BRPI0617775B1 - sistema de liberação de medicamento particulados e seu processo de produção - Google Patents

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Petereit Hans-Ulrich
Stickler Manfred
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Windhab Norbert
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Abstract

<b>sistemas de liberação de fármaco<d>a presente invenção refere-se a novos sistemas de liberação de medicamento particulados com base em um suporte polimérico contendo pelo menos um polímero linear, ramificado ou reticulado em uma fração de mais de 50 por cento em peso em relação ao peso total do suporte. o siste- ma é caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substância de sinal para o transporte através de uma barreira biologia e pelo menos um ingredi- ente são armazenados, o suporte, a substância de sinal e o ingrediente não tendo nenhuma ligação covalente e nenhuma ligação coordenativa específi- ca do ingrediente e específica da substância de sinal entre um com o outro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMA DE LIBERAÇÃO DE MEDICAMENTO PARTICULADOS E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO.
A presente invenção refere-se a novos sistemas de liberação de fármacos baseados em veículos poliméricos, em particular veículos ramificados, reticulados ou dendríticos que compreendem tanto pelo menos um ingrediente ativo quanto pelo menos uma substância de sinal, onde o veículo, ingrediente ativo e substância de sinal não são especificamente ligados entre si ou juntamente complementares.
Um dos maiores problemas no tratamento médico de doenças é representado pelo transporte direcionado de ingredientes ativos para dentro do sítio alvo doente, isto é, dentro de um tecido, um órgão ou dentro das células apropriadas. As membranas são neste contexto as barreiras mais importantes que protegem o sítio alvo (sítio de ação) das substâncias ativas a serem transportadas. Um outro problema é a degradação ou derivatização dos ingredientes ativos livres no corpo. Uma tal metabolização reduz ou muitas vezes bloqueia um efeito farmacológico direcionado dos ingredientes ativos no sítio alvo. Além disso, os ingredientes ativos incorretamente distribuídos ou alterados podem, especialmente se eles tiverem toxicidade local ou sistêmica, conduzir a efeitos secundários indesejáveis no organismo.
Um caminho que já foi tentado para evitar estas desvantagens é a produção de formulações de ingrediente ativo particuladas, onde o ingrediente ativo está presente ligado em uma estrutura ou matriz polimérica (Nishiyama et al., Drug Discovery Today: Technologies (2005), 2(1), 21-26. Publisher: Elsevier B.V.). Geralmente é possível a este respeito distinguir veículos de volume puros em que o ingrediente ativo é fechado em um tipo de vesícula recipiente polimérica de veículos poliméricos quimicamente funcionalizados na qual os ingredientes individuais, por exemplo, ingredientes ativos ou substâncias de sinal, são quimicamente ligados ao veículo funcionalizado (tipo matriz).
O transporte do ingrediente ativo para dentro do tecido doente ocorre no caso de simples formulações de veículo/ingrediente ativo mediante a simples liberação e difusão (equilíbrio). A fim de melhorar a orientação dos
Petição 870190067393, de 17/07/2019, pág. 11/19 /9 ingredientes ativos particulares para o alvo, freqüentemente as substâncias de sinal são ligadas covalentemente ou pela coordenação com o ingrediente ativo ou com o veículo, em cujo caso a substância de sinal se liga especificamente às membranas celulares do tecido doente e inicia a absorção en5 docitótica descrita do ingrediente ativo dentro da célula (por exemplo, WO 2005/084158, WO 2004/072153, Pitard, B. et al., Proceedings of the Nationál Academy of Sciences of the United States of América (1999), 96(6), 26212626).
Embora seja possível mediante a ligação das substâncias de sinal que iniciam a absorção endocitótica do ingrediente ativo ou do sistema de transporte particulado para melhorar a orientação do ingrediente ativo ao alvo em comparação com a absorção puramente difusional, novos proble'< mas também são gerados pela funcionalização química do veículo e pela ligação, covalentemente ou por coordenação, da substância de sinal com o ingrediente ativo.
Assim, em particular, a otimização dos ingredientes farmacêuticos ativos é necessária em relação à sua absorção, distribuição, metabolismo e excreção (parâmetros ADME) e em relação ao seu efeito e toxicidade. A ligação de uma substância sinal com o ingrediente ativo freqüentemente altera estas propriedades, e o ingrediente ativo pode assim ser restrito na sua capacidade de utilização farmacêutica ou mesmo se torna inútil. A ligação de um ingrediente ativo a um veículo funcionalizado geralmente dá origem a problemas similares. Além disso, o veículo, substância de sinal e ingrediente ativo freqüentemente requerem funcionalização extra adequada de modo a tornar a ligação específica apropriada possível. Tais veículos e substâncias de sinal quimicamente funcionalizadas conseqüentemente permitem apenas combinações de veículo restrito, substância de sinal, ingrediente ativo. Além do mais, estes sistemas de liberação de fármaco são complicados para se produzir, e o ingrediente ativo deve, se for covalentemente ligado ou pela coordenação à substância de sinal ou ao veículo, geralmente ser quimicamente liberado no sítio alvo. A ligação, covalentemente ou pela coordenação, de uma substância de sinal ou veículo além do mais resulta em um no vo ingrediente ativo químico que requer teste clínico elaborado.
O objetivo da presente invenção seria agora fornecer novos sistemas de liberação de fármaco que tornam o transporte direcionado de ingrediente ativo através de barreiras biológicas possível e que eliminam pelo menos alguns dos problemas mencionados.
Foi surpreendentemente observado neste contexto que é suficiente utilizar sistemas de liberação de fármaco particulados baseados em um veículo polimérico ramificado ou reticulado que não são especificamente agregados tanto com os ingredientes ativos respectivamente empregados quanto com as substâncias de sinal utilizadas, sem a necessidade de ligação, covalentemente ou pela coordenação, da substância de sinal com o ingrediente ativo ou com o veículo.
Embora os modelos endocitóticos e difusores que foram debatidos até esta data não tenham sido capazes de explicar o transporte de ingrediente ativo através das membranas biológicas sem contradição, foi tacitamente assumido até esta data que uma ligação específica deve existir entre o ingrediente ativo e a substância de sinal iniciadora do transporte e entre a substância de sinal e as outras unidades de fusão ou entre a substância de sinal e o veículo contendo ingrediente ativo com relação ao transporte endocitótico de um ingrediente ativo através de uma membrana celular, havendo transporte dentro da célula no primeiro caso diretamente do ingrediente ativo e no segundo caso do veículo com o ingrediente ativo. No entanto, de acordo com a presente invenção, um tal acoplamento químico específico é precisamente desnecessário. Este transporte de ingrediente ativo podería, neste caso, ser imputável a um mecanismo anteriormente desconhecido para a absorção celular de ingredientes ativos (figura 1).
Assim, a presente invenção refere-se a um sistema de liberação de fármaco com base em um veículo polimérico, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substância de sinal para o transporte através de uma barreira biológica e pelo menos um ingrediente ativo são incluídos, com veículo, substância de sinal e ingrediente ativo não apresentando nenhuma ligação covalente uns com os outros.
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Os veículos adequados são polímeros lineares tais como, por exemplo, polilactídeos. No entanto, os veículos polimérícos preferidos compreendem pelo menos um polímero ramificado ou reticulado, porque os polímeros ramificados ou reticulados são particularmente adequados para a simples agregação da substância de sinal, ingrediente ativo e veículo. A proporção de polímeros veículos ramificados ou reticulados é de preferência mais do que 10 % em peso, em particular mais de 50 % em peso, com base no peso total do veículo.
As substâncias de sinal e ingredientes ativos estão preferivelmente neste caso presentes dispersos ou submetidos a coacervação no veículo polimérico. Particularmente adequados para este fim são os polímeros dendríticos ou altamente reticulados, e polímeros em pente. De interesse particular a este respeito são os polímeros idênticos por natureza ou isoméricos por natureza.
Os veículos particularmente preferíveis são os polímeros globulares altamente ramificados que são também referidos na literatura especializada como polímeros dendríticos. Estes polímeros dendríticos, que são sintetizados a partir de monômeros multifuncionais podem ser divididos em duas categorias diferentes, os dendrímeros e os polímeros hiperramificados. Os dendrímeros possuem uma estrutura de geração muito regular radialmente simétrica. Eles representam polímeros globulares monodispersos que, em comparação com os polímeros hiper-ramifiçados, são preparados na síntese de múltiplas etapas. A estrutura é além do mais caracterizada por três diferentes áreas:
- o núcleo polifuncional que representa o centro de simetria,
- várias camadas bem-definidas radialmente simétricas de uma unidade de repetição (geração) e
- os grupos terminais.
Em contraste com os dendrímeros, os polímeros hiperramificados são polidispersos e irregulares em termos da sua ramificação e estrutura. Além das unidades dendríticas e lineares, os polímeros hiperramificados também - em contraste com os dendrímeros - incluem unidades lineares. Um exemplo de cada dendrímero (figura 2a) e polímero hiperramificado (figura 2b), construído a partir das unidades de repetição que cada um tem três possibilidades de ligação, é retratado diagramaticamente na figura 2. Onde os polímeros dendríticos aqui utilizados possuem pelo menos 3 unidades de repetição por molécula, preferivelmente pelo menos 10 unidades de repetição por molécula e particularmente de preferência pelo menos 100 unidades de repetição por molécula e muito particularmente preferível pelo menos 200 unidades de repetição por molécula ou ainda melhor pelo menos 400 unidades de repetição por molécula, que por sua vez cada uma possui pelo menos três, preferivelmente pelo menos quatro, possibilidades de ligação, onde pelo menos 3 destas unidades de repetição, particularmente preferível pelo menos 10 e além do mais preferivelmente pelo menos 20 são cada uma ligada através de pelo menos três, preferivelmente através de pelo menos quatro, possibilidades de ligação em pelo menos três, de preferência pelo menos quatro, outras unidades de repetição. Os polímeros hiperramificados normalmente possuem um máximo de 10.000, de preferência um máximo de 5.000 e particularmente preferível um máximo de 2.500 unidades de repetição.
Em uma modalidade preferida, o polímero dendrítico altamente ramificado possui pelo menos três unidades de repetição cada uma das quais possui pelo menos três possibilidades de ligação possíveis, onde pelo menos três destas unidades de repetição possuem pelo menos duas possibilidades de ligação possíveis.
Neste contexto, o termo “unidade de repetição” preferivelmente significa uma estrutura que é continuamente repetida dentro da molécula hiper-ramificada, por exemplo, unidades lineares, dendríticas ou terminais como é definido na Seiler, Fortschritt-Berichte VDI, Series 3, No. 820 ISBN 3-18-382003-x e Gao, C. et al., Hyperbranched Polymers: from synthesis to application, Prog. Polym. Sei., 29 (2004) 183-275. O termo possibilidade de ligação de preferência significa que a estrutura funcional dentro de uma unidade de repetição com a qual se liga a uma outra unidade de repetição é possível. Em relação aos exemplos descritos acima de um polímero dendrí6 mero ou hiper-ramifiçado, a unidade de repetição é uma estrutura tendo em cada caso três possibilidades de ligação (X, Y, Z):
Z
X— y
A ligação das unidades de ligação individuais umas com as ou5 tras pode ocorrer pela polimerização de condensação, pela polimerização de radicais livres, pela polimerização aniônica, pela polimerização catiônica, pela polimerização de transferência de grupo, pela polimerização de coordenação, pela polimerização de abertura de anel ou pela polimerização enzimaticamente catalisada.
