BRPI0611454A2 - mutação em genes oas1 - Google Patents

Abstract

MUTAçãO EM GENES QAS1 Seqüências de aminoácido modificadas de proteínas QASi em primatas não-humanos e genes relacionados às mesmas são proporcionados.

Description

"MUTAÇÃO EM GENES OAS1"

DESCRIÇÃO

1. Campo Técnico

A presente invenção se refere a um método para de-tecção de uma mutação em um gene de sintetase de oligoadeni-Iato humano ou de primata não-humano e à proteínas OSAl ten-do pelo menos uma modificação.

2. Antecedentes da Invenção

Uma série de doenças foram identificadas até o mo-mento nas quais há resistência natural à infecção na popula-ção humana. Alter e Moyer, J. Acquir. Immune Defic. Syndr.Hum Retrovirol. 18 Supl. 1: S6-10 (1998) reportam taxas deinfecção viral hepatite C (HCV) tão altas quanto 90% em gru-pos de risco, tais como usuários de drogas injetáveis. Con-tudo, o mecanismo pelo qual os 10% restantes aparentementesão resistentes à infecção não foi identificado na literatu-ra. Proteínas que exercem um papel em infecção HCV incluemas sintetases de 2',5' oligoadenilato. OASs são proteínasinduzidas por interferon caracterizadas por sua capacidadede catalisar a síntese de 2',5' oligômeros de adenosina (2-5As) . Hovanessian e colaboradores, EMBO 6: 1273-1280 (1987)descobriram que células humanas tratadas com interferon con-têm várias OASs correspondendo à proteínas de 40 (0AS1), 46(OASl), 69 e 100 kD. Marie e colaboradores, Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 160: 580-587 £1989) geraram anticorpospoliclonais altamente específicos contra p69, a OAS de 69kD. Através de seleção de uma biblioteca de expressão de cé-lulas humanas tratadas com interferon com os anticorpos an-ti-p69, Marie e Hovanessian, J. Biol. Chem. 267: 9933-9939(1992) isolaram um cDNA de 0AS2 parcial. Eles selecionarambibliotecas adicionais com o cDNA parcial e recuperaramcDNAs que codificam duas isoformas de OAS2. A menor isoformaé codificada por dois mRNAs que diferem quanto ao comprimen-to da região 3' não traduzida.

Análise por Northern blot revelou que 0AS2 é ex-pressa como quatro mRNAs induzidos por interferon em célulashumanas. As proteínas 0AS2 previstas têm uma seqüência comumde 683 aminoácidos e diferentes términos 3'. De acordo comSDS-PAGE de produtos de transcrição/tradução in vitro, duasformas têm massas moleculares de 69 e 71 kD. Ambas as iso-formas exibiam atividade de OAS in vitro. Análise de seqüên-cia indicou que a 0AS2 contém dois domínios OASl-homólogosseparados por uma região ligante putativa rica em prolina.

Os domínios N- e C-terminais são 41% e 53% idênticos à 0AS1,respectivamente.

Através de hibridização por fluorescência in situe através de inclusão dentro de clones mapeados, Hovanian ecolaboradores, Genomics 52: 267-277 (1998) determinaram queos genes de 0AS1, 0AS2 e 0AS3 são agrupados com uma regiãode 130 kb sobre 12q24.2. 2-5As se liga a e ativa RNAse I, aqual degrada RNAs virais e celulares, levando à inibição desíntese de proteína celular e falha da replicação viral.

Um quarto gene de OAS humana, referido como 0ASL,difere do OASl, 0AS2 e 0AS3 pelo fato de que o 0ASL carecede atividade enzimática. 0 gene de OASL codifica uma proteí-na com dois domínios composta de uma unidade OAS fundida aum domínio C-terminal de 164 aminoácidos que é homólogo auma repetição aleatória de ubiquitina (Eskildsen e colabora-dores, Nuc. Acids Res. 31: 3166-3173, 2003; Kakuta e colabo-radores, J. Interferon & Cytokine Res. 22: 981-993, 2002).

Em virtude de seu papel na inibição de replicaçãoviral e infecção viral, há uma necessidade na técnica pormétodos e composições que suprimem a replicação viral rela-cionada à atividade de 0AS1, incluindo uma necessidade pro-funda por terapias baseadas em inibidor que suprimem a re-plicação de HCV.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à detecção de muta-ções relacionadas à resistência à hepatite C as quais podemser caracterizadas como mutações no gene de sintetase deoligoadenilato 1. Em uma modalidade, um método de seleçãogenética é considerado. O método compreende ensaio de umaamostra de ácido nucleico isolada de um ser humano ou prima-ta não-humano com relação à presença de uma mutação do genede sintetase de oligoadenilato 1 que ;causa uma modificaçãode aminoácido em uma ou mais das posições 1, 24, 25, 28, 31,36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113, 114, 115,116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161, 162, 166,175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279, 282, 284,288, 289, 292, 295, 314, 315 e 335 para todas as formas desintetase de oligoadenilato 1 (OASl) (incluindo, sem limita-ção, SEQ ID NO: 1).

Em uma outra modalidade, um ;método de seleção ge-nética é considerado. 0 método compreende ensaio de umaamostra de ácido nucleico isolada de um ser humano ou prima-ta não-humano com relação à presença de uma mutação no genede sintetase de oligoadenilato 1 que causa uma modificaçãode aminoácido na posição 363 para todas as formas de sinte-tase de oligoadenilato 1 que são carboxila-término homólogasao acesso ao Genbank NP_002525.1 (incluindo, sem limitação,SEQ ID NO: 3).

Em ainda uma outra modalidade, um método de sele-ção genética é considerado. 0 método compreende ensaio deuma amostra de ácido nucleico isolada de um ser humano ouprimata não-humano com relação à presença de uma mutação dogene de sintetase de oligoadenilato 1 que causa uma modifi-cação de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoáci-do 347, 350, 352, 353, 354, 356, 357, 361, 363, 364, 365,369, 371, 373, 374, 375, 378, 379, 382, 388, 389 ou 394 paratodas as formas de sintetase de oligoadenilato 1 que sãocarboxila-término homólogas ao acesso ao Genbank NP_002525.1(incluindo, sem limitação, SEQ ID NO: 2) .

Em ainda uma outra modalidade, um método de sele-ção genética é considerado. O .método compreende ensaio deuma amostra de ácido nucleico isolada de um ser humano ouprimata não-humano com relação à presença de uma mutação dogene de sintetase de oligoadenilato 1 que causa uma modifi-cação de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoáci-do 347, 361, 364, 372, 384, 385 ou 399 para todas as formasde sintetase de oligoadenilato · 1 que são carboxila-términohomólogas ao acesso ao Genbank NP_001027581.1 (incluindo,sem limitação, SEQ ID NO: 4).Era uma outra modalidade, a invenção proporcionauma proteína tendo pelo menos uma modificação de aminoácidoem posições 1, 24, 25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74,104, 108, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130,139, 142, 160, 161, 162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248,250, 254, 274, 279, 282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315 e335 para todas as formas de sintetase de oligoadenilato 1(OASl) (incluindo, sem limitação, SEQ ID NO: 1) e uso daproteína para preparar um diagnóstico para resistência à in-fecção viral, de preferência infecção flaviviral, mais pre-ferivelmente infecção hepatite C. Em modalidades específi-cas, o diagnóstico é um anticorpo.

Em uma outra modalidade, a invenção proporcionauma proteína OASl tendo uma modificação de aminoácido na po-sição 363 para todas as formas de sintetase de oligoadenila-to 1 que são carboxila-término homólogas ao acesso aoGenbank NP_002525.1 (incluindo, sem limitação, SEQ ID NO: 3)e uso da proteína para preparar um diagnóstico para resis-tência à infecção viral, de preferência infecção flaviviral,mais preferivelmente infecção hepatite C. Em modalidades es-pecíficas, o diagnóstico é um anticorpo. Em uma outra moda-lidade, a invenção proporciona uma proteína OASl tendo pelomenos uma modificação de aminoácido em posições 347, 350,352, 353, 354, 356, 357, 361, 363, 364, 365, 369, 371, 373,374, 375, 378, 379, 382, 388, 389 e 394 para todas as formasde sintetase de oligoadenilato 1 que são carboxila-términohomólogas ao acesso ao Genbank NP_058132.1 (incluindo, semlimitação, SEQ ID NO: 2) e uso da proteína para preparar umdiagnóstico para resistência à infecção viral, de preferên-cia infecção flaviviral, mais preferivelmente infecção hepa-tite C. Em modalidades especificas, o diagnóstico é um anti-corpo.

Em ainda outra modalidade, a invenção proporcionauma proteína OASl tendo pelo menos uma modificação de amino-ácido em posições 347, 361, 364, 372, 384, 385 ou 399 paratodas as formas de sintetase de oligoadenilato 1 que sãocarboxila-término homólogas ao acesso ao GenbankNP_01027581.1 (incluindo, sem limitação, SEQ ID NO: 4) e usoda proteína para preparar um diagnóstico para resistência àinfecção viral, de preferência infecção flaviviral, maispreferivelmente infecção hepatite G. Em modalidades especí-ficas, o diagnóstico é um anticorpo.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou inibição deinfecção por um vírus, de preferência um flavivírus, maispreferivelmente vírus da hepatite C, em que o composto tera-pêutico é uma proteína tendo pelo menos uma modificação deaminoácido de acordo com a invenção. Em outras modalidades,o composto terapêutico é um polinucleotídeo, tal como DNA ouRNA, que codifica a proteína.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou inibição deinfecção por um vírus, de preferência um flavivírus, maispreferivelmente um vírus da hepatite C, em que o compostoterapêutico é uma proteína codificada por OASl da invençãotendo uma ou mais das modificações de aminoácido divulgadas.Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou inibição deinfecção por um virus, de preferência um flavivirus, maispreferivelmente virus da hepatite C, em que o composto tera-pêutico imita os efeitos benéficos de pelo menos uma mutaçãoda invenção. 0 composto terapêutico pode ser uma pequena mo-lécula, proteína, peptídeo, molécula de DNA ou RNA ou anti-corpo.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou tratamentode câncer, de preferência câncer de próstata, em que o com-posto terapêutico é uma proteína codificada por um gene deOASl tendo pelo menos uma modificação da invenção. Em outrasmodalidades, o composto terapêutico é um polinucleotídeo,tal como DNA ou RNA, que codifica a proteína.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou tratamentode câncer, de- preferência câncer de próstata, em que o com-posto terapêutico é uma proteína OASl tendo pelo menos umamodificação de aminoácido da invenção.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção propor-ciona um composto terapêutico para prevenção ou tratamentode câncer, de preferência câncer de próstata, em que o com-posto terapêutico imita os efeitos benéficos de pelo menosuma mutação da invenção. 0 composto terapêutico pode ser umapequena molécula, proteína, peptídeo, molécula de DNA ou RNAou anticorpo.;

Em outras modalidades, o composto terapêutico écapaz de inibição da atividade de OASl ou pelo menos umasub-região ou sub-função da proteína toda e tais compostossão representados por moléculas anti-senso, ribozimas e mo-léculas de RNAi capazes de ligação especificamente a polinu-cleotídeos de OASl e por anticorpos e fragmentos dos mesmoscapazes de ligação especificamente à proteínas e polipeptí-deos de OASl.

A presente invenção proporciona, em uma modalida-de, inibidores de OASl. Inibidores da invenção incluem, masnão estão limitados a, moléculas anti-senso, ribozimas,RNAi, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, proteínas oupolipeptídeos, bem como pequenas moléculas. Moléculas anti-senso exemplificativas compreendem pelo menos 10, 15 ou 20nucleotídeos consecutivos de ou que se hibridizam, sob con-dições estringentes, ao polinucleotídeo que codifica OASltendo pelo menos uma modificação de aminoácido da invenção.

Em ainda uma outra modalidade, são previstos ini-bidores de OASl que se ligam especificamente à região dapresente invenção definida por um polipeptídeo OASl tendouma modificação de aminoácido da invenção, inibidores da in-venção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, frag-mentos de anticorpo, pequenas moléculas, proteínas ou poli-peptídeos.

Em ainda uma outra modalidade, são previstos ini-bidores de OASl que são compreendidos de moléculas anti-senso ou RNAi que se ligam ou hibridizam especificamente aum polinucleotídeo que codifica uma proteína OASl tendo pelomenos uma modificação de aminoácido da invenção.Em outras modalidades, são proporcionadas composi-ções que compreendem um ou mais inibidores de OASl em umveiculo farmaceuticamente aceitável.

Modalidades adicionais proporcionam métodos de di-minuição de expressão ou atividade biológica do gene deOASl.

Modalidades adicionais proporcionam métodos de au-mento ou diminuição especifica da expressão de determinadasformas do gene de OASl tendo pelo menos uma mutação, confor-me divulgado pela invenção.

A invenção proporciona um oligonucleotideo anti-senso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosideomodificada.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotideoanti-senso tendo uma ligação de fosforotioato.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotideoanti-senso compreendendo pelo menos uma porção de açúcar mo-dificada.

A invenção também proporciona um oligonucleotideoanti-senso compreendendo pelo menos uma porção de açúcar mo-dificada a qual é uma porção de 2'-0-metil açúcar.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotideoanti-senso compreendendo pelo menos uma nucleobase modificada.

A invenção ainda proporciona um oligonucleotideoanti-senso tendo uma nucleobase modificada em que a nucleo-base modificada é 5-metilcitosina.

A invenção também proporciona um composto anti-senso em que o composto anti-senso é um oligonucleotídeoquimérico.

A invenção proporciona um método de inibição daexpressão de OASl humana em células ou tecidos humanos com-preendendo contato das células ou tecidos in vivo com umcomposto anti-senso ou uma ribozima de 8 a 35 nucleotideosde comprimento objetivada a uma molécula de ácido nucleicoque codifica OASl humana, de modo que expressão de OASl hu-mana é inibida.

A invenção ainda proporciona um método de diminui-ção ou aumento de expressão de formas especificas de OASl invivo, tais formas sendo definidas por terem pelo menos umamutação em uma posição de acordo com a invenção, usando com-postos anti-senso ou RNAi ou ribozimas.

A invenção ainda proporciona um método de modula-ção do crescimento de células cancerígenas compreendendocontato das células cancerígenas in vivo com um composto an-ti-senso ou ribozima de 8 a 35 nucleotideos de comprimentoobjetivada a uma molécula de ácido nucleico que codificaOASl humana, de modo que expressão de OASl humana é inibida.

A invenção ainda proporciona identificação de re-giões alvo de polinucleotídeos de OASl.

A invenção também proporciona sondas rotuladaspara identificação de polinucleotídeos de OASl através dehibridização in situ.

A invenção proporciona o uso de um inibidor deOASl de acordo com a invenção para preparar um medicamentopara prevenção ou inibição de infecção HCV.A invenção ainda proporciona dirigir um inibidorde OASl à regiões especificas da proteína OASl ou à funçõesespecíficas da proteína.

A invenção também proporciona uma composição far-macêutica para inibição de expressão de OASl compreendendoum oligonucleotídeo anti-senso de acordo com a invenção emuma mistura com um veículo ou diluente fisiologicamenteaceitável.

A invenção ainda proporciona uma ribozima capaz declivagem especificamente de RNA de OASl e uma composiçãofarmacêutica compreendendo a ribozima.

A invenção também proporciona inibidores de OASlde pequena molécula, em que os inibidores são capazes de re-duzir a atividade de OASl ou de reduzir ou impedir a expres-são de mRNA de OASl.

A invenção ainda proporciona inibidores de OASlque modificam outras funções específicas da proteína que nãoa síntese de 2'-5' oligoadenilatos, tais funções incluindointeração com outras proteínas, tal como proteína NS5A dovírus da hepatite C.

A invenção ainda proporciona compostos que alterammodificações pós-traducionais de OASl incluindo, mas não li-mitado a, glicosilação e fosforilação.

A invenção ainda proporciona um método de seleçãogenética humana para identificação de uma mutação do gene desintetase de oligoadenilato compreendendo: (a) tratamento,sob condições de amplificação, de uma amostra de DNA genômi-co de um ser humano com um par de primer de reação em cadeiade polimerase (PCR) para amplificação de uma região de DNAgenômico humano contendo pelo menos uma mutação de um genede OASl de acordo com a invenção, o referido tratamento pro-duzindo um produto da amplificação contendo a referida regi-ão; e (b) detecção, no produto da amplificação da etapa (a),da presença de uma mutação de nucleotideo em uma posição denucleotideo da invenção, desse modo, identificando a referi-da mutação.

A invenção também se refere a um método para de-tecção, em um ser humano, de um alelo de doença com resis-tência à infecção hepatite C contendo uma mutação compreen-dendo uma substituição de um nucleotideo não do tipo silves-tre por um nucleotideo do tipo silvestre em uma posição denucleotideo correspondendo a uma modificação de aminoácidoda invenção na proteína OASl codificada pelo gene de sinte-tase de oligoadenilato (OASl), método o qual compreende: (a)formação de uma mistura de reação em cadeia de polimerase(PCR) através de combinação, em um tampão de PCR, de umaamostra de DNA genômico do referido ser humano e um par deprimer de PCR específico ao gene de sintetase de oligoadeni-lato; (b) sujeição da mistura de PCR a uma pluralidade determociclos de PCR para produzir um produto da amplificaçãodo gene de sintetase de oligoadenilato; e (c) tratamento,sob condições de hibridização, de produtos produzidos naetapa (b) , com uma sonda capaz de detectar a referida muta-ção.

Também proporcionado é um inibidor de OASl seleci-onado do grupo consistindo de um oligonucleotídeo anti-senso, uma ribozima, um pequeno RNA inibitório (RNAi), umaproteína, um polipeptideo, um anticorpo e uma pequena molé-cula. 0 inibidor isolado pode ser uma molécula anti-senso ouo complemento da mesma compreendendo pelo menos 15 ácidosnucleicos consecutivos de uma seqüência de polinucleotídeocorrespondendo a uma mutação do gene de OASl associada a umasubstituição de aminoácido da invenção.

