KR20080063343A - 비인강 암종에서의 예후 서브클래스의 확인을 위한 유전자발현 프로파일링 - Google Patents

비인강 암종에서의 예후 서브클래스의 확인을 위한 유전자발현 프로파일링 Download PDF

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앤드류 후앙
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차이나 신테틱 러버 코포레이션
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Abstract

mRNA 전사 프로파일링을 사용하여 원발성 NPC에 대한 원격 전이의 분자성 예측물을 제형할 수 있다. 예측된 결과는 짧은 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존과 고도로 관련된다. 예측은 52개의 유전자를 기초로 하는 예측물 및 12개의 유전자를 기초로 하는 예측물을 사용하여 이루어진다.
비인강 암종, 원격 전이, 유전자 발현 프로파일

Description

비인강 암종에서의 예후 서브클래스의 확인을 위한 유전자 발현 프로파일링{GENE EXPRESSION PROFILING FOR IDENTIFICATION OF PROGNOSTIC SUBCLASSES IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMAS}
일반적으로 본 발명은 비인강 암과 관련된 유전자의 발현 수준을 측정하여 이러한 암 환자에 대한 결과의 개별화된 예측 또는 평가를 가능하게 하는 것을 포함하는 비인강 암 상태 및 결과의 평가 및/또는 예측 방법에 관한 것이다.
서론
비인강 암종 (NPC: nasopharyngeal carcinoma)은 역학, 병리학, 임상 증상 및 치료에 대한 응답과 관련하여 상부 호흡소화관의 다른 악성 종양과 상이한 독특한 유형의 두경부 암이다.1, 2 NPC의 발달은 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)의 감염과 관련되는 것으로 생각된다.3, 4 이러한 유형의 암은 중국 북부, 대만 및 동남 아시아에서 풍토병이다 (1년에 100,000명 당 25-30명).5-8 이는 인접한 기관에 침윤할 수 있고, 인두뒤 및 경부 림프절을 침범할 수 있으며, 원위 부위로 전파될 수 있는 더욱 공격성인 두경부 암들 중 하나이다.9-11
지난 30년 동안의 방사선 요법의 진흥으로 NPC가 성공적으로 장기(長期) 제 어되었다.12-16 방사선 요법은 NPC 치료의 명백한 대들보이다. I기 및 II기 질환의 환자는 방사선 요법 단독으로의 치료율이 높다. 그럼에도 불구하고, NPC로 새롭게 진단된 환자의 70％ 초과는 III기 및 IV기 질환의 환자이다.14-17 이러한 환자들은 이들의 치료 결과를 개선시키기 위하여 추가적인 동반 화학요법을 필요로 한다.15, 16 또한, III기 및 IVa/b기 질환의 NPC 환자의 약 30％에서는 결국 원격 전이, 즉 NPC의 국소영역성 구역 외부로의 전이가 발달된다.14-17 모든 NPC 환자의 10 내지 20％에는 초기 진단 시점에 원격 전이 및 IVc기 질환이 있다.14-17 대부분의 환자는 원격 전이의 발달 후에 곧 질환으로 사망한다. 원격 전이는 III기 및 IV기 NPC 환자에서 국소영역성 재발의 부재 하에 종종 일어나고, 가장 중요한 예후 인자이다.
최근의 메타-분석은 진전된 병기의 NPC 환자에서의 개선된 생존이 원격 전이의 거의 확실한 예방 및 제어를 위한 동반된 전신 화학요법의 결과이었을 것임을 나타냈다.15, 16 70％를 초과하는 NPC 환자가 III기 및 IV기 질환을 나타내고, 이들 중 약 30％에서 원격 전이가 발달될 수 있다는 것을 고려하여,14-17 이러한 환자에서의 생존의 추가적인 개선이 초기 증상에서 원격 전이에 대한 위험이 높은 환자의 성공적인 확인에서 시작되어야 한다. 이같은 예측이 현실이 되었을 때, 현재 최적화된 치료가 적용될 수 있고, 그후 전체적인 생존을 개선시키기 위해 원격 전이의 더욱 효과적인 예방 및 제어를 위한 더욱 새로운 치료 양식을 테스트하도록 임상 실험이 디자인될 수 있다.
더욱 진전된 병기의 NPC에서 원격 전이의 위험이 증가하는 것으로 공지되었기 때문에14 -17, 원격 전이의 예방 및 장기 생존의 개선을 위한 방사선 요법 및 화학요법의 적절한 조합의 선택을 안내하도록 TNM 병기 결정이 사용되었다.15, 16, 31 예를 들어, T1N2M0 및 T2aN2M0 질환 환자를 제외환 AJCC III기 환자는 동반 화학-방사선 요법 (CCRT) + 2회 사이클의 시스플라틴 + 5-FU로의 보조 화학요법으로 <Koo Foundation SYS Cancer Center (Taipei, Taiwan)>에서 치료되었다.31 IVa/b기 환자는 CCRT에 이은 2회 사이클의 보조 화학요법, 및 6개월 동안의 5-FU 및 류코보린으로의 주1회 유지 화학요법으로 치료된다.31 상당수의 III기 질환 환자가 치료에 잘 응답하였고 생존이 우수하였지만 (도 6), 약 20％의 III기 환자에서 원격 전이가 발달되었고, 생존이 불량하였다. 초기 요법 3년 이내에 원격 전이가 발달된 III기 환자의 전체적인 생존 및 전이가 없는 생존은 IVa/b기 NPC 환자의 것과 중첩되었다 (도 6).
이러한 발견으로, 원격 전이가 발달될 위험이 있는 III기 환자가 신보조 화학요법, 더욱 새롭거나 더욱 강한 보조 화학요법 및/또는 유지 화학요법에 의해 더욱 공격적으로 치료되었어야 하는지 여부에 대한 의문이 제기되었다. 원격 전이가 발달될 위험이 있는 IVa/b기 NPC 환자에 대한 치료의 타당성에 또한 의문이 제기되었다 (도 6). 모든 이러한 발견들은 진단 시점에, 그리고 치료의 개시 전에 원격 전이가 발달될 위험이 있는 NPC 환자를 확인하는 것의 임상적 중요성을 분명히 나타냈다. 이같은 환자를 확인하고 원격 전이의 위험이 낮은 III기 및 IVa/b기 NPC 환자를 배제하는 능력이 더욱 효율적인 임상 실험을 수행하는데 중요하다.
기존에 보고된 바와 같이, 마이크로어레이(microarray) 분석법이 종양18 -22 및 이들의 임상 거동23 -30의 분류, 예컨대 다양한 유형의 악성 종양 환자에서의 원격 전이의 위험 및 전체적인 생존의 예측을 위한 분자 서명을 확인하는데 성공적으로 사용되었다. 기타 연구에 NPC가 수반된다.37-54
또한 미국 특허 출원 60/420,729 (2002년 10월 24일 출원); 미국 특허 출원 60/421,102 (2002년 10월 25일 출원); 미국 특허 출원 60/421,062 (2002년 10월 25일 출원); 미국 특허 출원 60/424,701 (2002년 11월 8일 출원); 미국 특허 출원 60/424,718 (2002년 11월 8일 출원); 미국 특허 출원 60/424,715 (2002년 11월 8일 출원); 미국 특허 출원 60/425,256 (2002년 11월 12일 출원); 미국 특허 출원 60/448,462 (2003년 2월 21일 출원); 미국 특허 출원 60/448,466 (2003년 2월 21일 출원); 미국 특허 출원 60/457,877 (2003년 3월 27일 출원); 미국 특허 출원 60/458,373 (2003년 3월 31일 출원); 미국 특허 출원 10/291,878 (2002년 11월 12일 출원); 미국 특허 출원 10/291,886 (2002년 11월 12일 출원); 국제 특허 출원 US02/38216 (2002년 11월 12일 출원); 및 국제 특허 출원 US02/38222 (2002년 11월 12일 출원); 미국 특허 출원 11/015,764 (2004년 12월 20일 출원); 미국 특허 출원 11/090,294 (2005년 3월 28일 출원) 및 미국 가특허 출원 60/665,652 (2005년 3월 25일 출원) 참조 (본원에서 사용된 방법론에 대한 상세사항에 대해 이들 모두의 전체적인 개시 내용이 거명에 의해 본원에 포함됨).
발명의 개요
본 발명은 NPC 환자에서의 원격 전이에 대한 게놈 서명을 확인한다. NPC 환자에서의 원격 전이에 대해 귀착되는 개선된 예측은 위험이 높은 개별적인 환자를 확인할 수 있도록 하고, 이들에 대해 원격 전이의 예방 및/또는 완화 및 장기 생존의 개선을 위해 적절한 요법 (예를 들어, 방사선 및/또는 화학요법)이 선택될 수 있다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 NPC 환자에서의 유전자 발현 수준을 상기 환자에서의 위험 인자 및 임상 결과와 상관시키는 방법을 포함한다.
따라서, 본 발명은 비인강 암종이 있는 환자로부터의 샘플 내의 하기 표 4 및 5에 열거된 유전자 중 1개 이상의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는, 비인강 암종이 있는 환자에서 원격 전이의 위험을 평가하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본질적으로 모든, 그리고 특히 모든 표 4의 52개의 유전자 및/또는 본질적으로 모든, 그리고 특히 모든 표 5의 12개의 유전자가, 예를 들어, 환자 샘플, 바람직하게는 NPC 조직 샘플에서 발현 수준에 대해 평가된다. 따라서, 확률 분석에 대해 평가된 유전자의 개수가 질환 결과 (예를 들어, 원격 전이)와 상관되는 한 표 4 또는 5의 유전자들 중 2개 이상이 평가될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 12개 유전자 셋트에 대해, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 이상의 유전자가 사용될 수 있다. 이같은 유전자 개수, 또는 12개 이상... 15개 이상... 20개 이상... 25개 이상... 30개 이 상... 35개 이상... 40개 이상... 45개 이상... 50개 이상... 51개 이상, 뿐만 아니라 여기서 명확하게 언급되지 않은, 또다른 포함되는 유전자의 개수가 52개 유전자 셋트와 관련하여 또한 사용될 수 있다. 각각의 셋트에 대한 이러한 유전자 개수는 하기 논의된 조합 방법에서 또한 사용될 수 있다. 물론, 최적의 결과를 위해, 모든 또는 본질적으로 모든 유전자가 일반적으로 사용될 것이다. 따라서, 또다른 양상에서, 상기 방법에서 사용된 유전자는 본원에서 열거된 것들 중 1개 이상이다.
또한 본 발명은 원격 전이와 관련된 모든 이같은 유전자 또는 이의 부분집합의 예를 들어 매체 또는 키트 등 내의 수집물에 관한 것이고; 본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 관련된 방법, 매체 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양상에 따라, 분석된 환자 검사물은 임의의 조직 예컨대 혈액, 종양 또는 세포 등일 수 있다. 바람직하게는, 검사물은 NPC 종양으로부터의 것이다. 분석할 검사물을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 NPC 환자에서의 원격 전이의 평가 또는 예측에 관련된 유전자의 수집물을 제공한다. 이같은 유전자는 1가지 이상의 이같은 암의 표현형과 상관되는 발현 패턴 (즉, 수준 발현 또는 이의 결여)을 갖는다. 추가적인 유전자가 NPC에 또한 수반될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명을 위해, 임상 데이타가 잘 문서화된 NPC 환자로부터의 저장된 생검 검사물에 대해 유전자 발현 프로파일링 연구가 수행되었다. 연구된 모든 생검 샘플은 액체 질소에 저장되었다. 전체 RNA의 현저한 분해가 없는 샘플만을 연구하였 다. 작동자와 관련된 변이를 최소화하기 위해, 2명의 고도로 훈련된 기술자만이 종양 샘플의 프로세싱 및 마이크로어레이 데이타의 수집에 수반되었다. 이들은 원격 전이의 위험이 높거나 낮은 환자로부터의 유사한 개수의 검사물을 무작위로 취급하였다. 양쪽 기술자에 의해 수행 및 수집된 마이크로어레이 데이타의 통계 분석은 어떠한 통계적 편향도 나타내지 않았다 (도 7). 또한 연구 전반에 걸쳐 동일한 유체공학 스테이션 및 동일한 스캐너를 사용하였다.
칩 제작, 샘플 프로세싱, cRNA의 로딩(loading) 용량 및 칩 프로세싱과 관련된 변이를 추가로 최소화하기 위해, 각각의 마이크로어레이의 유전자 발현 강도 데이타를 Affymetrix MAS 5.0 소프트웨어를 사용하여 500의 절사 평균으로 표준화시킨 후, 본 발명가들의 실험실에서 기존에 수립된 NPC 참조 표준에 따른 각각의 프로브 셋트의 발현 강도의 분위수 표준화가 이어졌다. 실시예 I 참조. 이같은 표준화 접근법의 유효성이 6개의 무작위로 선택된 NPC 검사물에 대한 반복된 측정의 GeneChip 결과의 비교에 의해 입증되었다. 결과는 프로브 셋트 수준에서의 분위수 표준화 절차가 실험적 변이를 정정하는데 실제로 효과적이었음을 나타냈다 (도 8).
