BRPI0609916A2 - uso de glicomacropeptìdeo de caseìna - Google Patents

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Abstract

USO DE GLICOMACROPEPTIDEO DE CASEìNA. A presente invenção refere-se a um método de melhora do procedimento de aprendizagem e/ou de memória em um mamífero que é descrito envolver a administração ao mamífero de glicomacropeptídeo de caseína em uma quantidade suficiente para melhorar o procedimento de aprendizagem e/ou de memória no mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DEMELHORAR A APRENDIZAGEM E MEMÓRIA NOS MAMÍFEROS".
Antecedentes da Invenção
(1) Campo da Invenção:
A presente invenção refere-se a um método de melhorar o pro-cedimento de aprendizagem e/ou memória nos mamíferos por meios dietéti-cos, e mais particularmente a um método de melhorar o procedimento deaprendizagem e/ou memória em um mamífero mediante a administração deuma fonte dietética de ácido siálico.
(2) Descrição da Técnica Relacionada:
É reconhecido que o leite de mama e a amamentação é o modopreferível para alimentar o recém-nascido humano. Entre os benefícios re-conhecidos da amamentação está o desenvolvimento mental ideal. Para osrecém-nascidos que consomem fórmulas de bebê, existe esforço substanci-al para fornecer composições de fórmula que sustentam o desenvolvimentomental ideal quando comparado com aquelas observadas no recém-nascidocriado ao peito.
Comparado com outros primatas, o cérebro humano adulto équatro vezes maior em relação à massa corporal, mas o recém-nascido hu-mano é relativamente imaturo no nascimento. Parker, S. T. et al., Origin ofIntelligence, pp. 313 - 345, The Johns Hopkins Univ. Press, Baltimore, MD(1999). O desenvolvimento cerebral, portanto, prossegue rapidamente tantoantes quanto após o nascimento, colocando enormes demandas sobre ofornecimento de compostos precursores requeridos para o desenvolvimentodo cérebro. A nutrição subideal durante uma fase crítica de desenvolvimentocerebral precoce pode ter efeitos a longo prazo sobre a função cognitiva -um assunto de saúde pública principal e interesse clínico. Lucas, A. et al.,BMJ, 217:1481 - 1487 (1998), e Lucas, A. et al., Lancet, 339:261-264(1992). Em um teste controlado, cego, feito de forma aleatória a esmo emrecém-nascidos prematuros, aqueles alimentados com uma fórmula infantilpadrão em vez de fórmula enriquecida com nutrientes tinham reduzido oquociente de inteligência verbal (Ql) com 8 anos de idade. Ver, Lucas, Id,(1998). Perturbativamente, quase metade dos recém-nascidos masculinosalimentados de fórmula padrão tinha um Ql subnormal comparado com a-penas 13 % daqueles alimentados com leite enriquecido. Tais estudos real-çaram a vulnerabilidade potencial dos números crescentes de recém-nascidos prematuros e de peso baixo no nascimento com nutrição subideal.
Os componentes específicos exclusivos do leite humano possu-em o potencial de sustentar o rápido desenvolvimento cerebral. Em particu-lar, os ácidos siálicos (uma família de derivados substituídos por N e O deácido neuramínio; e em particular ácido Nacetilneuramínico, ou NANA) ocor-rem em grandes quantidades como um componente de oligossacarídeos deleite humano (até 1 g/l), e também forma o resíduo funcional terminal degangliosídeos e glicoproteínas do cérebro. Wang, B. et al., Am. J. Clin. Nutr.,74:510-515 (2001), e Carlson, S. E., Am. J. Clin. Nutr., 41:720-726 (1985).Os componente de ácido siálico ocorrem em concentrações mais elevadasno leite humano exatamente após o nascimento. Idota et al., in J. of Japa-nese Soe. of Nutr. And Food Sei. (Nihon Eiyo Shokuryo Gakkai-shi),47(5):363-367 (1994), mostram uma diminuição dramática no teor de 6'-sialillactose do leite de mama humano de 3 a 482 dias pós-parto.
Na natureza, as concentrações mais elevadas de ácido siálicosão observadas no córtex cerebral do cérebro humano. Schauer, R., Sialicacids, Chemistry, Metabolism and Function, Springer-Verlag, Wien, NewYork (1982), and Svennerholm, L. et al., Biochem Biophys Acta, 1005:109-117 (1989). Em particular, a molécula de aderência celular neural (NCAM) éuma proteína submetida a siálico que parece desempenhar um papel impor-tante na aprendizagem e na memória. Está envolvida em uma ampla faixade eventos morfogênicos, incluindo a migração celular, crescimento de neu-rita, exploração, desenvolvimento rápido, regeneração e plasticidade sináp-tica. Nakayama, J. et al., Virchows Archiv, 433:419-426 (1998), Mahal, L, K.et al., J. Biol. Chem., 277:9255-9261 (2002), e Ong, E. et al., Glycobiology,8:415-424 (1998). Em roedores, o grau de polissialilação da NCAM está as-sociado com a aprendizagem e memória aumentadas. Cremer, H. et al., Na-ture, 367:455-459 (1994).Pesquisa tem mostrado que a maioria do ácido N-acetilneuramínico (NANA) nos cérebros de filhotes de rato administradoNANA por injeção intraperitoneal foi incorporada na fração sinaptossômica.Morgan, B.L G. et al., Br. J. Nutr., 46:231-238 (1981). Later, Carlson, S. E.,et al., em J. Nutr., 116:881-886 (1986) mostraram que a administração tantooral quanto intraperitoneal de ácido N-acetilneuramínico resultou em signifi-cativamente mais ácido N-acetilneurâmico de glangliosídeo e glicoproteínacerebral e cerebelar do que resultaram as injeções de glicose.
Morgan, B. L. G. et al., in J. Nutr., 110:416-424 (1980), tambémmostraram que filhotes de rato subnutridos que foram injetados intraperito-nealmente com ácido N-acetilneuramínico aprenderam um labirinto maisrapidamente do que os companheiros de ninhada injetados com glicose, eapresentaram anormalidades comportamentais esperadas reduzidas devidoà subnutrição.
Fórmulas com base em leite de vaca geralmente possuem teorde ácido siálico baixo. Em um estudo, a concentração de ácido siálico emvárias fórmulas de combinação de caseína/soro de leite era menor do que200 mg de ácido siálico/L. Além do mais, as fórmulas com base em proteínade soja contêm níveis substancialmente reduzidos de ácido siálico quandocomparado com a fórmula baseada em leite de vaca. Portanto, as fórmulasque são tanto livre de lactose quanto baseadas em proteína devem apresen-tar teor de ácido siálico muito baixo. Em alguns exemplos, pesquisa temmostrado que a suplementação dietética com ácido siálico, ou com um ma-terial contendo ácido siálico fornece certos benefícios.
Existem várias fontes conhecidas de ácido siálico e suas váriasformas conjugadas. Estas incluem, mas não são limitados a elas, ácido N-acetilneuramínico livre (ou ácido siálico), a sialilactose de oligossacarídeo,gangliosídeos contendo ácido siálico, e a proteína macropeptídeo de caseí-na (CMP), também referido como glicomacropeptídeo (GMP), e, quando ob-tido de leite de vaca, glicomacropeptídeo de caseína (CGMP), similar.
Um método de produção de CGMP é descrito no Pedido de Pa-tente U.S. 20040022918, que ensina que a fabricação de queijo a partir doleite mediante a coagulação do leite de vaca com coalho faz com que o co-águlo se contraia em uma coalhada quando expressa soro de leite. O ma-cropeptídeo de caseína (CMP) é clivado a partir da proteína de caseína co-mo um resultado da ação do coalho sobre a capa caseína e cerca de 90 %do CMP é tipicamente removido com o soro de leite. O CMP é um grupoheterogêneo de proteínas, que contém todas as variações genéticas e modi-ficações pós-translacionais de capa caseína (Yvon et al., Reprod. Nutr. Dev.,34:527-537 (1994)). O carboidrato predominante é o ácido siálico. O glico-macropeptídeo ou GMP é o componente principal (50 a 75 %) de CMP. Oteor de carboidrato do GMP o torna solúvel em uma solução de ácido triclo-roacético a 12 %. Várias técnicas de medição analítica incluem um pré-tratamento, que envolve uma solução de TCA, esta pode remover pelo me-nos uma parte do CMP submetido a glicosila. Por exemplo, o método publi-cado em The Official Journal of the European Communities (L228/10 AnnexIV), detalha um método de HPLC para a medição de GMP em produtos delaticínios e utiliza o nível de GMP para calcular o nível de soro de leite dequeijo presente em uma amostra. Outros métodos de produção de CGMPdo leite são descritos por Brody, E. P., em Br. J. of Nutr., 84(Suppl. 1):S39-S46 (2000).
A adição de ácido siálico ou fontes de ácido siálico em certasfórmulas nutricionais foi debatida na Patente U.S. N2 6.506.422, que descre-ve uma fórmula nutricional particular contendo glicomacropeptídeo de case-ína e aminoácidos essenciais complementares diferentes de fenilalaninapara administração em pacientes que sofrem de fenilcetonúria. Os níveis deácido siálico observados nas fórmulas infantis não são mencionados.
