BRPI0610275A2 - modulação de crescimento de planta através de alteração de tomada de aminoácido - Google Patents

Abstract

Esta invenção refere-se à verificação de que crescimento de planta é diretamente afetado por alterações na expressão de transportadores de aminoácidos que mediam a tomada de aminoácidos a partir do ambiente. Processos de modulação de crescimento de planta através de modulação de expressão de transportador de aminoácidos são providos.

Description

"MODULAÇÃO DE CRESCIMENTO DE PLANTA ATRAVÉS DE ALTERAÇÃO DE TOMADA DE AMINOÁCIDO"

Esta invenção refere-se à modulação da tomada deaminoácidos a partir do ambiente por plantas através de al-terações na expressão de transportadores de aminoácidos demodo a influenciar crescimento de planta.

Nitrogênio é um nutriente mineral que é necessárioem grandes quantidades por plantas. Fontes de nitrogênio pa-ra crescimento de plantas incluem compostos de nitrogênioinorgânicos, como amônio e nitrato, e compostos de nitrogê-nio orgânicos, incluindo aminoácidos.

Aperfeiçoamento de aquisição de nitrogênio porplantas é um objetivo importante em aumento de rendimentosde colheitas (Britto et al (2004) BioEssays 26:683-692). En-tretanto, tentativas para aperfeiçoar aquisição de nitrogê-nio pelas plantas através de crescente expressão de proteí-nas transportadoras de nitrogênio foram impedidas por váriosfatores.

Em muitas espécies de plantas, o influxo de nitro-gênio a partir do ambiente é inversamente relacionado ao te-or de nitrogênio da planta, isto é, quanto maior o teor denitrogênio da planta, menor a tomada de nitrogênio. Tomadade nitrogênio pode ser regulada descendentemente pelas fon-tes de nitrogênio originalmente transportadas, que podem seacumular para substanciais concentrações dentro de célulasde plantas, ou os produtos da assimilação metabólica destesions. Esta inibição de retroalimentação torna dificil aumen-tar a capacidade de plantas abstraírem nitrogênio do solo.Além disso, raizes de planta freqüentemente mos-tram excesso de capacidade de influxo de nitrogênio e mesmosob condições de limitação de nitrogênio, um influxo mensu-rável de nitrogênio é freqüentemente observado a partir decélulas de raiz de volta no ambiente externo. Este excessode capacidade de influxo de nitrogênio indica que plantasretiram mais nitrogênio do ambiente do que elas assimilam ouestocam, e este excesso é então expelido de volta no ambien-te. A superexpressão de transportadores de influxo de nitro-gênio resulta assim em aumentado efluxo de nitrogênio, semnenhuma vantagem liquida para a colheita.

Aminoácidos ocorrendo no solo são genericamenteabsorvidos por plantas através de raiz e, seguindo absorção,metabolizados de modo que nitrogênio carreado pelos aminoá-cidos é distribuído em uma faixa de compostos de nitrogênio.

A presente invenção refere-se à verificação de queo crescimento de plantas pode ser diretamente afetado pelaalterada expressão de transportadores de aminoácidos que me-diam a tomada de aminoácidos a partir do ambiente. Isto podeser útil em alteração de características de crescimento deplanta.

Um aspecto da invenção prove um processo de aumen-to de crescimento de uma planta compreendendo:

aumento de expressão de um ácido nucléico codifi-cando um transportador de aminoácido na planta,

o crescimento da dita planta sendo aumentado se-guindo a dita expressão.

Expressão de um ácido nucléico codificando umtransportador de aminoácido pode ser aumentada em uma plantaatravés de meios recombinantes (isto é, através de técnicasde engenharia genética), por exemplo, através de expressãode um ácido nucléico recombinante codificando o transporta-dor de aminoácido na planta ou através de aumento ou ativa-ção de expressão de um ácido nucléico endogeno codificando otransportador de aminoácido na planta usando uma construçãode ácido nucléico recombinante, por exemplo, através de li-gação operável de ácido nucléico com um promotor heterólogo(isto é, um promotor com o qual o ácido nucléico não é natu-ralmente expresso).

0 ácido nucléico pode ser um ácido nucléico hete-rólogo. Um processo de aumento de crescimento de uma plantapode, por exemplo, compreender:

expressão de um ácido nucléico heterólogo codifi-cando um transportador de aminoácido na planta,

o crescimento da dita planta sendo aumentado se-guindo a dita expressão.

A planta pode ser exposta a um substrato de cres-cimento compreendendo um ou mais aminoácidos, de modo que otransportador de aminoácido expresso media a tomada de ami-noácidos a partir do substrato na planta. Apropriados subs-tratos de crescimento são bem conhecidos na técnica e inclu-em meios naturais de crescimento de plantas, como solo, tur-fa ou composto, ou meios sintéticos de crescimento de plan-ta, como meios Murashige & Skoog, Gamborg's B5 e Chu's N6(Qbiogene, Irvine CA) . Um ou mais aminoácidos podem estarnaturalmente presentes no meio de crescimento ou podem seradicionados ao meio de crescimento. Em algumas realizações,o único ou mais aminoácidos podem ser a única fonte de ni-trogênio no meio de crescimento.

Apropriados aminoácidos incluem L- e/ou D-enantiômeros de aminoácidos tais como His, Glu, Gln, Ala,Lys, Arg, Asp, e Ser e o aminoácido não-quiral GLy.

Em realizações preferidas, aminoácidos tomados pe-la planta através de transportador de aminoácidos são meta-bolizados via caminhos de metabolismo de nitrogênio da plan-ta e não são estocados ou acumulados em sementes ou outrostecidos.

Preferivelmente, o ácido nucléico codificando otransportador de aminoácidos é expresso preferivelmente ouespecificamente em tecidos da planta que contatam o meio decrescimento compreendendo um ou mais aminoácidos. Por exem-plo, o ácido nucléico pode ser especificamente expresso emtecido de raiz da planta, em particular os pêlos de raiz daplanta. Expressão especifica de tecido do ácido nucléico po-de ser obtida através de ligação operável de ácido nucléicoa um ou mais elementos reguladores específicos de tecido,como descrito abaixo.

O ácido nucléico expresso pode codificar qualquertransportador de aminoácidos que seja capaz de mediar a to-mada de um aminoácido na planta a partir do exterior daplanta (por exemplo, a partir do meio de crescimento) . Porexemplo, o transportador de aminoácidos pode mediar a tomadade qualquer aminoácido que esteja naturalmente presente nomeio de crescimento ou seja adicionado ao meio de crescimen-to, L- e/ou D-enantiômeros de aminoácidos como His, Glu,Gln, Ala, Lys, Arg, Asp e Ser e o aminoácido não-quiral Gly.0 transportador de aminoácidos pode ser um transportador deaminoácidos que seja naturalmente expresso na planta (istoé, um transportador de aminoácido endógeno) ou um transpor-tador de aminoácido que não seja naturalmente expresso naplanta (isto é, um transportador de aminoácido exógeno ouestranho).

Apropriados transportadores de aminoácidos incluemproteínas de planta e não-planta, incluindo proteínas debactérias como E. coli cycA, ou suas variantes ou fragmen-tos.

Apropriados transportadores de aminoácido podemmediar tomada de ambos enantiômeros D e L de aminoácidos(Montamat et al. 1999, Plant Mol Biol 41:259-268).

Transportadores de lisina / histidina podem serusados em processos da invenção. Transportadores de lisina /histidina incluem os transportadores de aminoácidos. Um a-propriado transportador de aminoácido LHT1 pode ter a se-qüência do transportador de aminoácido LHTl de Arabidopsisthaliana (entrada de base de dados de proteína:AAC9885.1 GI:2576361; entrada de base de dados de ácido nucléico(U39782.1 GI: 2576360) ou pode ser uma sua variante ou frag-mento. Apropriadas variantes ou fragmentos de um transporta-dor de aminoácido LHTl retêm a atividade da seqüência tiposelvagem para mediar tomada de aminoácidos.