고도의 감독 하의 분석이 수행되었다. 앞서 논의된 바와 같이, 초기 치료 후 3년 내에 원격 전이가 발달되지 않은 대부분의 NPC 환자는 장기 생존이 양호하였고, 생존 결과가 불량한 NPC 환자에서는 최초 치료 후 3년 이내에 일반적으로 원격 전이가 발달되었다. 질환의 상반되는 말단에서의 이러한 두 군의 임상적으로 잘 규명된 환자로부터의 생검 검사물을 분석에서 사용하여, 원격 전이의 예측을 위한 더욱 신뢰성이 높은 분자 서명을 확인하였다. 신뢰성이 높은 분자 예측물을 발 견하기 위해 이같은 접근법을 취하는 것의 이점이 최근에 보고되었다.35
동시에, 오버핏팅(overfitting)은 [Simon et al.]에 의해 명료하게 표현된 바와 같이 고차원 측정치를 갖는 제한된 숫자의 환자로부터 클래스 예측물을 발견하는데 심각한 함정이다. 오버핏팅 문제를 극복하기 위해, 평가를 위한 사례의 진실로 독립적인 테스트 셋트가 포함되었고, 가능한 한 많은 환자가 연구에 포함되었다. 138명의 적격 환자가 포함되었다. 또한, 확인 목적을 위해 연구의 매우 초기에 저위험군 및 고위험군으로부터의 환자의 1/3을 독립적인 테스트 셋트에 무작위로 할당하였다. 중요한 임상 변수, 예컨대 연령, 성, 종양 병기, 추적 기간을 무작위에 고려하였다. 모든 테스트 셋트 사례는 훈련 프로세스 동안 예측물 유전자의 선택 및 예측 규칙의 수립에 수반되지 않았다. 테스트 셋트에 대한 본 발명의 결과는 민감도, 특이성 및 전체적인 정확성이 문헌에서 다른 유형의 고형 종양에 대해 보고된 것에 필적하거나 이보다 양호하였음을 나타냈다.23, 24, 27-30
생육가능한 종양 세포 및 주위의 림프계/염증성/기질 세포의 양은 여러 환자의 생검 검사물 간에 현저하게 다양할 수 있다 (생물학적 이질성). 그러나, 이용가능한 생검 조직의 매우 제한된 양 및 RNA의 불안정성으로 인해, 유전자 발현 프로파일링에 사용된 생검 검사물의 조직학적 검사는 수행되지 않았다. 또한, 진단 및 GeneChip 연구를 위한 생검 부위가 동일하지 않았기 때문에, 진단용 생검 검사물의 조직학은 예측된 결과의 정확성과 상관되지 않았다. 생검 검사물의 이질성과 관련된 잡음이 예측 정확성을 한정할 수 있었다.
2개의 바람직한 예측 규칙이 본 발명에 의해 생성된다. 실시예 IV 및 V 참조. 1개는 52개 유전자의 서명 및 k-NN 분류 방법을 기초로 하고, 다른 1개는 12개의 유전자 및 로지스틱 회귀를 기초로 한다.
한 셋트에서, 9개의 상이한 SOM 클러스터로부터의 52개의 유전자가 예측에 사용된다. 이들은 표 4에 요약된다. 이러한 52개의 유전자들 중에는, NIAID-DAVID 툴 (http://apps1.niaid.nih.gov/david/)에 따르면 신호 전달 (n=9), mRNA 프로세싱 (n=7), 전사 조절 (n=3), 단백질 합성 (n=4), 뉴클레오티드 대사 (n=4), 지질 대사 (n=3), 단백질 폴딩(folding) (n=3), 세포질분열 (n=2), 핵 수송 (n=2), 단백질 이화 (n=2), 항-세포자멸사 (n=1), ATP 합성 (n=1), 세포 주기 (n=1), 면역 응답 (n=1), 세포내 단백질 수송 (n=1) 및 아미노산 수송 (n=1)에 수반되는 구성원들이 있다. 나머지 7개 유전자의 기능은 미지(未知)였다.
고위험 군에서 52개의 유전자 중 22개는 발현이 감소되었고, 30개는 발현이 증가되었다. 고위험군과 저위험군 사이의 예측물 유전자의 발현 강도를 비교했을 때, mRNA 프로세싱, 핵 수송, 뉴클레오티드 대사, 및 단백질 폴딩에 수반되는 거의 모든 유전자의 평균 발현이 예측된 고위험군에서 더 컸다는 것을 주지할 수 있었다. 반면에, 전사 조절 및 단백질 이화에 수반되는 모든 유전자의 발현은 원격 전이에 대한 위험이 높은 것으로 예측된 군에서 감소되었다.
12개의 유전자를 기초로 하는 예측 방법에 대해, 6개의 유전자는 k-NN 방법에 의한 예측에 사용된 52개의 유전자 내에 또한 존재하였다. 나머지 6개는 Affymterix 프로브 셋트 ID에 따른 52개의 유전자의 목록에 존재하지 않았다. 이 러한 12개의 유전자가 표 5에 요약된다. 이러한 12개의 유전자 중에서, 3개의 유전자는 단백질 폴딩에, 2개의 유전자는 단백질 합성에, 2개의 유전자는 리보솜 생체발생에, 2개의 유전자는 뉴클레오티드 대사에, 그리고 1개의 유전자 각각은 mRNA 프로세싱 및 단백질 이화에 수반되었다. 마지막 유전자 (가상 단백질 FLJ12671)는 핵소체 엑소뉴클레아제 모티프를 갖는 것으로 공지되었고, 이의 정확한 기능은 미지였다. 모든 12개의 유전자의 기능은 52개 유전자의 셋트에서의 것들과 현저한 중첩을 나타냈다. 52개의 유전자 중 어떠한 것에도 포함되지 않은 6개의 유전자 중 하나 (비-POU 도메인 함유 단백질)가 52개의 유전자 내의 상이한 프로브 셋트 ID에 의해 표시되는 유전자와 실제로 동일하였다는 것이 주지되었다. 이러한 유전자는 mRNA 프로세싱에 수반된다. 12개의 유전자 셋트 내의 3개의 유전자는 종양 세포의 증식에서 연루된 동일한 샤페로닌 함유 t-복합체 1 (TCP-1)의 알파, 베타 및 감마 서브유닛이다.34 서브유닛 알파 및 감마에 대한 유전자는 12개- 및 52개- 유전자 셋트 모두에 존재하였다. 서브유닛 베타에 대한 유전자는 12개-유전자 셋트에만 존재하였다. 모든 이러한 발견은 이러한 두 셋트의 예측물 유전자들 간의 고도의 정합성을 나타냈다.
예측 규칙의 사용 결과는 52개-유전자 예측 방법이 12개-유전자 예측 방법보다 거짓 양성 비율이 더 낮았음을 나타낸다 (14％ 대 28％). 반면에, 52개-유전자 예측 방법은 거짓 음성 비율이 12개-유전자 예측 방법보다 더 높았다 (31％ 대 15％). 예측 방법을 사용하여 임상 실험을 위한 원격 전이의 위험이 높은 환자를 선 택하는 경우, 저위험 환자의 안전 및 고위험 환자의 권리가 보호되도록 거짓 양성 및 거짓 음성 비율이 최소로 감소될 것이다.
예를 들어, 예측을 위한 2가지 방법이 한 방법으로 조합될 수 있다. 2가지 방법 간의 부합 결과만이 허용된다. 비부합 결과는 불확정으로 간주된다 (n=8). 실시예 VI 참조. 이같은 접근법을 취함으로써, 거짓 양성 비율이 10％로 감소되었다. 거짓 음성 비율은 약 15％였다. 불확정 사례가 독립적인 테스트 셋트 내의 모든 환자의 19％ (8/42)를 차지하였지만, 오직 2명의 임상적으로 위험이 높은 환자만이 분자성 예측물의 조합 사용에 의해 불확정 카테고리에 할당되었다. 이러한 방식으로, 임상적으로 위험이 높은 환자의 15％ (2/13)를 배제하는 것을 희생하여 양호한 위험의 환자를 고위험 환자를 위한 실험에 거짓으로 포함시키는 기회가 효과적으로 최소화될 수 있다. 다른 15％의 임상적으로 위험이 높은 환자가 부정확하게 저위험으로 예측될 것이다 (표 6). 그럼에도 불구하고, 적어도 70％의 모든 고위험 환자가 정확하게 확인될 것이고, 고위험 환자에 대해 디자인된 실험에 포함될 수 있다.
따라서, 원격 전이가 발달될 위험이 높거나 낮은 NPC 환자를 예측하도록 52개-유전자 및 12개-유전자의 신뢰성이 높은 분자 서명이 확인되었다. 예측은 42개의 독립적인 테스트 셋트 사례로 확인되었다. 독립적인 테스트 셋트에 의해 평가된 전체적인 정확성은 52개-유전자 서명, 12개-유전자 서명 및 조합 서명에 대해 각각 81％, 76％ 및 85％였다. 이러한 결과들은 확인을 위해 독립적인 테스트 셋 트를 또한 사용한 최근에 발표된 예측 연구에 필적한다.28-30 신보조 화학요법에 대한 유방암 응답의 예측에 대해 78％의 정확성이 보고되었고28, 두경부 편평세포 암종에 의한 림프절 전이의 예측에 대해 86％의 정확성이 보고되었다.30 분자 서명은 원격 전이의 예방, 완화 및 제어, 및 장기 생존의 추가적인 개선을 위해 NPC 환자에서 새로운 신보조, 보조, 유지 화학요법 및/또는 표적화-요법을 안내하는데 유용할 것이다. 원격 전이에 대한 위험이 낮거나 높은 NPC 환자의 확인의 확인은 과잉- 및 과소-치료의 비율을 또한 감소시킬 것이다.
본 발명의 NPC 전이 관련 유전자의 수집물은 물질적 또는 가상일 수 있다. 물질적 수집물은 NPC 암 관련 유전자가 집단 내에 제시되는, 즉 서열이 수집물 내의 NPC 암 관련 유전자의 게놈 서열, 또는 더욱 전형적으로는 코딩 서열에 상응하는 핵산 분자가 집단 내에 존재하는, 상이한 핵산 분자들의 집단을 포함하는 수집물이다. 다수의 실시양태에서, 핵산 분자는 이들이 상응하는 유전자의 센스 가닥과 서열이 실질적으로 동일 또는 동일하거나, 또는 이들이 상응하는 센스 가닥에, 전형적으로는 엄격한 조건 하에 이들이 이들의 상응하는 센스 가닥에 혼성화되도록 하는 정도로, 상보적이다. 혼성화 조건 (즉, 낮은 엄격도, 중간 정도의 엄격도, 또는 높은 엄격도)을 결정하는 것은 당업자의 지식 내이다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 50℃ 이상 및 0.1×SSC (15 mM 염화나트륨/1.5 mM 시트르산나트륨)에서의 혼성화이다. 엄격한 혼성화 조건의 또다른 예는 50％ 포름아미드, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10 ％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎎/㎖ 변성 전단 연어 정자 DNA의 용액에서 42℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 필터를 0.1×SSC에서 약 65℃에서 세정하는 것이다. 엄격한 혼성화 조건은 적어도 상기의 대표적인 조건만큼 엄격한 혼성화 조건이고, 이때 조건은 상기의 구체적인 엄격한 조건의 적어도 약 80％만큼, 전형적으로 적어도 약 90％만큼 엄격하다면 적어도 엄격한 것으로 간주된다. 기타 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 이러한 특정 실시양태의 핵산을 확인하는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 물질적 수집물을 구성하는 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 또한, 물질적 수집물을 구성하는 핵산은 선형 또는 원형일 수 있고, 개별적인 핵산 분자는, NPC 암 관련 유전자에 더하여, 기타 서열, 예를 들어, 벡터 서열을 포함할 수 있다. 다양한 상이한 핵산이 본 발명의 물질적 수집물, 예를 들어, 라이브러리, 예컨대 벡터 라이브러리를 구성할 수 있고, 이때 상이한 유형의 핵산의 예로는 DNA, 예를 들어, cDNA 등, RNA, 예를 들어, mRNA, cRNA 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 물질적 수집물의 핵산은 용액 내에 존재하거나, 어레이 실시양태에서 발견되는 바와 같이 고체 지지체, 예컨대 기판에 고정, 즉 부착될 수 있고, 이같은 다양한 실시양태들의 추가적인 기술이 하기에 제공된다.
본 발명의 NPC 관련 유전자의 가상 수집물이 또한 제공된다. 가상 수집물은 수집물의 유전자의 서열 정보를 포함하는 1가지 이상의 데이타 파일 또는 기타 컴퓨터 판독가능 데이타 조직 요소를 의미하고, 이때 서열 정보는 게놈 서열 정보일 수 있지만, 전형적으로는 코딩 서열 정보이다. 가상 수집물은 임의의 편리한 컴퓨 터 또는 프로세서 판독가능 저장 매체 상에 기록될 수 있다. 수집물 데이타가 저장되는 컴퓨터 또는 프로세서 판독가능 저장 매체는 CD, DAT, 플로피 디스크, RAM, ROM 등이 포함되는 임의의 편리한 매체일 수 있고, 이러한 매체는 장치의 하드웨어 성분에 의해 판독될 수 있다.
NPC 관련 유전자의 발현 프로파일의 데이타베이스가 또한 제공된다. 이같은 데이타베이스는 전형적으로 NPC 관련 표현형, 예컨대 다양한 병기의 NPC를 갖는 다양한 세포/조직의 발현 프로파일, 음성 발현 프로파일, 예후 프로파일 등을 포함할 것이고, 이같은 프로파일은 하기에 추가로 기술된다.