A Patente U.S. N2 6.270,827, descreve uma formulação conten-do proteínas de leite humano ou fatores de resistência a hospedeiro recom-binante, um dos quais é a capa-caseína humana recombinante, para suple-mentar as fórmulas infantis sintéticas.
A Patente U.S. N2 4.762.822 apresenta o uso de ácido acetil-neurâmico ou ganglosídeos contendo ácido siálico na fórmula infantil paraproteger o recém-nascido de organismos produtores de doença gastrointes-tinal.
O pedido de patente internacional WO 01/60346 A2 descreveuma formulação nutricional contendo oligofrutose de oligossacarídeos e sia-lilactose como substâncias pré-bióticas para promover o desenvolvimento debifidobactérias no intestino que podem ser usadas em conjunto com a fór-mula infantil.
O WO-A-00 49885 descreve o uso de um hidrolisato de proteínade leite para tratar distúrbios ósseos ou dentários. O glicomacropeptídeo decaseína (CGMP) é extraído de soro de leite doce mediante uma combinaçãode eletrodiálise, resina de troca de cátion, resina de troca de ânion, evapo-ração, secagem por pulverização, ultrafiltração e secagem por congelamen-to, e é usado para enriquecer os alimentos ou composições entéricas líquidas.
Embora a administração dietética de ácido siálico tenha sidorelatada para vários propósitos, a suplementação dietética com ácido siáliconão afetou o procedimento de aprendizagem ou memória de um mamífero.Pela razão da suplementação dietética ser um método fácil e amplamenteaceito de administração de vários agentes aos indivíduos, e em particularaos mamíferos recém-nascidos, seria útil fornecer um método pelo qual oprocedimento de aprendizagem e memória de um mamífero possa ser me-lhorado por meios dietéticos. Um tal método seria particularmente útil paraindivíduos mamíferos neonatais que estavam com necessidade de melhorano procedimento de aprendizagem e memória.
Sumário da Invenção
Resumidamente, portanto, a presente invenção é direcionada aum novo método de melhorar o procedimento de aprendizagem e/ou memó-ria em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífe-ro de glicomacropeptídeo de caseína em uma quantidade suficiente paramelhorar o procedimento de aprendizagem e/ou memória no mamífero.
A presente invenção é também direcionada a um novo métodode aumentar o ácido siálico ligado a proteína no cérebro em um mamífero, ométodo compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidadede glicomacropeptídeo de caseína que é suficiente para aumentar o ácidosiálico ligado a proteína no cérebro no mamífero.
A presente invenção é também direcionada a um novo métodode melhora do procedimento de aprendizagem e/ou memória em um mamí-fero, o método compreendendo: determinar se o mamífero é aquele que es-tá com necessidade de melhora na aprendizagem e/ou na memória; e, sen-do assim, administrar ao mamífero glicomacropeptídeo de caseína em umaquantidade suficiente para melhorar o procedimento de aprendizagem e/oumemória no mamífero.
Entre as várias vantagens observadas de serem obtidas pelapresente invenção, portanto, pode ser observado a provisão de um métodopelo qual o procedimento de aprendizagem e/ou memória de um mamífero émelhorado por meios dietéticos, e também a provisão de um tal método queé particularmente útil para os indivíduos mamíferos neonatais que estãocom necessidade de melhora no procedimento de aprendizagem e memória.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é uma ilustração esquemática de um labirinto de 8subdivisões que é útil para o teste de procedimento de aprendizagem e dememória em leitões;
A figura 2 é uma ilustração esquemática de uma das subdivi-sões do labirinto de 8 subdivisões na figura 1;
A figura 3 mostra sugestões visuais usadas (A) na tarefa de a-prendizagem 1, e (B) na tarefa de aprendizagem 2, no teste de procedimen-to de aprendizagem dos leitões;
A figura 4 é um gráfico que mostra a fração de leitões em cadaum dos quatro grupos que aprendeu a resposta correta para a sugestão vi-sual na tarefa 1 como uma função do número de testes, onde os leitões doGrupo 4 (22 melhor desempenho) receberam uma dieta tendo 842 mg/L deácido siálico com suplementação por glicomacropeptídeo de caseína (240mg/kg/dia de ácido siálico), leitões do Grupo 3 (32 melhor) receberam umadieta tendo 600 mg/L de ácido siálico com suplementação por glicomacro-peptídeo de caseína (171 mg/kg/dia de ácido siálico), leitões do Grupo 2(melhor) receberam uma dieta tendo 250 mg/L de ácido siálico com suple-mentação de glicomacropeptídeo de caseína (71 mg/kg/dia de ácido siálico),e leitões do Grupo 1 (pior desempenho) receberam uma suplementação dedieta de 77 mg/L de ácido siálico (25 mg/kg/dia de ácido siálico) sem suple-mentação de glicomacropeptídeo de caseína;
A figura 5 é um gráfico que mostra a fração de leitões em cadaum dos quatro grupos que aprenderam a resposta correta para a sugestãovisual na tarefa 2 como uma função do número de testes, onde os leitões doGrupo 4 (melhor desempenho) receberam uma dieta tendo 842 mg/L de á-cido siálico com suplementação por glicomacropeptídeo de caseína (240mg/kg/dia de ácido siálico), leitões do Grupo 3 (22 melhor) receberam umadieta tendo 600 mg/L de ácido siálico com suplementação por glicomacro-peptídeo de caseína (171 mg/kg/dia de ácido siálico), leitões do Grupo 2 (32melhor) receberam uma dieta tendo 250 mg/L de ácido siálico com suple-mentação de glicomacropeptídeo de caseína (71 mg/kg/dia de ácido siálico),e leitões do Grupo 1 (pior desempenho) receberam uma suplementação dedieta de 77 mg/L de ácido siálico (25 mg/kg/dia de ácido siálico) sem suple-mentação de glicomacropeptídeo de caseína;
A figura 6 é um gráfico de barra que mostra o número total deerros em cada grupo de leitões nas tarefas 1 e 2, e indicando que o númerototal mais elevado de erros para cada tarefa foi feito por leitões no gruponão tendo nenhuma suplementação dietética com glicomacropeptídeo decaseína, e que a suplementação em todos os níveis melhoraram a capaci-dade de aprendizagem dos leitões;
A figura 7 mostra dois gráficos de barras, onde o gráfico (A)mostra o número médio de erros feitos por leitões em cada um dos quatrogrupos para o teste de memória na tarefa 1, e (B) mostra o número médiode erros feitos por leitões em cada um dos quatro grupos para o teste dememória na tarefa 2;
A figura 8 mostra dois gráficos de barra, onde (A) mostra umacomparação dos níveis de cortisol no plasma entre cada um dos quatro gru-pos de leitões para cada semana do estudo, e (B) mostra uma comparaçãodos níveis de cortisol no plasma entre os grupos de tratamento combinadosversus o grupo de controle para cada semana do estudo de cinco semanas;
A figura 9 é um gráfico de barras que mostra uma comparaçãoda concentração de ácido siálico na massa cinzenta do cérebro entre osgrupos de tratamento e controle, e que indica, o teor de ácido siálico maiselevado nos cérebros dos leitões que receberam suplementação dietética deglicomacropeptídeo de caseína;
A figura 10 mostra dois diagramas de dispersão da concentra-ção de ácido siálico ligado a proteína no tecido do córtex frontal do cérebroversus o número de testes para aprender a sugestão visual para (A) leitõesna tarefa 1, e (B) leitões na tarefa 2, onde ambos os diagramas indicam queníveis mais elevados de ácido siálico ligado a proteína no tecido de córtexfrontal do cérebro se correlacionam com o procedimento de aprendizagemnos leitões;
A figura 11 mostra dois diagramas de dispersão da concentra-ção de ácido siálico ligado a gangliosídeo no tecido de córtex frontal do cé-rebro versus o número de testes para aprender a sugestão visual para (A)leitões na tarefa 1, e (B) leitões na tarefa 2, onde ambos os diagramas indi-cam que níveis mais elevados de ácido siálico ligado a gangliosídeo no teci-do de córtex frontal do cérebro se correlacionam com o procedimento deaprendizagem melhorado nos leitões;
A figura 12 mostra um gráfico do número de erros feitos na tare-fa 1 de memória pelos leitões do grupo 4 como uma função da concentraçãode ácido siálico ligado a proteína no tecido de córtex frontal do cérebro, eindica que tendo níveis mais elevados de ácido siálico ligado a proteína notecido de córtex frontal do cérebro produz menos erros em um teste de me-mória, e possuem procedimento de memória melhorado sobre aqueles ten-do níveis mais baixos de ácido siálico; e
A figura 13 é um gráfico que mostra o ganho de peso corporalmédio para os leitões em cada um dos quatro grupos durante a duração doteste, e que mostra que a dieta de cada grupo era comparável com referên-cia ao encontro dos requisitos nutricionais globais dos leitões.Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas.
