetas de
clase.
La aplicación de este análisis con un valor de
p<0,001 proporcionó una lista de 69 sondas estadísticamente
significativas entre los dos grupos, que son las siguientes:
SG12, SG20, SG23, SG24, SG38, SG39, SG45, SG49,
SG53, SG59, SG60, SG62, SG76, SG78, SG89, SG92, SG94, SG102, SG474,
SG478, SG487, SG114, SG120, SG140, SG142, SG145, SG150, SG154,
SG158, SG174, SG175, SG194, SG195, SG211, SG230, SG231, SG235,
SG260, SG264, SG266, SG268, SG270, SG272, SG282, SG294, SG308,
SG311, SG330, SG332, SG333, SG339, SG344, SG364, SG403, SG423,
SG434, SG456, SG506, SG513, SG514, SG515, SG524, SG533, SG538,
SG541, SG559.
Una vez conocidos los genes estadísticamente
significativos para distinguir entre los dos grupos de muestras
(que serían los genes correspondientes a las sondas identificadas
como estadísticamente significativas) se efectuó el agrupamiento
supervisado de las muestras en función de la intensidad de la señal
de las 69 sondas estadísticamente significativas obtenidas. El
término "supervisado", aplicado a un agrupamiento, hace
referencia al hecho de que la estructura de los datos se conoce de
antemano, lo que permite utilizar la información previa; con ello,
tras un proceso de entrenamiento que permite al sistema aprender a
distinguir entre clases, puede utilizarse la red para asignar
nuevos miembros a las clases predefinidas. En este caso, el
agrupamiento supervisado de las muestras en función de la intensidad
de la señal obtenida con las 69 sondas estadísticamente
significativas obtenidas, vuelve a ser un árbol que se divide en
dos ramas principales en función del tipo celular al que pertenecen
las muestras. El árbol obtenido con el agrupamiento supervisado se
muestra en la parte B de la Figura 1.
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Ejemplo
2
Se comparó la expresión de 5 muestras de células
U937 y de 5 muestras de células Jurkat frente a la expresión de 10
muestras provenientes de sangre total de sujetos sanos. De forma
similar a la descrita en el Ejemplo 1, se llevaron a cabo los pasos
de procesamiento inicial de los datos, validación de las
hibridaciones, normalización y filtrado. Un total de 180 genes
superaron los procesos de filtrado. El agrupamiento no supervisado
de las muestras (realizado con la función hclust del paquete
stats de R aplicando correlación de Pearson) en función de la
expresión de los 180 genes proporcionó un árbol con dos ramas
principales: una rama contiene todas las muestras procedentes de
cultivos celulares y la otra rama contiene todas las muestras
procedentes de sangre total de sujetos sanos, por lo que se
demuestra que la herramienta es capaz de encontrar diferencias de
expresión. El árbol obtenido tras realizar este agrupamiento no
supervisado se muestra en la parte A de la Figura 2.
Se realizó la prueba maxT (p<0,001) para
buscar genes con diferencias estadísticamente significativas entre
las muestras procedentes de cultivos celulares U937y Jurkart y las
10 muestras procedentes de sangre total de sujetos sanos. El
análisis estadístico proporcionó una lista de 131 sondas con
diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de
muestras. Son los siguientes:
SG1, SG4, SG7, SG8, SG10, SG13, SG15, SG16,
SG17, SG18, SG19, SG20, SG26, SG29, SG30, SG34, SG36, SG39, SG42,
SG44, SG49, SG51, SG52, SG58, SG64, SG65, SG67, SG76, SG77, SG80,
SG84, SG86, SG89, SG92, SG93, SG94, SG98, SG99, SG101, SG102,
SG107, SG463, SG464, SG474, SG475, SG485, SG487, SG466, SG467,
SG471, SG472, SG473, SG120, SG129, SG138, SG141, SG144, SG145,
SG147, SG158, SG163, SG164, SG176, SG185, SG186, SG197, SG207,
SG208, SG217, SG227, SG231, SG265, SG266, SG277, SG278, SG283,
SG285, SG299, SG307, SG308, SG311,SG313, SG318, SG319, SG328,
SG333, SG336, SG342, SG344, SG357, SG361, SG376, SG384, SG389,
SG395, SG398, SG403, SG404, SG407, SG416, SG420, SG423, SG430,
SG436, SG446, SG455, SG461, SG489, SG491, SG492, SG493, SG498,
SG500, SG504, SG505, SG506, SG514, SG516, SG517, SG520, SG526,
SG530, SG533, SG538, SG545, SG547, SG554, SG555, SG558.
El agrupamiento de las 20 muestras en función de
la expresión de las sondas estadísticamente significativas
encontradas dio lugar de nuevo a un árbol con dos ramas
principales, una correspondiente a los muestras procedentes de
cultivos celulares y otra correspondiente a las muestras
procedentes de individuos sanos. Dicho agrupamiento aparece en la
parte B de la Figura 2.
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Ejemplo
3
Se compararon los perfiles de expresión de
muestras procedentes de cultivos celulares U937 y Jurkats con 26
muestras procedentes de sangre total de sujetos con LLC.
Las muestras se sometieron a un procesamiento
preliminar de los datos, se normalizaron y filtraron de forma
análoga a la utilizada en los Ejemplos 1 y 2 y un total de 236
sondas superaron los filtros. El agrupamiento no supervisado de las
muestras en función de la expresión de las sondas que superaron los
filtros mostró un árbol con dos ramas principales: una que contenía
las muestras de cultivos celulares y la otra las muestras LLC.
Dicho árbol se muestra en la parte A de la Figura 3.
Se aplicó la prueba maxT (p<0,001) para
buscar genes con diferencias estadísticamente significativas entre
los dos grupos de muestras. Este análisis proporcionó una lista de
120 sondas. Son las siguientes:
SG2, SG4, SG8, SG10, SG13, SG15, SG16, SG19,
SG20, SG23, SG26, SG28, SG31, SG34, SG36, SG39, SG48, SG58, SG60,
SG65, SG76, SG77, SG84, SG89, SG94, SG9, SG97, SG99, SG102, SG106,
SG107, SG463, SG464, SG474, SG475, SG481, SG465, SG485, SG487,
SG466, SG467, SG471, SG473, SG115, SG116, SG117, SG120, SG129,
SG134, SG135, SG138, SG139, SG141, SG145, SG158, SG161, SG163,
SG176, SG178, SG185, SG207, SG208, SG210, SG217, SG227, SG231,
SG237, SG264, SG272, SG277, SG281, SG283, SG286, SG294, SG298,
SG299, SG307, SG308, SG319, SG328, SG330, SG333, SG336, SG342,
SG344, SG345, SG347, SG361, SG384, SG389, SG395, SG404, SG407,
SG416, SG423, SG428, SG430, SG432, SG434, SG444, SG446, SG453,
SG458, SG459, SG491, SG498, SG507, SG508, SG511, SG517, SG518,
SG522, SG526, SG530, SG533, SG538, SG541, SG554, SG558, SG561.
El agrupamiento de las 30 muestras en función de
la expresión de las 120 sondas estadísticamente significativas dio
lugar de nuevo a un árbol con dos ramas principales, una
correspondiente a las muestras de cultivos celulares y la otra
correspondiente a las muestras extraídas de sujetos que padecen LLC.
Este árbol se muestra en la parte B de la Figura 3.
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Ejemplo
4
68 hibridaciones que cumplieron los criterios de
calidad provenientes de 68 muestras de diferentes sujetos sanos y
con diagnóstico clínico de LLC se dividieron en 2 grupos: Grupo de
Entrenamiento utilizado para obtener las funciones del clasificador
y Grupo de Prueba, utilizado para probar el clasificador obtenido.
El Grupo de Entrenamiento estaba compuesto por 30 muestras (10 de
sujetos sanos y 20 de sujetos LLC) y el Grupo de Prueba estaba
compuesto por 38 muestras (5 muestras de sujetos sanos y 33
muestras de sujetos con LLC).