발현 프로파일 및 이의 데이타베이스는 이들의 사용을 용이하게 하도록 다양한 매체에서 제공될 수 있다. "매체"는 본 발명의 발현 프로파일 정보를 함유하는 제품을 지칭한다. 본 발명의 데이타베이스는 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들어 컴퓨터가 직접적으로 판독 및 액세스할 수 있는 임의의 매체 상에 기록될 수 있다. 이같은 매체에는 자기 저장 매체, 예컨대 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체, 및 자기 테이프; 광학 저장 매체 예컨대 CD-ROM; 전자 저장 매체 예컨대 RAM 및 ROM; 및 이러한 카테고리의 하이브리드 예컨대 자기/광학 저장 매체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 어떻게 임의의 현재 공지된 컴퓨터 판독가능 매체가 본 발명의 데이타베이스 정보의 기록을 포함하는 제품을 생성시키는데 사용될 수 있는지를 쉽게 이해할 수 있다. "기록된"은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 방법을 사용하여 컴퓨터 판독가능 매체 상에 정보를 저장하는 프로세스를 지칭한다. 저장된 정보에 액세스하는데 사용된 수단을 기초로 임의의 편리한 데이타 저 장 구조가 선택될 수 있다. 다양한 데이타 프로세서 프로그램 및 포맷, 예를 들어 워드 프로세싱 텍스트 파일, 데이타베이스 포맷 등이 저장에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "컴퓨터-기재 시스템"은 본 발명의 정보를 분석하는데 사용된 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단, 및 데이타 저장 수단을 지칭한다. 본 발명의 컴퓨터-기재 시스템의 최소 하드웨어는 중앙 처리 장치 (CPU: central processing unit), 입력 수단, 출력 수단, 및 데이타 저장 수단을 포함한다. 당업자는 현재 이용가능한 컴퓨터-기재 시스템 중 임의의 하나가 본 발명에서 사용하기에 적절하다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. 데이타 저장 수단은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 정보의 기록을 포함하는 임의의 제품, 또는 이같은 제품에 액세스할 수 있는 메모리 액세스 수단을 포함할 수 있다.
입력 및 출력 수단을 위한 다양한 구조적 포맷이 본 발명의 컴퓨터-기재 시스템에 정보를 입력 및 출력시키는데 사용될 수 있다. 출력 수단을 위한 한 포맷은 참조 발현 프로파일에 대한 유사성 정도가 다양한 발현 프로파일의 순위를 매긴다. 이같은 제시는 당업자에게 유사성의 순위를 제공하고, 테스트 발현 프로파일에 함유된 유사성의 정도를 확인시킨다.
유전자 발현 프로파일은 단일 시점에 측정될 수 있거나, 또는 장기간에 걸쳐 여러 시점을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 당업계에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소/중합효소 PCR) 또는 유전자 발현에 관한 정량적 정보를 제공할 수 있는, 미래에 고안될 방법에 의해 결정될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 유전자 발현 수준은 유전자 발현 산물 예컨대 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA)를 정량함으로써 결정된다. 핵산의 정량은 핵산을 직접 정량함으로써 또는 상응하는 조절 유전자 또는 조절 서열 요소를 정량함으로써 수행될 수 있다. 추가적으로, 유전자의 변이체 예컨대 스플라이스 변이체 및 다형성 변이체를 정량할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 유전자 발현은 mRNA로부터 번역된 단백질 또는 폴리펩티드의 수준을 정량함으로써 측정된다. 샘플 내의 단백질 또는 폴리펩티드의 수준을 측정하고 이같은 데이타를 발현 수준과 상관시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 당업계에 공지된 방법에 의해 수득하여, 샘플 또는 검사물 내의 단백질 또는 폴리펩티드를 검출 및/또는 측정하는데 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 유전자 발현은 샘플 또는 검사물 내의 mRNA의 수준을 정량함으로써 측정된다. 이는 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, mRNA를 당해 유전자에 대해 특이적인 핵산 프로브가 고정된 적절한 마이크로어레이와 접촉시키고, 마이크로어레이 상의 프로브에 대한 샘플 내의 mRNA의 혼성화 정도를 결정한다. 이같은 마이크로어레이 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조 방법의 예가, 예를 들어, WO 95/11995에 기술되어 있다. 기타 방법이 당업계에 쉽게 공지되어 있다.
측정 또는 평가된 유전자 발현 값은 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 기구로부터 수득된 숫자 값이다. 값은 기구로부터의 원 값, 또는 바람직하게 재조 정, 필터링 및/또는 표준화된 값이다. 예를 들어, 실시예 I 참조. 특정한 엄격성 조건에 적용된 샘플로부터의 핵산 (예를 들어, mRNA)이 칩 상의 프로브에 혼성화된다. 분석될 핵산 (예를 들어, 표적)은 어레이에의 혼성화 전에 단리되고, 증폭되고, 검출가능한 표지 (예를 들어, 32P 또는 형광 표지)로 표지된다. 혼성화 후, 어레이가 혼성화 패턴을 검출할 수 있는 스캐너 내로 삽입된다. 이러한 패턴은 이제 마이크로어레이에 부착된 표지된 표적을 검출함으로써 검출되고, 예를 들어, 표적이 형광 표지된 경우, 혼성화 데이타는 표지된 기로부터 방출되는 빛으로서 수집된다. 표지된 표적이, 당업자에게 공지된 적절한 엄격성 조건 하에, 마이크로어레이 내에 함유된 상보적인 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하기 때문에, 그리고 어레이 내의 각각의 올리고뉴클레오티드의 서열 및 위치가 공지되어 있기 때문에, 프로브에 적용된 표적 핵산의 신원이 결정된다.
본 발명은 본 발명의 유전자 발현 프로파일을 모니터링함으로써 개체에서의 치료 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 개체에 대한 기준선 유전자 발현 프로파일을 결정할 수 있고, 반복된 유전자 발현 프로파일을 치료 기간 동안의 시점들에 결정할 수 있다. 불량한 치료 결과와 상관된 프로파일에서 개선된 치료 결과와 상관된 프로파일로의 유전자 발현 프로파일 이동은 효과적인 치료 요법의 증거인 반면, 불량한 치료 결과와 상관된 반복된 프로파일은 비효과적인 치료 요법의 증거이다.
본 발명의 진단 용도에서, 세포 또는 이의 수집물, 예를 들어, 조직, 뿐만 아니라 세포/조직을 포함하는 동물 (대상, 숙주 등, 예를 들어, 포유동물, 예컨대 애완동물, 가축, 및 인간 등)을 분석하여, NPC 전이의 존재 및/또는 발달 확률을 결정한다. 따라서, 진단 방법은 이같은 표현형의 존재를 결정하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표현형의 존재뿐만 아니라 중증도 또는 병기가 또한 결정된다. 또한, 진단 방법은 이같은 암 표현형이 존재하지 않지만 발생하기 쉽다는 결정이 이루어지도록, 이같은 암 표현형이 발달될 경향을 결정하는 방법을 또한 포함한다. 본 발명의 진단 및 기타 방법의 실행에서, 세포, 조직 또는 진단될 대상으로부터 수득 또는 유래된 핵산 샘플을 분석하여 발현 프로파일을 생성시킨 후, 본 발명의 방법을 수행한다.
상기 지시된 바와 같이, 진단 방법에서 사용된 발현 프로파일을 생성시키도록 분석되는 샘플은 핵산 샘플인 것이다. 핵산 샘플은 진단될 세포 또는 조직의 당해 NPC 관련 유전자의 발현 정보를 포함하는 다수의 상이한 핵산 또는 이의 집단을 포함한다. 핵산은, 샘플이 수득된 숙주 세포 또는 조직의 발현 정보를 샘플이 유지하는 한, RNA 또는 DNA 핵산, 예를 들어, mRNA, cRNA, cDNA 등을 포함할 수 있다. 샘플은 당업계에 공지된 바와 같은 다수의 상이한 방식으로, 예를 들어, 세포로부터의 mRNA 단리에 의해 제조될 수 있고, 이때 단리된 mRNA는, 차별 발현 업계에 공지된 바와 같이, 그대로 사용되거나, 증폭되거나, cDNA, cRNA 등을 제조하는데 사용된다. 전형적으로 샘플은 진단될 대상으로부터 수확된 세포 또는 조직으로부터, 예를 들어, 조직의 생검을 통해, 표준 프로토콜을 사용하여 제조되고, 이때 이같은 핵산이 생성될 수 있는 세포 유형 또는 조직에는 단핵구, 내피, 및/또는 평 활근이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 결정될 NPC 표현형의 발현 패턴이 존재하는 임의의 조직이 포함된다.
발현 프로파일은 초기 핵산 샘플로부터 임의 편리한 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 발현 프로파일을 생성시키는 다양한 상이한 방식, 예컨대 차별 유전자 발현 분석 분야에서 사용되는 것들이 공지되어 있지만, 발현 프로파일의 생성을 위한 한가지 대표적이고 편리한 유형의 프로토콜은 어레이를 기초로 하는 유전자 발현 프로파일 생성 프로토콜이다. 이같은 응용은 생성될 프로파일에서 분석/프로파일링될 각각의 유전자에 대한 "프로브" 핵산을 나타내는 핵산이 사용되는 혼성화 분석법이다. 이러한 분석법에서, 분석될 초기 핵산 샘플로부터 표적 핵산의 샘플을 먼저 제조하고, 이때 제조는 표적 핵산을 표지, 예를 들어, 신호 생산 시스템의 구성원으로 표지시키는 것을 포함할 수 있다. 표적 핵산 샘플 제조에 이어서, 샘플이 혼성화 조건 하에 어레이와 접촉됨으로써, 어레이 표면에 부착된 프로브 서열에 상보적인 표적 핵산 간에 복합체가 형성된다. 그후, 혼성화된 복합체의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 검출한다. 본 방법에서 사용된 발현 프로파일을 생성시키는데 실행될 수 있는 특이적 혼성화 기술에는 미국 특허 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,800,992 (이들의 개시 내용은 거명에 의해 본원에 포함됨); 뿐만 아니라 WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; 및 EP 785 280에 기술된 기술이 포함된다. 이러한 방법들에서, 발현이 분석될 각각의 NPC 관련 유전자에 대한 프로브를 포함하는 "프로 브" 핵산의 어레이가 상기 기술된 바와 같은 표적 핵산과 접촉된다. 혼성화 조건, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건 하에 접촉이 수행된 후, 결합되지 않은 핵산이 제거된다. 혼성화된 핵산의 생성된 패턴은 프로빙된 각각의 유전자에 대한 발현에 관한 정보를 제공하고, 이때 발현 정보는 유전자가 발현되었는지 여부의 관점이고, 전형적으로 어떤 수준인지이며, 이때 발현 데이타, 즉 발현 프로파일은 정성적 및 정량적 모두일 수 있다.
다수의 실시양태에서, 분석될 세포/조직에 관한 상기 수득된 정보를 사용하여, 경과 및 결과를 예측하기 위해 이미 발달된 곳의 존재, 상태 또는 경향에 관하여 숙주, 대상 또는 환자를 진단한다. 예를 들어, 분석되는 세포/조직이 NPC 전이 표현형을 갖는 것으로 결정된 경우, 정보를 사용하여 세포/조직이 수득된 대상을 암 재발 확률이 있는 것으로 진단할 수 있다.
특정 치료의 유효성을 모니터링하는 것에 더하여, 본 발명은 잠재적인 약물 후보물을 NPC 전이 가능성의 치료에서의 이의 효능에 대해 스크리닝하는데 적용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 샘플의 발현 프로파일을 후보 약물로의 처리 전후에 비교하고, 이때 불량한 치료 결과와 상관된 프로파일에서 개선된 치료 결과와 상관된 프로파일로의 치료된 샘플에서의 유전자 발현 프로파일에서의 이동은 약물의 효능에 대한 증거이다. 이같은 분석법은 시험관내에서 또는 동물 모델에서 편리한 절차를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 NPC 관련 유전자의 수집물의 또다른 용도는 제공된 치료 프로토콜의 모니터링 또는 평가이다. 이같은 방법에서, 치료가 진행되고 있는 환자의 세포 /조직 샘플을 본원에 기술된 절차를 사용하여 모니터링하고, 이때 수득된 발현 프로파일(들)을 1가지 이상의 참조 프로파일과 비교하여 제공된 치료 프로토콜이 치료될 질환에 대해 원하는 효과를 갖는지 여부를 결정한다. 예를 들어, 주기적인 발현 프로파일을 치료 동안 환자로부터 수득하여, 다양한 NPC 전이 병기의 발현 프로파일 및 정상적인 발현 프로파일을 포함하는 일련의 참조/대조군과 비교한다. 정상적인 프로파일을 향하는 모니터링된 발현 프로파일에서의 관찰된 결과는 제공된 치료 프로토콜이 원하는 방식으로 작동되고 있음을 가리킨다.
치료제 스크리닝 용도
본 발명은 NPC 전이 표현형을 조정하는, 예를 들어, 이를 증강시키거나 감소시키는 능력을 갖는 작용제를 확인하는 방법을 또한 포함하고, 이는 치료제의 확인에서 용도가 발견된다.
이같은 표현형을 조정하는 화합물의 확인은 다양한 약물 스크리닝 기술 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 스크리닝 분석법은 NPC 전이 표현형 결정적 유전자의 발현 프로파일을 조정하는 작용제의 능력을 일반적으로 기초로 한다.
본원에서 사용된 용어 "작용제"는 차별적으로 발현된 유전자 산물의 생물학적 활성을 조정하는 능력을 갖는 임의의 분자, 예를 들어, 단백질, 소형 분자 또는 기타 제약을 기술한다. 일반적으로, 다수의 분석 혼합물이 상이한 작용제 농도로 병행 실행되어, 다양한 농도에 대한 상이한 응답이 수득된다. 전형적으로, 이러한 농도 중 하나가 음성 대조군으로, 즉 0 농도에서 또는 검출 수준 미만에서 작용한 다.
후보 작용제는 수많은 화학물질 부류를 포함하지만, 전형적으로 이는 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 50 달톤 초과, 약 2,500 달톤 미만인 소형 유기 화합물이다. 후보 작용제는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 관능기를 종종 포함하고, 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실 기를 종종 포함하며, 바람직하게는 2개 이상의 화학 관능기를 포함한다. 후보 작용제는 1개 이상의 상기 관능기로 치환된 고리형 탄소 또는 헤테로고리형 구조 및/또는 방향족 또는 다중방향족 구조를 종종 포함한다. 또한 후보 작용제는 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합물이 포함되지만 이에 한정되지 않는 생체분자 중에서 발견된다.
