BRPI0616139A2 - método para avaliar o risco de metástase à distáncia, microestrutura de ácido nucléico útil na determinação do risco de metástase à distáncia e coleção em meio ou kit - Google Patents

Abstract

METODO PARA AVALIAR O RISCO DE METáSTASE A DISTANCIA, MICROESTRUTURA DE áCIDO NUCLéICO úTIL NA DETETERMINAçAO DO RISCO DE METáSTASE à DISTANCIA E COLEçAO EM MEIO OU KIT A presente invenção revela que a definição do perfil de transcrito de mRNA pode ser utilizada para formular preditores moleculares de metástase à distância, para NPC's primários, Os resultados previstos são altamente correlacionados com sobrevivência geral e livre de metástase curta. As predições são feitas usando preditores baseados em 52 genes e preditores baseados em 12 genes.

Description

MÉTODO PARA AVALIAR O RISCO DE METÁSTASE À DISTÂNCIA,MICROESTRUTURA DE ÁCIDO NUCLÉICO ÚTIL NA DETERMINAÇÃO DORISCO DE METÁSTASE À DISTÂNCIA E COLEÇÃO EM MEIO OU KIT

A presente invenção se refere geralmente a métodos

para avaliar e/ou predizer estados e efeitos de câncernasofaringeal compreendendo medir os níveis de expressão degenes relacionados a tal câncer, permitindo prediçõesindividualizadas ou avaliações de efeitos para estespacientes com câncer.

INTRODUÇÃO

0 carcinoma nasofaringeal (NPC) é um tipo distinto decâncer de cabeça e pescoço que difere de outrasmalignidades do trato aerodigestivo superior com relação àepidemiologia, patologia, apresentação clínica e respostaao tratamento.1' 2 0 desenvolvimento de NPC é pensado estarassociado com infecção de vírus Epstein-Barr (EBV) .3' 4Este tipo de câncer é endêmico no sul da China, Taiwan eSul da Ásia (25-30 por 100.000 por ano).5"8 Ele é um doscânceres de cabeça e pescoço mais agressivos que podeminfiltrar órgãos adjacentes, invadirem nodos de linfaretrofaringeal e cervical, e disseminar em locais àdistância.9-11

O avanço da terapia de radiação durante as trêsdécadas passadas tem conduzido ao controle bem sucedido delongo prazo de NPC.12"16 A terapia de radiação é o suporteprincipal incontestável do tratamento de NPC. Os pacientescom doença de estágio I e II têm uma alta taxa de cura comterapia de radiação apenas. Não obstante, mais do que 70%de pacientes com NPC recentemente diagnosticados têmdoenças de estágio III e IV.14'17" Estes pacientes requeremquimioterapia adicional concorrente para aperfeiçoar seuefeito de tratamento.15,16 Além disso, aproximadamente 30% depacientes com NPC com doença de estágio III e IVa/beventualmente desenvolvem metástase à distância,14,17 isto é,metástase fora da área loco-regional do NPC. Dez a vintepor cento de todos os pacientes com NPC têm metástase àdistância e doenças de estágio IVc no momento da diagnoseinicial.14,17 Muitos pacientes morrem da doença logo após odesenvolvimento de metástase à distância. Metástase àdistância freqüentemente ocorre na ausência de recorrêncialoco-regional em pacientes no estágio III e IV NPC, efator de prognóstico mais importante.

A meta-análise recente demonstra que a sobrevivênciaaperfeiçoada em pacientes com estágios avançados de NPCfoi, do mesmo modo, o resultado de quimioterapia sistêmicaconcorrente para prevenção e controle prováveis demetástase à distância.15'16 Considerando-se que mais do que70% de pacientes com NPC presentes com doença de estágioIII e IV e cerca de 30% deles podem desenvolver metástase àdistância, 14,17 aperfeiçoamento adicional de sobrevivêncianestes pacientes tem que começar com identificação bemsucedida de pacientes em alto risco de metástase àdistância na apresentação inicial. Quando tal predição setorna uma realidade, tratamento concorrentemente otimizado pode ser aplicado, e ensaios clinicos podem, em seguida,serem designados para testar modalidades terapêuticas maisrecentes para prevenção e controle mais efetivos demetástase à distância para aperfeiçoar a sobrevivênciatotal.

Desde que o risco de metástase à distância é conhecidopor aumentar com estágios mais avançados de NPC14,11, oestágio de TNM tem sido usado para guiar a seleção decombinações adequadas de terapia de radiação equimioterapia para a prevenção de metástase à distância eaperfeiçoamento de sobrevivência de longo prazo.15,16,31 Porexemplo, pacientes AJCC de Estágio III excluindo aquelescom doença T1N2M0 e T2aN2M0, têm sido tratados comquimioterapia concorrente de radiação (CCRT), mais doisciclos de quimioterapia adjuvante com cisplatin, mais 5-FUem Koo Foundation SYS Câncer Center, Taipei, Taiwan.31 Ospacientes de Estágio IVa/b são tratados com CCRT, seguidopor 2 ciclos de quimioterapia adjuvante, e quimioterapiasemanal de manutenção com 5-FU e leucovorin por 6 meses.31Embora um número significante de pacientes com doença deestágio III respondesse bem ao tratamento e tivesseexcelente sobrevivência (Fig. 6), aproximadamente 20% depacientes de estágio III desenvolveram metástase àdistância, e tiveram pobre sobrevivência. A sobrevivênciatotal e a sobrevivência livre de metástase dos pacientes deestágio III que desenvolveram metástase à distância dentrode três anos de terapia inicial foram sub-repostas comaqueles pacientes de estágio IVa/b NPC (Fig. 6).Estas descobertas levantam a questão se pacientes deestágio III em risco de desenvolver metástase à distânciadevem ter sido tratados mais agressivamente porquimioterapia neoadjuvante, quimioterapia adjuvante maisrecente ou mais intensa, e/ou quimioterapia de manutenção.A adequação de tratamento para pacientes de NPC de estágioIVa/b em risco de desenvolver metástase à distância étambém levada em questão (Fig. 6) . Todas estas descobertassalientam a importância clinica de identificação depacientes com NPC que estão em risco de desenvolvermetástase à distância no momento da diagnose, e antes doinicio do tratamento. A capacidade de se identificar taispacientes e excluir pacientes com NPC de estágio III eIVa/b que são de baixo risco de metástase à distância sãoimportantes para condução de ensaios clínicos maiseficazes.

Conforme reportado anteriormente, a análise de micro-arranjo tem sido empregada com sucesso para identificar18-22

assinaturas moleculares para classificação de tumores eseu comportamento clinico23"30, tal como predição de riscosde metástase à distância e sobrevivência total em pacientescom vários tipos de malignidades. Outros estudos envolvemNPC.37"54

Ver também Pedido dos Estados Unidos N0 60/420.729,depositado em 24 de outubro de 2002; Pedido dos EstadosUnidos N°. 60/421.102, depositado em 25 de outubro de 2002;Pedido dos Estados Unidos N°. 60/421.062, depositado em 25de outubro de 2002; Pedido dos Estados Unidos N0.60/424.701, depositado em 8 de novembro de 2002; Pedido dosEstados Unidos N°. 60/424.718, depositado em 8 de novembrode 2002; Pedido dos Estados Unidos N°. 60/424.715,depositado em 8 de novembro de 2002; Pedido dos EstadosUnidos N°. 60/425.256, depositado em 12 de novembro de2002; Pedido dos Estados Unidos N°. 60/448.462, depositadoem 21 de fevereiro de 2003; Pedido dos Estados Unidos N°.60/448.466, depositado em 21 de fevereiro de 2003; Pedidodos Estados Unidos N°. 60/457.877, depositado em 27 demarço de 2003; Pedido dos Estados Unidos N°. 60/458.373,depositado em 31 de março de 2003; Pedido dos EstadosUnidos N°. 10/291.878, depositado em 12 de novembro de2002; Pedido dos Estados Unidos N°. 10/291.886, depositadoem 12 de novembro de 2002; Pedido Internacional No.US02/38216, depositado em 12 de novembro de 2002; e PedidoInternacional No. US02/38222, depositado em 12 de novembrode 2002; Pedido dos Estados Unidos N0. 11/015.764,depositado em 20 de dezembro de 2004; Pedido dos EstadosUnidos No. 11/090.294, depositado em 28 de março de 2005, ePedido Provisório dos Estados Unidos No. 60/665.652,depositado em 25 de março de 2005, as revelações totais detodos sendo aqui incorporadas por referência para detalhesna metodologia aqui usada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção identifica assinaturas genômicas parametástase à distância em pacientes com NPC. A prediçãoaperfeiçoada que resulta da metástase à distância empacientes com NPC capacita identificar pacientesindividuais em alto risco para quem terapias adequadas (porexemplo, radiação e/ou quimioterapia) podem serselecionadas para a prevenção e/ou melhoramento demetástase à distância, e aperfeiçoamento de sobrevivênciade longo prazo. Desse modo, em um aspecto, esta invençãoenvolve um método de correlacionar níveis de expressão degene em pacientes com NPC a fatores de risco e efeitosclínicos em referidos pacientes.

Desse modo, a invenção se refere a um método deavaliar o risco de metástase à distância em um pacientetendo carcinoma nasofaringeal compreendendo avaliar operfil de expressão de pelo menos um dos genes listados nasTabelas 4 e 5 abaixo em uma amostra de referido paciente.

Preferivelmente, essencialmente todos e especialmente todosdos 52 genes da Tabela 4 e/ou essencialmente todos eespecialmente todos dos 12 genes da Tabela 5 são avaliadospara nível de expressão, por exemplo, em amostras depaciente, preferivelmente amostras de tecido de NPC. Dessemodo, dois ou mais dos genes das Tabelas 4 ou 5 podem serempregados, considerando-se que o número de genes avaliadospara análise de probabilidade está correlacionado com oefeito da doença (por exemplo, metástase à distância). Emoutras concretizações, para o conjunto de 12 genes, 3 oumais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 oumais, 9 ou mais, 10 ou mais, ou 11 ou mais dos genes podemser empregados. Tais números de genes podem também seremempregados com relação ao conjunto de 52 genes, ou 12 oumais... 15 ou mais... 20 ou mais... 25 ou mais... 30 ou mais... 35 oumais... 40 ou mais... 45 ou mais... 50 ou mais... 51 ou mais, bemcomo outros números envolvidos de genes não explicitamentemencionados aqui. Tais números de genes de cada conjuntopodem também serem empregados no método de combinaçãodiscutido abaixo. Naturalmente, para resultados ótimos,todos ou essencialmente todos os genes serão empregados emgeral. Desse modo, em outro aspecto, os genes usados nosmétodos precedentes são um ou mais daqueles aqui listados.

Esta invenção também se refere às coleções, porexemplo, em meio ou kits, etc., de todos ou subconjuntos detais genes relacionados à metástase à distância; e ela serefere a métodos associados, meio e kits usados naefetuação dos métodos desta invenção.

De acordo com outro aspecto da invenção, a espécime depaciente analisado pode ser qualquer tecido, tal comosangue, tumores ou células, etc. Preferivelmente, aespécime é de um tumor de NPC. Métodos para obtenção de umaespécime a ser analisada são conhecidos na técnica.

A invenção objeto proporciona coleções de genes quesão relevantes para a avaliação ou predição de metástase àdistância em um paciente com NPC. Tais genes têm um modelode expressão (isto é, expressão de nivel ou falta desta)que se correlacionam com pelo menos um tal fenótipo decâncer. É compreendido que genes adicionais podem tambémserem envolvidos no NPC.

Para esta invenção, um estudo de perfil de expressãode gene foi conduzido em espécimes de biópsia de bancada depacientes com NPC que tinha dados clínicos bemdocumentados. Todas as amostras de biópsia estudadas foramarmazenadas em nitrogênio líquido. Somente amostras semdegradação significante de RNA total foram estudadas. Demodo a minimizar a variação relacionada ao operador,somente dois peritos altamente treinados foram envolvidosno processamento de amostras de tumor e coleção de dados demicro-arranjo. Eles manusearam aleatoriamente númerossimilares de espécimes de pacientes com alto ou baixo riscode metástase à distância. As análises estatísticas de dadosde micro-arranjo realizadas e coletadas por ambos osperitos não mostraram qualquer tendência estatística (Fig.7). Nós também usamos a mesma estação fluídica e o mesmoscanner através de todo o estudo.

De modo à adicionalmente minimizar variaçõesassociadas com manufatura de chip, processamento deamostra, carregamento de doses de cRNA, e processamento dechip, os dados de intensidade de expressão de gene de cadamicro-arranjo foram normalizados a uma média aplicada de500 usando-se software Affymetrix MAS 5.0, e seguido pornormalização quantile da intensidade de expressão de cadaconjunto de sonda de acordo com um padrão de referência deNPC previamente estabelecido em nosso laboratório. VerExemplo I. A eficiência de tal aproximação de normalizaçãofoi validada por comparação dos resultados de GeneChip demedições repetidas em seis espécimes de NPC aleatoriamenteselecionadas. Os resultados mostraram que o procedimento denormalização quantile no nível de conjunto de sondas foi defato efetivo para corrigir as variações experimentais (Fig.8) .