Os dendrímeros particularmente preferidos são os dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) Starbust®, dendrímeros de polipropilenoimina, dendrímeros com base em óxido de polietileno, dendrímeros de poliéter, dendrímeros revestidos PAMAM, por exemplo, com revestimento de polilactídeo-co-glicolídeo, dendrímeros de polilisina, incluindo dendrímeros de poli15 lisina-bloco-PEG-bloco-polilisina, éteres poliarílicos. Tais dendrímeros preferidos são descritos, por exemplo, em Frechet, J.M.J. et al., Dendrimers and Other Dendritic Polymers, John Wiley & Sons Ltd., West Sussex, UK (2001); Malik, N. et al., Journal of Controlled Release 65, (2000), 133-148; Frey, H. et al., Reviews in Molecular Biotechnology 90 (2002) 257-267; Jikei, M. et al., 20 Hyperbranched Polymers: a promising new class of materiais, Prog. Polym.
Sei., 26 (2001), 1233-1285.
Os polímeros veículos lineares ou hiper-ramificados que são preferíveis neste contexto são poliésteres, polieste ram idas, poliéteres, polyamidas, polietilenoiminas, poligliceróis, poliglicolídeos, polilactídeos, polilac25 tídeo-co-glicolídeos, politartratos e polissacarídeos. Os polímeros particularmente preferidos entre estes são os poliésteres hiper-ramificados já disponíveis comercialmente sob o nome comercial Boltorn® da Perstorp AB, como poliesteramidas hiper-ramifiçadas obtidas sob o nome comercial Hybrane® da DSM BV Niederlande, os poligliceróis produzidos por Hiperpolímeros 30 GmbH, e as polietilenoiminas hiper-ramificadas obtidas como Polyimin® da
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BASFAG.
Outros polímeros veículos ramificados preferidos são policaprolactonas, copolímeros tais como poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeos) e os compostos de poliéster produzidos pela Degussa AG das famílias de produto 5 Dynapol®S e Dynacoll®.
Os polímeros dendríticos particularmente preferidos são polímeros tendo uma massa molar entre 1000 g/mol e 2.000.000 g/mol, particularmente preferível entre 2000 g/mol e 700.000 g/mol e muito particularmente preferível entre 6000 g/mol e 100.000 g/mol, um ponto de fusão de preferên10 cia entre 0 9C e 150 QC e/ou uma viscosidade em fusão dos polímeros veículos preferidos de menos do que 3,0 Pas, preferivelmente menos do que 2,5 Pas, em particular menos do que 2,0 Pas, medido a 80 °C. Os veículos poliméricos hiper-ramificados possuem, além disso, em particular, um grau de ramificação entre 20 % e 100 %, de preferência entre 30 % e 70 % e/ou um 15 número hidróxi entre 10 mg de KOH/g e 600 mg de KOH/g. O grau de ramificação dos dendrímeros está preferencialmente entre 25 % e 75 %.
Outros polímeros veículos preferidos são homo- ou heteropolímeros ramificados ou reticulados de carboidratos (polissacarídeos), de aminoácidos naturais e artificiais; de ácidos nucleicos naturais e artificiais; de 20 poliaminas, de poliésteres; de poliéteres; de polióis, em particular álcoois polivinílicos, de poliolefinas, em particular de poliisoprenos, polietilenos, polipropilenos, polibutadienos ou poliestirenos; de polialquilenos glicóis, em particular de polietilenos glicóis, de poliam idas, de poliacetais, de poliacrilatos; de poliacetatos, em particular de acetatos de polivinila; de poliuretanos; de 25 polímeros de organossilício tais como, por exemplo, silicones, de resinas epóxi, de politióis ou de policarbonatos.
Outros veículos poliméricos preferidos são biocompatíveis e enzimaticamente degradáveis com um atraso. Referência especial deve ser feita neste contexto de polímeros veículos ramificados ou reticulados enzi30 maticamente degradáveis do grupo de policaprolactonas, poliglicolídeos, polilactídeos, polilactídeo-co-glicolídeos, politartratos ou poliésteres. Os polissacarídeos ramificados ou reticulados baseados em celulose, pectina, ami8 lopectina ou dextranos são particularmente preferidos.
Os polímeros veículos reticulados particularmente preferidos são hidrogéis, especialmente hidrogéis dendríticos tais como aqueles descritos, por exemplo, em Rueda, J.C., et af., Macromol. Chem. Phys. 2003, 204, 947-953; Hatice, K.C. et al., published online 24 October 2003 in Wiley InterScience DOI 10.1002/app.13125; Knischka, R. et al., Polymeric Materiais: Science & Engineering 2001,84, 945.
Os veículos poliméricos utilizados em uma forma de realização particularmente preferida são deixados sempre que possível no estado natural ou quase natural e em particular não são ainda funcionalizados ou derivatizados. Por um lado, é possível desta maneira assegurar que nenhuma reação química indesejada prosseguirá com os ingredientes ativos ou as substâncias de sinal, assim possivelmente alterando seu perfil de propriedade farmacológica, e, por outro lado, o risco de uma reação alérgica ao sistema de liberação de fármaco é desta maneira minimizado.
Em uma modalidade preferida, os polímeros ramificados ou reticulados possuem um teor de pelo menos 50 % em peso, preferivelmente mais do que 75 % em peso, com base no peso total do veículo. É adicionalmente possível misturar outros polímeros, em particular também polímeros não ramificados não reticulados das classes poliméricas recentemente mencionadas, com o veículo. Em uma modalidade particularmente preferida, os polímeros exclusivamente ramificados ou reticulados são empregados como veículo.
A proporção do veículo no sistema de liberação de fármaco reivindicado está preferivelmente entre 30 % em peso e 99,5 % em peso, de preferência entre 50 % em peso e 98 % em peso, com base no peso total do sistema de liberação de fármaco particulado. Onde as formulações com ingredientes altamente ativos preferivelmente possuem uma proporção de mais do que 80 % em peso a 99,5 % em peso, em particular entre 90 % em peso e 99 % em peso, de veículo. As formulações com ingredientes ativos costumeiros em contrapartida possuem uma proporção preferida de 55 % em peso a 94,5 % em peso, particularmente preferível entre 65 % em peso e % em peso, de veículo.
As substâncias de sinal significam no contexto da presente invenção todas as substâncias que são capazes de iniciar um transporte direcionado de um ingrediente ativo através de uma barreira biológica. Por isto são dispostos em particular peptídeos específicos do organismo, incluindo peptídeos específicos da espécie, em particular específicos de mamífero, de preferência peptídeos específicos de ser humano, que são capazes de ter um efeito estimulante de transporte em relação à barreira biológica a ser atravessada. Estes incluem muito geralmente sinais de estímulo de todos os domínios de transdução biológicos, biomórficos ou bioanálogos (PTDs), especialmente peptídeos de ligação ao receptor, peptídeos d-análogos, anticorpos ou fragmentos de ditos peptídeos ou proteínas. As substâncias encontradas de novo (por exemplo, pesquisa Blast em bases de dados) tais como, por exemplo, haptenos, agonistas e antagonistas receptores podem, além disso, também ser empregadas como estímulo de transporte como substância de sinal. Os peptídeos de sinal conhecidos preferidos são selecionados do grupo de VP22 (proteínas do vírus da herpes simples), Antp (tendo a seqüência de aminoácido RQIKIWFQNRRMKWKK), R9 (tendo a seqüência de aminoácido RRRRRRRRR) e Tat (tendo a seqüência de aminoácido YGRKKRRQRRR).
O peptídeo de sinal preferivelmente empregado é lactoferrina, em particular lactoferrina humana ou bovina, ou um peptídeo compreendendo um fragmento de lactoferrina de pelo menos 8 aminoácidos constitutivos, com o dito peptídeo atuando como peptídeo penetrante de célula (CPP).
Em uma modalidade preferida, os ditos peptídeos de sinal compreendem pelo menos quatro aminoácidos catiônicos. Os peptídeos de sinal catiônicos preferidos possuem em particular uma carga líquida positiva em valores de pH fisiológico. Em uma outra modalidade preferida, a substância de sinal empregada é um peptídeo derivado de lactoferrina, que compreende pelo menos duas cisteínas ou um análogo apropriado. Em uma forma de realização particularmente preferida, o peptídeo de sinal compreende uma ponte de dissulfeto formada dos dois resíduos de cisteína ou de uma articu lação análoga formada por um análogo de cisteína. As duas cisteínas ou seus análogos são preferivelmente separadas uma da outra por 8 a 20 aminoácidos, em particular por 14 a 18 aminoácidos, particularmente preferível por 16 aminoácidos. As duas cisteínas ou seus análogos podem diretamente formar a extremidade C-terminal e/ou N-terminal do peptídeo sinal ou ser localizadas nas imediações da extremidade C- e/ou N-terminal. Tais peptídeos de sinal estabilizados com ponte normalmente possuem uma estrutura em loop que possui uma maior estabilidade para a degradação enzimática, em particular, para a degradação de protease.
Em uma modalidade preferida, uma proteína lactoferrina humana tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID No. 1 ou uma proteína de lactoferrina bovina tendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID No. 2 é utilizada.
Em uma outra modalidade, os peptídeos de sinal derivados da lactoferrina compreendem uma região com uma conformação alfa-helicoidal, preferivelmente com um comprimento de 12 a 20 aminoácidos, ou uma região com uma conformação de lâmina beta-dobrada, de preferência com um comprimento de 8 a 12 aminoácidos. Os peptídeos de sinal particularmente preferidos possuem um motivo de lâmina de inclinação helicoidal.
Em uma outra modalidade preferida, os peptídeos de sinal derivados da lactoferrina incluem de 8 a 60 aminoácidos, de preferência de 20 a 45 aminoácidos, particularmente preferível de 18 a 22 aminoácidos.
Os peptídeos de sinal particularmente preferidos derivados da lactoferrina são aqueles tendo uma seqüência de aminoácido correspondendo aos aminoácidos da posição de 20 a 64 da seqüência de aminoácido SEQ ID No. 1.
É ainda possível utilizar peptídeos de sinal cuja extremidade Nterminal é uma seqüência correspondendo aos de aminoácidos da posição de 20 a 64 das seqüências de aminoácido SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2. Exemplos de tais peptídeos de sinal são peptídeos tendo uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 20 a 711 correspondendo à SEQ ID No. 1 ou de acordo com as posições de 20 a 708 correspondendo à SEQ
ID No. 2.
Em uma modalidade particularmente preferida, um peptídeo de sinal é selecionado do grupo de peptídeos tendo uma seqüência de aminoácido
KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 3),
CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 4), FQWQRNMRKVRGPPVS (SEQ ID No. 5), FQWQRNMRKVR (SEQ ID No. 6), KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR (SEQ ID No. 29) e CRRWQWRMKKLGAPSITC (SEQ ID No. 30) Ou um derivado destes.
Em uma modalidade preferida, os peptídeos penetrantes da célula compreendendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 ou uma seqüência correspondente com uma identidade de pelo menos 40 %, preferivelmente pelo menos 50 %, particularmente preferível com uma identidade de mais do que 75 % ou mais vantajoso de mais do que 90 %.