후보 작용제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 공급원으로부터 수득된다. 예를 들어, 무작위화된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하여, 수많은 수단이 광범위한 유기 화합물 및 생체 분자의 무작위 및 지정 합성에 이용가능하다. 별법적으로, 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 추출물 (차별적으로 발현된 유전자 산물에 영향을 미치는 내인성 인자를 확인하기 위한 인간 조직으로부터의 추출물 포함) 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 입수가능하거나 또는 쉽게 생산된다. 추가적으로, 천연 또는 합성 생산된 라이브러리 및 화합물이 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 작용제가 지정 또는 무작위 화학 변형, 예컨대 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등에 적용되 어 구조적 유사체가 생산될 수 있다.
특히 흥미로운 대표적인 후보 작용제에는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 및 항체, 가용성 수용체 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 차별적으로 발현된 표적 유전자 산물(들)이 분비되거나 세포 표면에서 접근가능한 경우 (예를 들어, 외부 세포막과 안정적으로 회합된 수용체 및 기타 분자), 항체 및 가용성 수용체가 후보 작용제로서 특히 흥미롭다.
스크리닝 분석법은 당업자가 쉽게 이용가능하고 당업자에게 공지된 다양한 기술들 중 임의의 것을 기초로 할 수 있다. 일반적으로, 스크리닝 분석법은 NPC 전이 표현형을 갖는 것으로 공지된 세포 또는 조직을 후보 작용제와 접촉시키고, 표현형 결정적 유전자로 구성된 유전자 발현 프로파일에 대한 효과를 평가하는 것을 수반한다. 효과는 임의의 편리한 프로토콜을 사용하여 검출할 수 있고, 다수의 실시양태에서, 상기 기술된 진단 프로토콜이 사용된다. 일반적으로, 이같은 분석법은 시험관 내에서 수행되지만, 다수의 분석법이, 예를 들어, 암의 동물 모델에서, 생체내 분석을 위해 개조될 수 있다.
약물 표적에 대한 스크리닝
또다른 실시양태에서, 치료 표적으로서 본원의 목록으로부터 유전자 및 이의 산물을 확인하는 것이 본 발명에서 구현된다. 어느 면에서, 이는 NPC 전이 표현형을 조정하는 (예를 들어, 감소시키거나 증가시키는) 활성을 갖는 작용제의 확인을 위한 상기 기술된 분석법의 역(逆)이고, 특히 표현형 결정적인 유전자, 또는 이의 발현 산물을 치료 표적으로서 확인하는 것에 대해 지시된다.
이러한 실시양태에서, 치료 표적은 NPC 표현형을 조정하는 (예를 들어, 이같은 표현형을 억제 또는 저해하는) 것으로 나타날 수 있거나 나타난 작용제의 효과(들)을 시험함으로써 확인된다. 예를 들어, 작용제는 선택된 유전자 전사물에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본원의 표에 나타난 유전자의 서열에 상응하는 서열을 가질 수 있다.
치료 표적을 확인하기 위한 분석법은 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 후보 유전자, 예를 들어, 본원의 표에서 발견되는 유전자를 발현 또는 과발현하는 테스트 세포가 공지된 NPC 작용제와 접촉되고, NPC 표현형 및 후보 유전자 산물의 생물학적 활성에 대한 효과가 평가된다. 후보 유전자 산물의 생물학적 활성은, 예를 들어, 후보 유전자 산물을 코딩하는 유전자의 발현의 조정 (예를 들어, 전사물 수준 또는 폴리펩티드 수준에서의 증가 또는 감소에 의해 검출됨), 또는 유전자 산물의 효소적 또는 기타 활성의 조정을 시험함으로써 분석될 수 있다.
NPC 전이 표현형의 억제 또는 저해는 후보 유전자 산물이 치료에 적절한 표적이라는 것을 가리킨다. 본원에 기술되고/되거나 당업계에 공지된 분석법이 치료 표적의 확인을 위한 분석법을 위해 쉽게 개조될 수 있다. 일반적으로, 이같은 분석법은 시험관 내에서 수행되지만, 많은 분석법이, 예를 들어, 적절한, 당업계에서 허용되는 동물 모델에서, 생체내 분석을 위해 개조될 수 있다.
시약 및 키트
상기 기술된 방법들 중 1가지 이상을 실행하기 위한 시약 및 이의 키트가 또 한 제공된다. 본 발명의 시약 및 이의 키트는 크게 변할 수 있다. 당해 시약은 NPC 표현형 결정적 유전자의 상기 기술된 발현 프로파일의 생산에서의 사용에 대해 특이적으로 디자인된 시약을 포함한다.
이같은 시약의 한가지 유형은 당해 NPC 전이 표현형 결정적 유전자가 제시된 핵산의 프로브의 어레이이다. 프로브 구조, 기판 조성물 및 부착 기술이 광범위하게 상이한 다양한 상이한 어레이 포맷이 당업계에 공지되어 있다. 당해 대표적인 어레이 구조에는 미국 특허: 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,800,992 (이들의 개시 내용은 거명에 의해 본원에 포함됨); 뿐만 아니라 WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; 및 EP 785 280에 기술된 것들이 포함된다. 다수의 실시양태에서, 어레이는 본원에 열거된 유전자들 중 2개 이상에 대한 프로브를 포함한다. 특정 실시양태에서, 어레이 상에 제시된 유전자의 개수는 5개 이상, 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상이고, 본원에 열거된 유전자 모두를 포함한다. 본 발명의 어레이는 본원에 열거된 유전자들만을 포함할 수 있거나, 또는 본원에 열거되지 않은 추가적인 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 어레이가 이같은 추가적인 유전자에 대한 프로브를 포함하는 경우, 특정 실시양태에서, 제시된 추가적인 유전자의 개수 ％는 약 50％를 초과하지 않고, 일반적으로 약 25 ％를 초과하지 않는다. 이같은 추가적인 유전자가 포함된 다수의 실시양태에서, 수집물 내의 유전자의 대부분은 NPC 암 표현형 결정적 유전자일 것이고, 이때 대부분은 적어도 약 75％, 일반적으로 적어도 약 80％, 때 때로 적어도 약 85, 90, 95％ 또는 그 이상을 의미하고, 수집물 내의 유전자 100％가 NPC 암 표현형 결정적 유전자인 실시양태를 포함한다. 다수의 실시양태에서, 어레이 상에 제시된 유전자들 중 1개 이상은 기능이 이를 NPC 암 표현형의 생산에 쉽게 관련시키지 않는 유전자이다.
NPC 암 표현형 결정적 유전자의 발현 프로파일을 생성시키는데 특이적으로 맞춰진 또다른 유형의 시약은 이같은 유전자를 선택적으로 증폭시키도록 디자인된 유전자 특이적 프라이머의 수집물이다. 유전자 특이적 프라이머 및 이의 사용 방법은 미국 특허 5,994,076 (거명에 의해 개시 내용이 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 본원에 열거된 유전자들 중 2개 이상에 대한 프라이머를 갖는 유전자 특이적 프라이머의 수집물이 특히 흥미롭다. 특정 실시양태에서, 수집물 내에 프라이머를 갖는 이같은 유전자의 개수는 5개 이상, 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상이고, 본원에 열거된 유전자 모두를 포함한다. 본 발명의 유전자 특이적 프라이머 수집물은 본원에 열거된 유전자들만을 포함할 수 있거나, 또는 본원에 열거되지 않은 추가적인 유전자에 대한 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 특이적 프라이머 수집물이 이같은 추가적인 유전자에 대한 프라이머를 포함하는 경우, 특정 실시양태에서, 제시된 추가적인 유전자의 개수 ％는 약 50％를 초과하지 않고, 일반적으로 약 25 ％를 초과하지 않는다. 이같은 추가적인 유전자가 포함된 다수의 실시양태에서, 수집물 내의 유전자의 대부분은 NPC 표현형 결정적 유전자일 것이고, 이때 대부분은 적어도 약 75％, 일반적으로 적어도 약 80％, 때때로 적어도 약 85, 90, 95％ 또는 그 이상을 의미하고, 수집물 내의 유전자 100％가 NPC 표현 형 결정적 유전자인 실시양태를 포함한다. 다수의 실시양태에서, 유전자 특이적 프라이머의 수집물 상에 제시된 유전자들 중 1개 이상은 기능이 이를 NPC 암 표현형의 생산에 쉽게 관련시키지 않는 유전자이다.
본 발명의 키트는 상기 기술된 어레이 및/또는 유전자 특이적 프라이머 수집물을 포함할 수 있다. 키트는 다양한 방법에서 사용되는 1가지 이상의 추가적인 시약, 예컨대 표적 핵산을 생성시키기 위한 프라이머, dNTP 및/또는 rNTP (예비혼합되거나 분리될 수 있음), 1가지 이상의 독특하게 표지된 dNTP 및/또는 rNTP, 예컨대 비오틴화 또는 Cy3 또는 Cy5 태그가 부착된 dNTP, 상이한 산란 스펙트럼을 갖는 금 또는 은 입자, 또는 기타 합성후 표지화 시약, 예컨대 형광 염료의 화학적으로 활성인 유도체, 효소, 예컨대 역전사효소, DNA 중합효소, RNA 중합효소 등, 다양한 완충제 매질, 예를 들어 혼성화 및 세정 완충제, 사전제작된 프로브 어레이, 표지된 프로브 정제 시약 및 성분, 스핀 컬럼 등, 신호 생성 및 검출 시약, 예를 들어 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접합물, 화학형광성 또는 화학발광성 기질 등을 추가로 포함할 수 있다
상기 성분들에 더하여, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실행하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 이러한 설명서는 본 발명의 키트에 다양한 형태로 존재할 수 있고, 1개 이상이 키트에 존재할 수 있다. 이러한 설명서가 존재할 수 있는 한가지 형태는 적절한 매체 또는 기판 상에 인쇄 정보로서, 예를 들어, 정보가 인쇄된 한 장 또는 여러 장의 종이로서, 키트의 포장물 내, 포장 삽입물 내 등이다. 또다른 수단은 정보가 기록될 수 있는 컴퓨터 판독가능한 매체, 예를 들 어, 디스켓, CD 등이다. 존재할 수 있는 또다른 수단은 먼 장소에서 정보에 액세스하도록 인터넷을 통해 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 임의의 편리한 수단이 키트 내에 존재할 수 있다.
NPC 전이의 치료를 위한 화합물 및 방법
NPC 전이 가능성이 완화될 수 있는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 본 발명은 1개 이상의 표적 유전자의 발현 또는 이의 1개 이상의 산물의 활성을 조정함으로써 이같은 용태를 완화시키는, 예를 들어 치료하는 방법을 제공하고, 이때 표적 유전자는 본원에 열거된 NPC 표현형 결정적 유전자 중 1개 이상이다.
특정 NPC 질환 상태는, 적어도 부분적으로, 과도한 수준의 유전자 산물(들)에 의해, 또는 비정상적이거나 과도한 활성을 나타내는 유전자 산물(들)의 존재에 의해 초래된다. 따라서, 이같은 유전자 산물의 수준 및/또는 활성에서의 감소는 질환 재발의 완화를 초래할 것이다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 산물 활성 수준의 감소를 위한 기술은 하기에 논의된다.
별법적으로, 또다른 특정 NPC 질환 상태는, 적어도 부분적으로, 유전자 발현의 부재 또는 수준 감소, 또는 유전자 산물 활성 수준에서의 감소에 의해 초래된다. 따라서, 유전자 발현 수준 및/또는 이같은 유전자 산물의 활성에서의 증가는 질환의 완화를 초래할 것이다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 산물 활성 수준을 증가시키기 위한 기술은 하기에 논의된다.
돌연변이 표적 유전자의 발현, 합성 또는 활성을 억제하는 화합물
상기 논의된 바와 같이, NPC 질환 장애에 수반되는 표적 유전자는 표적 유전 자 활성의 증가된 수준을 통해 이같은 장애를 야기할 수 있다. 질환 상태 하에 유전자가 세포/조직에서 상향 조절되는 경우, 다양한 기술을 사용하여 이같은 표적 유전자 및/또는 단백질의 발현, 합성 또는 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 억제 활성을 나타내는 기술된 분석법을 통해 확인된 것들과 같은 화합물이 질환 증상을 완화시키도록 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 이같은 분자는 소형 유기 분자, 펩티드, 항체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 억제성 항체 기술이 하기에 기술된다.
예를 들어, 표적 유전자 산물이 결합하는, 표적 유전자 산물에 대한 내인성 리간드와 경쟁하는 화합물이 투여될 수 있다. 리간드-결합된 유전자 표적의 양에서의 결과적인 감소는 내피 세포 생리학을 조정할 것이다. 이러한 목적에 특히 유용할 수 있는 화합물에는, 가용성 융합 단백질 예컨대 Ig-꼬리 융합 단백질이 예를 들어 포함되는, 가용성 단백질 또는 펩티드, 예컨대 표적 유전자 산물의 세포외 도메인들, 또는 이의 일부분 및/또는 유사체 중 1개 이상을 포함하는 펩티드가 예를 들어 포함된다 (Ig-꼬리 융합 단백질의 생산에 대한 논의를 위해서는, 예를 들어, 미국 특허 5,116,964 참조). 별법적으로, 표적 유전자 산물 수용체 부위에 결합하지만, 단백질을 활성화시키지 않는, 리간드 유사체 또는 항체와 같은 화합물 (예를 들어, 수용체-리간드 길항제)이 표적 유전자 산물 활성을 억제하는데 효과적일 수 있다. 또한, 표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 및 리보자임 분자가 비정상적인 표적 유전자 활성을 억제하도록 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다. 이같은 기술이 하기에 기술된다. 추가적으로, 하기에 또한 기술되는 바와 같이, 삼중 나선 분자가 비정상적인 표적 유전자 활성을 억제하는데 사용될 수 있다.