Polipeptideos aminoácido permease (AA) podem serusados em processos da invenção. Aminoácido permeases inclu-em os transportadores de aminoácido AAP1, AAP3, AAP6 e AAP8.

Apropriados polipeptideos AAP podem ter a seqüência dotransportador AAP1, AAP3, AAP6 ou AAP8 de Arabidopsis thali-ana (como referido em Tabela 2) ou uma sua variante ou frag-mento. Aproriadas variantes ou fragmentos de um transporta-dor de AAP retêm a atividade da seqüência tipo selvagem paramediar tomada de aminoácido.

Outros apropriados transportadores de aminoácidosincluem mas não são limitados a polipeptideos listados na

Tabela 2 ou suas variantes ou fragmentos.

Uma variante de uma seqüência de polipeptideo parauso de acordo com qualquer aspecto da invenção pode ter umaou mais de adição, inserção, supressão ou substituição de umou mais aminoácidos na seqüência de polipeptideo tipo selva-gem. Por exemplo, até cerca de 5, 10, 15 ou 20 aminoácidospodem ser alterados. Tais alterações podem ser causadas poruma ou mais de adição, inserção, supressão ou substituiçãode um ou mais nucleotideos no ácido nucléico codificante.

Uma variante de seqüência de aminoácido de uma seqüência depolipeptideo tipo selvagem pode compreender uma seqüência deaminoácidos que compartilha mais que 20% de identidade deseqüência com a seqüência tipo selvagem, mais que 30%, maisque 35%, mais que 40%, mais que 45%, mais que 55%, mais que65%, mais que 70%, mais que 80%, mais que 90% ou mais que95%. A seqüência pode compartilhar mais que 20% de similari-dade com a seqüência tipo selvagem, mais que 30% de simila-ridade, mais que 40% de similaridade, mais que 50% de simi-laridade, mais que 60% de similaridade, mais que 70% de si-milaridade, mais que 80% de similaridade ou mais que 90% desimilaridade.

Similaridade e identidade de seqüência são comu-mente definidas com referência ao algoritmo GAP (WisconsinGCG package, Accelerys Inc, San Diego USA). GAP usa o algo-ritmo de Needleman and Wunsch para alinhar duas seqüênciascompletas que maximizam o número de ajuste e minimiza o nú-mero de folgas. Genericamente, parâmetros default são usa-dos, com uma penalidade de criação de folga = 12 e penalida-de de extensão de folga = 4 . Uso de GAP pode ser preferidomas outros algoritmos podem ser usados, por exemplo, BLAST(que usa o processo de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:405-410), FASTA (que usa o processo de Pearson and Lip-man (1988) PNAS USA 85:2444-2448, ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147:195-197), ou o programa TBLASTN, de Altschul et al (1990) supra,genericamente empregando parâmetros default. Em particular,o algoritmo psi-Blast (Nucl. Acids. Res. (1997) 25 3389-3402) pode ser usado. Identidade e similaridade de seqüênciatambém podem ser determinadas usando software Genomequest(Gene-IT, Worcester MA USA).

Comparações de seqüências são preferivelmente fei-tas sobre o comprimento inteiro da seqüência relevante aquidescrita.

Similaridade permite "variação conservativa", istoé, substituição de um residuo hidrofóbico como isoleucina,valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição deum residuo polar por outro, como arginina por lisina, ácidoglutâmico por aspártico, ou glutamina por asparagina.

0 termo "heterólogo" indica um elemento que nãoestá ocorrendo naturalmente em um contexto particular. Porexemplo, uma seqüência de nucleotideo ou polipeptideo que éheteróloga a uma célula de planta pode estar ocorrendo não-naturalmente em células daquele tipo, variedade ou espécies.Similarmente, um elemento regulador heterólogo ou promotorpode não estar naturalmente associado com uma seqüência co-dificando ácido nucleico em natureza. Elementos heterólogospodem ser combinados ou associados através de engenharia ge-nética ou meios recombinantes. Em algumas realizações, umácido nucleico heterólogo ou elemento regulador pode ser umácido nucleico recombinante ou elemento regulador.

Ácido nucleico codificando um transportador de a-minoácido pode estar contido em uma construção de ácido nu-cleico ou vetor. A construção ou vetor é preferivelmente a-propriado para transformação em e/ou expressão dentro de umacélula de planta. Em algumas realizações, a construção ouvetor compreendendo o ácido nucleico não inclui um promotorou outra seqüência reguladora, por exemplo, se o vetor é pa-ra ser usado para introduzir o ácido nucleico em células pa-ra recombinação no genoma. Em outras realizações, o ácidonucleico codificando o transportador de aminoácido está ope-rativamente ligado a um elemento regulador. O elemento regu-lador é preferivelmente heterólogo ou estranho para o ácidonucleico codificando o transportador de aminoácido.

Preferivelmente, o elemento regulador é especificode planta. Uma seqüência ou elemento reguladora especificade planta é uma seqüência que preferivelmente dirige a ex-pressão de um ácido nucléico dentro de uma célula de plantaem relação a outros tipos de células. Por exemplo, expressãoa partir de uma tal seqüência pode ser reduzida ou abolidaem células não-plantas, tais como células de bactérias e ma-míferos. Tais seqüências reguladoras podem prover eficienteexpressão dentro de uma célula de planta. Muitas seqüênciasreguladoras apropriadas são conhecidas na técnica e podemser usadas de acordo com a invenção. Exemplos de apropriadasseqüências reguladoras podem ser derivadas de um virus deplanta, por exemplo, o promotor 35S de gene de virus mosaicode couve-flor (CaMV 35S) que é expresso em um alto nivel emvirtualmente todos os tecidos de plantas (Benfey et al.,(1990)EMBO J 9: 1677-1684). Promotores específicos de folhatambém podem ser usados (ver, por exemplo, Lagrange et alPlant cell. 1997 9 (8): 1469-1479). Outros elementos regula-dores constitutivos apropriados incluem o promotor 19S devirus mosaico de couve-flor; o promotor de virus mosaico deescrofulária; e o promotor de gene nopalina sintase (nos)(Singer et al. , Plant Mol. Biol. 14:433 (1990); Na, PlantPhysiol. 81:86 (1986)).

Em algumas realizações preferidas, um elemento re-gulador especifico de tecido pode ser empregado, em particu-lar um elemento regulador especifico de raiz, por exemplo,um elemento que especificamente dirige expressão do trans-portador de aminoácido em pêlo de raiz.

Apropriados elementos reguladores específicos deraiz incluem o promotor LeExtl (Bucher et al Plant Physio-logy, March 2002, Vol. 128, pp. 911-923) e o promotor ROP2(Xu et al. The Plant Cell, Vol. 17, 525-536).

Em algumas realizações, uma seqüência reguladoraoperativamente ligada a seqüência de ácido nucléico pode serinduzivel. Promotores induziveis são bem conhecidos na téc-nica e incluem, por exemplo, o promotor HSP (Severin K. eSchõffl F. 1990. Plant Mol. Biol. 15: 827-833). Em essência,expressão sob o controle de um promotor induzivel é "ligada"ou aumentada em resposta a um estimulo aplicado (que podeser gerado dentro de uma célula ou provido exogenamente). Anatureza do estimulo varia entre promotores. Qualquer queseja o nivel na ausência do estimulo, expressão a partir dequalquer promotor induzivel é aumentada na presença do cor-reto estimulo. A situação preferível é onde o nivel de ex-pressão do transportador de aminoácido é aumentada na pre-sença do estimulo relevante por uma quantidade que é efetivapara alterar tomada de aminoácido e pelo que modular cresci-mento.