Os peptídeos de sinal compreendendo uma seqüência de aminoácido com uma identidade de pelo menos 40 % para a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 são preferivelmente caracterizados pela troca e/ou eliminação de 1 a 13 aminoácidos em comparação com a SEQ ID No. 3 ou a SEQ ID No. 29, ou de 1 a 10 de aminoácidos em comparação com a SEQ ID No. 4 ou a SEQ ID No. 30. Onde as seqüências que através da troca de um ou mais aminoácidos por aminoácido homólogo são do maior interesse.
Os peptídeos que incluem uma seqüência de aminoácido como mostrados na SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 ou uma seqüência correspondente com uma identidade de pelo menos 40 % consistem em pelo menos 8 aminoácidos (com relação aos peptídeos de sinal derivados da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 29) ou de pelo menos 9 aminoácidos (com relação aos peptídeos de sinal derivados da SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 30). Os peptídeos de sinal preferivelmente possuem de 10
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a 45 aminoácidos, particularmente preferível de 14 a 25 aminoácidos.
A troca de um aminoácido homólogo preferivelmente significa a troca de um aminoácido por outra do mesmo grupo. Neste contexto, os aminoácidos podem ser divididos em aminoácidos hidrofóbicos (incluindo os aminoácidos alifáticos), aminoácidos aromáticos, aminoácidos catiônicos e aniônicos, aminoácidos neutros, aminoácidos contendo enxofre e aminoácidos heterocíclicos. Os aminoácidos hidrofóbicos são preferivelmente glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, os aminoácidos aromáticos são preferivelmente fenilalanina, tirosina e triptofano, os aminoácidos tônicos são preferivelmente aminoácidos catiônicos tais como lisina, arginina, histidina, e os aminoácidos aniônicos tais como aspartato e glutamato, os aminoácidos neutros são preferivelmente serina, treoninas, asparagina, glutamina e metionina, os aminoácidos contendo enxofre são preferivelmente cisteína e metionina e os aminoácidos heterocíclicos são preferivelmente prolina e histidina.
Os peptídeos de sinal preferidos como mostrados na SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 ou uma seqüência correspondente com uma identidade de pelo menos 40 % possuem uma carga catiônica, em particular através de pelo menos quatro aminoácidos catiônicos que são localizados dentro da SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30. Um outro aspecto preferido de ditos peptídeos de sinal é a presença de pelo menos dois resíduos de cisteína ou análogos de cisteína capazes de formar uma ponte de dissulfeto ou uma ponte análoga a esta. As duas cisteínas ou seus análogos incluem pelo menos 6, de preferência entre 12 e 43 aminoácidos.
Em uma outra modalidade preferida existem os derivados de peptídeos tendo uma seqüência de aminoácido como mostrada na SEQ ID No. 3-6, onde o resíduo metionina é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que compreende valina, isoleucina, norvalina, leucina e norleucina. Exemplos de tais peptídeos são peptídeos tendo uma seqüência de aminoácido:
KCFQWQRNVRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 7),
KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 8), KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 9), onde X é
norvalina, KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 10), KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 28), onde X é
norleucina, CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 11), CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 12), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 13), onde X é norva-
lina, CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 14), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 15), onde X é norleu-
cina, FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ ID No. 16), FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ ID No. 17), FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ ID No. 18), onde X é norvalina, FQWQRNLRKVRGPPVS (SEQ ID No. 19), FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ ID No. 20), onde X é norleucina, FQWQRNVRKVR (SEQ ID No. 21), FQWQRNIRKVR (SEQ ID No. 22), FQWQRNXRKVR (SEQ ID No. 23), onde X é norvalina, FQWQRNLRKVR (SEQ ID No. 24), FQWQRNXRKVR (SEQ ID No. 25), onde X é norleucina. Em uma outra modalidade preferida, os peptídeos de sinal tam-
bém incluem aqueles derivados compreendendo um grupo ligador, preferivelmente selecionados do grupo de tioésteres, onde o grupo ligador substitui a ponte de dissulfeto. Além disso é possível incorporar no peptídeo grupos ligadores que estrutural e funcionalmente substituem a ponte de dissulfeto, mas não estão sujeitos à divagem redutiva. Exemplos de tal grupo ligador são as pontes de etileno (JACS, 1985, 107, 2986-2987, Bíoorg. Med. Chem. Letter 1999, 9, 1767-1772, J. Med. Chem. 2002, 45, 1767-1777), pontes de tioéter (Yu et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 6633-6636), pontes de carbonila
2>J (Pawlak et al., J. Pept. Sei. 2001,7, 128-140), pontes alifáticas mais longas, em particular tendo até 10 átomos de carbono (Tetrahedron Lett. 2001, 42, 5804). Uma outra possibilidade é também substituir um resíduo de cisteína por outros resíduos tais como, por exemplo, homoserina (Yu et al., Tetrahedron Lett. 1998, 39 6633-6636).
Ditas substâncias de sinal peptídicas podem também ser radíorrotuladas, de preferência com um aminoácido radiorrotulado, em particular com o aminoácido rotulado por trítio. As substâncias de sinal podem, além disso, ser modificadas com grupos detectáveis, tais grupos preferivelmente sendo selecionados do grupo de fluoroforos, de marcadores radioativos e haptenos, a biotina de hapteno sendo particularmente adequado.
É possível através do uso de substâncias de sinal humanas, em particular de peptídeos penetrantes da célula derivados de lactoferrina, em particular para minimizar as reações alérgicas direcionadas contra o sistema de liberação de fármaco. Os peptídeos derivados de lactoferrina ainda apresentam uma eficiência elevada na penetração celular tanto em relação à quantidade de peptídeo ou formulação de peptídeo absorvida na célula, quanto em relação ao tempo necessário para a absorção. É mais vantajoso que os peptídeos, formulações ou ingredientes das formulações que são absorvidos, sejam transportados para dentro do citoplasma da célula.
Os peptídeos de sinal derivados da lactoferrina são de interesse, em particular com relação ao transporte de ingredientes ativos através do epitélio intestinal, em cujo caso o ingrediente ativo é transportado com alta eficiência nas células epiteliais e é subseqüentemente liberado dentro da corrente sanguínea. O peptídeo de sinal também pode ser mascarado para o transporte direcionado de ingredientes ativos, por exemplo, nas células tumorais. O peptídeo mascarado pode então ser clivado, por uma divagem proteolítica, por exemplo, por proteases que são liberadas pelas células tumorais, em sua forma funcional de penetração celular (análogo a Jíang, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 17867-17872, 2004).
Ditos peptídeos de sinal podem ainda estar em uma forma derivatizada pelos métodos usuais. Menção particular deve ser feita neste con texto de peptídeos C-terminalmente submetidos a acetila ou submetidos a amida, que são freqüentemente distintos pela boa estabilidade sob condições fisiológicas. No entanto, os peptídeos de sinal não modificados são preferivelmente utilizados.
A carga do veículo com uma substância de sinal tipicamente ocorre com uma quantidade entre 0,5 % em peso e 20 % em peso, preferivelmente entre 1 % em peso e 10 % em peso, com base no peso total do sistema de liberação de fármaco particulado.
É ainda conhecido em particular da tecnologia de anti-sentido que os compostos iônicos, ácidos nucléicos, fragmentos de ácido nucleico, conjugados de ácido nucleico e análogos de ácido nucléico podem intensificar os transportes de membrana, isto é, fragmentos puros ou quimicamente modificados são da mesma maneira empregados como estímulo suplementar.
Visto que nenhum acoplamento específico dos ingredientes ativos ou das substâncias de sinal ocorre, a carga do veículo polimérico não é restrita em relação aos ingredientes ativos e substâncias de sinal que podem ser utilizados para produzir os sistemas de liberação de fármaco particulados. No entanto, os sistemas de transporte aqui descritos devem ser considerados como particularmente vantajosos para os ingredientes ativos ou misturas de ingrediente ativo que devem ser protegidos da degradação química ou enzimática durante o transporte para o sítio alvo e que, para evitar efeitos colaterais, devem ser liberados apenas no sítio alvo. Consequentemente, os sistemas de liberação de fármaco descritos são particularmente adequados para o transporte de peptídeos ou proteínas farmaceuticamente eficazes. Tais ingredientes ativos são, por exemplo, proteínas farmacêuticas ou ingredientes proteo ativos, tais como, por exemplo, anticorpos, hormônios de peptídeo, receptores ou ligandos peptídicos destes ou enzimas. Exemplos destes que podem ser mencionados são os inibidores da a1-protease, eglina, elastase, a1-antitripsina (enfisemas), antitrombina (anticoagulante), angiotensinase (pressão arterial elevada), fator VII, VIII, IX, X, fibrinogênio, trombina, inibidor do ativador do plasminogênio (distúrbios de coagulação), £5
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imunoglobulinas (imunização passiva), ganciclovir, aciclovir, interferons (infecções virais, terapia de tumores), fator da necrose tumoral, caquectina, diidrofolato reductase, linfotoxina, interleucinas, proteínas supressoras de tumor tais como, por exemplo, P53 (câncer), plasmina, urocinase, hirudina, estreptocinase, urocinase, ativador de plasminogênio do tecido, proteína C, proteína S (trombólise), fosfolipase A2, uromodulina, proteína Tamm-Horsfall (inflamações), insulina (diabetes), inibidor da tripsina (pancreatite), lisozima, timopoietina, antibióticos de peptídeo (infecções bacterianas), eritropoietina (anemia). No entanto, os sistemas de liberação de fármaco aqui descritos não se limitam a tais ingredientes ativos; também é possível empregar ingredientes ativos de peso molecular baixo (moléculas pequenas) tais como, por exemplo, muitas substâncias antivirais, substâncias hepatoterapêuticas, substâncias neuroprotetoras, imunoterapêuticos e imunossupressores, ingredientes ativos de peso molecular baixo para distúrbios cardiovasculares ou câncer, analgésicos, antiinflamatório de peso molecular baixo, ingredientes ativos antibióticos e antimicrobianos e hormônios de peso molecular baixo, ou ingredientes ativos macromoleculares tais como, por exemplo, fragmentos de ácido nucléico ou ácidos nucléicos (DNA genômico, cDNA, mRNA, siRNA, oligonucleotídeos anti-sentido etc). Exemplos de ingredientes ativos de peso molecular baixo são análogos de nucleosídeo, β-interferons, ácido α-lipóico, análogos de peptídeo, inibidores de enzima ou receptor, agonistas e antagonistas, prostaglandinas, esteróides, citostáticos e antibióticos heterocíclicos. Também é possível em particular empregar ingredientes ativos na forma de seus pró-fármacos.
Uma das vantagens das presentes partículas de transporte é que também é possível incorporar dois ou mais ingredientes ativos, em particular também tendo diferentes propriedades físicas, tais como, por exemplo, diferente capacidade hidrofílica, ao mesmo tempo em uma formulação. Uma classificação farmacológica a este respeito é fornecida pelo sistema BCS que foi desenvolvido pelo FDA e divide os ingredientes farmacêuticos ativos em quatro diferentes classes. As partículas aqui descritas são particularmente adequadas para justamente incluir os ingredientes ativos de dife <3^ rentes classes de um sistema de transporte.