Uma análise altamente supervisionada foi realizada.Conforme discutido anteriormente, muitos pacientes com NPCsem o desenvolvimento de metástase à distância em três anosapós o tratamento inicial tiveram boa sobrevivência delongo prazo, e pacientes com NPC de efeito de sobrevivênciapobre usualmente desenvolveram metástase à distância dentrode três anos após o primeiro tratamento. Os espécimes debiópsia destes dois grupos de pacientes clinicamente bemdefinidos em extremidades opostas da doença foram usados naanálise para identificar assinaturas moleculares maisseguras para predição de metástase à distância. 0 beneficiode tomar tal aproximação para encontrar preditoresmoleculares seguros foi reportado recentemente.35

Ao mesmo tempo, o sobre-ajuste é um sério perigoimprevisto para descoberta de preditores de classe de umnúmero limitado de pacientes com altas mediçõesdimensionais, conforme articulado por Simon et al. Parasuperar o problema de sobre-ajuste, um conjuntoverdadeiramente independente de casos para validação foiincluído, e o máximo de pacientes possível foi incluído noestudo. Cento e trinta e oito pacientes elegíveis foramincluídos. Além disso, um terço dos pacientes de grupos debaixo e alto risco de pacientes foram aleatoriamentedesignados para um conjunto de teste independentemente emtodo começo do estudo para proposta de validação. Variáveisclínicas importantes, tais como idade, sexo, estágio detumor, durações, foram consideradas para randomização.Todos os casos de conjunto de teste não foram envolvidos naseleção de genes preditores e no estabelecimento de regraspreditivas através de todo o processo de treinamento. Osresultados desta invenção no conjunto de teste mostraramque a sensibilidade, a especificidade e a precisão totalforam comparáveis a, ou melhores do que foi reportado paraoutros tipos de tumores sólidos na literatura. 23,24,27-30

As quantidades de células de tumor viáveis e célulasIinfóide/inflamatória/estromal circundantes podem variarsignificantemente entre espécimes de biópsia de pacientesdiferentes (heterogeneidade biológica). Devido àsquantidades muito limitadas de tecidos de biópsiadisponíveis e a instabilidade do RNA, o exame histológicodos espécimes de biópsia usados para perfil de expressão degene, contudo, não foi realizado. Também, a histologia dosespécimes de biópsia de diagnóstico não se correlaciona coma precisão dos resultados prognosticados porque os locaisde biópsia para diagnóstico e para estudo de GeneChip nãoforam idênticos. 0 ruído associado com a heterogeneidade deespécimes de biópsia pode limitar a precisão prognosticada.

Duas regras preditivas preferidas são geradas por estainvenção. Ver Exemplos IV e V. Uma é baseada na assinaturade 52 genes e método de classificação de k-NN, e a outra ébaseada nos 12 genes e regressão logística.

Em um conjunto, cinqüenta e dois genes de nove gruposde SOM diferentes são usados para predição. Eles sãoresumidos na Tabela 4. Entre estes 52 genes, são membrosenvolvidos em transdução de sinal (n=9), processamento demRNA (n=7), regulação de transcrito (n=3), síntese deproteína (n=4), metabolismo de nucleotídeo (n=4),metabolismo de lipídeo (n=3) , dobramento de proteína (n=3),citoquinese (n=2), transporte nuclear (n=2), catabolismo deproteína (n=2), anti-apoptose (n=l), síntese de ATP (n=l),ciclo de célula (n=l), resposta imune (n=l), transporte deproteína intracelular (n=l) e transporte de amino ácido(n=l), de acordo com as Ferramentas NIAID-DAVID(http://appsl.niaid.nih.gov/david/). As funções dos setegenes restantes são desconhecidas.

Vinte e dois dos 52 genes têm expressão reduzida, etrinta têm expressão aumentada no grupo de alto risco.Quando as intensidades de expressão dos genes preditoresentre os grupos de alto e baixo risco foram comparadas,pode ser notado que a expressão média de quase todos osgenes envolvidos no processamento de mRNA, transportenuclear, metabolismo de nucleotídeo, e dobramento deproteína, foi maior no grupo de alto risco prognosticado.Em contraste, a expressão de todos os genes envolvidos naregulação de transcrito e catabolismo de proteína foireduzida no grupo prognosticado como alto risco parametástase à distância.

Para o método preditivo baseado nos 12 genes, 6 genesestavam também presentes nos 52 genes usados para prediçãopor um método de k-NN. Os outros seis não estavam presentesna lista dos 52 genes de acordo com o conjunto de sondaAffymterix ID. Estes 12 genes são resumidos na Tabela 5.Entre estes 12 genes, 3 genes estavam envolvidos nodobramento de proteína, 2 genes na síntese de proteína, 2genes na biogênese de ribossomo, 2 genes no metabolismo denucleotídeo, e 1 gene cada no processamento de mRNA ecatabolismo de proteína. 0 último gene (proteína hipotéticaFLJ12 671) era conhecido por ter motivo de exonucleasenucleolar, e sua função exata não era conhecida. As funçõesde todos os 12 genes mostraram sobreposição significantecom aquelas no conjunto de 52 genes. Foi notado que um dosseis genes (proteína contendo não-domínio de POU) que nãoestava incluído em qualquer dos 52 genes era atualmente omesmo conforme o gene representado por um conjunto de sondadiferente ID nos 52 genes. Este gene é envolvido noprocessamento de mRNA. Três genes no conjunto de 12 genessão subunidades alfa, beta e gama do mesmo chaperonincontendo t-complex 1 (TCP-I) que tinha sido implicado naproliferação de células de tumor.34 Os genes para assubunidades alfa e gama estavam presentes em ambos osconjuntos de 12 e 52 genes. 0 gene para a subunidade betaestava presente somente no conjunto de 12 genes. Todasestas descobertas mostraram um alto grau de consistênciaentre estes dois conjuntos de genes preditores.

Os resultados do uso das regras preditivas mostram queo método de predição de 52 genes tinha uma taxa positivafalsa mais baixa do que o método de predição de 12 genes(14% versus 28%) . Em contraste, o método de predição de 52genes tinha uma taxa negativa falsa mais alta do que ométodo de 12 genes (31% versus 15%) . Quando os métodospreditivos são usados para selecionar pacientes com altorisco de metástase à distância para ensaios clínicos, taxaspositivas e negativas falsas serão reduzidas a um mínimo demodo que a segurança de pacientes de baixo risco e odireito de pacientes de alto risco são protegidos.

Por exemplo, os dois métodos para predição podem sercombinados em um método. Somente resultados de acordo entreos dois métodos são aceitos. Os resultados de discordânciaestão relacionados como indeterminados (n=8). Ver ExemploVI. Tomando-se tal aproximação, a taxa positiva falsa foireduzida para 10%. A taxa positiva falsa foi ao redor de15%. Embora os casos indeterminados cheguem a 19% (8/42) detodos os pacientes no conjunto de teste independente,somente 2 pacientes clinicamente de alto risco foramtransferidos para a categoria indeterminada pelo usocombinado de preditores moleculares. Dessa maneira, aschances de falsidade incluindo pacientes de bom risco em umensaio para os pacientes de alto risco podem serefetivamente minimizadas no dispêndio de exclusão de 15%(2/13) de pacientes clinicamente de alto risco. Os outros15% de pacientes clinicamente de alto risco serãoincorretamente prognosticados como risco baixo (Tabela 6) .Não obstante, pelo menos 70% de todos os pacientes de altorisco serão corretamente identificados, e podem serincluídos em ensaios designados para pacientes de altorisco.

Desse modo, assinaturas moleculares seguras de 52genes e 12 genes foram identificadas para prognosticarempacientes com NPC em alto ou baixo risco de desenvolvermetástase à distância. A predição é validada com 42 casosde conjunto de teste independente. As precisões totaisavaliadas pelo conjunto de teste independente foram 81%,76% e 85% para a assinatura de 52 genes, a assinatura de 12genes e a assinatura combinada, respectivamente. Estesresultados são comparáveis aos estudos preditivosrecentemente publicados que também usaram conjuntos deteste independente para validação. 28,30 Uma precisão de 78%foi reportada para predição de resposta de câncer de seiopara quimioterapia neoadj uvante28, e uma precisão de 86%para predição de metástase de nodo de linfa por carcinomade célula escamosa de cabeça e pescoço.30 As assinaturasmoleculares serão úteis para guiar novo neoadjuvante,adjuvante, quimioterapia de manutenção e/ou terapia alvo empacientes com NPC para prevenção, melhora e controle demetástase à distância, e para aperfeiçoamento adicional desobrevivência de longo prazo. A identificação de pacientescom NPC com baixo ou alto risco de metástase à distânciatambém deve reduzir as taxas de sobre e sub-tratamento.

As coleções objetos de genes relacionados à metástasede NPC podem ser físicas ou virtuais. As coleções físicassão aquelas coleções que incluem uma população de moléculasde ácido nucléico diferentes, onde os genes relacionados acâncer de NPC são representados na população, isto é,existem moléculas de ácido nucléico na população quecorrespondem em seqüência ao genômico, ou, maistipicamente, seqüência de codificação dos genesrelacionados a câncer de NPC na coleção. Em muitasconcretizações, as moléculas de ácido nucléico são, ousubstancialmente idênticas, ou idênticas na seqüência parao trançado de sentido do gene ao qual eles correspondem, ousão c ompl ementar es ao trançado de sentido ao qual elescorrespondem, tipicamente a uma extensão que permite queeles hibridizem para seu trançado de sentido correspondentesob condições estringentes. A determinação das condições dehibridização (isto é, baixa, média ou alta estringência)está dentro do conhecimento do técnico no assunto. Umexemplo de condições de hibridização estringentes éhibridização a 50°C ou mais alta, e 0,1 SSC (15 mM decloreto de sódio/1.5 mM de citrato de sódio). Outro exemplode condições de hibridização estringentes é incubaçãodurante toda noite a 420C em uma solução: 50% de formamida,5 χ SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trisódio) , 50mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt,10% de sulfato de dextran, e 20 mg/ml de DNA de esperma desalmão desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1χ SSC a cerca de 65°C. As condições de hibridizaçãoestringentes são condições de hibridização que são pelomenos tão estringentes quanto às condições representativasacima, onde as condições são consideradas serem pelo menostão estringentes se elas são pelo menos cerca de 80% tãoestringentes, tipicamente pelo menos cerca de 90% tãoestringentes quanto às condições estringentes especificasacima. Outras condições de hibridização estringentes sãoconhecidas na técnica, e podem também serem empregadas paraidentificar ácidos nucléicos desta concretização particularda invenção.Os ácidos nucléicos que compõem as coleções físicasobjetos podem ser de trançado simples ou de trançado duplo.Em adição, os ácidos nucléicos que compõem as coleçõesfísicas podem ser lineares ou circulares, e as moléculasindividuais de ácido nucléico podem incluir, em adição aosgenes relacionados a câncer de NPC, outras seqüências, porexemplo, seqüências de vetor. Uma variedade de ácidosnucléicos diferentes pode compor as coleções físicas, porexemplo, bibliotecas, tais como bibliotecas de vetor, dainvenção objeto, onde exemplos de tipos diferentes deácidos nucléicos incluem, mas não estão limitados a, DNA,por exemplo, cDNA, etc., RNA, por exemplo, mRNA, cRNA, etc.e similares. Os ácidos nucléicos das coleções físicas podemestar presentes na solução ou fixados, isto é, fixados a umsuporte sólido, tal como um substrato conforme é encontradoem concretizações de arranjo, onde descrição adicional detais concretizações diversas é provida abaixo.

Também providas são coleções virtuais dos genesrelacionados à NPC objetos. Por coleção virtual ésignificativo um ou mais arquivos de dados, ou outroselementos organizacionais de leitura de computador queincluem a informação de seqüência dos genes da coleção,onde a informação de seqüência pode ser a informação deseqüência genômica, mas é tipicamente a informação deseqüência de codificação. A coleção virtual pode serregistrada em qualquer computador conveniente, ou meio dearmazenagem de leitura de processador. 0 computador ou meiode armazenagem de leitura de processador nos quais os dadosde coleção são armazenados podem ser qualquer meioconveniente, incluindo CD, DAT, disco flexível, RAM, ROM,etc, cujo meio é capaz de ser lido por um componente dehardware do dispositivo.

Também providas são bases de dados de perfis deexpressão de genes relacionados à NPC. Tais bases de dadoscompreenderão tipicamente perfis de expressão de váriascélulas/tecidos tendo fenótipos relacionados à NPC, taiscomo vários estágios de NPC, perfis de expressão negativa,perfis de prognóstico, etc., onde tais perfis sãoadicionalmente descritos abaixo.

Os perfis de expressão e bases de dados destes podemser providos em uma variedade de meios para facilitar seuuso. "Meios" se referem a uma manufatura que contém ainformação de perfil de expressão da presente invenção. Asbases de dados da presente invenção podem ser registradasno meio de leitura de computador, por exemplo, qualquermeio que pode ser lido e avaliado diretamente por umcomputador. Tais meios incluem, mas não estão limitados a:meios de armazenagem magnéticos, tais como discosflexíveis, meios de armazenagem de disco rígido, e fitamagnética; meios de armazenagem óticos, tais como CD-ROM;meios de armazenagem elétricos, tais como RAM e ROM; ehíbridos destas categorias, tais como meios de armazenagemmagnéticos/óticos. Um técnico no assunto pode apreciarprontamente quanto dos meios de leitura de computadoratualmente conhecidos podem ser usados para criar umamanufatura compreendendo registro da informação de base dedados atual. "Registrado" se refere a um processo paraarmazenar informação nos meios de leitura de computador,usando-se quaisquer tais métodos conforme conhecidos natécnica. Qualquer estrutura de armazenagem de dadosconveniente pode ser escolhida, baseada nos meios usadospara acessar a informação armazenada. Uma variedade deprogramas de processador de dados e formatos pode ser usadapara armazenagem, por exemplo, arquivo de texto deprocessamento de palavra, formato de base de dados, etc.

Conforme aqui usado, "um sistema baseado emcomputador" se refere aos meios de hardware, meios desoftware, e meios de armazenagem de dados usados paraanalisar a informação da presente invenção. 0 hardwaremínimo dos sistemas baseados em computador da presenteinvenção compreende uma unidade de processamento central(CPU), meios de entrada, meios de produção, e meios dearmazenagem de dados. Um técnico no assunto pode apreciarprontamente que qualquer um do sistema baseado emcomputador atualmente disponível é adequado para uso napresente invenção. Os meios de armazenagem de dados podemcompreender qualquer manufatura compreendendo um registroda presente informação conforme descrito acima, ou um meiode acesso de memória que pode acessar tal manufatura.

Uma variedade de formatos estruturais para os meios deentrada e saída pode ser usada para admitir ou produzir ainformação nos sistemas baseados em computador da presenteinvenção. Um formato para meios de saída estima perfis deexpressão que possuem graus variados de similaridade a umperfil de expressão de referência. Tal apresentaçãoproporciona um técnico no assunto com uma gama desimilaridades, e identifica o grau de similaridade contidono perfil de expressão teste.