0 inibidor de OASl isolado pode ser selecionado dogrupo consistindo de um anticorpo e um fragmento de anticor-po. Também proporcionada é uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidorde OASl em um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção também se refere a um método de inibi-ção da expressão de OASl em uma célula de mamífero compreen-dendo administração, à célula, de um inibidor de OASl sele-cionado do grupo consistindo de um oligonucleotídeo anti-senso, uma ribozima, uma proteína, um RNAi, um polipeptideo,um anticorpo e uma pequena molécula.

A invenção ainda se refere a um método de inibiçãoda expressão do gene de OASl em um indivíduo compreendendoadministração, ao indivíduo, em um veículo farmaceuticamenteaceitável, de uma quantidade de um oligonucleotídeo anti-senso a qual é eficaz para se hibridizar especificamente atoda ou parte de uma seqüência de ácido nucleico alvo sele-cionada derivada do referido gene de OASl.

A invenção ainda se refere a um método de preven-ção de infecção por um flavivírus em um ser humano suscetí-vel à infecção compreendendo administração, ao ser humano,de um inibidor de OASl selecionado do grupo consistindo deum oligonucleotideo anti-senso, uma ribozima, um RNAi, umaproteína, um polipeptídeo, um anticorpo e uma pequena molé-cula, em que o referido inibidor de OASl impede infecçãopelo referido flavivírus.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é uma seqüência de aminoácido de umaforma terapêutica de proteína OASl (SEQ ID NO: 1).

A Figura 2 é uma tabela listando substituições deaminoácido úteis em todas as formas terapêuticas de OASl.

A Figura 3 é uma tabela listando modificações deaminoácido de OASl de primata úteis em formas terapêuticasde OASl. Posições indicadas com * se referem à formas deOASl que são carboxila-término homólogas ao acesso aoGenbank NP_002525.1. Posições indicadas com + se referem àformas de OASl que são carboxila-término homólogas ao acessoao Genbank NP_0581321. Posições indicadas com Λ se referem àformas de OASl que são carboxila-término homólogas ao acessoao Genbank NP_01027581.1.

A Figura 4 é um gráfico indicando as posições demutações de genes OASl de primata e correspondendo à modifi-cações de aminoácido.

A Figura 5 é uma listagem de isoformas de OASladicionais da presente invenção, incluindo formas humanas ede primata não-humano. Também proporcionadas são mutações deisoformas de primata. Essas isoformas, quer sozinhas ou jun-to com quaisquer mutações identificadas na presente inven-ção, são úteis para fins diagnósticos, terapêuticos e outrosdescritos aqui.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à novas mutações nogene de sintetase de oligoadenilato 1, ao uso dessas muta-ções para diagnóstico de suscetibilidade ou resistência àinfecção viral, à proteínas codificadas por um gene tendouma mutação de acordo com a invenção e à prevenção ou inibi-ção de infecção viral usando as proteínas, anticorpos e áci-dos nucleicos relacionados. Essas mutações se correlacionamcom resistência do portador à infecção por flavivírus, par-ticularmente vírus da hepatite C.

Muito da pesquisa médica atual está focalizada so-bre a identificação de mutações e defeitos que causam oucontribuem para a doença. Tal pesquisa é projetada para le-var a compostos e métodos de tratamento objetivados ao esta-do doentio. Menos atenção tem sido dada ao estudo das in-fluências genéticas que permitem que as pessoas se mantenhamsaudáveis, a despeito de exposição a agentes infecciosos eoutros fatores de risco. A presente invenção representa umaaplicação com sucesso de um processo desenvolvido pelos in-ventores através do qual populações específicas de seres hu-manos são verificadas e analisadas de forma a descobrir va-riações ou mutações genéticas que conferem resistência à do-ença. A identificação de um segmento de sub-população quetem uma resistência natural a uma doença ou condição bioló-gica particular ainda permite a identificação de genes eproteínas que são alvos adequados para intervenção farmacêu-tica, avaliação diagnostica ou prevenção, tal como vacinaçãoprofilática.

Um segmento de sub-população foi anteriormenteidentificado e divulgado no pedido co-pendente No. de Série10/972.135 e era compreendido de indivíduos que, a despeitode exposição repetida ao vírus da hepatite C (HCV), todavia,permaneceram soro-negativos, enquanto que companheiros setornaram infectados (soro-positivos) . As populações estuda-das incluíam pacientes hemofílicos submetidos à transfusõesde sangue repetidas e usuários de drogas intravenosas que setornaram expostos ao compartilharem agulhas e outros fatoresde risco.

A presente divulgação proporciona mutações identi-ficadas em genes OASl de primatas não-humanos, conforme des-crito no Exemplo 1.

O Pedido No. de Série 10/972.135 proporciona di-vulgação relacionada à infecção HCV; definições; modos depraticar a invenção; análise de polinucleotídeo; preparo deprimers de polinucleotídeo; reação em cadeia de polimerasevanálise de seqüência de ácido nucleico; detecção de seqüên-cias alvo membrana-imobilizadas; técnicas de exploração paradetecção de substituições de base; agentes terapêuticos pararestaurar e/ou intensificar função de OAS1; agentes terapêu-ticos para inibição de função de OASl; ribozimas; RNAi; pro-teínas e polipeptídeos; pequenas moléculas; métodos paraavaliação da eficácia de inibidores de OAS1; e composiçõesfarmacêuticas. 0 Pedido No. de Série 10/972.135 é aqui in-corporado por referência em sua totalidade.

Os polipeptídeos da presente invenção são capazes,como parte de sua função nativa, de transduzir através deuma membrana celular e mediar seus efeitos antivirais na au-sência de um vetor de distribuição ou veiculo de expressão.

As propriedades de transdução celular de proteínas básicaspositivamente carregadas foram anteriormente descritas e sãobem conhecidas por aqueles habilitados na técnica (Ryser eHancock, Science. 22 de Outubro de 1965; 150 (695): 501-3).

No caso onde os polipeptídeos são preparados comouma formulação líquida e administrados através de injeção,de preferência, a solução é uma solução salina isotônicacontendo cloreto de sódio a 140 milimolares e cálcio a 10milimolares em um pH de 7,4. A injeção pode ser administra-da, por exemplo, em uma quantidade terapeuticamente eficaz,de preferência em uma dose de cerca de 1 μς/kg de peso cor-poral a cerca de 5 mg/kg de peso corporal diariamente, Ie-vando-se em conta as vias de administração, saúde do pacien-te, etc.

0(s) polipeptídeo(s) da presente invenção pode(m)ser empregado(s) em combinação com um veículo farmacêuticoadequado. Tais composições compreendem uma quantidade tera-peuticamente eficaz da proteína e um veículo ou excipientefarmaceuticamente aceitável. Tal veículo inclui, mas nãoestá limitado a, solução salina, solução salina tamponada,dextrose, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. Aformulação deverá se adequar ao modo de administração.

0(s) polipeptídeo(s) da presente invenção- tambémpode(m) ser modificados através de ligação química do poli-peptídeo a uma ou mais porções ou conjugados que intensifi-cam a atividade, distribuição celular ou captação celulardo(s) polipeptideo(s). Tais porções ou conjugados incluemlipidios, tais como colesterol, ácido cólico, tioéter, ca-deias alifáticas, fosfolipidios e seus derivados, poliami-nas, polietileno glicol (PEG), porções palmitila e outrasconforme divulgado, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos.5.514.758, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481,5.587.371, 5.597.696 e 5.958.773.

Os polipeptideos da presente invenção também podemser modificados aos tipos de célula alvo especifica para umaindicação de doença em particular incluindo, mas não limita-do a, células hepáticas no caso de infecção hepatite C. Con-forme pode ser apreciado por aqueles habilitados na técnica,foram descritos métodos adequados que obtém as metas de ob-jetivação descritas e incluem, sem limitação, objetivaçãolipossômica, endocitose receptor-mediada e ligação de anti-corpo-antigeno. Em uma modalidade, o receptor de asialogli-coproteina pode ser usado para objetivar células hepáticasatravés da adição de uma porção galactose ao(s) polipeptí-deo(s). Em outra modalidade, porções manose podem ser conju-gadas ao(s) polipeptideo(s) de forma a objetivar o receptorde manose encontrado sobre macrófagos e células hepáticas.Por exemplo, o(s) polipeptideo(s} da presente invenção podeser objetivado à células hepáticas através de encapsulaçãodentro de lipossomas, tais lipossomas sendo conjugados à ga-lactose para objetivação ao receptor de asialoglicoproteina.

A invenção também proporciona um pacote ou kitfarmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios comum ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas dainvenção. Associada a tal(is) recipiente(s) pode estar umaadvertência na forma prescrita por uma agência governamentalque regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos far-macêuticos ou biológicos, advertência a qual reflete aprova-ção pela agência de fabricação, uso ou venda para adminis-tração humana. Além disso, o polipeptideo da presente inven-ção pode ser empregado em conjunto com outros compostos te-rapêuticos.

Quando o(s) polipeptideo(s) da presente invençãoé(são) usado(s) como um produto farmacêutico, ele(s) pode(m)ser fornecido(s) a mamífero, em um veículo adequado. Quandoos polipeptídeos da presente invenção são usados como umproduto farmacêutico, conforme descrito acima, eles são for-necidos, por exemplo, em doses terapeuticamente eficazes decerca de 10 μg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg depeso corporal diariamente, levando-se em conta as vias deadministração, saúde do paciente, etc. A quantidade forneci-da é, de preferência, adequada para obter prevenção ou ini-bição de infecção por um vírus, de preferência um flaviví-rus, mais preferivelmente RSV e HCV, prevenção ou tratamentode câncer, inflamação, diabetes ou outras doenças.

As proteínas, seus fragmentos ou outros derivadosou análogos dos mesmos ou células expressando os mesmos po-dem ser usados como um imunogênio para produzir anticorposaos mesmos. Esses anticorpos podem ser, por exemplo, poli-clonais, monoclonais, quiméricos, com cadeia simples, frag-mentos Fab ou o produto de uma biblioteca de expressão deFab. Vários procedimentos conhecidos na técnica podem serusados para a produção de anticorpos policlonais.

Anticorpos gerados contra o(s) polipeptideo(s) dapresente invenção podem ser obtidos através de injeção dire-ta do polipeptideo em um animal ou através de administraçãodo polipeptideo a um animal, de preferência um não-humano. 0anticorpo assim obtido, então, se ligará ao polipeptideo emsi. Dessa maneira, mesmo uma seqüência que codifica apenasum fragmento do polipeptideo pode ser usada para gerar anti-corpos que se ligam ao polipeptideo nativo todo. Além disso,um painel de tais anticorpos específicos a um grande númerode polipeptídeos pode ser usado.

Para preparo de anticorpos monoclonais, qualquertécnica a qual proporciona anticorpos produzidos através deculturas de linhagem de células contínuas pode ser usada.Exemplos incluem a técnica de hibridoma (Kohler e Milstein,1975, Nature, 256: 495-597), a técnica de trioma, a técnicade hibridoma de células B humanas - (Kozbor, e colaboradores,1983, Immunology Today 4: 72) e a técnica de hibridoma-EBVpara produzir anticorpos monoclonais humanos (Coe e colabo-radores, 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy,Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96).

Técnicas descritas para a produção de anticorposcom cadeia simples (Pat. U.S. No. 4.946.778) podem ser adap-tadas para produzir anticorpos com cadeia simples em produ-tos de polipeptideo imunogênico da-presente invenção.

Os anticorpos podem ser usados em métodos referen-tes à localização e atividade das seqüências de proteína dainvenção, por exemplo, para formação de imagem dessas pro-teínas, medição dos níveis das mesmas em amostras fisiológi-cas apropriadas e semelhantes.

A invenção proporciona polipeptídeos que diferemdos polipeptídeos das Figuras 1-5 por 1 a 34 aminoácidos,tais diferenças podem incluir substituições, inserções, de-leções, a incorporação de aminoácidos modificados ou deriva-dos de aminoácido e a adição ou deleção de aminoácidos do C-término ou N-término dos polipeptídeos. A invenção proporci-ona usos terapêuticos e profiláticos desses polipeptídeosincluindo, mas não limitado a, o tratamento de infecção vi-ral, neoplasma, câncer, diabetes e promoção de crescimento ediferenciação celular e regeneração tecidual. A invençãoproporciona polinucleotídeos que codificam os polipeptídeosda invenção e usos dos mesmos incluindo, mas não limitado a,usos na fabricação dos polipeptídeos, como terapias genéti-cas, como ferramentas diagnosticas, etc.

Composições farmacêuticas

A invenção proporciona composições farmacêuticasdos polipeptídeos como ingrediente ativos para uma aplicaçãoterapêutica. Essas composições podem também ser usadas nométodo da presente invenção. Em geral, a composição farma-cêutica para inibição de infecção viral, câncer, neoplasma,inflamação ou outra doença em um mamífero ou indivíduo in-clui uma quantidade eficaz de pelo menos um polipeptídeoconforme descrito acima necessária para a prática d antígenoou um fragmento do mesmo mostrando ter o mesmo efeito e umveículo ou diluente farmacêutica ou fisiologicamente aceitá-vel. De acordo com a presente invenção, uma composição far-macêutica pode ser composta de dois ou mais dos polipeptí-deos das Figuras 1-5 em combinação. A composição farmacêuti-ca pode ainda ser composta de um único polipeptideo que con-tém uma ou mais das modificações das Figuras 1-5 dentro deuma molécula continua.

As composições podem ser administradas oralmente,subcutaneamente ou parenteralmente, incluindo intravenosa,intra-arterial, intramuscular, intraperitonealmente e admi-nistração intranasal, bem, como técnicas de infusão e intra-tecal, conforme requerido. Os veículos, diluentes, adjuvan-tes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis, bem comoveículos para implante, geralmente se referem a enchedores,diluentes ou material de encapsulação sólidos ou líquidosnão tóxicos que não reagem com os ingredientes ativos da in-venção. lipídios catiônicos também podem ser incluídos nacomposição para facilitar captação do polipeptideo. Implan-tes dos compostos também são úteis. Em geral, as composiçõesfarmacêuticas são estéreis.

A presente invenção se refere à composições dospolipeptídeos aos quais um rótulo detectável é preso, talcomo uma molécula fluorescente, quimioluminescente ou radio-ativa.

Outro exemplo é uma composição farmacêutica a qualpode ser formulada através de técnicas conhecidas usando ma-teriais conhecidos, veja Remington's Pharmaceutical Scien-ces, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042)páginas 1435-1712, a qual é aqui incorporada por referência.Geralmente, a formulação dependerá de uma variedade de fato-res, tais como administração, estabilidade, preocupações deprodução e outros fatores. Os polipeptideos das Figuras 1-5podem ser administrados através de injeção ou através de ad-ministração pulmonar via inalação. Formas de dosagem entéri-cas também podem estar disponíveis e, portanto, administra-ção oral pode ser eficaz. Os polipeptideos da invenção podemser inseridos em lipossomas ou outros microveículos paradistribuição e podem ser formados em géis ou outras composi-ções para liberação sustentada. Embora composições preferi-das variem dependendo do uso para o qual a composição seráempregada, geralmente, para os polipeptideos da presente in-venção, composições farmacêuticas preferidas são aquelaspreparadas para injeção subcutânea ou para administraçãopulmonar via inalação, embora as formulações particularespara cada tipo de administração dependam das característicasdo polipeptídeo específico.

Formulações terapêuticas dos polipeptideos ou con-jugados polipeptídicos da invenção são, tipicamente, admi-nistradas em uma composição que inclui um ou mais veículosou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composi-ções farmacêuticas podem ser preparadas de uma maneira co-nhecida per se na técnica para resultar em um produto farma-cêutico de polipeptídeo que é suficientemente estável ao ar-mazenamento e é adequado para administração a seres humanosou animais.

Os polipeptideos ou conjugados polipeptídicos dainvenção podem ser usados "como estão" e/ou em uma forma desal dos mesmos. Sais adequados incluem, mas não estão limi-tados a, sais com metais alcalinos ou metais alcalinos ter-rosos, tais como sódio, potássio, cálcio e magnésio, bemcomo, por exemplo, sais de zinco. Esses sais ou complexospodem estar presentes como uma estrutura cristalina e/ouamorfa.

"Farmaceuticamente aceitável" significa um veiculoou excipiente que, nas dosagens e concentrações empregadas,não causa quaisquer efeitos indesejados no paciente ao qualeles são administrados. Tais veículos e excipientes farma-ceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (vejaRemington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. R. Gen-naro, Ed., Mack Publishing Company (1990); PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins, S.Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); eHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edição, A. Kibbe,Ed., Phannaceutical Press (2000)).

A composição da invenção pode ser administrada so-zinha ou ; em conjunto com outros agentes terapêuticos. Foimostrado que Ribavirina e interferon alfa, por exemplo, sãoum tratamento eficaz para infecção HCV quando usados em com-binação. Sua eficácia em combinação excede a eficácia dequalquer produto de fármaco quando usado sozinho. As compo-sições da invenção podem ser administradas sozinhas ou emcombinação com interferon, ribavirina e/ou uma variedade depequenas moléculas que estão sendo desenvolvidas contra al-vos virais (proteases virais, polimerase viral, montagem decomplexos de replicação viral) e alvos no hospedeiro (prote-ases do hospedeiro requeridas para processamento viral, quí-nases do hospedeiro requeridas para fosforilação de alvosvirais, tal como NS5A, e inibidores de fatores do hospedeirorequeridos para utilizar eficazmente a IRES viral). Citoci-nas podem ser co-administradas tais como, por exemplo, IL-2,IL- 12, IL-23, IL-27 ou IFN-gama. Esses agentes podem serincorporados como parte da mesma composição farmacêutica oupodem ser administrados separadamente dos polipeptideos ouconjugados da invenção, quer concorrentemente ou de acordocom outro esquema de tratamento. Além disso, os polipepti-deos, conjugados polipeptidicos ou composições da invençãopodem ser usados como um adjuvante a outras terapias.

