BRPI0608926A2 - ativador de células t gamadelta, composição farmacêutica, uso de um ativador de células t gamadelta, composição de vacina, método de ativação de uma célula t gamadelta, célula t gamadelta, e, uso de uma célula t gamadelta - Google Patents

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Abstract

ATIVADOR DE CéLULAS T GAMADELTA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DE UM ATIVADOR DE CéLULAS T GAMADELTA, COMPOSIçãO DE VACINA, METODO DE ATIVAçãO DE UMA CéLULA T GAMADELTA, CéLULA T GAMADELTA, E, USO DE UMA CéLULA T GAMADELTA. A presente invenção refere-se a uma nova classe de compostos tendo propriedades ativadoras das células <sym><sym>T, referidos aqui como angelil ou tiglil fosfoésteres, composições compreendendo qualquer um destes compostos e métodos para regular uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar estes compostos.

Description

" ATIV ADOR DE CÉLULAS T GAMADELTA, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, USO DE UM ATIVADOR DE CÉLULAS TGAMADELTA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, MÉTODO DE ATIVAÇÃODE UMA CÉLULA T GAMADELTA, CÉLULA T GAMADELTA, E, USODE UMA CÉLULA T GAMADELTA"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a uma nova classe de compostostendo propriedades ativadoras de células γδΤ, referidos aqui como angelilfosfoésteres, composições compreendendo qualquer um destes compostos emétodos para regular uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo aetapa de administrar estes compostos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A maioria das células γδΤ sangüíneas periféricas humanasexpressam um heterodímero yôTCR codificado por genes Vy9/V62, algunsreceptores de linhagem-NK para MHC classe I e quase nenhum CD4 nemCD8. Estas células mostrou exibir forte atividade citolítica, restringida-MHC,contra células infectadas por vírus (Poccia et al. (1997), células infectadas porparasita (Constant et al (1995)), ou células tumorais (Fournie et Bonneville(1996). Estas células são também fisiologicamente ampliadas no contexto dediversas doenças infecciosas não-relacionadas, tais como tuberculose,malária, tularemia, colibacilose e também por tumores de célula-B (pararecapitulação, vide Hayday, 2000.
Além de sua atividade antiinfecciosa, foi mostrado em ensaiosde citotoxicidade de curto termo que as células Vy9/VÔ82 T são capazes delisar uma larga variedade de linhagens de células tumorais de origens muitodiversas: linfoma e leucemia de linhagens de célula-B, célula-T ou mielóides(Fisch et al., 2000; Selin et al., 1992; Sicard et al., 2001; Sturm et al., 1990;Zheng et al., 2001a), carcinoma de mama (Bank et al., 1993), glioblastoma(Fujimiya et al., 1997; Yamaguchi et al., 1997), carcinoma de célula renal(Choudhary et al., 1995; Kobayashi et al., 2001; Mitropoulos et al., 1994),carcinoma nasofaríngeo (Zheng et al., 2001b), adenocarcinoma de pulmão(Ferrarini et al., 1996).
Em micróbios, os linfócitos Vy9/V52+ reconhecemespontaneamente um conjunto de antígenos não-peptídicos estruturalmenterelacionados, referidos como fosfoantígenos e alquilaminas naturais. Nostumores de célula B, a natureza dos antígenos para as células T γδpermanecem não identificados. Os linfócitos Vy9/VÔ2+ são tambémresponsivos a uma variedade de tipos de células viralmente infectadas,ativadas ou tumorais, sem exposição anterior. Repetindo, nestas situações, osantígenos responsáveis permanecem desconhecidos (para recapitulação, videFisch, 2000).