Um perfil de expressão de gene pode ser medido em umponto de tempo simples, ou cobre vários pontos de temposobre um período de tempo. Os níveis de expressão dos genespodem ser determinados por qualquer método conhecido natécnica (por exemplo, reação de cadeia de polimerasequantitativa (PCR), transcriptase reversa/polimerase PCR) ,ou que é projetada no futuro que pode proporcionarinformação quantitativa com relação à expressão de gene.

Em outra concretização, os níveis de expressão de genesão determinados pela quantificação dos produtos deexpressão de gene, tais como proteínas, polipeptídeos oumoléculas de ácido nucléico (por exemplo, mRNA, tRNA,rRNA) . A quantificação de ácido nucléico pode ser realizadapela quantificação de ácido nucléico diretamente, ou porquantificação de um gene regulatório correspondente, ouelemento de seqüência regulatória. Adicionalmente,variantes de genes, tais como variantes de união evariantes polimórficas podem ser quantificadas.

Em outra concretização, a expressão de gene é medidapela quantificação do nível de proteína ou polipeptídeotransladado de mRNA. Os métodos para quantificação do nívelde proteína ou polipeptídeo em uma amostra ecorrelacionando tais dados com níveis de expressão sãoconhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos policlonaisou monoclonais específicos para uma proteína oupolipeptídeo podem ser obtidos por métodos conhecidos natécnica, e usados para detectar e/ou medir a proteína oupolipeptídeo na amostra ou espécime.

Em uma concretização preferida, a expressão de gene émedida pela quantificação do nível de mRNA em uma amostraou espécime. Isto pode ser efetuado por qualquer dosmétodos conhecidos na técnica. Em uma concretização, mRNA écontactado com um micro-arranjo adequado compreendendosondas de ácido nucléico imobilizadas específicas para osgenes de interesse, e determinação da extensão dehibridização do mRNA na amostra para as sondas no micro-arranjo. Tais micro-arranjos estão também dentro do escopo da invenção. Exemplos de métodos de produção de micro-arranjos de oligonucleotídeos são descritos, por exemplo,em WO 95/11995. Outros métodos são prontamente conhecidosna técnica.

O valor de expressão de gene medido ou acessado é ovalor numérico obtido de um aparelho que pode medir osníveis de expressão de gene. Os valores são valores brutosa partir do aparelho, ou valores que são preferivelmentere-escalados, filtrados e/ou normalizados. Ver, porexemplo, Exemplo I. Ácidos nucléicos (por exemplo, mRNA) deuma amostra que foi submetida a condições particulares deestringência hibridiza para as sondas no chip. 0 ácidonucléico a ser analisado (por exemplo, o alvo) é isolado,amplificado e etiquetado com uma etiqueta detectável (porexemplo, 32P ou etiqueta fluorescente) antes da hibridizaçãodos arranjos. Após hibridização, os arranjos são inseridosem um scanner que pode detectar modelos de hibridização.Estes modelos são detectados pela detecção do alvoetiquetado agora fixado ao micro-arranjo, por exemplo, se oalvo é fluorescentemente etiquetado, os dados dehibridização são coletados como luz emitida a partir dosgrupos etiquetados. Desde que os alvos etiquetadoshibridizam, sob condições de estringência apropriadasconhecidas a um técnico no assunto, especificamente paraoligonucleotideos complementares contidos no micro-arranjo,e visto que a seqüência e posição de cada oligonucleotideono arranjo são conhecidas, a identidade do ácido nucléicoalvo aplicada à sonda é determinada.

a presente invenção também proporciona um método paramonitorar o efeito de um regime de tratamento em umindivíduo pelo monitoramento dos perfis de expressão degene da invenção. Por exemplo, um perfil de expressão degene base para o indivíduo pode ser determinado, e perfisde expressão de gene repetidos podem ser determinados nospontos de tempo durante tratamento. Uma alteração no perfilde expressão de gene de um perfil correlacionado com efeitopobre de tratamento a um perfil correlacionado com efeitode tratamento aperfeiçoado é evidência de um regimeterapêutico efetivo, enquanto um perfil repetidocorrelacionado com efeito pobre de tratamento é evidênciade um regime terapêutico não-efetivo.

Nas aplicações de diagnóstico da invenção objeto, ascélulas ou coleções destas, por exemplo, tecidos, bem comoanimais (indivíduos, hospedeiros, etc., por exemplo,mamíferos, tais como animais domésticos, criações, ehumanos, etc.) que incluem as células/tecidos são ensaiadaspara determinar a presença de e/ou probabilidade dedesenvolvimento de uma metástase de NPC. Como tais, osmétodos de disgnóstico incluem métodos de determinação dapresença de tal fenótipo. Em certas concretizações, nãosomente a presença, mas também a severidade ou estágio deum fenótipo, é determinada. Em adição, os métodos dediagnóstico também incluem métodos de determinação dapropensidade de desenvolver tal fenótipo de câncer, tal queuma determinação é feita que tal fenótipo de câncer nãoesteja presente. Mas, do mesmo modo, ocorre. Na prática dodiagnóstico objeto e outros métodos, uma amostra de ácidonucléico obtida ou derivada de uma célula, tecido ouindivíduo que é para ser diagnosticado para gerar um perfilde expressão e, em seguida, o método da invenção éefetuado.

Conforme indicado acima, a amostra que é ensaiada paragerar o perfil de expressão empregado nos métodos dediagnóstico é uma que é uma amostra de ácido nucléico. Aamostra de ácido nucléico inclui uma pluralidade oupopulação de ácidos nucléicos distintos que incluem ainformação de expressão dos genes relacionados à NPC deinteresse da célula ou tecido sendo diagnosticado. 0 ácidonucléico pode incluir ácidos nucléicos de RNA ou DNA, porexemplo, mRNA, cRNA, cDNA etc., considerando-se que aamostra retém a informação de expressão na célulahospedeira ou tecido do qual ela é obtida. A amostra podeser preparada em um número de modos diferentes, conforme éconhecido na técnica, por exemplo, por isolamento de mRNAde uma célula, onde o mRNA isolado é usado conforme éamplificado, empregado para preparar cDNA, cRNA, etc.,conforme é conhecido na técnica de expressão diferencial. Aamostra é tipicamente preparada de uma célula ou tecidocolhido a partir de um indivíduo a ser diagnosticado, porexemplo, via biopsia do tecido, usando-se protocolospadrões, onde tipos de célula ou tecidos dos quais taisácidos nucléicos podem ser gerados incluem qualquer tecidono qual o modelo de expressão do fenótipo de NPC a serdeterminado existe, incluindo, mas não limitado a,monócitos, endotélio, e/ou músculo liso.

O perfil de expressão pode ser gerado a partir deamostra de ácido nucléico inicial usando-se qualquerprotocolo conveniente. Enquanto uma variedade de maneirasdiferentes de geração de perfis de expressão sejaconhecida, tais como aquelas empregadas no campo da análisede expressão de gene diferencial, um tipo representativo econveniente de protocolo para geração de perfis deexpressão é arranjo baseado em protocolos de perfil deexpressão de gene. Tais aplicações são ensaios dehibridização em que um ácido nucléico que revela ácidosnucléicos "sondas" para cada um dos genes a seremensaiados/perfilados no perfil a ser gerado é empregado.

Nestes ensaios, uma amostra de ácidos nucléicos alvos éprimeiro preparada a partir da amostra de ácido nucléicoinicial sendo ensaiada, onde a preparação pode incluiretiquetação dos ácidos nucléicos alvos com uma etiqueta,por exemplo, um membro de sistema de produção de sinal. Emseguida a preparação da amostra de ácido nucléico alvo, aamostra é contactada com o arranjo sob condições dehibridização, pelo que complexos são formados entre ácidosnucléicos alvos que são complementares às seqüências desonda fixadas à superfície de arranjo. A presença decomplexos hibridizados é, em seguida, detectada, ouqualitativamente ou quantitativamente. A tecnologia dehibridização específica que pode ser praticada para geraros perfis de expressão empregados nos métodos objetosincluem a tecnologia descrita nas Patentes dos EstadosUnidos Nos.: 5.143.854; 5.288.644; 5.324.633; 5.432.049;5.470.710; 5.492.806; 5.503.980; 5.510.270; 5.525.464;5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; as revelaçõesdas quais são aqui incorporadas por referência; bem como WO95/21265; WO 96/31622; W097/10365; WO 97/27317; EP 373 203;e EP 785 280. Nestes métodos, um arranjo de ácidosnucléicos "sonda" que inclui uma sonda para cada um dosgenes relacionados à NPC cuja expressão está sendo ensaiadaé contactado com ácidos nucléicos alvos conforme descritoacima. O contato é efetuado sob condições de hibridização,por exemplo, condições estringentes de hibridizaçãoconforme descrito acima, e um ácido nucléico não-ligado éentão removido. O modelo resultante de ácido nucléicohibridizado proporciona informação relacionada à expressãopara cada um dos genes que foram sondados, onde ainformação de expressão é em termos de se ou não o gene éexpresso e, tipicamente, em qual nível, onde os dados deexpressão, isto é, perfil de expressão, podem ser ambosqualitativos e quantitativos.Em muitas concretizações, a informação obtida acimasobre a célula/tecido sendo ensaiada é empregada paradiagnosticar um hospedeiro, indivíduo ou paciente com relação à presença de estado de ou propensidade onde jádesenvolvido, para prognosticar curso e efeitos. Porexemplo, onde a célula/tecido que é ensaiada é determinadapara ter um fenótipo de metástase de NPC, a informação podeser empregada para diagnosticar um indivíduo do qual acélula/tecido foi obtida como tendo probabilidade derecorrência de câncer.

Em adição ao monitoramento, à eficiência de umtratamento particular, a presente invenção pode seraplicada para classificar candidatos de droga potencial porsua eficácia no tratamento de probabilidade de metástase deNPC. Nesta concretização, um perfil de expressão de amostraé comparado antes e após tratamento com a droga candidato,no qual uma alteração no perfil de expressão de gene naamostra tratada de um perfil correlacionado com efeitopobre de tratamento para um perfil correlacionado comefeito aperfeiçoado de tratamento é evidência da eficáciada droga. Tais ensaios podem ser realizados in vitro ou emmodelos de animal usando-se procedimentos convencionais.

Outra aplicação na qual as coleções objetos de genesrelacionados à NPC encontram uso está no monitoramento ouavaliação de um dado protocolo de tratamento. Em taismétodos, uma amostra de célula/tecido de um pacientesuportando tratamento é monitorada usando-se osprocedimentos aqui descritos onde o(s) perfil(is) deexpressão obtido(s) é/são comparado(s) a um ou mais perfisde referência para determinar se um dado protocolo detratamento está tendo um impacto desejado na doença sendotratada. Por exemplo, perfis de expressão periódicos sãoobtidos de um paciente durante tratamento, e comparados auma série de referência/controles que incluem perfis deexpressão de vários estágios de metástase de NPC e perfisde expressão normais. Uma mudança observada no perfil deexpressão monitorado em direção a um perfil normal indicaque um dado protocolo de tratamento está operando em umamaneira desejada.

Aplicações de Classificação de Agente Terapêutico

A presente invenção também envolve métodos paraidentificação de agentes tendo a capacidade de modular ofenótipo de metástase de NPC, por exemplo, aumentá-lo oudiminui-lo, que encontra uso na identificação de agentesterapêuticos.

A identificação de compostos que modulam tal fenótipopode ser efetuada usando-se qualquer de uma variedade detécnicas de classificação de droga. A classificação dosensaios da invenção é geralmente baseada na capacidade doagente modular um perfil de expressão de genesdeterminativos de fenótipo de metástase de NPC.

O termo "agente", conforme aqui usado, descrevequalquer molécula, por exemplo, proteína, molécula pequena,ou outro farmacêutico, com a capacidade de modular umaatividade biológica de um produto de gene diferencialmenteexpresso. Geralmente uma pluralidade de misturas de ensaiosão operadas em paralelo com concentrações diferentes deagente para obter uma resposta diferencial às váriasconcentrações. Tipicamente, uma destas concentrações servecomo um controle negativo, isto é, em concentração zero ouabaixo do nivel de detecção.

Os agentes candidatos envolvem numerosas classesquímicas, embora tipicamente eles sejam moléculasorgânicas, preferivelmente compostos orgânicos pequenostendo um peso molecular de mais do que 50, e menos do quecerca de 2.500 daltons. Os agentes candidatosfreqüentemente compreendem grupos funcionais necessáriospara interação estrutural com proteínas, particularmenteligação de hidrogênio, e freqüentemente incluem pelo menosum grupo amina, carbonil, hidroxil ou carboxil,preferivelmente pelo menos dois dos grupos químicosfuncionais. Os agentes candidatos freqüentementecompreendem estruturas cíclicas de carbono ouheterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticassubstituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Osagentes candidatos são também encontrados entrebiomoléculas incluindo, mas não limitados a: peptídeos,sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas,pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinaçõesdestes.Os agentes candidatos são obtidos de uma amplavariedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostossintéticos ou naturais. Por exemplo, numerosos meios sãoconhecidos para síntese aleatória e direta de uma amplavariedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindoexpressão de oligonucleotídeos randomizados eoligopeptídeos. Alternativamente, bibliotecas de compostosnaturais na forma de extratos bacteriais, fungais, planta eanimal (incluindo extratos de tecido humano paraidentificar fatores endógenos que afetam produtos de genediferencialmente expressos) são disponíveis ou prontamenteproduzidos. Adicionalmente, as bibliotecas naturais ousinteticamente produzidas e compostos são prontamentemodificados através de meios químicos, físicos ebioquímicos convencionais, e podem ser usados para produzirbibliotecas combinatórias. Os agentes farmacológicosconhecidos podem ser submetidos a modificações químicasdiretas ou aleatórias, tais como acilação, alquilação,esterificação, amidificação, etc., para produzir análogosestruturais.