A carga do veículo com um ingrediente ativo tipicamente ocorre com uma quantidade entre 0,001 % em peso a 50 % em peso com base no peso total do sistema de liberação de fármaco particulado. Onde os ingredientes ativos tendo uma atividade elevada estão preferivelmente presentes em uma quantidade entre 0,01 % em peso e 1 % em peso, em particular preferivelmente abaixo de 0,1 % em peso. Outros ingredientes ativos são geralmente empregados em uma quantidade entre 1 % em peso e 30 % em peso, de preferência entre 5 % em peso é 25 % em peso.
O teor de ingrediente ativo no sistema de liberação de fármaco particulado é selecionado para a formulação farmacêutica de modo que preferivelmente entre 0,1 mg e 100 mg de ingrediente ativo por kg de peso corporal do paciente sejam atingidos. No caso de ingredientes ativos tendo atividade elevada, tais como, por exemplo, hormônios, dosagens mais baixas também são suficientes.
Um aspecto particularmente preferido das substâncias de sinal e ingredientes ativos aqui utilizados é que eles são não modificados. Não modificado significa no contexto da presente invenção que a substância de sinal ou o ingrediente ativo não é derivatizado com quaisquer grupos funcionais adicionais ou ligadores de modo a produzir coordenação ou ligação covalente ao veículo ou um com o outro possível.
O termo barreira biológica significa no contexto da presente invenção além da membrana celular em geral, em particular também as camadas celulares epiteliais e endoteliais. Conseqüentemente, a expressão barreira biológica abrange também as barreiras de órgãos e tecidos tais como, por exemplo, a barreira hematoencefálica ou o epitélio intestinal. Onde a vascularização garante boa farmacocinética promove transporte (sucção de ingrediente ativo) após a barreira ter sido atravessada.
É crucial para a construção dos sistemas de liberação de fármaco particulados de acordo com a invenção que tanto os ingredientes ativos quanto as substâncias estão em agregação não específica com o veículo polimérico ramificado ou reticulado, isto é, não entra em qualquer ligação covalente um com o outro. O termo ligação covalente também inclui as ligações de coordenação onde o par de elétrons de ligação é fornecido por um parceiro de ligação à um aceitante de par de elétrons definido. O termo ligação de coordenação não inclui quaisquer ligações não específicas que sejam instáveis e não seletivas sob condições fisiológicas. As ligações de coordenação específicas são representadas, por exemplo, por complexos tais como ligações de epitopo ou ligações semelhantes a haptâmero ou ligações semelhantes a aptâmero. As ligações também geralmente designadas como ligações hospedeiras-hóspedes devem ser consideradas como uma ligação de formação complexa. Tais ligações de coordenação são distintas pela sua estabilidade e seletividade da ligação sob condições fisiológicas. As ligações não específicas não seletivas no sentido da presente invenção são interações polares ou interações lípofílicas e interações Van der Waals que geralmente possuem uma entalpia de ligação de menos do que 50 kJ/mol ou menos do que 20 kJ/mol (dependendo do radical considerado que está disponível para uma tal ligação). Nos sistemas de transporte particulados aqui descritos, ao contrário, tanto as substâncias de sinal quanto os ingredientes ativos apropriados são preferivelmente de forma simples dispersos ou submetidos a coacervação no material veículo polimérico.
Os sistemas de liberação de fármaco configurados desta maneira possuem diversas vantagens sobre as formulações de ingrediente ativo convencionais. Assim, os ingredientes ativos e as substâncias de sinal podem ser empregados sem modificações químicas, desta maneira retendo suas propriedades, em particular em relação aos seus efeitos e em relação aos parâmetros ADME. É ainda possível também empregar veículos polimérícos ramificados ou reticulados naturais ou aqueles compostos de monômeros de ocorrência natural. É assim possível obter sistemas de liberação de fármaco particulados bem tolerados que devem em particular também ser vantajosos evitando reações alérgicas. Os sistemas de liberação de fármaco de acordo com a invenção também são mais fáceis de produzir porque nem a funcionalização adicional de componentes individuais nem uma ligação específica entre veículo, substância de sinal e/ou ingrediente ativo são ne cessárias. É desta maneira adicionalmente possível simplesmente combinar entre si diferentes substâncias sinal e ingredientes ativos sem um novo ingrediente ativo resultante, como seria o caso, por exemplo, na ligação covalente da proteína Tat (substância de sinal) com uma proteína p53 (ingrediente ativo) (proteína de fusão Tat-p53). Além disso, também é desnecessária para o ingrediente ativo ser liberado, por exemplo, por uma eliminação proteolítica ou enzimática do veículo e/ou da substância de sinal. Uma outra vantagem do sistema de liberação de fármaco descrito deve ser considerada como o fato de que diferentes substâncias de sinal e ingredientes ativos podem ser formuladas entre si em um sistema de transporte. As quantidades das substâncias de sinal e ingredientes ativos com as quais as partículas de transporte são carregadas também podem ser selecionadas livremente e podem assim ser adaptadas sem dificuldade à respectiva indicação.
Em particular, através da utilização de polímeros veículos dendríticos é possível ajustar através do tipo e número de grupos funcionais, em particular dos grupos polares, no veículo a concentração de carga das partículas com um ingrediente ativo e uma substância de sinal, e além disso é possível alcançar extraordinariamente altas concentrações de carga de mais do que 20 % em peso do ingrediente ativo e substância de sinal com base no peso total das partículas. Além disso, a quantidade de ingrediente ativo liberada por unidade de tempo também pode ser controlada através do número de grupos funcionais.
Em uma modalidade preferida, os peptídeos derivados do lactoferrina são incorporados como substâncias de sinal no sistema de liberação de fármaco reivindicado, que utiliza a formulação negativamente carregada ou veículos facilmente polarizáveis. Uma possibilidade alternativa é também empregar veículos com uma carga líquida positiva, utilizando uma formulação negativa carregada auxiliar, tal como, por exemplo, por meio de fragmentos de ácido nucléico.
Consequentemente, os sistemas de liberação de fármaco de interesse particular compreendem
a)um peptídeo de sinal penetrante celular (CPP) derivado de
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lactoferrina,
b) um ingrediente ativo farmacêutico e
c) um veículo polimérico composto por homo- ou heteropolímeros ramificados ou reticulados de carboidratos (polissacarídeos); de poliéster; de poliéteres; de polióis, de poliolefinas, de polialquilenos glicóis, de poliamidas, de poliacetáis, de poliacrilatos; de poliacetatos, de poliuretanos, de polímeros de organossilício, de resinas de epóxi, de politióis, de policarbonatos, de policaprolactonas, de poliglicolídeos, de polilactídeos, de polilactídeoco-glícolídeos ou de politartratos.
Tais formulações são particularmente adequadas com relação ao transporte transcelular de ingredientes farmacêuticos ativos através do epitélio intestinal. Conseqüentemente, a combinação de CPPs derivados de lactoferrina e hepatoterapêuticos tais como, por exemplo, certos citostáticos, análogos de nucleosídeo ou ácido α-lipóico, interferon, lamivudina, corticóides, azathioprina, clorambucil, colquizina, metotrexato, ácido ursodeoxicólico, naloxona, anfotericina B, fluconazol, albendazol, é particularmente preferida.
Os sistemas de liberação de fármaco particulados podem ser administrados, por exemplo, pela via oral, pulmonar, sublingual, bucal, nasal, ocular ou via gastrointestinal. De interesse particular neste contexto são, em particular, a forma de administração oral e intravenosa. Para este propósito, as partículas de transporte podem ser encapsuladas sem perda da função adicionalmente com substâncias farmacêuticas comercialmente disponíveis, tais como Eudragit® por exemplo.
Os sistemas de liberação de fármaco particulados podem ser produzidos por vários métodos. Neste contexto, o método de coacervação além da secagem por atomização, o método de alta pressão com gases comprimidos e a evaporação do solvente revelou-se ser um método preferido. É possível, em princípio, com relação ao ingrediente ativo e a substância de sinal serem formulados em conjunto ou em operações separadas com os sistemas de liberação de fármaco da invenção.
A coacervação é uma separação de fase forçada para precipitar
3?
os colóides e produzir partículas. Esta pode se induzida por vários estímulos externos tais como a temperatura, pH, soluções salinas ou não solventes. Finalmente, as partículas resultantes são consolidadas pelo calor, reticulação, remoção de solvente ou secagem. O método de coacervação é muito versátil e pode ser realizado com vários polímeros. Além disso é possível com relação à espessura de parede e o tamanho das partículas, e o grau de carga de um ingrediente ativo (ativo), serem variados sem restrição. Além disso, é possível com relação ao perfil de liberação do ingrediente ativo encapsulado ser ajustado conforme desejado. O método de coacervação é um método muito eficaz para produzir formulações de particulado uma vez que permite um alto rendimento, uma elevada taxa de carga e uma boa capacidade de reprodução.
É feita uma distinção entre a coacervação simples e complexa, e entre a separação de fase aquosa e orgânica (Arshady, R. Microspheres and microcapsules, a survey of manufacturing techniques, Part II, Coacervation, Polymer Engineering and Science, 30 (15), 905, 1990). Na coacervação simples existe o uso de um componente coloidal, por exemplo, gelatina, e na coacervação complexa existe o uso de dois componentes coloidais opostamente carregados, por exemplo, gelatina e goma arábica. O princípio de coacervação consiste em, por exemplo, converter uma solução aquosa de gelatina mediante a adição de etanol em um sistema de duas fases que consiste em uma fase rica em gelatina (coacervada) e pobre em gelatina. Isto é muito similar a um fracionamento polimérico, embora neste caso as micropartículas com um tamanho médio de 2 a 5000 pm são produzidos pela ação das forças de cisalhamento.
A produção de microcápsuias por coacervação pode ser dividida em três etapas: (1) geração de três fases imiscíveis, (2) deposição do colóide como estrutura de cápsula e (3) consolidação da estrutura de cápsula. As três fases imiscíveis consistem em um meio externo, um material de núcleo e o material de estrutura de cápsula. O material de estrutura de cápsula é dissolvido no meio externo, e o material de núcleo é nele disperso. Quando um estímulo externo (temperatura, pH, eletrólitos) atua, o material de estru22 tura de cápsula torna-se insolúvel no meio externo e é depositado na interface com o material de núcleo disperso. Após filtração, a estrutura de cápsula é finalmente endurecida pela ação do calor, reticulação ou remoção de solvente ou seca mediante a secagem por atomização ou secagem por congelamento.
A formulação de ingrediente ativo particulada é seca particularmente de forma vantajosa mediante a lavagem das partículas em um solvente particularmente volátil (por exemplo, etanol, propanol, acetona, diclorometano), com secagem subseqüente em um vácuo, secador de placa ou de rolagem. Alternativamente, pode também ocorrer pela secagem por atomização ou congelamento. A fase rica em solvente que permanece sobre a remoção das partículas pode ser reciclada em uma escala relativamente elevada.