억제성 안티센스 , 리보자임 및 삼중 나선 접근법
NPC 전이를 완화시키는 능력을 나타낼 수 있는 화합물에는 안티센스, 리보자임, 및 삼중 나선 분자가 있다. 이같은 분자들은 돌연변이 표적 유전자 활성을 감소시키거나 억제하도록 디자인될 수 있다. 이같은 분자의 생산 및 사용을 위한 기술은 당업자에게 주지되어 있다.
안티센스 RNA 및 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA와 관련하여, 번역 개시 부위로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어, 당해 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 -10 영역 내지 +10 영역 사이의 것이 바람직하다. 리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소성 RNA 분자이다. 리보자임의 작용 메커니즘은 상보적인 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열 특이적 혼성화에 이은 엔도뉴클레오라이틱(endonucleolytic) 절단을 수반한다. 리보자임 분자의 조성은 표적 유전자 mRNA에 상보적인 1개 이상의 서열을 포함하여야 하고, mRNA 절단을 담당하는 주지된 촉매 서열을 포함하여야 한다. 이러한 서열에 대해서는, 미국 특허 5,093,246 (거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨) 참조. 따라서, 표적 유전자 단백질을 코딩하는 RNA 서열의 엔도뉴클레오라이틱 절단을 특이적으로 및 효율적으로 촉매하는 조작된 해머헤드(hammerhead) 모티프 리보자임 분자는 본 발명의 범주 내이다. 임의의 잠재적인 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위가 GUA, GUU 및 GUC의 서열을 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 당해 분자를 스캐닝함으로써 초기에 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 표적 유전자의 영역에 상응하는 리보뉴클레오티드 15개 내지 20개의 짧은 RNA 서열을 올리고뉴클레오티드 서열을 부적절하게 할 수 있는 예측된 구조 양상, 예컨대 2차 구조에 대해 평가할 수 있다. 후보 서열의 적절성은 리보뉴클레아제 보호 분석법을 사용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 접근성을 테스트함으로써 또한 평가될 수 있다. 전사 억제를 위한 삼중 나선 형성에서 사용될 핵산 분자는 단일 가닥이어야 하고, 데옥시리보뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍 형성 규칙을 통한 삼중 나선 형성을 촉진하도록 디자인되어야 하고, 이는 퓨린 또는 피리미딘의 상당한 신축물이 듀플렉스(duplex) 중 한 가닥 상에 존재하는 것을 일반적으로 필요로 한다. 뉴클레오티드 서열은 피리미딘을 기초로 할 수 있고, 생성된 삼중 나선의 3개의 회합된 가닥들을 가로질러 TAT 및 CGC+ 트리플렛(triplet)이 생성될 것이다. 피리미딘-풍부 분자는 듀플렉스의 단일 가닥의 퓨린-풍부 영역에 대해 이러한 가닥에 평행한 배향으로 염기 상보성을 제공한다. 또한, 퓨린이 풍부한, 예를 들어 G 잔기의 신축물을 함유하는 핵산 분자가 선택될 수 있다. 이러한 분자는 GC 쌍이 풍부한 DNA 듀플렉스와 삼중 나선을 형성할 것이고, 이때 대부분의 퓨린 잔기는 표적화된 듀플렉스의 단일 가닥 상에 위치하여, 트리플렉스의 3개의 가닥을 가로질러 GGC 트리플렛이 생성된다. 별법적으로, 삼중 나선 형성에 대해 표적화될 수 있는 잠재적인 서열이 소위 "스위치백(switchback)" 핵산 분자를 생성시킴으로써 증가될 수 있다. 스위치백 분자는 듀플렉스의 첫번째 한 가닥과 염기 쌍을 이 룬 후, 나머지와 쌍을 이루도록, 교대되는 5'-3', 3'-5' 방식으로 합성되어, 퓨린 또는 피리미딘의 상당한 신축물이 듀플렉스의 한 가닥 상에 존재하여야 하는 필요성을 제거한다. 본원에 기술된 안티센스, 리보자임, 및/또는 삼중 나선 분자가 정상적 및 돌연변이 표적 유전자 대립유전자 모두에 의해 생산된 mRNA의 전사 (삼중 나선) 및/또는 번역 (안티센스, 리보자임)을 감소시키거나 억제할 수 있는 것이 가능하다. 실질적으로 정상적인 수준의 표적 유전자 활성이 유지되는 것을 확실히 하기 위해, 안티센스, 리보자임, 또는 삼중 나선 치료가 사용되는 것 모두에 민감한 서열을 함유하지 않는, 정상적인 활성을 나타내는 표적 유전자 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 핵산 분자가 유전자 요법 방법 예컨대 하기 기술된 것들을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 별법적으로, 세포 또는 조직 표적 유전자 활성의 필수적인 수준을 유지하기 위해 정상적인 표적 유전자 단백질을 세포 또는 조직 내로 공동-투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임, 및 삼중 나선 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 당업계에 주지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위한 기술 예컨대 고체 상 포스포르아미디트 화학 합성이 포함된다. 별법적으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이같은 DNA 서열은 적절한 RNA 중합효소 프로모터 예컨대 T7 또는 SP6 중합효소 프로모터가 혼입된 광범위한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 별법적으로, 사용된 프로모터에 따라 구성적으로 또는 유도적 으로 안티센스 RNA를 생산하는 안티센스 cDNA 구축물이 세포주 내로 안정적으로 도입될 수 있다.
DNA 분자에 대한 다양한 주지된 변형이 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로 도입될 수 있다. 가능한 변형에는 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 플랭킹(flanking) 서열을 부가하는 것, 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 골격 내에서 포스포디에스테라제 연결보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 것이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
표적 유전자 산물에 대한 항체
표적 유전자 단백질에 특이적이고 또한 이의 활성을 방해하는 항체를 사용하여 표적 유전자 기능을 억제할 수 있다. 이같은 항체는 단백질 자체에 대하여 또는 단백질의 일부분에 상응하는 펩티드에 대하여 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이같은 항체는 폴리클로날, 모노클로날, Fab 단편, 단일쇄 항체, 키메라 항체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
표적 유전자 단백질이 세포내 단백질이고 전체 항체가 사용된 경우, 내재화되는 항체가 바람직할 수 있다. 그러나, 리포펙틴 리보솜이 항체 또는 표적 유전자 에피토프에 결합하는 Fab 영역의 단편을 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 결합하는 최소형 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 표적 유전자 단백질에 결합하는 항체의 가변 영역의 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 사용할 수 있다. 이같은 펩 티드는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나 재조합 DNA 기술을 통해 생산될 수 있다 (예를 들어, [Creighton, 1983, 상기 문헌]; 및 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌] 참조). 별법적으로, 세포내 표적 유전자 에피토프에 결합하는 단일쇄 중화 항체가 또한 투여될 수 있다. 이같은 단일쇄 항체는 [Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893]에 기술된 것들과 같은 기술을 예를 들어 사용함으로써 단일쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표적 세포 집단 내에서 발현시킴으로써 예를 들어 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자 단백질은 세포외 단백질이거나, 막횡단 단백질이다. 예를 들어, 유전자 산물의 1개 이상의 세포외 도메인에 특이적이고, 이의 활성을 방해하는 항체가 유방암 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 이같은 항체는 혈류로부터 직접적으로 표적 도메인에 접근할 수 있기 때문에 특히 효율적이다. 펩티드 투여에 적합한, 하기 기술된 투여 기술들 중 임의의 것을 사용하여, 억제성 표적 유전자 항체를 이의 작용 부위에 효율적으로 투여할 수 있다.
표적 유전자 활성의 복구 방법
NPC 전이에 기여하는 표적 유전자는 질환 상황에서 과소발현될 수 있다. 유전자가 질환 상태 하에 하향 조절되거나 표적 유전자 산물의 활성이 감소되어, 질환 증상의 발달에 이르는 경우, 표적 유전자 활성 수준이 NPC 질환 증상이 완화된 수준으로 증가될 수 있는 방법을 사용할 수 있다. 유전자 활성의 수준은, 예를 들어, 존재하는 표적 유전자 산물의 수준을 증가시킴으로써 또는 존재하는 활성 표적 유전자 산물의 수준을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
예를 들어, NPC 전이를 완화시키는데 충분한 수준의 표적 유전자 단백질이 이같은 증상을 나타내는 환자에게 투여될 수 있다. 하기에 논의된 기술들 중 임의의 것이 이같은 투여에 사용될 수 있다. 당업자는, 하기 기술된 것들과 같은 기술을 사용하여, 정상적인 표적 유전자 단백질의 효과적이고 비독성인 용량의 농도를 결정하는 방법을 쉽게 인지할 것이다.
추가적으로, 표적 유전자 단백질을 코딩하는 RNA 서열이 NPC 전이를 나타내는 환자에게 이같은 증상이 완화되도록 하는 수준의 표적 유전자 단백질을 생산하는데 충분한 농도로 직접 투여될 수 있다. 화합물의 세포내 투여를 달성하는 하기 논의된 기술들 중 임의의 것, 예컨대 리포솜 투여를 이같은 RNA 분자의 투여에 사용할 수 있다. RNA 분자는, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다.
또한, 환자는 유전자 대체 요법으로 치료될 수 있다. 정상적인 표적 유전자, 또는 표적 유전자의 기능을 갖는 정상적인 표적 유전자 단백질의 생산을 지시하는 유전자의 일부의 1개 이상의 카피를 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터가 포함되지만 이에 한정되지 않는 벡터에 더하여, DNA를 세포 내로 도입하는 기타 입자, 예컨대 리포솜을 사용하여 세포 내로 삽입할 수 있다. 추가적으로, 상기 기술된 것들과 같은 기술을 정상적인 표적 유전자 서열의 인간 세포 내로의 도입에 사용할 수 있다.
그후, 정상적인 표적 유전자 발현 유전자를 함유하는 세포, 바람직하게는 자가 세포가 증상의 완화를 허용하는 위치에서 환자에게 도입 또는 재도입된다. 이 같은 세포 대체 기술은, 예를 들어, 표적 유전자 산물이 분비되는 세포외 유전자 산물인 경우에 바람직할 수 있다.
제약 제제 및 투여 방법
표적 유전자 발현, 합성 및/또는 활성을 억제하는 확인된 화합물이 NPC 전이를 치료하거나 완화시키도록 치료적 유효 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료적 유효 용량은 증상의 완화가 초래되는데 충분한 화합물의 양을 지칭한다.
유효 용량
이같은 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (집단의 50％에 치사적인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 비율 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 치료 지수가 큰 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화시킴으로써 부작용을 감소시키기 위해 이같은 화합물을 침범된 조직의 부위에 표적화시키는 전달 시스템을 디자인하는데 주의하여야 한다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 수득된 데이타를 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제형하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는 이같은 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 용량이 제형될 수 있다. 이같은 정보를 사용하여 인간에서의 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내의 수준을, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정할 수 있다.
제형 및 용도
본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물을 1가지 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형할 수 있다.
따라서, 화합물 및 이의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매 화합물이 흡입 또는 통기에 의한 투여 (입 또는 코를 통한 투여) 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여용으로 제형될 수 있다.
경구 투여를 위해, 제약 조성물은, 예를 들어, 제약상 허용가능한 부형제 예컨대 결합제 (예를 들어, 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤화제 (예를 들어, 소듐 라우릴 술페이트)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 주지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있 거나, 또는 사용 전 물 또는 기타 적절한 비히클로의 구성을 위한 건조 분말로 제시될 수 있다. 이같은 액체 제제는 제약상 허용가능한 첨가물 예컨대 현탁화제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예를 들어, 아몬드오일, 오일성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성 오일); 및 방부제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소브르산)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 제제는 적합하다면 완충제 염, 풍미, 착색 및 감미 작용제를 또한 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 제공하도록 적절하게 제형될 수 있다. 구강 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태를 취할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적절한 분사제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체를 사용하는, 분무기 또는 가압 팩으로부터의 에어로졸 스프레이 제제의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물 및 적절한 분말 기제 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형될 수 있다.
화합물은 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형될 수 있다. 주사용 제형은 방부제가 부가된 단위 투여량 형태로, 예 를 들어, 앰퓰 또는 다중-투여 컨테이너로 제시될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀션의 형태를 취할 수 있고, 현탁화, 가용화 및/또는 분산 작용제와 같은 제형 작용제를 함유할 수 있다. 별법적으로, 활성 성분은 사용 전 적절한 비히클, 예를 들어, 발열원이 없는 무균수로의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
화합물은 통상적인 좌약 기제 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 예를 들어 함유하는 직장 조성물 예컨대 좌약 또는 정체 관장제로 또한 제형될 수 있다.
앞서 기술된 제형들에 더하여, 화합물은 데포(depot) 제제로서 또한 제형될 수 있다. 이같은 장기 작용 제형은 이식 (예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적절한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용가능한 오일 내의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 절약적으로 가용성인 유도체로서, 예를 들어, 절약적으로 가용성인 염으로 제형될 수 있다.
조성물은, 원한다면, 활성 성분을 함유하는 1가지 이상의 단위 투여량 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치 내에 제시될 수 있다. 팩은 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 예를 들어 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에 투여용 설명서가 동반될 수 있다.
본 발명의 다양한 양상 및 부수적인 장점이 첨부된 도면을 참조로 고려될 때 더욱 잘 이해됨에 따라 더욱 완전하게 이해될 것이고, 도면에서 유사한 참조 문자는 여러 측면을 통한 동일하거나 유사한 부분을 명시한다.
도 1은 mRNA 전사물 프로파일링 데이타를 기초로 하는 분자 예측물의 개발 및 확인에 사용된 전략의 개요를 나타낸다.
