BRPI0617401A2

BRPI0617401A2 - nanopartÍculas de quitosana e heparina

Info

Publication number: BRPI0617401A2
Application number: BRPI0617401-9A
Authority: BR
Inventors: Ana Isabel Vila Pena; Silvia Suarez Luque; Ma Jose Alonso Fernandez
Original assignee: Advanced In Vitro Cell Tech S L
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CN101374530A; EP1774971A1; JP2009511549A; CA2625620A1; WO2007042572A1; KR20080056210A; AU2006301162B2; IL190696A0; EP1937282A1; AU2006301162A1; US20080317864A1

Abstract

NANOPARTICULAS DE QUITOSANA E HEPARINA A invenção é dirigida a sistemas nanoparticulados para a liberação controlada de heparina. É especificamente dirigida a sistemas nanoparticulados compreendendo quitosana, heparina e opcionalmente um derivado polioxietilenado, e que são ionicamente reticulados, bem como é dirigida a processos para a obtenção dos mesmos.

Description

NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA E HEPARINA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção é dirigida para sistemas nanoparticuladospara a liberação controlada de heparina. É particularmentedirigida para sistemas nanoparticulados compreendendoquitosana, heparina e opcionalmente um derivadopolioxietilenado, os quais são reticulados ionicamente, bemcomo a processos de obtenção dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os sistemas para a liberação de agentes biologicamenteativos formam um campo de pesquisa em constantedesenvolvimento. É conhecido que existem desvantagens naadministração de ingredientes ativos aos corpos humanos eanimais através de diferentes vias de administração. Algunsfármacos, entre os quais estão os peptideos, proteínas epolissacarídeos, não são eficazmente absorvidas através desuperfícies de mucosa devido à permeabilidade limitada dasbarreiras epiteliais nos corpos humanos e animais. Um exemplodestes fármacos apresentando uma capacidade pequena paraatravessar barreiras da mucosa é a heparina, a administraçãodesta é atualmente por via parenteral ou subcutânea, istotorna, portanto, necessário o desenvolvimento de sistemas deadministração que permitam uma melhor absorção desta moléculaativa através da mucosa se vias alternativas a estasatualmente existentes estão para ser encontradas. Também éespecialmente desejável que elas possam ser administradasoralmente.

Existem documentos que descrevem polímerosbiocompatíveis e biodegradáveis, tais como a quitosana,combinada com a heparina e seus usos farmacêuticos.

Desta forma, o documento EP0771206 descreve o uso de umamatriz de quitosana e heparina imobilizada nesta porprecipitação ou por ligações covalentes, para fabricar umfármaco capaz de regenerar tecidos duros, tais como o tecidoósseo. A combinação pode ser na forma de pó, solução, filme ougel.

A patente EP0930885 também se refere ao uso de heparinaem combinação com quitosana para a obtenção de um fármaco queprevine infecções causadas pelo vírus da herpes. Esta podeestar em qualquer forma física, tal como uma suspensão, umasolução ou um gel.

As patentes EP0772446 e EP0759760 descrevem o uso dequitosana e um polissacarídeo, tal como heparina imobilizadanestes por meio de ligações iônicas ou covalentes ou porinclusão mecânica, para regenerar tecidos no caso deferimentos. A composição pode ser na forma de um filme, umamembrana, um tubo, uma solução, um pó ou um gel.

Nenhum destes documentos menciona um sistema na forma denanopartí cuias ou seu uso para administração controladaatravés da mucosa.

Por outro lado, o pedido de patente WO 03/090763 édirigido ao uso de uma composição aquosa compreendendocomplexos de quitosana em combinação com heparina paratratamento retal de doenças inflamatórias por administraçãotópica da solução.

O pedido de patente WO 96/20730 se refere à formulaçãofarmacêutica compreendendo uma quitosana com um grau deacetilação e peso molecular específicos como um polímero quepermite o aumento da permeabilidade epitelial de fármacoshidrofílicos. Heparina com baixo peso molecular é mencionadaentre outros princípios ativos como um possível agenteterapêutico.

A incorporação de ingredientes ativos em partículaspequenas é para ser enfatizada entre as possibilidadespropostas recentemente para se superar a barreira biológicaconfrontadas pelas drogas.

Neste sentido, os pedidos de patentes WO 98/04244, WO2004/009060 e WO 2004/112758 descrevem sistemasnanoparticulados contendo quitosana para a administração deingredientes ativos.

O pedido de patente WO 96/05810 descreve partículas dequitosana para administração sobre mucosa, especificando aadição de uma solução de heparina com baixo peso molecular amicroesferas de quitosana já formadas de tamanhos entre 10-50mícrons, formando uma suspensão que é congelada e liofilizadapara sua administração.

Andersson, M. e Lofroth, JE descrevem em Int. J. Pharm.2003, 257(1-2) 305-309, partículas de tamanho nanométrico deum complexo de heparina/quitosana que são formadas commicroemulsões.Apesar das numerosas publicações dirigidas aodesenvolvimento de sistemas de liberação de heparina, aindaexiste uma grande necessidade para o provimento de um tipo desistema de partículas de pequeno tamanho de fácil produção ecom altos rendimentos, tendo uma grande capacidade paraassociação com heparina e que permita a liberação da mesmaatravés da mucosa em uma taxa controlada.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Com a presente invenção, os inventores revelaram que umsistema feito de nanopartículas compreendendo quitosana eheparina, na presença de um derivado polioxietilenado ou não,e obtido por meio de um processo de gelificação iônica napresença de um agente que causa a reticulação da quitosana,permite uma associação eficaz da molécula de heparina bem comoa posterior liberação da mesma em um ambiente biológicoadequado. Surpreendentemente, estas nanopartículas sãoestáveis em fluidos gastrintestinais e apresentam umaexcelente eficácia e biodisponibilidade, tal como demonstradopor dados obtidos in vivo. A liberação ocorre de formacontrolada e lenta. Estes sistemas são, portanto, bastanteadequados para administração oral. De fato, os níveis deheparina no plasma que têm sido obtidos por meio deadministração oral destas nanopartículas são até 10 vezesmaiores que quando a heparina é administrada em uma solução.

Além disso, os sistemas nanoparticulados propostos nainvenção para associação e liberação controlada de heparinatêm numerosas vantagens tais como (1) o processo deincorporação da heparina é simples e não requer o uso deingredientes tóxicos para o organismo; (2) suas propriedadesfisico-quimicas, especificamente seu tamanho e sua carga desuperfície, podem ser moduladas de acordo com a razão doscomponentes da formulação e seus pesos moleculares; (3) têmuma capacidade de associação com a heparina extraordinária; e(4) liberam a dita molécula ativa em uma taxa controlada.