Construções e vetores ainda podem compreender mar-cadores genéticos selecionáveis consistindo em genes queconferem fenótipos selecionáveis tais como resistência a an-tibióticos como canamicina, higromicina, fosfinotricina,clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, spectinomicina, imi-dazolinonas, glifosato e D-aminoácidos.

Aqueles versados na técnica podem construir veto-res desenhar protocolos para expressão de gene recombinante,por exemplo, em uma célula de micróbio ou planta. Apropria-dos vetores podem ser escolhidos ou construídos, contendoapropriadas seqüências reguladoras, incluindo seqüênciaspromotoras, fragmentos terminadores, seqüências de poliade-nilação, seqüências aperfeiçoadoras, genes marcadores e ou-tras seqüências quando apropriado. Para ainda detalhes ver,por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rdedition, Sambrook et al. , 2001, Cold Spring Harbor Labora-tory Press e Protocols in Molecular Biology, Second Edition,Ausubel et al. , eds. John Wiley & Sons, 1992. Específicosprocedimentos e vetores previamente usados com amplo sucessoem plantas são descritos por Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)12, 8711-8721), e Guerineau and Mullineaux (1993) Planttransformation and expression vectors. In: Plant MolecularBiology Labfax (Croy RRD ed)Oxford, BIOS Scientific Publish-ers, pp. 121-148.

Quando introduzindo uma construção de gene esco-lhida em uma célula, certas considerações têm de ser levadasem consideração, bem conhecidas por aqueles versados na téc-nica. O ácido nucléico a ser inserido deve ser montado den-tro de uma construção que contem efetivos elementos regula-dores que dirigirão transcrição. Tem de haver disponível umprocesso de transporte de construção na célula. Uma vez aconstrução esteja dentro de membrana de célula, integraçãono material cromossômico endógeno tanto ocorrerá como não.Finalmente, o tipo de célula alvo é preferivelmente tal quecélulas podem ser regeneradas em plantas inteiras.

Técnicas bem conhecidas por aqueles versados podemser usadas para introdução de construções de ácido nucléicoe vetores em células de plantas para produção de plantastransgênicas com as propriedades aqui descritas.

Uma planta compreendendo um ácido nucléico que co-difica um transportador de aminoácido, por exemplo, um ácidonucléico heterólogo, pode ser produzida através de transfor-mação de uma célula de planta com o ácido nucléico e regene-rando a planta a partir da célula.

Transformação com Agrobacterium é um processo am-plamente usado por aqueles versados na técnica para trans-formação de espécies de plantas. Produção de plantas trans-gênicas férteis, estáveis agora é rotineira na técnica: (To-riyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, etal. (1988) Plant cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988)Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Na-ture 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8,736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962;Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute,Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant CellRep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al.91992) Plant cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) PlantMolecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Bio-technology 11, 194-200; Vasil, I.K. 91994) Plant MolecularBiology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiol-ogyl02, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10,1589-1594; W092/14828; Nilsson, O. et al. (1992) TransgenicResearch 1, 209-220).Outros processos, tais como bombardeio com micro-projétil ou partícula (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), eletroporação (EP 290395), WO 8706614), microinje-ção (WO 92/ 09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Greenet al. (1987) Plant Tissue and cell Culture, AcademicPress), tomada direta de ADN (DE 4005152, WO 9012096, US4684611), tomada de ADN mediada por lipossoma (por exemplo,Freeman et al. Plant cell Physiol. 29:1353 (1984)), ou oprocesso de formação de vórtice (por exemplo, Kindle, PNASU.S.A. 87: 1228 (1990d)) pode ser preferido onde transforma-ção com Agrobacterium é ineficiente ou ineficaz, por exem-plo, em algumas espécies gimnospermas.

Processos fisicos para a transformação de célulasde plantas são revistos em Oard, 1991, Biotech. Adv. 9:1-11.

Alternativamente, uma combinação de diferentestécnicas pode ser empregada para aperfeiçoar a eficiência doprocesso de transformação, por exemplo, bombardeio com mi-croparticulas revestidas com Agrobacterium (EP-A-486234) oubombardeio com micro-projétil para indução de ferimento se-guido por co-cultura com Agrobacterium (EP-A-486233).

Seguindo transformação, uma planta pode ser rege-nerada, por exemplo, a partir de células simples, tecido decallus ou discos de folhas, como é padrão na técnica. Quasequalquer planta pode ser inteiramente regenerada a partir decélulas, tecidos e órgãos da planta. Técnicas disponíveissão revistas em Vasil et al., Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants, Vol I, II e III, Laboratory Proceduresand Their Applications, Academic Press, 1984, e Weissbachand Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, AcademicPress, 1989.

A particular escolha de uma tecnologia de trans-formação será determinada por sua eficiência para transfor-mar certas espécies de plantas assim como a experiência epreferência da pessoa praticando a invenção com uma particu-lar metodologia de escolha. Será visivel para aqueles versa-dos na técnica que a particular escolha de um sistema detransformação para introdução de ácido nucléico em célulasde plantas não é essencial para ou uma limitação da inven-ção, nem é a escolha de técnica para regeneração de planta.

Um outro aspecto da invenção prove um processo decrescimento seletivo de uma planta compreendendo:

provimento de uma planta com reduzidos niveis ouatividades de um transportador de aminoácido que media toma-da de um D-aminoácido e tratando a planta com o D-aminoácido,

o dito tratamento provendo crescimento seletivo daplanta.

Apropriados D-aminoácido são tóxicos para a plantae incluem um D-aminoácido selecionado do grupo consistindoem D-arg, D-glu, D-ala, D-asp, D-cys, D-gln, D-his, D-ile,D-leu, D-lys, D-met, D-asn, D-phe, D-pro, D-ser, D-thr, D-trp, D-tyr, ou D-val. Por exemplo, o D-aminoácido pode serD-ala, D-ser, D-arg, D-glu, em particular D-ala ou D-ser.

O nivel ou atividade de um transportador de amino-ácido pode ser reduzido através de qualquer processo conve-niente. Por exemplo, niveis podem ser reduzidos através deexpressão de um supressor de ácido nucléico, por exemplo, umácido nucléico ARNi ou sentido, anti-sentido, através de mu-tação de um ácido nucléico codificando o transportador deaminoácido, em células da planta ou um seu antecessor ou a-través de silenciamento de gene induzido por virus (VIGS).

Em algumas realizações, o nivel ou atividade de umtransportador de aminoácido mediando tomada de aminoácidos apartir do ambiente externo pode ser reduzido nas raizes daplanta, preferivelmente especificamente nas raizes da plantae não em outros tecidos. A planta então pode ser tratada comum D-aminoácido através de crescimento de planta em um meiocompreendendo o D-aminoácido.

Em outras realizações, o nivel ou atividade de umtransportador de aminoácido mediando tomada de aminoácidos apartir do ambiente externo pode ser reduzido na porção acimade solo da planta, preferivelmente especificamente na porçãoacima de solo da planta e não nas raizes da planta ou em ou-tros tecidos. A planta então pode ser tratada com um D-aminoácido através de contato de porção de planta acima dosolo com uma composição compreendendo o D-amino-acido.

Apropriados transportadores de aminoácido cujosniveis ou atividades podem ser reduzidos de acordo com ospresentes processos são descritos em mais detalhes acima.