도 2는 96개의 훈련 셋트 사례로부터 선택된 798개의 유전자를 사용한 계층적 클러스터 분석법을 묘사한다. 개별적인 유전자들은 좌측 및 우측 상에 지시된 바와 같이 행에 제시된다. 개별적인 사례들은 최상부 상의 열로서 제시된다. 결과는 유전자가 좌측 상의 유색 막대에 의해 지시되는 바와 같은 6개의 군으로 클러스터링되었음을 가리킨다.
도 3은 52개-유전자 서명 및 k-최근접 이웃 분류 방법에 의해 원격 전이에 대해 저위험 및 고위험으로 예측된 사례들에 대한 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존의 확률의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 나타낸다. 제시된 결과는 독립적인 테스트 셋트 사례들로부터 수득되었다. p 값은 로그-순위 테스트로 계산되었다.
도 4는 12개-유전자 서명 및 로지스틱 회귀 모델에 의해 원격 전이에 대해 저위험 및 고위험으로 예측된 사례들에 대한 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존의 확률의 카플란-마이어 분석을 나타낸다. 제시된 결과는 독립적인 테스트 셋트 사례들로부터 수득되었다. p 값은 로그-순위 테스트로 계산되었다.
도 5는 52개-유전자 및 12개-유전자 서명의 조합된 예측 결과에 따른 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존의 확률의 카플란-마이어 분석을 나타낸다. 2가지 서 명들 간에 비부합성 결과를 나타내는 사례들은 "불확정"으로 간주되었다 (표 6). 부합성 결과를 나타내는 사례들은 원격 전이에 대한 저위험 또는 고위험 내에 속하였다. 저위험 및 고위험 서명의 군이 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존에 대해 비교되었을 때, p 값은 각각 <0.0001 및 0.002였다. 전이가 없는 생존 (p=0.09 및 0.05) 및 전체적인 생존 (p=0.31 및 0.09)에 대해 불확정 군과 저위험 또는 고위험 군 사이의 유의한 차이는 없었다. p 값은 로그-순위 테스트로 계산되었다.
도 6은 원격 전이가 있거나 없는 III기 또는 IVa/b기 NPC 환자들 간의 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존의 확률의 카플란-마이어 분석을 나타낸다. 연구에 포함된 대부분의 환자들은 기관 프로토콜에 따라 1997년과 2002년 사이에 치료받기 시작하였고, 정기적으로 추적되었다. 상부 패널은 이러한 4군의 환자들의 전체적인 생존 곡선을 나타낸다. 원격 전이가 발달되지 않거나 발달된 III기 환자는 각각 106명 및 27명이었다. 유사하게, 47명 및 35명의 IV기 환자가 있었다. III기 또는 IVa/b기 환자에 대한 원격 전이가 발달된 환자와 발달되지 않은 환자 간의 전체적인 생존의 차이는 모두 p 값 <0.0001으로 유의하였다. 원격 전이가 있거나 (p=0.39) 또는 없는 (p=0.35) III기 및 IVa/b기 환자들 간에는 유의한 차이가 없었다. 하부 패널은 결국 원격 전이가 발달된 III기 및 IVa/b기 환자에 대한 전이가 없는 생존의 확률을 나타낸다. 모든 III기 환자는 동시 화학방사선 요법 및 보조 화학요법만으로 치료된 반면, IVa/b기 환자에게는 유지 화학요법이 부가되었다.
도 7은 2명의 다른 작업자 간의 "존재하는" 프로브 셋트의 중앙 강도의 상관관계를 나타낸다. 훈련 셋트 내의 모든 NPC 검사물이 2명의 작업자에 의해 무작위 로 수행되었다. 작업자 A는 훈련 셋트 내의 24개의 전이가 없는 사례 및 14개의 양성 전이 사례를 수행하였다. 작업자 B는 35개의 전이가 없는 사례 및 18개의 양성 전이 사례를 수행하였다. 각각의 작업자에 의해 수행된 사례의 각각의 프로브 셋트에 대한 표준화된 발현 강도의 중앙값을 계산하였다. 결과는 작업자와 관련된 계통적인 편향이 없었음을 가리키는 완벽한 대각선 선형 상관관계를 나타냈다.
도 8은 실험 변이의 정정을 위한 프로브 셋트 수준에서의 분위수 표준화의 결과를 나타낸다. 6개의 상이한 NPC 검사물 (I-VI)로부터의 cRNA를 2개의 부분으로 나누고, 상이한 날짜에 2개의 U133-A GeneChip에 혼성화시켰다. U133-A GeneChip 상의 인간 유전자에 대한 모든 프로브 셋트의 강도의 상관관계가 도면에 제시된 바와 같은 각각의 사례에 대해 수행되었다. 상부 패널은 표준화되지 않은 칩 파일로부터의 프로브 셋트 강도의 상관관계를 나타낸다. 중간 패널은 500의 절사 평균으로 조정된 후의 프로브 셋트 강도의 상관관계를 나타낸다. 하부 패널은 기존에 수립된 표준에 대한 모든 인간 프로브 셋트의 발현 강도의 분위수 표준화 후의 프로브 셋트 강도의 상관관계를 나타낸다. 결과는 프로브 셋트 수준에서의 분위수 표준화가 실험 변이를 정정하는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
추가적인 상술 없이, 기존의 기술(記述)을 사용하여, 당업자가 본 발명을 이의 최대한도로 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기의 바람직한 구체적인 실시양태들은 단지 설명적이고, 어떠한 방식으로도 나머지 개시내용의 한정적이지 않는 것으로 해석된다.
상기 및 하기의 예에서, 모든 온도는 섭씨 온도로 정정되지 않고 기재되고, 모든 부 및 백분율은 달리 지시되지 않는 한 중량 기준이다.
바람직한 양상에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
1. 비인강 암종이 있는 환자로부터의 샘플 내의 표 4 및 5에 열거된 유전자들 중 1개 이상의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는, 비인강 암종이 있는 환자에서 원격 전이의 위험을 평가하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 표 4에 열거된 52개의 유전자들 중 2개 이상의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 표 4에 열거된 52개의 유전자들의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 표 4에 열거된 52개의 유전자들의 발현의 평가가 표 4에 제시된 유전자들의 9개의 클러스터 각각에 대한 회귀 모델을 사용하여 수행되는 방법.
5. 제4항에 있어서, 표 1의 개별적인 회귀 모델 등식을 사용하여 9개의 유전자 클러스터 각각에 대해 로짓 점수가 생성되는 방법.
6. 제5항에 있어서, 원격 전이의 위험에 대한 예측 규칙이 상기 9개의 유전자 클러스터에 대한 상기 로짓 점수에 적용된 k-최근접 이웃 분류 방법에 의해 생성되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 표 5에 열거된 12개의 유전자들 중 2개 이상의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 표 5에 열거된 12개의 유전자들의 발현 프로파일을 평가하는 것을 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 표 5에 열거된 12개의 유전자들의 발현의 평가가 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 수행되는 방법.
10. 제9항에 있어서, 로짓 점수가 표 2의 회귀 모델 등식을 사용하여 상기 12개 유전자의 발현 프로파일을 기초로 생성되고, 상기 로짓 점수가 원격 전이의 위험과 상관되는 방법.
11. 제10항에 있어서, 원격 전이의 저위험에 대한 예측 규칙이 하기와 같은 방법:
[원격 전이의 저위험에 대한 확률] =
Figure 112008028248725-PCT00001
12. 제6항에 있어서, 상기 예측 규칙으로부터 생성된 원격 전이의 위험이 등식
[원격 전이의 저위험에 대한 확률] =
Figure 112008028248725-PCT00002
(식중, 로짓 점수는 표 2의 회귀 모델 등식 및 표 5에 열거된 12개의 유전자의 발현 프로파일을 사용하여 생성된다)을 사용하여 상기 위험을 평가하는 제2의 독립적인 예측 규칙으로부터의 원격 전이의 위험과 비교되는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 방법들 양쪽 모두로부터 결정된 원격 전이의 위험이 낮거나 높은 경우에는 위험이 각각 낮거나 높은 것으로 점수화되고, 상기 결정된 위험이 비부합성인 경우에는 위험이 불확정으로 점수화되는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 발현 프로파일이 NPC 종양 검사물에서 평가되는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 발현 프로파일이 mRNA 전사물로부터 생성되는 방법.
16. (a) 표 4에 열거된 52개의 유전자, (b) 표 5에 열거된 12개의 유전자, 또는 (c) 상기 52개의 유전자 및 상기 12개의 유전자 모두의 발현 프로파일을 결정하기 위한 프로브로 본질적으로 구성되는, 비인강 암종이 있는 환자에서 원격 전이의 위험을 결정하는데 유용한 핵산 마이크로어레이.
17. 표 4에 열거된 52개의 유전자 모두 및/또는 표 5에 열거된 12개의 유전자 모두; 및/또는 상기 52개의 유전자 또는 상기 12개의 유전자의 부분집합 또는 양쪽의 부분집합으로 본질적으로 구성되고, 각각의 경우에 상기 부분집합은 비인강 암종 환자에서의 원격 전이의 위험을 예측하는데 효과적인, 매체 또는 키트 형태의 수집물.
실시예 I
mRNA 전사물 프로파일링을 치료 전에 수득된 원발성 NPC의 138개의 생검 검사물에 대해 수행하였다. 검사물은 NPC 환자의 2가지의 상반된 임상 군을 나타냈다: 초기 치료 후 3년 이내에 원격 전이 (고위험군, n=47) 대 3년을 초과하는 추적 후 원격 전이가 없음 (저위험군, n=91). 138개의 검사물 중 2/3를 훈련 셋트로 무작위화시키고, 1/3은 테스트 셋트로 무작위화시켰다. 감독 하의 분석을 수행하여, 훈련 셋트 (n=96)에서 원격 전이의 발달과 관련된 유전자 발현 서명을 발견하였다. 발견된 분자 예측물을 42개 검사물의 독립적인 테스트 셋트에서 확인하였다.
환자 선택 및 종양 조직
1992년 내지 2004년 사이에 <Tumor Bank of the Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center (KF-SYSCC)>에서 수집된 375명의 NPC 환자의 원발성 종양으로부터의 새롭게 동결된 생검 샘플이 전체 RNA 추출에 이용가능하였다. 서면화된 사전 동의를 모든 환자로부터 수득하였고, 연구는 기관 심의 위원회에 의해 허가되었다. 105명의 환자의 RNA는 심각하게 분해되었고, 연구로부터 거절되었다. 나머지 270개의 샘플에서, 138개의 샘플만이 하기의 기준 중 하나를 충족시켰고, 연구에 선택되었다. 첫번째 선택 기준은 원격 전이가 발달되지 않았고 초기 치료로부터 3년 이상 동안 정기적으로 추적된 환자를 요구하였다. 이러한 군의 환자 (n=91)는 원격 전이에 대한 임상적 저위험으로 칭해졌다. 두번째 선택 기준은 최초 치료를 받은 시점에 원격 전이가 이미 발달되었거나 초기 치료로부터 3년 이내에 원격 전이가 발달된 환자를 요구하였다. 원격 전이는 폐, 뼈, 간, 신장, 뇌 및 기타 내장 기관에서의 NPC의 전이로 정의되었다. 전이는 미세 바늘 흡인 또는 중심 생검으로 조직학적으로 확인되었다. 이러한 군의 환자 (n=47)는 원격 전이에 대한 임상적 고위험으로 칭해졌다.
1개의 샘플을 1992년에 수집한 것을 제외하고는 모든 적격 환자로부터의 원발성 종양의 생검 샘플을 1995년 내지 2004년 사이에 수집하였다. 대다수의 샘플 (83％)은 1998년 내지 2001년 사이에 수집되었다. 진단 시점의 환자의 연령은 11세 내지 71세 범위였고, 중앙값 및 평균은 각각 44세 및 45세였다. 초기 진단 및 병기결정 정밀검사 후, 환자들을 기관 프로토콜에 따라 치료하였다31. 추적의 중앙값 및 평균 기간은 각각 3.34년 및 3.29년이었다. 추적 기간 동안, 29명의 환자가 사망하였고, 이들 중 28명은 임상적 고위험군에 속하였다. NPC 환자의 병기결정은 1997 AJCC 정의에 따라 수행하였다.
mRNA 전사물 프로파일링 연구
전체 RNA를 액체 질소 내에 동결된 조직으로부터 Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 단리하였다. 단리된 RNA를 RNAEasy Mini 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 추가로 정제하고, 품질을 RNA 6000 Nano 분석법에 의해 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)에서 평가하였다. 유전자 발현 프로파일링 연구에 사용된 모든 RNA 샘플은 RNA 통합성 수 (RIN: RNA Integrity Number)가 6.0 내지 10.0 사이였다 (7.8 ± 1.1, 평균 ± SD). 혼성화 표적을 전체 RNA로부터 Affymetrix 프로토콜에 따라 제조하고, Affymetrix U133A GeneChip에 혼성화시켰다. U133 A GeneChip은 대략 13,000개의 인간 유전자에 대한 22,238개의 프로브 셋트를 함유하였다. 어레이의 특징은 통상적이었고, 예를 들어, Affymetrix 웹 사이트 (www.affymetrix.com/products/arrays)에 상술되어 있다. 간략하게, 이중 가닥 cDNA를 샘플 당 8 ㎍의 전체 RNA로부터 합성하였다. 비오틴으로 표지된 상보적인 RNA (cRNA)가 시험관내 전사에 의해 cDNA로부터 생성되었다. cRNA를 정제하고, 혼성화 전에 화학적으로 분획화시켰다. 특정량의 분획화된 cRNA, 프로브 어레이 대조군, 소 혈청 알부민 및 청어 정자 DNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 배합함으로써 칵테일을 제조하였다. cRNA 칵테일이 U133A GeneChip 상의 올리고뉴클레오티드 프로브에 16시간 동안 45℃에서 혼성화되었다. 혼성화 직후에, 혼성화된 프로브 어레이에 프로토콜 EukGE WS2v4를 사용하여 Affymetrix GeneChip 유체공학 스테이 션 400에서 자동화 세정 및 염색이 진행되었다. 그 후, U133A GeneChip을 Affymetrix GeneArray 스캐너 2500에서 스캐닝하였다.