Os agentes candidatos exemplares de interesseparticular incluem, mas não estão limitados a,polinucleotídeos de antisentido, e anticorpos, receptoressolúveis, e similares. Os anticorpos e receptores solúveissão de interesse particular como agentes candidatos ondeo(s) produto(s) expresso(s) diferencialmente é/sãosecretado(s) ou acessível(is) na superfície da célula (porexemplo, receptores e outra molécula estavelmente associadacom a membrana de célula externa).Os ensaios de classificação podem ser baseados emqualquer de uma variedade de técnicas prontamentedisponíveis e conhecidas a um técnico no assunto. Em geral,os ensaios de classificação envolvem contactar uma célulaou tecido conhecido que tem fenótipo de metástase de NPCcom um agente candidato, e acessando o efeito sob um perfilde expressão de gene composto de genes determinativos defenótipo. O efeito pode ser detectado usando-se qualquerprotocolo conveniente, onde, em muitas concretizações, osprotocolos de diagnóstico acima descritos são empregados.Geralmente tais ensaios são conduzidos in vitro, mas muitosensaios podem ser adaptados para análises in vivo, porexemplo, em um modelo de animal do câncer.

Classificação Para Drogas Alvos

Em outra concretização, a invenção contemplaidentificação de genes e seus produtos, das listas aquicomo alvos terapêuticos. Em alguns aspectos, este é oinverso dos ensaios descritos acima para identificação deagentes tendo atividade na modulação (por exemplo,diminuindo ou aumentando) um fenótipo de metástase de NPC,e é dirigido a identificação de genes que sãoparticularmente fenótipo determinativo, ou seus produtos deexpressão, como alvos terapêuticos.

Nesta concretização, os alvos terapêuticos sãoidentificados pelo exame do(s) efeito(s) de um agente quepode ser demonstrado, ou tem sido demonstrado para modularum fenótipo de NPC (por exemplo, inibir ou suprimir talfenótipo) . Por exemplo, o agente pode ser umoligonucleotideo de antisentido que é especifico para umtranscrito de gene selecionado. Por exemplo, ooligonucleotideo de antisentido pode ter uma seqüênciacorrespondente a uma seqüência de um gene que aparece nastabelas aqui.

Os ensaios para identificação de alvos terapêuticospodem ser conduzidos em uma variedade de modos usando-semétodos que são bem conhecidos a um técnico no assunto. Porexemplo, uma célula teste que expressa ou sobre-expressa umgene candidato, por exemplo, um gene encontrado nas tabelasaqui, contactada com o agente de NPC conhecido, e o efeitosob um fenótipo de NPC e uma atividade biológica do produtode gene candidato acessado. A atividade biológica doproduto de gene candidato pode ser ensaiada pelo exame, porexemplo, da modulação de expressão de um gene que codificao produto de gene candidato (por exemplo, conformedetectado por, por exemplo, um aumento ou diminuição nosníveis de transcritos ou níveis de polipeptídeo), oumodulação de uma atividade enzimática ou outra atividade doproduto de gene.

A inibição ou supressão do fenótipo de metástase deNPC indica que o produto de gene candidato é um alvoadequado para terapia. Os ensaios aqui descritos e/ouconhecidos na técnica podem ser prontamente adaptados paraensaios de identificação de alvos terapêuticos. Geralmentetais ensaios são conduzidos in vitro, mas muitos ensaiospodem ser adaptados para análises in vivo, por exemplo, emum modelo de animal aceito na técnica apropriado.

Reaqentes E Kits

Também providos são reagentes e kits destes parapraticar um ou mais dos métodos acima descritos. Osreagentes objetos e kits destes podem variar grandemente.Os reagentes de interesse incluem reagentes especificamentedesignados para uso na produção dos perfis de expressãoacima descritos de genes determinativos de fenótipo de NPC.

Um tipo de tal reagente é um arranjo de sondas deácidos nucléicos no qual os genes determinativos defenótipo de metástase de NPC de interesse sãorepresentados. Uma variedade de formatos de arranjodiferentes é conhecida na técnica, com uma ampla variedadede estruturas de sonda diferentes, composições de substratoe tecnologias de fixação. Estruturas representativas dearranjo de interesse incluem aquelas descritas nas Patentesdos Estados Unidos Nos.: 5.143.854; 5.288.644; 5.324.633;5.432.049; 5.470.710; 5.492.806; 5.503.980; 5.510.270;5.525.464; 5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; asrevelações das quais sendo aqui incorporadas porreferência; bem como WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365;WO 97/27317; EP 373 203; e EP 785 280. Em muitasconcretizações, os arranjos incluem sondas para pelo menos2 dos genes aqui listados. Em certas concretizações, onúmero de genes representado no arranjo é pelo menos 5,pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50, ou mais,incluindo todos os genes aqui listados. Os arranjos objetospodem incluir somente aqueles genes que são aqui listados,ou eles podem incluir genes adicionais que não são aquilistados. Onde os arranjos objetos incluem sondas para taisgenes adicionais, em certas concretizações o número % degenes adicionais que são representados não excede cerca de50%, usualmente não excede cerca de 25%. Em muitasconcretizações onde tais genes adicionais são incluídos,uma grande maioria dos genes na coleção será genesdeterminativos de fenótipo de câncer de NPC, onde porgrande maioria é significativo pelo menos cerca de 75%,usualmente pelo menos cerca de 80% e, às vezes, pelo menoscerca de 85, 90, 95%, ou mais alta, incluindoconcretizações onde 100% dos genes na coleção são genesdeterminativos de fenótipo de câncer de NPC. Em muitasconcretizações, pelo menos um dos genes representado noarranjo é um gene cuja função não implica prontamente naprodução de um fenótipo de câncer de NPC.

Outro tipo de reagente que é especificamente providopara geração de perfis de expressão de genes determinativosde fenótipo de câncer de NPC é uma coleção de iniciadoresespecíficos de gene que é designada para amplificarseletivamente tais genes. Iniciadores específicos de genese métodos para uso dos mesmos são descritos na Patente dosEstados Unidos No. 5.994.076, a revelação da qual sendoaqui incorporada por referência. De interesse particularsão coleções de iniciadores específicos de gene que têminiciadores para pelo menos 2 dos genes aqui listados. Emcertas concretizações, o número de tais genes que teminiciadores na coleção é pelo menos 5, pelo menos 10, pelomenos 25, pelo menos 50, ou mais, incluindo todos dos genesaqui listados. As coleções de iniciador especifico de geneobjetos podem incluir somente aqueles genes que são aquilistados, ou elas podem incluir iniciadores para genesadicionais que não são aqui listados. Onde as coleções deiniciador especifico de gene objetos incluem iniciadorespara tais genes adicionais, em certas concretizações onúmero % de genes adicionais que são representados nãoexcede cerca de 50%, usualmente não excede cerca de 25%. Emmuitas concretizações onde tais genes adicionais sãoincluídos, uma grande maioria de genes na coleção são genesdeterminativos de fenótipo de NPC, onde por grande maioriaé significativo pelo menos cerca de 75%, usualmente pelomenos cerca de 80 % e, às vezes, pelo menos cerca de 85,90, 95 % ou mais alta, incluindo concretizações onde 100%dos genes na coleção são genes determinativos de fenótipode NPC. Em muitas concretizações, pelo menos um dos genesrepresentado em uma coleção de iniciadores específicos degene é um gene cuja função não implica prontamente naprodução de um fenótipo de câncer de NPC.

Os kits da invenção objeto podem incluir os arranjosacima descritos e/ou coleções de iniciador específico degene. Os kits podem incluir adicionalmente um ou maisreagentes adicionais empregados nos vários métodos, taiscomo iniciadores para geração de ácidos nucléicos alvos,dNTPs e/ou rNTPs, que podem ser ou pré-misturados ouseparados, um ou mais dNTPs unicamente etiquetados e/ourNTPs, tais como dNTPs etiquetados biotinilatados ou Cy3 ouCy5, partículas de ouro ou prata com espectro de difusãodiferente, ou outro reagente de etiquetação de pós-sintese,tal como derivados quimicamente ativos de corantesfluorescentes, enzimas, tais como transcriptases reversas,DNA polimerases, RNA polimerases, e similares, vários meiosde tampão, por exemplo, hibridização e tampões de lavagem,arranjos de sondas pré-fabricados, reagentes de purificaçãode sonda etiquetados e componentes, similares a colunas derotação, etc., reagentes de geração de sinal e de detecção,por exemplo, conjugado de treptavidin-fosfatase alcalina,substrato quimiofluorescente ou quimioluminescente, esimilares.

Em adição aos componentes acima, os kits objetosincluirão adicionalmente instruções para praticar osmétodos objetos. Estas instruções podem estar presentes noskits objetos em uma variedade de formas, uma ou mais dasquais podem estar presentes no kit. Uma forma na qual estasinstruções podem estar presentes é como informação impressaem um meio adequado ou substrato, por exemplo, uma peça oupeças de papel nas quais a informação é impressa noacondicionamento do kit, em um inserto de acondicionamento,etc. Ainda outro meio seria um meio de leitura decomputador, por exemplo, disquete, CD, etc., no qual ainformação tenha sido registrada. Ainda outro meio que podeestar presente é um endereço de website que pode ser usadovia a internet para acessar a informação em um localremovido. Qualquer meio conveniente pode estar presente noskits.Compostos E Métodos Para Tratamento De Metástase deNPC

Também providos são métodos e composições pelos quaisprobabilidade de metástase de NPC pode ser melhorada. Ainvenção objeto proporciona métodos de melhorar, porexemplo, tratamento de tais condições, por modulação daexpressão de um ou mais genes alvos, ou a atividade de umou mais produtos destes, onde os genes alvos são um ou maisdos genes determinativos de fenótipo de NPC aqui listados.

Certos estados de doença de NPC são providos, pelomenos em parte, por um nivel excessivo de produto(s) degene, ou pela presença de um produto (s) de gene exibindouma atividade anormal ou excessiva. Como tal, a redução nonivel e/ou atividade de tais produtos de gene proporciona amelhora da recorrência de doença. Técnicas para a reduçãode niveis de expressão de gene alvos ou níveis de atividadede produto de gene alvos são discutidas abaixo.

Alternativamente, certos outros estados de doença deNPC são providos, pelo menos em parte, pela ausência ouredução do nível de expressão de gene, ou uma redução nonível de uma atividade de produto de gene. Como tal, umaumento no nível de expressão de gene e/ou a atividade detais produtos de gene proporciona a melhora da doença.Técnicas para aumentar os níveis alvos de expressão de geneou níveis alvos de atividade de produto de gene são discutidas abaixo.Compostos Que Inibem Expressão, Síntese ou Atividadede Atividade de Gene Alvo Mutante

Conforme discutido acima, os genes alvos envolvidosnas enfermidades de doença de NPC podem causar taisenfermidades, via um nível aumentado de atividade de genealvo. Onde um gene é regulado em células/tecidos sobcondições de doença, uma variedade de técnicas pode serutilizada para inibir a expressão, síntese ou atividade detais genes e/ou proteínas alvos. Por exemplo, os compostostais como aqueles identificados através dos ensaiosdescritos que exibem atividade inibitória, podem ser usadosde acordo com a invenção para melhorar os sintomas dadoença. Conforme discutido acima, tais moléculas podemincluir, mas não estão limitadas a, moléculas orgânicaspequenas, peptídeos, anticorpos, e similares. Técnicasinibitórias de anticorpo são descritas abaixo.

Por exemplo, os compostos podem ser administrados quecompetem com um ligante endógeno para o produto de genealvo, onde o produto de gene alvo se liga a um liganteendógeno. A redução resultante na quantidade de gene deligação de ligante alvo modulará a fisiologia da célulaendotelial. Os compostos que podem ser particularmenteúteis para esta proposta incluem, por exemplo, proteínassolúveis ou peptídeos, tais como peptídeos compreendendo umou mais dos domínios extracelulares, ou porções e/ouanálogos destes do produto de gene alvo, incluindo, porexemplo, proteínas de fusão solúveis como proteínas defusão de extremidade Ig. (Para uma discussão da produção deproteínas de fusão de extremidade Ig, ver, por exemplo,Patente dos Estados Unidos No. 5.116.964.).Alternativamente, os compostos, tais como análogos deligante ou anticorpos, que se ligam ao local de receptor deproduto de gene alvo, mas não ativam a proteína, (porexemplo, antagonistas de receptor-ligante) podem serefetivos na inibição da atividade de produto de gene alvo.Além disso, moléculas de antisentido e ribozima que inibemexpressão do gene alvo podem também serem usadas de acordocom a invenção para inibir a atividade de gene alvoaberrante. Tais técnicas são descritas abaixo. Aindaadicionalmente, também conforme descrito abaixo, moléculashelicoidais triplas podem ser utilizadas na inibição daatividade de gene alvo aberrante.

Aproximações Inibitórias de Antisentido, Ribozima EHelicoidal Tripla

Entre os compostos que podem exibir a capacidade demelhorar a metástase de NPC estão a ribozima de antisentidoe moléculas helicoidais triplas. Tais moléculas podem serdesignadas para reduzir ou inibir atividade de gene alvomutante. Técnicas para a produção e uso de tais moléculassão bem conhecidas àqueles técnicos no assunto.