Uma planta tendo um nivel ou atividade reduzido deum transportador de aminoácido mediando tomada de aminoáci-dos a partir do ambiente externo pode ser produzida atravésde mutação de seqüência de ácido nucléico codificando umtransportador de aminoácido, ou um seu elemento regulador,em uma célula de planta ou tecido de planta tal como uma se-mente, e regenerando uma planta da célula ou tecido. 0 ácidonucléico pode sofrer mutação através de qualquer processoconveniente, incluindo processos de mutação alvejada, talcomo inserção de ADN-T e processos promovendo alterações deseqüência randômicas no genoma tal como tratamento SEM. A-propriados processos são bem conhecidos na técnica. Em ou-tras realizações, uma planta tendo um reduzido nivel ou ati-vidade de um transportador de aminoácido mediando tomada deaminoácido a partir de ambiente externo pode ser produzidaatravés de expressão de uma construção de supressão de ácidonucléico tal como um ácido nucléico ARNi ou sentido, anti-sentido compreendendo ou consistindo em toda ou parte da se-qüência de ácido nucléico codificando o transportador. Pro-cessos para supressão de expressão de ácidos nucléicos usan-do técnicas sentido, anti-sentido ou ARNi são bem conheci-dos .

Um processo pode compreender redução de nivel ouatividade do transportador de aminoácido que media tomada deaminoácidos do ambiente externo na planta através de expres-são de uma construção supressora de ácido nucléico.

Um outro aspecto da invenção prove um processo deaumento de sensitividade de uma planta a um D-aminoácido tó-xico compreendendo:

expressão na planta de um ácido nucléico heterólo-go codificando um transportador de aminoácido que media atomada do D-aminoácido tóxico,

a dita expressão aumentando a sensitividade daplanta ao D-aminoácido tóxico.

Um processo de inibição seletiva de crescimento deuma planta pode compreender:

expressão na planta de um ácido nucléico heterólo-go codificando um transportador de aminoácido que media atomada do D-aminoácido tóxico, e:

tratando a dita planta com uma composição compre-endendo o D-aminoácido,

a dita expressão aumentando a tomada do D-aminoácido tóxico.

Apropriados D-aminoácidos tóxicos incluem um D-aminoácido selecionado do grupo consistindo em D-arg, D-glu,D-ala, D-asp, D-cys, D-gln, D-his, D-ile, D-leu, D-lys, D-met, D-asn, D-phe, D-pro, D-ser, D-thr, D-trp, D-tyr ou D-vai. Por exemplo, o D-aminoácido pode ser D-ala, D-ser, D-arg, ou D-glu, em particular D-ala ou D-ser (Erikson et al.2004, Nature Biotech 22: 455-458).

Processos e meios para expressão de transportado-res de aminoácido em plantas são descritos acima.

Em algumas realizações, o transportador de aminoá-cido que media tomada de aminoácidos do ambiente externo po-de ser expresso nas raizes da planta, preferivelmente espe-cificamente nas raizes da planta e não em outros tecidos. Aplanta então pode ser tratada com um D-aminoácido através decrescimento de planta em um meio compreendendo o D-aminoácido.

Em outras realizações, o transportador de aminoá-cido que media tomada de aminoácidos do ambiente externo po-de ser expresso na porção acima do solo da planta, preferi-velmente especificamente na porção da planta acima do solo enão nas raizes da planta ou em outros tecidos. A planta en-tão pode ser tratada com um D-aminoácido através de contatoda porção da planta acima do solo com uma composição compre-endendo o D-aminoácido.

Apropriados transportadores de aminoácido que po-dem ser expressos de acordo com os presentes processos sãodescritos em mais detalhes acima.

Vários aspectos da invenção referem-se a plantasque são capazes de metabolizar um ou mais D-aminoácidos. A-propriadas plantas por exemplo, podem ser engenheiradas paraexpressarem um polipeptideo heterologo que tem uma atividadeenzimática que converte o um ou mais D-aminoácidos em umsubstrato metabolizavel pela planta.

Um proceso de desenvolvimento seletivo de umaplanta que metaboliza um D-aminoácido pode compreender:

expressão na planta de um ácido nucléico heterolo-go codificando um transportador de aminoácido que media atomada do D-aminoácido, e:

tratando a dita planta com uma composição compre-endendo o D-aminoácido,

a dita expressão provendo crescimento seletivo dadita planta.

O D-aminoácido pode ser D-arg, D-glu, D-ala, D-asp, D-cys, D-gln, D-his, D-ile, D-leu, D-lys, D-met, D-asn,D-phe, D-pro, D-ser, D-thr, D-trp, D-tyr ou D-val; preferi-velmente, D-ser, D-asn, D-ala, D-ile, D-glu, D-arg, D-lys,D-his, ou D-asp; mais preferivelmente D-ala, D-ile ou D-ser.

Outros aminoácidos podem incluir aminoácidos dex-tro-rotatórios não-proteina, precursores de aminoácidos dex-tro-rotatórios, tais como D-ornitina e D-citrulina, e deri-vados de aminoácidos dextro-rotatórios. Tais podem ser usa-dos como uma fonte de nitrogênio de planta somente após con-versão em uma apropriada forma metabolizável através de umaenzima de metabolização de D-aminoácido.

Em algumas realizações, o transportador de aminoá-cido pode ser especificamente expresso nas raizes da planta.

A planta então pode ser tratada com o D-aminoácido atravésde crescimento de planta em um meio compreendendo o D-aminoácido.

Em outras realizações, o transportador de aminoá-cido pode ser especificamente expresso na porção da plantaacima do solo. A planta então pode ser tratada com um D-aminoácido através de contato da porção da planta acima dosolo com uma composição compreendendo o D-aminoácido, porexemplo, através de espargimento.

Uma planta que metaboliza um D-aminoácido pode serproduzida de acordo com processos conhecidos através detransformação de uma célula de planta com um ácido nucléicocodificando um polipeptideo com atividade metabolizante deD-aminoácido e regenerando a planta a partir da célula.

Um polipeptideo com atividade metabolizante de D-aminoácido é um polipeptideo que converte um substrato D-aminoácido em produtos que são substratos para enzimas deplanta endógenas (isto é, podem ser metabolizados por plan-tas), em particular compostos não-dextrorotatórios, isto é,compostos nou L. O polipeptideo metabolizando D-aminoácidopor isso catalisa a conversão bioquímica do substrato D-aminoácido em produtos, por exemplo, produtos não-dextrorotatórios, que podem ser usados por plantas como fon-tes de nutrientes, em particular como fontes de nitrogênio.Apropriados polipeptideos metabolizando D-aminoácido inclu-em, por exemplo, oxidases, racemases, descarboxilases, tran-saminases ou desidratases (também chamadas amônia liases).

Oxidases catalisam a conversão de um D-aminoácido em NH4+,um ceto ácido (dependendo do substrato D-aminoácido) e H2Ü2(ver figura 2) . Racemases convertem um D-aminoácido na cor-respondente forma L-aminoácido. L-aminoácidos são úteis comouma fonte de nitrogênio para plantas. Descarboxilases con-vertem um D-aminoácido em um V-aminoácido que pode ser meta-bolizado por plantas. Transaminases convertem um D-aminoácido em uma diferente forma de L ou D aminoácido. L-aminoácidos então podem ser diretamente metabolizados en-quanto D-aminoácidos ainda podem sofrer conversão em formasmetabolizáveis. Desidratases catalisam a conversão de um hi-droxi D-aminoácido tal como D-ser ou D-thr em NH4+, um cetoácido (dependendo do substrato D-aminoácido) e H20. Desidro-genases catalisam a conversão de um D-aminoácido em NH4+, umceto ácido (dependendo do substrato D-aminoácido) e H2O.

Um apropriado polipeptideo metabolizando D-aminoácido pode ser uma enzima eucariótica, por exemplo, deuma levedura (por exemplo, Rhodotorula grascilis), fungo, ouanimal ou pode ser uma enzima procariótica, por exemplo, deuma bactéria como Escherichia coli. Exemplos de apropriadospolipeptideos que metabolizam D-aminoácidos são mostrados naTabela 1.