Um "paciente", para fins da presente invenção, in-clui seres humanos e outros mamíferos. Assim, os métodos sãoaplicáveis à terapia humana e aplicações veterinárias.

A composição farmacêutica compreendendo o poli-peptídeo ou conjugado da invenção pode ser formulada em umavariedade de formas, por exemplo, como um líquido, gel, Iio-fiiizado ou como um sólido comprimido. A forma preferida de-penderá da indicação que está sendo tratada em particular eserá evidente para aqueles habilitados na técnica.

A administração das formulações da presente inven-ção pode ser realizada em uma variedade de formas incluindo,mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosa-mente, intracerebralmente, intranasalmente, transdermicamen-te,· intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar-men-te, intratecalmente, vaginalmente, retalmente, intraocu-larmente ou de qualquer outra maneira aceitável. As formula-ções podem ser administradas continuamente através de infu-são, embora injeção de bolo seja aceitável, usando métodosbem conhecidos na técnica, tais como bombas (por exemplo,bombas osmóticas subcutâneas) ou implante. Em alguns casos,as formulações podem ser diretamente aplicadas como uma so-lução ou spray.

Um exemplo de uma composição farmacêutica é umasolução projetada para administração parenteral. Embora, emmuitos casos, formulações de solução farmacêutica sejam pro-porcionadas na forma liquida, apropriadas para uso imediato,tais formulações parenterais também podem ser proporcionadasna forma congelada ou liofilizada. No primeiro caso, a com-posição deve ser descongelada antes de uso. A última forma éfreqüentemente usada para intensificar a estabilidade docomposto ativo contido na composição sob uma variedade maisampla de condições de armazenamento, uma vez que é reconhe-cido por aqueles habilitados na técnica que preparados Iio-filizados são, geralmente, mais estáveis do que suas contra-partes líquidas. Tais preparados liofilizados são reconsti-tuídos antes de uso através da adição de um ou mais diluen-tes farmaceuticamente aceitáveis adequados, tais como águaestéril para injeção ou solução salina fisiológica estéril

Parenterais podem ser preparados para armazenamen-to como formulações liofilizadas ou soluções aquosas atravésde mistura, conforme apropriado, do polipeptídeo tendo ograu desejado de pureza com um ou mais veículos, excipientesou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis tipicamenteempregados na técnica (todos os quais são denominados "exci-pientes"), por exemplo, agentes de tamponamento, agentes deestabilização, conservantes, isotonificantes, detergentesnão-iônicos, antioxidantes e/ou outros aditivos diversos.

Agentes de tamponamento ajudam a manter o pH nafaixa a qual se aproxima das condições fisiológicas. Elesestão, tipicamente, presentes em uma concentração oscilandode cerca de 2 mM a cerca de 50 mM. Agentes de tamponamentoadequados para uso com a presente invenção incluem ácidosorgânicos e inorgânicos e sais dos mesmos, tais como tampõesde citrato (por exemplo, mistura de citrato monossódico ecitrato dissódico), mistura de ácido citrico-citrato trissó-dico, mistura de ácido citrico-citrato monossódico, etc.),tampões de succinato (por exemplo, mistura de ácido succini-co-succinato monossódico, mistura de ácido succinico-hidróxido de sódio, mistura de ácido succinico-succinatodissódico), tampões de tartrato (por exemplo, ácido tartári-co-tartrato de sódio, mistura de ácido tartárico-tartrato depotássio, mistura de ácido tartárico-hidróxido de sódio,etc.), tampões de fumarato (por exemplo, mistura de ácidofumárico-fumarato monossódico, mistura de ácido fumárico-fumarato dissódico, mistura de fumarato monossódico-fumaratodissódico, etc.), tampões de gluconato (por exemplo, misturade ácido glucônico-gliconato de sódio, mistura de ácido glu-cônico-hidróxido de sódio, mistura de ácido glucônico-gluconato de potássio, etc.), tampão de oxalato (por exem-plo, mistura de ácido oxálico-oxalato de sódio, mistura deácido oxálico-hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico-oxalato de potássio, etc.), tampões de lactato (por exemplo,mistura de ácido láctico-lactato de sódio, mistura de ácidoláctico-hidróxido de sódio, mistura de ácido láctico-lactatode potássio, etc.) e tampões de acetato (por exemplo, mistu-ra de ácido acético-acetato de sódio, mistura de ácido acé-tico-hidróxido de sódio, etc.)· Possibilidades adicionaissão tampões de fosfato, tampões de histidina e sais de tri-metilamina, tal como Tris.

Conservantes são adicionados para retardar o cres-cimento microbiano e são, tipicamente, adicionados em quan-tidades de cerca de 0,2%-l% (peso/v). Conservantes adequadospara uso com a presente invenção incluem fenol, álcool ben-zilico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, clore-to de octadecil dimetilbenzil amônio, haletos de benzalcônio(por exemplo, cloreto, brometo ou iodeto de benzalcônio),cloreto de hexametônio, alquil parabenos, tais como metil oupropil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol e 3-pentanol.

Isotonificantes são adicionados para assegurarisotonicidade de composições líquidas e incluem álcoois deaçúcar poliídricos, de preferência álcoois de açúcar trií-dricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol, arabi-tol, xilitol, sorbitol e manitol. Álcoois poliídricos podemestar presentes em uma quantidade entre 0,1% e 25% em peso,tipicamente 1% a 5%, levando-se em conta as quantidades re-lativas dos outros ingredientes.

Estabilizantes se refere a uma ampla categoria deexcipientes os quais podem oscilar, quanto à função, de umagente de composição de volume a um aditivo o qual solubili-za o agente terapêutico ou ajuda a prevenir desnaturação ouaderência à parede do recipiente. Estabilizantes típicos po-dem ser álcoois de açúcar poliídricos (enumerados acima);aminoácidos, tais como arginina, lisina, glicina, glutamina,asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc., açúcares or-gânicos ou álcoois de anticorpo, tais como lactose, trealo-se, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioino-sitol, galactitol, glicerol e semelhantes, incluindo cicli-tóis, tal como inositol; polietileno glicol; polímeros deaminoácido; agentes de redução contendo enxofre, tais comouréia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio,tioglicerol, alfa-monotioglicerol e tio-sulfato de sódio;polipeptídeos de baixo peso molecular (isto é, <10 resídu-os); proteínas, tais como albumina de soro humano, albuminade soro bovino, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hi-drofílicos, tal como polivinilpirrolidona; monossacarídeos,tais como xilose, manose, frutose e glicose; dissacarídeos,tais como lactose, maltose e sacarose; trissacarídeos, talcomo rafinose e polissacarídeos, tal como dextrana. Estabi-lizantes estão, tipicamente, presentes na faixa de 0,1 a10.000 partes em peso, baseado no peso da proteína ativa.

Tensoativos ou detergentes não-iônicos (também co-nhecidos como "agentes de umedecimento") podem estar presen-tes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem comoproteger o polipeptídeo terapêutico contra agregação agita-ção-induzida, o que também permite que a formulação seja ex-posta à tensão de superfície de cisalhamento sem causar des-naturação do polipeptideo. Tensoativos não-iônicos adequadosincluem polisorbatos (20, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188,etc.), polióis Pluronic®, monoéteres de sorbitan de polioxi-etileno (Tween®-20, Tween®-80), etc.

Excipientes diversos adicionais incluem agentes decomposição de volume ou enchedores (por exemplo, amido),agentes de quelação (por exemplo, EDTA), antioxidantes (porexemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) e co-solventes.

O ingrediente ativo também pode estar encerrado emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicasde coacervação ou através de polimerização interfacial, porexemplo, hidróximetil celulose, gelatina ou microcápsulas de(poli)metilmetacrilato, em sistemas de distribuição de fár-maco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de al-bumina, microemulsões, nano-particulas e nanocápsulas) ou emmacroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington1SPharmaceutical Sciences, supra. Em um aspecto da invenção, acomposição é uma composição liquida, tal como uma composiçãoaquosa, e compreende um derivado de sulfoalquil éter ciclo-dextrina.

Formulações parenterais a serem usadas para admi-nistração in vivo devem ser estéreis. Isso é prontamente re-alizado, por exemplo, por meio de filtração através de mem-branas de filtração estéreis.

Exemplos adequados de preparados com liberaçãosustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hi-drofóbicos sólidos contendo o polipeptideo ou conjugado, asmatrizes tendo uma forma adequada, tal como um filme ou mi-crocápsulas. Exemplos de matrizes com liberação sustentadaincluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)-2-hidróxietil-metacrilato ou álcool (poli)vinilico), polilac-tideos, copolimeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato,acetato de vinila não-degradável, copolimeros de ácido lác-tico-ácido glicólico degradáveis, tal como a tecnologia Pro-Lease® ou Lupron Depot® (microesferas injetáveis compostasde copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato deleuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidróxibutírico. Embora po-límeros, tais como acetato de etileno-vinila e ácido lácti-co-ácido glicólico, permitam a liberação de moléculas duran-te longos períodos, tal como ate ou mais de 100 dias, deter-minados hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tem-po mais curtos. Quando polipeptídeos encapsulados permanecemno corpo durante um longo tempo, eles podem desnaturar ouagregar como um resultado de exposição à umidade a 37 °C,resultando em uma perda de atividade biológica e possíveisalterações na imunogenicidade.

Estratégias racionais podemser consideradas para estabilização, dependendo do mecanismoenvolvido. Por exemplo, se é descoberto que o mecanismo deagregação é intermolecular, formação de ligação S-S atravésde permuta de tio-dissulfeto, estabilização pode ser obtidaatravés de modificação de resíduos de sulfidrila, liofiliza-ção de soluções ácidas, controle do teor de umidade, usandoaditivos apropriados e desenvolvimento de composições de ma-triz polimérica específicas.

Administração oral dos peptídeos e conjugadospeptidicos é uma prática considerada d antigeno. Para admi-nistração oral, a composição farmacêutica pode estar em umaforma sólida ou liquida, por exemplo, na forma de uma cápsu-la, tablete, suspensão, emulsão ou solução. A composiçãofarmacêutica é, de preferência, feita na forma de uma unida-de de dosagem contendo uma determinada quantidade do ingre-diente ativo. Uma dose diária adequada para um ser humano ououtro mamífero pode variar amplamente, dependendo da condi-ção do paciente e outros fatores, mas pode ser determinadapor aqueles habilitados na técnica usando métodos de rotina.

Formas de dosagem sólida para administração oralpodem incluir cápsulas, tabletes, supositórios, pós e grânu-Ios. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativopode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, talcomo sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem tam-bém podem compreender, conforme é normal na prática, sub-stâncias adicionais, por exemplo, agentes de lubrificação,tal como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, table-tes e comprimidos, as formas de dosagem podem também compre-ender agentes de tamponamento. Tabletes e comprimidos podem,adicionalmente, ser preparados com revestimentos entéricos.

Os polipeptídeos ou conjugados podem ser mistura-dos com adjuvantes, tais como lactose, sacarose, pó de ami-do, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácido esteári-co, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais desódio é cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, ge-latina, alginato de sódio, polivinil pirrolidina e/ou álcoolpolivinílico e transformados em tabletes ou encapsuladospara administração convencional. Alternativamente, eles po-dem ser dissolvidos em solução salina, água, polietilenoglicol, propileno glicol, etanol, óleos (tal como óleo demilho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleode gergelim), goma tragacanta e/ou vários tampões. Outrosadjuvantes e modos de administração são bem conhecidos natécnica farmacêutica. 0 veiculo ou diluente pode incluir ma-terial de retardo de tempo, tal como monoestearato de glice-rila ou diestearato de glicerila, sozinho ou com uma cera ououtros materiais bem conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas podem ser submetidasà operações farmacêuticas convencionais, tal como esterili-zação e/ou podem conter adjuvantes convencionais, tais comoconservantes, agentes de umedecimento, emulsificantes, tam-pões, enchedores, etc., por exemplo, conforme divulgado emalguma parte aqui.

Formas de dosagem líquidas para administração oralpodem incluir emulsões farmaceuticamente aceitáveis, solu-ções, suspensões, xaropes e elixires contendo diluentesinertes comumente usados na técnica, tal como água. .Taiscomposições podem também compreender adjuvantes, tais comoagentes de umedecimento, adoçantes, agentes de flavorizaçãoe agentes de perfume.

Formulações adequadas para administração pulmonarsão consideradas como parte da invenção. Formulações adequa-das para uso com um nebulizador, quer a jato ou ultra-sônico, compreenderão, tipicamente, o polipeptídeo ou conju-gado dissolvido em água em uma concentração, por exemplo, decerca de 0,01 a 25 mg de conjugado por mL de solução, depreferência cerca de 0,1 a 10 mg/mL. A formulação tambémpode incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo,para estabilização de proteína e regulação de pressão osmó-tica) e/ou albumina de soro humano oscilando, quanto à con-centração, de 0,1 a 10 mg/ml. Exemplos de tampões que podemser usados são acetato de sódio, citrato e glicina. De pre-ferência, o tampão terá uma composição e molaridade adequa-das para ajustar a solução para um pH na faixa de 3 a 9. Ge-ralmente, molaridades do tampão de 1 mM a 50 mM são adequa-das para essa finalidade. Exemplos de açúcares os quais po-dem ser utilizados são lactose, maltose, manitol, sorbitol,trealose e xilose, usualmente em quantidades oscilando de 1%a 10% em peso da formulação.

A formulação para nebulizador também pode conterum tensoativo para reduzir ou prevenir agregação induzida nasuperfície da proteína causada pela atomização da soluçãoquando de formação do aerossol. Vários tensoativos adicio-nais podem ser empregados, tais como ésteres e ;álcoois deácido graxo de polioxietileno e ésteres de ácido graxo desorbitan de polioxietileno. Quantidades geralmente oscilarãoentre 0,001% e 4% em peso da formulação. Um tensoativo espe-cialmente preferido para fins da presente invenção é monoo-leato de sorbitan de polioxietileno.

Formulações e métodos específicos de geração dedispersões adequadas de partículas líquidas da invenção sãodescritos no WO 94/20069, Pat. U.S. No. 5.915.378,- Pat. U.S.No. 5.960.792, Pat. U.S. No. 5.957.124, Pat. U.S. No.5.934.272, Pat. U.S. No. 5.915.378, Pat. U.S. No. 5.855.564,Pat. U.S. No. 5.826.570 e Pat. U.S. No. 5.522.385, os quaissão aqui incorporados por referência.

Formulações para uso com um dispositivo inaladorde dose medida geralmente compreenderão um pó finamente di-vidido. Esse pó pode ser produzido através de liofilizaçãoe, então, trituração de uma formulação de conjugado liquidae também pode conter um estabilizante, tal como albumina desoro humano (HSA) . Tipicamente, mais de ,5% (peso/peso) deHSA são adicionados. Adicionalmente, um ou mais açúcares ouálcoois de açúcar podem ser adicionados ao preparado se ne-cessário. exemplos incluem lactose, maltose, manitol, sorbi-tol, sorbitose, trealose, xilitol e xilose. A quantidadeadicionada à formulação pode oscilar de cerca de 0,01 a 200%(peso/peso), de preferência de aproximadamente 1 a 50% dopresente conjugado. Tais formulações são, então, liofiliza-das e trituradas ao tamanho de partícula desejado.

As partículas de tamanho apropriado são, então,suspensas em um propelente com o auxílio de=um tensoativo. 0propelente pode ser qualquer material convencional empregadopara essa finalidade, tal como um clorofluorocarboneto, umhidroclorofluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto ou um hi-drocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifIuo-rometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano ou combinações dos mesmos. Tensoativos ade-quados incluem trioleato de sorbitan e lecitina de soja.Ácido oléico pode também ser útil como um :tensoativo. Essamistura é, então, carregada no dispositivo de distribuição.Um exemplo de um inalador de dose medida comercialmente dis-ponível adequado para uso na presente invenção é o inaladorde dose medida Ventolin, fabricado pela Glaxo Inc., ResearchTriangle Park, N.C., EUA.

Formulações para inaladores de pó compreenderão umpó seco finamente dividido contendo polipeptídeos ou conju-gados de polipeptídeo e pode também incluir um agente decomposição de volume, tal como lactose, sorbitol, sacaroseou manitol, em quantidades as quais facilitam a dispersão dopó do dispositivo, por exemplo, 50% a 90% em peso da formu-lação. As partículas do pó deverão ter propriedades aerodi-nâmicas no pulmão, correspondendo à partículas com uma den-sidade de cerca de 1 g/cm2 tendo um diâmetro médio de menosde 10 micrometros, de preferência entre 0,5 e 5 micrometros,mais preferivelmente entre 1,5 e 3,5 micrometros. Um exemplode um inalador de pó adequado para uso de acordo com os en-sinamentos aqui é o inalador de pó Spinhaler, fabricado pelaFisons Corp., Bedford, Mass., EUA. Os pós para esses dispo-sitivos podem ser gerados e/ou distribuídos através de méto-dos divulgados na Pat. U.S. No. 5 . 997.848, Pat. U.S. No.5.993.783, Pat. U.S. No. 5.985.248, Pat. U.S. No. 5.976.574,Pat. U.S. No. 5.922.354, Pat. U.S. No. 5.785.049 e Pat. U.S.No. 5.654.007.

Dispositivos mecânicos projetados para distribui-ção pulmonar de produtos terapêuticos incluem, mas não estãolimitados a, nebulizadores, inaladores de dose medida e ina-ladores de pó, todos os quais são familiares para aqueleshabilitados na técnica. Exemplos de dispositivos comercial-mente disponíveis adequados para a prática da presente in-venção são o nebulizador Ultravent, fabricado pela Mallin-ckrodt, Inc., St. Louis, Mo., EUS; o nebulizador Acorn II,fabricado pela Marquest Medicai Products, Englewood, Colo.,EUA; o inalador de dose medida Ventolin, fabricado pela Gla-xo Inc., Research Triangle Park, N.C., EUA; o inalador de póSpinhaler, fabricado pela Fisons Corp., Bedford, Mass., EUA,dispositivo de "névoa permanente" da Nektar Therapeutics,Inc., San Carlos, Calif, EUA; o inalador AIR, fabricado pelaAlkermes, Cambridge, Mass., EUA; e o sistema de distribuiçãopulmonar AERx, fabricado pela Aradigm Corporation, Hayward,Calif., EUA.