As micropartículas podem ser carregadas com um ingrediente (ativo), isto é, que o material de núcleo corresponda a este ingrediente ativo. Isto pode implicar substâncias hidrofóbicas ou hidrofílicas, levando à necessidade de usar uma separação de fase aquosa ou orgânica. No caso da separação de fase aquosa é possível para as substâncias hidrofóbicas serem fechadas/encapsuladas. Inversamente, uma separação de fase orgânica é requerida para as substâncias hidrofílicas, ou seja, o colóide é dissolvido na fase orgânica e, após a ação de um estímulo externo, se acumula na interface com a substância hidrofílica. Os termos coacervação aquosa e orgânica desta maneira substituem, em cada caso, os colóides solúveis em água e em óleo. O carregamento das microcápsulas com a substância de sinal e o ingrediente ativo é de 0,5 a 70 % em peso e a liberação da substância incluída pode ser iniciada por vários mecanismos: difusão, dissolução do material de estrutura da cápsula, degradação enzimática, etc. Os seguintes materiais de estrutura de cápsula são preferivelmente utilizados na simples coacervação: carboximetilcelulose, nitrocelulose, álcool polivinílico, poliuretanos, laca, carragenina, alginatos, gelatina, albumina, colágeno, acetato de celulose, ftalatos, etilcelulose, poligliceróis, poliésteres, Eudragits®, etc. No caso da coacervação complexa, preferivelmente as seguintes combinações com ge latina são utilizadas: gelatina com goma arábica, Carbopol ou pectina.
Uma outra possibilidade para produzir as formulações de ingrediente ativo particuladas de acordo com a invenção é representada por processos de alta pressão com fluidos comprimidos ou supercríticos (Gamse et al., in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680; McHugh and Krukonis in Supercritical Fluid Extraction: Principies and Practices, Stoneham MA 1986, Fages etaL, Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220).
Os métodos mais conhecidos para a produção de partículas com gases comprimidos são o processo GAS (Antissolvente gasoso), o processo PCA (Precipitação com um antissolvente fluido comprimido), o processo PGSS (Partículas de soluções saturadas gasosas) e o processo RESS (Expansão Rápida de Soluções Supercríticas). Estes métodos são explicados de forma sucinta abaixo.
No processo GAS, uma solução que compreende polímero, ingrediente ativo, substância de sinal e solvente é introduzida em uma autoclave em temperatura constante e, em seguida, exposta a um gás como não-solvente, de modo que o polímero e o ingrediente ativo precipitem como partículas finas. Neste caso, a mistura da solução/suspensão por meio de um agitador é sensível a fim de evitar a aglomeração das partículas.
As moléculas de substância de sinal e ingrediente ativo podem durante a precipitação ser ligadas na matriz polimérica ou estar presentes como núcleo (reservatório) em torno do qual um revestimento polimérico tenha se formado. A suspensão é depois formada e pode ser fracionada por filtração. Os resíduos de solvente podem ser extraídos mediante a lavagem das partículas em um fluido supercrítico. Além da possibilidade de realizar o processo em temperaturas baixas e assim separando o ingrediente ativo, particularmente importante é a influência dos cinéticos da fase de transição, isto é, da formação de partícula. A distribuição do tamanho de partículas também pode ser selecionada mediante o controle da supersaturação pelo decurso do tempo e da intensidade da adição de gás. Em uma primeira etapa, a separação de fase é iniciada e existe formação de núcleos cristaliza24 ção na forma de gotículas da fase rica em polímero resultante, das micropartículas posteriores. Agora é importante não permitir que estas gotículas coalesçam e cresçam, mas garantir que o solvente seja extraído tão rapidamente quanto possível para fora destas gotas. As partículas resultantes então possuem diâmetros pequenos (Gamse et al., Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res„ 37, (1997) 32083220). A distribuição de partícula e o tamanho de partícula podem ser ajustados pela variação direcionada destas duas etapas.
O processo PCA ou então processo SEDS (Dispersão Intensificada da Solução por Fluidos Supercríticos) otimiza as duas quantidades limitativas do processo GAS, ou seja, a taxa de formação de pressão como iniciador da formação de partícula e o transporte da matéria a fim de remover o solvente para fora das gotas (Gamse et al., in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680; Fages et al., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220). A solução de substância de sinal - ingrediente ativo - polímero da autoclave é neste caso comprimida e levada em contato em um bico de injeção com o gás supercrítico e pulverizado conjuntamente na unidade de precipitação. Em uma etapa de lavagem final, o solvente é removido das partículas mediante a extração com o fluido supercrítico. Uma taxa elevada da formação de pressão pode ser alcançada através do tempo de contato curto por levar a solução e o fluido supercrítico juntos pouco antes da etapa de pulverização no esguicho. Como já mencionado acima, o resultado disto é uma supersaturação elevada da solução de polímero - ingrediente ativo - sinal de substância. É possível desta forma alcançar distribuições homogêneas e pequenos tamanhos de partícula, visto que a separação de fase inicial é seguida, através da pulverização, mediante uma dispersão fina em que um transporte melhorado da matéria do solvente dentro do gás comprimido ou supercrítico pode ocorrer devido à área superficial específica elevada das gotas de solução polimérica. É possível através da secagem por atomização supercrítica combinar cristalização por deslocamento e cristalização por evaporação de solvente.
O processo PGSS difere fundamentalmente dos processos de alta pressão descritos acima, porque ele produz sem a utilização de um (frequentemente tóxico) solvente para o polímero. Conforme descrito por Weidner no WO 95/21688, Gamse etal. in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680, Fages etal., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert 5 et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220, este processo faz uso do efeito da redução da temperatura de transição vítrea de um polímero pelo fluido supercrítico. O polímero é fundido no fluido supercrítico, e o ingrediente ativo é disperso na solução. Durante isto, a viscosidade da fusão polimérica também diminui. A fusão de polímerò-gás com o ingrediente ativo e a 10 substância de sinal dispersas é descomprimida na unidade de precipitação através de um esguicho, com o esguicho adicionalmente da mesma forma possivelmente sendo fornecido com gás supercrítico. Como um resultado da redução da temperatura através do efeito Joule-Thomson, a solução esfria, e o polímero se precipita como pó fino. As partículas podem ser removidas da 15 corrente de gás em um ciclone ou um eletrofiltro a jusante. As frações de tamanho diferente podem ser fracionadas desta forma. O ingrediente ativo pode ser disperso na matriz polimérica devido à fusão do polímero. A descompressão no esguicho resulta em partículas monodispersas finas.
O processo RESS se parece com o processo PGSS porque ne20 nhum solvente orgânico é utilizado neste processo. Conforme descrito por
Gamse et al. in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680, Fages et al., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220, em primeiro lugar o polímero é dissolvido em uma autoclave de alta pressão. O ingrediente ativo e a substância de sinal 25 são igualmente dissolvidos ou dispersos com um agitador. No caso das micropartículas carregadas, a dispersão homogênea do ingrediente ativo e da substância de sinal na fusão é extremamente importante, pois em última análise o tamanho das moléculas de ingrediente ativo representa a limitação crucial para o tamanho das micropartículas (Gamse et al., Chemie Ingenieur 30 Technik 77 (2005) 669-680; Fages etal., Powder Technology 141 (2004)
219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220). A solução supercrítico é pulverizada em uma unidade de precipitação em pressão ambiente. A supersaturação da solução ou das gotículas na descompressão ocorre com uma velocidade muito maior em comparação com os métodos descritos acima. Devido à descompressão, a densidade do fluido supercrítico e desta maneira também a força de dissolução cai em um tempo muito curto para os valores típicos de gás. A formação e transporte de núcleo da matéria ocorrem em sucessão direta neste processo e são otimizados muitas vezes pela comparação com os outros métodos (Gamse et al., Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680; Fages et al., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997)3208-3220).
Os sistemas de liberação de fármaco particulados com um diâmetro de partícula preferido de menos do que 900 pm, preferivelmente de menos do que 500 pm, podem ser obtidos facilmente com os métodos descritos. Também é possível com os métodos descritos produzir sistemas de liberação de fármaco com um diâmetro de partícula entre 100 nm e 100 pm, as partículas normalmente empregadas tendo um diâmetro de partícula entre 500 nm e 10 pm.
A carga de ingrediente ativo e substância de sinal do veículo mediante a coacervação ou a dispersão de ingrediente ativo e substância de sinal em uma fusão polimérica veículo ou uma solução rica em polímero veículo preferivelmente ocorre em uma faixa de temperatura entre -30 °C e +100 °C, particularmente preferível entre 0 °C e 60 °C. A pressão durante estes processos está preferivelmente entre 10 Pa e 2 Mpa (0,1 mbar e 20 bar), particularmente preferível entre 100 Pa e 1 Mpa (1 mbare 10 bar).
A produção alternativa da formulação de ingrediente ativo de acordo com a invenção mediante a secagem por atomização, o processo GAS (Antissolvente Gasoso), o processo PCA (Precipitação com um Antissolvente fluido comprimido), o processo PGSS (Partículas de soluções saturadas com gás) e o processo RPESS (expansão rápida das soluções supercríticas) preferivelmente ocorre na faixa de temperatura entre -30 °C e +150 °C, de preferência entre 0 3C e 100 eC e com pressões de sistema entre 10 Pa e 25 Mpa (0,1 mbar e 250 bar), preferivelmente entre 0,1 Mpa e 18 Mpa >>
(1 bare 180 bar).
Os solventes adequados que devem ser mencionados para os métodos de produção descritos são em particular água, álcoois tais como, por exemplo, etanol ou isopropanol, CO2 comprimido, propano comprimido, 5 tetraidrofurano, tolueno, acetona, peróxido de benzoíla, solução aquosa de HCL, hexano, ácido acético, etanodiol, diclorometano, dicloroetano e líquidos iônicos.
O encapsulamento dos sistemas de liberação de fármaco particulados fornecidos desta maneira, em particular para a disponibilidade oral 10 em princípio, é possível sem perda da função usando substâncias farmacêuticas comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, com EUDRAGIT® (Degussa AG, DE).
Se as variantes especiais do método de coacervação ou métodos de revestimento especial (secagem por atomização, processo de mi15 crosfera Brace, bocai coaxial, revestimento de leito fluidificado) forem empregadas, os ingredientes ativos e as substâncias de sinal podem ser envolvidos ou revestidos com um ou mais polímeros veículos em uma pluralidade de camadas. Assim, por exemplo, as substâncias de sinal podem ser incorporadas na camada externa, e os ingredientes ativos na camada interna, de 20 modo que primeiro a substância de sinal e depois o ingrediente ativo seja liberado. É ainda possível para uma pluralidade de diferentes ingredientes ativos também ser agregada em diferentes camadas de partícula.
Quando os ingredientes farmacêuticos ativos forem incorporados nas formulações farmacêuticas, por exemplo, utilizando os métodos há 25 pouco descritos, requisitos sempre mais específicos devem ser encontrados pela estabilidade das formulações de ingrediente ativo, pelo perfil de propriedade do polímero veículo, pelo acionador da liberação e os cinéticos de liberação. Isto ocorre porque os ingredientes ativos ocasionalmente mostram uma reação sensível ao seu meio ambiente (degradação enzimática, tempe30 ratura, alterações de pH), são insolúveis ou são não-lipofílicos. Os sistemas de liberação de fármaco particulados produzidos com estes métodos utilizando os veículos poliméricos lineares ou ramificados ou reticulados acima
Figure BRPI0617775B1_D0004
descritos mostram uma estabilidade particularmente elevada, tornando-o assim possível em particular para ingredientes farmacêuticos ativos tóxicos, sensíveis, reativos ou instável a serem liberados em uma maneira controlada e estabilizada juntamente com as substâncias de sinal. Se os polímeros veículos ramificados ou reticulados, de preferência polímeros dendríticos e particularmente preferíveis polímeros hiper-ramificados contendo grupo de poliéster, poligliceróis hiper-ramificados, polissacarídeos ou dendrímeros PAMAM como materiais veículos para ingredientes ativos biologicamente ativos e substâncias de sinal forem possíveis com relação às desvantagens descritas a serem reduzidas ou totalmente eliminadas.