Foi mostrado que, in vitro, os linfócitos Vy9/VÔ2 2+ respondema medicamentos sintéticos, tais como aminobisfosfonatos terapêuticos(recapitulado em Espinosa, 2001), resultando em sua ativação in vitro. Oreconhecimento de antígenos não-peptídicos naturais é mediado por TCR γδ,através de resíduos amino ácidos localizados nas regiões CDR3 tanto Vy9-como VÔ2-. Embora não esteja envolvido processamento nem apresentaçãopor moléculas CDl ou MHC, a ativação de linfócito Vy9/Vô2+ por antígenosnão-peptídicos parece requerer contato de célula-com-célula (Lang, 1995;Morita, 1995; Miyagawa, 2001, Rojas, 2002).
Os antígenos bacterianos estimulantes foram mostrados serempequenos compostos não peptídicos, classicamente referidos comofosfoantígenos (Behr et al., 1996; Belmant et al., 2000; Constant et al., 1995;Poquet et al., 1998; Tanaka et al., 1995), devido à presença de grupos fosfatona maioria dos exemplos.
As células T Vy9/VÔ2+ podem também ser ativadas através demetabólitos endógenos (atuando na faixa micromolar), tais como pirofosfatode isopentenila ou IPP (Espinosa et al., 2001b; Tanaka et al., 1995), que éproduzido através o trajeto do mevalonato convencional, compartilhado porcélulas tanto de microorganismos como de mamíferos. A produção de IPP nasúltimas células pode ser supra-reguladas em situações de estresse etransformação celular. Em particular, um estudo recente informou umacorrelação entre os níveis de produção endógenos de IPP em células tumoraise sua susceptibilidade à Iise mediada por célula T Vy9/VÔ2 (Gober et al.,2003).
Também consistente com uma contribuição direta demetabólitos endógenos do trajeto de mevalonato para reconhecimento dascélulas T Vy9/VÔ2, o tratamento celular com agentes farmacológicos evitandoa biossíntese de IPP (tal como estatinas) ou resultando no acúmulo de IPP (talcomo aminobisfosfatos, vide abaixo) resultam respectivamente nasdiminuídas ou aumentadas propriedades estimulantes das células Vy9/VÔ2 dascélulas tratadas (Gober et al., 2003).
Pensa-se que os aminobisfosfonatos inibem a FPP sintase, umaenzima do trajeto de mevalonato, cuja inibição causa o acúmulo e liberaçãodos lipídeos isoprenóides a montante, tais como IPP. Os compostos deaminobisfosfonato tinham sido usados em terapia humana, para o tratamentode metástase óssea em pacientes com câncer e forneceram um primeiroconjunto de evidências para expansão in vivo de linfócitos Wy9/V82+,induzidos por agonistas de fosfoantígeno, relatando aumentos de células γδdentro de uma a três semanas em adultos humanos com múltiplo mieloma,após injeção intravenosa terapêutica de 60 - 90 mg de pamidronato(Kunzmann et al, 1999).
Entretanto, tais compostos requerem apresentaçãopor células apresentando antígeno e não podem produzir substancial estímulode atividade de célula T Vy9/VÔ2, como avaliado por secreção de citocina emuma cultura pura de células T Vy9/V52. Além disso, o pamidronato apresentapotência de ativação muito baixa das células T γδ, relatado obter na melhordas hipóteses aumento somente de 2 vezes na contagem de células T γδ(Wilhelm et al., 2003).
Recentemente, diversos compostos contendo pirofosfatoativadores das células T γδ altamente potentes foram descritos, que ativamdiretamente as células T γδ. Em particular, os compostos de fosfoaloidrina efosfoepóxido foram descritos pelo grupo J.J. Fournie. (R, S)-3-(bromometil)-3-butanol-l-il-difosfato, também referido como BrHPP (Pirofosfato deBromoidrina), é atualmente usado em estudos clínicos humanos contínuos,para estimular a proliferação das células T γδ ex vivo. Outros compostoscontendo pirofosfato, com alta atividade específica (EC50 na faixa nanomolarou melhor), são produzidos através de um trajeto biossintético de isoprenóide,chamado o trajeto de "Rohmer" ou de "não-mevalonato", que é específicopara microorganismos pro e eucarióticos (Feurle et al., 2002; Hintz et al(2003); Jomaa et al., 1999a; Jomaa et al., 1999b; Rohmer et al., 1993).