Para obtener la función de clasificación se
trabajó con los resultados obtenidos de las hibridaciones del Grupo
de Entrenamiento. Los pasos realizados para obtener la función de
clasificación fueron:
- Normalización de datos. Se utilizó el
método "variance stabilization normalization", disponible en
el paquete "vsn" de R.
- Filtrado de datos. Se han realizado dos
operaciones de filtrado con la función "Filterfun" del paquete
"Genefilter" de R. Los genes que no superaron alguno de los
dos filtros no fueron utilizados en el análisis de datos. De los 588
oligonucleótidos del chip, 224 superaron los 2 filtros y
constituyeron la lista de trabajo.
- 2.
- Filtrado para excluir genes con un valor de intensidad próximo al DMSO. Este filtro permitió trabajar con genes con valor de intensidad menos ruido de fondo medio mayor de 550 unidades arbitrarias (aproximadamente 2 veces el valor del DMSO) en más del 25% de las 30 muestras (7 muestras) que componen el Grupo de Entrenamiento.
- 3.
- Filtrado para excluir genes con mínima variación de intensidad a lo largo de las muestras. Se trabajó con genes con rango intercuartílico de intensidad normalizada a lo largo de las muestras mayor de 0,3.
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Se utilizaron dos sistemas de clasificación:
Para identificar grupos de genes que mejor
caracterizan cada tipo de muestra y comprobar la tasa de
clasificación de estos grupos de genes se utilizó Prediction
Analysis for Microarrays (PAM) disponible como paquete
"pamr^{a}" de R. Es una técnica estadística que identifica
un grupo de genes que mejor caracteriza a una clase predefinida y
utiliza este grupo de genes para predecir la clase a la que
pertenecen nuevas muestras. PAM utiliza una versión modificada del
método de clasificación "nearest centroids" (Tibshirani et
al., 2002) denominada "Nearest Shrunken Centroids". Se
realizó una validación denominada "10 fold cross validation"
que consiste en construir el modelo con el 90% de las muestras y se
intenta predecir la clase del 10% de las muestras que no han
intervenido en la construcción del modelo. Este procedimiento se
repite 10 veces y el error de clasificación del 10% de las muestras
se junta para calcular el error global. Este error refleja el número
de muestras mal clasificadas (Bullinger et al., 2005).
4.1.1. Construcción del modelo. A partir
de los datos filtrados y normalizados de las 30 muestras que
componen el Grupo de Entrenamiento, atribuyendo de forma arbitraria
el Grupo de Sanos a grupo 0 y el Grupo de LLC a grupo 1, realizando
las 10 validaciones cruzadas y con un valor de umbral de Delta 3,1.
El modelo obtenido lo formaron los siguientes oligonucleótidos:
SG459, SG428, SG507, SG508, SG117, SG237. Los coeficientes del
clasificador correspondientes a cada uno de estos oligonucleótidos
se muestran a continuación en la Tabla 8:
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\vskip1.000000\baselineskip
4.1.2. Validación del clasificador PAM.
La validación cruzada de las muestras que componen el Grupo de
Entrenamiento clasificó correctamente 28 de las 30 muestras.
A partir de los datos filtrados y normalizados
de las 38 muestras que componen el Grupo de Prueba, se obtuvieron
valores de probabilidad p de pertenencia al grupo 0 (grupo sano) o
grupo 1 (grupo LLC). Cuanto mayor sea el valor de p, mayor
probabilidad de pertenecer a ese grupo. Se ha considerado que los
valores mayores de 0,5 indican pertenencia a ese grupo. Los valores
de p obtenidos para cada muestra se indican en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Con este modelo se clasifican correctamente 37
de las 38 muestras del Grupo de Prueba: todas las muestras
correspondientes a individuos sanos (aquellas cuya denominación va
encabezada por la letra "S") presentan una probabilidad mayor
de 0,5 de pertenecer al grupo 0, mientras que todas las muestras
correspondientes a individuos que padecen LLC (que son las muestras
cuya denominación comienza por las letras "LLC") menos una
presentan una probabilidad mayor de 0,5 de pertenecer al grupo
1.
\vskip1.000000\baselineskip
4.2.1.- Selección de genes con diferencias
estadísticamente significativas entre sanos y LLC (Grupo de
Entrenamiento). A partir de datos normalizados y filtrados como
se ha descrito anteriormente, para la selección de genes con
diferencias significativas se utilizó el método
"Step-down maxT multiple testing procedures"
(maxT), que es una aplicación de la función mt.maxT del paquete
multtest del software R de Bioconductor, que aplica un test
estadístico y realiza un fuerte control sobre la tasa de falsos
positivos. La aplicación de este test estadístico, con un valor de
p<0,001, a los 224 oligonucleótidos que superaron los filtros,
produjo una lista de 7 oligonucleótidos: SG117, SG428, SG459,
SG461, SG493, SG507, SG508.
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Los pasos utilizados para obtener la lista de 7
genes significativos entre sanos y LLC fueron:
- \quad
- Método que hace permutaciones y va ajustando los valores de p resT<-mt.maxT(exprs(224 oligonucleótidos que hay superado los filtros y normalizados del grupo de entrenemiento), Tipos de muestras en el grupo de entrenamiento, test="t", B=100000): función mt.maxT que a través de permutaciones va ajustando los valores de probabilidad (significación), lo que supone un fuerte control de la tasa de falsos positivos.
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A esta función hay que proporcionarle
1.- Genes sobre los que se quiere aplicar el
test estadístico, en este caso, sobre los valores normalizados de
los 224 oligonucleótidos que han superado los filtros de todas las
muestras incluidas en el Grupo de Entrenamiento.
2.- Grupos de los que se quiere buscar
diferencias, en este caso 10 muestras de sanos y 20 muestras de
LLC. Se quieren encontrar diferencias entre sanos y LLC.
3.- Número de permutaciones que se quieren
realizar. En este caso se realizaron 100.000 permutaciones.
4.- Por defecto se eligió el, test de Welch como
test estadístico.
Los genes estadísticamente significativos a
nivel de p<0,001 se seleccionaron mediante este test y se obtuvo
un numero de 7.
4.2.2.- Obtención de la función de
clasificación con SPSS. Por regresión logística a partir de los
valores normalizados de los 7 oligonucleótidos estadísticamente
significativos obtenidos de las 30 muestras que componen el Grupo
de Entrenamiento y asignando de forma arbitraria grupo 0 a las
muestras sanas y grupo 1 a las muestras LLC, se obtuvieron los
valores de la función de clasificación. Los coeficientes
correspondientes a cada oligonucléotido fueron los que se muestran
a continuación en la Tabla 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
A partir de estos coeficientes, para cada
muestra i se calcula un valor x_{i} de la siguiente forma:
- x_{i} =
- Constante+ (Coef ohle0009*Imn_{i} SG117)+ (Coef SG428* Imn_{i} SG428)+ (Coef SG459* Imn_{i} SG459)+ (Coef SG461* Imn_{i} SG461)+ (Coef SG493* Imn_{i} SG493)+ (Coef SG507* Imn_{i} SG507)+ (Coef SG508* Imn_{i} SG508).
donde Imn_{i} es el valor medio
de intensidad normalizada de la muestra
i.
A partir del valor x_{i} se calcula un valor
de probabilidad (p_{i}). Cuanto más cercano sea el valor de p a
0, mayor probabilidad de que la muestra pertenezca al grupo de
sujetos sanos (asignados como grupo 0) y cuanto más cercano sea el
valor de p a 1, mayor probabilidad de que la muestra pertenezca al
grupo de sujetos LLC (asignados como grupo 1). La fórmula utilizada
para determinar el valor de p es:
p_{i} =
1/(1+e^{-xi}).
Como se muestra en la Tabla 11, la función
obtenida clasificó de forma correcta las 30 muestras pertenecientes
al grupo de entrenamiento. Cuanto mas cerca de 0 mayor probabilidad
de que sea sano y cuanto mas cercano sea a 1 mayor probabilidad
LLC.
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4.2.3. Validación del sistema
clasificador.- A partir los valores filtrados y normalizados
tal y como se ha detallado anteriormente se obtuvieron los valores
Imn_{i} de los 7 oligonucleótidos que componen el clasificador de
cada una de las 38 muestras que componen el grupo de prueba.