Portanto, um objeto da presente invenção consiste em umacomposição farmacêutica compreendendo nanopartículas com umtamanho menor que 1 micrômetro para a liberação controlada deheparina, em que as nanopartículas compreendem pelo menosquitosana ou um derivado da mesma, e pelo menos uma heparinaou um derivado da mesma, e em que as ditas nanopartículas sãoreticuladas por meio de um agente de reticulação.

Em uma realização preferida da invenção, o agente dereticulação é um sal de polifosfato, preferivelmentetripolifosfato de sódio.

Em outra realização da invenção, as nanopartículascompreendem:

a) entre 50% e 90% em peso de quitosana ou um derivadoda mesma, e

b) entre 10% e 50% em peso de heparina ou um derivado damesma.

Em outra realização, as nanopartículas de quitosana-heparina adicionalmente compreendem um composto

polioxietilenado, preferivelmente um polioxietileno ou umcopolímero de óxido de etileno e óxido de propileno.Em outra realização da invenção, as nanoparticulasapresentam uma superfície de carga elétrica ou potencial Z quevaria entre 0 mV e +50 mV, preferivelmente a carga elétricavaria entre +1 e +40 mV.

Em uma realização preferida, a composição é paraadministração através da mucosa.

Em uma outra realização preferida, a composição é paraadministração oral.

Em uma outra realização da invenção, as nanoparticulasestão na forma liofilizada.

Um outro objeto da invenção consiste em um processo paraa preparação de uma composição farmacêutica para liberaçãocontrolada de heparina tal como aquela definida acima ecompreendendo:

a) preparar uma solução aquosa compreendendo quitosanaou um derivado da mesma;

b) preparar uma solução aquosa compreendendo heparina ouum derivado da mesma e o agente de reticulação; e

c) misturar, com agitação, as soluções das etapas a) eb), de tal forma que as nanoparticulas de quitosana-heparinasão obtidas por meio de gelificação iônica.

Em uma realização da invenção, este processo compreendeainda uma etapa adicional depois da etapa c) em que asnanoparticulas são Iiofilizadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

A figura 1 mostra níveis de heparina com baixo pesomolecular (LMWH, Iow molecular weight heparin) no plasmaexpressos como atividade anti-Xa (Ul/ml) depois daadministração oral de LMWH em solução e associada ananoparticulas de quitosana com alto peso molecular (HMWCS,high molecular weight chitosan) em ratos (n = 5).

A figura 2 mostra níveis de heparina com baixo pesomolecular (LMWH) no plasma expressos como atividade anti-Xa(UI/ml) depois da administração oral de LMWH em solução eassociada a nanoparticulas de quitosana com baixo pesomolecular (LMWCS) em ratos (n = 5).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

0 sistema da presente invenção compreende nanoparticulascuja estrutura é um reticulado de quitosana e heparina. Aestrutura é mantida unida por interações eletrônicas entre aquitosana (com carga positiva) e a heparina (com carganegativa), não havendo substancialmente qualquer ligaçãocovalente entre elas.

O termo "nanopartícuia" é entendido como uma estruturaformada pela interação eletrostática entre a quitosana e aheparina e a partir da gelificação ionotrópica do ditoconjugado por meio da adição de um agente de reticulaçãoaniônica. A interação eletrostática resultante entre ambos oscomponentes das nanoparticulas e a posterior reticulação geramentidades com características físicas, que são independentes eobserváveis, cujo tamanho médio é menor que 1 μπι, isto é, umtamanho médio entre 1 e 999 nm.

Pelo termo "tamanho médio" entende-se o diâmetro médioda população de nanoparticulas, que compreende a estruturapolimérica reticulada, que se move em conjunto em um meioaquoso. 0 tamanho médio destes sistemas pode ser medidoutilizando-se os procedimentos padrão conhecidos por umtécnico no assunto, e que são descritos, por exemplo, na parteexperimental abaixo.

As nanoparticulas do sistema da invenção têm um tamanhomédio de partícula menor que 1 μιη, isto é, têm um tamanhomédio entre 1 e 999 nm, preferivelmente entre 50 e 800 nm,mais preferivelmente entre 50 e 500 nm, ainda maispreferivelmente entre 50 e 200 nm. O tamanho médio departícula é influenciado principalmente pelo peso molecular daquitosana, pelo grau de desacetilação da quitosana, pelaproporção de quitosana em relação ao derivadopolioxietilenado, se presente, e também pelas condições deformação da partícula (concentração da quitosana, concentraçãodo agente de reticulação e razão entre eles). Em geral, apresença do derivado polioxietilenado provoca um aumento notamanho médio de partícula com respeito aos sistemas formadospor quitosana sem o dito derivado.

As nanoparticulas podem ter uma carga elétrica desuperfície (medida por potencial Z) que varia dependendo daproporção da quitosana e da heparina nas nanoparticulas. Acontribuição para a carga positiva é atribuída aos gruposamina da quitosana, enquanto que a contribuição para a carganegativa é atribuída aos grupos carboxílicose sulfato daheparina. Dependendo da proporção quitosana/heparina eparticularmente do grau de desacetilação e da presença ouausência de sais inorgânicos, a magnitude da carga pode variarentre 0 mV e +50 mV, preferivelmente entre +1 e +40 mV.

Freqüentemente, é interessante que a carga da superfícieseja positiva a fim de melhorar a interação entre asnanopartículas e as superfícies biológicas, particularmentesuperfícies mucosas, que são negativamente carregadas. Destaforma, a molécula biologicamente ativa irá favoravelmente agirnos tecidos alvo. Entretanto, em algumas circunstâncias, umacarga neutra pode ser mais adequada a fim de assegurar aestabilidade das nanopartículas após a administraçãoparenteral.

Quitosana

A quitosana é um polímero natural que tem uma estruturade aminopolissacarídeo e um caráter catiônico. Compreende arepetição de unidades de monômero de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde η é um número inteiro e representa o grau depolimerização, isto é, o número de unidades de monômero em umacadeia de quitosana.

Em adição a estas unidades de monômero, a quitosanageralmente contém uma proporção de unidades de monômeros emque o grupo amino é acetilado. De fato, a quitosana é obtidapela desacetilação de quitina (100% acetilada). O dito grau dedesacetilação fica em geral dentro de uma faixa compreendidaentre 30 e 95, preferivelmente entre 55 e 90, o que indica queentre 10 e 45% dos grupos amino são acetilados.