Além disso, em particular, os polímeros veículos dendríticos, provavelmente por causa de suas viscosidades e fusão e em solução que são comparativamente baixas para polímeros, os métodos de encapsulamento podem ser operados com quantidades distintamente reduzidas de solventes ou gases comprimidos. O polímero dendrítico atua neste caso propriamente dito como solvente/dispersante. A ocorrência reduzida de solvente torna a produção dos sistemas de transporte particulados mais seguros, em particular a liberação de vapores, que são explosivos ou prejudiciais à saúde é distintamente reduzida.
A liberação controlada de ingrediente ativo pode ser influenciada, em particular, pela espessura da camada de polímero veículo que circunda o ingrediente ativo e a substância de sinal, pela natureza e pelo número dos grupos funcionais no polímero veículo e pelo tipo de método de encapsulamento. O período de liberação torna-se mais longo quando a estrutura polimérica do veículo torna-se mais espessa. A espessura do veículo pode ser alcançada, além da variação dos parâmetros do processo (pH, temperatura, solvente), em particular através da alteração da concentração polimérica na mistura inicial. É possível através da utilização de polímeros dendríticos como veículo aumentar a carga do veículo com ingredientes ativos e substâncias de sinal até 70 % em peso, de modo que os tempos de liberação particularmente longos com grandes quantidades de ingrediente ativo liberadas podem ser alcançados. Além da espessura da estrutura do t 29 polímero veículo, o período de liberação é decidido pelo grau de funcionalização e pelo número de hidróxi. Se os ingredientes ativos fossem liberados em meio polar, a liberação se tornaria mais lenta quando menos grupos polares livres, por exemplo, grupos de OH, estivessem presentes no polímero veículo. O número de grupos de OH livres pode por sua vez ser influenciado pela esterificação com ácidos graxos.
A liberação das substâncias de sinal e ingredientes ativos do sistema de liberação de fármaco particulado ocorre por vários mecanismos tais como, por exemplo, pela degradação enzimática do polímero veículo, por processos hidrolíticos, mudanças de pH ou modificações de temperatura. A degradação enzimática do veículo é de particular interesse para a liberação direcionada ingredientes ativos farmacológicos. Os veículos poliméricos particularmente adequados a este respeito são polímeros que carregam grupo de éster, especialmente poliésteres ramificados ou reticulados ou, de preferência dendríticos.
Os sistemas de liberação de medicamento particulados podem ainda compreender excipientes convencionais tais como, por exemplo, estabilizantes, tensoativos, lubrificantes, óleos, ceras, estratos de planta, levedura ou alga, aminoácidos, derivados de aminoácido, vitaminas e seus derivados, lipídios bioativos tais como colesterol, ceramidas, pseudoceramidas, antioxidantes, conservantes, colorantes e pigmentos.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1a mostra por meio de exemplo, um agregado de veículo - ingrediente ativo - substância de sinal consistindo de uma substância de sinal de barreira não especificamente incorporada, não modificada (1), por exemplo, a proteína Tat, de um ingrediente ativo não especificamente incorporado, não modificado (2), com a substância de sinal e o ingrediente ativo sendo submetidos à coacervação em duas camadas com um veículo polimérico ramificado (3). A formulação de ingrediente ativo é adicionalmente circundada por uma camada digestiva oral (4), por exemplo, de Eudragit®.
A figura 1b mostra a liberação da substância sinal (8) na matriz extracelular (5), pela qual a captação (9) do sistema de transporte através da membrana celular (7) no citoplasma (6) ocorre. A figura 1c depois mostra a seguinte liberação (10) do ingrediente ativo na célula.
A figura 2 mostra exemplos diagramáticos de uma material veículo dendrítico, a figura 2a mostra por meio de exemplo um dendrímero, a figura 2b um polímero hiper-ramificado.
A figura 3 mostra um micrógrafo de fluorescência de células CHO que foram tratadas com os sistemas de liberação de fármaco de acordo com a invenção, empregando o peptídeo Tat como substância de sinal, e carboxifluorescina (marcadores) como análogo de ingrediente ativo. A captação direcionada do marcador dentro das células CHO é evidente; a fluorescência é virtualmente não mais evidente fora das células CHO após a incubação durante 30 minutos. Este efeito sustenta a idéia de que os ingredientes ativos podem ser transportados através de uma membrana celular (barreira) com o sistema de liberação de fármaco descrito mesmo por meio de estímulos extracelulares não especificamente ligados (pulo).
A figura 4 mostra a dependência de concentração, medida pela citometria de fluxo, da captação de várias substâncias de sinal de peptídeo em células HeLa (peptídeo Tat, peptídeo Antp, peptídeo hLF (com uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 38 a 59 correspondendo à SEQ ID No. 1 ), peptídeo bLF (com uma seqüência de aminoácido, de acordo com as posições de 33 a 50 correspondendo à SEQ ID No. 2)).
A figura 5 mostra a captação, determinada pela citometria de fluxo, de peptídeos hFL rotulados por fluoresceína (com uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 38 a 59 correspondendo à SEQ ID No. 1) comparado com os peptídeos truncado LF1 e LF2 (com uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 40 a 55 correspondendo à SEQ ID No. 1 (LF1) e com uma seqüência de aminoácido, de acordo com as posições de 40 a 50 correspondendo à SEQ ID No. 1 (LF2)).
A figura 6 mostra o resultado das investigações sobre a toxicidade em células HeLa na incubação com várias concentrações de peptídeos hLF (com uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 38 a 59 correspondendo à SEQ ID No. 1) durante 0,5 hora ou 6 horas.
Figure BRPI0617775B1_D0005
A figura 7 mostra os sistemas de liberação de fármaco particulados que compreendem ácido α-lipóico (figuras 7 A e B) ou um peptídeo de sinal derivado de lactoferrina humana e ácido a-lipóico.
MODALIDADES EXEMPLARES
As seguintes abreviações são usadas nas modalidades exemplares:
Boc terc-Butiloxicarbonila
DIPEA Diisopropiletilamina
DMF Dimetilformamida
EDT Etanoditiol
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonila
HBTU hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)1,1,3,3-tetrametilurônio
HPLC cromatografia líquida de alta pressão
Pmc 2,2,5,7,8-Pentametilcromansulfonila tBu terc-butila
TES Trietilsilano
TFA Ácido trifluoroacético
Trt Trifenilmetila
EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE UM ADJUVANTE DE SINAL DE PEPTÍDEO
Um peptídeo de sinal idêntico por natureza com a seqüência Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-GIn-Arg-Arg-Arg (seqüência Tat) é produzido pela estratégia Fmoc/tBu, com a alfa-aminofunção dos L-aminoácidos empregados sendo Fmoc-protegido, e as cadeias laterais dos aminoácidos trifuncionais sendo protegidas pelos seguintes grupos de proteção: Boc para lisina e triptofano; tBu para ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina; Pmc para arginina; Trt para cisteína, histidina, asparagina e glutamina.
O peptídeo é produzido automaticamente em um sintetizador de peptídeo Syroll (MultiSynTech, Witten, DE). Para este propósito, em cada caso, 70 mg de Fmoc-Gly-tritil-resina (carga de 0,85 mmol/g; 59,5 pmol) são introduzidos em seringas plásticas de 5 ml de substâncias vítreas plásticas.
Os aminoácidos de Fmoc protegidos pela cadeia lateral são dissolvidos em 0,4 M DMF, e 0,4 M HBTU em DMF e 0,8 M DIPEA em DMF são empregados como reagentes de ativação, e o grupo de proteção Fmoc temporário é eliminado com 40 % de piperidina em DMF. O acoplamento dos aminoácidos, a eliminação do grupo de proteção Fmoc e as etapas de lavagem ocorrem enquanto se agita com um agitador magnético.
Protocolo da síntese: a resina é primeiro intumescida com 2 ml de DMF durante 5 min e extraída por filtração com sucção e depois lavada três vezes mais com 2 ml de DMF. Para eliminar o grupo de proteção Fmoc da Fmoc-glicina primária, a resina é misturada com 1,2 ml de piperidina/DMF a 40 % durante 15 min, extraída por filtração com sucção e novamente misturada com 1,2 ml de piperidina/DMF a 40 % durante 15 min, extraída por filtração com sucção e lavada quatro vezes com 2 ml de DMF. Para o acoplamento, em primeiro lugar 600 pl da respectiva solução de aminoácido 0,4 M em DMF (240 μ mol, 4 eq) e depois 600 pl de 0,8 M DIPEA/DMF (480 pmol, 8 eq) e subsequentemente 600 μΙ de 0,4 M HBTU/DMF (240 μητιοΙ, 4 eq) são adicionados à resina. Após 1 h, a solução de acoplamento é extraída por filtração com sucção e a resina é lavada quatro vezes com 2 ml de DMF. Os outros ciclos de acoplamento são realizados em analogia à primeira posição, com a eliminação de Fmoc que ocorre primeiro como exatamente descrito. Um outro aminoácido protegido por Fmoc é depois acoplado no produto ativado lavado, e o produto de acoplamento resultante é novamente lavado. Após o último aminoácido ter sido acoplado, o grupo de proteção Fmoc é eliminado como indicado acima, e a resina é depois lavada quatro vezes com 2 ml de DMF, 2 ml de metanol e 2 ml de diclorometano e sugado seco. Subsequentemente, o peptídeo resultante é tratado com 1,5 ml de TFA/EDT/TES/H2O (92,5:2,5:2,5:2,5) durante 3 h de modo a remover os grupos de proteção de cadeia lateral e eliminar o peptídeo montado a partir do suporte sólido. Após filtração do peptídeo resultante, o filtrado contendo peptídeo é concentrado em um evaporador a vácuo IR (TecConsult + Trading, Eggstãtt, DE) de 0,5 ml em cada caso e, após a adição de 3,5 ml de éter dietílico gelado, armazenado em -20 °C durante 2 h. O peptídeo precipi tado é girado para baixo e em três outras ocasiões misturado com 3,5 ml de éter dietílico gelado, transformado em pasta fluida, armazenado a -20 °C durante 2 h e girado para baixo novamente. O peptídeo resultante é depois secado in vacuo. O produto resultante foi examinado por HPLC e espectrometria de massa.
Os compostos descontaminantes requeridos para a síntese foram adquiridos da Fluka (Seelze, DE). A resina da síntese oriunda da Rapp Polymere (Tübingen, DE), e os aminoácidos de Fmoc de proteção de cadeia lateral e HBTU oriundos da Novabiochem (Bad Soden, DE).