Resultados de la validación del sistema
clasificador. A continuación se muestran unas tablas en donde se
detalla el valor Imn_{i} de cada uno de los 7 oligonucleótidos
incluidos en el clasificador y los valores de x_{i} y p_{i}
calculados según las fórmulas descritas anteriormente, obtenidos
para cada una de las 38 muestras del grupo de prueba. Las muestras
que comienzan por S corresponden a sujetos sanos y las muestras que
comienzan con LLC son provenientes de sujetos LLC. 37 de 38
muestras se clasifican de forma correcta. Sólo la muestra LLC 175,
para la que se obtiene un valor de pi =0, se clasifica de forma
incorrecta.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se formó un tercer grupo de 40 muestras. Para
ello se utilizaron réplicas de hibridación o de marcaje (las
muestras cuya denominación comienza por S y Strans son muestras de
personas consideradas sanas y las que comienzan por LLC muestras
procedentes de pacientes con leucemia linfática crónica). Ester
grupo de muestras se utilizó para la validación del sistema de
clasificación. Los datos se normalizaron como se ha descrito
anteriormente. Los resultados de la clasificación se muestran en la
Tabla 13. 40 de las 40 muestras se clasifican correctamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
5
Se consideraron muestras
"LLC-estables tipo" (E) aquellas muestras de
pacientes que llevan más de 5 años con LLC estable y muestras
"LLC-progresivas tipo" (P) "progresivas
tipo" a las muestras de pacientes clasificadas de estables en el
momento del diagnóstico y cuya enfermedad ha progresad en menos de
un año.
En total se analizaron 6 muestras E y 6 muestras
P. Las 12 muestras fueron recogidas en momento diagnóstico, no
había diferencias clínicas entre ellas, pero al cabo de un año, 6
de esos pacientes habían progresado. Las 12 hibridaciones han
pasado los criterios de calidad detallados anteriormente.
Muestras Estables: E142R, E148, E156, E163,
E164, E193
Muestras Progresivas: P111, P105, P177, P158,
P157 y P197.
Todo el análisis de datos se realizó en R
versión 1.9.1.
Normalización de datos. En este caso, y
para evitar que los genes significativos obtenidos sean debidos a
una verdadera diferencia entre muestras y no a un efecto de
normalización, los datos se normalizaron de dos formas diferentes
("variance stabilization normalization" (vsn) y por cuantiles
robustos) y con cada una de las normalizaciones se realizó el mismo
análisis estadístico.
- Análisis estadístico con datos normalizados
por "variance stabilization normalization". La lista de
genes estadisticamente significativos se obtuvo a partir de un test
de Welch con la función mt.maxT del paquete multtest de R, con un
valor de p<0,05 sin ajustar, es decir, sin realizar ningún
control sobre los falsos positivos, y produjo una lista de 29 genes
con diferencias estadisticamente significativas entre el grupo
LLC-estables tipo y LLC-progresivos
tipo.
Los oligonucleótidos estadísticamente
significativos obtenidos fueron:
SG26, SG31, SG70, SG98, SG177, SG194, SG195,
SG208, SG213, SG216, SG272, SG293, SG301, SG309, SG321, SG333,
SG343, SG352, SG357, SG366, SG368, SG405, SG426, SG439, SG447,
SG452, SG521, SG555, SG556.
Se llevó entonces a cabo el agrupamiento de las
muestras, que se realizó con la función hclust del paquete
stats de R aplicando correlaciones de Pearson. El árbol
obtenido se muestra en la parte A de la Figura 4.
El agrupamiento jerárquico de las 12 muestras en
función de la expresión de los 29 genes estadísticamente
significativos obtenidos agrupaba las muestras de forma correcta:
el árbol contiene dos grandes ramas, de las cuales la rama de la
derecha contiene las 6 muestras estables y la rama de la izquierda
contiene las 6 muestras progresivas.
- Análisis estadístico con datos normalizados
por cuantiles robustos. La lista de genes estadísticamente
significativos se obtuvo a partir de un test de Welch con la
función mt.maxT del paquete multtest de R con los valores de p sin
ajustar, es decir, sin ejercer ningún control sobre la tasa de
falsos positivos, con un valor de p<0,05, y produjo una lista de
19 genes con diferencias estadísticamente significativas entre el
grupo LLC-estables tipo y
LLC-progresivos
tipo:
tipo:
SG26, SG31, SG177, SG194, SG195, SG197, SG213,
SG216, SG293, SG301, SG309, SG333, SG343, SG357, SG366, SG439,
SG452, SG555, SG556.
El agrupamiento supervisado de las 12 muestras
en función de la expresión de los 19 genes estadísticamente
significativos obtenidos dio lugar al árbol que aparece en la parte
B de la Figura 4, en el que las muestras aparecen agrupadas
igualmente de forma correcta.
Se seleccionaron 18 oligonucleótidos comunes a
ambas listas de genes estadísticamente significativos y se calculó
la media de intensidad de cada uno de ellos en el grupo de muestras
estables y en el grupo de muestras progresivos, así como la
variación de intensidad media entre el grupo de estables y
progresivos. Los valores obtenidos se muestran en la Tabla 14.
\vskip1.000000\baselineskip
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Para validar los resultados obtenidos con el
microarray, se seleccionaron 5 de las sondas estadísticamente
significativas comunes obtenidas al comparar datos de expresión de
sujetos LLC estables frente a sujetos LLC progresivos y se procedió
al estudio de la expresión con RT-PCR de los genes
representados por esas sondas. Los criterios utilizados para la
selección de las 5 sondas fueron: intensidad de hibridación, cambio
de intensidad entre grupo de estables y progresivos y valor de
significación estadística. De esta forma se seleccionaron 5 sondas
que representan a los genes PSMB4, CD23A, LCP1, ABCC5 y POU2F2. Se
determinó la expresión de estos 5 genes en 11 de las 12 muestras
LLC tipo, ya que no se disponía de RNA total de la muestra 105. Con
los valores de expresión de los genes en cada muestra, se determinó
la tasa de cambio entre el grupo de estables y progresivos y el
valor de significación de esa variación y se comparó con los
resultados obtenidos con los microarrays.
La técnica utilizada para la validación fue
RT-PCR o PCR a tiempo real utilizando un
LightCycler. Esta técnica es la técnica de elección para validar
datos de chips y al igual que los microarrays, mide nivel de
mRNA.
Se diseñaron cebadores para cada uno de los 5
genes cuyo oligonucleótido representativo fue seleccionado. Los
detalles de los mismos se muestran a continuación en la Tabla
15.
La Figura 5 muestra la distribución de los datos
de expresión obtenidos mediante RT-PCR (gráficos de
la parte izquierda) y mediante el microarray (gráficos de la parte
derecha). La parte A corresponde al gen PSMB4, la parte B al gen
CD23A y la parte C al gen POU2F2.
A continuación, en la Tabla 16, se detallan los
resultados obtenidos con el microarray y con RT-PCR
de los valores de cambio de los 5 genes seleccionados en el grupo
de muestras estables frente al grupo de muestras progresivas
obtenidos como la significación del cambio. En 3 de los 5 genes
seleccionados (PSMB4, CD23A y POU2F2) los valores de cambio, el
sentido del cambio y los valores de significación obtenidos con
RT-PCR concuerdan con los obtenidos con el
microarray, por lo que esos 3 genes se consideran validados, es
decir, que los resultados obtenidos para esos 3 genes con el
microarray coinciden con los resultados obtenidos por otra técnica
que también mide nivel de mRNA.