A quitosana usada para obter as nanoparticulas dapresente invenção tem um peso molecular compreendido entre 2 e2000 kDa, preferivelmente entre 2 e 500 kDa, maispreferivelmente entre 5 e 150 kDa.

Em uma realização particular da invenção, a assimchamada quitosana de baixo peso molecular (LMWCS) é usada, naqual o dito peso molecular é menor que 10 kDa. Em uma outravariante a assim chamada quitosana de alto peso molecular(HMWCS) é usada, na qual o peso molecular varia entre 100 e150 kDa.

Como uma alternativa à quitosana, um derivado da mesmatambém pode ser usado, entendendo-se por isto uma quitosana emque um ou mais grupos hidroxila e/ou um ou mais grupos aminaforam modificados, com o objetivo de aumentar a solubilidadeda quitosana ou aumentar a natureza adesiva da mesma. Estesderivados incluem, entre outros, quitosanas acetiladas,alquiladas ou sulfonadas, derivados tiolados, como é descritoem Roberts, Chitin Chemistryl Macmillan, 1992, 166.Preferivelmente, quando um derivado é usado é selecionado deéteres O-alquil, ésteres O-acil, trimetil quitosana,quitosanas modificadas com polietilenoglicol, etc. Outrosderivados possíveis são sais, tais como citrato, nitrato,lactato, fosfato, glutamato, etc. Em qualquer caso, um técnicono assunto sabe como identificar as modificações que podem serfeitas em uma quitosana sem afetar a estabilidade eviabilidade comercial da formulação final.

Heparina

A heparina é uma substância natural no sangue, umpolissacarideo envolvido no processo de coagulação do sangue.Sua estrutura química compreende a repetição de unidades demonômeros de fórmula (II):

<formula>formula see original document page 12</formula>

onde η é um número inteiro e representa o grau depolimerização, isto é, o número de unidades de monômero em umacadeia de heparina.

A heparina tradicional ou não fracionada (UFH) édistinta da heparina fracionada ou com baixo peso molecular(LMWH). A primeira é uma substância natural, presente em todosos vertebrados. É formada por cadeias múltiplas com pesosmoleculares variáveis, que dão a ela uma grandeheterogeneidade, entretanto, todas as cadeias são integradaspor uma combinação de dois açúcares: ácido urônico eglucosalina. O comprimento da cadeia varia, embora possa serestabelecido que tem uma média de 50 açúcares por cadeia, como peso molecular médio de 15 kDa. É usada como tal oupreferivelmente na forma de um sal, tal como, por exemplo, seusal de sódio ou de cálcio.

A heparina fracionada ou com baixo peso molecular éproduzida por despolimerização química ou enzimática deheparinas convencionais. Exemplos deste tipo de heparina sãoenoxaparina, parnaparina, dalteparina e nadroparina, e seussais tais como seus sais de sódio e de cálcio. Em geral, ascadeias tendo 18 açúcares, ou 5,4 kDa, são obtidas, em grandeproporção. Com este comprimento, os efeitos da heparina sealteram sob o ponto de vista enzimático, assim como suafarmacocinética.

Os derivados de heparina também podem ser usados nolugar da heparina não fracionada ou com baixo peso molecularem uma composição da presente invenção. Estes derivados sãoconhecidos e originados a partir da reatividade de gruposfuncionais diferentes presentes nas moléculas como pode servisto na fórmula II. Desta forma, heparinas N-desulfatadas, N-acetiladas, O-descarboxiladas, heparinas oxidadas oureduzidas, etc., são conhecidas.

Entre as aplicações conhecidas das heparinas ou seusderivados estão a prevenção e o tratamento de trombose venosaprofunda, tromboembolismo pulmonar, arterial ou cerebral, aprevenção de coágulos em pacientes submetidos a cirurgias, adiálise ou a transfusão de sangue, devido a sua atividadeanticoagulante.

A composição da invenção, compreendendo nanoparticuiaspara a administração de heparina ou derivados da mesma,preferivelmente apresenta um conteúdo de quitosana ou dederivado de quitosana compreendido entre 50 e 99% em peso,preferivelmente entre 50% e 90% em peso. Por outro lado, oconteúdo de heparina no sistema é preferivelmente compreendidoentre 10 e 50% em peso, preferivelmente entre 25% e 40% empeso.

O sistema de nanoparticula de quitosana-heparina dainvenção é caracterizado pelo fato de ter sido formado pormeio de um processo de precipitação conjunta de quitosana eheparina na forma de nanogrupos poliméricos causada pelaadição de um agente de reticulação. O uso de solventes

orgânicos ou condições extremas de pH ou substâncias tóxicasauxiliares não é requerido. A associação da heparina àsnanoparticulas ocorre de acordo com um mecanismo de interaçãoiônica. A heparina tem numerosos grupos negativos em suaestrutura, grupos sulfato e carboxilato, que justificam a alta

afinidade iônica para os grupos amino positivos de quitosana,favorecendo o surgimento da nanoparticula. A presença doagente de reticulação permite a reticulação do sistema dequitosana-heparina de modo que uma rede é formada enquanto aheparina é inserida, a qual pode posteriormente ser liberada.

Além disso, o agente de reticulação proporciona nanoparticulascom seu tamanho, potencial e características estruturais queas torna adequadas como um sistema de administração para adita molécula ativa.

O agente de reticulação é preferivelmente um salaniônico que permite a reticulação de um sistema de quitosana-heparina por meio de gelificação iônica, provocando a formaçãoespontânea de nanoparticulas. Preferivelmente é usado um salde polifosfato, o tripolifosfato de sódio (TPP) sendoespecialmente preferido.

Em uma realização particular do sistema da invenção, asnanoparticulas podem incluir um composto polioxietilenado. Umcomposto polioxietilenado é entendido como um polímerosintético hidrofílico de caráter não iônico apresentandounidades de óxido de etileno em sua estrutura, sendo preferidoo uso de um polioxietileno ou um copolímero poli(óxido deetileno) e poli(óxido de propileno) (PEO-PPO), comumentedenominados poloxâmeros. Estes polímeros são comercializadoscom diferentes pesos moleculares, entretanto, na presenteinvenção senso preferido o uso de derivados polioxietilenadostendo pesos moleculares compreendidos entre 2000 e 10000. Emuma realização preferida, o derivado polioxietilenado é umcopolímero tribloco (PEO-PPO-PEO), tal como, por exemplo,aquele comercialmente denominado Poloxamer 188.