Em realizações preferidas, o polipeptideo metabo-lizando D-aminoácido é uma desidratase, por exemplo, D-seramônia liase (anteriormente conhecida como D-ser desidrata-se) ou uma oxidase, por exemplo, D-aminoácido oxidase.

Outros apropriados polipeptideos metabolizando D-aminoácido podem ser variantes ou fragmentos de polipepti-deos exemplificados na Tabela 1. Variantes ou fragmentos deseqüências de polipeptideos tipo selvagem são também aquidescritas.

Aqueles versados na técnica são facilmente capazesde determinar usando técnicas rotineiras se um polipeptideopossui uma atividade metabolizante de D-aminoácido (isto é,é uma enzima de metabolização de D-aminoácido) , como descri-to acima.

A identidade do D-aminoácido no meio é determinadapela especificidade do polipeptideo metabolizando D-aminoácido heterólogo que é expresso pela planta ou célulade planta, isto é, o meio contem o substrato D-aminoácido dopolipeptideo metabolizando D-aminoácido heterólogo. Por e-xemplo, onde D-serina desidratase heteróloga é expressa poruma planta, D-serina está presente no meio de crescimento.

Expressão do transportador de aminoácido em umaplanta que metaboliza D-aminoácidos pode mostrar aumentadocrescimento pode mostrar aumentado crescimento sobre meioscompreendendo D-aminoácidos em relação a plantas similaresnão expressando o transportador de aminoácidos, em particu-lar onde o D-aminoácido representa a única fonte de nitrogênio.

0 transportador de aminoácidos media a tomada doD-aminoácido a partir do meio na planta para permitir reaçãocom o polipeptideo metabolisando D-amino. Assim, a identida-de do transportador de aminoácido expresso pela planta é de-terminada pelo D-aminoácido no meio, que é, por sua vez, de-terminado pela especificidade do polipeptideo metabolizandoD-amino.

Apropriados transportadores de aminoácido são des-critos em mais detalhes acima e incluem transportadores deaminoácido de planta e não-planta, por exemplo, transporta-dores de aminoácidos de bactérias tais como o transportadorde aminoácido cycA de E. coli, que media transporte de gli-cina, D-alanina e D-serina.

A acumulação de produtos de metabolismo de D-aminoácido, incluindo, por exemplo, vários ceto - ácidos e aprodução der H2C>2 por D-aminoácido oxidases, pode ser preju-dicial para plantas transgênicas. Processos aqui descritospor isso podem ser úteis na remoção seletiva de plantastransgênicas a partir de populações mistas ou remoção de hí-bridos entre plantas transgênicas e plantas tipo selvagem apartir de populações naturais.

Um processo de inibição de crescimento de umaplanta que metaboliza um D-aminoácido pode compreender:tratamento de planta com o D-aminoácido,

o dito tratamento inibindo o crescimento da plan-ta.

Um apropriado D-aminoácido pode ser não-tóxico pa-ra a planta, mas pode ser metabolizado pela planta em umproduto tóxico. D-amino ácidos que exibem baixa toxidez paraplantas tipo selvagem, por exemplo, D-ile, D-val, D-asn, ouD-gln, mas que, seguindo metabolismo em plantas transgênicascontendo D-aminoácido oxidases exógenas, conduzem à produçãode ceto ácidos tóxicos e/ou H2O2 tóxica, são particularmenteapropriados para uso em tais processos.

Uma planta que metaboliza um D-aminoácido pode serproduzida através de transformação de uma célula de plantacom um ácido nucléico codificando um polipeptideo que meta-boliza um D-amino ácido e regenerando a planta a partir dacélula.

Um transportador de aminoácido pode ser expressousando qualquer técnica conveniente, como descrito acima. Umapropriado transportador de aminoácido media tomada do ami-noácido a partir do meio. Apropriados transportadores de a-minoácidos são descritos em mais detalhes acima e incluemtransportadores de planta e não-planta, tal como o polipep-tideo cycA de E. coli.

Em algumas realizações, a planta pode oxidar um D-aminoácido, por exemplo, através de expressão de uma D-aminoácido oxidase. D-aminoácidos como D-ile e D-val têmbaixa toxidez para plantas tipo selvagem, mas são metaboli-zados nos ceto ácidos tóxicos 3-metil-2-oxopentanoato e 3-metil-2-oxobutanoato, respectivamente por plantas expressan-do uma D-aminoácido oxidase. A exposição de plantas expres-sando uma D-aminoácido oxidase a compostos tais como D-ileou D-val, derivados destes ou outros compostos que com ati-vidade da D-aminoácido oxidase produzem produtos tóxicos po-de assim ser usada para inibir seletivamente crescimento detais plantas.

A adição de um D-aminoácido por isso pode ser usa-da para inibir ou reduzir o crescimento ou viabilidade deuma planta transgênica que tem uma atividade D-aminoácidooxidase.

Outros aspectos da invenção referem-se a processosde produção de plantas transgênicas que são úteis nos pre-sentes processos. Uma planta apropriada para uso nos proces-sos aqui descritos pode ser produzida através de:

provimento de uma célula de planta que compreendeum ácido nucléico heterólogo que codifica um polipeptideoque metaboliza um D-aminoácido,

transformação de célula de planta com um ácido nu-cléico que codifica um transportador de aminoácido que mediaa tomada do D-aminoácido; e

regeneração da dita planta a partir da dita célula.

Em algumas realizações, a planta pode ser regene-rada sobre um substrato que compreende um D-aminoácido, quepode, por exemplo, ser a única fonte de nitrogênio no meio.

Um outro aspecto da invenção prove uma célula deplanta compreendendo um primeiro ácido nucléico heterólogoque codifica um polipeptideo que metaboliza um D-aminoácido,

onde a célula de planta ainda compreende um segun-do ácido nucléico heterólogo que codifica um transportadorde aminoácido que media a tomada do D-aminoácido.

0 primeiro e segundo ácidos nucléicos podem estarcontidos em construções ou vetores de ácido nucléico. 0 pri-meiro e o segundo ácidos nucléicos podem estar contidos nomesmo vetor de expressão ou diferentes vetores de expressãona dita célula.

0 primeiro e segundo ácidos nucléicos podem serextra-cromossômicos ou podem estar integrados no cromossomada célula.

Pode existir mais de uma seqüência de nucleotideoheteróloga por genoma haplóide. Isto, por exemplo, permiteaumentada expressão do produto gene comparado com niveis en-dógenos.

Os ácidos nucléicos podem ser operativamente liga-dos a elementos reguladores para expressão. Apropriados ele-mentos são descritos acima e incluem promotores de gene in-duziveis externamente , por exemplo, para colocar expressãosob o controle do usuário.

Uma célula de planta pode conter a primeira e se-gunda seqüências de ácidos nucléicos como um resultado daintrodução das seqüências de ácidos nucléicos na célula ouuma célula ancestral.

Como aqui descrito, expressão do transportador deaminoácido e polipeptideo metabolizando D-aminoácido a par-tir do ácido nucléico codificando pode ser usado apara sele-cionar transformantes que contêm o primeiro e segundo ácidosnucléicos como aqui descrito. Em algumas realizações, um ve-tor adicionalmente pode compreender um marcador genético se-lecionável consistindo em um gene quimérico que confere umfenótipo selecionável tal como resistência a um antibióticocomo canamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron,metotrexato, gentamicina, spectinomicina, imidazolinonas eglifosato. Isto permite um segundo nivel de seleção, se de-sejado, em adição a seleção usando o transportador de amino-ácido e polipeptideo metabolizando D-aminoácido.