A presente invenção também proporciona kits inclu-indo os polipeptideos, conjugados, polinucleotídeos, vetoresde expressão, células, métodos, composições e sistemas eaparelhos da invenção. Kits da invenção compreendem, opcio-nalmente, pelo menos um dos seguintes da invenção: (1) umaparelho, sistema, componente de sistema ou componente deaparelho conforme descrito aqui/ (2) pelo menos um componen-te do kit compreendendo um polipeptídeo ou conjugado ou po-linucleotideo da invenção; um vetor de expressão de plasmí-deo que codifica um polipeptídeo da invenção; uma célula ex-pressando um polipeptídeo da invenção; ou uma componentecompreendendo pelo menos um de tais componentes; (3) instru-ções para prática de qualquer método descrito aqui, incluin-do um método terapêutico ou profilático, instruções para usode qualquer componente identificado em (2) ou qualquer com-posição de qualquer tal componente; e/ou instruções paraoperação de qualquer aparelho, sistema ou componente descri-to aqui; (4) um recipiente para contenção do referido pelomenos um de tais componentes ou composição e (5) materiaisde embalagem.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporci-ona o uso de um qualquer aparelho, componente, composição oukit descrito acima e aqui, para a prática de qualquer métodoou ensaio descrito aqui e/ou o uso de qualquer aparelho,componente, composição ou kit para praticar qualquer ensaioou método descrito aqui.

Modificações Químicas, Conjugados e FusõesQualquer polipeptídeo da invenção pode estar pre-sente como parte de uma seqüência polipeptídica maior, porexemplo, uma proteína de fusão, tal como ocorre quando daadição de um ou mais domínios ou sub-seqüências para estabi-lização ou detecção ou purificação do polipeptídeo. Uma sub-seqüência de purificação de polipeptídeo pode incluir, porexemplo, uma tag de epítopo, uma tag FLAG, uma seqüência depolihistidina, uma fusão de GST ou qualquer outra sub-seqüência de detecção/purificação ou "tag" conhecida na téc-nica. Esses domínios ou sub-seqüências adicionais têm poucoou nenhum efeito sobre a atividade do polipeptídeo da inven-ção ou podem ser removidos através de etapas de processamen-to pós-síntese, tal como através de tratamento com uma pro-tease, inclusão de uma inteína ou semelhante.

A invenção inclui proteínas de fusão compreendendoum polipeptídeo da invenção, por exemplo, conforme descritoaqui, fundidas a uma molécula de Ig, por exemplo, uma dobra-diça de Fc de IgG humana ("fragmento cristalizável" ou frag-mento de ligação de complemento), domínio CH2 ou domínio CH3e seqüências de nucleotídeo que codificam tal proteína defusão. Fc é a porção do anticorpo responsável pela ligação areceptores de anticorpo sobre células e ao componente Clq docomplemento. Essas proteínas de fusão e seus ácidos nuclei-cos codificados são úteis como fármacos terapêuticos e/ouprofiláticos ou como ferramentas diagnosticas (veja também,por exemplo, Challita-Eid, P. e colaboradores (1998) J. Im-munol 160: 3419-3426; Sturmhoefel, K. e colaboradores (1999)Câncer Res 59: 4964-4972). A invenção também inclui proteí-nas de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção, fun-dido a uma molécula de albumina, tal como albumina de sorohumano, conforme descrito, por exemplo, na Pat. U.S. No.5.876.969 e seqüências de nucleotídeo que codificam a prote-ína de fusão. As proteínas de fusão de Ig e albumina podemexibir meia-vida aumentada do polipeptídeo no soro e/oumeía-vida funcional in vivo, antigenicidade reduzida do po-lipeptídeo, estabilidade ao armazenamento aumentada do poli-peptídeo ou biodisponibilidade aumentada, por exemplo, AUC50aumentada e, assim, podem ser úteis como fármacos profiláti-cos e/ou terapêuticos.

Todos os polipeptídeos da invenção têm uma capaci-dade inerente de transduzir através de membranas celulares edesempenhar funções terapêuticas dentro de células. A inven-ção, portanto, proporciona o uso dos polipeptídeos da inven-ção para intensificar a permeabilidade ou transdutibilidadecelular de qualquer outra molécula. A invenção ainda propor-ciona o uso de qualquer fragmento ou sub-fragmento dos poli-peptideos da invenção para intensificar a permeabilidade ce-lular de qualquer outra molécula, tais fragmentos ou sub-fragmentos sendo de cerca de 5 aminoácidos de comprimento,de cerca de 10 aminoácidos de comprimento, tal como 15 ami-noácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 20 aminoáci-dos de comprimento, de cerca de 25 aminoácidos de comprimen-to, de cerca de 30 aminoácidos de comprimento, tal como 35aminoácidos de comprimento, de cerca de 35-50 aminoácidos decomprimento, de cerca de 50-100 aminoácidos de comprimento,tal como 75 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 100-125aminoácidos de comprimento.

Qualquer polipeptideo da invenção também pode com-preender um ou mais aminoácidos modificados. O aminoácidomodificado pode ser, por exemplo, um aminoácido glicosilado,um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um ami-noácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácidoconjugado a uma porção lipidica ou um aminoácido conjugado aum agente de derivatização orgânico. A presença de aminoáci-dos modificados pode ser vantajosa, por exemplo, em (a) au-mento da meia-vida do polipeptideo no soro e/ou meia-vidafuncional in vivo, (b) redução de antigenicidade do poli-peptideo, (c) aumento da estabilidade ao armazenamento dopolipeptideo ou (d) aumento da biodisponibilidade, por exem-pio, aumento da AUC50. Aminoácido(s) é(são) modificado(s),por exemplo,· co-traducionalmente ou pós-traducionalmente du-rante produção recombinante (por exemplo, glicosilação N-ligada em motivos N-X-S/T durante expressão em células demamífero) ou modificado(s) através de meios sintéticos.

O termo "conjugado" (ou, permutavelmente, "conju-gado polipeptídico" ou "polipeptídeo conjugado") se destinaa indicar uma molécula heterogênea (no sentido da composi-ção) formada através da fixação covalente de um ou mais po-lipeptideos da invenção a uma ou mais porções não-polipeptidicas. O termo "fixação covalente" significa que opolipeptídeo e a porção não-polipeptídica são diretamenteunidos covalentemente um ao outro ou mesmo são indiretamenteunidos covalentemente um ao outro através de porção ou por-cos intervenientes, tais como uma ligação em ponte, espaça-dor ou porção ou porções de ligação. De preferência, um po-lipeptídeo conjugado é solúvel em concentrações e condiçõesrelevantes, isto é, solúvel em fluidos fisiológicos, talcomo sangue. Exemplos de polipeptídeos conjugados da inven-ção incluem polipeptídeos glicosilados e/ou PEGuilados. 0termo "polipeptídeo não-conjugado" pode ser usado para sereferir à parte polipeptídica do polipeptídeo conjugado.

O termo "porção não-polipeptídica" se destina asignificar uma molécula que é capaz de conjugação a um grupode fixação do polipeptídeo. Exemplos preferidos de porçõesnão-polipeptídicas incluem moléculas poliméricas, porções deanticorpo, compostos lipofílicos ou agentes de derivatizaçãoorgânicos, em particular moléculas poliméricas ou porções deaçúcar. Será compreendido que a porção não-polipeptídica éligada ao polipeptídeo através de um grupo de fixação do po-lipeptídeo. Exceto onde o número de porções não-polipeptídicas, tal como molécula(s) polimérica(s), preso aopolipeptideo é expressamente indicado, cada referência a uma"porção não-polipeptídica" presa ao polipeptideo ou, de ou-tro modo, usado na presente invenção será uma referência auma ou mais porções não-polipeptidicas presas ao polipeptí-deo.

0 termo "molécula polimérica" é definido como umamolécula formada através de ligação covalente de dois oumais monômeros, em que nenhum dos monômeros é um resíduo deaminoácido. 0 termo "polímero" pode ser usado permutavelmen-te com o termo "molécula polimérica".

0 termo "porção açúcar" se destina a indicar umamolécula de carboidrato presa, através de glicosilação invivo ou in vitro, tal como N- ou O-glicosilação. Um "sítiode N-glicosilação" tem a seqüência N-X-S/T/C, em que X équalquer resíduo de aminoácido, exceto prolina, N é aspara-gina e S/T/C é serina, treonina ou cisteína, de preferênciaserina ou treonina e, mais preferivelmente, treonina. Um"sítio de O-glicosilação" compreende o grupo OH de um resí-duo de serina ou treonina.

O termo " grupo de fixação" se destina a indicarum grupo de resíduo de aminoácido capaz de acoplamento a umaporção não-polipeptídica relevante, tal como uma moléculapolimérica ou uma porção de açúcar.

Para N-glicosilação in vivo, o termo "grupo de fi-xação" é usado de uma forma não convencional para indicar os

• resíduos de aminoácido que constituem um sítio de N-

• glicosilação (com a seqüência N-X-S/T/C, em que X é qualquerresíduo de aminoácido, exceto prolina, N é asparagina eS/T/C é serina, treonina ou cisteína, de preferência serinaou treonina e, mais preferivelmente, treonina). Embora o re-síduo de asparagina do sítio de N-glicosilação seja um aoqual a porção açúcar está presa durante glicosilação, talfixação não pode ser obtida, a menos que os outros resíduosde aminoácido do sítio de N-glicosilação estejam presentes.Conseqüentemente, quando a porção não-polipeptídica é umaporção açúcar e acredita-se que a conjugação tenha de seratravés de N-glicosilação, o termo "resíduo de aminoácidocompreendendo um grupo de fixação para a porção não-polipeptídica", conforme usado com relação à alterações daseqüência de aminoácido do polipeptídeo da invenção, deveser entendido como um, dois ou todos os resíduos de aminoá-cido que constituem um sítio de N-glicosilação sendo altera-dos de uma maneira tal que um sítio de N-glicosilação funci-onal é introduzido na seqüência de aminoácido, removido dareferida seqüência ou um sítio de N-glicosilação funcional éretido na seqüência de aminoácido (por exemplo, através desubstituição de um resíduo de serina, o qual já constituiparte de um sítio de N-glicosilação) por um resíduo de treo-nina e vice versa).

O termo "introduzir" (isto é, um resíduo de amino-ácido "introduzido", "introdução de um resíduo de aminoáci-do) se destina a significar, primariamente, substituição deum resíduo de aminoácido existente por outro resíduo de ami-noácido, mas também significa inserção de um resíduo de ami-noácido adicional.

O termo "remover" (isto é, um resíduo de aminoáci-do "removido", "remoção" de um resíduo de aminoácido) sedestina a significar, primariamente, substituição do resíduode aminoácido a ser removido por outro resíduo de aminoáci-do, mas também pode significar deleção (sem substituição) doresíduo de aminoácido a ser removido.

0 termo "resíduo de aminoácido compreendendo umgrupo de fixação para a porção não-polipeptídica" se destinaa indicar que o resíduo de aminoácido é um ao qual a porçãonão-polipeptídica se liga (no caso de um resíduo de aminoá-cido introduzido) ou teria se ligado (no caso de um resíduode aminoácido removido).

O termo "meia-vida funcional in vivo" é usado emseu significado normal, isto é, o tempo no qual 50% da ati-vidade biológica do polipeptídeo ainda está presente no cor-po/órgão alvo ou o tempo no qual a atividade do polipeptídeoé 50% do valor inicial. A meia-vida funcional in vivo podeser determinada em um animal experimental, tal como rato,camundongo, coelho, cão ou macaco. De preferência, a meia-vida funcional in vivo é determinada em um primata não-humano, tal como um macaco. Além disso, a meia-vida funcio-nal in vivo pode ser determinada para uma amostra que foiadministrada intravenosa ou subcutaneamente.

Como uma alternativa à determinação da meia-vidafuncional in vivo, a "meia-vida no soro" pode ser determina-da, isto é, o tempo no qual 50% do polipeptídeo circula noplasma ou corrente sangüínea antes de ser eliminado. Deter-minação da meia-vida no soro é, freqüentemente, mais simplesdo que determinação da meia-vida funcional in vivo e a mag-nitude da meia-vida no soro é, usualmente, uma boa indicaçãoda magnitude da meia-v ida funcional in vivo. Alternativa-mente, termos para a meia-vida no soro incluem "meia-vida noplasma", "meia-vida em circulação", "eliminação do soro","eliminação do plasma" e "meia-vida de eliminação".

Polinucleotideos e Métodos de Mutagênese

A invenção inclui ácidos nucleicos e polinucleotídeos que codificam os polipeptideos da invenção. A invençãoinclui composições produzidas através de digestão de um oumais de qualquer um dos polinucleotideos da invenção com umaendonuclease de restrição, uma RNAse ou uma DNAse (por exem-plo, conforme é realizado em determinados formatos de recom-binação em alguma parte na especificação); e composiçõesproduzidas através de fragmentação ou cisalhamento de um oumais polinucleotideos da invenção através de meios mecânicos(por exemplo, ultra-som, vórtice e semelhantes), as quaistambém podem ser usadas para proporcionar substratos pararecombinação nos métodos descritos aqui. A invenção tambémproporciona composições produzidas através de clivagem depelo menos um de qualquer um dos polinucleotideos da inven-ção. A clivagem pode compreender clivagem com uma endonucle-ase de restrição, uma RNAse ou uma DNAse.

Também incluídas na invenção são composições pro-duzidas por um processo compreendendo incubação de um oumais dos polinucleotideos fragmentados da invenção na pre-sença de trifosfatos de ribonucleotídeo ou deóxiribonucleo-tídeo e uma polimerase de ácido nucleico. Essa composiçãoresultante forma uma mistura de recombinação para qualquerum dos formatos de recombinação mencionados acima. A polime-rase de ácido nucleico pode ser uma RNA polimerase, uma DNApolimerase ou uma DNA polimerase RNA-dirigida (por exemplo,uma "transcriptase reversa"); a polimerase pode ser, porexemplo, uma DNA polimerase termoestável (por exemplo, VENT,TAQ ou semelhante).

Similarmente, composições compreendendo conjuntosde oligonucleotideos correspondendo a mais de um dos ácidosnucleicos da invenção são úteis como substratos de recombi-nação e são uma característica da invenção. Por conveniên-cia, essas misturas de oligonucleotídeo sintetizado, frag-mentado ou cisalhado são referidas como conjuntos de ácidonucleico fragmentados.

A invenção também proporciona um ácido nucleicoisolado ou recombinante que codifica um polipeptídeo produ-zido através de mutação ou recombinação de pelo menos um po-linucleotideo da invenção.

Polinucleotideos, oligonucleotideos e fragmentosde ácido nucleico da invenção podem ser preparados atravésde métodos padrões em fase sólida, de acordo com métodossintéticos conhecidos. Tipicamente, fragmentos de até cercade 100 bases são individualmente sintetizados, então, unidos(por exemplo, através de métodos de ligação enzimática ouquímica ou métodos de recombinação mediados por polimerase)para formar essencialmente qualquer seqüência contínua dese-jada.

Por exemplo, os polinucleotídeos e oligonucleotideosda invenção podem ser preparados através de síntese químicausando, por exemplo, o método clássico com fosforamiditadescrito, por exemplo, por Beaucage e colaboradores (1981)Tetrahedron Letters 22: 1859-69 ou o método descrito porMatthes e colaboradores (1984) EMBO J 3: 801-05, por exem-plo, conforme é tipicamente praticado em métodos sintéticosautomáticos. De acordo com o método com fosforamidita, oli-gonucleotideos são sintetizados, por exemplo, em um sinteti-zador automático de DNA, purificados, anelados, ligados eclonados em vetores apropriados.

Além disso, essencialmente qualquer polinucleotí-deo pode ser pedido de qualquer uma de uma variedade de fon-tes comerciais, tal como Operon Technologies Inc. (Alameda,Calif.) e muitas outras. Similarmente, polipeptideos e anti-corpos podem ser pedidos de qualquer uma de uma variedade defontes, por exemplo, Celtek Peptides (Nashville, Tenn.);Washington Biotechnology, Inc. (Baltimore Md.); GlobalPeptide Services (Ft. Collin Colo.) e muitas outras.

Determinados polinucleotideos da invenção tambémpodem ser obtidos através de seleção de bibliotecas de cDNA(por exemplo, bibliotecas geradas através de recombinação deácidos nucleicos homólogos, conforme em métodos de recombi-nação de seqüência recursiva típicos) usando sondas de oli-gonucleotídeo que podem se hibridizar a ou polinucleotideosde amplificação por PCR os quais codificam polipeptideos deOAS e fragmentos desses polipeptideos. Procedimentos paraseleção e isolamento de clones de cDNA são bem conhecidospor aqueles habilitados na técnica. Tais técnicas são des-critas, por exemplo, em Berger e Kimmel, Guide to MolecularCloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad.Press, Inc., San Diego, Calif. ("Berger"); J. Sambrook eD.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ter-ceira Edição. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,NY, ("Sambrook"); e EM. Ausubel e colaboradores (1987-2005)Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience,New York, NY ("Ausubel"). Alguns polinucleotideos da inven-ção podem ser obtidos através de alteração de uma seqüênciaque ocorre naturalmente, por exemplo, através de mutagênese,recombinação de seqüência recursiva (por exemplo, embaralha-mento) ou recombinação de oligonucleotideo. Em outros casos,tais polinucleotideos podem ser feitos in silico ou atravésde métodos de recombinação de oligonucleotideo, conformedescrito nas referências citadas aqui.