As moléculas de RNA e DNA de antisentido agem parabloquear a translação de mRNA pela hibridização do mRNAalvo, e impedindo a translação da proteína. Com relação aoDNA de antisentido, oligodeoxiribonucleotídeos derivados apartir do local de iniciação de translação, por exemplo,entre as regiões -10 e +10 da seqüência de nucleotideo degene alvo de interesse, são preferidos. As ribozimas sãomoléculas enzimáticas de RNA capazes de catalisar aclivagem especifica de RNA. O mecanismo de ação de ribozimaenvolve hibridização especifica de seqüência da molécula deribozima em RNA alvo complementar, seguido por uma clivagemendonucleolitica. A composição de moléculas de ribozimainclui uma ou mais seqüências complementares ao mRNA degene alvo, e deve incluir a seqüência catalitica bemconhecida responsável pela clivagem de mRNA. Para estaseqüência, ver Patente dos Estados Unidos No. 5.093.246,que é incorporada por referência aqui em sua totalidade.Como tal dentro do escopo da invenção estão moléculas deribozima de motivo de tubarão-martelo projetadas queespecificamente e eficientemente catalisam clivagemendonucleolitica de seqüências de RNA que codificamproteínas de gene. Os locais de clivagem de ribozimaespecíficos dentro de qualquer alvo de RNA potencial sãoinicialmente identificados pela varredura da molécula deinteresse para locais de clivagem de ribozima que incluemas seguintes seqüências, GUA, GUU e GUC. Uma vezidentificadas, as seqüências de RNA curtas de entre 15 e 20ribonucleotídeos correspondentes à região do gene alvocontendo o local de clivagem podem ser avaliadas paracaracterísticas estruturais prognosticadas, tal comoestrutura secundária, que pode tornar a seqüência deoligonucleotídeo inadequada. A adequabilidade de seqüênciascandidatos pode também ser avaliada pelo teste de suaacessabilidade a hibridização com oligonucleotídeoscomplementares, usando-se ensaios de proteção deribonuclease. As moléculas de ácido nucléico a serem usadasna formação helicoidal tripla para a inibição de transcritodevem ser de trançado simples e compostas dedeoxiribonucleotideos. A composição base destesoligonucleotideos deve ser designada para promover formaçãohelicoidal tripla, via regras de emparelhamento de base deHoogsteen,que geralmente requerem esticamentodimensionáveis de ou purinas ou pirimidinas a estarempresentes em um trançado de um duplex. As seqüências denucleotideos podem ser baseadas em pirimidina, queresultarão em trios TAT e CGC+ através dos três trançadosassociados da helicoidal tripla resultante. As moléculasricas em pirimidina proporcionam complementaridade de basepara uma região rica em purina de um trançado simples doduplex em uma orientação paralela àquele trançado. Emadição, as moléculas de ácido nucléico podem ser escolhidasque são ricas em purina, por exemplo, contendo umesticamento de resíduos G. Estas moléculas formarão umahelicoidal tripla com um duplex de DNA que é rica em paresGC, em que a maioria dos resíduos de purina está localizadaem um trançado simples da duplex alvo, resultando em triosGGC através dos três trançados no trio. Alternativamente,as seqüências potenciais que podem ser alvejadas paraformação de helicoidal tripla podem ser aumentadas pelacriação de uma assim denominada molécula de ácido nucléico"sinuosa". As moléculas sinuosas são sintetizadas em umamaneira alternante 5'-3', 3'-5', tal que elas emparelhampor base com primeiro um trançado de um duplex e, emseguida, o outro, eliminando a necessidade de umesticamento dimensionável de, ou purinas ou pirimidinas,esteja presente em um trançado de um duplex. É possível quea ribozima de antisentido e/ou moléculas helicoidaistriplas aqui descritas possam reduzir ou inibir otranscrito (helicoidal tripla) e/ou translação (ribozima deantisentido) de mRNA produzido por ambos os alelos de genealvo normal e mutante. De modo a assegurar que níveissubstancialmente normais de atividade de gene alvo sejammantidos, as moléculas de ácido nucléico que codificam eexpressam polipeptídeos de gene alvo exibindo atividadenormal podem ser introduzidas nas células via métodos deterapia de gene tais como aqueles descritos abaixo, que nãocontêm seqüências susceptíveis a qualquer que seja ribozimade antisentido, ou tratamentos de helicoidais triplas estãosendo utilizados. Alternativamente, pode ser preferível co-administrar proteína de gene alvo normal na célula outecido de modo a manter o nível de requisito de atividadede gene alvo celular ou de tecido.

RNA e DNA de antisentido, ribozima, e moléculashelicoidais triplas da invenção, podem ser preparados porqualquer método conhecido na técnica para síntese demoléculas de DNA e RNA. Estas incluem técnicas parasintetizar quimicamente oligodesoxiribonucleotídeos eoligoribonucleotídeos bem conhecidos na técnica, tal como,por exemplo, síntese química de fosforamidita de fasesólida. Alternativamente, as moléculas de RNA podem sergeradas por transcrito in vitro e in vivo de seqüências deDNA que codificam a molécula de RNA de antisentido. Taisseqüências de DNA podem ser incorporadas em uma amplavariedade de vetores que incorporam promotores depolimerase de RNA adequados, tais como os promotores depolimerase T7 ou SP6. Alternativamente, construções de cDNAde antisentido que sintetizam RNA de antisentidoconstitutivamente ou induzivelmente, dependendo do promotorusado, podem ser introduzidas estavelmente nas linhas decélulas.

Várias modificações bem conhecidas às moléculas de DNApodem ser introduzidas como um meio de aumentar aestabilidade e meia-vida intracelular. Modificaçõespossíveis incluem, mas não estão limitadas a, adição deseqüências de flanqueamento de ribonucleotídeos oudesoxiribonucleotídeos para as extremidades 5' e/ou 3' damolécula, ou o uso de f osforotioato ou 2' O-metilpreferivelmente do que ligações de fosfodiesterase dentrodo suporte de oligodesoxiribonucleotídeo.

Anticorpos Para Produtos De Gene Alvos

Os anticorpos que são ambos para proteína de gene alvoe interferem com sua atividade, podem ser usados parainibir a função de gene alvo. Tais anticorpos podem sergerados usando-se técnicas padrões conhecidas na técnicacontra as próprias proteínas, ou contra peptídeoscorrespondentes às porções das proteínas. Tais anticorposincluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais,anticorpos monoclonais, fragmentos de Fab, anticorpos decadeia simples, anticorpos quiméricos, etc.Nos exemplos onde a proteína de gene alvo éintracelular, e cujos anticorpos são usados, anticorpos deinternalização podem ser preferidos. Contudo, lipofectinlipossomos podem ser usados para distribuir o anticorpo ouum fragmento da região de Fab que se liga ao epítope degene alvo nas células. Onde os fragmentos do anticorpo sãousados, o fragmento inibitório menor que se liga ao domíniode ligação de proteína alvo é preferido. Por exemplo,peptídeos tendo uma seqüência de amino ácido correspondenteao domínio da região variável do anticorpo que se liga àproteína de gene alvo podem também ser usados. Taispeptídeos podem ser sintetizados quimicamente, ouproduzidos, via tecnologia de DNA recombinante usando-semétodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, verCreighton, 1983, supra; e Sambrook et al., 1989, supra).Alternativamente, anticorpos de neutralização de cadeiasimples que se ligam aos epítopes de gene alvo intracelularpodem também ser administrados. Tais anticorpos de cadeiasimples podem ser administrados, por exemplo, pelaexpressão de seqüências de nucleotídeo que codificamanticorpos de cadeia simples dentro da população de célulaalvo pela utilização, por exemplo, de técnicas, tais comoaquelas descritas em Marasco et al. (Marasco, W. et al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7889-7893).

Em alguns exemplos, a proteína de gene alvo éextracelular, ou é uma proteína de transmembrana. Osanticorpos que são específicos para um ou mais domíniosextracelulares do produto de gene, por exemplo, e queinterferem com sua atividade, são particularmente úteis notratamento de doença de câncer de seio. Tais anticorpos sãoespecialmente eficientes porque eles podem acessar osdomínios alvos diretamente a partir da corrente sangüínea.

Qualquer das técnicas de administração descritas abaixo quesão apropriadas para administração de peptídeo pode serutilizada para administrar eficientemente anticorpos degene alvos inibitórios em seu local de ação.

Métodos Para Restauração da Atividade de Gene Alvo

Os genes alvos que contribuem para metástase de NPCpodem ser sub-expressos dentro das situações de doença.Onde um gene é sub-regulado sob condições de doença, ou aatividade de produtos de gele alvos é diminuída, conduzindoao desenvolvimento de sintomas de doença, métodos podem serusados pelo que o nível de atividade de gene alvo pode seraumentado a níveis nos quais os sintomas de doença de NPCsão melhorados. 0 nível de atividade de gene pode seraumentado, por exemplo, ou pelo aumento do nível de produtode gene alvo presente, ou pelo aumento do nível de produtode gene alvo ativo que está presente.

Por exemplo, uma proteína de gene alvo, em um nívelsuficiente para melhorar metástase de NPC, pode seradministrada a um paciente exibindo tais sintomas. Qualquerdas técnicas discutidas abaixo pode ser utilizada para taladministração. Um técnico no assunto saberá prontamentedeterminar a concentração de doses não-tóxicas efetivas daproteína de gene alvo normal, utilizando técnicas tais comoaquelas descritas abaixo.Adicionalmente, as seqüências de RNA que codificamproteína de gene alvo podem ser diretamente administradas aum paciente exibindo metástase de NPC, em uma concentraçãosuficiente para produzir um nível de proteína de gene alvotal que os sintomas são melhorados. Qualquer das técnicasdiscutidas abaixo que efetuam administração intracelular decompostos, tais como, por exemplo, administração delipossoma, pode ser utilizada para a administração de taismoléculas de RNA. As moléculas de RNA podem ser produzidas,por exemplo, por técnicas recombinantes conforme éconhecido na técnica.

Adicionalmente, pacientes podem ser tratados porterapia de substituição de gene. Uma ou mais cópias de umgene alvo normal, ou uma porção do gene que dirige aprodução de uma proteína de gene alvo normal com função degene alvo, podem ser inseridas nas células usando-sevetores que incluem, mas não estão limitados a, adenovírus,vírus adeno-associados, e vetores de retrovírus, em adiçãoa outras partículas que introduzem DNA nas células, taiscomo lipossomas. Adicionalmente, técnicas tais como aquelasdescritas acima podem ser utilizadas para a introdução deseqüências de gene alvo normal em células humanas.

Células, preferivelmente células autólogas, contendoseqüências de gene de expressão de gene alvo normal podem,em seguida, ser introduzidas ou reintroduzidas no pacienteem posições que permitem a melhora dos sintomas. Taistécnicas de substituição de célula podem ser preferidas,por exemplo, quando o produto de gene alvo é um produto degene secretado extracelular.

Preparações Farmacêuticas E Métodos de Administração

Os compostos identificados que inibem expressão degene alvo, síntese e/ou atividade, podem ser administradosa um paciente em doses terapeuticamente efetivas paratratar ou melhorar metástase de NPC. Uma doseterapeuticamente efetiva se refere àquela quantidade docomposto suficiente para resultar na melhora dos sintomas.

Dose Efetiva

A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostospodem ser determinadas por procedimentos farmacêuticospadrões em culturas de célula ou animais experimentais, porexemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50%da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos eterapêuticos é o índice terapêutico, e ele pode serexpresso como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibemgrandes índices terapêuticos são preferidos. Enquanto oscompostos que exibem efeitos colaterais tóxicos podem serusados, cuidado deve ser tomado para designar um sistema dedistribuição que tenha como alvo tais compostos ao local detecido afetado de modo a minimizar dano potencial àscélulas não-infectadas e, desse modo, reduzir os efeitoscolaterais.Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura decélula e estudos de animal podem ser usados na formulaçãode uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem detais compostos assenta preferivelmente dentro de uma faixade concentrações circulantes que incluem a ED50 com poucaou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro destafaixa, dependendo da forma de dosagem empregada, e da rotade administração utilizada. Para qualquer composto usado nométodo da invenção, a dose terapeuticamente efetiva podeser estimada inicialmente de ensaios de cultura de célula.Uma dose pode ser formulada em modelos de animal paraalcançar uma faixa de concentração de plasma de circulaçãoque inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto testeque alcança uma inibição meio-máxima de sintomas), conformedeterminado em cultura de célula. Tal informação pode serusada para determinar mais precisamente doses úteis emhumanos. Neveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,por cromatografia liquida de alta performance.

Formulações E Uso

As composições farmacêuticas para uso de acordo com apresente invenção podem ser formuladas na maneiraconvencional usando-se um ou mais veículos ou excipientesfisiologicamente aceitáveis.

Desse modo, os compostos e seus sais farmaceuticamenteaceitáveis e solvatos podem ser formulados paraadministração por inalação ou insuflação (ou através daboca ou do nariz) ou administração oral, bucal, parenteralou retal.

Para administração oral, as composições farmacêuticaspodem ser tomadas na forma de, por exemplo, Tabletes oucápsulas preparadas por meios convencionais com excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação(por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado,polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose) ;cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina oufosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearatode magnésio, talco ou silica); desintegrantes (por exemplo,amido de batata ou sódio amido glicolato); ou agentes deumedecimento (por exemplo, sódio lauril sulfato). OsTabletes podem ser revestidos por métodos bem conhecidos natécnica. Preparações líquidas para administração oral podemtomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes oususpensões, ou elas podem ser apresentadas como um produtoseco para constituição com água ou outro veículo adequadoantes do uso. Tais preparações líquidas podem serpreparadas por meios convencionais com aditivosfarmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes desuspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados decelulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentesemulsificantes (por exemplo, lecitin ou acácia); veículosnão-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos,etil álcool ou óleos vegetais fracionados) ; e preservativos(por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos, ou ácidosórbico). As preparações podem também conter sais detampão, aromatizantes, agentes de coloração ou deadoçamento, conforme apropriado.

As preparações para administração oral podem seradequadamente formuladas para dar liberação controlada docomposto ativo. Para administração bucal, as composiçõespodem tomar a forma de Tabletes ou losangos formulados namaneira convencional. Para administração por inalação, oscompostos para uso de acordo com a presente invenção sãoconvenientemente distribuídos na forma de uma apresentaçãode pulverização de aerosol de acondicionamentospressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propelenteadequado, por exemplo,diclorodifluormetano,triclorofluormetano, diclorotetrafluoroetano, dióxido decarbono, ou outro gás adequado. No caso de um aerosolpressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinadapela provisão de uma válvula para distribuir uma quantidademedida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina parauso em um inalador ou insuflador, podem ser formuladascontendo uma mistura de pó do composto e uma base de póadequada, tal como lactose ou amido.

Os compostos podem ser formulados para administraçãoparenteral por injeção, por exemplo, por injeção de massaou infusão contínua. Formulações para injeção podem serapresentadas na forma de dosagem de unidade, por exemplo,em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas, com umpreservativo adicionado. As composições podem tomar taisformas como suspensões, soluções ou emulsões em veículosaquosos ou oleosos, e podem conter agentes formulatórios,tais como agentes de suspensão, estabilização e/oudispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estarna forma de pó para constituição com um veiculo adequado,por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes do uso.

Os compostos podem também serem formulados emcomposições retais, tais como supositórios ou enemas deretenção, por exemplo, contendo bases de supositórioconvencionais, tais como manteiga de cacau, ou outrosglicerideos.