Apesar do precedente, há ainda necessidade de novoscompostos provendo ativação das células T γδ, em particular compostos tendoaumentada potência e/ou preferidas propriedades farmacodinâmicas. Taiscompostos têm particulares vantagens em indicações de não-ameaça de vidaou terapêuticas crônicas, em que as terapias devem ser livres de toxicidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção agora descreve uma nova classe decompostos tendo propriedades ativadoras das células T γδ. Esta nova classede compostos é referida como a classe de angelil fosfoéster e tiglil. Osinventores descobriram que a classe de compostos descrita aqui tem altapotência, em comparação com outros compostos sabidos modularem aatividade das células T γδ. Preferivelmente, os compostos da invenção sãoisolados, purificados ou parcialmente purificados.
Estes compostos podem ser usados para eficientemente regulara atividade das células T γδ, particularmente a ativação e proliferação dascélulas T γδ, preferivelmente células T Yy9/Vò2, in vivo em um indivíduo.Estes novos ativadores das células T γδ podem ser usados de acordo comqualquer um dos métodos aqui descritos. Estes compostos são particularmenteadequados para imunoterapia, particularmente para tratar um indivíduo tendoum tumor ou um indivíduo sofrendo de outras doenças, particularmente umadoença infecciosa, uma doença autoimune ou uma doença alérgica. Oscompostos de acordo com a presente invenção podem também ser usadoscomo um adjuvante de vacina.
Por conseguinte, a invenção fornece um ativador de células Tγδ de fórmula (I):
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3;
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado;
A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2, ou qualquer outro grupoisostérico;
W é C-R^ouN;
R7 é um grupo (Ci.C3)aquila ou qualquer outro grupoisostérico tal como Cp3;
R3, R4 e R6, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)aquila ou qualquer outro grupo isostérico tal como CF3;
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci_C3)álcool, ou um(C2-C3)éster; e,
Y = CTCat+, um grupo (Ci.C3) aquila, um grupo -Α-R, em queR é um grupo hidrocarboneto C1-C50, linear, ramificado ou cíclico, aromáticoou não, saturado ou insaturado, opcionalmente interrompido pelo menos porum heteroátomo, em que dito grupo hidrocarboneto compreende uma alquila,uma alquilenila, ou uma alquinila, preferivelmente uma alquila ou umalquileno, que pode ser substituído por um ou diversos substituintesselecionados do grupo consistindo de: uma alquila, uma alquilenila, umaalquinila, uma epoxialquila, uma arila, um heterociclo, um alcóxi, uma acila,um álcool, um grupo carboxílico (-COOH), um éster, uma amina, um aminogrupo (-NH2), um amido (-CONH2), uma imina, uma nitrila, uma hidroxila (-OH), um grupo aldeído (-CHO), um halogênio, uma halogenoalquila, um tiol(-SH), uma tioalquila, uma sulfona, um sulfóxido, e uma combinação deles.
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais Preferivelmente, A é O.Mais Preferivelmente, R3, R4 e R<$ são hidrogênio. Preferivelmente, R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais Preferivelmente, R5 é -CH2-OH. Preferivelmente, R7 é CH3 ou um seu grupo isostérico, tal como CH2F,CF2H ou CF3. Preferivelmente, m é 1.
Em uma forma de realização, o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de fórmula (I) são na configuração Z (ou eis). Emoutra forma de realização, o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de fórmula (I) são na configuração E (ou trans) com respeito à posiçãode dupla ligação. Tanto quanto é observado aqui (vide Exemplos) que oativador das células T γδ de fórmula (I), em que o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY estão na configuração Z, tem significativamentemaior atividade na ativação das células T γδ do que na configuração E, aconfiguração Z é preferida.