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gen humano PYGB
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gen humano ABL1
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<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG14
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IFRD1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaattcctt cgaaatgtat ttgaacttgg acccccagtg atgcttgatg ctgca
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG15
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL36A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttgagccc aactgcagat ctaagagaat gctggctatt aaaagatgca agcat
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IGFBP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttctgaca cacgtattta tatttggaaa gagaccagca ccgagctcgg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG17
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NDRG1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactttcctt ccctctcctg cttcctcttt tcctgctccc taacctttcg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FKBP9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgactcac catgcccagc cacttagttt tttcttattc ccacctttct atccc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG19
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NDP52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt gaaacagtct ctctctgtca cccaggctgg cgtgcaatgg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG20
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FABP5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgcattgg ttcagcatca ggagtgggat gggaaggaaa gcacaataac aagaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG21
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FARP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggtttcca gtactaacaa agggaataaa aatacctcac gccacaatcc agcat
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG22
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PGF
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagaggag gagagagaag cagagaccca cagactgcca cctgtg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG23
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GDI2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgagaag gaaatcagac cagctttgga gctcttggaa ccaattgaac agaaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG24
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TAGLN2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggctgcc taccatggtc tggggcttga ggaagatgag tttgttgatt taaat
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG25
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BLVRB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacatgagg agcaaaggaa gggggcaata aatgttgagc caagagcttc aaatt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG26
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PSMB4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttacaaccgg tttcaaaccg ccactgtcac cgaaaaaggt gttgaaatag
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG27
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TACSTD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccacatat gcttgtcact gggaaagaag cctgtttcag ctgcctgaac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG28
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCEB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaaggttcg ctacactaac agctccaccg agattcctga attcccaatt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG29
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EEF1A1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaatgttt tgtggacacg ttggttttct tttttgcgtg tggcagtttt agtta
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG30
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano H3F3A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcatacgt ggagaacgtg cttaagaatc cactatgatg ggaaacattt cattc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG31
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ODC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatttgtag cttgtacaat ggcagaatgg gccaaaagct tagtgttgtg acctg
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG32
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano XRCC5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagtcacc tctgtcttca gcaccctcat aagtcgtcac taatacacag ttttg
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG33
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IGFBP3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcacttctc tgtcttctgt ttctctccca cagtgtcgcc cttccaaagg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG34
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NCL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggaggagga ggtgaccaca agccacaagg aaagaagacg aagtttgaat a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG35
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano S100A2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgccatgga tctcttgggc ccaggactgt tgatgccttt gagttttgta ttcaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG36
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagctcccc gagttggtgg aaaacgctaa actggcagat tagattttta aat
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG37
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GJA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcacccctaag aatggttctg tgtatgtgaa tgagcgggtg gtaattgtgg ctaaa
\hfill55
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG38
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GUSB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipaatgtttgga aaacagcccg tttacttgag caagactgat accacctgcg
\hfill50
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<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG39
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HSD17B1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttggagacc agccagagca acacagtgag acccccatct ctacaaaaat aaaga
\hfill55
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG40
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SFTPB
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttcaaaaa atcagcaatt ccccagcgta gtcaagggtg gacactgcac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG41
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL23A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcggcctg atggagagaa gaaggcatat gttcgactgg ctcctgatta
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG42
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CSRP2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctaactcg taggaagaga gcactgtatg gtatcctttt gctttattca ccagc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG43
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CXADR
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctgttgtg tgatcaaaca tgtctctgtg tagttccagc aaatcaagct gagct
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG44
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EEF1G
\newpage
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggaacca acaatagcag ctccatttct ggagtctggg tcttccgagg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG45
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CKS2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcatgagct gtattcttca cagcaacaga gctcagttaa atgcaactg caagt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG46
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano COL4A6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaatggca tatggtccta gacaaaccat ctcctccttg ccggctcccc c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG47
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CRYAB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgtcaccg cagcccccaa gaaatagatg ccctttcttg aattgcattt tttaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG48
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CYC1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagctc tgggccctcc ttcagccccc atcatgggaa taaattaatt ttctc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG49
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FNTB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactcctcc ctatcatgta ccgtgaaaac cccctctgat ggcctcaagg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG50
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GOT1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagatcaag ttgtctgaag gagccaaagt gtgaatgtgg gtgtcggctg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG51
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LGALS7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggttcct cccaatgcca gcaggttcca tgtaaacctg ctgtgc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG52
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SERPINB5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatagctg tcccatctgg tcatgtggtt ggcactagac tggtggcagg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG53
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PSMC5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaaaaattg ctgagctcat gccaggagca tcaggggctg aagtgaaggg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG54
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgtggca aactgaccaa gcccaaacct caagcagaat ctaagaagaa gaaaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG55
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RBBP8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaaggagc agaagacata gacgttgaaa cagaaacaga aggatgaagg acagt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG56
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RGS1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccctcaga actgggaagg ccaggtaact ctagttacac agaaactgtg actaa
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG57
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RXRA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttcgagtaa tttttaaagc cttgctctgt tgtgtcctgt tgccggctct
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG58
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SDHD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttggagtg cttctgaata tacagaagtt ccatttaagg gcaagtttcc ccgt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG59
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SEPW1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcaagggg aagccaagag aggcatcagg atgggtgggt ttctgattgt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> SG60
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SSBP1
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<212> DNA
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<221> Sonda
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<223> SG61
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TEGT
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG62
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HIST1H2BN
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG63
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BECN1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG64
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ANXA7
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG65
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NDUFAl
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG66
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ARHGEF2
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG67
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano C5orf13
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<211> 52
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG68
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano XBP1
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG69
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano G1P2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG70
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GLUD1
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG71
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano S100A2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG72
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LASP1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 73
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG73
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TIA-2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG74
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PGRMC1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG75
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ZFPL1
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 76
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG76
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAP4K1
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG77
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano STAT1
\newpage
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<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG78
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HNRPH3
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<210> 79
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<211> 53
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG79
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TMEM4
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\hfill53
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<210> 80
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<211> 51
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG80
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KIAA0247
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<210> 81
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG81
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RISl
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipgtggcctggt gggcgtttct tcttgtactt atgtggtttt ttggctttta ataca
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<210> 82
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<211> 53
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG82
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ARS2
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\hskip-.1em\dddseqskiptcttcaacaa gcatgcagag aaaattgagg aagtgaaaaa ggaagtcgcg ttt
\hfill53
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<210> 83
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG83
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CAl2
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcatccactgg ctgaatgatc agggaggcat agcagtgaga gccataggtc
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<210> 84
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG84
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EEF1B2
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\hfill55
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<210> 85
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG85
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TRIB2
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\hfill55
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<210> 86
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG86
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FLJ22169
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG87
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ASNS
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<400>
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\hfill50
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<210> 88
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG88
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano WBSCR20C
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<210> 89
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<211> 51
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG89
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano AKR1A1
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<400>
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\hfill51
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<210> 90
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG90
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SPRRIA
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcgggtgcatt tgaggatgga tttggggagg gatcaagtga accatcccta gtctt
\hfill55
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<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG91
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EFNB1
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipattaatgtct taattggctg ttgcctgggg aacaggagag ctgctgcagg
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG92
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPS5
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<400>
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\hfill50
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<210> 93
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<211> 51
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG93
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPS9
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgctggattg tctcgttttc ctgccaaata aacaggatca gcgctttaaa a
\hfill51
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<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG94
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL17
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill55
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<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG95
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ETS2
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgcctca atacccacaa aagaccattc ccagtataca taagcacagg atgtt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG96
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF4B
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG97
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ZYX
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptttgatgtct agcccctccc atttccaacc cctccctagc atcccaggtg
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG98
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano XPO6
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcggacagtcc tttctccagc ccgacatcca cctttttaaa caaaatctct tctac
\hfill55
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<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG99
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LOC285148
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcaatacgt agaggtacgc ttttttcctc aggcttaaac ctttgccact gatat
\hfill55
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG100
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano C21orf33
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipaataaacgcc ttcccaaaat ggcaacttcc cacagccaca tttcagacct
\hfill50
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<210> 101
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG101
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EEF1D
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtcgata tcgcagcttt caacaagatc tgaagcctga gtgtgtgtac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
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<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG102
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PABPC1
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<400>
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactacaagc ccaccaagct aaagaggctg cccagaaagc agttaacagt g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG103
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RBBP6
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipgccagctcag cagaaagtca ggacagcaag aagaagaaga aaaagaagga aaaga
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG104
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HRAS
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptttgaggaca tccaccagta cagggagcag atcaaacggg tgaaggactc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG105
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GGA3
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskiptactccaagc ctccgtcaca aaaaaaaaat caccagctgc catagacacg
\hfill50
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<210> 106
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<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG106
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CFL1
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<210> 107
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<212> DNA
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<220>
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<223> SG107
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF3S2
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<210> 108
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG108
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KRT18
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG109
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IGFIR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG110
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL8
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG111
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IRF1
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<210> 112
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG112
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IRF2
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<400>
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<210> 113
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG113
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LYN
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<210> 114
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG114
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LYZ
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<400>
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<210> 115
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG115
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NFKBIA
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<400>
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<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG116
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAZ
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagccctgg tcttgtcttt tcatccctct tccccacgac agaagaagtt
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG117
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD79A
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<400>
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<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG118
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MCM3
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggaaatgc ctcaagtaca cactccaaag acggcagact cacaggagac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG119