Em adição às formulações descritas anteriormente, oscompostos podem também serem formulados como uma preparaçãode depósito. Tais formulações de ação longa podem seradministradas pela implantação (por exemplo,subcutaneamente ou intramuscularmente) , ou por injeçãointramuscular. Desse modo, por exemplo, os compostos podemser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicosadequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleoaceitável) , ou em resinas de troca de ion, ou comoderivados escassamente solúveis, por exemplo, como um salescassamente solúvel.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas emum acondicionamento ou dispositivo dispensador que podeconter uma ou mais formas de dosagem de unidade contendo oingrediente ativo. 0 acondicionamento pode, por exemplo,compreender metal ou óleo plástico, tal como umacondicionamento a blister. 0 acondicionamento oudispositivo dispensador podem ser acompanhados pelasinstruções para administração.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Várias características e vantagens da presenteinvenção tornar-se-ão mais totalmente apreciadas conforme amesma se torna melhor compreendida quando considerada emconjunto com os desenhos acompanhantes, nos quaiscaracteres de referência similares designam a mesma oupartes similares através das várias vistas, e nos quais:

A Figura 1 mostra um esboço da estratégia usada paradesenvolvimento e validação de preditores molecularesbaseados em dados de perfil de transcrito de mRNA.

A Figura 2 representa uma análise de agrupamentohierárquico usando 798 genes selecionados de 96 casos deconjunto de treinamento. Os genes individuais são mostradosem séries conforme indicado na esquerda e direita. Casosindividuais são mostrados como colunas no topo. Osresultados indicam que os genes foram agrupados em 6 gruposconforme indicado por barras coloridas à esquerda.

A Figura 3 mostra análises de Kaplan-Meier deprobabilidades livres de metástase e sobrevivência totalpara casos prognosticados de baixo e alto risco parametástase à distância por assinatura de 52 genes e métodode classificação de vizinhanças mais próximos de k. Osresultados mostrados foram obtidos a partir de casos deconjunto teste independentes. Os valores ρ foram calculadoscom teste de classificação de log.

A Figura 4 mostra análises de Kaplan-Meier deprobabilidades livres de metástase e sobrevivência totalpara casos prognosticados de baixo e alto risco parametástase à distância por assinatura de 12 genes, e omodelo de regressão logístico. Os resultados mostradosforam obtidos a partir de casos de conjunto testeindependentes. Os valores foram calculados com teste declassificação de log.

A Figura 5 mostra análises de Kaplan-Meier deprobabilidades livres de metástase e sobrevivência total deacordo com os resultados preditivos combinados deassinaturas de 52 genes e 12 genes. Os casos mostrandoresultados discordantes entre duas assinaturas foramrelacionados como "indeterminados" (Tabela 6) . Os casosmostrando resultados concordantes caíram ou no baixo oualto risco para metástase à distância. Quando os grupos deassinatura de baixo e alto risco foram comparados aoslivres de metástase e sobrevivência total, os valores ρforam <0,0001 e 0,002, respectivamente. Não existemdiferenças significantes entre o grupo indeterminado e ogrupo de baixo ou alto risco para sobrevivência livre demetástase (p=0,09 e 0,05) e sobrevivência total (p=0,31 e0,09). Os valores ρ foram calculados com o uso de teste declassificação de log.A Figura 6 mostra análises de Kaplan-Meier deprobabilidades de sobrevivência total e livre de metástaseentre pacientes de estágio III ou IVa/b NPC com e semmetástase à distância. Mais pacientes incluídos no estudocomeçaram a receber seu tratamento entre 1997 e 2002 deacordo com os protocolos institucionais, e foram seguidosregularmente. 0 painel superior mostra as curvas desobrevivência total destes quatro grupos de pacientes.Existem 106 e 27 pacientes de estágio III sem e comdesenvolvimento de metástase à distância, respectivamente.Similarmente, existem 47 e 35 pacientes de estágio IV. Asdiferenças de sobrevivência total entre pacientes com e semdesenvolvimento de metástase à distância para pacientes deestágio III ou IVa/b foram significantes com ambos osvalores ρ <0,0001. Não existe diferença significante entrepacientes de estágio III e IVa/b com (p=0,39), ou sem(p=0,35) metástase à distância. O painel inferior mostraprobabilidades de sobrevivência livre de metástase parapacientes de estágio III e IVa/b que eventualmentedesenvolveram metástase à distância. Todos os pacientes deestágio III foram tratados com quimioterapia concorrente deradiação e quimioterapia adjuvante somente, pelo quequimioterapia de manutenção foi adicionado aos pacientes deestágio IVa/b.

A Figura 7 mostra a correlação de intensidades médiasde conjuntos de sonda "presentes" entre dois operadoresdiferentes. Todas as espécimes de NPC nos conjuntos detreinamento foram aleatoriamente realizadas pelos doisoperadores. O operador A realizou 24 casos de não-metástasee 14 casos positivos de metástase no conjunto detreinamento. 0 operador B realizou 35 casos de não-metástase e 18 casos positivos de metástase. A média dasintensidades de expressão normalizada para cada conjunto desonda dos casos realizados por cada operador foi calculada.Os resultados mostraram correlação linear diagonal perfeitaindicando que não existe inclinação sistemática associadacom os operadores.

A Figura 8 mostra os resultados de normalizaçãoQuantile no nivel de conjunto de sonda para correção devariações experimentais. Amostras de cRNA de seis espécimesde NPC diferentes (I-VI) foram divididas em duas porções ehibridizadas em dois U133-A GeneChips em datas diferentes.A correlação de intensidades de todos os conjuntos de sondapara genes humanos em U133-A GeneChip foi realizada paracada caso conforme mostrado na figura. 0 painel superiormostra correlação de intensidades de conjunto de sonda dearquivo chp sem normalização. 0 painel intermediário mostracorrelação de intensidades de conjunto de sonda após escalaem uma média neutra de 500. 0 painel inferior mostracorrelação de intensidades de conjunto de sonda apósnormalização quantile de intensidades de expressão de todosos conjuntos de sonda humana para um padrão previamenteestabelecido. Os resultados mostram que normalizaçãoquantile em níveis de conjunto de sonda é efetiva paracorrigir variações experimentais.

Sem elaboração adicional, acredita-se que um técnicono assunto pode, usando a descrição precedente, utilizar apresente invenção para sua extensão mais total. Asseguintes concretizações especificas preferidas são,portanto, para serem construidas como meramenteilustrativas, e não limitativas do restante da revelação dequalquer modo.

No precedente e nos exemplos seguintes, todas astemperaturas são colocadas não-corrigidas em graus Celsiuse, todas as partes e percentagens são por peso, a menos quede outro modo indicado.

Nos aspectos preferidos, esta invenção proporciona:

1. Um método de avaliar o risco de metástase àdistância em um paciente tendo carcinoma nasofaringealcompreendendo avaliar o perfil de expressão de pelo menosum dos genes listados nas Tabelas 4 e 5 em uma amostra dereferido paciente.

2. Um método como em 1 compreendendo avaliar osperfis de expressão de dois ou mais dos 52 genes listadosna Tabela 4.

3. Um método como em 1 compreendendo avaliar osperfis de expressão dos 52 genes listados Tabela 4.

4 . Um método como em 3 no qual a avaliação daexpressão dos 52 genes listados na Tabela 4 é realizadausando-se um modelo de regressão para cada um dos 9agrupamentos de genes mostrados na Tabela 4.

5. Um método como em 4 no qual escores logit sãogeradas para cada um dos nove agrupamentos de gene usando-se as respectivas equações de modelo de regressão da Tabela 1.

6. Um método como em 5 no qual uma regra preditivapara risco de metástase à distância é gerada por um métodode classificação de vizinhanças mais próximos de k aplicadoàs referidas escores logit para referidos nove agrupamentosde gene.

7. Um método como em 1 compreendendo avaliar operfil de expressão de dois ou mais dos 12 genes listadosna Tabela 5.

8. Um método como em 1 compreendendo avaliar osperfis de expressão dos 12 genes listados na Tabela 5.

9. Um método como em 8 no qual a avaliação daexpressão dos 12 genes listados na Tabela 5 é realizadausando-se um modelo de regressão logístico.

10. Um método como em 9 no qual um escore logit égerada baseada nos perfis de expressão de referidos 12genes usando-se a equação de modelo de regressão da Tabela-2, e referida escore logit está correlacionada com risco demetástase à distância.11. Um método como em 10 no qual a regra preditivapara baixo risco de metástase à distância é

[Probabilidade para baixo risco de metástase àdistância] = <formula>formula see original document page 57</formula>

12. Um método como em 6 no qual o risco de metástaseà distância resultante de referida regra preditiva écomparado com o risco de metástase à distância de umasegunda regra preditiva independente que avalia referidorisco usando a equação

[Probabilidade para baixo risco de metástase àdistância] = <formula>formula see original document page 57</formula> no qual a escore logit é gerada usando a equação demodelo de regressão da Tabela 2 e os perfis de expressãodos 12 genes listados na Tabela 5.

13. Um método como em 12 no qual quando o risco demetástase à distância determinado de ambos de referidosmétodos é baixo ou alto, então o risco é contado como baixoou alto, respectivamente, e quando referidos riscosdeterminados são discordantes, então o risco é contado comoindeterminado.

14. Um método como em 1 no qual referido perfil deexpressão é avaliado em uma espécime de tumor de NPC.

15. Um método como em 1 no qual referido perfil deexpressão é gerado de transcrições de mRNA.

16. Um micro-arranjo de ácido nucléico útil paradeterminar o risco de metástase à distância em um pacientetendo carcinoma nasofaringeal consistindo essencialmente desondas para determinar os perfis de expressão dos (a) 52genes listados na Tabela 4, (b) 12 genes listados na Tabela-5, ou (c) ambos referidos 52 e referidos 12 genes.

17. Uma coleção forma de meio ou kit consistindo detodos os 52 genes listados na Tabela 4 e/ou todos os 12genes listados na Tabela 5; e/ou um subconjunto dereferidos 52 genes ou de referidos 12 genes, ou ambossubconjuntos, em cada caso referido subconjunto sendoefetivo para predição de risco de metástase à distância empacientes com carcinoma nasofaringeal.EXEMPLOS

EXEMPLO I

A perfilação de transcrito de mRNA foi realizada em138 espécimes de biópsia de NPC primário obtidas antes daterapia. Os espécimes representam dois grupos clínicosopostos de pacientes de NPC: metástase à distância dentrode três anos após tratamento inicial (grupo de alto risco,n=47) versus nenhuma metástase à distância após mais do quetrês anos seguidos (grupo de baixo risco, n=91). Doisterços de 138 espécimes foram randomizados ao conjunto detreinamento, e um terço para o conjunto teste. Análisessupervisionadas foram conduzidas para descobrir assinaturasde expressão de gene associadas com desenvolvimento demetástase à distância no conjunto de treinamento (n=96). Ospreditores moleculares descobertos foram validados em umconjunto teste independente de 42 espécimes.

Seleção de Paciente e Tecidos de Tumor

Amostras de biópsia recentemente congeladas a partirde tumor primário de 375 pacientes de NPC coletadas entre1992 e 2004 no Banco de Tumor da Koo Foundation Sun Yat-SenCâncer Center (KF-SYSCC) foram disponíveis para extração deRNA total. Consentimentos informados escritos foram obtidosde todos os pacientes, e o estudo foi aprovado peloconselho de revisão institucional. RNAs de 105 pacientesforam seriamente degradados e rejeitados a partir doestudo. Nas 270 amostras restantes, somente 138 amostrasencontraram qualquer dos seguintes critérios, e foramselecionadas para o estudo. 0 primeiro critério de seleçãodenominado para pacientes que não tinham desenvolvidometástase à distância e tinham sido regularmente seguidaspor três anos ou mais a partir do tratamento inicial. Estegrupo de pacientes (n=91) foi designado como clinicamentede baixo risco para metástase à distância. 0 segundocritério de seleção denominado para pacientes que, ou játinham desenvolvido metástase à distância no momento queeles receberam o primeiro tratamento, ou desenvolveramdoença â distância dentro de três anos a partir dotratamento inicial. Metástases à distância foram definidascomo metástases de NPC em pulmões, osso, fígado, rins,cérebro, e outros órgãos viscerais. As metástases foramconfirmadas histologicamente com aspiração de agulha finaou biópsia de núcleo. Este grupo de pacientes (n=47) foidesignado como clinicamente de alto risco para metástase àdistância.

As amostras de biópsia de tumores primários a partirde todos os pacientes elegíveis foram coletadas entre 1995e 2004, exceto que uma amostra foi coletada em 1992. Amaioria das amostras (83%) foi coletada entre 1998 e 2001.

As idades dos pacientes no momento do diagnóstico variaramde 11 a 71 anos de idade com uma média e uma média de 44 e45 anos, respectivamente. Após diagnóstico inicial eoperação de estágio, os pacientes foram tratados de acordocom os protocolos institucionais31. A média e duraçõesmédias de seguimento foram 3,34 e 3,29 anos,respectivamente. Durante o período seguido, 29 pacientesmorreram e 28 deles estavam no grupo clinicamente de altorisco. O estágio de pacientes de NPC foi conduzido deacordo com a definição 1997 AJCC.