Em um aspecto, dito ativador é um composto selecionado dogrupo consistindo de:
Um composto de Fórmula (II):
<formula>formula see original document page 7</formula>
em que Cat+, m, B, A, R5, R3, R4, R6, R7 e Y são definidos como na Fórmula (I).Um composto de Fórmula (III):
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que Cat+, m, B, A, R5, R3, R4, R7 e Y são definidos como na Fórmula (I).
Um composto de Fórmula (IV):
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que Cat+, m, B, A, W, R5, R3, R4, R6, R7, e Y são definidos como naFórmula (I).
Um composto de Fórmula (V):
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que Cat+, m, B, A, W, R5, R3, R4, R6 e Y são definidos como na Fórmula (I)·
Um composto de Fórmula (VI):
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que Cat+, m, B, A, W, R3, R4, R6, e Y são definidos como na Fórmula (I).
Um composto de Fórmula (VII):
<formula>formula see original document page 8</formula>em que Cat+, m, B, W, R5, R3, R4, R6, R7 e Y são definidos como na Fórmula(I), R8 é H ou F, e R9 é H ou F.
Um composto de Fórmula (VIII):
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que Cat+, m, B, W, R5, R3, R4, R6, R7, e Y são definidos como na Fórmula (I).
Um composto de Fórmula (IX):
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que Cat+, m, B, W, R3, R4, R6, e Y são definidos como na Fórmula (I).
Um composto de Fórmula (X):
<formula>formula see original document page 9</formula> O-Cat+
em que Cat+, m, B, W, R3, R4, R6, e Y são definidos como na Fórmula (I), R8é H ou F, e R9 é H ou F.
Um composto de Fórmula (XI):
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que Cat+, m, B, W, R3, R4, R6 e Y são definidos como na Fórmula (I).
Em uma forma de realização preferida, o ativador das célulasT γδ é um composto de Fórmula (XII) ou (ΧΙΓ):pirofosfato de (Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila pirofosfato (também referidocomo HAngelilPP)
<formula>formula see original document page 10</formula>
pirofosfato de (E)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila pirofosfato (também referidocomo HTiglilPP)
Em outras formas de realização preferidas, o ativador dascélulas T γδ é um composto de Fórmula (XIII) ou (ΧΙΙΓ):
<formula>formula see original document page 10</formula>
pirofosfonato de (Z)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enila (também referido como C-HAngelilPP)
<formula>formula see original document page 10</formula>
pirofosfonato de (E)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enila (também referido como C-HTiglilPP)
Em formas de realização preferidas adicionais, o ativador decélulas T γδ é um composto de Fórmula (XIV) ou (XIV'):
<formula>formula see original document page 10</formula>
pirofosforamidato de (Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoN-HAngelilPP)
<formula>formula see original document page 11</formula>
pirofosforamidato de (E)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoN-HTiglilPP)
Em outras formas de realização, o ativador de células T γδ éum composto de Fórmula (XV):
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que Cat+ e A são definidos como na Fórmula (I); X é H e Z é CH3(deoxirribonucleosideo é timidina) ou X é OH e Z é H (ribonucleosídeo éuridina). Em uma forma de realização, o composto de Fórmula (XVI) é naconfiguração E (ou trans). Em uma forma de realização preferida, o compostode Fórmula (XVI) é na configuração Z (ou eis).
A presente invenção também provê composição farmacêuticacompreendendo um ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasformas de realização aqui descritas. Em formas de realização preferidas, ocátion Cat+ será um cátion farmaceuticamente aceitável. São tambémfornecidos métodos de modular, preferivelmente ativar, uma célula T γδ, ométodo compreendendo trazer uma célula T γδ em contato com um compostoativante de células T γδ aqui descrito. Como será apreciado, os compostos dapresente invenção podem ser usados para ativar as células T γδ in vitro ou invivo. As células T γδ ativadas in vitro podem ser usadas em qualquer métodoadequado em seguida à ativação, incluindo em terapia ou prevenção dedoença. Em um exemplo preferido, as células T γδ ativadas são administradasa um mamífero, preferivelmente um humano. Em um aspecto preferido, ainvenção abrange um método de tratamento, compreendendo (a) trazer umacélula T γδ em contato com um composto ativante de célula T γδ aqui descritoe (b) administrar as células T γδ da etapa (a) a um indivíduo. Os métodos parapreparar as células T γδ para tais aplicações são conhecidos na arte, porexemplo, podem ser realizados como descrito em US2005196385 eW003070921, ambos de Romagne e Laplace, cujas descrições sãoincorporadas aqui por referência.