A proporção de quitosana em relação ao compostopolioxietilenado que é incorporado ao meio de formação departícula pode ser bastante variável, variando entre 50:0 e1:100, preferivelmente entre 50:0 e 1:20. A presença docomposto polioxietilenado pode ter como efeito um ligeiroaumento do tamanho das nanoparticulas e isso ajuda aestabelecer o sistema coloidal. Se o mesmo é adicionadoposteriormente à formação da nanopartícula, isso forma umrevestimento que aumenta significantemente o tamanho da mesma.

Embora a presença do derivado polioxietilenado não sejanecessária para a obtenção das nanoparticulas, o mesmo permitemodificar características físico-químicas das ditasnanoparticulas (tamanho e potencial Ζ), e acima de tudo,estabilizar o sistema em fluidos gastrintestinais.

A preparação e formação de nanoparticulas de quitosana eum ingrediente ativo, por meio de um agente de reticulação napresença ou na ausência de um composto polioxietilenado, édescrita no documento WO 98/04244, o qual é incorporado aquiem sua totalidade como referência.

A composição farmacêutica da invenção pode serapresentada em forma liquida (suspensão de nanoparticula) ousólida. Neste caso, as nanoparticulas podem se encontrar emforma liofilizadaa ou de aspersão, formando um pó que pode serusado para fazer granulados, comprimidos, cápsulas oupreparações para inalação.

Embora a composição seja principalmente paraadministração através da mucosa, a composição farmacêutica dainvenção pode ser administrada por via oral, bucal ousublingual, transdérmica, ocular, nasal, vaginal ouparenteral. No caso de vias não parenterais, o contato dasnanoparticulas com a pele ou com a mucosa pode ser melhoradoao prover as partículas com uma significativa carga positiva,a qual irá favorecer sua interação com as ditas superfíciesnegativamente carregadas.

Em uma realização preferida, a formulação é administradapor via da mucosa. A carga positiva da quitosana proporcionauma melhor absorção de heparina na superfície da mucosaatravés de sua interação com a mucosa e as superfícies dascélulas epiteliais que são negativamente carregadas.Em uma outra realização preferida, a formulação éadministrada por via oral. Neste caso, as nanoparticulas têm avantagem adicional de serem estáveis em fluidosgastrintestinais, de modo que elas podem alcançar e permanecerno tecido epitelial intestinal de modo a liberar a heparina.

As composições farmacêuticas da invenção sãoespecialmente adequadas, entre outras, para a prevenção detrombose venosa em pacientes submetidos a cirurgiasortopédicas ou cirurgias em geral e em pacientes nãosubmetidos a cirurgias imobilizados, cuja situação pode ser

definida como uma situação de risco moderado ou alto. Sãotambém indicadas na prevenção de coagulação no circuitocirculatório extracorpóreo em hemodiálise, no tratamento detrombose venosa profunda estabelecida (com ou sem emboliapulmonar) e no tratamento de angina instável e infarto do

miocárdio, administradas em conjunto com outrosanticoagulantes.

Uma outra realização da presente invenção se refere a umprocesso para a preparação de nanoparticulas de quitosana-heparina tais como aquelas definidas anteriormente,compreendendo:

a) preparar uma solução aquosa de quitosana ou umderivado da mesma;

b) preparar uma solução aquosa de heparina e do agente dereticulação; e

c) misturar, com agitação, as soluções das etapas a) eb) , de tal forma que as nanoparticulas de quitosana-heparina sejam espontaneamente obtidas por meio degelificação iônica e posterior precipitação.

Em uma realização particular do processo mencionadoacima, a razão resultante entre agente dereticulação/quitosana fica compreendida entre 0,01/1 e 0,50/1,sendo preferida a razão entre 0,05/1 e 0,40/1, que proporcionaformulações com uma polidispersibilidade relativamente baixa.Entretanto, o uso de razões maiores ou menores entre agente dereticulação/quitosana também é possível.

Em outra realização do processo, o mesmo compreendeainda a incorporação do composto polioxietilenado à soluçãoaquosa de quitosana mencionada acima.

Em outra realização do processo para a obtenção dasnanopartículas da invenção, podem ser usados sais inorgânicos,tais como, por exemplo, cloreto de sódio, que permitemaumentar o rendimento da produção da nanopartícula. Os mesmospodem ser adicionados à solução de quitosana ou de derivado dequitosana. Entretanto, tem se observado que a adição de ditossais modifica a interação entre a quitosana e a heparina,causando um ligeiro decréscimo na quantidade de heparinaassociada ao sistema nanoparticulado, bem como a neutralizaçãoda carga da nanopartícula devido aos íons negativos do meioque são absorvidos na superfície positiva da quitosana.Levando-se isto em consideração, um técnico no assunto podeusar os ditos sais, de acordo com as características finaisdesejadas, no caso de baixos rendimentos, e em quantidades quelevam a um rendimento adequado, mas sem afetar negativamente ograu de associação ou a carga se isto é desejado, para sersuficientemente alto de maneira a melhorar a interação com amucosa.

Em ainda uma outra realização do processo, se desejadoque as nanoparticulas de quitosana-heparina sejam revestidaspelo composto polioxietilenado, este último é incorporadodepois da formação de nanoparticula.

Estes processos para preparar as nanoparticulas dainvenção permitem uma associação de heparina às nanoparticulasque excede a 90%. Variações ligeiras na dita associação podemser observadas dependendo do peso molecular da quitosana, doseu grau de desacetilação e da presença do derivadopolioxietilenado ou dos sais inorgânicos.

Uma vez que as nanoparticulas estejam formadas, elaspodem ser isoladas por meio de centrifugação em um leito deglicerol ou de glicose, ou em uma solução de trealose,descartando o sobrenadante, com o objetivo de separar asmoléculas de heparina que não estão associadas àsnanoparticulas. As nanoparticulas podem ser posteriormente re-suspendidas em água ou tampão para seu uso em suspensão.

O processo para a preparação de nanoparticulas dequitosana-heparina pode adicionalmente compreender uma etapaadicional em que as ditas nanoparticulas são liofilizadas ouatomizadas. Sob um ponto de vista farmacêutico é importante seser capaz de ter as nanoparticulas disponíveis na formaliofilizada, uma vez que isto aumenta sua estabilidade durantea armazenagem. As nanoparticulas de quitosana-heparina (em quea quitosana pode ser fisicamente misturada com um derivadopolioxietilenado) podem ser liofilizadas na presença de umcrioprotetor, tal como glicose, sacarose ou trealose, a umaconcentração de 5%. De fato, as nanopartículas da invenção têma vantagem adicional que o tamanho da partícula antes e depoisda liofilização não é significantemente modificado. Isto é, asnanopartículas podem ser liofilizadas e re-suspendidas semalteração das características das mesmas. Do mesmo modo, asditas nanopartículas também podem ser atomizadas pelo uso demanitol ou lactose como adjuvantes.