Uma célula de planta como aqui descrita pode sercompreendida em uma planta, uma parte de planta ou propágulode planta, ou um extrato ou derivado de uma planta como des-crito abaixo. Uma planta pode ser regenerada a partir de umaou mais células como descrito acima. Descendência ou descen-dentes da planta regenerada então podem ser sexualmente ouassexualmente propagadas ou desenvolvidas.

Uma planta compreendendo uma célula como aqui des-crita pode expressar o polipeptideo metabolizando D-aminoácido codificado e transportador de aminoácido e assimpode ter aperfeiçoada tolerância a D-aminoácido e pode serselecionável usando tratamento com D-aminoácido.

Plantas que incluem uma célula de planta como aquidescrita também são providas, junto com qualquer sua parteou propágulo, semente, progênie selfed ou hibrida e descen-dentes. Particularmente providas são monocotiledôneas trans-gênicas, dicotiledôneas, gimnospermas, angiospermas e algas,samambaias e musgos. De particular interesse são plantas su-periores transgênicas, especialmente colheitas de florestase de agricultura, por exemplo, cereais, árvores e flores or-namentais, que foram engenheiradas para carrearem uma cons-trução de ácido nucléico como descrita acima.

Exemplos de plantas apropriadas incluem tabaco,cucúrbitas, cenoura, brassicáceas, melões, cápsicos, uvas,alface, morango, plantas de colheitas como brassicáceas desemente de óleo, beterraba sacarina, trigo, cevada, milho earroz, soja, ervilha, sorgo, girassol, tomate, batata, pi-menta, crisântemo, violeta, álamo, eucalipto, algodão, bor-racha, linhaça, bambu, acácia, plantas de frutos como maçã,ameixa, pêra, banana, laranja, kiwi, limão, framboesa, to-ronja e figo, cânhamo, abeto, bétula, amendoins, centeio epinho.

Em adição a uma planta, a presente invenção provequalquer clone de uma tal planta, semente progênie selfed ouhibrida e descendentes, e qualquer parte ou propágulo dequalquer destes, tais como cortes e semente, que podem serusados em reprodução ou propagação, sexual ou assexual. Tam-bém abrangida pela invenção é uma planta que é descendência,clone ou descendente propagada sexual ou assexualmente deuma tal planta, ou qualquer parte ou propágulo da dita plan-ta, descendência, clone ou descendente.

Experimentos controles podem ser realizados quandoapropriado nos processos, aqui descritos. A performance deapropriados controles está bem dentro da competência e habi-lidade daqueles versados na técnica.

Ainda vários aspectos e realizações da presenteinvenção serão aparentes para aqueles versados na técnica emvista da presente exposição. Todos os documentos mencionadosneste relatório descritivo são aqui incorporados por refe-rência em sua totalidade.

A invenção abrange cada uma e todas as combinaçõese sub-combinações das características que são descritas acima.

Certos aspectos e realizações da invenção serãoagora ilustrados a titulo de exemplo e com referência às fi-guras descritas acima e tabelas descritas abaixo.

A Figura 1 mostra crescimento de plantas de A.thaliana sobre meios MS de resistência ^ onde todos os com-postos de nitrogênio foram trocados por D-serina 3 mM.Crescimento de plantas carreando o gene dsdA codificando D-serina amônia liase a partir de E. coli foi comparado comaquele de plantas carreando ambos genes dsdA e cycA deE.coli e codificando o transportador D-serina / D-alanina.

A Figura 2 mostra taxas de tomada de aminoácidospor A. thaliana medida em taxas de esgotamento de uma solu-ção externa. Plantas tipo selvagem de ecotipo Col-0 são com-paradas com plantas carreando uma inserção de ADN-T no geneLHTl, codificando o . transportador de aminoácido nol Lisina-Histidina.

A Figura 3 mostra a contribuição de L-alanina e L-glutamina N (Ala e Gln, respectivamente) para a nutrição Nde plantas Arabidopsis thaliana tipo selvagem crescidas es-téreis (wt) e plantas carecendo de expressão do transporta-dor lisina - histidina 1 (T27). O eixo-X é a fração de N o-riginando de aminoácidos.

A Figura 4 mostra o crescimento de A. thaliana ti-po selvagem (wt) e transgênica expressando o transportadorcycA de bactéria sobre diferentes concentrações de glicina.Plantas foram crescidas em meios agar estéreis baseados emmeios MS de resistência ^ onde nitrogênio foi suprido somen-te como glicina. Cyc4:2, cyc7:2 e cyc8:2, refere-se a trêsdiferentes linhas transgênicas.

Experimentos

Materiais e Processos

Transformação de Arabidopsis com cycA

Manipulações de ADN foram realizadas através detécnicas padrões (Sambrook and Russell, 2001). O gene de E.coli cycA foi clonado por PCR usando iniciadores de PCR 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCATGGTAGATCAGGTAAAAGTCGTT e 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTTATTTCCGCAGTTCAGC, os frag-mentos de PCR foram recombinados no pDONR e subseqüentementerecombinados no cassete de expressão 35S CaMV do vetor biná-rio pH7WG2D. O vetor foi analisado por seqüenciamento e res-trição enzimática.

Plantas A. thaliana transgênicas carreando o genedsdA de E. coli (Erikson et al. 2005, Plant Mol Biol 57,425-433) foram transformadas com Agrobacterium tumefacienslinhagem GV3101::pMP90 RK através de infiltração in plantavacuum como descrito por Clough and Bent (1998). Sementes Txforam selecionadas sobre higromicina. Todas as linhas indi-viduais isoladas foram selecionadas com PCR, amplificando ogene cycA para confirmar integração do transgene.

Crescimento de plantas sobre placas de Petri

MS de resistência ^, livre de nitrogênio com agar0,5% peso / volume e sucrose 0,5% peso / volume e tamponadopara pH 5,8 com tampão MES (ácido morfolino etano sulfônico2N) foi usado em todas as seleções e experimentos. Este meiofoi corrigido com diferentes fontes de N como descrito abaixo.

Seleção de mutantes ADN-T e SEM

Exceto para Arabidopsis thaliana tipo selvagem(Col-0), dois tipos de Arabidopsis foram usados nos experi-mentos; mutantes de inserção de ADN-T e mutantes metano sul-fonato de etila (SEM).

Sementes de 77 linhas mutantes de ADN-T, represen-tando mutações em 46 genes individuais codificando ou codi-ficando putativamente transportadores de aminoácidos foramobtidas de Nottinghamseed stock center (NASC). Aproximada-mente 1 grama de sementes SEM foi obtido de semente Lehle.

Seleção para mutações em absorção em raiz de ami-noácidos foi realizada através de espalhamento de sementessobre placas contendo niveis tóxicos de D-aminoácidos.

Placas para seleção de linhas mutantes contioveramos meios padrões descritos acima emendados com D-alanina 3mM ou D-serina 3 mM. D-aminoácidos foram esterilizados emfiltro e adicionados após autoclavagem. Sementes foram este-rilizadas na superfície e semeadas sobre placas de Petri queforam seladas com fita permeável a gás. Todas as sementesforam tratadas frias por dois dias a 4°C após semeadura paragerminação uniforme.

Um número de plantas SEM e uma linha de inserçãoADN-T foram identificadas como resistentes a alanina enquan-to nenhuma das linhas foi verificada ser resistente a D-serina. As plantas SEM foram movidas para solo e foram autopropagadas. Somente uma linha SEM foi verificada ser resis-tente a D-alanina.

A linha nocaute sobrevivendo a D-alanina corres-pondeu a uma inserção de ADN-T no exon do transportador deLisina Histidina 1 (LHT1). Após a primeira seleção, o mutan-te LHT1 foi submetido a análise genética. PCR foi usada paraverificar se a mutação de inserção foi recessiva ou dominan-te. Análises PCR mostraram homozigosidade de inserção nasplantas que sobreviveram a seleção com D-alanina, além dis-so, a descendência de plantas parentes heterozigotos segre-gou 3 sensíveis para 1 resistente sobre D-alanina, indicandoque a mutação foi recessiva.