De acordo com a presente invenção, foi descoberto que o pro-cedimento de aprendizagem e/ou memória em um mamífero pode ser me-lhorado mediante a administração ao mamífero de glicomacropeptídeo decaseína em uma quantidade suficiente para melhorar o procedimento deaprendizagem e/ou memória no mamífero. Em uma forma de realização útil,o glicomacropeptídeo de caseína pode ser incluído em uma fórmula.
Foi agora mostrado que os leitões alimentados com dietas con-tendo 77 mg/L de ácido siálico (sem suplementação), e 250 mg/L, e 842mg/L de ácido siálico fornecidos pela suplementação das dietas com glico-macropeptídeo de caseína apresentaram diferenças tanto no procedimentode aprendizagem quanto no procedimento de memória. De fato, foi mostra-do que tanto o procedimento de aprendizagem quanto o procedimento dememória foram melhorados nos leitões que receberam as dietas suplemen-tadas com glicomacropeptídeo de caseína, em relação aos leitões que rece-beram as dietas não suplementadas, mas de outra maneira nutricionalmentesuficientes.
Esta melhora foi inesperada, porque os inventores não estavama par de nenhuma descoberta anterior de melhora na aprendizagem e me-mória devido à suplementação dietética de um dieta diferente nutricional-mente suficiente com glicomacropeptídeo de caseína. Também, estudosanteriores mostraram uma correlação entre a entrada reduzida de alimentose a inclusão de CGMP na dieta. Ver, por exemplo, a Publicação de PatenteU.S. nos. 20040077530 e 20030059495, por exemplo. Pela razão da entra-da reduzida de alimentos estar associada mais freqüentemente com a acui-dade mental mais baixa, em vez de aprendizagem e memória melhoradas,foi inesperado com relação a suplementação dietética com CGMP para re-almente melhorar tal desempenho, como foi mostrado na presente invenção.
Os inventores observaram que o glicomacropeptídeo de caseínaé uma fonte surpreendentemente boa de suplementação dietética para me-lhorar o procedimento de aprendizagem e memória. É surpreendente porqueo leite de vaca, em geral, é pobre em ácido siálico, e também, as macromo-léculas as quais o ácido siálico está ligado são diferentes do que aquelasobservadas no leite humano, por exemplo. Entretanto, os inventores obser-varam que o glicomacropeptídeo de caseína é um suplemento dietético sur-preendehtemente eficaz para melhorar o procedimento de aprendizagem ememória, e além disso, o CGMP é relativamente econômico, facilmente dis-ponível, e nutricionalmente seguro para crianças.
A presente invenção é útil para qualquer mamífero. No entanto,é particularmente útil para os seres humanos. O mamífero pode ser dequalquer idade. Entretanto, foi observado que o presente método é particu-larmente útil quando o mamífero está entre cerca de 1 dia e cerca de 4 anosde idade. Esta faixa de idade significa incluir recém-nascidos e crianças en-tre um e três anos quando o mamífero for um ser humano. É preferível queo mamífero seja um mamífero neonatal. Como aqui usado, o termo "neona-tal" significa descrever as idades entre o nascimento e cerca de dois anos.
O presente método é particularmente útil quando o mamífero foraquele que está com necessidade de melhora no procedimento de aprendi-zagem e/ou memória. Quando os termos "com necessidade de melhora noprocedimento de aprendizagem e/ou memória" forem usados, eles signifi-cam descrever um indivíduo o qual pode ser beneficiar, não importa quanto,muito ou ligeiramente, de uma melhora no procedimento de aprendizageme/ou procedimento de memória. O presente método opcionalmente inclui aetapa de determinar se o mamífero é aquele que está com necessidade deuma melhora na aprendizagem e/ou na memória; e, nesse caso, administrarao mamífero uma fórmula que compreenda glicomacropeptídeo de caseínaem uma quantidade eficaz.
Os termos "melhora no procedimento de aprendizagem", signifi-cam incluir qualquer melhora, não importa quão pouco, na capacidade deaprendizagem do indivíduo. Os termos, "melhora no procedimento de me-mória", significam incluir qualquer melhora, não importa quão pouco, no pro-cedimento de memória do indivíduo. A melhora no procedimento de apren-dizagem e/ou memória pode ser medida por qualquer um ou mais de váriostestes que são úteis para medir o procedimento de aprendizagem e memó-ria em crianças humanas. Exemplos de tais testes incluem, sem limitação, oFagan Test of Infant Intelligence (FTII), a adaptação Dunst do Uzgiris-HuntObject Permanence Scale (OP), o teste Cross Modal Transfer (CMT), asBayley Scales of Infant Development, Second Edition, Mental DevelopmentoIndex (MDI), a Bayley Infant Neurodevelopment Screener (BINS), e o Amiel-Tison Neurologic Exam (AT). Outra informação sobre teste de aprendizageme memória em crianças humanas pode ser observado em Bayley, N. Manualfor the Bayley scales fo infant development, Psychological Corporation, NewYork (1969); Bates, J. E. et al., Child Dev., 50:794-803 (1979); e Black, M.M. et al., Bayley Scales of Infant Development II Assessment, Unlimited Le-arning Resources, Winston-Salem, NC (2003).
É aceito como certo que uma necessidade de melhora no pro-cedimento de aprendizagem e/ou memória pode ser motivada em um mamí-fero, e em um ser humano em particular, por qualquer um de vários fatoresque são conhecidos na técnica. Por meio de exemplo, deficiência de nutri-ção, a presença de fatores ambientais - tais como ingestão de certos me-tais, privação de oxigênio, trauma, doença, e outros fatores, podem ser cau-sa de uma necessidade para tal melhora. Em uma situação, como debatidoacima, a técnica anterior deduziu alguma conexão entre a capacidade cogni-tiva de alguns mamíferos neonatais e o nível dietético de certos nutrientes -e o ácido siálico foi mostrado ser um destes nutrientes. Conseqüentemente,acredita-se que na presente invenção a necessidade de melhora no proce-dimento de aprendizagem e/ou memória é apresentada, ou a determinaçãopode ser produzida em que o mamífero é aquele com necessidade de me-lhora na aprendizagem e/ou memória, onde pelo menos uma parte do requi-sito nutricional do mamífero foi fornecida por uma fórmula tendo menos doque cerca de 100 mg/L de ácido siálico, e em particular, onde substancial-mente todo o requisito nutricional do mamífero foi fornecido mediante a ad-ministração de uma fórmula tendo menos do que cerca de 100 mg/L de áci-do siálico.
Quando for dito que "pelo menos uma parte do requisito nutri-cional do mamífero foi fornecida" por uma certa fórmula, significa que pelomenos 25 % dos requisitos nutricionais do mamífero foi fornecido em pelomenos uma maioria do período do nascimento até a presente idade do ma-mífero pela fórmula. É preferível que a parte dos requisitos nutricionais domamífero que foi fornecida para pelo menos a maioria do período do nasci-mente até a presente idade do mamífero seja pelo menos 50 %, mais prefe-rível seja 75 %, e ainda mais preferível seja substancialmente todos os re-quisitos nutricionais do mamífero.
Devido ao nível baixo de ácido siálico na proteína de soja e pro-teína de leite de vaca, quando comparado com os níveis de ácido siálico noleite humano - especialmente no colostro e leite produzido durante o inícioda lactação, acredita-se que um mamífero que receba uma fórmula em quea parte principal da proteína seja proteína de soja ou proteína de leite devaca, e em que o nível de ácido siálico é menor do que cerca de 100 mg/L,é aquele que está com necessidade de melhora no procedimento de apren-dizagem e/ou memória. Em particular, isto é julgado de ser o caso quandopelo menos cerca de 75 % em peso da proteína contida na fórmula for pro-teína de soja ou proteína de leite de vaca, e é ainda mais verdadeiro quandosubstancialmente toda a proteína contida na fórmula for proteína de soja ouproteína de leite de vaca.
De fato, acredita-se que a necessidade de melhora no procedi-mento de aprendizagem e/ou memória em um mamífero é mostrada onde orequisito nutricional do mamífero foi fornecido por uma dieta que forneceácido siálico em uma quantidade que é mais baixa do que normalmente se-ria obtida a partir da amamentação. Quando é dito que "o requisito nutricio-nal do mamífero foi fornecido", significa que o requisito nutricional do mamí-fero foi fornecido durante pelo menos uma maioria do período do nascimen-to até a presente idade do mamífero. Os termos "uma dieta que forneça áci-do siálico em uma quantidade que seja mais baixa do que normalmente se-ria obtida a partira da amamentação", significa uma dieta que compreendeuma fórmula líquida tendo um teor de ácido siálico que está abaixo de cercade 100 mg/ml. Em outras formas de realização, e em algumas formas derealização, uma fórmula líquida tendo um teor de ácido siálico que está a-baixo de cerca de 200 mg/L.
Na presente invenção, a fórmula que compreende glicomacro-peptídeo de caseína pode ser administrada ao mamífero por qualquer tipode administração entérica. Como aqui usado, a administração entérica incluia administração de uma fórmula em qualquer ponto no trato Gl do mamífe-ro, e inclui sem limitação, a administração oral, e a administração tubularentérica.