Alguns exemplos ilustrativos são descritos abaixomostrando as características e vantagens da invenção; eles nãodevem ser interpretados como limitantes do objetivo dainvenção.

EXEMPLOS

Como um processo comum a todos os exemplos detalhadosabaixo, as nanopartículas são caracterizadas sob o ponto devista do tamanho, do potencial Z (ou carga de superfície) , daeficácia da associação (porcentagem de heparina que foiassociada às nanopartículas) e do rendimento da produção(porcentagem de materiais que formam as nanopartículas).

A Distribuição de Tamanho foi realizada por meio deespectroscopia de correlação de fóton (PCS; Zeta Sizer, Nanoseries, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) , fornecendo valoresde tamanho médio e dispersão da população de nanopartículas(índice de polidispersão).

O Potencial Z foi medido por Anemometria Laser Doppler(LDA; Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments,UK). As amostras foram diluídas em água Milli-Q de modo adeterminar a mobilidade eletroforética.

A Quantificação da quantidade de heparina associada éindiretamente determinada pela quantificação de heparina quenão se associou, e esta última é por sua vez determinada pelaquantificação da atividade anti-Xa, usando um Kit HeparinaStachrom® (Diagnostica Stago, Roche). A fim de realizar estaquantificação, as nanopartículas são isoladas porcentrifugação e o sobrenadante obtido é filtrado através dePVDF de 0,22 μm.

O Rendimento de produção foi quantificado por meio dacentrifugação das nanopartículas a 16000 xg durante 40minutos, remoção posterior do sobrenadante (onde estarão oscomponentes que permanecem em solução) e finalmente pesagem doresíduo seco.

A quitosana (Protasan UP Cl 113) usada nos exemplos foiproveniente, de NovaMatriz-FMC Biopolymer, a heparina com baixopeso molecular da Aventis (Enoxaparina), o Poloxâmero 188 daBASF Corporation, e o restante dos produtos usados são daSigma Aldrich, tal como a heparina não fracionada, otripolifosfato de sódio, o cloreto de sódio, a sacarose, aglicose, o manitol e os sais para preparar os fluidosgastrintestinais simulados sem enzimas.

Exemplo 1

Preparação e caracterização das nanopartículas dequitosana com heparinas de pesos moleculares diferentes (napresença ou na ausência de Poloxâmero 188 na solução dequitosana)

As soluções aquosas de quitosana (CS) (1 mg/ml) forampreparadas com e sem o Poloxâmero 188 (4 e 10 mg/ml) . Estassoluções foram submetidas a agitação magnética enquanto umasolução aquosa de heparina com peso molecular diferente (UFH eLMWH; carga teórica de 25% em peso em relação à quitosana) etripolifosfato de sódio (TPP, CS/TPP razão: 1/0,1 - 1/0,4). Arazão volumétrica entre ambas as fases aquosas foi mantidaconstante, 1 ml de solução aquosa de quitosana: 0,2 ml desolução de heparina e agente de reticulação.

A incorporação do poloxâmero na fase aquosa da quitosanapode causar um ligeiro aumento no diâmetro da partícula e umligeiro decréscimo na percentagem de heparina associada aosistema nanoparticulado, independentemente do tipo de heparina(UFH ou LMWH), tal como pode ser visto na Tabela I. Em algumasformulações (especialmente aquelas que se associam com UFH) apresença do poloxâmero pode também causar um ligeirodecréscimo na carga de superfície (ou potencial Ζ) , emboraeste efeito seja geralmente insignificante. Estas modificações(características físico-químicas) observadas quando seadiciona o poloxâmero na fase aquosa de quitosana, podem seratribuídas ao fato de que durante a formação do sistema,cadeias do mesmo permanecem presas na matriz de quitosana eheparina.

Os dados para o índice de polidispersão, que varia entre0,20 e 0,30, indicam que, independentemente da presença ou daausência do poloxâmero, este parâmetro é mantido inalterado, eque, portanto, o poloxâmero não aumenta a dispersão do tamanhode nanopartícula.

O peso do poloxâmero não foi considerado nos cálculos dorendimento de produção uma vez que o poloxâmero está emexcesso e é eliminado com o sobrenadante depois do processo decentrifugação. Em principio, a presença do poloxâmero emsolução pode favorecer a estabilidade do sistema (é umtensoativo estabilizante comumente usado em sistemascoloidais). Com base nos rendimentos de produção obtidos podeser dito que as cadeias de poloxâmero efetivamente existem nasmalhas da matriz de nanoparticulas.

Tabela I: Tamanho e potencial da quitosana comnanoparticulas de heparina (carga teórica de 25% em relação àquitosana) na presença de proporções diferentes de Poloxâmero188 (n > 3; Média ± DP).

<table>table see original document page 23</column></row><table>

n.d.: não determinado; LMWH: Heparinamolecular: UFH: Heparina não fracionada*: Poloxâmero peso não consideradoExemplo 2

Preparação e caracterização de nanopartícuias dequitosana com heparinas com pesos moleculares diferentes erevestidas com Poloxâmero 188

As nanoparticulas de quitosana (CS) (1 mg/ml) forampreparadas com ambos os tipos de heparina (UFH e LMWH) deacordo com o processo descrito no Exemplo 1, e o poloxâmero188 (10 mg/l mg CS) foi então adicionado. A carga teórica de25 e 40% com respeito à quitosana foi testada com a LMWH e acarga teórica de 25% foi testada com a UFH, com o propósito deobservar o efeito do revestimento de poloxâmero resultante.