Conforme descrito em maiores detalhes aqui, os po-linucleotideos da invenção incluem polinucleotideos que co-dificam polipeptideos da invenção, seqüências de polinucleo-tideo complementares a essas seqüências de polinucleotideo epolinucleotideos que se hibridizam, sob condições pelo menosestringentes, às seqüências definidas aqui. Uma seqüência decodificação se refere a uma seqüência de polinucleotideo quecodifica um polipeptideo em particular ou domínio, região oufragmento do referido polipeptideo. Os polinucleotideos dainvenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA eincluem mRNA, cRNA, RNA e DNA sintéticos e cDNA. Os polinu-cleotídeos podem ser fita simples ou fita dupla e, se fitasimples, podem ser a fita de codificação ou a fita de não-codificação (anti-senso, complementar). Os polinucleotideosda invenção incluem a seqüência de codificação de um poli-peptídeo da invenção (i) isoladamente, (ii) em combinaçãocom uma ou mais seqüências de codificação adicionais de modoa codificar, por exemplo, uma proteína de fusão, uma pré-proteína, uma prepro-proteína ou semelhante, (iii) em combi-nação com seqüências de não-codificação, tais como íntrons,elementos de controle, tal como um promotor (por exemplo, umpromotor que ocorre naturalmente ou recombinante ou embara-lhado) , um elemento terminador ou regiões não traduzidas 5'e/ou 3' eficazes para expressão da seqüência de codificaçãoem um hospedeiro adequado e/ou (iv) em um vetor, célula ouambiente hospedeiro no qual a seqüência de codificação é umgene heterólogo.

Os polinucleotídeos da invenção também podem serencontrados em combinação com formulações composicionais tí-picas de ácidos nucleicos, incluindo a presença de veículos,tampões, adjuvantes, excipientes e semelhantes, conforme éconhecido por aqueles habilitados na técnica. Fragmentos depolinucleotídeo compreendem, tipicamente, pelo menos cercade 200 bases de nucleotídeo, tal como pelo menos cerca de250, 300, 350, 400, 450, 460, 470 ou mais bases. Os fragmen-tos de nucleotídeo de polinucleotídeos da invenção podem sehibridizar, sob condições altamente estringentes, a uma se-qüência de polinucleotídeo descrita aqui e/ou codificar se-qüências de aminoácido tendo pelo menos uma das propriedadesde polipeptídeos da invenção descritos aqui.

Os polinucleotídeos da invenção podem ter uma va-riedade de usos, por exemplo, em produção recombinante (istoé, expressão) dos polipeptídeos da invenção, tipicamenteatravés de expressão de um vetor de expressão de plasmídeocompreendendo uma seqüência de codificação do polipeptideoou fragmento do mesmo; como produtos terapêuticos; como pro-dutos profiláticos; como ferramentas diagnosticas; comoimunogênios; como adjuvantes; como sondas diagnosticas comrelação à presença de ácidos nucleicos complementares ouparcialmente complementares (incluindo para detecção de umácido nucleico de sintetase de oligoadenilato do tipo sil-vestre) , como substratos para outras reações, por exemplo,reações de recombinação de seqüência recursiva ou reações demutação para produzir variantes novas e/ou aperfeiçoadas esemelhantes.

Vetores de Expressão, Métodos de Fabricação, Tera-pia Genética

Métodos recombinantes para produção e isolamentode polipeptideos da invenção são descritos aqui. Além deprodução recombinante, os polipeptideos podem ser produzidosatravés de síntese direta de peptídeo usando técnicas emfase sólida (veja, por exemplo, Stewart e colaboradores(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman .Co, SanFrancisco; Merrifield J. (1963) JAm Chem Soc 85: 2149-2154).Síntese de peptídeo pode ser realizada usando técnicas manu-ais ou através de automatização. Síntese automática pode serobtida, por exemplo, usando o Sintetizador de PeptídeoApplied Biosystems 43 IA (Perkin Elmer, Foster City, Calif.)de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Porexemplo, sub-seqüências podem ser quimicamente sintetizadasseparadamente e combinadas usando métodos químicos para pro-porcionar polipeptídeos de comprimento total ou fragmentosdos mesmos. Alternativamente, tais seqüências podem ser pe-didas de qualquer série de companhias as quais se especiali-zaram na produção de polipeptideos. Mais comumente, poli-peptideos da invenção podem ser produzidos através de ex-pressão de ácidos nucleicos de codificação e recuperação dospolipeptideos, por exemplo, conforme descrito abaixo.

Métodos para produção dos polipeptideos da inven-ção também são incluídos. Um de tais métodos compreende in-trodução, em uma população de células, de qualquer ácido nu-cleico da invenção, o qual é operativamente ligado a uma se-qüência regulatória eficaz para produzir o polipeptídeo co-dificado, cultura das células em um meio de cultura para ex-pressar o polipeptídeo e isolamento do polipeptídeo das cé-lulas ou do meio de cultura. Uma quantidade de ácido nuclei-co suficiente para facilitar a captação pelas células(transfecção) e/ou expressão do polipeptídeo é utilizada. 0ácido nucleico é introduzido em tais células através dequalquer método de distribuição conforme é conhecido na téc-nica incluindo, por exemplo, injeção, pistola.de gene, cap-tação passiva, etc. Conforme aqueles habilitados na técnicareconhecerão, o ácido nucleico pode ser parte de um vetor,tal como um vetor de expressão recombinante, incluindo umvetor de plasmídeo de DNA ou qualquer vetor conhecido natécnica. 0 ácido nucleico ou vetor compreendendo um ácidonucleico da invenção pode ser preparado e formulado atravésde tecnologias de DNA recombinante e métodos;de isolamentopadrões, conforme conhecido na técnica. Tal ácido nucleicoou vetor de expressão pode ser introduzido em uma populaçãode células de um mamífero in vivo ou células selecionadas domamífero (por exemplo, células tumorígenas) podem ser remo-vidas do mamífero e o vetor de expressão de ácido nucleicointroduzido ex vivo na população de tais células em umaquantidade suficiente, de modo que captação e expressão dopolipeptídeo codificado resulte. Ou, um ácido nucleico ouvetor compreendendo um ácido nucleico da invenção é produzi-do usando células cultivadas in vitro. Em um aspecto, o mé-todo de produção de um polipeptídeo da invenção compreendeintrodução, em uma população de células, de um vetor de ex-pressão recombinante compreendendo qualquer ácido nucleicoda invenção descrito aqui em uma quantidade e fórmula, demodo que captação do vetor e expressão do polipeptídeo codi-ficado resultarão; administração do vetor de expressão em ummamífero através do formato de introdução/distribuição des-crito aqui; e isolamento do polipeptídeo do mamífero ou deum subproduto do mamífero.

A invenção proporciona ácidos nucleicos isoladosou recombinantes (também referidos aqui como polinucleotí-deos), coletivamente referidos como "ácidos nucleicos (oupolinucleotídeos) da invenção", os quais codificam poli-peptídeos da invenção. Os polinucleotídeos da invenção sãoúteis em uma variedade de aplicações. Conforme discutidoacima, os polinucleotídeos são úteis na produção de poli-peptídeos da invenção. Além disso, pol-inucleotídeos da in-venção podem ser incorporados em vetores de expressão úteispara terapia genética, vacinação de DNA e imunoterapia, con-forme descrito em alguma parte no presente pedido.

Qualquer um dos polinucleotideos da invenção (aqual inclui aqueles descritos acima) pode codificar uma pro-teína de fusão compreendendo pelo menos uma seqüência deaminoácido adicional tal como, por exemplo, uma seqüência desecreção/localização, uma seqüência útil para solubilizaçãoou imobilização (por exemplo, para visualização na superfí-cie celular) do polipeptídeo, uma seqüência útil para detec-ção e/ou purificação do polipeptídeo (por exemplo, uma sub-seqüência de purificação de polipeptídeo, tal como uma tagde epítopo, uma seqüência de polihistidina e semelhantes).

Em outro aspecto, a invenção proporciona células compreen-dendo um ou mais dos polinucleotideos da invenção. Tais cé-lulas podem expressar um polipeptídeos codificados pelos po-linucleotídeos da invenção.

A invenção também proporciona vetores compreenden-do qualquer um dos polinucleotideos da invenção. Tais veto-res podem compreender um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, umvírus ou um fragmento de um vírus. Tais vetores podem com-preender um vetor de expressão e., se desejado, o ácido nu-cleico é operavelmente ligado a um promotor, incluindo aque-les discutidos aqui e abaixo. Além disso, em outro aspecto,a invenção proporciona composições compreendendo um excipi-ente ou veículo e pelo menos um ou qualquer um dos polinu-cleotídeos da invenção ou vetores, células ou hospedeiroscompreendendo tais ácidos nucleicos. Tal composição pode sercomposições farmacêuticas e o excipiente ou veículo pode serum excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.A invenção também inclui composições compreendendodois ou mais ácidos nucleicos da invenção ou fragmentos dosmesmos (por exemplo, como substratos para recombinação) . Acomposição pode compreender uma biblioteca de ácidos nuclei-cos recombinantes, onde a biblioteca contém pelo menos 2,pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20,pelo menos 50 ou pelo menos 100 ou mais ácidos nucleicosdescritos acima. Os ácidos nucleicos são opcionalmente clo-nados em vetores de expressão, proporcionando bibliotecas deexpressão.

Os polinucleotideos da invenção e fragmentos dosmesmos, bem como vetores compreendendo tais polinucleoti-deos, podem ser empregados para usos terapêuticos ou profi-láticos em combinação com um veiculo adequado, tal como umveiculo farmacêutico. Tais composições compreendem uma quan-tidade terapêutica e/ou profilaticamente eficaz do compostoe um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Talveiculo ou excipiente inclui, mas não está limitado a, solu-ção salina, solução salina ;tamponada, dextrose, água, glice-rol, etanol e combinações dos mesmos. A formulação deverá seadequar ao modo de administração. Métodos de administraçãode ácidos nucleicos, polipeptideos e proteínas são bem co-nhecidos na técnica.

Textos gerais que descrevem técnicas de biologiamolecular úteis aqui, incluindo o uso de vetores, promotorese muitos outros tópicos relevantes incluem: Berger, supra;Sambrook (1989), supra e Ausubel, supra. Exemplos de técni-cas suficiente para orientar aqueles habilitados através demétodos de amplificação in vitro, incluindo a reação em ca-deia de polimerase (PCR), a reação em cadeia de ligase(LCR), amplificação de Q beta-replicase e outras técnicasmediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA), por exem-pio, para a produção dos ácidos nucleicos homólogos da in-venção são encontradas em Berger, Sambrook e Ausubel, todossupra, bem como Mullis e colaboradores (1987) Pat. U.S. No.4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicati-ons (Innis e colaboradores, eds.) Academic Press Inc. SanDiego, Calif. (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1 deOut. de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991)3: 81-94; (Kwoh e colaboradores (1989) Proc Natl Acad SciUSA 86: 1173-1177; Guatelli e colaboradores (1990) Proc NatlAcad Sci USA 87: 1874-1878; Lomeli e colaboradores (1989) JClin Chem 35: 1826-1831; Landegren e colaboradores (1988)Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu e Wallace (1989) Gene 4: 560-569; Barringer ecolaboradores (1990) Gene 89: 117-122 e Sooknanan e Malek(1995) Biotechnology. 13: 563-564. Métodos aperfeiçoados declonagem in vitro de.ácidos nucleicos amplificados são des-critos em Wallace e colaboradores, Pat. U.S. No. 5.426.039.Métodos aperfeiçoados de amplificação de grandes ácidos nu-cleicos através de PCR são resumidos em Cheng e colaborado-res (1994) Nature 369: 684-685 e as referências no mesmo, naqual amplicons de PCR de até 40 quilobases (kb) são gerados.

Aqueles habilitados apreciarão que essencialmente qualquerRNA pode ser convertido em um DNA fita dupla adequado paradigestão por restrição, expansão por PCR e seqüenciamentousando transcriptase reversa e uma polimerase. Veja AusubelfSambrook e Berger, todos supra.

Em células hospedeiras de mamífero, uma série desistemas de expressão, tais como sistemas baseados em vírus,podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usadocomo um vetor de expressão, uma seqüência de codificação éopcionalmente ligada em um complexo de transcrição/traduçãode adenovírus consistindo do promotor tardio e seqüência lí-der tripartida. Inserção em uma região El ou E3 não-essencial do genoma viral resulta em um vírus viável capazde expressão de um polipeptídeo da invenção em células hos-pedeiras infectadas (Logan e Shenk ( 1984) Proc Natl AcadSci USA 81: 3655-3659). Além disso, intensificadores detranscrição, tal como o intensificador do vírus do sarcomade Rous (RSV), são usados para aumentar a expressão em célu-las hospedeiras de mamífero. Células hospedeiras, meios,sistemas de expressão e métodos de produção incluem aquelesconhecidos para clonagem e expressão de várias proteínas demamífero. A eficácia de expressão pode ser intensificadaatravés da inclusão de intensificadores apropriados no sis-tema celular em uso (veja, por exemplo, Scharf D. e colabo-radores (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62; e Bi-ttner e colaboradores (1987) Methods in Enzymol 153: 516-544).

Sinais iniciais específicos podem auxiliar em tra-dução eficaz de uma seqüência de codificação de polinucleo-tídeo da invenção e/ou fragmentos da mesma. Esses sinais po-dem incluir, por exemplo, o códon ATG inicial e seqüênciasadjacentes. Em casos onde uma seqüência de codificação, seucódon inicial e seqüências a montante são inseridas no vetorde expressão apropriado, nenhum sinal de controle de tradu-ção adicional pode ser necessário. Contudo, em casos ondeapenas a seqüência de codificação (por exemplo, uma seqüên-cia de codificação de proteína madura) ou uma porção da mes-ma é inserida, sinais de controle transcricional de ácidonucleico exógeno, incluindo o códon inicial ATG, devem serproporcionados. Além disso, o códon inicial deve estar narede de leitura correta para assegurar transcrição do inser-to todo. Elementos transcricionais e códons iniciais exóge-nos podem ser de várias origens, naturais e sintéticas.

Introdução da estrutura na célula hospedeira podeser realizada através de transfecção com fosfato de cálcio,transfecção mediada por DEAE-Dextrina, eletroporação, pisto-la de gene ou vacina, injeção ou outras técnicas comuns(veja, por exemplo, Davis, L., Dibner, M. e Battey, I.(1986) Basic Methods in Molecular Biology) para métodos invivo, ex vivo ou in vitro.

Conforme mencionado, muitas referências estão dis-poníveis para a cultura e produção de muitas células, inclu-indo células de origem bacteriana, vegetal, animal (especi-almente mamífero) e archebacteriana. Veja, por exemplo, Sam-brook, Ausubel e Berger (todos supra), bem como Freshney(1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique,terceira edição, Wiley-Liss, New York e referências citadasno mesmo; Doyle e Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture:Essential Techniques John Wiley and Sons, New York; Humason(1979) Animal Tissue Techniques, quarta edição W.H. Freemanand Company; e Ricciardelli e colaboradores (1989) In vitroCell Dev Biol 25: 1016-1024. Para cultura e regeneração decélulas de vegetais veja, por exemplo, Payne e colaboradores(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems JohnWiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips(eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Funda-mental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (BerlinHeidelberg New York) e Plant Molecular Biology (1993) R. R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, ReinoUnido. ISBN 0 12 198370 6. Meios de cultura de células são,em geral, apresentados em Atlas and Parks (eds.) The Hand-book of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton,Fio. Informação adicional para cultura de células é encon-trada na literatura comercial disponível, tal como o Catálo-go Life Science Research Cell Culture da Sigma-Aldrich, Inc(St Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC") e, por exemplo, o CatálogoPlant Culture e suplemento também da Sigma-Aldrich, Inc (StLouis, Mo.) ( "Sigma-PCCS") .

Polipeptideos da invenção podem ser recuperados epurificados de culturas de células recombinantes através dequalquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técni-ca, incluindo precipitação com sulfato de amônio ou etanol,extração com ácido, cromatografia de troca de ânions ou cá-tions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia por in-teração hidrofóbica, cromatografia por afinidade (por exem-plo, usando qualquer um dos sistemas de rotulação menciona-dos aqui), cromatografia de hidróxiapatita e cromatografiade lecitina. Etapas de reduplicação de proteína podem serusadas, conforme desejado, para terminar a configuração daproteína madura ou fragmentos da mesma. Finalmente, cromato-grafia de líquido de alto desempenho (HPLC) pode ser empre-gada nas etapas finais de purificação. Além das referênciasmencionadas, supra, uma variedade de métodos de purificaçãosão bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, aque-les apresentados em Sandana (1997) Bioseparation of Pro-teins, Academic Press, Inc.; Bollag e colaboradores (1996)Protein Methods, 2a Edição, Wiley-Liss, New York; Walker(1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, New Jer-sey; Harris e Angal (1990) Protein Purification Applicati-ons: A Practical Approach IRL Press em Oxford, Oxford, In-glaterra; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A15 Practical Approach IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra;Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice3a Edição, Springer Verlag, New York; Janson e Ryden (1998)Protein Purification: Principies, High Resolution Methods; and Applications, Segunda Edição, Wiley-VCH, New York; e

.20 Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NewJersey.

Uma série de vetores virais adequados para trans-dução e expressão orgânica in vivo são conhecidos. Tais ve-tores incluem vetores retrovirais (veja, por exemplo, Mi-25 Iler, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158: 1-24; Salmons eGunzburg (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller e co-laboradores (1994) Methods in Enzymology 217: 581-599) e ve-tores adeno-associados (revistos em Carter (1992) Curr Opi-nion Biotech 3: 533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top MicrobiolImmunol. 158: 97-129). Outros vetores virais que são usadosincluem vetores adenovirais, vetores virais do herpes e ve-tores virais Sindbis, conforme geralmente descrito, porexemplo, em Jolly (1994) Câncer Gene Therapy 1: 51-64; La-tchman (1994) Molec Biotechnol 2: 179-195; e Johanning e co-laboradores (1995) Nucl Acids Res 23: 1495-1501.