Embora o glicomacropeptídeo de caseína possa ser administra-do em um mamífero como está, e sem qualquer composto ou material a-companhante, é útil fornecer o CGMP como um ingrediente de uma fórmula.A fórmula que compreende glicomacropeptídeo de caseína pode ser qual-quer fórmula nutricional, mais é preferivelmente uma fórmula infantil. Emalgumas formas de realização, a fórmula infantil é uma fórmula infantil nutri-cionalmente completa compreendendo carboidrato, lipideo e proteína. Afórmula infantil para uso na presente invenção pode ser nutricionalmentecompleta, ou pode ser uma fórmula suplementar. Tipicamente, a fórmulacontém tipos e quantidades adequadas de lipídeos, carboidratos, proteínas,vitaminas e minerais. A quantidade de lipídeos e gorduras tipicamente podevariar de cerca de 3 a cerca de 7 g/100 kcal. A quantidade de proteínas tipi-camente pode variar de cerca de 1 a cerca de 5g/100 kcal. A quantidade decarboidratos tipicamente podem variar de cerca de 6 a cerca de 16 g/100 kcal.
Como aqui usado, o termo "fórmula" significa uma composiçãopreparada para o ser humano, e não deve ser interpretado incluir leite depeito, por exemplo.
As fontes de proteína podem ser qualquer uma usada na técni-ca, e podem incluir, por exemplo, leite desnatado, proteína de soro de leite,caseína, proteína de soja, proteína hidrolizada, e aminoacidos. As fontes delipideo podem ser qualquer uma usada na técnica tais como, por exemplo,óleos vegetais como óleo de palma, óleo de soja, óleo de oleína de palma,óleo de milho, óleo de canola, óleo de coco, óleos de triglicerídeo de cadeiamédia, óleo de girassol oléico elevado, e óleo de açafroa oléico elevado. Asfontes de carboidrato podem qualquer uma conhecida na técnica tais como,por exemplo, lactose, polímeros de glicose, sólidos de xarope de milho, mal-todextrinas, sacarose, amido e sólidos de xarope de arroz.
Convencionalmente, várias fórmulas infantis comercialmentedisponíveis podem ser usadas como a fórmula básica para as adições deCGMP. Por exemplo, Enfamil® Lipil com ferro (disponível da Mead Johnson& Company, Evansville, Indiana, U.S.A.) pode ser suplementado com umaquantidade eficaz de CGMP e usado para praticar o método da presenteinvenção. As fórmulas infantis particulares adequadas para uso na presenteinvenção são descritas nos Exemplos anexos.
A proteína total na formulação de todas as fontes de proteínadeve ser nutricionalmente apropriada para crianças, que é tipicamente decerca de 12 g per litro a 18 g per litro e, em algumas formas de realização,pode ser de cerca de 14 g per litro. O ácido siálico total na formulação podeestar entre cerca de 200 e cerca de 1500 mg per litro. É preferível que apresente fórmula compreenda um líquido tendo uma concentração de ácidosiálico de pelo menos cerca de 200 mg/litro. Em algumas formas de realiza-ção, é mais preferível que a fórmula compreenda um líquido tendo um nívelde ácido siálico de pelo menos cerca de 300 mg/litro, e um nível de ácidosiálico de pelo menos cerca de 600 mg/litro é ainda mais preferível. É prefe-rível que a fórmula contenha até 6 g per litro de glicomacropeptídeo de case-ína (CGMP) ou fração de proteína relacionada, como comercialmente dis-ponível de várias fontes, contendo cerca de 81 % de proteína e entre cercade 40 e cerca de 300 mg de ácido siálico per grama de proteína, mas tipi-camente entre cerca de 40 e 60 mg de SA/mg proteína, e, assim, contribu-indo entre cerca de 194 e cerca de 1458 mg de ácido siálico per litro de fór-mula, mas tipicamente entre cerca de 194 e 290 mg SA/litro de fórmula; ouaté cerca de 6 g/litro de uma fração de CGMP tendo um nível intensificadode ácido siálico.
O glicomacropeptídeo de caseína que é útil na presente inven-ção, em geral, pode ser de qualquer fonte e de qualquer pureza ou grau queseja adequado para uso nutricional, ou para incluisão em uma fórmula infan-til. O glicomacropeptídeo de caseína pode ser extraído de leite usando pro-cessamento adequado. Por exemplo, o glicomacropeptídeo de caseína podeser extraído do retentato obtido da concentração de proteína de soro de lei-te. Isto pode ser feito por pelo menos parcialmente remover a lactose doretentato e depois adicionar etanol para causar precipitação. O sobrenadan-te é depois coletado e secado para fornecer o glicomacropeptídeo de caseí-na. A Patente U.S. N2 5.216.129, que é aqui incorporada completamente porreferência na medida em que não seja incompatível com a informação aquidescrita, fornece uma descrição mais detalhada deste processo. O CGMPque é útil no presente método pode também ser produzido de acordo comas técnicas descritas nas Patentes U.S. N- 6.555.659, 5.280.107, 5.968.586e 5.075.424, e no PCT/US94/15952, e WO 03/049547. Alternativamente, oCGMP pode ser adquirido de fontes comerciais tais como, por exemplo, TheTatua Co-Operative Dairy Company Limited, Tatuanui Morrinsville, New Zea-land, MD Foods Ingredients amba of DK-6920 Videbaek, Denmark ou daDMV International of NCB-laan 80, NL-5460 BA Veghel, The Netherlands.
No presente método, é preferível que o glicomacropeptídeo decaseína, ou a fórmula que compreende o glicomacropeptídeo de caseína,seja administrado em uma quantidade suficiente para fornecer 100mg/kg/dia de ácido siálico ao mamífero, e em algumas formas de realização,a provisão de 200 mg/kg/dia de ácido siálico ao mamífero é mais preferível.
Em uma forma de realização da presente invenção, é preferívelque a fórmula tenha teor de proteína total entre 12 e 16 gramas/litro dosquais não mais do que 40 % em peso é fornecido pelo glicomacropeptídeode caseína. É mais preferível que a fórmula compreende um teor de proteí-na total entre 13 e 15 gramas/litro dos quais não mais do que 30 % em pesoseja fornecido pelo glicomacropeptídeo de caseína. Em uma forma de reali-zação, o teor de proteína da fórmula é fornecido pelo glicomacropeptídeo decaseína e proteína de soja.
Algumas formas de realização da presente invenção envolvem ouso de novos produtos de CGMP que contêm níveis de ácido siálico que sãomais elevados do que o normalmente observado nos produtos de CGMPpadrão que são comercialmente disponíveis. Estes novos produtos podemser usados isoladamente ou em combinação para alcançar os níveis de áci-do siálico que imitam aqueles observados no leite de peito, com base noteor de ácido siálico dos vários ingredientes da fonte. Em uma forma de rea-lização, o glicomacropeptídeo de caseína compreende um glicomacropeptí-deo de caseína tendo uma concentração acentuada de ácido siálico.
Como aqui usado, os termos "CGMP tendo uma concentraçãoacentuada de ácido siálico" significam uma fração contendo glicomacropep-tídeo de caseína (CGMP) de leite que foi tratado para aumentar o nível deácido siálico, e em que o nível de ácido siálico é mais elevado, por qualquerquantidade, do que antes do tratamento. Os produtos de GCMP com níveisintensificados de ácido siálico são descritos abaixo nos Exemplos de Refe-rência 2 e 3.
Um tal produto, um exemplo do qual é descrito no Exemplo deReferência 2, pode ser referido aqui como "CGMP tendo um nível acentuadode ácido siálico", ou "CGMP com alto teor de ácido siálico". O CGMP comalto teor de ácido siálico possui um teor de ácido siálico acima de cerca de60 mg/g de proteína. É preferível que o teor de ácido siálico esteja acima decerca de 100 mg/g de proteína, mais preferível esteja acima de cerca de 150mg/g de proteína, e ainda mais preferível seja um teor de ácido siálico acimade 200 mg/g de proteína. Tipicamente, este produto possui um teor de pro-teína de cerca de 50 % a 60 % em peso para um produto de pó seco, umteor de ácido siálico de cerca de 190 a 230 mg/g de proteína, ou cerca de100 a 130 mg/g de pó. Em comparação, o pó seco de CGMP regular (porexemplo, glicomacropeptídeo disponível da Tatua Co-Operative Dairy Com-pany Limited) contém 81 % de proteína em peso, e possui um teor de ácidosiálico de cerca de 52 mg/g de proteína, ou 42 mg/g de pó. Fica evidente,portanto, que o teor de ácido siálico do CGMP com alto teor de ácido siálicofoi intensificado sobre aquele do pó de glicomacropeptídeo regular em cercade 3 vezes na base do peso do pó, e cerca de 4 vezes na base do teor deproteína dos produtos. Para propósitos de comparação, o pó de soro de leitesubmetido a eletrodiálise (ED) contém cerca de 14 % de proteína em umabase seca, e contém cerca de 30 mg de ácido siálico/g de proteína, ou cercade 4,3 mg de ácido siálico/g de pó.