Estudo de Perfil de Transcrito de mRNARNA total foi isolado de tecidos congelados emnitrogênio liquido usando-se reagentes Trizol (Invitrogen,Carlsbad, CA) de acordo com a instrução do fabricante. 0RNA isolado foi adicionalmente purificado usando-se RNAEasyMini kit (Qiagen, Valencia, CA), e a qualidade foi avaliadapelo ensaio RNA 6000 Nano em um Bioanalisador Agilent 2100(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Todas asamostras de RNA usadas para estudo de perfil de expressãode gene tinham um Número de Integridade de RNA (RIN) entre6,0 e 10,0 (7,8 ± 1,1, média ± SD). Alvos de hibridizaçãoforam preparados de RNA total de acordo com protocolosAffymetrix, e hibridizados para Affymetrix U133A GeneChips.0 U133 A GeneChip continha 22.238 conjuntos de sonda paraaproximadamente 13.000 genes humanos. As características doarranjo são convencionais e, por exemplo, detalhadas naAffymetrix web site (www.affymetrix.com/products/arranjos).Brevemente, cDNA de trançado duplo foi sintetizado de 8μgde RNA total por amostra. RNA complementar etiquetado combiotin (cRNA) foi gerado por transcrito in vitro a partirde cDNA. 0 cRNA foi purificado e quimicamente fragmentadoantes da hibridização. Um coquetel foi preparado porcombinação de quantidades específicas de cRNA fragmentado,controles de arranjo de sonda, albumina de soro bovino, eDNA de esperma de arenque de acordo com o protocolo dofabricante. O coquetel de cRNA foi hibridizado para sondasde oligonucleotideo no U133A GeneChip por 16 horas a 45°C.Imediatamente em seguida à hibridização, o arranjo de sondahibridizado suportou uma lavagem automática e manchamentoem uma estação 400 de Affymetrix GeneChip usando-se oprotocolo EukGE WS2v4. Em seguida, U133A GeneChips foramescaneados em um Affymetrix GeneArranjo scanner 2500.

Escala e Normalização de Dados de Micro-arranjo

A intensidade de expressão de cada gene foideterminada pela escala em um alvo médio neutro de 500usando-se um software de Análise de Micro-arranjo AdequadaAffymetrix (MAS) 5.0. As intensidades de expressão emescala de todos os genes humanos em um U133A GeneChip foramlogaritmicamente transformadas na base 2, e normalizadasusando-se o método de normalização quantile.32 0 padrão dereferência para normalização quantile foi previamenteestabelecido em nosso laboratório a partir de dados U133AGeneChip de 164 NPC primários, 15 tecidos nasofaringealnormais e 23 NPC metastáticos. Ver USSN 11/015.764 de 20 dedezembro de 2004 e 11/090.294 de 28 de março de 2004, osconteúdos totais de cada um dos quais sendo incorporadoaqui por referência. Outras medições de qualidadeadicionais de dados de U133A GeneChip incluem a percentagemde genes que foram detectáveis como "presentes" (52.1 ± 5.8%, médio ± SD), e a razão de GAPDH 3' para 5' (0.96 ± 0.18,médio ± SD). Ambos os parâmetros suportaram boa qualidadetotal das amostras e ensaios.EXEMPLO II

Análise Estatística de Dados

O processo de análises estatísticas empregado éresumido e representado na Figura 1.

Divisão de Amostras em Conjuntos de Treinamento e

Teste

Em 138 casos de NPC incluídos em nosso estudo, 91casos não desenvolveram qualquer metástase à distância apósiniciação do primeiro tratamento, e foram seguidos por maisdo que três anos. Estes 91 casos foram classificados comoclinicamente de baixo risco para metástase à distância. Nos47 casos restantes, toda a metástase à distânciadesenvolvida no momento do primeiro tratamento ou dentro detrês anos após iniciação do primeiro tratamento. Eles foramclassificados como clinicamente de alto risco parametástase à distância. O intervalo médio entre a data doprimeiro diagnóstico e a data do primeiro tratamento paratodos os pacientes foi 20 ± 51 dias (média ± SD) . Doisterços dos pacientes de cada grupo de risco foramtransferidos aleatoriamente usando-se software SAS (versão9.1) para o conjunto de treinamento. (Software SAS édisponível de SAS Institute Inc., Cary, NC). Um terço dospacientes foi transferido para o conjunto teste. Atransferência de pacientes de alto risco foi estratifiçadade acordo com o sexo, idade (< e > 45 anos), 1997 AJCC TNMestágio (I e II vs. III e IV), e duração seguida (< e > 4,5anos) . Pacientes de alto risco foram estratifiçados deacordo com o sexo, idade, estágio de TNM, e tempo a partirdo primeiro tratamento para o desenvolvimento de metástaseà distância e > 1,5 anos). Existem 62 casos de baixo

risco e 34 casos de alto risco no conjunto de treinamento;e existem 29 casos de baixo risco e 13 casos de alto riscono conjunto de teste independente. As amostras do conjuntode teste independente não foram envolvidas através de todoo processo de treinamento.

Seleção de Genes para Análise

Somente conjuntos de sonda com sua expressãodeterminada como "presente" por softaware Affymetrix MAS5.0 em todas as amostras de NPC, excluindo as amostras deconjunto teste, foram selecionados para análise. Os dadosde expressão normalizados e logaritmicamente transformadosde cada gene foram primeiro analisados por teste deKruskal-Wallis entre os grupos de baixo e alto riscousando-se software GeneLinker Platinum 4.5 (PredictivePatterns Software, Inc., Inverary, Canada). Setecentos enoventa e oito genes com valores ρ <0,05 foram selecionadospara estudo adicional por métodos de mapa de auto-organização (SOM) (GeneLinker Platinum 4.5 software).

Análise de SOM

Os 798 genes foram analisados por SOM. 0 conjunto deparâmetros para análise de SOM incluiu orientação porgenes, correlação de Pearson para métrica de distância, edimensão de mapa de 2 (altura) x3 (largura) . Para vetor dereferência e propriedades algorítmicas, os valores deomissão foram usados. A escolha de dimensão 2x3 foi guiadapor agrupamento hierárquico de 798 genes nos casos deconjunto de treinamento (Fig. 2). Esta aproximação ofereceuum meio objetivo de selecionar uma dimensão de mapa paraanálise de SOM. Todos os 798 genes foram, portanto,agrupados em seis grupos diferentes de SOM (I a VI).

Os genes em cada grupamento de SOM foramadicionalmente selecionados por regressão logística deavanço binária usando-se software SPSS 9.0 software (SPSS,Inc., Chicago, Illinois). A entrada e remoção de valores ρpara regressão logística de avanço foram <0,05 e >0,1,respectivamente. Após análise de regressão logística, osnúmeros dos genes selecionados de grupamentos de SOM II, Ve VI foram 6, 6 e 5, respectivamente. Separação completafoi encontrada para grupamentos de SOM I, III e IV duranteanálise de regressão logística. Subseqüentemente, duasanálises dimensionais de SOM foram realizadas nos genes degrupamentos de SOM I, III e IV, separadamente. Os númerosresultantes dos genes selecionados nos grupamentos de SOMIa, Ib, IIIa, IIIb, IVa, e IVb foram 9, 5, 8, 4, 6 e 3,respectivamente. Desse modo, existem 52 genes em novegrupamentos de SOM.

Estabelecimento de Métodos PreditivosDois métodos preditivos para identificação depacientes de NPC com alto risco de desenvolver metástase àdistância foram estabelecidos. 0 primeiro método foibaseado em 52 genes em nove grupamentos de SOM. Um modelode regressão foi estabelecido para os genes de cadagrupamento. A equação de cada modelo de regressão é listadana Tabela 1. Um escore logit foi gerado de cada equaçãopara toda amostra. Os nove escores logit para cada amostrano conjunto de treinamento foram usadas para desenvolver aregra preditiva pelo método de classificação (k-NN) devizinhanças mais próximos de k usando-se software SAS 9.0.Os valores "k" de 1, 3, 5, 10 e 30 foram separadamentetestados pelo uso do conjunto de treinamento. Validaçãocruzada de partida foi conduzida. 0 valor k testado de 10deu o melhor resultado de acordo com a validação cruzada departida, e foi escolhido para o método preditivo.

O segundo método preditivo foi baseado em 12 genesderivados de 197 genes no grupamento de SOM original I.Conforme mencionado acima, três grupamentos de SOM de genesmostraram separação completa durante regressão logísticacom análise de seleção de avanço. Os resultados sugeriramvalor preditivo de alto potencial de genes destes trêsgrupamentos de SOM. De modo a identificar genes dos quais ogrupamento de SOM pode ser seguramente usado para predição,à seleção de gene foi conduzida de cada grupamento de SOMpor regressão logística de avanço binária (software SPSS9.0) usando-se casos de conjunto de treinamento, e aseleção de genes foi cessada correta antes de encontrarseparação completa. Os genes selecionados de cadagrupamento foram usados para derivar um escore logit quefoi usada para estimar a probabilidade. A probabilidademaior do que 0,5 foi transferida para metástase à distânciade baixo risco, e probabilidade menor do que 0,5 foitransferida para metástase à distância de alto risco. Osresultados mostraram que 12 genes selecionados a partir dogrupamento de SOM I produziram os melhores resultadosusando-se os casos no conjunto de treinamento. A equação domodelo de regressão baseado nos 12 genes a partir dogrupamento de SOM I é mostrada na Tabela 2.

Análise de Sobrevivência

As análises livre de matástase e de sobrevivênciatotal foram efetuadas por teste de classificação de Iog deKaplan-Meier usando-se o software SAS 9.0. A sobrevivênciafoi definida como a duração entre a data de começo doprimeiro tratamento e a última data seguida, ou a data demorte. A sobrevivência livre de metástase foi definida comoa duração entre a data de começo do primeiro tratamento e adata da primeira metástase à distância diagnosticada.

EXEMPLO III

Resumo dos Resultados

Conforme mostrado, dois preditores foram estabelecidospara identificação de pacientes de NPC em alto ou baixorisco de desenvolver metástase à distância. 0 primeiropreditor foi baseado em 52 genes em nove grupamentos demapas de auto-organização diferentes, e um método declassificação de vizinhanças mais próximas de k. 0 segundopreditor foi baseado em 12 genes e um modelo de regressãologístico. Ambos os métodos foram fortemente preditivospara intervalo curto para metástase à distância esobrevivência total curta no conjunto de testeindependente. As precisões totais de ambos os métodosavaliados nos casos de conjunto de teste independentesforam 81% e 7 6%, respectivamente. Quando ambos os métodospreditivos foram combinados, a precisão foi aumentada para85%. A razão perigosa estimada para metástase à distânciano grupo de assinatura de alto risco, conforme comparadacom o grupo de assinatura de baixo risco, foi 11,1 (95% deintervalo de confidência 2,4 a 52,4 , p=0,002).

Características dos Pacientes

Para identificar assinaturas de gene para predição depacientes com NPC em alto ou baixo risco de desenvolvermetástase à distância com sobrevivência pobre ou boa total,uma análise supervisionada foi conduzida entre dois gruposde pacientes com NPC clinicamente bem definidos. É bemreconhecido que pacientes com NPC que não desenvolvemmetástase à distância dentro de três anos após o tratamentoinicial tinham boa sobrevivência de longo prazo livre demetástase e total.31,33 Em contraste, pacientes com NPC quedesenvolveram metástase à distância, no momento de, oudentro de três anos após o primeiro tratamento, usualmentemorreram da doença, e tinham sobrevivência mais pobre.Entre 138 pacientes em nosso estudo, 91 pacientespertenciam ao grupo clinicalmente de baixo risco e 47pacientes ao grupo clinicamente de alto risco. Dois terçosdos pacientes de baixo e alto risco foram aleatoriamentetransferidos para o conjunto de treinamento, e um terçopara o conjunto de teste. As características destespacientes são resumidas na Tabela 3. Não existem diferençassignificantes para as características clínicas listadasentre os casos de conjunto de treinamento e de conjuntoteste para ambos os grupos de baixo e alto risco. Emadição, a distribuição de locais de metástase à distânciaentre o conjunto de treinamento (n=34) e o conjunto deteste (n=13) para osso foi 50% vs 69%, fígado 50% vs 54%,pulmões 38% vs 23%, outros 15% vs 23%. Outros incluemcérebro, rins, baço e órgãos da pelvis. A distribuição foisimilar entre os dois grupos.

EXEMPLO IV

Predição de Metástase à distância por assinatura de 52 genes

Para identificar genes preditores, uma análisealtamente supervisionada foi conduzida. Somente genes(4.814 conjuntos de sonda) que podem ser determinados como"presentes" por software Affymetrix MAS 5.0 em todas asamostras de NPC, excluindo os casos de conjunto de teste,foram usados para o estudo. Nós, em seguida, realizamos umteste de Kruskal-Wallis entre os grupos clinicamente debaixo risco e os grupos clinicamente de alto risco doconjunto de treinamento. Setecentos e noventa e oito genesmostrando diferença significante (p <0,05) com suaexpressão foram selecionados para estudo adicional. Umaanálise de grupamento hierárquico não-supervisionada foirealizada nos casos de conjunto de treinamento usando-se os798 genes escolhidos. Os resultados mostraram seisgrupamentos de gene maiores (Fig. 2). Com base no resultadode agrupamento hierárquico, uma dimensão de mapa de 2x3 foiescolhida para análise de SOM. Muitos genes em cadagrupamento de SOM se agregaram juntos e estavam em paralelocom os grupamentos de gene gerados pelo agrupamentohierárquico.

Os genes em cada um dos seis grupamentos de SOM foramadicionalmente analisados por regressão logística comseleção avançada para os casos de baixo e alto risco noconjunto de treinamento. Estes três grupamentos de SOM degenes mostraram o problema de separação completa. Os genesem cada um destes três grupamentos foram adicionalmenteanalisados por SOM para dois sub-grupamentos. Um total de52 genes foi selecionado a partir de nove grupamentos deSOM, e usados para desenvolver um modelo preditivo parametástase à distância. Estes 52 genes estão resumidos naTabela 4. As equações usadas para determinar o escore logitde genes em cada grupamento de SOM são resumidas na Tabela1.

Desse modo, nove escores logit foram gerados a partirdas intensidades de expressão dos 52 genes para cada caso.Os nove escores logit de cada caso no conjunto detreinamento foram usados para estabelecer uma regrapreditiva pelo método de classificação k-NN. A validaçãocruzada de partida para a regra preditiva mostrou que aespecificidade e a sensibilidade para predição de casos deconjunto de treinamento com alto risco de metástase àdistância foram 98% (61/62) e 88% (30/34), respectivamente.A precisão total foi 95% (91/96). Quando os casos deconjunto de teste independentes (n=42) foram analisados deacordo com a regra preditiva estabelecida, aespecificidade, a sensibilidade e a precisão total foram86% (25/29), 69% (9/13), e 81% (34/42), respectivamente. Oteste exato de Fisher para associação (p=0,0007) confirmoua robustez dos 52 genes preditores. As razões perigosasestimadas entre os grupos de assinatura de alto riscoprognosticado e de baixo risco prognosticado para metástaseà distância e sobrevivência total mais curta foram 7,1(p=0,002, 95% de intervalo de confidência 2,2-23,5) e 5,4(p=0,001, 95% de intervalo de confidência 1,5-19,4),respectivamente.