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MEIS1
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG120
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PRTN3
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<210> 121
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG121
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MMP2
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<210> 122
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG122
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MMP7
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<210> 123
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG123
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MMP8
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipttaccagagt tgcaagaggc aataaatggc ttaactgtag atatggctga
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG124
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DOK1
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\hskip-.1em\dddseqskipcctggtactg caactggcag tggcatcaaa agccacaact cagccctgta
\hfill50
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<210> 125
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<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG125
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PDGFA
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipccgctgtctg caagaccagg acggtcattt acgagattcc tcggagtcag
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG126
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PRL
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatctcaa gctcctgaag tgccgaatca tccacaacaa caactgctaa
\hfill50
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<210> 127
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG127
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RAF1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipctattggtga tagtggagtc ccagcactac cttctttgac tatgcgtcgt
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<210> 128
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG128
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RARE
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptcagtggatt gacccaaacc gaatggcagc atcggcacac tgctcaatca
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG129
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano OPRD1
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<210> 130
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<212> DNA
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<223> SG130
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RET
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<210> 131
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG131
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SREBF1
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<210> 132
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNF
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<210> 133
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG133
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TERF1
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<210> 134
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG134
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano VCAM1
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<210> 135
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG135
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ATP5O
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<210> 136
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG136
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFSF5
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<210> 137
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG137
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano POLR2C
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG138
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PLA2G6
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipagctcagccc ccaccgatca gcctaaacaa cctagaacta caggatctca
\hfill50
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<210> 139
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG139
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCT6A
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG140
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PDHA1
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\hskip-.1em\dddseqskipccacagacca tctcatcaca gcctaccggg ctcacggctt tactttcacc
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<210> 141
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG141
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LADH
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcggaataaag gatgatgtct tccttagtgt tccttgcatt ttgggacaga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 142
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG142
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SNRPB
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<210> 143
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG143
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SNRPB
\newpage
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG144
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano H2AFX
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<210> 145
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG145
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MRPL37
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG146
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano UBE2C
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG147
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPS3
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\hfill50
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<210> 148
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<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG148
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ALDHIA1
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\hfill50
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<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG149
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano AFlq
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipgcagaccagg agaaaaaccc tgaaggtgat ggcctccttg agtacagcac
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG150
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RUNX1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 151
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG151
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MYBL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipatgggaagac agaagaccaa cttattatga ctgaacaagc aagaagatat
\hfill50
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<210> 152
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG152
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ANXA6
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ALK
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MNDA
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gen humano APAF1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BIRC3
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ABCC6
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ATIC
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ATM
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<223> SG160
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BAX
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG161
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCND1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG162
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG163
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL3
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG164
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL6
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG165
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL7A
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<223> SG166
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL7b
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG167
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL10
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<221> Sonda
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<223> SG168
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL2L1
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<223> SG169
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCR
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG170
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG171
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano OLIG2
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\hskip-.1em\dddseqskipcaactacatc ctcatgctca ccaactcgct ggaggagatg aagcgactgg
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<210> 172
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG172
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BIK
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<210> 173
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG173
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BCL2LAA
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG174
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BMI1
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\hskip-.1em\dddseqskipcaatagacct cgaaaatcat cagtaaatgg gtcatcagca acttcttctg
\hfill50
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<210> 175
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<221> Sonda
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<223> SG175
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BLMH
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gen humano BLR1
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gen humano IBSP
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gen humano BTG1
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gen humano ABL1
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gen humano CASP1
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gen humano CASP3
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<223> SG183
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gen humano CASP4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG184
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CASP5
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG185
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CASP6
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG186
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CASP7
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG187
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CASP8
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG188
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CASP9
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG189
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CBFB
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG190
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CALD1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG191
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CAST
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<223> SG192
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDC25A
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG193
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDC25B
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG194
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD2
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG195
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD3E
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG196
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD4
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG197
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD5
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<210> 198
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG198
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD6
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<212> DNA
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD7
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<210> 200
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG200
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD8
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<400>
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<210> 201
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> SG201
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD9
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MME
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<210> 203
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG203
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGAL
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\hskip-.1em\dddseqskiptgcctgaagc ccctccatga gaaggactct gagagtggtg gtggcaagga
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<210> 204
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG204
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGAM
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<400>
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<210> 205
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG205
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGAX
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<400>
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<210> 206
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG206
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ANPEP
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipagccctggag aagacgaaag ccaacatcaa gtgggtgaag gagaacaagg
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<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG207
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD14
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 208
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG208
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SELE
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipaattgggctc ctgcacacag tggcccgcta caagttctac ctggctttcg
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<210> 209
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG209
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FCGR3A
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgaagacaa acattcgaag ctcaacaaga gactggaagg accataaatt
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG210
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FCGR3B
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttggtgat ggtactcctt tttgcagtgg acacaggact atatttctct
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG211
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGB2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgataatcccc ttttcaagag cgccaccacg acggtcatga accccaagtt
\hfill50
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<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG212
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD19
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\hskip-.1em\dddseqskipactccattcg gggccagcct ggacccaatc atgaggaaga tgcagactct
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<210> 213
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG213
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MS4A1
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipctccccaaga tcaggaatcc tcaccaatag aaaatgacag ctctccttaa
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<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG214
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CR2
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcatttagaag cacgagaagt atattctgtt gatccataca acccagccag
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<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG215
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD22
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipacgtcattcc agattttcca gaagatgagg ggattcatta ctcagagctg
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG216
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FCER2
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\hskip-.1em\dddseqskipactccgggag gaggtgacaa agctaaggat ggagttgcag gtgtccagcg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG217
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD24
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagccagtct cttcgtggtc tcactctctc ttctgcatct ctactcttaa
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG218
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL2RA
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\hskip-.1em\dddseqskipctgctgagag cgtctgcaaa atgacccacg ggaagacaag gtggacccag
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<210> 219
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG219
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DPP4
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\hskip-.1em\dddseqskipgacaaccttg accattacag aaattcaaca gtcatgagca gagctgaaaa
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<210> 220
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG220
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGB1
\newpage
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaaaatga atgccaaatg ggacacgcaa gaaaatccga tttacaagag
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG221
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF8
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipagacggtcac caagccccag gatatggctg agaaggacac cacctttgag
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD33
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD34
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD36
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD38
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<223> SG226
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF5
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SPN
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<212> DNA
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD44
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<210> 229
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG229
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD44v6
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<210> 230
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG230
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTPRCCD
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<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG231
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD47
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG232
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGA2
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<210> 233
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG233
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGA3
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG234
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGA4
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<210> 235
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG235
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGA5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG236
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ICAM3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG237
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDW52
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG238
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ICAM1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG239
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NCAM1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG240
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD58
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\hskip-.1em\dddseqskipcatcaatcat tttgacaacc tgtatcccaa gcagcggtca ttcaagacac
\hfill50
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Sonda
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<223> SG241
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD59
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\hfill50
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<210> 242
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG242
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SELL
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG243
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD79B
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\hskip-.1em\dddseqskipgccacctatg aggacatagt gacgctgcgg acaggggaag tgaagtggtc
\hfill50
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<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG244
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD81
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcaaggag gactgccacc agaagatcga tgacctcttc tccgggaagc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
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gen humano KAI1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD83
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD86
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF6
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFSF6
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gen humano SLC7A5
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gen humano SDC1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDK4
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano STAT3
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<223> SG254
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FGR
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<223> SG255
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FOS
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<223> SG256
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCNE1
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<223> SG257
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDA
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<223> SG258
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAFB
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<223> SG259
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MPL
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MYC
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MYB
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<223> SG262
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CKMT1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG263
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CREBBP
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG264
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CTGF
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<223> SG265