São também fornecidos métodos de modular, preferivelmenteativar, uma célula T γδ, compreendendo administrar a um indivíduo umativador de célula T γδ aqui descrito. Em formas de realização preferidas, osinvenção fornece um método para tratar ou evitar uma doença,compreendendo administrar a um indivíduo um ativador de células T γδ aquidescrito em uma quantidade suficiente para melhorar ou evitar dita doença. Etambém provido o uso de um ativador de células T γδ da invenção, para amanufatura de uma composição farmacêutica para regular as células T γδ emum indivíduo humano, preferivelmente desse modo tratando uma doença.
Preferivelmente, dita doença é um tumor ou distúrbio proliferativo, umadoença infecciosa, uma doença autoimune ou uma doença alérgica.
Formas de realização adicionais e detalhes são aindafornecidos aqui.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um esquema sintético para a preparação docomposto HTiglilPP, como realizada no Exemplo 1.
A Figura 2 é um esquema sintético para a preparação doscompostos H-AngelilPP e C-HAngelilPP, como realizada nos Exemplos 2 e 3.
A Figura 3 mostra uma curva de resposta de dose in vitro e osvalores EC50 para os compostos da presente invenção H-AngelilPP eHTiglilIPP e compostos de referência (R5S)-BrHPP e (E)-HDMAPP.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Definições
Dentro do contexto da presente invenção, a expressão "regulara atividade das células T γδ" designa causar ou favorecer um aumento nonúmero e/ou atividade biológica de tais células em um indivíduo. Regularassim inclui, sem limitação, modular (p. ex., estimular) a expansão de taiscélulas em um indivíduo e/ou, por exemplo, o acionamento da secreção dacitocina (p. ex., TNFa ou IFΝγ). Como indicado, as células T γδ normalmenterepresentam entre cerca de 1 - 10% dos linfócitos circulantes totais em umindivíduo humano adulto saudável. A presente invenção pode ser usada parasignificativamente aumentar a população das células T γδ em um indivíduo,particularmente para alcançar pelo menos 10%, 12%, 15%, 20%, ou 30-90%dos linfócitos totais circulantes, tipicamente 40 - 90%, mais preferivelmentede 50 - 90%. Em formas de realização típicas, a invenção permite a expansãoseletiva das células T γδ em um indivíduo, para alcançar 60 - 90% doslinfócitos circulantes totais, preferivelmente 70 - 90%, mais preferivelmentede 80 - 90%. Regular também inclui, em adição ou em alternativa, modular aatividade biológica das células T γδ em um indivíduo, particularmente suaatividade citolítica ou sua atividade de secreção de citocina. A invençãodefine novas condições e estratégias para aumentar a atividade biológica dascélulas T γδ em relação às células alvo.
Onde "compreendendo" for usado, este pode serpreferivelmente substituído por "consistindo essencialmente de", maispreferivelmente por "consistindo de".
Onde os termos numéricos aqui antes e a seguir forem usados,eles destinam-se a incluir os números representando os limites superior einferior. Por exemplo, "entre 1 e 3" representa uma faixa "de e incluindo 1 atée incluindo 3" e "na faixa de 1 a 3" representaria "de e incluindo 1 até eincluindo 3". O mesmo é verdadeiro onde, em vez de números (p. ex., 3),palavras indicando números forem usadas (p. ex., "três").