Quando os pacientes no conjunto de testeprognosticados como baixo (n=29) ou alto (n=13) risco parametástase à distância foram comparados para suasobrevivência livre de metástase e total, os pacientesprognosticados como tendo alto risco para metástase àdistância tinham sobrevivência livre de metástasesignificantemente mais curta (p=0,0001), e sobrevivênciatotal mais curta (p=0,003) (Fig. 3).

EXEMPLO VPredição de Metástase à distância por assinatura de 12

genes

0 segundo método preditivo foi baseado nos 12 genesselecionados por análise de regressão logística a partir degenes no grupamento de SOM I. As equações usadas paracalcular a probabilidade do baixo risco para metástase àdistância são resumidas na Tabela 2. Os 12 genes sãolistados na Tabela 5. Quando a regra preditiva dos 12 genesfoi aplicada aos casos de conjunto de teste independentes(n=42), a sensibilidade, a especificidade e a precisãototal para predição de alto risco metastático foram 85%(11/13), 72% (21/29) e 76% (32/42), respectivamente. Para opreditor de 12 genes, o teste exato de Fisher paraassociação (p=0,0008) confirmou robustez similar aopreditor de 52 genes. As razões perigosas estimadas entregrupos de assinatura de alto risco prognosticado e de baixorisco prognosticado para metástase à distância esobrevivência total mais curta foram 8.2 (p=0,006, 95% deintervalo de confidência 1,8-37,4) e 6,3 (p=0,02, 95% deintervalo de confidência 1,3-29,7), respectivamente.

Quando casos prognosticados como de baixo risco (n=23)ou de alto risco (n=19) pelo preditor de 12 genes foramanalisados para a sobrevivência livre de metástase esobrevivência total, os resultados mostraram sobrevivênciamais curta livre de metástase (p=0,0007) e sobrevivênciatotal (p=0,007) para pacientes prognosticados como tendoalto rico para metástase à distância (Fig. 4).EXEMPLO VI

Predição de metástase à distância por assinaturascombinadas

Quando os resultados dos dois métodos preditivos dosExemplos IV e V foram analisados para sua concordância noscasos de conjunto de teste independentes, 22 casos (52%)foram prognosticados de baixo risco e 12 casos (29%) foramprognosticados de alto risco para ambos os métodos (Tabela6). Oito casos (19%) foram discordantes entre dois métodose relacionados como indeterminados. Entre os casosconcordantes (n=34), cinco foram incorretamenteprognosticados. Três casos foram falsos positivos e doiscasos foram falsos negativos. Desse modo, a precisão totalfoi 85% (29/34). As razões perigosas estimadas entre osgrupos de assinatura de alto risco e de baixo risco parametástase à distância e sobrevivência total mais curtaforam 11,1 (p=0, 002, 95% de intervalo de confidência 2,4-52,4) e 8,5 (p=0, 009, 95% de intervalo de confidência 1,7-42,8), respectivamente. A análise de sobrevivência doscasos prognosticados como de baixo risco, de alto risco eindeterminado, revelou que casos de alto risco tinhamsobrevivência livre de metástase e total significantementepior do que aquela prognosticada como de baixo risco (Fig.5). A diferença de sobrevivência livre de metástase e totalentre os casos de baixo risco e indeterminados não foiestatisticamente significante.EXEMPLO VII

Comparação de Sobrevivência Entre pacientes com NPC deestágio III e IV

De modo a aprender o impacto clinico potencial dosmétodos preditivos estabelecidos, dados clínicos de 133pacientes com NPC de estágio III e 82 pacientes com NPC deestágio IVa e IVb (IVa/b) foram coletados. Entre estespacientes, somente 90 eram parte do estudo de transcrito demRNA acima. Todos os pacientes tinham sido tratados eregularmente seguidos de acordo com os protocolosinstitucionais31 entre 1997 e 2003. Os pacientes de TNM deestágio III ou IVa/b foram adicionalmente divididos em doisgrupos de acordo com o desenvolvimento subseqüente demetástase à distância. As sobrevivências total e livre demetástase destes quatro grupos de pacientes foramcomparadas. Os resultados mostraram que os pacientes comNPC com doença de estágio III que desenvolveramsubseqüentemente metástase à distância tinham sobrevivênciatotal e livre de metástase similar aos pacientes comdoenças de estágio IVa/b que também desenvolveram metástaseà distância (n=35) (Fig. 6) . Em contraste, pacientes deestágio III (n=106) ou IVa/b (n=47) sem desenvolvimento demetástase à distância tinham sobrevivência total muitomelhor do que aqueles pacientes com metástase à distância(Fig. 6) .Os resultados indicam que existem dois grupos diversosde pacientes de estágio III ou IVa/b. Um grupo tinha baixorisco de desenvolver metástase à distância, e bom efeitoclinico. 0 outro desenvolveu metástase à distância dentrode três anos após o tratamento inicial, e tinha efeito desobrevivência pobre (Fig. 6) . Estas descobertas suportamque predição precisa de pacientes que estão em alto riscode desenvolver metástase à distância não somente temimplicação prognostica importante, mas também proporcionaum meio de selecionar pacientes apropriados para testarnovas modalidades terapêuticas para aperfeiçoar o efeito detratamento de longo prazo.

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Tabela 1. Equações de modelo de regressão logísticopara genes selecionados em nove grupamentos de SOM

<table>table see original document page 82</column></row><table>LOGIT IIIa = (201123_s_at) χ 0.8651 + (201642_at) χ3.9114 + (202301_s_at) χ 7.9516 + (206544_x_at) χ (-1.8805)+ (208698_s_at) χ 2.8301 + (211115_x_at) χ 4.0432 +(211575_s_at) X (-4.3726) + (211913_s_at) χ (-2.2606) -117.98

LOGIT IIIb = (200880_at) χ 2.7955 + (208765_s_at) χ2.1072 + (209157_at) χ 2.2478 + (212398_at) χ 3.4807 -104.518

LOGIT IVa = (201178_at) χ (-2.6194) + (212911_at) χ (-2.4526) + (213254_at) χ (-1.7758) + (217969_at) χ 2.475 +(218659_at) χ 3.3188 + (64418_at) χ (-2.4296) + 22.4303

LOGIT IVb = (202211_at) χ (-2.1207) + (212884_x_at) χ(-1.0461) + (2212 69_s_at) χ (-0.9598) + 40.9722

LOGIT V = (200921_s_at) χ (-2.6385) + (201057_s_at) χ(-2.5845) + (2 07 335_x_at) χ (-2.7044) + (209584_x_at) χ (-1.6973) + (2117 33_x_at) χ (-4.2067) + (217118_s_at) χ (-2.539) + 171.7096

LOGIT VI = (201266_at) χ 2.5851 + (202905_x_at) χ2.7306 + (203006_at) χ 1.6767 + (206559_x_at) χ 13.1357 +(212295_s_at) χ 2.7269 - 286.114_

Os números de identificação de conjunto de sondaAffymetrix em parênteses representam a intensidade deexpressão normalizada da transcrito de mRNA para osconjuntos de sonda indicados. Os escores logit foramcalculados a partir das equações listadas e usados paraprognosticar risco de metástase pelo método de vizinhançasmais próximas de k.Tabela 2. Equação para cálculo de escore logit baseadonas intensidades de expressão de 12 genes para estimarrisco de metástase à distância

Equação para modelo de regressão logístico paracalcular escore logit:

log it(n) = 459.9 + (200057_s_at) x( -12.5305) +(200842_s_at) χ 12.3230 + (200910_at) χ 21.4064 +(201892_s_at) χ (-10.5046) + (201947_s_at) χ 20.0446 +(201948_at) χ (-17.7163) + (208114_s_at) χ (-35.1981) +(2 08 699_x_at) χ (-13.8378) + (208722_s_at) χ (-11.2409) +(218593_at) x

(-15.2664) + (221494_x_at) χ 25.3464 + (222011_s_at) χ (-22.8465)

Equação para cálculo de probabilidade de baixo riscopara metástase à distância:

<formula>formula see original document page 84</formula>

η: escore logit; π\ probabilidade para baixo risco demetástase à distância

a:constante; β : coeficiente; X: intensidade normalizada

de cada conjunto de sonda._

Os números de identificação de conjunto de sondaAffymetrix em parênteses representam a intensidade deexpressão normalizada da transcrito de mRNA para osconjuntos de sonda indicados. 0 escore logit calculado apartir da equação listada foi usado para estimar aprobabilidade de baixo risco para metástase à distância.Uma probabilidade de > 0.5 foi relacionada como baixo riscopara metástase à distância. Uma probabilidade de <0.5 foirelacionada como alto risco.

Tabela 3. Características Clinicas de 138 Pacientes:<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>Tabela 5 Doze genes para predição de metástase à distânciapor regressão logística

<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table>

Genes mais realçados não estão presentes na lista daTabela 4.

Tabela 6 Concordância de resultados prognosticadosbaseados nos 52 e 12 genes

<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table>

*; "O" significa baixo risco para metástase à distância; **: "1"significa alto risco para metástase à distância,· ***: "9" significadiscordância entre dois métodos preditivos.

As revelações totais de todos os pedidos, patentes epublicações, aqui citados são aqui incorporados porreferência.

Os exemplos precedentes podem ser repetidos comsucesso similar pela substituição dos reagentes e/oucondições de operação genericamente ou especificamentedescritas desta invenção por aqueles usados nos exemplosprecedentes.

A partir da descrição precedente, um técnico noassunto pode facilmente determinar as característicasessenciais desta invenção, e, sem fugir do espírito eescopo da mesma, pode efetuar várias mudanças emodificações da invenção para adaptá-la a vários usos econdições.

Claims (18)

1. Método para avaliar o risco de metástase à distância,em pacientes apresentando carcinoma nasofaringeo,caracterizado pelo fato de que compreende avaliar o perfilde expressão de pelo menos um dos genes listados nasTabelas 4 e 5, em uma amostra obtida do referido paciente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende avaliar os perfis de expressãode dois ou mais dos 52 genes listados na Tabela 4.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende avaliar os perfis de expressãodos 52 genes listados na Tabela 4.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que a avaliação da expressão dos 52 geneslistados na Tabela 4 é realizada usando um modelo deregressão para cada um dos 9 grupos de genes mostrados naTabela 4.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que os escores logit são gerados para cada umdos 9 grupos de genes, usando as respectivas equaçõesmodelo de regressão da Tabela 1.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a regra preditiva para o risco demetástase à distância é gerada por um método declassificação de vizinhanças mais próximas de k, aplicadoaos referidos escores logit, para os referidos nove gruposde genes.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende avaliar os perfis de expressãode dois ou mais dos 12 genes listados na Tabela 5.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende avaliar os perfis de expressãodos 12 genes listados na Tabela 5.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a avaliação da expressão dos 12 geneslistados na Tabela 5 é realizada usando um modelo deregressão logístico.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que um escore logit é gerado, com base nosperfis de expressão dos referidos 12 genes, usando aequação modelo de regressão da Tabela 2 e o referido escorelogit é correlacionado com o risco de metástase àdistância.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a regra preditiva para baixo risco demetástase à distância é[probabilidade para baixo risco de metástase à distância] =(escore logit)-1 + e

12. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadoo pelo fato de que o risco de metástase à distânciaresultante da referida regra preditiva é comparado com orisco de metástase à distância de uma segunda regra- preditiva independente, a qual avalia o referido riscousando a equação[probabilidade para baixo risco de metástase à distância] =- (escore logit)-1 + eem que o escore logit é gerado usando a equação modelo deregressão da Tabela 2 e os perfis de expressão dos 12 geneslistados na Tabela 5.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que, quando o risco de metástase à distânciadeterminado de ambos os referidos métodos é alto ou baixo,o risco é classificado como alto ou baixo, respectivamente,e quando os referidos riscos determinados são diferentes, orisco é classificado como indeterminado.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido perfil de expressão é avaliadoem uma amostra de tumor de NPC.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido perfil de expressão é gerado apartir de transcritos de mRNA.

16. Microestrutura de ácido nucléico útil na determinaçãodo risco de metástase à distância, em pacientesapresentando carcinoma nasofaringeo, caracterizada pelofato de que consiste essencialmente de sondas para adeterminação dos perfis de expressão de (a) 52 geneslistados na Tabela 4, (b) 12 genes listados na Tabela 5 ou(c) ambos os referidos 52 e 12 genes.

17. Coleção em meio ou kit, caracterizado pelo fato de queconsiste essencialmente de todos os 52 genes listados naTabela 4 e/ou todos os 12 genes listados na Tabela 5; e/ouum subjogo dos referidos 52 genes ou dos referidos 12 genesou ambos os subjogos, em cada caso o referido subjogo sendoeficaz na predição do risco de metástase à distância, empacientes apresentando carcinoma nasofaringeo.

18. Método para avaliar o risco de metástase à distância,em pacientes apresentando carcinoma nasofaringeo,caracterizado pelo fato de que compreende, em uma amostrado paciente, avaliar o perfil de expressão dos 52 geneslistados na Tabela 4, utilizando uma regra preditiva geradapor um método de classificação de vizinhanças mais próximasde k, aplicado a um jogo de escores logit gerado para cadaum dos nove grupos de genes mostrados na Tabela 4, usandoas respectivas equações modelo de regressão da Tabela 1;avaliar o perfil de expressão dos 12 genes listados naTabela 5, utilizando a regra preditiva[probabilidade para baixo risco de metástase à distância] =<formula>formula see original document page 100</formula>em que o escore logit é gerado, com base nos perfis deexpressão dos referidos 12 genes, usando a equação modelode regressão da Tabela 2; e comparar os resultados de riscodas duas regras preditivas, de modo que, quando o risco demetástase à distância determinado de ambos os referidosmétodos é alto ou baixo, o risco é classificado como altoou baixo, respectivamente, e quando os referidos riscosdeterminados são diferentes, o risco é classificado comoindeterminado.