마이크로어레이 데이타의 조정 및 표준화
Affymetrix Microarray Analysis Suite (MAS) 5.0 소프트웨어를 사용하여 500의 표적 절사 평균으로 조정함으로써 각각의 유전자의 발현 강도를 결정하였다. U133A GeneChip 상의 모든 인간 유전자의 조정된 발현 강도를 밑수 2에 대해 대수적으로 변환시키고, 분위수 표준화 방법을 사용하여 표준화시켰다.32 분위수 표준화에 대한 참조 표준은 164개의 원발성 NPC, 15개의 정상적인 비인강 조직 및 23개의 전이성 NPC의 U133A GeneChip 데이타로부터 본 발명가들의 실험실에서 기존에 수립되었다. 거명에 의해 각각의 전체 내용이 본원에 포함된 USSN 11/015,764 (2004년 12월 20일) 및 11/090,294 (2004년 3월 28일) 참조. U133A GeneChip 데이타의 기타 추가적인 품질 측정은 "존재하는" 것으로 검출가능한 유전자의 백분율 (52.1 ± 5.8 ％, 평균 ± SD), 및 GAPDH 3' 대 5'의 비율 (0.96 ± 0.18, 평균 ± SD)을 포함한다. 양쪽 파라메터 모두 샘플 및 분석법의 양호한 전체적인 품질을 지지하였다.
실시예 II
데이타의 통계적 분석
사용된 통계적 분석법의 프로세스가 도 1에 요약 및 도해된다.
훈련 및 테스트 셋트로의 샘플의 분배
본 발명가들의 연구에 포함된 138명의 NPC 사례에서, 91명의 사례에서는 최초 치료 개시 후 어떠한 원격 전이도 발달되지 않았고, 3년 초과 동안 추적되었다. 이러한 91명의 사례는 원격 전이에 대해 임상적 저위험으로 분류되었다. 나머지 47명의 사례에서는, 최초 치료 시점에 또는 최초 치료 개시 후 3년 이내에 모두 원격 전이가 발달되었다. 이들은 원격 전이에 대해 임상적 고위험으로 분류되었다. 모든 환자에 대한 최초 진단일과 최초 치료일 간의 평균 간격은 20 ± 51일 (평균 ± SD)이었다. 각각의 위험군의 2/3을 SAS 소프트웨어 (버젼 9.1)를 사용하여 무작위로 훈련 셋트에 할당하였다. (SAS 소프트웨어는 SAS Institute Inc. (Gary, NC)로부터 입수가능하다.) 환자의 1/3은 테스트 셋트에 할당되었다. 저위험 환자의 할당은 성, 연령 (45세 이하 및 45세 초과), 1997 AJCC TNM 병기 (I기 및 II기 대 III기 및 IV기), 및 추적 기간 (4.5년 이하 및 4.5년 초과)에 따라 계층화되었다. 고위험 환자는 성, 연령, TNM 병기, 및 최초 치료로부터 원격 전이의 발달까지의 시간 (1.5년 이하 및 1.5년 초과)에 따라 계층화되었다. 훈련 셋트에는 62명의 저위험 사례와 및 34명의 고위험 사례가 있었고; 독립적인 테스트 셋트에는 29명의 저위험 사례 및 13명의 고위험 사례가 있었다. 독립적인 테스트 셋트 샘플은 훈련 프로세스 동안 수반되지 않았다.
분석을 위한 유전자의 선택
테스트 셋트 샘플을 제외한 모든 NPC 샘플에서 Affymetrix MAS5.0 소프트웨어에 의해 발현이 "존재하는" 것으로 결정된 프로브 셋트만이 분석에 선택되었다. 각각의 유전자의 표준화 및 대수적으로 전환된 발현 데이타를 먼저 GeneLinker Platinum 4.5 소프트웨어 (Predictive Patterns Software, Inc., Inverary, Canada)를 사용하여 저위험군과 고위험군 간에 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트에 의해 분석하였다. p 값이 0.05 미만인 798개의 유전자를 자기-조직화 지도 (SOM: self-organizing map) 방법 (GeneLinker Platinum 4.5 소프트웨어)에 의한 추가적인 연구에 선택하였다.
SOM 분석
798개의 유전자를 SOM에 의해 분석하였다. SOM 분석을 위한 파라메터는 유전자에 의한 오리엔테이션, 거리 척도에 대한 피어슨(Pearson) 상관관계, 및 2 (높이) × 3 (폭)의 지도 치수를 포함한다. 참조 벡터 및 알고리즘 성질에 대해서는, 디폴트 값이 사용되었다. 2 × 3 치수의 선택은 훈련 셋트 사례에 대한 798개의 유전자의 계층적 클러스터링에 의해 안내되었다 (도 2). 이러한 접근법은 SOM 분석을 위한 지도 치수를 선택하는데 객관적인 수단을 제공하였다. 따라서 모든 798개의 유전자가 6개의 상이한 SOM 클러스터 (I 내지 VI)로 분류되었다.
각각의 SOM 클러스터 내의 유전자를 SPSS 9.0 소프트웨어 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois)를 사용하여 2진 순방향 로지스틱 회귀에 의해 추가로 선택하였다. 순방향 로지스틱 회귀에 대한 진입 및 제거 p 값은 각각 <0.05 및 >0.1이었다, 로지스틱 회귀 분석 후, SOM 클러스터 II, V 및 VI으로부터 선택된 유전자의 개수는 각각 6, 6 및 5였다. 로지스틱 회귀 분석 동안 SOM 클러스터 I, III 및 IV에 대해서 완전히 분리에 마주쳤다. 이어서, 2차원 SOM 분석을 SOM 클러스터 I, III 및 IV 각각의 유전자에 대해 수행하였다. SOM 클러스터 Ia, Ib, IIIa, IIIb, IVa, 및 IVb 내의 선택된 유전자의 생성된 개수는 각각 9, 5, 8, 4, 6 및 3이었다. 따라서, 52개의 유전자가 9개의 SOM 클러스터 내에 있었다.
예측 방법의 수립
원격 전이가 발달될 위험이 높은 NPC 환자의 확인을 위한 2가지 예측 방법이 수립되었다. 첫번째 방법은 9개의 SOM 클러스터 내의 52개의 유전자를 기초로 한다. 회귀 모델이 각각의 클러스터의 유전자에 대해 수립되었다. 각각의 회귀 모델의 등식이 표 1에 열거된다. 로짓 점수가 매 샘플에 대해 각각의 등식으로부터 생성되었다. 훈련 셋트 내의 각각의 샘플에 대한 9개의 로짓 점수를 SAS 9.0 소프트웨어를 사용하여 k-최근접 이웃 (k-NN) 분류 방법에 의해 예측 규칙을 개발하는데 사용하였다. 1, 3, 5, 10 및 30의 "k" 값을 훈련 셋트를 사용하여 별도로 테스트하였다. 리브-원-아웃(leave-one-out) 교차 검정을 수행하였다. 10의 테스트된 k 값이 리브-원-아웃 교차 검정에 따라 최상의 결과를 제공하였고, 예측 방법에 선택되었다.
두번째 예측 방법은 원래의 SOM 클러스터 I 내의 197개의 유전자로부터 유래된 12개의 유전자를 기초로 하였다. 상기 언급된 바와 같이, 유전자들의 3개의 SOM 클러스터가 순방향 선택 분석으로의 로지스틱 회귀 동안 완전한 분리를 나타냈다. 결과는 이러한 3개의 SOM 클러스터의 유전자들의 잠재적인 높은 예측값을 시사하였다. SOM 클러스터가 예측에 쉽게 사용될 수 있는 유전자들을 확인하기 위해, 훈련 셋트 사례를 사용하여 2진 순방향 로지스틱 회귀 (SPSS 9.0 소프트웨어)에 의해 각각의 SOM 클러스터로부터 유전자 선택을 수행하였고, 완전한 분리 직전 에 유전자의 선택이 정지되었다. 각각의 클러스터로부터의 선택된 유전자를 사용하여 로짓 점수를 유도하였고, 이를 사용하여 확률을 추정하였다. 0.5를 초과하는 확률은 원격 전이에 대한 저위험으로 할당하였고, 0.5 미만의 확률은 원격 전이에 대한 고위험으로 할당하였다. 결과는 SOM 클러스터 I로부터 선택된 12개의 유전자가 훈련 셋트에서의 사례를 사용하여 최상의 결과를 생산하였음을 나타냈다. SOM 클러스터 I로부터의 12개의 유전자를 기초로 하는 회귀 모델의 등식이 표 2에 제시된다.
생존 분석
전이가 없는 생존 및 전체적인 생존 분석이 SAS 9.0 소프트웨어를 사용하여 카플라-마이어 로그 순위 테스트에 의해 수행되었다. 생존은 최초 치료의 시작일과 마지막 추적일 또는 사망일 간의 기간으로 정의되었다. 전이가 없는 생존은 최초 치료의 시작일과 최초로 원격 전이가 진단된 날 간의 기간으로 정의되었다.
실시예 III
결과 요약
제시된 바와 같이, 2가지 예측물이 원격 전이가 발달될 위험이 높거나 낮은 NPC 환자의 확인을 위해 수립되었다. 첫번째 예측물은 9개의 상이한 자기 조직화 지도 클러스터 내의 52개의 유전자 및 k-최근접 이웃 분류 방법을 기초로 하였다. 두번째 예측물은 12개의 유전자 및 로지스틱 회귀 모델을 기초로 하였다. 양쪽 방법 모두 독립적인 테스트 셋트에서 원격 전이에 대한 짧은 간격 및 짧은 전체적인 생존에 대해 강력하게 예측적이었다. 독립적인 테스트 셋트에서 평가된 양쪽 방법 의 전체적인 정확성은 각각 81％ 및 76％였다. 양쪽 예측 방법이 조합되었을 때, 정확성이 85％로 증가하였다. 고위험 서명 군에서의 원격 전이에 대한 추정 위험 비율은, 저위험 서명 군과 비교하여, 11.1이었다 (95％ 신뢰 구간 2.4 내지 52.4 , p=0.002).
환자의 특징화
전체적인 생존이 불량하거나 양호한, 원격 전이가 발달될 위험이 높거나 낮은 NPC 환자의 예측을 위한 유전자 서명을 확인하기 위해, 임상적으로 잘 규정된 NPC 환자의 2개의 군 간에 감독 하의 분석을 수행하였다. 초기 치료 후 3년 이내에 원격 전이가 발달되지 않은 NPC 환자는 장기적인 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존이 양호한 것으로 잘 인지되어 있다.31, 33 반면에, 최초 치료 시점에 또는 3년 이내에 원격 전이가 발달된 NPC 환자는 일반적으로 질환으로 사망하였고, 생존이 더 불량하였다. 본 발명가들의 연구에서의 138명 중에서, 91명의 환자는 임상적 저위험군에 속하였고, 47명의 환자는 임상적 고위험군에 속하였다. 저위험 환자 및 고위험 환자의 2/3를 무작위로 훈련 셋트로 할당하고, 1/3은 테스트 셋트에 할당하였다. 이러한 환자들의 특징이 표 3에 요약된다. 저위험군 및 고위험군 모두에 대해 훈련 셋트와 테스트 셋트 간에 열거된 임상 특성에 대해 유의한 차이가 없었다. 또한, 훈련 셋트 (n=34)와 테스트 셋트 (n=13) 간의 원격 전이 부위의 분포는 뼈에 대해 50％ 대 69％, 간에 대해 50％ 대 54％, 폐에 대해 38％ 대 23％, 기타에 대해 15％ 대 23％였다. 기타에는 뇌, 신장, 지라 및 골반 기관이 포함된다. 분포는 두 군 간에 유사하였다.
실시예 IV
52개 유전자의 서명에 의한 원격 전이의 예측
예측물 유전자를 확인하기 위해, 고도의 감독 하의 분석을 수행하였다. 테스트 셋트 사례를 제외한 모든 NPC 샘플에서 Affymetrix MAS 5.0 소프트웨어에 의해 "존재하는" 것으로 결정될 수 있는 유전자 (4,814 프로브 셋트)만을 연구에 사용하였다. 그 후, 훈련 셋트의 임상적 저위험군과 임상적 고위험군 간의 크루스칼-왈리스 테스트를 수행하였다. 발현에서 유의한 차이 (p <0.05)를 나타내는 798개의 유전자를 추가적인 연구용으로 선택하였다. 798개의 선택된 유전자를 사용하여 훈련 셋트 사례에 대해 무감독 계층적 클러스터 분석을 수행하였다. 결과는 6개의 주요 유전자 클러스터를 나타냈다 (도 2). 계층적 클러스터링 결과를 기초로, 2×3의 지도 치수를 SOM 분석에 선택하였다. 각각의 SOM 클러스터 내의 대부분의 유전자들은 함께 결집되었고, 계층적 클러스터링에 의해 생성된 유전자 클러스터와 평행하였다.