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO PARTICULADA
Para este propósito, um polímero dendrítico (dendrímero de poliamidoamina (PAMAM)), com uma massa molar Mw de 6909 g/mol, uma viscosidade em fusão a 80 °C de menos do que 3 Pa s, um grau de ramificação de 100 % e um diâmetro da molécula portadora PAMAM de cerca de 36 Â a 100 °C é fundido em um primeiro recipiente de mistura.
Carboxifluoresceína (marcador) é usada para simular um ingrediente ativo. A carboxifluoresceína é medida em juntamente com o peptídeo de sinal produzido no Exemplo 1 no primeiro recipiente de mistura até que um teor de marcador de cerca de 1 % em peso e um teor de peptídeo de sinal de cerca de 1 % em peso com base na fusão polimérica sejam atingidos. A carboxifluoresceína e o peptídeo de sinal são dispersos na fusão polimérica pela mistura vigorosa.
Uma mistura de 2 % em peso de pectina (estabilizante), 1 % em peso de sulfato de éter laurílico (emulsificante) em 87 % em peso de água (solvente) é introduzida em um segundo recipiente de mistura a 50 °C com agitação, em que 10 % em peso de dispersão polimérica/marcador/peptídeo de sinal são medidos a partir do primeiro recipiente de misturar enquanto se agita continuamente (os dados de % em peso são aqui baseados sobre o peso total da emulsão no segundo recipiente de mistura). Após um tempo de permanência de até 10 minutos, as formulações particuladas resultantes se sedimentam. As partículas resultantes são depois extraídas por filtração, lavadas com o solvente volátil etanol e depois secadas em um vácuo, seca dor de placa ou tombo.
A maioria das partículas resultantes possuem um tamanho de partícula entre 1 pm e 200 pm.
EXEMPLO 3: PROVA DE TRANSPORTE DE BARREIRA DOS SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACO PARTICULADOS
Para este propósito, as células HeLa e CHO são incubadas em argilas líquidas cobertas com 8 câmaras (Nunc), em um meio de Eagle modificado da Dulbecco com e sem indicadores de pH compreendendo 10 μΜ dos sistemas de liberação de fármaco particulados produzidos no Exemplo 2 a 37 °C durante 30 min. As células são depois lavadas com médio, destacadas por tripsinização durante 5 min, colocadas em suspensão em PBS e imediatamente depois disso, a intensidade de fluorescência média/célula é determinada para um total de 10.000 células usando citômetro de fluxo (BD FACSCalibur System, Becton Dickinson, Heidelberg, DE). As células vivas são selecionadas com base em dispersões laterais e dianteiras. As células selecionadas mostram uma morfologia não prejudicada.
Todas as medições de captação de ingrediente ativo são realizadas com células vivas com um microscópio de expulsão a laser LSM510 inverso (Carl Zeiss, Gõttingen, DE), utilizando uma objetiva Plan-Apochromat 63x 1.4 N.A. A incubação com peptídeo ocorre como descrito para a citometria de fluxo. Para detectar a carboxifluoresceína, a fluorescência é excitada com a linhagem 488 nm de um laser de íon de argônio através de um divisor de feixe HFT UV/488; a fluorescência é detectada com um filtro BP 505-550 bandpass.
A figura 3 mostra por meio de exemplo a mudança nos sinais de células CHO após incubação durante 30 minutos sob o microscópio de fluorescência confocal. A boa profundidade de penetração do sinal de fluorescência (sinal de ingrediente ativo) é evidente. Consequentemente, nenhuma ligação covalente do peptídeo de sinal para o ingrediente ativo ou para o veículo polimérico é necessária a fim de garantir o transporte do ingrediente ativo através da membrana celular.
Em uma outra experiência, um sistema de liberação de fármaco particulado foi produzido em analogia aos exemplos 1 e 2 com uma combinação das tinturas fluorescentes Cy3 (0,5 % em peso) e Cy5 (0,5 % em peso), e as células CHO foram incubadas com elas. A absorção direcionada de ambas as tinturas nas células CHO foi detectável também neste caso.
EXEMPLO 4: LACTOFERRINA HUMANA E BOVINA COMO SUBSTÂNCIA DE SINAL GERAL:
Células e reagentes: As células de carcinoma HeLa humanas utilizadas são derivadas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). As células HeLa foram cultivadas em meio RPMI 1640 estabilizado com glutamina e 2,0 g/l de NaHCOs (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) e com 10 % soro de bezerro fetal (PAN Biotech). Clorbromazina foi adquirida da (Calbiochem (Bad Soden, Germany), 5-(N-etil-Nísopropil)amÍlorida (ElPA), metil-p-ciclodextrina (MpCD) e MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólio] foram adquiridos da Sigma (Deisenhofen, Germany).
Peptídeos: Os peptídeos utilizados foram sintetizados por microcoleções EMC (Tübingen, Germany). A pureza de todos os peptídeos foi verificada por HPLC analítica. A identidade dos peptídeos foi confirmada por espectrometria de massa MALDI-TOF. A pureza de todos os peptídeos foi > 95 % (214 nm HPLC). Os peptídeos foram N-terminalmente rotulados com carboxifluoresceína (como descrito na Fischeret al., Bioconjugate Chem. 14, 653-660, 2003).
Solução de matéria-prima dos peptídeos: Os peptídeos foram absorvidos em DMSO para resultar em uma solução de 10 mM. A solução de matéria-prima resultante foi misturada com PBS ou meio. A concentração de peptídeo da solução de matéria-prima DMSO foi verificada por meio da absorção de carboxifluoresceína. Isso ocorreu pela espectrometria de UV/VIS com uma diluição de 1:100 da solução de matéria-prima com tampão 0,1 M Tris/HCI (pH 8,8), a absorção em 492 nm foi medida, e carboxifluoresceína foi assumida de ter um coeficiente de extinção de 75.000 l/(mol-cm).
Citometria de fluxo: Para determinar a eficiência de carga com peptídeos, as células HeLa foram introduzidas em uma densidade de 50.000 por cavidade em uma placa de 24 cavidades (Sarstedt, Nümbrecht, Ger many) em soro contendo RPMI 1640. Depois de um dia, as células foram lavadas com meio e dissolvidas com os peptídeos nas concentrações desejadas e incubadas em 300 pl de RPM11640 durante 30 min. Cada mistura foi realizada em triplicata. Após a incubação, as células foram lavadas com meio e destacadas por tripsinização durante 5 minutos, colocadas em suspensão em PBS gelado contendo 0,1 % (p/v) BSA e imediatamente determinadas por citometria de fluxo (BD FACS Calibur Systems, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). A fluorescência de 7000 células vitais foi alcançada em cada amostra. As células vitais foram identificadas pela dispersão lateral ou dianteira.
EXEMPLO 4.1: EFICIÊNCIA DA ABSORÇÃO DE PEPTÍDEOS DE LACTOFERRINA HUMANA E BOVINA
Os peptídeos derivados de lactoferrina humana ou bovina foram preparados pela síntese de peptídeo de fase sólida. Para verificar a absorção e a distribuição intracelular dos peptídeos em células vivas, ambos os peptídeos foram modificados com carboxifluoresceína no N terminal. A fim de determinar se os peptídeos de lactoferrina derivados possuem uma atividade como peptídeos penetrantes de célula, a fluorescência associada com a célula das células HeLa incubadas com peptídeos bLF ou peptídeos hLF foi determinada por citometria de fluxo. Para comparação, os peptídeos Antp e Tat foram selecionados como peptídeos penetrantes da célula bem estabelecidos.
Como mostrado na figura. 4, a fluorescência celular, medido por citometria de fluxo, aumenta com o aumento da concentração de peptídeo para todos os quatro peptídeos.
EXEMPLO 4.2: DETERMINAÇÃO DAS CONEXÕES ESTRUTURAATIVIDADE
O peptídeo hLF, tendo 22 aminoácidos, é um peptídeo penetrante da célula de comprimento médio. A nonaarginina possui apenas nove aminoácidos, enquanto o peptídeo penetrante da célula popular transportan possui 27. Quatro dos sete aminoácidos catiônicos e o aminoácido aromático estão neste caso localizados perto do resíduo de citosina. Na proteína completa, o resíduo de citosina forma uma ponte de dissulfeto, por meio da qual o domínio forma uma conformação em loop. Além disso, a absorção celular dos peptídeos truncados (LF1 e LF2, Tabela 1) desprovidos do resíduo de cisteína terminal em comparação com as proteínas completas foi testada.
TABELA 1: ESTRUTURA PRIMÁRIA DOS PEPTÍDEOS TESTADOS
NQ peptídeo Seqüência
1 peptídeo Tat FIuo-YGRKKRRQRRR-CONH2
2 peptídeo Antp FIuo-RQIKIWFQNRRMKWKK-CONH2
3 peptídeo hLF Fluo-KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR-
CONH2
4 peptídeo bLF FIuo-PEWFKCRRWQWRMKKLGA-CONH2
5 peptídeo LF1 FIuo-FQWQRNMRKVRGPPVS-CONH2
6 peptídeo LF2 FIuo-FQWQRNMRKVR-CONH2
Todos os peptídeos foram sintetizados como amidas de peptídeo. Fluo representa 5(6)-carboxifluoresceína, e CONH2 representa o C terminal submetido a amida dos peptídeos. As seqüências de aminoácido inalteradas correspondem à SEQ ID NQS 3-6 (Tabela 1 entrada No. 3-6), a seqüência Tat inalterada corresponde à SEQ ID No. 27, e a seqüência Antp inalterada corresponde à SEQ ID No. 28.
Os resultados da citometria de fluxo são representados na figura
5. A absorção dos peptídeos LF1 e LF2, desprovidos das cisteínas, foi apenas um décimo da quantidade absorvida de peptídeo hLF que compreende igualmente resíduos de cisteína.
EXEMPLO 4.3: CITOTOXICIDADE DE PEPTÍDEOS HLF
Nas experiências acima descritas, as concentrações de peptídeo hLF de cerca de 40 μΜ foram empregadas, pelas quais nenhum efeito citotóxico foi observado. No entanto, os tempos de incubação relativamente curtos de menos do que uma hora foram utilizados quando se observa a absorção de peptídeo em células vivas. Além disso, por conseguinte, 0 efeito dos tempos de incubação mais longos e concentrações mais elevadas dos peptídeos sobre a capacidade das células de sobreviver foi testado. As célu38
Ias HeLa foram para este propósito incubadas com peptídeo hLF em uma concentração de 1,25 μΜ a 160 pm durante 0,5 ou 6 h. A vitalidade das células foi então determinada com um teste MTT. Os resultados são resumidos na figura. 6.
Nenhum efeito citotóxico pode ser observado nas células incubadas durante apenas 30 min com o peptídeo até uma concentração de 40 μΜ. A capacidade das células de sobreviver foi ligeiramente reduzida em uma concentração de peptídeo de 5 μΜ após 6 h. As células foram mortas em concentrações acima de 40 μΜ.
EXEMPLO 5
Carga de partículas de liberação de fármaco com e sem peptídeos de sinal derivados da lactoferrina humana e ácido a-lipóico.