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CXCR3
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG266
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CXCR4
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG267
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCNA1
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\hskip-.1em\dddseqskipgcaatcatgt accctggatc ttttattggg ggctggggag aagagtatct
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<210> 268
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gen humano CCNB1
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<223> SG269
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCND2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CYP1A1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CYP2A6
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DAD-1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF10C
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DEK
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG275
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DCK
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG276
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DHFR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG277
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCF3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG278
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano E2F1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG279
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCF3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG280
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EB-1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG281
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCR7
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG282
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EBI2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG283
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MUC-1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG284
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EphA3
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<210> 285
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG285
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EPOR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG286
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERCC1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG287
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERCC2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG288
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERCC3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG289
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERCC5
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG290
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERCC6
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<210> 291
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CUZD1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ETV6
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF4E
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF5A
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EZH2
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<221> Sonda
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gen humano FADD
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<212> DNA
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<221> Sonda
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<223> SG297
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTK2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG298
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FAT
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<210> 299
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG299
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FGFR1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG300
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FGFR3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG301
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FHIT
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG302
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FLT3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG303
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GRIA3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG304
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FUS
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG305
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF4E
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG306
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SIAT4A
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG307
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CSF3
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG308
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CSF2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG309
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NR3C1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG310
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GSTT1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG311
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GZMA
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG312
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DNAJA1
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<210> 313
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Sonda
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<223> SG313
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HLF
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\hskip-.1em\dddseqskipgatcctgaca ccatccaggt cccagtgggt tatgagccag acccagcaga
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<210> 314
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BST2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HOXA9
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TLX1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano UHRF1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IER3
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL1B
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<221> Sonda
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<223> SG320
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL2
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<221> Sonda
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<223> SG321
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL3
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG322
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL6
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG323
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL6R
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG324
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL10
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG325
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL15
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG326
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IRF4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG327
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano JAK1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG328
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano JAK2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG329
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MKI67
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<223> SG330
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano XRCC5
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<223> SG331
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LAG3
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<221> Sonda
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<223> SG332
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LCK
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG333
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LCP1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG334
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LEPR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG335
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LMO2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG336
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LIF
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<210> 337
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LSP1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LYL1
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gen humano NFKB1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAL
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAGEA1
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<221> Sonda
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<223> SG343
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAPK10
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MBP1
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<221> Sonda
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<223> SG345
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MCL1
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<223> SG346
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MDM2
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<223> SG347
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ABCB1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG348
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ABCB4
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<223> SG349
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MEN1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG350
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CXCL9
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<223> SG351
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MLF1
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<221> Sonda
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<223> SG352
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MLL
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<223> SG353
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MMP9
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<223> SG354
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NDUFB
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<223> SG355
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MPO
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG356
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ABCC3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG357
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ABCC5
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG358
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MTCP1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG359
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MTCP1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG360
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gen humano MYOD1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MX1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NINJ1
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gen humano NPM1
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gen humano IL32
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gen humano NUMA1
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gen humano POU2F2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano POU2F2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano OGGI
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN2B
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN2A
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<223> SG371
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN2C
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN1A
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<223> SG373
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN1B
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<223> SG374
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDK5R1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TOPORS
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano P55CDC
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<223> SG377
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN1C
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TP73
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<223> SG379
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PAX5
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gen humano PBX1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG381
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PBX3
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG382
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ENPP1
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<210> 383
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG383
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PCA1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PCNA
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<210> 385
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<211> 50
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<212> DNA
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<223> SG385
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PDGFRB
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<212> DNA
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PRKCQ
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PLK1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PML
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<212> DNA
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<223> SG389
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PRAME
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<223> SG390
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PRKCI
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG391
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTEN
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG392
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTGS1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG393
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTHLH
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG394
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SPI1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG395
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PTK2B
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<210> 396
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG396
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RAD51
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG397
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RAG1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG398
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RARA
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<210> 399
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG399
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KRAS2
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<223> SG400
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RB1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG401
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano VEGF
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG402
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ZYX
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<210> 403
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG403
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD28
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<210> 404
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG404
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD28
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\hfill50
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<210> 405
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG405
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RBEP4
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\hskip-.1em\dddseqskipttctgtatca gaagacaata tcatgcaagt gtggcaaatg gcagagaaca
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<210> 406
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG406
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DDX6
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano APEX
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DPF2
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RGS1
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HMMR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG411
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano STAT5B
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG412
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BIRC5
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG413
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TAL1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG414
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NXF1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG415
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCL1A
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG416
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TRA@
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG417
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCR beta
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG418
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DNTT
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG419
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TERT
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG420
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERBB4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG421
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ERBB2
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG422
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EGFR
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<221> Sonda
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<223> SG423
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano THPO
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG424
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TIAM1
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG425
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TK1
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipggaagctctt tgccccacag cagattctgc aatgcagccc tgccaactga
\hfill50
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<210> 426
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG426
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF1A
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 427
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG427
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TOP2A
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG428
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FAIM3
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\hskip-.1em\dddseqskipaccagcctgc cgccatgatg gaggacagtg attcagatga ctacatcaat
\hfill50
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<210> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG429
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PLS3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
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gen humano TRADD
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFSF10
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TRAP 1
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gen humano THBS1
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gen humano SUMO1
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gen humano UVRAG
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano VPREB1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano WNT16
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano WT1
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<221> Sonda
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<223> SG439
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano XRCC3
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<223> SG440
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCND3
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<221> Sonda
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<223> SG441
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDK2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG442
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano p14ARF
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG443
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HELLS
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG444
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GATA2
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<221> Sonda
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<223> SG445
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GATA1
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<223> SG446
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MLLT10
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<223> SG447
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PICALM
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG448
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KIT
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG449
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL3RA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG450
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CEBPA
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG451
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ITGA6
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\hskip-.1em\dddseqskipagatccatgc tcagccatct gataaagaga ggcttacttc tgatgcatag
\hfill50
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<210> 452
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG452
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CML66
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<400>
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gen humano TRAF3
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<212> DNA
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gen humano DAPK1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MAP3K12
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gen humano PRKDC
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DNMT3B
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GSTP1
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gen humano HLA-DRA
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gen humano HOXA10
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<212> DNA