Em um aspecto, um vetor de virus da varíola podeser usados. O vetor viral de varíola é transfectado com umaseqüência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo dainvenção e é útil em aplicações profiláticas, terapêuticas ediagnosticas, onde intensificação de uma resposta imune talcomo, por exemplo, proliferação de células T aumentada ouaperfeiçoada, é desejada. Veja vetores virais discutidos,por exemplo, em Berencsi e colaboradores, J Infect Dis(2001)183(8): 1171-9; Rosenwirth e colaboradores, Vaccine. 8de Fevereiro de 2001; 19(13-14): 1661-70; Kittlesen e cola-boradores, J Immunol (2000) 164(8): 4204-11; Brown e colabo-radores, Gene Ther 2000 7(19): 1680-9; Kanesa-thasan e cola-boradores, Vaccine (2000) 19(4-5): 483-91; Sten (2000) Drug60(2): 249-71. Composições compreendendo tais vetores e umexcipiente aceitável também são uma característica da invenção.

Terapia genética e vacinas genéticas proporcionammétodos para combate de doenças infecciosas crônicas (porexemplo, infecção pelo HIV, hepatite viral), bem como doen-ças não-infecciosas, incluindo câncer e algumas formas dedefeitos congênitos, tais como deficiências enzimáticas, etais métodos podem ser empregados com polinucleotídeos dainvenção incluindo, por exemplo, vetores e células compreen-dendo tais polinucleotídeos. Várias abordagens para introdu-ção de ácidos nucleicos e vetores em células in vivo, exvivo e in vitro têm sido usadas e podem ser empregadas compolinucleotídeos da invenção e vetores compreendendo taispolinucleotídeos. Essas abordagens incluem distribuição degene baseada em lipossoma (Debs e Zhu (1993) WO 93/24640 ePat. U.S. No. 5.641.662; Mannino e Gould-Fogerite (1988) Bi-oTechniques 6(7): 682-691; Rose, Pat. U.S. No. 5.279.833;Brigham (1991) WO 91/06309; e Feigner e colaboradores (1987)Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413-7414; Brigham e colaborado-res (1989) Am J Med Sci 298: 278-281; Nabel e colaboradores(1990) Science 249: 1285- 1288; Hazinski e colaboradores(1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4: 206-209; e Wang e Huang(1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7851-7855); distribuiçãode gene mediada por vetor adenoviral, por exemplo, para tra-tar câncer (veja, por exemplo, Chen e colaboradores (1994)Proc Natl Acad Sci USA 91: 3054-3057; Tong e colaboradores(1996) Gynecol Oncol 61: 175-179; Clayman e colaboradores(1995) Câncer Res. 5: 1-6; O1Malley e colaboradores (1995)Câncer Res 55: 1080-1085; Hwang e colaboradores (1995) Am JRespir Cell Mol Biol 13: 7-16; Haddada e colaboradores(1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3): 297-306;Addison e colaboradores (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8522-8526; Colak e colaboradores (1995) Brain Res 691: 76-82; Crystal (1995) Science 270: 404-410; Elshami e colabora-dores (1996) Human Gene Ther 7: 141-148; Vincent e colabora-dores (1996) J Neurosurg 85: 648-654) e muitos outros. Veto-res retrovirais replicação-defectivos abrigando uma seqüên-cia de polinucleotídeo terapêutica como parte do genoma re-troviral também podem ser usados, particularmente com rela-ção a vetores MuLV simples. Veja, por exemplo, Miller e co-laboradores (1990) Mol Cell Biol 10: 4239 (1990); Kolberg(1992) JNIH Res 4: 43 e Cornetta e colaboradores (1991) HumGene Ther 2: 215). Transporte de ácido nucleico acoplado asistemas de transporte cátions-baseados, ligante-especificos(Wu e Wu (1988) J Biol Chem, 263: 14621-14624) também têmsido usados. Vetores de expressão de DNA nu também foramdescritos (Nabel e colaboradores (1990), supra); Wolff e co-laboradores (1990) Science, 247: 1465-1468). Em geral, essasabordagens podem ser adaptadas à invenção através de incor-poração de ácidos nucleicos que codificam os polipeptideosda invenção nos vetores apropriados.

Textos gerais os quais descrevem protocolos de te-rapia genética os quais podem ser adaptados à presente in-venção através de introdução dos ácidos nucleicos da inven-ção em pacientes incluem, por exemplo, Robbins (1996) GeneTherapy Protocols, Humana Press, New Jersey e Joyner (1993)Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, In-glaterra.

Tratamentos Antivirais

Os polinucleotideos e polipeptideos da invençãopodem ser usados terapêutica ou profilaticamente para tratarou prevenir infecção viral. Virus exemplificativos incluem,mas não estão limitados a, vírus da família Flaviviridaetais como, por exemplo, Vírus da Hepatite C, Vírus da FebreAmarela, Vírus West Nile, Vírus da Encefalite Japonesa, Ví-rus da Dengue e Vírus da Diarréia Viral Bovina; vírus da fa-mília Hepadnaviridae tais como, por exemplo, vírus da Hepa-tite B; vírus da família Picornaviridae tais como, por exem-plo, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Humano e Vírusda Hepatite A; vírus da família Retroviridae tais como, porexemplo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Imunode-ficiência em Símios, Vírus T-Linfotrópico Humano e Vírus doSarcoma de Rous; vírus da família Coronaviridae tais como,por exemplo, Coronavirus da SARS; vírus da família Rhabdovi-ridae tais como, por exemplo, Vírus da Raiva e Vírus da Es-tomatite Vesicular; vírus da família Paramyxoviridae taiscomo, por exemplo, Vírus Sincicial Respiratório e Vírus daParainfluenza; vírus da família Papillomaviridae tais como,por exemplo, Papilomavírus Humano e vírus da família Herpes-viridae tais como, por exemplo, Vírus do Herpex Simplex.

É outro objetivo da invenção proporcionar conjuga-dos, tais conjugados compreendendo uma ou mais porções não-polipeptídicas ligadas a um polípeptídeo da invenção, conju-gado o qual exibe uma propriedade antiviral e o qual exibe,opcionalmente, outras propriedades desejáveis, tais comomeia-vida aumentada no soro e/ou meia-vida funcional in vivoe/ou antigenicidade diminuída, comparado com o polípeptídeonão-conjugado. Alguns de tais conjugados podem exibir eficá-cia intensificada na eliminação de um vírus de células in-fectadas com o vírus, comparado a uma sintetase de oligoade-nilato de referência. Alguns de tais conjugados podem aindater toxicidade reduzida comparado com uma sintetase de oli-goadenilato de referência.

É outro objetivo da invenção proporciona um métodode inibição de replicação viral em células infectadas comvirus, o método compreendendo administração, às células in-fectadas com virus, de um polipeptideo ou conjugado da in-venção em uma quantidade eficaz para inibir replicação viralnas referidas células. A invenção também proporciona um mé-todo de redução do número de cópias de um virus em célulasinfectadas com virus compreendendo administração, às célulasinfectadas com virus, de um polipeptideo ou conjugado da in-venção em uma quantidade eficaz para reduzir o número de có-pias do virus nas referidas células. As células podem estarem cultura ou, de outro modo, ser isoladas de um mamífero(isto é, in vitro ou ex vivo) ou podem estar in vivo, porexemplo, em um indivíduo, em um mamífero, em um primata ouno homem.

Tratamentos Anti-câncer e Inflamação

Foi demonstrado que os polípeptídeos da invençãopodem fazer com que determinados tipos de células e linha-gens de células sofram apoptose ou realizem retardo de cres-cimento das referidas linhagens de células ou tipos de célu-las. Tais linhagens de células ou tipos de células incluem,em uma modalidade exemplificativa, aqueles derivados dapróstata e mama.

A invenção proporciona um método de inibição deproliferação de uma população de células compreendendo con-tato da população de células com um polipeptideo da invençãoem uma quantidade eficaz para diminuir a proliferação da po-pulação de células. Δ população de células pode estar emcultura ou, de outro modo, ser isolada de um mamífero (istoé, in vitro ou ex vivo) ou pode estar in vivo, por exemplo,em um indivíduo, em um mamífero, um primata ou no homem.

A invenção proporciona tratamento de cânceres edoenças neoplásicas usando os polipeptídeos e polinucleotí-deos da invenção. Cânceres e doenças neoplásicas exemplifi-cativos incluem, mas não estão limitados a: carcinoma adre-nocortical, cânceres relacionados à AIDS, sarcoma de Kaposi,linfoma AIDS-relacionado, câncer anal, astrocitoma, carcino-ma de células basais, cânceres do duto biliar, câncer da be-xiga, cânceres ósseos, osteosarcomas, histiocitomas fibrososmalignos, glioma do tronco cerebral, tumores cerebrais, gli-ornas, astrocitomas, gliomas malignos, ependimomas, medu-loblastomas, neuroblastomas, tumor neuroectodérmico primiti-vo supratentorial, glioma hipotalâmico e da via visual, cân-cer de mama, adenoma brônquico, linfoma de Burkitt, tumorescarcinóides, linfoma do sistema nervoso central, câncer cer- vical, leucemias, leucemia de células pilosas, leucemia Iin-foblástica aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocí-tica crônica e leucemia mielogênea crônica, distúrbios mie-loproliferativos crônicos, câncer cólon-retal, linfoma decélulas T cutâneas, câncer endometrial, câncer esofageal, afamília Ewing de tumores, tumor de células germinativas ex-tracraniano, tumor de células germinativas extragonadal, ·cânceres dos olhos, melanoma intraocular, câncer da cabeça e·pescoço, carcinoma hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfo-ma não-Hodgkin, linfoma primário do CNS, câncer nasofaringe-al, carcinoma de células da ilhota, câncer renal (célula re-nal), câncer laringeal, câncer dos lábios e oral, câncer defígado, câncer de pulmão, cânceres de pulmão de células não-pequenas e células pequenas, macroglobulinemia de Waldens-trom, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncerescamoso metastático do pescoço, neoplasia endócrina múlti-pla, mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas,fungóides de micose, síndromes mielodisplásicas, doenças mi-eloproliferativas, câncer do sinus paranasal e da cavidadenasal, câncer ovariano, tal como de células germinativas eepiteliais, tumor ovariano com baixo potencial maligno, cân-cer pancreático, câncer da paratireóide, câncer de pênis,feocromocitoma, tumor da pituitária, blastoma pleuropulmo-nar, câncer de próstata, rhadbomiosarcoma, câncer da glându-la salivar, sarcomas, síndrome de Sezary, câncer de pele talcomo, por exemplo, melanoma e carcinoma de células escamo-sas, câncer testicular, timoma, carcinoma tímico, câncer datiróide, câncer de células transitórias, tumor trofoblásti-co, câncer uretral, câncer uterino, câncer vaginal, câncervulvar e tumor de Wilm.

A invenção ainda proporciona tratamento de doençasautoimunes e inflamação usando os polipeptídeos e polinucle-otídeos da invenção, as referidas doenças autoimunes e in-flamatórias incluem, mas não estão limitadas a: asma, doençade Crohn, síndrome de Guillain-Barré, esclerose múltipla,miastenia gravis, neurite óptica, psoríase, artrite reuma-tóide, doença de Grave, doença de Hashimoto (tiroidite) , ti-roidite de Ord, diabetes, diabetes mellitus, sindrome de Re-iter, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, cirrosehepática, fibrose hepática, sindrome de anticorpo antifosfo-lipidio, sindrome de mioclonus opsoclonus, arterite tempo-ral, encefalomielite disseminada aguda, sindrome de Goodpas-ture, granulomatose de Wegener, doença celiaca, pênfigo, po-liartrite, anemia hemolitica autoimune do verão, arterite deTakayasu, doença da artéria coronária, endometriose, cistiteintersticial, neuromiotonia, escleroderma, vitiligo, vulvo-dinia, doença de Chagas, sarcoidose, sindrome de fadiga crô-nica, sindrome de dificuldade respiratória aguda, tendinite,bursite, polimialgia reumática, doença inflamatória do in-testino, doença pulmonar obstrutiva crônica, rinite alergia,doença cardiovascular, colecistite crônica, bronquiectasia,pneumoconiose tal como, por exemplo, silicose, osteoartrite,aterosclerose, disautonomia, espondilite anquilosante, uve-Iite anterior aguda, lupus eritematoso sistêmico, diabetesmellitus dependente de insulina, pênfigo vulgaris, encefalo-mielite experimental alérgica, uveorenite autoimune experi-mental, doença mista do tecido conectivo, sindrome de Sjor-gen, anemia hemolitica autoimune, trombocitopenia púrpura,febre reumática aguda, crioglobulinemia essencial mista, ar-trite reumatóide juvenil, doença degenerativa da articula-ção, espondilite anquilosante, artrite psoriática, neural-gia, sinoviite, glomerulonefrite, vasculite, inflamações queocorrem como seqüelas à influenza, a gripe comum e outrasinfecções virais, gota, dermatite de contato, dor na parteinferior das costas e pescoço, dismenorréia, dor de cabeça,dor de dente, torções, distensões, miosite, queimaduras, fe-ridas e dor e inflamação que seguem após procedimentos ci-rúrgicos e dentais em um indivíduo.

Crescimento Celular e Tratamentos de Regeneração Tecidual

Foi mostrado que os polipeptídeos da invenção es-timulam um programa de promoção de crescimento mitogênico emtipos de células e linhagens de células específicas taiscomo, por exemplo, células de hepatoma Huh7 e células de fi-broblasto de pulmão fetal MRC5. Esse programa mitogênico éidentificado usando análise em microarranjos de expressão eensaios de viabilidade celular de células e linhagens de cé-lulas tratadas com os polipeptídeos da invenção. A invençãoproporciona usos dos polipeptídeos da invenção para estimu-lar o crescimento celular e regeneração tecidual in vitro,in vivo e ex vivo usando tecidos e células derivados de in-divíduos ou mamíferos.

Derivados dos Polipeptídeos da Invenção

A invenção proporciona polipeptídeos que diferemde qualquer um dos polipeptídeos das Figuras 1-5 em 1 a 34aminoácidos, tais diferenças podem incluir substituições,inserções, deleções, a incorporação de aminoácidos modifica-dos ou derivados de aminoácido e a adição ou deleção de ami-noácidos do C-término ou N-término dos polipeptídeos. Uma oumais substituições de aminoácido podem ser feitas nos poli-peptídeos da invenção de acordo, por exemplo, com um grupode substituição (tal como um grupo de substituição conserva-tiva), tal como um apresentado abaixo. Alternativamente oualém disso, uma ou mais substituições de aminoácido podemser feitas nos polipeptídeos, as quais introduzem ou removemum resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de fixaçãopara uma porção não-polipeptidica. Exemplos incluem introdu-ção de um ou mais sítios de N-glicosilação, introdução de umou mais resíduos de cisteína ou resíduos de lisina, remoçãode um ou mais sítios de N-glicosilação e/ou remoção de umaou mais lisinas ou histidinas. Alguns de tais polipeptídeosexibem uma atividade de sintetase de oligoadenilato. Gruposde substituição conservativa incluem: Grupo 1, Alanina (A)Glicina (G) Serina (S) Treonina (T), Grupo 2, Ácido Aspárti-co (D) Ácido Glutâmico (E), Grupo 3, Asparagina (N) Glutami-na (Q), Grupo 4, Arginina (R) Lisina (K) Histidina (H), Gru-po 5, Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V) eGrupo 6, Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptofano (W) . Ou-tros grupos de substituição de aminoácidos podem ser consi-derados. Por exemplo, aminoácidos podem ser agrupados pelafunção ou estrutura química ou composição similar (por exem-plo, ácido, básico, alifático, aromático, contendo enxofre).

Por exemplo, um agrupamento alifático pode compreender: Gli-cina (G) , Alanina (A) , Valina (V) , Leucina (L) , Isoleucina(I). Outros grupos contendo aminoácidos que são consideradossubstituições conservativas uns pelos outros incluem: Aromá-ticos: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); Con-tendo enxofre: Metionina (M), Cisteína (C); Básicos: Argini-na (R), Lisina (K), Histidina (H);- Ácidos: Ácido aspártico(D) , Ácido glutâmico (E) , Asparagina (N) , Glutamina (Q) .Veja também Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Com-pany, para agrupamentos de aminoácidos adicionais. Listagemde uma seqüência de polipeptideo aqui, em conjunto com osgrupos de substituição acima, proporciona uma listagem ex-pressa de todas as seqüências de polipeptideo conservativa-mente substituídas.

Em um aspecto, a invenção proporciona polipeptí-deos isolados ou recombinantes, cada um compreendendo umaseqüência tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência(por exemplo, pelo menos cerca 91%, pelo menos cerca 92%,pelo menos cerca 93%, pelo menos cerca 94%, pelo menos cerca95%, pelo menos cerca 96%, pelo menos cerca 97%, pelo menoscerca 98% ou pelo menos cerca 99% de identidade de seqüênciade aminoácido) a qualquer um dos polipeptídeos da Figura 5.

Em alguns casos, o polipeptideo exibe atividade de sintetasede oligoadenilato.

O grau ao qual uma seqüência (polipeptideo ou áci-do nucleico) é similar à outra proporciona uma indicação depropriedades estruturais e funcionais similares para as duasseqüências. Conseqüentemente,; no contexto da presente inven-ção, seqüências as quais têm, uma seqüência similar a qual-quer dada seqüência exemplificativa são uma característicada presente invenção. Em particular, seqüências que têmidentidades percentuais de seqüência, conforme definidoabaixo, são uma característica da invenção. Uma variedade demétodos de determinação de relações de seqüência pode serusada, incluindo alinhamento manual e alinhamento e análisede seqüência auxiliados por: computador. Uma variedade deprogramas de computador para realização de alinhamentos deseqüência está disponível ou um alinhamento pode ser prepa-rado manualmente por aqueles habilitados.