As características fisico-químicas das nanoparticulassão mostradas na Tabela II. Em comparação com a adição depoloxâmero na solução de quitosana (Exemplo 1, Tabela I) , oaumento de tamanho é mais evidente quando o mesmo é adicionadoàs nanoparticulas depois do seu processo de formação,especialmente quando a carga teórica de heparina é aumentadade 25% para 40% (em relação à quitosana) . Além disso, opotencial Z das nanoparticulas mostra um ligeiro decréscimoquando elas são revestidas, especialmente quando a heparinaUFH é usada. Estes dados mostram que o poloxâmero reveste defato as nanoparticulas.24/37

Tabela II:

Tamanho e potencial da quitosana com nanoparticulas deheparina (carga teórica de 25% e/ou 40% em relação àquitosana) antes e depois de adicionar Poloxâmero 18 8 (n > 3;Média ± DP). <table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo 3

Preparação e caracterização de nanoparticulas dequitosana com heparinas com pesos moleculares diferentes (come sem cloreto de sódio na solução de quitosana)

Foram preparadas soluções aquosas de quitosana (CS) (2mg/ml) nas quais foram adicionados volumes de cloreto de sódio(0,9%) variando entre 0 e 1,5 ml. Estas soluções foramsubmetidas a agitação magnética enquanto foi adicionada àsmesmas uma solução aquosa de heparina (UFH ou LMWH) (cargateórica de 25% em relação à quitosana) e agente dereticulação, tripolifosfato de sódio (TPP, razão CS/TPP:1/0,3-1/0,4).

Como é mostrado na Tabela III, se o cloreto de sódio éadicionado à fase aquosa de quitosana antes da preparação dasnanoparticulas, as características fisico-químicas dasnanopartículas não são significantemente modificadas.Entretanto, um aumento evidente do rendimento de produção e umligeiro decréscimo na quantidade de heparina associada aosistema nanoparticulado são observados. Isto mostra que apresença de íons nas soluções iniciais antes de preparar asnanopartículas modifica ligeiramente . a interação quitosana-heparina.

O potencial Z das nanopartículas com cloreto de sódioproduz valores neutros (aproximadamente 0 mV) devido ao fatodos íons negativos do meio permanecerem absorvidos nasuperfície das nanopartículas de quitosana, neutralizando acarga das mesmas.Tabela III: Caracter!sticas das nanopartícuias de quitosana-heparina depois da adição de cloreto de sódio à solução dequitosana (n>3; Média ± DP)

<table>table see original document page 27</column></row><table>

CS: Quitosana; LMWH: Heparina com baixo peso molecular; UFH:Heparina não fracionada;

*: O potencial Z das nanopartículas é protegido por os ions do meio

Exemplo 4

Preparação e caracterização de nanopartículas dequitosana com heparinas com pesos moleculares diferentes (comPoloxâmero 188 e cloreto de sódio)

Considerando-se os exemplos prévios, em que foi vistocomo a adição de polímeros hidrofílicos (tais como poloxâmero)ou de sais (tais como cloreto de sódio) modifica ascaracterísticas das nanopartículas, o objetivo desteexperimento foi estudar as características das nanopartículasresultantes da adição de ambas as substâncias na preparaçãodas nanopartículas.

Como mostrado na Tabela a seguir, se o poloxâmero e ocloreto de sódio são adicionados à solução de quitosana, osistema nanoparticulado resultante tem um tamanho de partículamaior (basicamente devido à presença do poloxâmero) e umaeficácia de associação ligeiramente menor (devido à presençade ambos componentes).

Tabela IV: Influência da adição de Poloxâmero 188 (10 mg) e/oude cloreto de sódio (0,9%, 1,5 ml) na preparação denanopartículas de quitosana com heparina não fracionada (UFH)e heparina com baixo peso molecular (LMWH) com uma carga de25% (n>3; Média ± DP).

<table>table see original document page 28</column></row><table>

CS: Quitosana; LMWH: Heparina com baixo peso molecular; UFH:Heparina não fracionada.

Exemplo 5

Preparação e caracterização de nanopartículas dequitosana (de pesos moleculares diferentes) com heparina combaixo peso molecularO objetivo deste estudo foi preparar nanoparticulasassociadas a heparina utilizando-se quitosanas com pesosmoleculares diferentes. As soluções aquosas foram preparadasde quitosana (CS) (1 mg/ml) com pesos moleculares diferentes(quitosana com alto peso molecular: HMWCS: 100-150 kDa equitosana com baixo peso molecular: LMWCS: <10kDa). Aquitosana com baixo peso molecular foi obtida depois dafragmentação da quitosana com alto peso molecular. De maneiraa realizar o processo de fragmentação, a CS é dissolvida (20mg/ml) em água ultra-pura (Milli-Q) por meio de agitaçãomagnética (2-4 horas) e então 0,1 ml de NaNO2 (0,1 M) éadicionado gota a gota a uma solução de quitosana comagitação. A solução de quitosana é deixada sob agitaçãomagnética durante a noite.

As nanoparticulas foram preparadas com ambas asquitosana com alto peso molecular e quitosana fracionada(baixo peso molecular) seguindo-se o método de preparaçãodescrito em Exemplo 1 (nanoparticulas de quitosana e heparina,com e sem poloxâmero como aditivo na fase aquosa externa).

Os resultados obtidos estão representados na Tabela V.As nanoparticulas de quitosana com baixo peso molecular têm umdiâmetro da partícula, índice de polidispersão, potencial Z epercentagem de associação que são menores que os dados obtidospara as nanoparticulas preparadas com a quitosana com altopeso molecular. A presença do poloxâmero na preparação denanoparticulas quando a quitosana tem baixo peso molecular nãocausa aumento no tamanho médio do sistema de nanopartícularesultante (Exemplo 1; Tabela 1).Tabela V: Influência do peso molecular de quitosana na

formação de nanoparticulas com LMWH (carga teórica de 25% em

relação à quitosana) e a presença de Poloxâmero 188 (n>3;Média ± DP) .

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Exemplo 6

Preparação e caracterização de nanoparticulas dequitosana (com um grau de acetilação diferente) com heparinacom baixo peso molecular

Foram preparadas nanoparticulas de quitosana LMWH, comdois graus deferentes de acetilação (10-15% e 35-45%), mas como mesmo peso molecular (PM<10 kDa) . 0 processo de acetilaçãode quitosana consistiu em adicionar anidrido acético (2,5 ml)a uma solução de quitosana (2 mg/ml; 25 ml) e deixando-a sobagitação magnética durante a noite. Então a quitosana foisubmetida a diálise durante 24 horas com o propósito deeliminar o anidrido acético que não reagiu e finalmente foiliofilizada. A obtenção da quitosana com baixo peso molecularfoi realizada como indicado no Exemplo 5. Deve ser ressaltadoque foi necessário modificar ligeiramente o pH da solução dequitosana acetilada uma vez que depois desta solubilização emágua, o pH resultante é 5,8-6,0, e deve ser diminuído para pH5,0 a fim de reproduzir as condições da quitosana nãoacetilada.