Uma vantagem de usar um CGMP com alto teor de ácido siálicocomo uma fonte de proteína em uma fórmula infantil é que o teor de ácidosiálico da fórmula pode ser aumentado sem substituir uma quantidade inde-vida das fontes convencionais de proteína que são usadas na fórmula. Estacaracterística é útil em que permite o rompimento mínimo do perfil de ami-noácido da proteína da fórmula.
Em uma forma de realização particular de um CGMP com altoteor de ácido siálico, o produto possui um nível do aminoácido treonina queé mais baixo do que o nível deste aminoácido no glicomacropeptídeo doqual o novo produto é derivado. Como aqui usado, este dito de CGMP comalto teor de ácido siálico é referido como "CGMP tendo um nível acentuadode ácido siálico e treonina reduzida", ou "CGMP com alto teor de ácido siáli-co com treonina reduzida". Um exemplo deste tipo de produto é descrito a-baixo no Exemplo de Referência 3.
O CGMP com alto teor de ácido siálico com treonina reduzidapossui um teor de ácido siálico acima de cerca de 60 mg/g de proteína euma concentração de treonina que é mais baixa do que cerca de 15 mg/16 gde nitrogênio. É preferível que o teor de ácido siálico esteja acima de cercade 100 mg/g de proteína, mais preferível esteja acima de cerca de 150 mg/gde proteína, e ainda mais preferível seja uma teor de ácido siálico acima de200 mg/g de proteína. Tipicamente, o CGMP com alto teor de ácido siálicocom treonina reduzida pode ter um teor de ácido siálico de cerca de 85 acerca de 150 mg de ácido siálico (SA)/ grama de pó, preferivelmente de cer-ca de 90 a cerca de 140 mg de SA/g de pó, que é comparável com o teor deácido siálico do CGMP com alto teor de ácido siálico. No entanto, o teor detreonina de CGMP com alto teor de ácido siálico com treonina reduzida éapenas cerca de um quarto daquele de um produto de CGMP comercial.Preferivelmente, o teor de treonina está abaixo de cerca de 10 g/16 g denitrogênio, mais preferivelmente abaixo de cerca de 7 g/16 g de nitrogênio,ainda mais preferivelmente abaixo de cerca de 5 g/16 g de nitrogênio, e ain-da mais preferivelmente abaixo de cerca de 4 g/16 g de nitrogênio. Repre-sentado em uma maneira alternativa, o teor de treonina está abaixo de cer-ca de 8 % em peso do peso total de aminoácidos da proteína, preferivel-mente abaixo de cerca de 6 %, mais preferivelmente abaixo de cerca de 4%, e ainda mais preferivelmente abaixo de cerca de 3 %.
Uma vantagem fornecida por este tipo de produto com ácidosiálico acentuado é que além do aumento no ácido siálico com rompimentodo perfil de aminoácido reduzido, como debatido acima, o nível de treoninadas fontes de proteína na fórmula infantil pode ser controlado. Isto é desejá-vel em algumas formas de realização a fim de reduzir ou eliminar o potencialde hipertreoninuria, ou outro distúrbio causado por, ou exacerbado por, ní-veis elevados de treonina na dieta.
Por meio de exemplo, uma fórmula infantil que é útil na presenteinvenção pode ser formulada para ter um teor de ácido siálico de pelo me-nos 200 mg/litro e ter um teor de proteína total entre 12 e 16 gramas/litrodos quais não mais do que 40 % em peso é fornecido por um CGMP tendouma concentração acentuada de ácido siálico. Preferivelmente, uma tal fór-mula infantil possui um teor de proteína total entre 13 e 15 gramas/litro dosquais não mais do que 30 % em peso é fornecido por um CGMP tendo umaconcentração acentuada de ácido siálico, mais preferivelmente, a fórmulainfantil possui um teor de proteína total entre 13 e 15 gramas/litro dos quaisnão mais do que 15 % em peso é fornecido por um CGMP tendo uma con-centração acentuada de ácido siálico.
Também como um exemplo, uma fórmula infantil que é útil napresente invenção pode ser formulada para ter um teor de ácido siálico depelo menos 400 mg/litro e ter um teor de proteína total entre 13 e 15 gra-mas/litro dos quais não mais do que 15 % em peso é fornecido por umCGMP tendo uma concentração acentuada de ácido siálico.
As fórmulas suplementadas com glicomacropeptídeo de caseínaque são úteis na presente invenção podem ser usadas da mesma maneiracomo qualquer outra fórmula infantil comercial. Podem ser produzidas naforma de pó, para posterior reconstituição com um líquido, ou podem serpreparadas na forma líquida. A fórmula deve ser acondicionada, armazena-da, controlada e distribuída da mesma maneira como qualquer outro produtosimilar, e deve, em geral, ser usada do mesmo modo.
Os seguintes exemplos descrevem as formas de realização e-xemplares da invenção. Outras formas de realização dentro do escopo dasreivindicações aqui contidas serão evidentes para uma pessoa versada natécnica a partir da consideração do relatório descritivo ou prática da inven-ção como aqui descrita. É pretendido que o relatório descritivo, juntamentecom os exemplos, seja considerado de ser apenas exemplar, com o escopoe o espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações que seguemos exemplos. Nos exemplos todas as porcentagens são dadas em uma ba-se de peso a não ser que de outra maneira indicada.
Exemplo de Referência 1
Este exemplo ilustra os componentes de nutriente em uma fór-mula infantil comercial adequada para adição de ácido siálico para uso napresente invenção.
Tabela 1: Informação de Nutriente para a Fórmula Infantil (Enfamil® Lipilcom Ferro)
<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>
Os ingredientes desta fórmula particular são: minerais reduzi-dos, soro de leite, leite desnatado, óleo vegetal (óleos de oleína de palma,soja, coco e girassol oléico elevado), lactose, e menos do que 1 %: óleo demortierella alpina, óleo de crypthecodinium cohnii, palmitato de vitamina A,vitamina D3, acetato de vitamina E, vitamina K1, cloridreto de tiamina, clori-dreto de vitamina B6, vitamina B12, niacinamida, ácido fólico, pantotenato decálcio, biotina, ascorbato de sódio, inositol, cloreto de cálcio, fosfato de cál-cio, sulfato ferroso, sulfato de zinco, sulfato de manganês, sulfato cúprico,cloreto de sódio, citrato de sódio, citrato de potássio, hidróxido de potássio,selenita de sódio, taurina, nucleotídeos (adenosina 5'-monofosfato, citidina5'-monofosfato, guanosina 5'-monofosfato de dissódio, uridina 5'-monofosfato de dissódio).
Para utilizar esta fórmula particular para praticar a presente in-venção, seria necessário adicionar, por exemplo, glicomacropeptídeo decaseína na fórmula em uma quantidade suficiente para fornecer cerca de250 mg per litro a cerca de 1500 mg per litro de ácido siálico na composiçãodescrita na Tabela 1. Esta quantidade adicionada de ácido siálico deve serparte da quantidade total de proteína (proteína total de aproximadamente2,1 gramas per 100 calorias).
Exemplo 1
Este exemplo ilustra uma combinação de fonte de proteína par-ticular para um teor de ácido siálico total de aproximadamente 250 mg perlitro. Os ingredientes listados na Tabela 2 devem ser usados para substituiro componente de proteína da fórmula descrita na Tabela 1.
Tabela 2: Composição de Fonte de Proteína A
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Exemplo 2
Este exemplo ilustra uma combinação de fonte de proteína par-ticular para um teor de ácido siálico total de aproximadamente 360 mg perlitro. Os ingredientes listados na Tabela 3 substituem o componente de pro-teína da fórmula descrita na Tabela 1.
Tabela 3: Composição de Fonte de Proteína B
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Observação: a. "SA" na tabela significa ácido siálico.
b. CGMP significa glicomacropeptídeo de caseína.
Exemplo 3
Este exemplo ilustra uma combinação de fonte de proteína par-ticular para um teor de ácido siálico total de aproximadamente 600 mg perlitro. Os ingredientes listados na Tabela 4 substituem o componente de pro-teína da fórmula descrita na Tabela 1.
Tabela 4: Composição de Fonte de Proteína B
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Observação: a. "SA" na tabela significa ácido siálico.
b. CGMP significa glicomacropeptídeo de caseína.
Exemplo 4
A Tabela 5 ilustra um exemplo de uma formulação nutricionalcompleta de uma fórmula infantil com um teor de ácido siálico total de apro-ximadamente 250 mg per litro.Tabela 5: Formulação infantil exemplar com ácido siálico.
<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>
A Tabela 6 e a Tabela 7 mostram o conteúdo de componentesespecíficos da formulação descrita na Tabela 5 como uma porcentagem de1) peso para peso, 2) peso para volume, e 3) calorias. A gravidade específi-ca desta formulação particular é 1,0310986.
Tabela 6: composição da formulação infantil.
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Tabela 7: distribuição calórica da fórmula infantil
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Exemplo 5
A Tabela 8 ilustra o conteúdo nutricional da formulação apresen-tada nó Exemplo 4 per 100 calorias, assim como per 100 mililitros de fórmula.