EXEMPLO 5.1
O poliéster hiper-ramificado empregado foi obtido pela transformação hidrofóbica de um poliéster hiper-ramificado hidrofílico (comercialmente disponível da Perstorp® sob o nome Boltorn H30®) que tinha um peso molecular médio ponderado Mw de 3500 g/mol, uma temperatura de transição vítrea de cerca de 35 °C e um número de hidróxi de cerca de 490 mg de KOH/g. A transformação hidrofóbica ocorrería pela esterificação do polímero hidrofílico com uma mistura de ácido esteárico e ácido palmítico (relação de ácido esteárico para ácido palmítico = 2 para 1 com base na massa), com 50 % dos grupos de hidróxi do polímero hidrofílico sendo reagido. O peso molecular Mw era 7500 g/mol.
O produto foi produzido pela dissolução de 20 %, em peso, de ácido α-lipóico (CAS: 62-46-4; comercialmente disponível da Degussa® AG) no polímero fundido em uma temperatura de cerca de 65 °C com uma agitador espiral (200 rpm) em um primeiro recipiente de mistura dentro de 5 minutos.
Uma mistura de tensoativos consistindo em 1 % em peso de álcool polivinílico (M = 6000 g/mol, Polisciences®, Warrington, USA) e 0,1 % em peso de um álcool graxo etoxilado (Tego® Alkanol L4 da Degussa® AG) foi introduzida em água a 50 °C com agitação em um outro recipiente de mistura.
Subseqüentemente, a fusão polimérica preparada no primeiro recipiente de mistura e contendo além do polímero também a substância a ser encapsulada foi transferida do primeiro recipiente de mistura durante a agitação contínua (ULTRA-TURRAX, 3000 rpm) para o segundo recipiente de mistura a 50 °C.
As partículas formadas após um tempo de permanência de 2 minutos e esfriamento da composição contida no segundo recipiente de mistura a uma temperatura que foi 25°C abaixo do ponto de fusão do polímero. A suspensão foi passada através de uma bomba de tubulação para uma centrífuga em que as partículas de ingrediente ativo foram separadas da fase contínua a 25 °C. As partículas de ingrediente ativo foram depois secadas em 25eC e 103 Pa 10 mbar em um secador a vácuo durante 100 h.
As partículas eram isentas de solventes indesejados e consistia em poliéster modificado por ácido graxo hiper-ramifiçado e cerca de 4 % em peso de ácido α-lipóico, com base na massa de partículas.
O teor de partícula de ácido α-lipóico foi determinado por HPLC após extração com metanol ou metanol/água, e 5,4 % em peso de ácido alípóico (ácido tiótico) estiveram presente.
Uma amostra das partículas obtidas desta maneira foi intumescida com o peptídeo de sinal do Exemplo 4, Tabela 1, Ne 3 em uma solução de acetonitrila/água durante cerca de 30 min e extraída por filtração com sucção em um filtro, e o material polimérico fluorescente externamente seco foi depois fixado em um suporte de tântalo de uma tira de filtro de papel com o material polimérico carregado por meio de fita adesiva e secado sob vácuo elevado durante a noite a fim de remover os vestígios de acetonitrila.
Parte das amostras foi seca e fixada e colocada em contato sobre uma lâmina adesiva de grafita. A morfologia sobre o material de amostra foi visualizada por micrógrafos eletrônicos de varredura. Os exames correspondentes são representados na figura. 7. As figuras 7 A e 7 B mostram micrógrafos eletrônicos de partículas carregadas com ácido α-lipóico. As figuras 7 C e 7 D mostram micrógrafos eletrônicos de partículas carregadas com ácido lipóico e o peptídeo de sinal.
Condições de varredura:
Microscópio: Jeol JSM 6400
Voltagem de aceleração: 20 KV
Distância de operação: 15 milímetros
As partículas resultantes (com e sem carga de peptídeo de sinal) foram caracterizadas por espectroscopia eletrônica de fóton com raio X analítico superficial (XPS) (analisador de superfície XPS da Leybold, Cologne, Mg edge). Os resultados estão representados nas Tabelas 2 e 3. As partículas sem peptídeos mostraram os sinais específicos do átomo do polímero veículo (C e O), e a formulação com peptídeo de sinal adicionalmente apresentou o sinal de nitrogênio (N) característico. O resultado mostra que o veículo, peptídeo sinal e ingrediente ativo estão na forma de uma agregação simples, que não é covalentemente ligado. O peptídeo de sinal é adicionalmente detectável sobre a superfície de partícula.
Tabela 2: Elemento Átomo% Órbita Reg Faixa
C 90,30 1s 291,8..279,6
O 9,10 1s a2 533,6-528,7
S 0,60 2p a5 167,2-161
Tabela 3: Elemento Átomo% Órbita Reg Faixa
C 91,17 1s 291,6-280,3
N 0,22 1s a3 402,2-398,3
O 8,34 1S a2 534-528,3
S 0,27 2p a5 166-162,2
EXEMPLO 5.2:
O produto foi produzido por dissolver 1 % em peso de ácido alipóico (CAS: 62-46-4; comercialmente disponível da Degussa® AG) e 4 % em peso de poli(DL-lactídeo-co-glicolídeo) (CAS: 26780-50-7, comercialmente disponível como RESOMER® RG 502H da Boehringer Ingelheim) em 95 % em volume de acetonitrila na temperatura ambiente usando uma agitador de pá (200 rpm) em um primeiro recipiente de mistura dentro de 5 minutos.
% em peso de um álcool graxo etoxilado (Tego® Alkanol L4 da Degussa® AG) em óleo de colza (ΕΑΝ N9 22112682, obtido da Associa-
Figure BRPI0617775B1_D0006
. 41 ted Oil Packers GmbH) foi introduzido com a agitação em temperatura ambiente em um outro recipiente de mistura.
Depois a solução polimérica que foi preparada no primeiro recipiente de mistura e que, além do polímero, também compreendia a substân5 cia sendo encapsulada, foi transferida do primeiro recipiente de mistura durante a agitação contínua (agitador de hélice, 500 rpm) para dentro de um segundo recipiente de mistura em temperatura ambiente.
Após um tempo de permanência de 3 horas, o solvente orgânico foi evaporado e as partículas formadas. O óleo vegetal é misturado com n10 hexano (na relação de 1:1 em massa) no mesmo recipiente dè mistura e depois as partículas são extraídas por filtração. As partículas filtradas foram secadas em um secador a vácuo em 50°C e 103 Pa (10 mbar) durante 100 h.
O teor de partícula de ácido α-lipóico foi determinado por HPLC 15 após extração com metanol ou metanol/água, e 0,4 % em peso de ácido alipóico (ácido tiótico) estava presente.

Claims (5)

1. Sistema de liberação de medicamento particulados, caracterizado pelo fato de que compreende:
um veículo polimérico, pelo menos uma substância de sinal para o transporte através de uma barreira biológica compreendendo pelo menos um peptídeo derivado de proteína lactoferrina que consiste na SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30, e pelo menos um ingrediente ativo, em que o veículo polimérico, a substância de sinal e o ingrediente ativo não apresentando nenhuma ligação covalente de um com o outro.
2. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto a substância de sinal quanto o ingrediente ativo estão presentes dispersos ou submetidos a coacervação no veículo polimérico.
3 do com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo consistindo em anticorpos, hormônios de peptídeo, receptores ou ligantes peptídicos destes, enzimas, interferons, fator da necrose tumoral, caquectina, diidrofolato reductase, linfotoxina, interleucinas, proteínas supressoras de tumor, plasmina, urocinase, hirudina, estreptocinase, urocinase, ativador de plasminogênio do tecido, proteína C, proteína S, fosfolipase A2, uromodulina, proteína TammHorsfall, insulina, inibidor da tripsina, lisozima, timopoietina, antibióticos de peptídeo, eritropoietina, substâncias hepatoterapêuticas, substâncias neuroprotetoras, imunoterapêuticos, imunossupressores, ingredientes ativos de peso molecular baixo para distúrbios cardiovasculares ou câncer, analgésicos, antiinflamatório de peso molecular baixo, ingredientes ativos antibióticos e antimicrobianos, hormônios de peso molecular baixo, fragmentos de ácido nucléico, ácidos nucléicos, análogos de nucleosídeo, β-interferons, ácido alipóico, análogos de peptídeo, inibidores de enzima ou receptor, agonistas de enzima ou receptor, antagonistas de enzima ou receptor, prostaglandinas, esteróides, citostáticos, antibióticos heterocíclicos e seus pró-fármacos.
12. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o ingrediente ativo é ácido α-lipóico.
13. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o veículo polimérico é polilactídeo-co-glicolídeo.
14. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a substância de sinal consiste na SEQ ID No. 3.
15. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a substância de sinal consiste na SEQ ID No. 4.
16. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de
Petição 870190067393, de 17/07/2019, pág. 14/19 que a substância de sinal consiste na SEQ ID No. 29.
17. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a substância de sinal consiste na SEQ ID No. 30.
3. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o veículo polimérico compreende pelo menos um polímero ramificado ou reticulado com uma proporção de mais do que 50 % em peso com base no peso total do veículo.
4. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o veículo polimérico é um polímero dendrítico.
5. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o veículo polimérico ramificado é um hidrogel ou um polímero em pente.
6. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o veículo polimérico é um polímero dendrítico tendo uma massa molar acima de 1000 g/mol e/ou uma viscosidade de fusão de menos do que 3,0 Pas a 80°C é empregado como veículo polimérico.
7. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o
Petição 870190067393, de 17/07/2019, pág. 12/19 veículo polimérico é pelo menos um:
veículo polimérico dendrítico selecionado do grupo consistindo em dendrímeros de poliamidoamina, de dendrímeros de polipropilenoimina, de dendrímeros com base em óxido de polietileno, de dendrímeros de poliéter, dendrímeros de poliamido, de dendrímeros de polilisina, de dendrímeros de éter poliarílico;
um polímero dendrítico do grupo consistindo em poliésteres, poliesteramidas, poliéteres, polyamidas, polietilenoiminas; policaprolactonas, poligliceróis, poliglicolídeos, polilactídeos, polilactídeo-co-glicolídeos, politartaratos e polissacarídeos; ou um polímero veículo reticulado selecionado do grupo consistindo em homo- ou copolímeros de carboidrato naturais e artificiais, de polímeros de aminoácido naturais e artificiais, de ácidos nucléicos naturais e artificiais, de poliaminas, de poliiminas, de poliésteres, de poliéteres, de polióis, de poliolefinas, de polialquilenos glicóis, de poliamidas, de poliacetáis, de poliacrilatos, de poliacetatos, de poliuretanos, de polímeros de organossilício, de resinas epóxi, de politióis, de policarbonatos, de policaprolactonas, de poliglicolídeos, de polilactídeos, de polilactídeo-co-glicolídeos e de politartaratos.
8. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o ingrediente ativo é um ingrediente farmacêutico ativo não modificado.
9. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os ingredientes ativos e/ou substâncias de sinal contidos são não especificamente agregados em diferentes camadas nas partículas de liberação de medicamento.
10. Sistema de liberação de medicamento particulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que existe agregação não específica de ingrediente ativo em uma camada interna e da substância de sinal em uma camada subsequente no sistema de liberação de medicamento particulado.
11. Sistema de liberação de medicamento particulados de acor-
Petição 870190067393, de 17/07/2019, pág. 13/19
5 18. Processo para produzir sistema de liberação de medicamento particulado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende combinar o veículo polimérico, a substância de sinal e o ingrediente ativo em uma forma particulada.
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