As nanopartículas foram preparadas pela mistura, sobagitação magnética, da solução de quitosana (com o grau deacetilação correspondente) e do poloxâmero com o agente dereticulação e a solução de LMWH (carga teórica de 25%).

As características destas nanopartículas sãorepresentadas na tabela VI. O tamanho e a dispersão de ambosos sistemas de nanopartículas são similares, independente dograu de acetilação da quitosana. Entretanto, o potencial Z émenos positivo para as nanopartículas preparadas com aquitosana acetilada devido ao fato de que parte dos gruposamino é acetilada. Esta modificação química da quitosanatambém provoca um aumento considerável no rendimento daprodução e na percentagem de heparina associada ao sistemacoloidal.Tabela VI: Influência do grau de acetilação de quitosana(LMWCS; <10 kDa) na formação de nanopartícuias com LMWH (cargateórica de 25% em relação à quitosana) e presença dePoloxâmero 188 (n>3; Média ± DP).

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Exemplo 7

Estabilidade dos sistemas nanoparticulados de quitosanacom heparina em fluidos gastrintestinais simulados

Para o propósito de administração oral de nanoparticulasde quitosana com LMWH, a estabilidade dos sistemasnanoparticulados foi inicialmente estudada sob o ponto devista do tamanho e liberação de LMWH. Foram preparadasnoparticulas diferentes, utilizando-se LMWCS acetilado e nãoacetilado para sua formulação, com e sem Poloxâmero 188,adicionado tanto durante a preparação da nanoparticula quantoapós terem sido obtidas. A proporção de quitosana em relaçãoao poloxâmero adicionado em todos os casos é deaproximadamente 10:1. Depois da preparação das ditasnanoparticulas, estas foram diluídas (razão do sistema:fluido;1:3) e foram incubadas a 370C por 15 e 30 minutos. O tamanhodas nanoparticulas foi medido antes e depois da incubação.A Tabela VII mostra a razão de tamanhos Df/Di (diâmetrodepois da incubação/diâmetro antes da incubação). Na ditatabela, pode ser visto que as nanoparticulas de quitosana (nãoacetilada) com heparina mantêm seu tamanho inicial em fluidogástrico e aumentam de tamanho até valores de 800-1000 nm(Df/Di = 4-5) em fluido intestinal quando incorporam opoloxâmero (tanto antes quanto depois da preparação dasnanoparticulas). Entretanto, quando não incorporam opoloxâmero no meio, estas nanoparticulas alcançam valores de 3μm (Df/Di = 14-15) e portanto perdem tamanho nanométrico

característico. Este estudo verifica que a presença depoloxâmero na suspensão de nanopartícula tem um efeito deestabilização do sistema, prevenindo esta agregação.

As nanoparticulas de quitosana acetilada mostram umaumento evidente em tamanho de partícula depois de suaincubação em meio intestinal, excedendo o tamanho máximo (> 3μm) permitido pelo equipamento (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK).

A liberação de LMWH dos sistemas nanoparticulados dequitosana foi determinada por meio da quantificação daatividade anti-Xa no sobrenadante (obtido após a centrifugaçãoe filtração das amostras), depois da incubação em fluidosgástrico e intestinal simulados sem enzimas (USP XXVII). Adita liberação não foi detectável ou foi menor que 1% daquantidade associada.

A atividade anti-Xa é uma medida da capacidade daheparina de inibir ou neutralizar, através da antitrombina IIIde plasma, a enzima de coagulação ativa do Fator X ativado(Fator Xa).

Tabela VII: Estabilidade em fluidos gástrico e intestinal dasnanoparticulas de LMWCS-LMWH com e sem poloxâmero 188 no meio(n>3; Média ± DP).

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Df: diâmetro da nanoparticula depois da incubação no meio;Di: diâmetro inicial da nanoparticula; LMWCS: quitosana combaixo peso molecular; LMWH: heparina com baixo peso molecular.

Exemplo 8

Estudo de liofilização de nanoparticula quitosana-heparina (ambas com baixo peso molecular)

Com o propósito de facilitar a preservação dos sistemasnanoparticulados e prevenir possíveis degradações, um estudode liofilização foi conduzido no sistema HMWCS-LMWHincorporando poloxâmero em sua preparação, onde crioprotetoresdiferentes, tais como sacarose, glicose e trealose, foramtestados. A presença de crioprotetores é indispensável uma vezque depois da liofilização da formulação (sem diluição), semestes protetores ao ser reconstituída com água, aparecemagregados poliméricos, perdendo suas características físico-químicas.

Depois da preparação das nanopartículas de quitosana comLMWH foi adicionada uma quantidade dos crioprotetoresselecionados para alcançar as concentrações de 1 ou 5% (p/v).As formulações foram medidas em frascos, congeladas (-20°C) eliofilizadas (Freeze-Dry System - 12 L, Labconco), onde aprimeira dessecação foi conduzida a -35°C durante 40 horas, ea segunda dessecação foi conduzida aumentando-se a temperatura(1 °C/min) para O0C (1 hora), então até 14°C (1 hora) efinalmente até 25°C. Os produtos liofilizados foram re-suspendidos em água e o tamanho foi medido antes e depois doprocesso de liofilização. A Tabela VIII mostra a razão deDf/Di dos tamanhos (diâmetro final - sistema liofilizado e re-suspendido / diâmetro inicial antes da liofilização), de talforma que valores perto de 1 indicam que o sistemananoparticulado mantém o tamanho nanométrico inicial depois doprocesso de liofilização e re-suspensão.

Como indicado na tabela a seguir, a re-suspensão dosistema liofilizado é adequada quando se adiciona 5% doscrioprotetores estudados.Tabela 8: Estudo de liofilização de nanoparticula LMWCS-LMWH-Poloxâmero (10/1; Polox/CS) com crioprotetores diferentes(n>2; Média ± DP).

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Df: Diâmetro das nanoparticulas depois da liofilização; Di:Diâmetro das nanoparticulas antes do processo de liofilização.

Exemplo 9

Administração oral de heparina com baixo peso molecularem solução e associada à nanoparticulas de quitosana (com altopeso molecular) em ratos. Determinação da biodisponibilidade.

Depois da preparação de nanoparticulas HMWCS-LMWH deacordo com o processo descrito no Exemplo 1, estasnanoparticulas foram liofilizadas na presença de sacarose (5%)e foram reconstituídas em um volume de água adequado de modo aadministrar 200 Ul/ml/rato. Deve ser observado que a heparinaé medida em Unidades Internacionais, em relação a um padrão,mudando-se a quantidade de miligramas em relação ao número deUnidades que possui. Por definição, uma Unidade Internacionalé igual a uma unidade de antitrombina e uma unidade de anti-Xa.