<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>27
Per 100 Cal Per 100 ml
Potássio, mg 108 73
Cloreto, mg 63 43
Selênio, mcg 2,8 1,89
ácido siálico, mcg 37 25
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Observação: Soma do nucleotídeo e nucleosídeo correspondente expressocomo os pesos de nucleotídeo.
Exemplo de Referência 2
Este ilustra a produção de um produto de CGMP tendo níveisacentuados de ácido siálico.
Uma fração de queijo de soro de leite que é enriquecida comGMP é fracionada mediante o uso de cromatografia de ânion para produziruma fração que é intensificada em ácido siálico. Este produto apresenta umperfil de aminoácido similar àquele do GMP corrente comercialmente dispo-nível (disponível da Tatua Co-Operative Dairy Company Limited, Tatuanui,Morrinsville, New Zealand), mas contém de 1,5 a 3 vezes o teor de ácidosiálico de produtos de GMP correntemente disponíveis.
A fração intensificada com ácido siálico pode ser dessalgada, sedesejável, por eletrodiálise, por exemplo, e pode ser secada para produzirum produto em pó seco, que é depois utilizável para introdução em um lí-quido ou uma mistura de fórmula infantil seca. Este produto é um CGMPcom alto teor de ácido siálico e está disponível conforme a data de arquiva-mento do presente pedido da Tatua Co-Operative Dairy Company Limited,como produtos designados como X4738, X4739, X4740 e X4741. O teor deproteína, teor de ácido siálico, e perfil de aminoácido destes materiais sãodescritos na Tabela 9.
Tabela 9: Perfil de aminoácido e teor de ácido siálico de quatro exemplos deprodutos de CGMP com alto teor de ácido siálico.
<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>
Exemplos de Referência 3
Este ilustra a produção de um produto de CGMP tendo níveisacentuados de ácido siálico e níveis baixos de treonina.
Uma fração de queijo de soro de leite que é enriquecida comGMP é submetida a uma hidrólise proteolítica parcial seguido pelo fraciona-mento mediante o uso de cromatografia de ânion para produzir uma fraçãoque é intensificada em ácido siálico e possui um teor de treonina baixo. Esteproduto contém de 1,5 a 3 vezes o teor de ácido siálico de produtos de GMPcorrentemente disponível, mas o nível de treonina é reduzido em cerca deum quarto do material de GMP de partida.
A fração de treonina baixa intensificada por ácido siálico podeser dessalgada, se desejável, por eletrodiálise, por exemplo, e pode ser se-cada para produzir um produto em pó seco, que é depois utilizável para in-trodução em um líquido ou uma mistura de fórmula infantil seca. Este produ-to é um CGMP com alto teor de ácido siálico com treonina reduzida e estádisponível conforme a data de arquivamento do presente pedido da TatuaCo-Operative Dairy Company Limited, Tatuanui, Morrinsville, New Zealand,como produto designado como W4733. O teor de proteína, teor de ácidosiálico, e perfil de aminoácido deste material são descritos na Tabela 10.
Tabela 10: Perfil de aminoácido e teor de ácido siálico de CGMP com altoteor de ácido siálico com treonina reduzida.
<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>
É observado que o nível de treonina do novo produto são decerca de um quarto daquele do CGMP comercial. Conseqüentemente, acre-dita-se que o uso de um CGMP com alto teor de ácido siálico com treoninareduzida em uma fórmula infantil pode forencer uma fórmula tendo um nívelelevado de ácido siálico em níveis de proteína normais desejáveis de cercade 14 g de proteína/ litro, e ainda fornecer um perfil de aminoácido desejávele níveis baixos de treonina.Exemplo 6
Este ilustra o uso de uma fração de CGMP tendo níveis acentu-ados de ácido siálico em uma fórmula infantil.
O produto de CGMP tendo níveis acentuados de ácido siálicopode ser usado como uma fonte de proteína em uma fórmula infantil damesma maneira como um pó de soro de leite ou pó de CGMP normal. Pormeio de exemplo, a Tabela 11 mostra o teor de ácido siálico que pode seresperado de uma fórmula infantil em que o teor de proteína é fornecido porfontes convencionais. A quantidade de pó de CGMP que é usada é limitadade modo a evitar a divergência indevida do perfil de aminoácido da proteínaque é fornecida de um perfil padrão infantil desejável.
Tabela 11: Teor de ácido siálico de fórmula infantil com proteína fornecidapor fontes convencionais:
<table>table see original document page 33</column></row><table>
O pó de CGMP que é usado nesta formulação pode ser substitU'ido pelo novo produto de CGMP tendo um nível acentuado de ácido siálico,como é descrito acima no Exemplo de Referência 3. A Tabela 12 mostraque quando isto é feito, o teor de ácido siálico da formulação é mais do quedobrado sem outro rompimento do perfil de aminoácido da proteína.Tabela 12: Teor de ácido sialico de fórmula infantil com proteína fornecidapor fontes convencionais acrescida de um produto de CGMP tendo um nívelacentuado de ácido sialico:
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Se o pó de CGMP tendo níveis de ácido sialico acentuados forusado em dobro dos níveis descrito acima à custa de leite em pó desnatado,o teor de ácido sialico da fórmula pode ser aumenado para o nível mostadona Tabela 13.
Tabela 13: Teor de ácido sialico de fórmula infantil com proteína fornecidapor fontes convencionais acrescida de um produto de CGMP com um nívelacentuado de ácido sialico:
<table>table see original document page 34</column></row><table>Exemplo 7
Este exemplo ilustra a eficácia de uma dieta contedo glicoma-cropeptídeo de caseína sobre o procedimento de aprendizagem e o proce-dimento de memória de leitões.
Métodos
Animais
Durante um período de 20 meses, leitões domésticos machoscom 3 dias de idade (Sus scrofa) pesando 1,5 a 2,4 kg de 14 ninhadas dife-rentes foram adquiridos de um chiqueiro comercial. Eles foram estratificadosde acordo com o peso e aleatoriamente alocados para 1 de 4 tratamentos.Os leitões foram alojados em pares de acordo com o tratamento em chiquei-ros de arame com piso de concreto em um ambiente com temperatura con-trolada. Os chiqueiros domésticos continham um 'leito' (um pneu de borra-cha converto com uma toalha), uma lâmpada quente e um brinquedo deplástico idêntico. Os leitões foram encorajados de usar a extremidade maisdistante do chiqueiro como um banheiro e os chiqueiros foram limpos diari-amente. As luzes foram mantidas em um ciclo de luz (8 am - 8 pm)/ escuro(8pm-8am)de 12 h.
Suplementacão de CGMP
O glicomacropeptídeo de caseína (CGMP) contendo 60 mg/g deácido siálico foi fornecido pela Tatua Dairy Cooperativé (Morrinsville, NewZealand) e misturado no substituto de leite de porco em níveis específicospor Wombaroo Food Products (Glen Osmond, Austrália). A quantidade deácido siálico no leite final variou de acordo com o grupo: 77 mg/L (grupo 1, ogrupo de controle sem CGMP adicionado), 250 mg/L (grupo 2, dose baixa),600 mg/L (grupo 3, dose média) e 842 mg/L (grupo 4, dose mais elevada).Estes níveis representaram uma entrada de 25, 71, 171 e 240 mg/kg de pe-so corporal/dia respectivamente. Os substitutos foram formulados de modoque a entrada de proteína total permaneceu a mesma sem restrição daquantidade de CGMP adicionada. Para manter as taxas normais de cresci-mento, os leitões receberam 285 ml de leite/kg nas primeiras 2 semanas deestudo e 230 ml/kg nas semanas restantes. Os períodos de alimentaçãoforam 8:00, 13:00, 18:00 e 22:30, com um extra de 50 ml de leite fornecidode noite. O peso corporal, entrada de leite e medicação foram registradosdiariamente.
Avaliação da capacidade de aprendizagem e desempenho de memória
Os testes de aprendizagem formais começaram em 23 dias deidade usando um labirinto radial com 8 ramificações (figura 1 e figura 2). Olabirinto era uma estrutura de madeira construída para o propósito situadaem uma área de aprendizagem (4,2 m x 4,4 m) adjacente aos chiqueirosdomésticos. Uma câmara de vídeo foi instalada suspenso para registrar ostestes de aprendizagem e de memória. De modo a reduzir o estresse, ospares de leitão foram deixados explorar o labirinto um dia antes do início doteste formal. Dois testes de aprendizagem foram executados: tarefa 1 e tare-fa 2. Ambos os testes tinham leite acessível em uma ramificação, e leite ina-cessível nas 7 ramificações restantes, tal que todos as 8 ramificações dolabirinto forneceram os mesmos sinais olfatórios. Em ambos os testes, umasugestão visual consistindo de 3 pontos pretos foi colocada aleatoriamenteem uma entrada com leite acessível na ramificação (figura 3). Na tarefa 1 (atarefa fácil), um ponto preto foi colocado nas 7 entradas restantes. Na tarefa2 (a tarefa mais difícil), dois pontos pretos foram colocados nas 7 entradasrestantes.