Conforme mencionado acima, as seqüências dos poli-peptídeos e ácidos nucleicos empregados na invenção em ques-tão não precisam ser idênticos, mas podem ser substancial-mente idênticos à seqüência correspondente de um polipeptí-deo da invenção ou ácido nucleico da invenção. Por exemplo,polipeptídeos da invenção podem estar sujeitos á várias al-terações, tais como uma ou mais inserções, deleções e/ousubstituições de aminoácido, quer conservativas ou não-conservativas incluindo onde, por exemplo, tais alteraçõespoderiam proporcionar determinadas vantagens quanto a seuuso, tais como quanto a seu uso terapêutico ou profiláticoou administração ou aplicação diagnostica. Os ácidos nuclei-cos da invenção também podem estar sujeitos à várias altera-ções, tais como uma ou mais substituições de um ou mais áci-dos nucleicos em um ou mais códons, de modo que um códonparticular codifica o mesmo ou um aminoácido diferente, re-sultando em uma variação silenciosa (conforme definido aqui)ou variação não-silenciosa ou uma ou mais deleções de um oumais ácidos nucleicos (ou códons) na seqüência. Os ácidosnucleicos podem também ser modificados para incluir um oumais códons que proporcionam expressão ótima em um sistemade expressão (por exemplo, bacteriano ou mamífero) ao mesmotempo em que, se desejado, o referido um ou mais códons ain-da codificam o(s) mesmo(s) aminoácido(s). Tais alterações deácido nucleico poderiam proporcionar determinadas vantagensquanto a seu uso ou administração terapêutica ou profiláticaou aplicação diagnostica. Os ácidos nucleicos e polipeptí-deos podem ser modificados de uma série de formas, na medidaem que eles compreendam uma seqüência substancialmente idên-tica (conforme definido abaixo) a uma seqüência em um res-pectivo ácido nucleico ou polipeptideo da invenção.

O termo "idêntica" ou "identidade", no contexto deduas ou mais seqüências de ácido nucleico ou polipeptideo,se refere a duas ou mais seqüências que são as mesmas ou têmum percentual especifico de resíduos de aminoácido ou nucle-otídeos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadaspara similaridade máxima, conforme determinado usando um al-goritmo de comparação de seqüência ou através de inspeçãovisual.

A "identidade percentual de seqüência (identidade%)" de uma seqüência em questão a uma seqüência de referên-cia (isto é, query) significa que a seqüência em questão éidêntica (isto é, em uma base aminoácido-por-aminoácido parauma seqüência de · polipeptideo ou uma base nucleotídeo-por-nucleotídeo para . uma seqüência de polinucleotídeo) em umpercentual específico à seqüência query sobre um comprimentode comparação.

Mutagênese Sitio-Dirigida para Criar os Polipeptí-deos da Invenção

Os polipeptídeos da presente invenção podem sermanipulados usando qualquer métodos padrão de mutagênese sí-tio-dirigida. As seqüências de ácido nucleico correspondendoaos polipeptídeos: da invenção são sintetizadas usando pri-mers de oligonucleotídeo específicos e uma DNA polimerase dealta fidelidade. A seqüência alvo está contida sobre umplasmideo fita dupla isolado de uma cepa de E. coli metila-ção-competente. Oligonucleotideos complementares contendo amutação desejada são sintetizados e purificados usando ele-troforese em gel de poliacrilamida. Um ciclizador térmico éusado para controlar a temperatura durante ciclos alternadosde desnaturação do template de plasmideo fita dupla (94 0Cdurante 30 segundos), anelamento dos primers de oligonucleo-tideo (55 0C durante 1 minuto) e extensão dos primers comuma polimerase de alta fidelidade (68 0C durante 1 minuto/kbde comprimento de plasmideo). Após aproximadamente 15 ci-clos, a mistura de DNA de entrada e recentemente sintetizadoé tratada com uma enzima de restrição especifica para resí-duos metilados (DpnI) para digerir o plasmideo precursor. ODNA resultante é introduzido em cepas bacterianas química oueletricamente competentes para seleção e isolamento de plas-mídeos contendo a mutação desejada. DNA de plasmideo é iso-lado dos transformantes e selecionado via seqüenciamento determinador-rcorante fluorescente para confirmar a seqüênciamutante.

Expresso de Produto de fármaco Bruto, Fermentaçãoe Purificação

Uma cepa de E. coli contendo um lisógeno de ÀDE3e, portanto, trazendo uma cópia cromossômica do gene de RNApolimerase T7 sob o controle do promotor lacUV5, é transfor-mada com um vetor de expressão bacteriana contendo um promo-tor IPTG-induzível que codifica uma seqüência de ácido nu-cleico correspondendo a um ou mais dos polipeptídeos da pre-sente invenção. Culturas são crescidas em meio de caldo deLuria suplementado com 34 μς/ιτΛ de cloranfenicol e 15 μς/mLde canamicina a 37 °C. Quando a OD60O atinge >0,4, a tempe-ratura é reduzida para 18 0C e as células são incubadas comIPTG a 0,5 mM durante 17 horas. As células bacterianas são,então, resuspensas em tampão contendo NaH2PO4 a 50 mM, pH de8, NaCl a 300 mM, imidazola a 20 mM, glicerol a 10%, NP40 a0,1%, DTT a 2 mM e inibidores de protease (VWR) , submetidasà Iise em um homogeneizador de Gaulin e centrifugadas pararemover os restos celulares antes de purificação de proteína.

Em uma modalidade, purificação dos polipeptídeosda presente invenção pode ser obtida usando uma tag de po-lihistidina no amino término. Uma coluna de níquel é usadaem purificações por afinidade de tags de polihistidina com,por exemplo, uma coluna de 5 mL sendo utilizada para lisatogerado por 4 L de E. coli. O lisato é carregado sobre a co-luna e, então, lavado com Tampão A (NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a300 mM, glicerol a 30%, imidazola a 20 mM, DTT a 2 mM em umpH de 7,5) . Uma etapa de eluição para 7% de Tampão B(NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a 300 mM, glicerol a 30%, imidazola a2 M, DTT a 2 mM em um pH de 6,8) sobre 3,2 volumes de colunaé, então, realizada. Um gradiente em 100% de Tampão B sobre3 volumes de coluna é, então, realizado. O polipeptídeo dapresente invenção pode, então, ser filtrado em gel em TampãoC (NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a 150, glicerol a 40%, EDTA a 1 mM,DTT a 2 mM em um pH de 6,8) e carregado sobre uma coluna detroca de cátions para outra purificação. Após a proteína sercarregada, a coluna é lavada com Tampão C, seguido por umaeluição em etapas para 75% de Tampão D (NaH2PO4 a 50 mM ,NaCl a 1 M, glicerol a 40%, EDTA a 1 mM, DTT a 2 mM em um pHde 6,8), então, um gradiente em 5 volumes de coluna para100% de Tampão D. A proteína é, então, filtrada em gel emTampão E (NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a 300 mM, glicerol a 40%,EDTA a 1 mM, DTT a 2 mM em um pH de 6,8) e armazenada a -20 °C.

Diferentes modalidades dos polipeptídeos da inven-ção incluindo, mas não limitado a: aquelas carecendo de umatag de histidina, aquelas possuindo uma tag de poliarginina,aquelas com teor reduzido de cisteína, aquelas com variaçõesda seqüência de aminoácido projetada para tornar o candidatoa fármaco mais termicamente estável, aquelas com modifica-ções para intensificar ou reduzir uma atividade particulardo candidato a fármaco, podem requerer estratégias de puri-ficação alternativas. Modalidades do candidato a fármaco depolipeptídeo podem requerer estratégias de purificação al-I ternativas. Modalidades do candidato a fármaco de polipeptí-deo carecendo de uma tag de polihistidina, por exemplo, po-dem ser diretamente aplicadas a uma coluna de troca de cáti-ons. Etapas adicionais, por exemplo, o uso de cromatografiapor interação hidrofóbica, podem ser utilizadas captando aproteína em Tampão F (NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a 300 mM, NHO2SO4a 1M, glicerol a 30%, EDTA a 1 mM, DTT a 2 mM em um pH de6,8) e operando um gradiente em volume de 10 colunas a Tam-pão E a 100%. Outras colunas de afinidade ou colunas de di-mensionamento podem ser usadas para purificar diferentes mo-dalidades dos candidatos a fármaco de polipeptídeo.

Técnicas alternativas também podem ser usadas paratroca de tampões, concentração dos candidatos a fármaco epurificação dos candidatos a fármaco. Essas poderiam inclu-ir, mas não estão limitadas a, ultrafiltração, filtração comfluxo tangencial e diafiltração para a concentração do can-didato a fármaco e para troca de tampões. Técnicas tal comoprecipitação dos candidatos a fármaco por (NILi)2SO4 ou ou-tro agente químico também podem ser usadas. Desnaturação docandidato a fármaco em uréia ou algum outro desnaturante ereduplicação do mesmo também pode ser usada.

Os polipeptídeos da presente invenção são estabi-lizados por excipientes contendo sais; soluções estáveis emNaCl a 300 mM podem começar a precipitar em NaCl a 150 mM.Por essa razão, misturas excipientes favorecem essas concen-trações de sal de estabilização os quais poderiam incluir,mas não estão limitados a, fosfato de sódio, cloreto de só-dio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

Foi provado que a adição de excipientes baseadosem aminoácido, tal como arginina, é estabilizante aos poli-peptídeos da presente invenção. Uma solução a 10% de sacaro-se permite que os polipeptídeos da invenção sejam estáveis a1 mg/mL, a adição de arginina a 2% peso/v permite, em algu-mas modalidades, que os polipeptídeos sejam estáveis a 3mg/mL. Por essa razão, outros compostos baseados em aminoá-cido incluindo, mas não limitado a, histidina, glutamina,glicina e albumina humana, podem ser usados como excipientes.A adição de excipientes, tal como glicerol, esta-biliza os polipeptideos da presente invenção. Por exemplo,em uma modalidade, um polipeptideo tem uma concentração má-xima com glicerol a 10% (v/v) de 1 mg/mL; enquanto que emglicerol a 40%, os candidatos a fármaco são estáveis até 12mg/mL. São consideradas misturas excipientes contendo com-postos com propriedades químicas similares que incluem, masnão estão limitados a, polióis, tais como manitol, xilitol esorbitol. Descobriu-se que dissacarideos, tal como sacarose,são estabilizantes a 10% peso/v; outros dissacarideos inclu-indo, mas não limitado a, maltose e trealose, também podemser usados. Monossacarideos também podem ser usados na pre-sente invenção. Polisorbatos, polietileno glicóis e compos-tos similares também podem ser usados para praticar a pre-sente invenção.

Conforme aqueles habilitados na técnica reconhece-rão, o uso de antioxidantes e conservantes também pode serusado para assegurar estabilidade dos polipeptideos durantearmazenamento. Antioxidantes incluindo, mas não limitado a,citrato de sódio, podem ser usados para estabilização duran-te armazenamento a longo prazo dos polipeptideos da inven-ção. Conservantes incluindo, mas não limitado a, álcool ben-zílico, podem também ser usados para estabilização dos poli-peptideos durante armazenamento e podem ser usados em mistu-ras excipientes finais.

Medição de Atividade de Sintetase de Oligoadenila-to de Polipeptideos

As atividades de sintetase de oligoadenilato dospolipeptideos da invenção são medidas de acordo com métodosanteriormente publicados (Justesen, J. e colaboradores. NucAcids Res. 8: 3073- 3085, 1980). Resumidamente, proteína éativada com 200 μς/ιπί de ácido poliinosínico:policitidíIicoem tampão contendo Tris-HCl a 20 mM, pH de 7,8, Mg(OAc)2 a50 mM, DTT a 1 mM, EDTA a 2 mM, ATP a 2,5 mM, a[32P]ATP, BSAa 0,5 mg/ml e glicerol a 10%. A reação se processa a 37 0Cdurante 30 minutos a 24 horas e é terminada através de aque-cimento para 90 0C durante 3 minutos. 2-4 μΐ da mistura dereação são colocados sobre uma lâmina com camada fina dePEI-nitrocelulose. Após secagem, a lâmina é relevada comTris-HCl a 0,4 M, MgCl2 a 30 mM, pH de 8,7. A lâmina é secae visualizada através de análise em um Phosphorimager. Al-ternativamente, a mistura de reação pode ser ainda incubadacom 0,05 U/μΙ de fosfatase intestinal de bezerro para remo-ver o fosfato terminal. Separação cromatográfica em camadafina é obtida usando um sistema tampão de revelação deKH2PO4 a 0,76M, pH de 3,6. A lâmina é, então, seca e visua-lizada através de análise no Phosphorimager.

Medição de Atividade Viral de Polipeptideos

A capacidade dos polipeptideos da presente inven-ção de proteger células cultivadas de vírus citotóxicos édemonstrada usando um modelo de infecção pelo vírus da ence-falomiocardite de murino (EMC, ATCC cepa VR-129B). Outrosmodelos de infecção in vitro incluem, mas não estão limita-dos a, flavivírus, tais como vírus da diarréia bovina, vírusWest Nile e vírus GBV-C, outros vírus de RNA, tal como vírussincícial respiratório e os sistemas de replicon de HCV (porexemplo, Blight, KJ. e colaboradores. 2002. J. Virologyl 76:13001-13014). Qualquer célula cultivada apropriada competen-te para replicação viral pode ser utilizada nos ensaios an-tivirais.

Células de hepatoma humano Huh7 são cultivadas emuma densidade de 1 χ IO4 células/cavidade em lâminas de cul-tura com 96 cavidades e incubadas durante a noite em meiocompleto (DMEM contendo soro bovino fetal a 10%). Na manhãseguinte, o meio é substituído por meio completo contendoproteína a 0-10 μΜ ou quantidades equivalentes de tampão dediluição de proteína. Quando desejado, alfa-interferon éadicionado em uma concentração de 100 IU/ml. As células sãopré-tratadas durante 2-8 horas antes de ínfecção viral. Apóspré-tratamento, um volume igual de meio contendo diluiçõesde vírus EMC em meio completo é adicionado às cavidades. Nosexperimentos descritos aqui, uma faixa de 50-500 unidades deformação de placa (pfu) é adicionada por cavidade.

Infecção viral é deixada prosseguir durante a noi-te (aproximadamente 18 horas) e a proporção de células viá-veis é calculada usando quaisquer reagentes de citotoxicida-de ou viabilidade celular disponíveis. Os resultados descri-tos aqui são obtidos usando um ensaio de viabilidade celularque mede a conversão de um composto de tetrazólido, [3 —(4,5 —dimetil-2-il)-5-(3-carbóximetóxifenil)-2-(4-sulfofenil) - 2H-tetrazólio, sal interno; MTS] em um composto de formazanocolorido em células viáveis. A conversão de MTS em formazanoé detectada em um leitor para lâmina com 96 cavidades em umaabsorbância de 492 nm. As densidades ópticas resultantes sãoplotadas diretamente para estimar a viabilidade celular ousão normalizadas por amostras tratadas com controle paracalcular um percentual de células viáveis após tratamento.

Peguilação de Polipeptideo: Sulfidrila

Conjugação de polietileno glicol (PEG) aos poli-peptideos da invenção foi obtida através de mistura de poli-peptideo purificado isento de ditiotreitol (DTT) com mPEG-MAL ativado (Nektar Therapeutics) em uma proporção molar de0,5-10:1. A reação processou em temperatura ambiente durante5 min-2 horas e foi resfriada através da adição de DTT a 2mM. Conjugação ocorreu em múltiplos sítios de cisteína usan-do PEGs linear de 20 kDa e ramificado de 40 kDa (FIGURAS 6Ae 6B). Formas não-peguiladas e formas contendo um ou maisPEGs podem ser separadas umas das outras usando uma varieda-de de metodologias cromatográficas, conforme conhecido poraqueles habilitados na técnica. Em modalidades exemplifica-tivas da presente invenção, colunas de troca de íons, colu-nas de interações hidrofóbicas, filtração de gel e cromato-grafia por exclusão de tamanho, cada uma sozinha ou em com-binação umas com as outras, podem ser utilizadas para isola-mento das diferentes formas de PEG.

Peguilação de Polipeptideo: N-terminalPolipeptideos da invenção podem ser peguilados naamina N-terminal. A polipeptídeos em NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a300 mM, glicerol a 30%, EDTA a 1 mM, DTT a 2 mM em um pH de5 contendo cianoborohidreto de sódio a 20 mM e agitação emum banho de gelo é adicionado um excesso de 5 vezes de mPEGbutyrALD-4OK. A reação é deixada processar durante até dezhoras e, então, resfriada através da adição de um excesso de50 vezes de glicina. Os produtos de reação são analisadosatravés de SDS-PAGE.

Os exemplos a seguir são oferecidos à guisa deilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

MODIFICAÇÕES DE AMINOÁCIDO EM PROTEÍNAS OASl DEPRIMATA NÃO-HUMANO

Os genes OASl de primatas não-humanos foram se-qüenciados e comparados com mutações encontradas no gene deOASl humano. Tais mutações proporcionam insight adicionalsobre a evolução do gene e proteína OASl. Aminoácidos evolu-cionariamente conservados sugerem sitios importantes, oucríticos, para função ou atividade enzimática de OASl. In-versamente, sítios de aminoácido de OASl que sofreram muta-ção recentemente, por exemplo, em seres humanos apenas, oumostram uma pluralidade de substituições de aminoácido com-parado com primatas, indicam sítios menos críticos para fun-ção ou atividade enzimática. A abundância de sítios com mu-tação dentro de um motivo particular da proteína OASl estácorrelacionada com a tolerância desse domínio funcional àmodificação. Tais sítios e motivos são otimizados para aper-feiçoar a função ou atividade específica da proteína. Simi-larmente, supõe-se que mutações em genes e proteínas comfunções de defesa imune ou viral, tal como 0AS1, resultem deestímulo histórico por infecção viral. Supõe-se que mutaçõesem proteínas OASl de primatas melhorem a eficácia anti-viralem sua base e são oportunidades para otimização de uma pro-teína OAS terapêutica humana.