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<223> SG461
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IRFB
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG462
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ID2
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG463
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ACTB
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG464
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ACTB
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG465
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GRK4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG466
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GAPD
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG467
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GAPD
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG468
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano STAT1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG469
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano 18S rRNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG470
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TFRC
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<400>
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG471
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano 28S rRNA
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\hskip-.1em\dddseqskiptctccccttc cttggtgcct tctcggctct tgacacttag ccgctgtctc
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<210> 472
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG472
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL37A
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG473
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RPL41
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG474
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HNRPL
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\hfill50
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<210> 475
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
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<223> SG475
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ILF2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
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gen humano CANP2
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gen humano PSMA5
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gen humano MLF2
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gen humano PPP1CC
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gen humano CASC3
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gen humano KIAA0864
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gen humano TXNRD1
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gen humano PSMD7
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EIF2B2
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gen humano HLA-A
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<223> SG488
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano MCM7
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<223> SG489
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TNFRSF25
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano LGALS3
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<223> SG491
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HLA-DPA1
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gen humano PLAU
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano COL3A1
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<221> Sonda
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<223> SG494
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ANK2
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG495
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SERPINA9
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG496
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NPM3
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<223> SG497
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CCR6
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG498
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HCK
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gen humano GRB2
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gen humano BCL2A1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ELF1
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gen humano CTSB
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GCET2
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gen humano FN1
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gen humano PDCD1
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<223> SG507
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HLA-DRB3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG508
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HLA-DQA1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG509
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GCET2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SERPNINA9
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG511
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CDKN3
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG512
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ELF1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CATSD
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HSPB1
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ACTN1
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<213> Secuencia artificial
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano BMP6
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<221> Sonda
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<223> SG517
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FAM38A
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<221> Sonda
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<223> SG518
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CD48
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG519
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano IL4R
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<223> SG520
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano DRP2
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<210> 521
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG521
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano JUNB
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gen humano S100A8
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gen humano ZNFN1A1
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gen humano MERTK
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KLF13
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gen humano CBFB
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gen humano CEBPB
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gen humano CEBPD
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<223> SG529
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TFCP2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CREB1
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<223> SG531
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NFIC
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<221> Sonda
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<223> SG532
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GABPB2
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EGR1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG534
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano KLF1
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<221> Sonda
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<223> SG535
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ELF1
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gen humano ETS1
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<223> SG537
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ETS2
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<223> SG538
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano FLI1
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<213> Secuencia artificial
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<223> SG539
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano GATA3
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<223> SG540
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano CBFA2T1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG541
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HIF1A
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG542
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCF1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG543
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HOXD8
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<210> 544
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG544
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano HOXD9
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<223> Disefiada para hibridar con cRNA del
gen humano MAFB
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<212> DNA
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<223> SG546
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<223> Disefiada para hibridar con cRNA del
gen humano MAFK
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<210> 547
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano EDF1
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<212> DNA
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ELF4
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ZNF42
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NF1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG551
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano NFATC1
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<223> SG552
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PAX6
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG553
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PAX8
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG554
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PLP
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG555
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano PLZF
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG556
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano RBP4
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<210> 557
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG557
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<220>
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ROBA
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG558
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano SP1
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Sonda
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<223> SG559
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano STAT1
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG560
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TBP
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG561
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano TCF7
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<210> 562
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SG562
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<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ETV7
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<210> 563
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<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SG563
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Diseñada para hibridar con cRNA del
gen humano ZAP70
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcggaagga gcagggcaca tacgccctgt ccctcatcta tgggaagacg
\hfill50
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<210> 564
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<221> Sonda
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<223> SC1
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<223> Control negativo
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\hskip-.1em\dddseqskipggggaaagaa agatcgatga gaaagaggaa cggggattga caggaatgaa gaagg
\hfill55
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<210> 565
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SC2
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SC3
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<223> Control negativo
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<210> 567
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<211> 55
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<221> Sonda
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<223> SC4
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<223> Control negativo
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\hfill55
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<210> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SC5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgtgggga ggggttgttt tggggttgtt tttgtttttt cttgccaggt agat
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 569
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SC6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctctctct ctctctctct ctctctgtct ctccccacct ctctcacatc ccttg
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 570
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SC7
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tggtgttgtg tgtgtttgtg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 571
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgtcaaga tgctaccgtt cagga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggccgtgaa gatatattca tcagctacca tgcgaaagac gatgtccaaa
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagccaggc aaagcggagt aactcagttc gaagtaaggg gaaaatgtcg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Da lugar a hibridación
inespecífica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttttcttc gtttatcatc accatcacca tcatcatcat catcatcatc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaggatct caaacccacc aaaccgttcc agaatcatgg accgctttcg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccaagcga gaagatactt aacaatatca acattaccat taccagcaga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 577
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN7
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccgatgc aaaaggcgga cgacaaggac tacggtctag aagctctgga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN8
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatcacc ttcaccattt ttcttcttcg ttgattctct gtttgtgttt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN9
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Da lugar a hibridación
inespecífica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctctgttt tgctcttgcc ttatccgctg cttctctctc cctctctttc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 580
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN10
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgacacga cctacaacaa tggctgcaac ggtggtctca tggactatgc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 581
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaataataa atgaagtgat gatgattgat gattgatgat tgatgattat
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 582
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN12
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgacaagt ttcgctgatt atagtggtta atgctggtct tatcttcgtc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 583
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SCN13
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control positivo de hibridación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgggcggtg cggggttgat gttgacgacg gtgtggctgc ggttgggtat
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaacgcc tacaaaagcc agtttatccc gtcaaaggat tccgtttcta
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttatacgg aagatgatga accgcttcat gccactgaat acgttgaaaa
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 586
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaccaagtg gctaaacgga ccgcagattt gtacggaaaa gaaatgcctc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacacaagcg gtttccacca tgtccacaag aaaggggagg taacaccagg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagcaaca actcaaccag caacaaaacc agtttcacag gtgtcaggac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 589
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcagattc agtagcagat gccgttcaaa aggtcgattt aagtagaagt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSPC7
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Actúa como control positivo interno
del proceso: spiked control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacttcctga tattgttgat acatgcggaa cagggggaga cggtatttcc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C8
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN8
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 595
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C12
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN12
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 597
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido antisentido
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C13
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Complementario a SCN13
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de biotina en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PSMB4_F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen PSMB4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctgggaga tggacacagc tata
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 599
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PSMB4_R
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen PSMB4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacaaaggg ttcatcttcg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CD23A_F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen CD23A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccctgaaa agtggatcaa t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 601
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CD23A_R
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen CD23A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgtcgtc acaggcatac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 602
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LCP1_F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen LCP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggtaccc ttctcgcttt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LCP1_R
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen LCP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcctggccc tcatcttgaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 604
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ABCC5_F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen ABCC5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctcaaagt ctgcaacttt aagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ABCC5_R
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen ABCC5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacaccaaa ccacacagca a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> POU2F2_F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen POU2F2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggaccagc atcgagacaa a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 607
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> POU2F2_R
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen POU2F2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccagacgc ggatcacttc
\hfill20
Claims (18)
1. Composición que comprende al menos los
oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 216 y SEQ ID
NO: 366 ó 367.
2. Composición, según la reivindicación 1, que
además comprende al menos uno o la totalidad de los
oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 117, SEQ ID
NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO:
293 ó 305, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 333, SEQ ID
NO: 343, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO:
555 y SEQ ID NO: 556.
3. Composición, según la reivindicación 1, que
además comprende los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 117,
SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 507 y SEQ ID NO:
508.
4. Composición, según la reivindicación 3, que
además comprende los oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 461 y
SEQ ID NO: 493.
5. Composición, según la reivindicación 3, que
además comprende el oligonucleótido de SEQ ID NO: 237.
6. Composición, según las reivindicaciones 1 a
5, que comprende la totalidad de los oligonucleótidos del grupo:
SEQ ID NO: 1-462, 465, 468-563.
7. Composición, según las reivindicaciones 1 a
6, que además comprende la pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO:
463 y SEQ ID NO: 464 y/o la pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO:
466 y SEQ ID NO: 467.
8. Composición, según las reivindicaciones 1 a
6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los
oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 584-590.
9. Composición, según las reivindicaciones 1 a
6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los
oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID
NO: 576, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582 y SEQ ID
NO: 583.
10. Composición, según las reivindicaciones 1 a
6, que además comprende al menos uno o la totalidad de los
oligonucleótidos del grupo: SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 575, SEQ ID
NO: 577, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO:
566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569 y SEQ ID NO:
570.
11. Microarray que comprende la composición de
las reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso del microarray de la reivindicación 11
para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de la evolución
de neoplasias originadas a partir de células hematopoyéticas,
preferentemente leucemia linfática crónica.
13. Método in vitro para el diagnóstico
y/o pronóstico de neoplasias originadas a partir de células
hematopoyéticas, preferentemente leucemia linfática crónica, que
comprende la estimación del nivel de expresión de al menos el grupo
de genes comprendido por: PSMB4, FCER2 o CD23A y POU2F2 empleando
la composición de la reivindicación 1.
14. Método, según la reivindicación 13, que
además comprende la estimación del nivel de expresión del al menos
uno, o de la totalidad, de los genes: ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CDS,
MS4A1, EIF4E, FHIT, NR3C1, LCP1, MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF
y RBP4 empleando la composición de la reivindicación 2.