Todos os leitões foram testados no labirinto individualmente.Quarenta testes da tarefa 1 foram conduzidos durante 5 dias (8 testes/dia) e40 testes da tarefa 2 durante 6 dias. A avaliação da velocidade de aprendi-zagem foi determinada como o número de testes tomados para de modobem sucedido aprender a sugestão visual e o número de erros (entrada er-rada) e sucessos (entrada correta) na descoberta da ramificação de leiteacessível durante cada teste. Um erro foi registrado de cada vez que o leitãoentrou ou colocou sua cabeça toda através da entrada errada. Um sucessofoi registrado apenas quando os leitões entraram na entrada correta e en-contraram o leite acessível. O critério para aprender a sugestão visual foi ummáximo de 1 erro em 3 testes consecutivos. Dois dias após a conclusão dostestes de tarefa 1 e testes de tarefa 2, a mesma tarefa foi apresentada comoum 'teste de memória' para um teste apenas. Todos os testes foram condu-zidos por 2 grupos de assistentes treinados os quais não estavam cegoscom relação ao nível de entrada de ácido siálico, mas os resultados forammais tarde confirmados pela análise independente do material de vídeo.
Avaliação da tensão
Desde que o estresse, possa influenciar a aprendizagem e amemória, a concentração de cortisol no sangue matutina foi medida em in-tervalos semanais que começam no dia 7 usando um kit comercial (Coat-A-Count Cortisol, Diagnostic Products, Doncaster, Austrália). A variação deinterensaio e intraensaio foram 9 % e 12 % respectivamente.
Análise de ácido siálico ligado a qanqliosídeo e ligado a proteína
No dia 34 ou 35, os leitões foram submetidos a eutanásia pelainjeção de pentotal de sódio (50 mg/kg). Os tecidos cerebrais do córtex fron-tal cerebral foram coletados e armazenados em -80 °C até que analisados.Os ácidos siálicos ligados a gangliosídeo e ligados a proteína foram deter-minados separadamente usando os métodos publicados (Ver,-Manai, id.).Todas as amostras foram analisadas em duplicata e a concentração final deácido siálico em cada fração foi expressa em u,g/g de tecido úmido.
Análise estatística
Diferenças na velocidade de aprendizagem (número de testespara aprender a sugestão visual) foram comparadas usando análise de so-brevivência Kaplan-Meier com regressão de Cox para examinar as estatísti-cas co-variáveis potenciais que possam influenciar a velocidade de aprendi-zagem. As comparações entre as médias (com ou sem estatísticas co-variáveis) foram executados usando o modelo linear geral (Univariate ANO-VA). A correlação de Pearson foi usada para examinar a conexão entre onúmero de erros, sucessos, peso corporal e desempenho de memória. To-das as análises estatísticas foram concluídas usando SPSS for Windows 11Inc, Chicago. Um nível significativo de 0,05 foi usado.
Resultados
Velocidade de aprendizagem
Na tarefa tanto fácil quanto mais difícil, os grupos suplementa-dos com ácido siálico aprenderam a sugestão visual mais rápido do que ogrupo de controle (Kaplan-Meier, P = 0,0014 na tarefa 1 e P = 0,0177 natarefa 2, ver a figura 4 e a figura 5). Na tarefa 1, apenas 45 % do grupo decontrole atingiu o critério dentro de 40 testes enquanto o melhor desempe-nho de aprendizagem foi no grupo 2 (100 % aprenderam dentro de 40 tes-tes) seguido pelo grupo 4 (80 %) e o grupo 3 (70 %). Na tarefa 2, existiuuma conexão de resposta de dose (P = 0,0177), com todos os leitões nogrupo 4 atingiram o critério dentro de 30 testes). As diferenças entre os gru-pos foram ainda significativos quando ajustados com relação as diferençasno peso corporal no momento do teste (P < 0,05).
Estatísticas co-variáveis com relação à aprendizagem
É provável que os leitões usaram a informação obtidas na tarefa1 para auxiliá-los a aprender a sugestão visual na tarefa 2. Portanto usamoso número total de erros e sucessos na tarefa 1 como estatísticas co-variáveis para a análise da velocidade de aprendizagem na tarefa 2. A dife-rença entre os grupos após o ajuste permaneceu altamente significativa (P =0,002 erros como estatísticas co-variáveis & 0,004 sucessos como estatísti-cas co-variáveis) e a ordem de resposta de dose na velocidade de aprendi-zagem da tarefa 2 não mudou. As descobertas foram similares se todos os40 testes na tarefa 1 forem considerados ou exatamente os últimos 20 tes-tes. O número de erros nos testes de 21 a 40 da tarefa 1 também variousignificativamente entre os grupos. Este foi o caso com ou sem o uso deerros nos testes de 1 a 10 como uma estatística co-variável (P = 0,016). Ogrupo de controle produziu significativamente mais erros do que o grupo 2(P = 0,005) e o grupo 4 (P = 0,006), mas apenas marginalmente mais doque o grupo 3 (P = 0,06). Em uma análise similar para a tarefa 2, a estatísti-ca co-variável foi significativa, mas os grupos não foram significativamentediferentes (com ou sem a estatística co-variável) (P > 0,05) (figura 6). Análi-ses similares usando o número total de erros em todos os testes revelaramuma diferença significativa entre os grupos de tratamento (grupos combina-dos 2, 3 & 4) vs o grupo de controle (P = 0,009) e uma diferença marginalentre os grupos na tarefa 2 (p = 0,048).Teste de memória
Os leitões que foram capazes de alcançar o critério de aprendi-zagem foram avaliados com relação a sua capacidade de lembrar a suges-tão visual 48 h mais tarde. A diferença global entre os grupos foi estatistica-mente significativa para a tarefa 2 (P = 0,036), mas não para a tarefa 1 (P =0,165, figura 7(A)).
Não existiu nenhum efeito de resposta de dose em cada tarefa.Na tarefa 2, o grupo 3 e o controle eram aproximadamente equivalentes (fi-gura 7(B)). A combinação dos grupos 2, 3 e 4 como o grupo tratado, existi-ram 35 % menos erros (média = 1,5) comparado com o grupo de controle(média 2,4, p = 0,036).
Não surpreendentemente, o número de erros e sucessos duran-te o período de aprendizagem significativamente influenciou o desempenhode memória em todos os leitões. Assim, um número superior de erros noperíodo de aprendizagem prognosticou um número superior de erros o testede memória (P = 0,03 na tarefa 1 e P = 0,029 na tarefa 2, correlações deSpearman 2 emendas). Similarmente, um número superior de sucessos noperíodo de aprendizagem foi significativamente associado com um númeroinferior de erros no teste de memória na tarefa 1 (P = 0,007), mas não natarefa 2 (P = 0,20). O peso corporal, taxa de ganho de peso e velocidade deaprendizagem significativamente não afetaram o desempenho no teste dememória (P > 0,05).
Cortisol no plasma
A concentração de cortisol média em cada grupo durante o perí-odo de estudo de cinco semanas é mostrada na figura 8(A). Sobre todos osgrupos, a diferença entre a primeira semana e todas as outras semanas foisignificativamente diferente (semana 1 vs semanas 2, 3, 4 e 5; P = 0,031,0,015, 0,001 e 0,001 respectivamente). A partir da semana 2 em diante, asconcentrações de cortisol para todos os leitões diminuíram na média, maisnão significativamente (P > 0,05). Quando todos os grupos suplementadosforam combinados em um grupo, a diferença entre o grupo de tratamento vsde controle não foi significativa (P > 0,05, figura 8(B)). Na semana 2, a dite-rença entre o grupo 2 e o grupo 3 foi significativa (P = 0,044). Quando aconcentração de cortisol no plasma sangüíneo foi usada como uma estatís-tica co-variável durante a aprendizagem, nenhum efeito significativo foi ob-servado (P > 0,05).
Concentração de ácido sialico no cérebro
A maioria do ácido sialico no córtex frontal do cérebro do leitão(86 %) era ligada aos glangiosídeos com uma fração pequena (-13 %) liga-da a glicoproteína e menos do que 2 % na forma livre. Isto é comparávelcom o trabalho publicado anterior por Brunngraber, E. G. et al., Brain Res.,38:151-162 (1972), e Mahal, L. K. et al., em J. Biol. Chem., 277:9255-9261(2002). Existiu uma conexão de resposta de dose significativa entre o ácidosialico ligado a proteína no cérebro e os níveis de suplementação de CGMP,por exemplo, o grupo 4 continha o nível mais elevado, seguido pelo grupo 3,2 e 1. O nível no grupo 1 era significativamente mais baixo do que o grupo 4(P = 0,001) e o grupo 3 (P = 0,001), mas não o grupo 2 (P = 0,126). Na mé-dia, o ácido sialico ligado a proteína é matéria cinzenta era de 6 a 10 % maiselevado nos grupos suplementados com CGMP vs o controle (P = 0,000, Tabela 14).
Tabela 14: O nível médio de ácido sialico ligado a qanqliosídeo, ligado a proteína e livreno córtex frontal do cérebro de acordo com o nível de suplementação de CGMP.