Em uma modalidade exemplificativa, o aminoácido doprimata ancestral para um sítio específico dentro da OASlpode ser restaurado para uma forma terapêutica humana daproteína OASl para otimizar atividade específica ou eficáciaanti-viral da proteína. Em outras modalidades, aminoácidosalternativos identificados em OASls de primatas não-humanos,mas não necessariamente conservados ancestralmente, sãosubstituídos em uma forma terapêutica humana de OASl de for-ma a aperfeiçoar a atividade específica ou eficácia anti-viral da proteína. Seqüências de DNA e mRNA que codificam asproteínas nativas de primata, bem como formas híbridas deprimata-humano são novas e têm utilidade. Vários exemplos desua utilidade são: como agentes para detectar suas respecti-vas contra-partes de DNA ou mRNA; em vetores de expressãousados na fabricação de proteínas terapêutica; e na detecçãode novos compostos que se ligam ao respectivo mRNA.

A Figura 1 proporciona uma forma terapêutica; deOASl (SEQ ID NO: 1). Modificações nessa forma de modo a pro-porcionar formas terapêuticas adicionais são realizadasusando pelo menos uma modificação de aminoácido, conformeproporcionado na Figura 2. Conforme descrito na Figura 2,uma modificação útil é a remoção da metionina inicial de SEQID NO: 1 e outras formas de OASl. Modificações adicionaissão feitas conforme indicado na Figura 3. As modificaçõesprecedentes descritas nas Figuras 2 e 3 também são aplicadasà outras isoformas de OASl terapêuticas proporcionadas naFigura 5. A Figura 3 também proporciona modificações especi-ficas de proteínas OASl que são carboxila-término homólogasao acesso ao Genbank NP_002525.1 (por exemplo, SEQ ID NO:3), modificações específicas de proteínas de OASl que sãocarboxila-término homólogas ao acesso ao GenbankNP_0058132.1 (por exemplo, SEQ ID NO: 2) e modificações es-pecíficas de proteínas de OASl que são carboxila-término ho-mólogas ao acesso ao Genbank NP_001027581.1 (por exemplo,SEQ ID NO: 4). Listadas na Figura 4 são mutações exemplifi-cativas identificadas em primatas não-humanos, incluindo go-rila, chimpanzé, orangotango e macaco. A Figura 5 lista iso-formas de OASl de primata não-humano e ser humano adicionaisque são úteis para os fins diagnósticos e terapêuticos dapresente invenção, bem como mutações particulares em prima-tas descritas pela presente invenção.

EXEMPLO 2

PREPARO E SEQUENCIAMENTO DE cDNA

RNA celular total é purificado de linfoblastos oufibroblastos cultivados dos pacientes tendo o fenotipo deresistência à hepatite C. 0 procedimento de purificação érealizado conforme descrito por Chomczynski e colaboradores,Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987). As células são homoge-neizadas em 10 mililitros (ml) de uma solução de desnatura-ção contendo tiocianato de guanidina a 4,OM, Tris-HCl a 0,1Mem um pH de 7,5 e beta-mercaptoetanol a 0,1M para formar umlisato de células. Lauril sarcosinato de sódio é, então,misturado até uma concentração final de 0,5% ao lisato decélulas, após o que a mistura foi centrifugada a 5000 X gdurante 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadanteresultante contendo o RNA total é colocado em camadas sobreum forro de cloreto de césio a 5,7M e EDTA a 0,01M em um pHde 7,5 e é pelotizado através de centrifugação. A pelota deRNA resultante é dissolvida em uma solução de Tris-HCl a 10mM em um pH de 7,6 e EDTA a 1 mM (TE) contendo dodecil sul-fato de sódio a 0,1% (SDS). Após extração com fenolclorofór-mio e precipitação com etanol, a concentração de RNA celulartotal purificado é estimada medindo-se a densidade óptica a260 nm.

RNA total preparado acima é usado com um templatepara síntese usando transcriptase reversa para síntese deprimeira fita e PCR com primers de oligonucleotídeo projeta-dos de modo a amplificar o cDNA em dois fragmentos sobrepos-tos designados o fragmento 5' e 3'. Os oligonucleotídeosusados na prática da presente invenção são sintetizados so-bre um Sintetizador de DNA Applied Biosystems 381A seguindoas instruções do fabricante. PCR é conduzida usando métodosconhecidos na técnica. Métodos de amplificação por PCR sãodescritos em detalhes nas Pats. U.S. Nos. 4.683.192,4.683.202, 4.800.159 e 4.965.188 e pelo menos em vários tex-tos, incluindo PCR Technology: Principies and Applicationsfor DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, NewYork (1989); e PCR Protocols: A Guide to Methods and Appli-cations, Innis e colaboradores, eds., Academic Press, SanDiego, Calif. (1990) e primers baseados nas seqüências denucleotídeo que codificam as regiões com aminoácido modifi-cado, conforme divulgado aqui.As seqüências determinadas diretamente a partirdos DNAs PCR-amplifiçados dos pacientes com e sem infecçãoHCV são analisadas. A presença de uma mutação a montante daregião de codificação do gene de OAS pode ser detectada empacientes que são soro-negativos para HCV, a despeito de ex-posições repetidas ao vírus.

A especificação precedente, incluindo as modalida-des específicas e exemplos, se destina a ser ilustrativa dapresente invenção e não deve ser tomada como limitativa. Nu-merosas outras variações e modificações podem ser realizadassem se desviar do verdadeiro espírito e escopo da invenção.Todas as patentes, publicações de patente e publicações denão-patente citadas são incorporadas por referência aqui.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Illumigen Biosciences inc.

<120> "MUTAÇÃO EM GENES OAS1"

<130> 55382-52

<140> PCT/US06/016983<141> 2006-05-03

<150> 60/677,680<151> 2005-05-04

<160> 16

<170> FastSEQ VERSÃO PARA WINDOWS 4.0

<210> 1<211> 346<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 1

Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile

15 10 15

Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His

20 25 30

Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly

35 40 45

Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys vai Val Lys Gly Gly ser Ser

50 55 60

Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg ser Asp Ala Asp Leu Val Val65 70 75 80

Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly

85 90 95

Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu

100 105 110

Arg Ala Phe Ser vai Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn

115 120 125

Pro Arg Ala Leu ser Phe Val Leu ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly

130 135 140

Val Glu Phe Asp vai Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr145 150 155 160

Gly Ser Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu

165 170 175

Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu

180 185 190

Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu

195 200 205

Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly

210 215 220

Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr vai Tyr Ala Trp225 230 235 240

Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg

245 250 255

Thr Val Leu Glu Leu vai Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp

260 265 270

Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg

275 280 285

Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro

290 295 300

Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala305 310 315 320

Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp325 330 335Gly Ser Pro Val Ser ser Trp Ile Leu Leu340 345

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys ser Leu Asp Lys Phe ile

15 10 15

Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His

20 25 30

Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly

35 40 45

Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser ser

50 55 60

Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val vai65 70 75 80

Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly

85 90 95

Glu Phe ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu

100 105 110

Arg Ala Phe ser vai Lys Phe Glu vai Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn

115 120 125

Pro Arg Ala Leu ser Phe Val Leu ser ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly

130 135 140

Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr145 150 155 160

Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu

165 170 175

Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu

180 185 190

Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu

195 200 205

Ile Arg Leu vai Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly

210 215 220

Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp225 230 235 240

Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg

245 250 255

Thr Val Leu Glu Leu vai ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp

260 265 270

Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg

275 280 285

Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro vai Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro

290 295 300

Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala305 310 315 320

Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp

325 330 335

Gly Ser Pro vai ser Ser Trp Ile Leu Leu Ala Glu Ser Asn ser Ala

340 345 350

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Glu Asp Tyr Leu Leu Pro, Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His

20 25 30

Ala Ile Asp Thr Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly

35 40 45

ser ser Tyr Pro Ala Arg Val ser Lys Val Val Lys Gly Gly ser ser

50 55 60

Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg ser Asp Ala Asp Leu Val Val65 70 75 80

Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly

85 90 95

Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Lys Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu

100 105 110

ser Ile Phe Arg Glu Val115

<210> 14<211> 400<212> PRT

<213> Pongo pygmaeus abelii<220>

<221> VARIANT<222> 113

<223> Xaa is Ser or Arg<220>

<221> VARIANT<222> 114

<223> Xaa is Ile or Ala<220>

<221> VARIANT<222> 116<223> Xaa is Arg or ser<220>

<221> VARIANT<222> 117

<223> Xaa is Glu or Val<220>

<221> VARIANT<222> 118

<223> Xaa is Val or Lys<220>

<221> VARIANT<222> 119

<223> Xaa is Phe or term<220>

<221> VARIANT<222> 142

<223> Xaa is Arg or Gly<220>

<221> VARIANT<222> 363

<223> Xaa is Pro or Gln<400> 14

Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile

15 10 15

Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His

20 25 30

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115 · 120 125

Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu ser ser Phe Gln Leu Xaa Glu Gly

130 13=5 140

Val Glu Phe Asp vai Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr145 150 155 160

Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr vai Lys Leu Ile Glu Glu

165 170 175

Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu

180 185 190

Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys ser Leu

195 200 205

Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly

210 215 220

Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp225 230 235 240

Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg

245 250 255

Thr Val Leu Glu Leu vai Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp

260 265 270

Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Leu Ser

275 280 285

Arg Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro

290 295 300

Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Ile Gly Trp Arg Gln Leu Ala305 310 31 "5 320Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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290 295 300

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165 170 175

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180 185 190

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355 360 365

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370 375 380

Leu Leu His Phe Gln vai Gly Leu Leu Ile Gln Arg Gly Gln Arg Ser385 390 395 400

ser vai ser Trp cys Ile Ile Gln Asp Arg Thr Gln vai ser405 410

Claims (28)

1. Método de seleção genética para identificaçãode uma mutação no gene de sintetase de oligoadenilato (OASl)compreendendo detecção, em uma amostra de ácido nucleico napresença de uma mutação na OASl, CARACTERIZADO pelo fato dea referida mutação resultar em pelo menos uma modificação deaminoácido na proteína OASl codificada.

2. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, exceto quanto apelo menos uma modificação de aminoácido na posição 1, 24,-25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113,-114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161,-162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279,-282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315 e 335.

3. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácido de uma proteína OASl que é carbo-xila-término homóloga ao acesso; ao Genbank NP_002525.1 e areferida seqüência de aminoácido. tem uma modificação de ami-noácido na posição 363.

4. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácido de uma proteína OASl que é carbo-xila-término homóloga ao acesso ao Genbank NP_058132.1, ex-ceto quanto a pelo menos uma modificação de aminoácido naposição 347, 350, 352, 353, 354, 356, 357, 361, 363, 364,-365, 369, 371, 373, 374, 375, 378, 379, 382, 388, 389 e 394.

5. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptideo tendoa seqüência de aminoácido de uma proteína OASl que é carbo-xila-término ao acesso ao Genbank NP_001027581.1, excetoquanto a pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 347, 361, 364, 372, 384, 385 e 399.

6. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptideo tendoa seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, exceto quanto apelo menos uma modificação de aminoácido na posição 1, 24,-25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113,-114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161,-162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279,-282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315, 335, 347, 350, 352,-353, 354, 356, 357, 361, 363, 364, 365, 369, 371, 373, 374,-375, 378, 379, 382, 388, 389 e 394.

7. Proteína de- sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de; compreender um polipeptideo tendoa seqüência de aminoácido . de SEQ ID NO: 3, exceto quanto apelo menos uma modificação de aminoácido na posição 1, 24,-25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113,-114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161,-162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279,-282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315, 335 e 363.

8. Proteína de· sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de- compreender um polipeptideo tendoa seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, exceto quanto apelo menos uma modificação de aminoácido na posição 1, 24,-25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113,-114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161,-162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279,-282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315, 335, 347, 361, 364,-372, 384, 385 e 399.

9. Proteína de sintetase de oligoadenilato 1,CARACTERIZADA pelo fato de compreender um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NO: 5- 16.

10. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato decodificar o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 2-9.

11. Composição terapêutica para tratamento ou pre-venção de infecção por um vírus em um mamífero,CARACTERIZADA pelo fato de a referida composição ser o poli-peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-9junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Composição terapêutica, de acordo com a rei-vindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de o vírus ser umfIavivírus.

13. Composição terapêutica, de acordo com a rei-vindicação 12·, CARACTERIZADA pelo fato de o vírus ser vírusda hepatite C.

14. Composição terapêutica, para tratamento decâncer em um mamífero, CARACTERIZADA pelo fato de a referidacomposição ser o polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2-9 junto com um veículo farmaceuticamenteaceitável.

15. Composição terapêutica, de acordo com a rei-vindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de o câncer ser cân-cer de próstata.

16. Composto terapêutico para tratamento ou pre-venção de infecção viral em um mamífero, CARACTERIZADO pelofato de o referido composto ser um inibidor da atividade dopolipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-9.

17. Composto terapêutico, de acordo com a reivin-dicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o composto terapêuti-co ser uma molécula anti-senso.

18. Composto terapêutico, de acordo com a reivin-dicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o composto terapêuti-co ser uma molécula de RNAi.

19. Composto terapêutico, de acordo com a reivin-dicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o composto terapêuti-co ser uma ribozima.

20. Composto terapêutico, de acordo com a reivin-dicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o composto terapêuti-co ser um anticorpo.

21. Kit diagnóstico para determinação de resistên-cia à infecção viral, CARACTERIZADO pelo fato de compreenderpelo menos um polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2-9.

22. Kit diagnóstico, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um ou maisde:(a) instruções para uso de pelo menos um poli-peptideo para seleção, diagnóstico, prognóstico, monitora-mento terapêutico ou qualquer combinação dessas aplicações;e(b) um rótulo ou bula indicando aprovação normati-va para uso em seleção, diagnóstico, prognóstico ou terapêu-tico ou qualquer combinação dos mesmos.

23. Kit diagnóstico, de acordo com a reivindicação-21, CARACTERIZADO pelo fato de o referido pelo menos um po-lipeptideo ser detectavelmente rotulado.

24. Método para tratamento de uma doença viral emum mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de compreender forneci-mento, ao indivíduo que precisa de tal tratamento, de umacomposição terapêutica de acordo com a reivindicação 11.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de a referida doença viral ser sele-cionada do grupo consistindo da família Flaviviridae, da fa-mília Picornaviridae, da família Hepadnaviridae, da famíliaCoronaviridae, da família Paramyxoviridae, da família Retro-viridae., da família Rhabdoviridae, da família Papillomaviri-dae e da família Herpesviridae.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de a referida doença viral ser sele-cionada do grupo consistindo de Vírus da Hepatite C, Vírusda Febre Amarela, Vírus West Nile, Vírus da Encefalite Japo-nesa, Vírus da Dengue, Vírus da Diarréia Viral Bovina, Vírusda Hepatite B, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Huma-no, Vírus da Hepatite A, Vírus da Imunodeficiência Humana,Vírus da Imunodeficiência em Símios, Vírus T-LinfotrópicoHumano, Vírus do Sarcoma de Rous, Coronavírus da SARS, Vírusda Raiva, Vírus da Estomatite Vesicular, Vírus SincicialRespiratório, Vírus da Parainfluenza, Papilomavírus Humano eVírus do Herpex Simplex.

27. Método para tratamento de câncer em um mamífe-ro, CARACTERIZADO pelo fato de compreender fornecimento, aoindivíduo que precisa de tal tratamento, de uma composiçãoterapêutica de acordo com a reivindicação 14.

28. método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de o referido câncer ser selecionadodo grupo consistindo de: carcinoma adrenocortical, cânceresrelacionados à AIDS, sarcoma de Kaposi, ^linfoma AIDS-relacionado, câncer anal, astrocitoma, carcinoma de célulasbasais, cânceres do duto biliar, câncer da bexiga, cânceresósseos, osteosarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, gli-oma do tronco cerebral, tumores cerebrais, gliomas, astroci-tomas, gliomas malignos, ependimomas, meduloblastomas, neu-roblastomas, tumor neuroectodérmico primitivo supratentori-al, glioma hipotalâmico e da via visual, câncer de mama,adenoma brônquico, linfoma de Burkitt, tumores carcinóides,linfoma do sistema nervoso central, câncer cervical, leuce-mias, leucemia de células pilosas, leucemia Iinfoblásticaaguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônicae leucemia mielogênea crônica, distúrbios mieloproliferati-vos crônicos, câncer cólon-retal, linfoma de células T cutâ-neas, câncer endometrial, câncer esofageal, a família Ewingde tumores, tumor de células germinativas extracraniano, tu-mor de células germinativas extragonadal, cânceres dosolhos, melanoma intraocular, câncer da cabeça e pescoço,carcinoma hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma primário do CNS, câncer nasofaringeal, car-cinoma de células da ilhota, câncer renal (célula renal),câncer laringeal, câncer dos lábios e oral, câncer de fíga-do, câncer de pulmão, cânceres de pulmão de células não-pequenas e células pequenas, macroglobulinemia de Waldens-trom, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncerescamoso metastático do pescoço, neoplasia endócrina múlti-pla, mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas,fungóides de micose, síndromes mielodisplásicas, doenças mi-eloproliferativas, câncer do sinus paranasal e da cavidadenasal, câncer ovariano, tal como de células germinativas eepiteliais, tumor ovariano com baixo potencial maligno, cân-cer pancreático, câncer da paratireóide, câncer de pênis,feocromocitoma, tumor da pituitária, blastoma pleuropulmo-nar, câncer de próstata, rhadbomiosarcoma, câncer da glându-la salivar, sarcomas, síndrome de Sezary, câncer de pele talcomo, por exemplo, melanoma e carcinoma de células escamo-sas, câncer testicular, timoma, carcinoma tímico, câncer datiróide, câncer de células transitórias, tumor trofoblásti-co, câncer uretral, câncer uterino, câncer vaginal, câncervulvar e tumor de Wilm.