As nanoparticulas não foram isoladas com o propósito deeliminar a heparina em solução devido ao fato que a quantidadede heparina associada ao sistema coloidal excede a 95%, e poresta razão a quantidade de heparina não associada foinegligenciada e a quantidade total de moléculas consideradaspara ajuste do volume de administração (de acordo com a dose).

Foi preparada uma formulação LMWH, que foi também liofilizada(na mesma concentração e sob as mesmas condições) e foi re-suspendida para o mesmo volume que as nanoparticulas de modoque as preparações tinham a mesma quantidade de sacarose.

Os animais (n = 5 para cada grupo) foram mantidos emjejum durante 12 horas antes da administração e amostras deplasma foram tomadas nos seguintes tempos: 0 (pré-administração) , 1, 2, 4, 6, 8 e 10 horas.

A atividade anti-Xa (Ul/ml) foi quantificada nasamostras de plasma por meio do uso de um kit colorimétrico(Stachrom Heparina, Diagnostica Stago, Roche), produzindo umalinha padrão com a HPBM em solução.

Os resultados "in vivo" estão representados na Figura 1,onde pode ser visto que as nanoparticulas HMWCS-LMWHproduziram níveis de plasma significantemente maiores(especificamente 10 vezes maiores) que quando a heparina estáem solução às 6 horas após a administração.

Para o propósito de quantificar a biodisponibilidaderelativa das formulações LMWH (em solução e associadas àsnanoparticulas) administradas oralmente em relação àcorrespondente à administração subcutânea de LMWH dissolvidoem solução salina (0,9%), LMWH foi administrada por ambas asvias utilizando-se doses iguais e as mesmas condições. Abiodisponibilidade oral durante o tempo de amostragem (0-10horas) foi 5% para a solução LMWH e 8% para a LMWH associada ànanoparticulas HMWCS.

firea scto a curva de níveis de plaara para adninistração oral χ dose I.V.

Biodisponibilidade (%) = --------------------------------------

Área sdb a curva de níveis de plasma para administração i.v χ dose Ciral

Exemplo 10

Administração oral de heparina com baixo peso molecularem solução e associada à nanoparticulas de quitosana (com baixopeso molecular) em ratos. Determinação da biodisponibilidade

Os processos de preparar e administrar ambas asformulações foram exatamente os mesmos que os descritos noexemplo anterior, com a exceção que a quitosana usada nestaocasião é a quitosana com baixo peso molecular (Exemplo 5) eque a faixa de amostragem de plasma foi estendida para até 4horas (a cada 2 horas).

Os níveis de atividade anti-Xa (Ul/ml) no plasma mostramque a absorção intestinal de LMWH associada às nanoparticulasLMWCS gera uma resposta terapêutica mais prolongada no tempo,

produzindo valores significantemente maiores entre 6 e 12 horasapós a administração.

Para o propósito de quantificar a biodisponibilidade deambas as formulações administradas oralmente, a administraçãosubcutânea de LMWH diluída em solução salina (0,9%) a um grupode ratos (doses e condições iguais) foi considerada. Abiodisponibilidade no tempo de amostragem (0-12 horas) foi de6% para a solução LMWH e de 11% para a LMWH associada ananoparticulas HMWCS.

Claims

1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato decompreender nanoparticulas com um tamanho menor que 1micrômetro para a liberação de heparina, em que asnanoparticulas compreendem pelo menos quitosana ou um derivadoda mesma, e pelo menos uma heparina ou um derivado da mesma, eem que as nanoparticulas são reticuladas por meio de um agentede reticulação.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato do agente de reticulação ser um sal depolifosfato, preferivelmente tripolifosfato de sódio.

3. Composição de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizada pelo fato das nanoparticulas compreenderem: a) entre 50% e 90% em peso de quitosana ou um derivadoda mesma, eb) entre 10% e 50% em peso de heparina ou um derivadoda mesma.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato das nanoparticulas ainda compreenderemum composto polioxietilenado.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato do composto polioxietilenado ser umpolioxietileno ou um polímero poli(óxido de etileno) epoli(óxido de propileno).

6. Composição de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato da proporção de quitosana, ou umderivado da mesma, em relação à quantidade inicial do compostopolioxietilenado estar compreendida entre 50:1 e 1:50 em peso,preferivelmente entre 50:1 e 1:20.

7. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato da quitosana, ouum derivado da mesma, apresentar um peso molecularcompreendido entre 2 e 2000 kDa, preferivelmente entre 2 e 500kDa, mais preferivelmente entre 5 e 150 kDa.

8. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato da quitosana, ouum derivado da mesma, apresentar um grau de desacetilaçãocompreendido entre 30% e 95%, preferivelmente entre 55% e 90%.

9. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações Ia 8, caracterizada pelo fato da razão entre oagente de reticulação e a quitosana estar compreendida entre-0,01:1 e 0,50:1, preferivelmente entre 0,05:1 e 0,40:1.

10. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato da cargaelétrica (potencial Z) das nanoparticulas estar compreendidaentre 0 mV e +50 mV, preferivelmente entre +1 e +40 mV.

11. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser paraadministração através da mucosa.

12. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser paraadministração oral.

13. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato dasnanoparticulas estarem em forma liofilizada.

14. Processo para a preparação de uma composiçãofarmacêutica para administração de heparina tal como definidaem quaisquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelofato de compreender:a) preparar uma solução aquosa compreendendo quitosanaou um derivado da mesma;b) preparar uma solução aquosa compreendendo heparinaou um derivado da mesma e o agente de reticulação;ec) misturar, com agitação, as soluções das etapas a) eb) , de tal forma que as nanoparticulas dequitosana-heparina são espontaneamente obtidas pormeio de gelificação iônica.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato da solução aquosa da etapa a)compreender ainda um composto polioxietilenado.

16. Processo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato da solução aquosa da etapa a)compreender ainda sais inorgânicos, preferivelmente cloreto desódio.

17. Processo de acordo com as reivindicações 14 a 16,caracterizado pelo fato do agente de reticulação ser umtripolifosfato, preferivelmente tripolifosfato de sódio.

18. Processo de acordo com as reivindicações 14 a 17,caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapaadicional depois da etapa c) em que as nanoparticulas sãoIiofilizadas.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato das nanoparticulas serem liofilizadasna presença de um crioprotetor selecionado de glicose,sacarose e trealose.