6개의 SOM 클러스터 각각 내의 유전자들을 훈련 셋트 내의 저위험 및 고위험 사례에 대한 순방향 선택으로의 로지스틱 회귀에 의해 추가로 분석하였다. 유전자들의 3개의 SOM 클러스터가 완전한 분리의 문제를 나타냈다. 이러한 3개의 클러스터 각각 내의 유전자를 SOM에 의해 2개의 서브-클러스터에 대해 추가로 분석하였다. 총 52개의 유전자가 9개의 SOM 클러스터로부터 선택되었고, 원격 전이에 대한 예측 모델을 개발하는데 사용되었다. 이러한 52개의 유전자들이 표 4에 요약된다. 각각의 SOM 클러스터 내의 유전자들로부터 로짓 점수를 결정하는데 사용된 등식이 표 1에 요약된다.
따라서, 9개의 로짓 점수가 각각의 사례에 대해 52개의 유전자의 발현 강도로부터 생성되었다. 훈련 셋트 내의 각각의 사례의 9개의 로짓 점수를 사용하여, k-NN 분류 방법에 의해 예측 규칙을 수립하였다. 예측 규칙에 대한 리브-원-아웃 교차 검정은 원격 전이의 위험이 높은 훈련 셋트 사례의 예측에 대한 특이성 및 민감도가 각각 98％ (61/62) 및 88％ (30/34)임을 나타냈다. 전체적인 정확성은 95％ (91/96)였다. 독립적인 테스트 셋트 사례 (n=42)를 수립된 예측 규칙에 따라 분석하였을 때, 특이성, 민감도 및 전체적인 정확성은 각각 86％ (25/29), 69％ (9/13), 및 81％ (34/42)였다. 연관성에 대한 피셔(Fisher)의 정확 검증 (p=0.0007)으로 52개-유전자 예측물의 로버스트성(robustness)이 확인되었다. 원격 전이 및 더 짧은 전체적인 생존에 대한 예측된 고위험 서명 군과 예측된 저위험 서명 군 간의 추정된 위험 비율은 각각 7.1 (p=0.002, 95％ 신뢰 구간 2.2-23.5) 및 5.4 (p=0.001, 95％ 신뢰 구간 1.5-19.4)였다.
원격 전이에 대한 위험이 낮거나 (n=29) 또는 높은 (n=13) 것으로 예측된 테스트 셋트 내의 환자들을 이들의 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존에 대해 비교했을 때, 원격 전이에 대한 위험이 높은 것으로 예측된 환자는 유의하게 전이가 없는 생존이 더 짧았고 (p=0.0001), 전체적인 생존이 더 짧았다 (p=0.003) (도 3).
실시예 V
12개 유전자의 서명에 의한 원격 전이의 예측
두번째 예측 방법은 SOM 클러스터 I 내의 유전자들로부터 로지스틱 회귀 분석에 의해 선택된 12개의 유전자를 기초로 하였다. 원격 전이에 대한 저위험의 확률을 계산하는데 사용된 등식이 표 2에 요약된다. 12개의 유전자는 표 5에 열거된다. 12개-유전자 예측 규칙을 독립적인 테스트 셋트 사례 (n=42)에 적용했을 때, 높은 전이 위험에 대한 특이성, 민감도 및 전체적인 정확성은 각각 85％ (11/13), 72％ (21/29) 및 76％ (32/42)였다. 12개-유전자 예측물에 대해, 연관성에 대한 피셔의 정확 검증 (p=0.0008)으로 52개-유전자 예측물과 유사한 로버스트성이 확인되었다. 원격 전이 및 더 짧은 전체적인 생존에 대한 예측된 고위험 서명 군과 예측된 저위험 서명 군 간의 추정된 위험 비율은 각각 8.2 (p=0.006, 95％ 신뢰 구간 1.8-37.4) 및 6.3 (p=0.02, 95％ 신뢰 구간 1.3-29.7)였다.
12개-유전자 예측물에 의해 저위험 (n=23) 또는 고위험 (n=19)으로 예측된 사례들을 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존에 대해 비교했을 때, 결과는 원격 전이에 대한 위험이 높은 것으로 예측된 환자에 대해 유의하게 더 짧은 전이가 없는 생존 (p=0.0007) 및 전체적인 생존 (p=0.007)을 나타냈다 (도 4).
실시예 VI
조합 서명에 의한 원격 전이의 예측
실시예 IV 및 V의 2가지 예측 방법의 결과를 독립적인 테스트 셋트 사례에서 이들의 부합성에 대해 분석했을 때, 양쪽 방법에 의해 22개의 사례 (52％)는 저위험으로 예측되었고, 12개의 사례 (29％)는 고위험으로 예측되었다 (표 6). 8개의 사례 (19％)는 2가지 방법 간에 비부합성이었고, 불확정으로 간주되었다. 부합 사 례 (n=34) 중에서, 5개는 부정확하게 예측되었다. 3개의 사례는 거짓 양성이었고, 2개는 거짓 음성이었다. 따라서, 전체적인 정확성은 85％ (29/34)였다. 원격 전이 및 더 짧은 전체적인 생존에 대한 예측된 고위험 서명 군과 예측된 저위험 서명 군 간의 추정된 위험 비율은 각각 11.1 (p=0.002, 95％ 신뢰 구간 2.4-52.4) 및 8.5 (p=0.009, 95％ 신뢰 구간 1.7-42.8)였다. 저위험, 고위험 및 불확정으로 예측된 사례들의 생존 분석은 고위험 사례에서 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존이 저위험으로 예측된 사례들에 비해 유의하게 더 불량하였음을 나타냈다 (도 5). 저위험 사례와 불확정 사례 간의 전이가 없는 생존 및 전체적인 생존의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
실시예 VII
III 기 NPC 환자와 IV 기 NPC 환자 간의 생존의 비교
수립된 예측 방법의 잠재적인 임상 효과를 학습하기 위해, 133명의 III기 및 82명의 IVa기 및 IVb기 (IVa/b) NPC 환자의 임상 데이타를 수집하였다. 이러한 환자들 중에서, 90명만이 상기 mRNA 전사물 프로파일링 연구의 일부분이었다. 모든 환자들을 1997년과 2003년 사이에 기관 프로토콜31에 따라 치료하고 정기적으로 추적하였다. TNM III기 또는 IVa/b기의 환자를 원격 전이의 후속 발달에 따라 2개의 군으로 추가로 나누었다. 이러한 4개 군의 환자에 대한 전체적인 생존 및 전이가 없는 생존을 비교하였다. 결과는 원격 전이가 추후에 발달된 III기 질환의 NPC 환자의 전체적인 생존 및 전이가 없는 생존이 원격 전이가 또한 발달된 IVa/b기 질환 의 환자 (n=35)와 유사하였음을 나타냈다 (도 6). 반면에, 원격 전이가 발달되지 않은 III기 (n=106) 또는 IVa/b기 (n=47) 환자의 전체적인 생존은 원격 전이가 있는 환자들에 비해 훨씬 더 양호하였다 (도 6).
결과는 III기 또는 IVa/b 환자 내에 2가지 다른 군이 있었음을 가리켰다. 한 군은 원격 전이가 발달할 위험이 낮았고, 임상 결과가 양호하였다. 나머지 군에서는 최초 치료 후 3년 이내에 원격 전이가 발달되었고, 생존 결과가 불량하였다 (도 6). 이러한 발견은 원격 전이가 발달될 위험이 높은 환자의 정확한 예측이 중요한 예후 암시를 가질 뿐만 아니라, 또한 장기 치료 결과를 개선시키기 위한 새로운 치료 양식을 테스트하기 위한 적절한 환자를 선택하는 수단을 제공한다는 것을 지지한다.
참조문헌
Figure 112008028248725-PCT00003
Figure 112008028248725-PCT00004
Figure 112008028248725-PCT00005
Figure 112008028248725-PCT00006
Figure 112008028248725-PCT00007
Figure 112008028248725-PCT00008
Figure 112008028248725-PCT00009
Figure 112008028248725-PCT00010
Figure 112008028248725-PCT00011
Figure 112008028248725-PCT00012
Figure 112008028248725-PCT00013
Figure 112008028248725-PCT00014
Figure 112008028248725-PCT00015
본원에서 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체적인 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
선행하는 예들은 선행하는 예에서 사용된 것들을 본 발명의 일반적으로 또는 명확하게 기술된 시약 및/또는 작업 조건으로 대체함으로써 유사하게 성공적으로 반복될 수 있다.
상기의 기술로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시켜 이를 다양한 용도 및 조건에 적응시킬 수 있다.

Claims (1)

  1. 비인강 암종이 있는 환자로부터의 샘플에서 표 4에 열거된 52개의 유전자의 발현 프로파일을 표 1의 개별적인 회귀 모델 등식을 사용하여 표 4에 제시된 9개의 유전자 클러스터 각각에 대해 생성된 로짓 점수의 셋트에 적용된 k-최근접 이웃 분류 방법에 의해 생성된 예측 규칙을 사용하여 평가하고;
    표 5에 열거된 12개의 유전자의 발현 프로파일을 하기 예측 규칙
    [원격 전이의 저위험에 대한 확률] =
    Figure 112008028248725-PCT00016
    (식중, 로짓 점수는 표 2의 회귀 모델 등식을 사용하여 상기 12개의 유전자의 발현 프로파일을 기초로 생성된다)
    을 사용하여 평가하고;
    2가지 예측 규칙으로부터의 위험 결과를 비교하여, 상기 방법들 양쪽 모두로부터 결정된 원격 전이의 위험이 낮거나 높은 경우에는 위험이 각각 낮거나 높은 것으로 점수화되고, 상기 결정된 위험이 비부합성인 경우에는 위험이 불확정으로 점수화되는 것
    을 포함하는, 비인강 암종이 있는 환자에서 원격 전이의 위험을 평가하는 방법.
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WO (1) WO2007038402A1 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8338109B2 (en) 2006-11-02 2012-12-25 Mayo Foundation For Medical Education And Research Predicting cancer outcome
WO2009085196A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for correlating genetic markers with prostate cancer risk
CA2618163A1 (en) 2008-02-07 2009-08-07 K. W. Michael Siu Head and neck cancer biomarkers
US9684001B2 (en) 2008-02-07 2017-06-20 Ranju Ralhan Biomarkers for head-and-neck cancers and precancers
EP2806054A1 (en) 2008-05-28 2014-11-26 Genomedx Biosciences Inc. Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer
US10407731B2 (en) 2008-05-30 2019-09-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes
WO2010030167A2 (en) * 2008-09-12 2010-03-18 Cancer Research Initiative Foundation Method of detection and diagnosis of oral and nasopharyngeal cancers
US9495515B1 (en) 2009-12-09 2016-11-15 Veracyte, Inc. Algorithms for disease diagnostics
GB2477705B (en) * 2008-11-17 2014-04-23 Veracyte Inc Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
US10236078B2 (en) 2008-11-17 2019-03-19 Veracyte, Inc. Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue
US9074258B2 (en) 2009-03-04 2015-07-07 Genomedx Biosciences Inc. Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease
EP2427575B1 (en) 2009-05-07 2018-01-24 Veracyte, Inc. Methods for diagnosis of thyroid conditions
US10446272B2 (en) 2009-12-09 2019-10-15 Veracyte, Inc. Methods and compositions for classification of samples
WO2011116380A2 (en) 2010-03-19 2011-09-22 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Hybrid model for the classification of carcinoma subtypes
US9732389B2 (en) 2010-09-03 2017-08-15 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for correlating genetic markers with prostate cancer risk
US9534256B2 (en) 2011-01-06 2017-01-03 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for correlating genetic markers with risk of aggressive prostate cancer
US10513737B2 (en) 2011-12-13 2019-12-24 Decipher Biosciences, Inc. Cancer diagnostics using non-coding transcripts
CN102732484B (zh) * 2012-07-10 2015-04-22 广东医学院 一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系建立方法
CA2881627A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Genomedx Biosciences Inc. Cancer diagnostics using biomarkers
CN103020454A (zh) * 2012-12-15 2013-04-03 中国科学院深圳先进技术研究院 发病关键因素提取与疾病预警方法及系统
KR101711584B1 (ko) * 2012-12-18 2017-03-02 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 변형된 eprs 단백질의 결정 구조 및 이의 결정화 방법
US11976329B2 (en) 2013-03-15 2024-05-07 Veracyte, Inc. Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia
EP3215170A4 (en) 2014-11-05 2018-04-25 Veracyte, Inc. Systems and methods of diagnosing idiopathic pulmonary fibrosis on transbronchial biopsies using machine learning and high dimensional transcriptional data
EP3504348B1 (en) 2016-08-24 2022-12-14 Decipher Biosciences, Inc. Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy
US11208697B2 (en) 2017-01-20 2021-12-28 Decipher Biosciences, Inc. Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer
WO2018165600A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genomedx Biosciences, Inc. Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy
US11078542B2 (en) 2017-05-12 2021-08-03 Decipher Biosciences, Inc. Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor aggressiveness
US11217329B1 (en) 2017-06-23 2022-01-04 Veracyte, Inc. Methods and systems for determining biological sample integrity
CN109801680B (zh) * 2018-12-03 2023-02-28 广州中医药大学(广州中医药研究院) 基于tcga数据库的肿瘤转移复发预测方法及系统

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004537261A (ja) 2000-12-08 2004-12-16 イプソゲン 候補遺伝子のアレイを用いた原発性乳がんの遺伝子発現プロファイリング
US20030014539A1 (en) * 2001-06-12 2003-01-16 Reznick Josh L. System and method for traffic management
GB0201498D0 (en) * 2002-01-23 2002-03-13 Biotech Res Ventures Pte Ltd Materials and methods for treating cancer
US20040009518A1 (en) * 2002-05-14 2004-01-15 The Chinese University Of Hong Kong Methods for evaluating a disease condition by nucleic acid detection and fractionation
CN1482256A (zh) * 2002-09-13 2004-03-17 中南大学 鼻咽癌分子标志物—brd7试剂盒
CN1445546A (zh) * 2003-01-08 2003-10-01 中山大学肿瘤防治中心 鼻咽癌早期诊断试剂盒

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