15. Método, según la reivindicación 13, que
además comprende la estimación del nivel de expresión del grupo de
genes: CD79A, FAIM3, HLA-DRA,
HLA-DRB3 y HLA-DQA1 empleando la
composición de la reivindicación 3.
16. Método, según la reivindicación 15, que
además comprende la estimación del nivel de expresión de al menos
los genes IRF8 y COL3A1 empleando la composición de la
reivindicación 4.
17. Método, según la reivindicación 15, que
además comprende la estimación del nivel de expresión de al menos
el gen CDW52 empleando la composición de la reivindicación 5.
18. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 13-17, comprende la estimación del
nivel de expresión grupo de genes: 18S rRNA, PSMB4, FCER2 o CD23A,
POU2F2, ODC1, CD79A, CD2, CD3E, CDS, MS4A1, FHIT, NR3C1, LCP1,
MAPK10, ABCC5, XRCC3, CML66, PLZF, RBP4, CEBPD, FAIM3,
HLA-DRA, HLA-DRB3,
HLA-DQA1, IRF8, COL3A1, CDW52, GABARAP,
IGLV6-57, PCD, NCALD, DLAD, SOSTDC1,
TIA-2, PYGB, LIMS1, ABL1, DRG1, BRMSI, ABHD1,
IFRD1, RPL36A, IGFBP2, NDRG1, FKBP9, NDP52, FABP5, FARP1, PGF,
GDI2, BLVRB, TACSTD2, TCEB1, EEF1A1, H3F3A, IGFBP3, NCL, RPL24,
GJA1, GUSB, HSD17B1, SFTPB, RPL23A, CSRP2, CXADR, EEFIG, CKS2,
COL4A6, CRYAB, CYC1, FNTB, GOT1, LGALS7, SERPINBS, PSMC5, PTN,
RBBP8, RXRA, SDHD, SEPW1, SSBP1, TEGT, HISTIH2BN, BECN1, ANXA7,
NDUFA1, ARHGEF2, C5orfl3, XBP1, GIP2, GLUD1, S100A2, LASP1, PGRMCI,
ZFPL1, MAP4K1, HNRPH3, TMEM4, KIAA0247, RIS1, ARS2, CAl2, EEF1B2,
TRIB2, FLJ22169, ASNS, WBSCR20C, AKR1A1, SPRR1A, EFNB1, RPS5, RPS9,
RPL17, EIF4B, ZYX, XPO6, LOC285148, C21orf33, EEF1D, PABPC1, RBBP6,
HRAS, GGA3, CFL1, EIF3S2, KRT18, IGFIR, ILB, IRF1, IRF2, LYN, LYZ,
NFKBIA, MAZ, MCM3, MEIS1, PRTN3, MMP2, MMP7, MMP8, DOK1, PDGFA,
PRL, RAF1, RARB, OPRD1, RET, SREBF1, TNF, TERF1, VCAM1, ATPSO,
TNFSF5, POLR2C, PLA2G6, CCT6A, PDHA1, LADH, SNRPB, H2AFX, MRPL37,
UBE2C, RPS3, ALDHIA1, AF1q, RUNX1, MYBL1, ANXA6, ALK, MNDA, APAF1,
BIRC3, ABCC6, ATIC, ATM, BAX, CCND1, BCL2, BCL3, BCL6, BCL7A,
BCL7b, BCL10, BCL2L1, BCR, OLIG2, BIK, BCL2LAA, BMI1, BLMH, BLR1,
IBSP, BTG1, BUB1, CASP1, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8,
CASP9, CBFB, CALD1, CAST, CDC25A, CDC25B, CD4, CD6, CD7, CD8, CD9,
MME, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ANPEP, CD14, SELE, FCGR3A, FCGR3B, ITGB2,
CD19, CR2, CD22, CD24, IL2RA, DPP4, ITGB1, TNFRSF8, CD33, CD34,
CD36, CD38, TNFRSF5, SPN, CD44, CD44v6, PTPRCCD, CD47, ITGA2,
ITGA3, ITGA4, ITGAS, ICAM3, ICAM1, NCAM1, CD58, CD59, SELL, CD79B,
CD81, KAI1, CD83, CD86, TNFRSF6, TNFSF6, SLC7A5, SDC1, CDK4, STAT3,
FGR, FOS, CCNE1, CDA, MAFB, MPL, MYC, MYB, CKMT1, CREBBP, CTGF,
CXCR3, CXCR4, CCNA1, CCNB1, CCND2, CYP1A1, CYP2A6,
DAD-1, TNFRSF10C, DEK, DCK, DHFR, TCF3, E2F1,
EB-1, CCR7, EBI2, MUC- 1, EphA3, EPOR, ERCC1, ERCC2,
ERCC3, ERCC5, ERCC6, CUZD1, ETV6, EIF4E, EIFSA, EZH2, FADD, PTK2,
FAT, FGFR1, FGFR3, FLT3, GRIA3, FUS, SIAT4A, CSF3, CSF2, GSTT1,
GZMA, DNAJA1, HLF, BST2, HOXA9, TLX1, UHRF1, IER3, ILIB, IL2, IL3,
IL6, IL6R, IL10, IL15, IRF4, JAK1, JAK2, MKI67, XRCC5, LAG3, LCK,
LEPR, LMO2, LIF, LRP, LSP1, LYL1, NFKB1, MAL, MAGEA1, MBP1, MCL1,
MDM2, ABCB1, ABCB4, MEN1, CXCL9, MLF1, MLL, MMP9, NDUFB, MPO,
ABCC3, MTCP1, MYOD1, MX1, NINJ1, NPM1, IL32, NUMA1, OGGI, CDKN2B,
CDKN2A, CDKN2C, CDKN1A, CDKN1B, CDK5R1, TOPORS, P55CDC, CDKN1C,
TP73, PAX5, PBX1, PBX3, ENPP1, PCA1, PCNA, PDGFRB, PRKCQ, PLK1,
PML, PRAME, PRKCI, PTEN, PTGS1, PTHLH, SPI1, PTK2B, RAD51, RAG1,
RARA, KRAS2, RBI, VEGF, CD28, RBBP4, DDX6, APEX, DPF2, RGS1, HMMR,
STAT5B, BIRC5, TALI, NXF1, TCL1A, TRA@, TCRbeta, DNTT, TERT, ERBB4,
ERBB2, EGFR, THPO, TIAM1, TK1, TNFRSF1A, TOP2A, PLS3, TRADD,
TNFSF10, TRAP1, THBS1, SUMO1, UVRAG, VPREB1, WNT16, WT1, CCND3,
CDK2, p14ARF, HELLS, GATA2, GATA1, MLLTIO, PICALM, KIT, IL3RA,
CEBPA, ITGA6, TRAF3, DAPK1, MAP3K12, PRKDC, DNMT3B, GSTP1, HOXA10,
ID2, GRK4, STAT1, TFRC, RPL37A, RPL41, HNRPL, ILF2, TAGLN2, CAPN2,
PSMA5, PMM1, MLF2, PPP1CC, CASC3, KIAA0864, TXNRD1, PSMD7, EIF2B2,
HLA-A, MCM7, TNFRSF25, LGALS3,
HLA-DPA1, PLAU, ANK2, SERPINA9, NPM3, CCR6, HCK,
GNL3, GRB2, BCL2A1, ELF1, CTSB, GCET2, FN1, PDCD1, CDKN3, CATSD,
HSPB1, ACTN1, BMP6, FAM38A, CD48, IL4R, DRP2, JUNB, S100A8, ZNFNIA1,
MERTK, KLF13, CEBPB, TFCP2, CREB1, NFIC, GABPB2, EGR1, KLF1, ETS1,
ETS2, FLI1, GATA3, CBFA2T1, HIF1A, TCF1, HOXD8, HOXD9, MAFK, EDF1,
ELF4, ZNF42, NF1, NFATC1, PAX6, PAX8, PLP, RORA, SP1, TBP, TCF7,
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