Para investigar se o mutante SEM e os mutantes deinserção de ADN-T foram alélicos, as duas linhas mutantesdiferentes foram cruzadas. A progênie (TI) deste cruzamentofoi verificada ser resistente a D-alanina. Plantas sobrevi-ventes também foram submetidas a análises PCR que mostraramque as inserções de ADN-T foram heterozigotos, corroborandoque os mutantes de fato foram alélicos.

Seqüenciamento do gene LHT1 do mutante SEM identi-ficado como resistente a D-alanina mostrou uma substituiçãode nucleotideo g/a simples, que baseou-se em genemodel TAIR

At5g40780.1 resultou em uma mudança do códon trp66 nativopara um códon de interrupção, pelo que abolindo a produçãode LHT1 também nesta planta.

- Experimentos 15N com linhas mutantes LHT1Sementes tipos selvagem e sementes de linhas SEM eADN-T foram semeadas sobre placas de agar contendo meio MSde resistência H com N suprido como uma mistura de NO3" 3 mMe L-15N glutamina 30 |jM, L-15N alanina 30 jiM ou L-15N lisina30 |iM. cada placa conteve 100 mL de meio. A concentração de15N dos aminoácidos supridos foi >98% para L-alanina e >49%para L-glutamina e L-lisina. Oito placas em réplica com trêssementes cada foram preparadas para cada tipo de planta etratamento. Placas de agar foram incubadas em uma sala res-friada por dois dias e então transferidas para uma câmaraclimatizada; 16 h de periodo de luz, temperatura de 24°C.

Após 14 dias, cinco placas selecionadas randomica-mente foram colhidas. Raizes foram rinsadas e inteiramentelimpas três vezes em CaCl2 0,5 mM para remoção de 15N das su-perficies. Plantas foram secadas a 60°C por toda noite, pe-sadas e homogeneizadas. Finalmente, amostras foram analisa-das para teor de N total e abundância de 15N em um EuropaScientific Isotope Ratio Mass Spectrometer.

Experimentos de Crescimento

Crescimento de plantas dsdA e cycAxdsdA

Plantas foram crescidas sobre meios MS livres de Nde resistência H descritos acima e emendados com S-serina 3mM como a única fonte de N. Plantas foram crescidas por 20dias em uma sala de crescimento sob as condições padrõesdescritas acima.

Crescimento de linhas mutantes LHT1

Sementes tipo selvagem e sementes de linhas SEM eADN-T foram semeadas sobre meios MS de resistência ^ livresde N descritos acima e emendados com N03" 3 mM; L-glutamina1,5 mM + N03" 3 mM ou L-alanina 3 mM + N03~ 3 mM. Oito placasréplicas, cada uma contendo 25 mL de meio com três sementescada foram preparadas para cada linha de semente e tratamen-to. Após semeadura, as placas de agar foram incubadas em umasala fria por dois dias e então transferidas para uma câmaraclimatizada, 16 h de periodo de luz e 24°C. Após 20 dias,plantas foram colhidas, secadas a 60°C e pesadas.

Experimento de tomada com linhas mutantes LHT1

Sementes tipo selvagem e sementes de linhas SEM eADN-T foram semeadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL enchidoscom agar. A tampa e o fundo de cada frasco foram cortadas, eo frasco colocado em fixadores de tubos Eppendorf colocadosem caixas de crescimento com solução nutriente. O propósitodesta montagem foi permitir contato entre o agar nos tubo ea solução na caixa, de modo gue raizes foram capazes decrescerem na solução. As caixas de crescimento foram enchi-das com uma solução nutriente contendo: L-Gly 1 mM, NH4NO3 1mM, K2HPO4 0,6 mM, CaS04 0, 3 mM, MgS04 0,55 mM, KC1 35 jiM,FeNA-EDTA 50 |iM, H3BO3 35 |^M, MnS04 7|iM, ZnS04 1,5 U.M, CuS04 1|iM, (NH4)6Mo7024 0, 05 uM e tamponada para pH 5,8 com MES.

Após semeadura, as caixas foram incubadas em umasala fria por dois dias e então transferidas para uma câmaraclimatizada; 8 h de periodo de luz, temp 24/18°C (dia / noi-te) .

Após 18 dias as plantas mais saudáveis foram sele-cionadas e as plantas identificadas transferidas para caixasindividuais. Durante os primeiros 18 dias, aeração das cai-xas foi realizada através de difusão via um filtro na tampamas para o restante (após 18 dias) da hidrocultura as caixasforam aeradas através de bombeamento de ar filtrado estérilatravés de uma seringa que foi injetada através da tampa eem contato com a solução nutriente. Por todo o experimento,unidades de crescimento que mostraram sinais de infecção fo-ram descartadas. Após 39 dias de crescimento, as maioresplantas foram selecionadas para o experimento de tomada.Três plantas de cada linha foram usadas nos experimentos detomada.

O experimento de tomada foi realizado em placasfabricadas comuns, cada uma com um orificio perfurado queadaptou um cilindro plástico oco que foi desenhado para fi-xar um frasco Eppendorf. Esta montagem permitiu um experi-mento no qual evaporação foi minimizada. O cilindro plásticocom tubos Eppendorf (contendo uma planta) foi adaptado àplaca de modo que a raiz, mas não o broto estava em contatocom a solução de tomada. Além disso, foi tomado cuidado paraassegurar que o tubo Eppendorf não estava em contato com asolução. A solução de tomada foi idêntica à solução nutrien-te usada durante cultivo de planta mas todas as fontes denitrogênio foram substituídas com uma mistura de aminoácidoscomposta por 25 uM de cada um dos seguintes aminoácidos D-ala, L-ala, D-ser, L-ser, L-lys, L-his, L-gln, L-glu e gly.

Cada placa foi enchida com 10 mL desta solução.

O experimento de tomada teve uma duração de 5 hcom amostragem cada hora e foi realizado em uma câmara cli-matizada sobre uma mesa de agitação. Em cada amostragem, 120uL de solução foram retirados, transferidos para um frascoEppendorf, e imediatamente congelados.

Após 5 h a solução restante foi pesada para deter-minar a perda evapo-transpiratorial de água. Raizes de plan-tas foram secadas e pesadas. Taxas de tomada (|amol/g DW ra-iz/h) foram calculadas como a média das diferenças de con-centrações entre cada amostragem (com concentração originalcomo a primeira referência). Nos cálculos perda evapo-transpiratorial foi compensada, assumindo que a evapo-transpiração foi linear sobre o tempo.

Análises

D- e L-aminoácidos foram analisados por RP-HPLC deseus derivados orto-ftaldialdeido de acordo com Brüekner etal. 1991 (Chromatographia, 32:383-388).

Resultados

Crescimento alterado de plantas através de altera-da expressão de transportadores de aminoácido

Expressão de enzimas metabolizando D-aminoácidosem plantas abole o efeito negativo de D-aminoácidos e permi-te plantas usarem estes compostos como fontes de nitrogêniopara crescimento (Erikson, 0 et al. 2004 Nature Biotechno-logy, 22: 455-458.

Plantas foram crescidas sobre D-serina como a úni-ca fonte de nitrogênio. Crescimento mediado por D-serina deplantas dsdA carreando o gene cycAA de E. coli, codificandoo transportador de D-serina / D-alanina foi comparado complantas carreando somente o gene dsdA (Fig. 1). Foi mostradoque crescimento mediado por D-serina foi drasticamente au-mentado através de expressão do gene cycA. Isto mostra quecrescimento de planta sobre aminoácidos pode ser aumentadoatravés de expressão de um gene heterólogo codificando umtransportador de aminoácido.