<table>table see original document page 40</column></row><table>
Observações:
a. "n" é o número de leitões per grupo.
A concentração média de ácido sialico ligado a ganglisídeo tam-bém seguiu uma ordem de resposta de dose (13 %, 11 % e 8 % mais eleva-da no grupo 4, grupo 3 e grupo 2 respectivamente vs controle), mas as dife-renças não alcançaram importância estatística (P = 0,089, 0,124 e 0,299respectivamente, Tabela 14). Quando todos os grupos suplementados porCGMP foram combinados em um grupo, a diferença entre o tratamento e ogrupo de controle foi marginalmente significativa (P = 0,07, figura 9). A vari-ação interindividual no ácido siálico ligado a gangliosídeo foi maior do queaquela do ácido siálico ligado a proteína (CV = ~5 % em ácido siálico ligadoa gangliosídeo vs 2 % em ácido siálico ligado a proteína). O mesmo fenô-meno foi relatado em um estudo de cérebros infantis humanos relatado porMahal, L. K., Id.
A concentração de ácido siálico total (ligado a gangliosídeo +ligado a proteína) foi marginalmente superior nos grupos de tratamento comCGMP combinados vs grupo de controle (P = 0,051), mas o ácido siálicolivre não foi (P = 0,58, figura 9).
Correlação de ácido siálico no cérebro com o desempenho deaprendizagem
Uma concentração mais elevada de ácido siálico ligado a prote-ína, ligado a gangliosídeo e total no córtex frontal do cérebro foi associadacom a aprendizagem mais rápida tanto na tarefa 1 quanto na tarefa 2 (verfigura 10(A), figura 10(B), figura 11 (A) e figura 11 (B)).
Nenhuma das correlações, quer paramétrica quer não paramé-trica, alcançou importância estatística (ver as figuras 10 e figuras 11 totais).Em uma análise similar para a tarefa de memória, uma correlação negativa(teor de ácido siálico elevado, menos erros) foi observada tanto na tarefa 1quanto na tarefa 2, mas novamente os resultados não alcançaram importân-cia estatística (P > 0,05), exceto para a forma ligada a proteína no grupo 4para a tarefa 1 (P = 0,045, figura 12). Existiu uma correlação positiva signifi-cativa entre o número total de sucessos e o ácido siálico ligado a gangliosí-deo na tarefa 1 (P = 0,045), mas não na tarefa 2 (P < 0,05).
Ganho de peso corporal
O peso corporal de partida médio (± SE) foi o mesmo em cadagrupo (2,1 ± 0,04 kg) e os animais ganharam peso em taxas similares (figura13). Embora o grupo de controle tenha pesado ligeiramente mais do que osoutros grupos no final do estudo, a taxa de ganho de peso (g/dia) não variousignificativamente entre os grupos (P = 0,503).
Todas as referências citadas neste relatório descritivo, incluindosem limitação todos os documentos, publicações, patentes, pedidos de pa-tente, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, folhetos, livros, posta-gens de internet, artigos de jornal, periódicos, e outros mais, são por meiodeste incorporados por referência neste relatório descritivo em sua totalida-de. O debate das referência é destinado meramente para resumir as decla-rações feitas pelos seus autores e nenhuma admissão é feita em que qual-quer referência constitua a técnica anterior. As Requerentes reservam o di-reito de se opor a exatidão e propriedade das referências citadas.
Em vista do acima, será observado que as várias vantagens dainvenção são obtidas e outros resultados vantajosos são obtidos.
Como várias mudanças podem ser feitas nos métodos e com-posições acima por aqueles de habilidade usual na técnica sem divergir doescopo da invenção, é planejado que toda a matéria contida na descriçãoacima e mostrada nos desenhos acompanhantes será interpretada comoilustrativa e não em um sentido limitativo. Além disso, deve ficar entendidoque estes aspectos das várias formas de realização podem ser trocadostanto no todo quanto em parte.

Claims (30)

1. Método de melhora do procedimento de aprendizagem e/oumemória em um mamífero com necessidade da melhora no procedimentode aprendizagem e/ou memória, o método compreendendo a administraçãoao mamífero de glicomacropeptídeo de caseína em uma quantidade sufici-ente para melhorar o procedimento de aprendizagem e/ou memória no ma-mífero.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o mamíferoestá entre cerca de 1 dia e cerca de 4 dias de idade.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o mamíferoé um mamífero neonatal.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a necessi-dade de melhora procedimento de aprendizagem e/ou memória é mostradaonde pelo menos uma parte do requisito nutricional do mamífero foi forneci-do por uma fórmula tendo menos do que cerca de 100 mg/L de ácido siálico.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a necessi-dade de melhora no procedimento de aprendizagem e/ou memória é mos-trada onde substancialmente todo do requisito nutricional do mamífero foifornecido mediante a administração de uma fórmula tendo menos do quecerca de 100 mg/L de ácido siálico.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que uma parteprincipal da proteína contida na fórmula é proteína de soja ou proteína deleite de vaca.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que pelo menoscerca de 75 % em peso da proteína contida na fórmula é proteína de soja ouproteína de leite de vaca.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que substanci-almente toda a proteína contida na fórmula é proteína de soja ou proteínade leite de vaca.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a necessi-dade de melhora no procedimento de aprendizagem e/ou memória é mos-trada onde o requisito nutricional do mamífero foi fornecido por um dieta quefornece ácido siálico em uma quantidade que é mais baixa do que normal-mente seria obtida a partir da amamentação.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a dieta quefornece uma quantidade mais baixa de ácido siálico do que normalmenteseria obtida da amamentação compreende uma fórmula líquida tendo teorde ácido siálico que está abaixo de cerca de 100 mg/L.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a dieta quefornece uma quantidade mais baixa de ácido siálico do que normalmenteseria obtida na amamentação compreende uma fórmula líquida tendo umteor de ácido siálico que está abaixo de cerca de 200 mg/L.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que aadministração da fórmula compreende a administração entérica.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o glicoma-cropeptídeo de caseina é incluído em uma fórmula que é uma fórmula infantil.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a fórmulaé uma fórmula infantil nutricionalmente completa que compreende carboidrato, lipídeo e proteína.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a proteí-na compreende um material que é selecionado de proteína de leite de vaca,proteína de soja, e mistura dos mesmos.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o glicoma-cropeptídeo de caseina é administrado em uma quantidade suficiente parafornecer pelo menos cerca de 100 mg/kg/dia de ácido siálico ao mamífero.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o glicoma-cropeptídeo de caseina é administrado em uma quantidade suficiente parafornecer pelo menos cerca de 200 mg/kg/dia de ácido siálico ao mamífero.
18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a fórmulacompreende um líquido tendo uma concentração de ácido siálico de pelomenos cerca de 200 mg/litro.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, tendo um nível deácido siálico de pelo menos cerca de 300 mg/litro.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, tendo um nível deácido siálico de pelo menos cerca de 600 mg/litro.
21. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendouma fórmula tendo um teor de proteína total entre 12 e 16 gramas/litro dosquais não mais do que 40 % em peso é fornecido pelo glicomacropeptídeodecaseína.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a fórmulacompreende um teor de proteína total entre 13 e 15 gramas/litro dos quaisnão mais do que 30 % em peso é fornecido pelo glicomacropeptídeo de ca-seína.
23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o glicoma-cropeptídeo de caseína compreende um glicomacropeptídeo de caseínatendo uma concentração acentuada de ácido siálico.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o glico-macropeptídeo de caseína tendo uma concentração acentuada de ácidosiálico compreende glicomacropeptídeo de caseína com teor elevado deácido siálico com treonina reduzida.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o glico-macropeptídeo de caseína está incluído em uma fórmula tendo um teor deproteína total entre 13 e 15 gramas/litro dos quais não mais do que 30 % empeso é fornecido por um glicomacropeptídeo de caseína tendo uma concen-tração acentuada de ácido siálico e tendo um teor de treonina de não maisque 10 gramas/16 gramas de nitrogênio.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o glicoma-cropeptídeo de caseína está incluído em uma fórmula tendo um teor de pro-teína total de cerca de 14 gramas/litro dos quais não mais de 4 % em peso étreonina e tendo um teor de ácido siálico de pelo menos 400 mg/litro.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen-dendo medir o procedimento de aprendizagem e/ou memória do mamíferoseguindo a administração do glicomacropeptídeo de caseína.
28. Método de aumentar o ácido siálico ligado a proteína no cé-rebro em um mamífero, o método compreendendo a administração ao ma-mífero de uma quantidade de glicomacropeptídeo de caseína que é suficien-te para aumentar o ácido siálico ligado a proteína no cérebro do mamífero.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o ácidosiálico ligado a proteína no cérebro é aumentado em uma quantidade depelo menos 5 %.
30. Método de melhora do procedimento de aprendizagem e/oumemória em um mamífero, o método compreendendo:determinar se o mamífero é aquele que está com necessidade de melhorana aprendizagem e/ou memória; e, nesse casoadministrar ao mamífero glicomacropeptídeo de caseína em uma quantida-de suficiente para melhorar o procedimento de aprendizagem e/ou memóriano mamífero.
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