Em um segundo experimento, a importância de ex-pressão de transportadores de aminoácidos para crescimentomediado por aminoácido foi mostrada. Primeiramente, caracte-rização funcional de mutantes nocaute LHT1 com relação à ta-xa de tomada por raiz de L-aminoácidos mostrou que um númerode L-aminoácidos foram absorvidos em menores taxas compara-dos a plantas tipo selvagem (Fig. 2).

Em segundo lugar, crescimento de plantas defecti-vas no gene LHT1 tanto causada por uma inserção de ADN-T(linha T27) como causada por mutagênese randômica seguindotratamento SEM e seleção sobre D-alanina (linha SEM-A)foisignificantemente menor sobre misturas de nitrato e aminoá-cidos comparado com aquele de plantas tipo selvagem. Cresci-mento de plantas defectivas de LHT1 sobre nitrato como a Cí-nica fonte de nitrogênio, entretanto, não foi diferente deplantas tipo selvagem.

A contribuição de N de L-alanina e L-glutamina (A-la e Gln, respectivamente) para nutrição de N foi determina-da em plantas Arabidopsis thaliana tipo selvagem crescidasestéreis (wt) e plantas carecendo de expressão do transpor-tador de lisina - histidina 1 (T27). Plantas foram crescidassobre meios MS de resistência H nos quais todo N foi trocadopor N03~ 3 mM e tanto 30 |_iM de L-alanina ou L-glutamina. Osaminoácidos fornecidos foram marcados (8%) com 15N de modoque a tomada de N destas fontes pode ser distinguida de to-mada de nitrato. Os resultados são mostrados na Figura 3. Nde L-alanina e L-glutamina foi observado realizar uma redu-zida contribuição para crescimento em plantas que careceramde expressão do transportador de lisina - histidina 1.

Plantas A. thaliana transgênicas e tipo selvagemcarreando o gene cycA de E. coli foram crescidas em meiosagar estéreis baseados em meios MS de resistência 1/1 ondenitrogênio foi suprido como glicina. Crescimento mediado porglicina das plantas transgênicas e tipo selvagem foi compa-rado (Fig. 4) .

As plantas transgênicas foram observadas mostraremaumentado crescimento mediado por glicina, em relação a con-troles tipo selvagem.

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Tabela 2

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Claims (44)

1. Processo de aumento de crescimento de uma plan-ta, CARACTERIZADO pelo fato de compreender:aumento de expressão de um ácido nucléico codifi-cando um transportador de aminoácido na planta,o crescimento da dita planta sendo aumentado se-guindo a dita expressão.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico está opera-velmente ligado a um elemento regulador heterólogo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nu-cléico é um ácido nucléico heterólogo.

4 . Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que otransportador de aminoácidos media a tomada de aminoácidosna dita planta.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que otransportador de aminoácidos é especificamente expresso notecido de raiz da planta.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito transportador de ami-noácidos é especificamente expresso no pêlo de raiz da plan-ta .

7. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de compre-ender exposição de planta a um meio de crescimento compreen-dendo um ou mais aminoácidos cuja tomada é mediada pelotransportador de aminoácidos.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de compreender exposição de raizesda planta ao meio de crescimento.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7 oureivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adi-ção ao meio de crescimento de um ou mais aminoácidos cujatomada é mediada pelo transportador de aminoácidos.

10. Processo de crescimento seletivo de uma plan-ta, CARACTERIZADO pelo fato de compreender:provimento de uma planta com reduzidos niveis ouatividade de um transportador de aminoácidos que media toma-da de um D-aminoácido, e;tratamento de planta com o D-aminoácido,o dito tratamento provendo crescimento seletivo daplanta.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o D-aminoácido é tóxico paraa dita planta.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o D-aminoácido é D-ala.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o trans-portador de aminoácidos media a tomada de um D-aminoácido.

14 . Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o niveldo transportador de aminoácidos é reduzido na planta atravésde expressão de um ácido nucléico supressor.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o nivelou atividade de um transportador de aminoácidos é reduzidona planta através de mutaçãPo do ácido nucléico codificandoo transportador de aminoácidos ou um seu elemento regulador.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que a mutação é uma inserção deADN-T.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o nivelou atividade de um transportador de aminoácidos é especifi-camente reduzido nas raizes da planta.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é tratada com um D-aminoácido através de exposição a um meio de crescimentocompreendendo o D-aminoácido.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o nivelou atividade de um transportador de aminoácidos é reduzidona porção da planta acima do solo.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é tratada com um D-aminoácido através de contato de porção de planta acima dosolo com uma composição compreendendo o D-aminoácido.

21. Processo de crescimento seletivo de uma plantaque metaboliza um D-aminoácido, CARACTERIZADO pelo fato decompreender:expressão na planta de um ácido nucléico heterólo-go codificando um transportador de aminoácidos que media to-mada do D-aminoácido, e;tratamento da dita planta com uma composição com-preendendo o D-aminoácido,onde a dita expressão prove crescimento seletivoda planta.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta expressa um ácidonucléico heterólogo codificando polipeptideo que metabolizao D-aminoácido.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo tem uma ativi-dade selecionada do grupo consistindo em oxidase, racemase,carboxilase, transaminase e desidratase.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo é mostrado naTabela 1.

25. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o trans-portador de aminoácidos é especificamente expresso nas raí-zes da planta.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é tratada com um D-aminoácido através de crescimento de planta em um meio com-preendendo o D-aminoácido.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o trans-portador de aminoácidos é especificamente expresso na porçãode planta acima do solo.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é tratada com um D-aminoácido através de contato de porção da planta acima dosolo com uma composição compreendendo o D-aminoácido.

29. Processo de inibição de crescimento de umaplanta que metaboliza um D-aminoácido, CARACTERIZADO pelofato de compreender:expressão de um transportador de aminoácidos naplanta, e;tratando a planta com o D-aminoácido,o dito tratamento inibindo o crescimento da planta.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato de D-aminoácido éD-ile ou D-val.

31. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que otransportador de aminoácidos é um transportador de aminoáci-dos de planta.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos é um transportador de aminoácidos AAP.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoácidoé um transportador de aminoácidos AAP1, AAP3, AAP6, ou AAP8.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos é um transportador de aminoácidos LHT.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos é um transportador de aminoácidos LHT1.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos LHT1 é LHT1 de Arabidopsis.

37. Processo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o trans-portador de aminoácidos é um transportador de aminoácidos debactéria.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 37,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos é um transportador cycA.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de aminoáci-dos é o transportador cycA de E. coli.

40. Processo de produção de uma planta transgêni-ca, CARACTERIZADO pelo fato de compreender:transformação de uma célula de planta com um ácidonucléico que codifica um polipeptideo que metaboliza um D-aminoácido;ainda transformação de célula de planta com um á-cido nucléico que codifica um transportador de aminoácidoque media a tomada do D-aminoácido; e,regeneração de planta a partir de célula de planta.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é regenerada sobreum meio que compreende um D-aminoácido.

42. Uma célula de planta, CARACTERIZADA pelo fatode compreender:um primeiro ácido nucléico heterólogo que codificaum polipeptideo que metaboliza um D-aminoácido; e,um segundo ácido nucléico heterólogo que codificaum transportador de aminoácido que media a toma do D-aminoácido.

43. Célula de planta, de acordo com a reivindica-ção 42, CARACTERIZADA pelo fato de que os ditos primeiro esegundo ácidos nucléicos são compreendidos em vetores de ex-pressão .

44. Planta, CARACTERIZADA pelo fato de compreenderuma célula de acordo com a reivindicação 51.