Onde "cerca de" for usado com relação a um número, estepreferivelmente significa o número ± 15%, mais preferivelmente o númeromais 5%, muitíssimo preferivelmente o próprio número sem "cerca de". Porexemplo, "cerca de 100" representaria "de e incluindo 85 a e incluindo 115".
Onde "cerca de" for usado com relação a faixas numéricas, por exemplo,"cerca de 1 a cerca de 3" ou "entre cerca de 1 e cerca de três",preferivelmente a definição de "cerca de" dada para um número da últimafrase é aplicada a cada número definindo o início e o fim de uma faixaseparadamente. Preferivelmente, onde "cerca de" for usado com relação aquaisquer valores numéricos, "cerca de" pode ser eliminado.
"Semanalmente" representa "cerca de uma vez por semana"(significando que mais do que um tratamento é feito com um intervalo decerca de uma semana entre tratamentos), cerca de aqui preferivelmentesignificando ± 1 dias (isto é, traduzindo em "cada 6 a 8 dias"); muitíssimopreferivelmente, "semanalmente" representa "uma vez a cada 7 dias".
Como aqui usado, o termo "EC50", com respeito a regular aatividade das células T γδ, refere-se à concentração eficiente das composiçõesdo assunto, que produzem 50% de sua máxima resposta ou efeito comrespeito a tal atividade de células T γδ.
O termo "isolado" refere-se a um composto ou produto querepresenta pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 50%, 60% ou70% e, muitíssimo preferivelmente, pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% docomposto presente na mistura.
Fosfoantígeno ou composição de fosfoantígeno purificadorefere-se a fosfoantígeno substancialmente puro, fosfoantígeno ou um seu salessencialmente puro, ou a fosfoantígeno ou um seu sal que é substancialmentelivre, essencialmente livre ou livre de outro composto.Fosfoantígeno ou composição de fosfoantígeno "parcialmentepurificada" refere-se a fosfoantígeno ou um seu sal que é menos do que 90% puro.
Nova classe de ativados de linfócito T γδ: angelil e tiglil fosfoésteres
A nova classe de compostos descrita pelos presentesinventores compreende angelil e tiglil fosfoéteres. Os inventores descobriramque os compostos desta classe apresentam significativa potência em relação aoutros compostos na modulação da atividade das células T γδ. Oreconhecimento dos compostos de angelil fosfoéster por seu alvo biológicopode envolver um processamento enzimático do composto. Esteprocessamento pensa-se basear-se em uma reação de ciclizaçãointramolecular concertada com a hidrólise do componente fosfato instável (ouliberação de energia). Os compostos de angelil fosfoéster do isômero Z sãopreditos favorecerem a ciclização intramolecular, em comparação com oisômero E do tiglil fosfoéster. Os compostos da classe de angelil fosfoésterpodem ter aumentada potência (p. ex., menos composto necessário, menosprobabilidade de toxicidade), ou estas composições podem fornecer distintaspropriedades farmacológicas, por exemplo, afinidade de ligação alvo,propriedades ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) emrelação aos ativadores anteriormente conhecidos das células T γδ. Em outrasformas de realização preferidas, são providos compostos específicos dainvenção que podem ter diferentes propriedades e podem ser usadosdependendo da aplicação procurada. Por exemplo, os compostos podemdiferir quanto à estabilidade in vivo, resultando, por exemplo, em diferentesmeias-vidas de circulação ou diferente ativação máxima das células T γδ.
A nova classe de ativadores de linfócito T γδ, de acordo com apresente invenção, compreende os compostos de Fórmula (I):
<formula>formula see original document page 15</formula>em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3;
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado;
A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2, ou qualquer outro grupoisostérico;
W é C-R6 ou N;
R7 é um grupo (Ci-C3)aquila ou qualquer outro grupoisostérico tal como CF3;
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)aquila ou qualquer outro grupo isostérico tal como CF3;
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci.C3)álcool, ou um(C2-C3)éster; e,
Y = CTCat+, um grupo Cl-C3 alquila, um grupo -Α-R, em queR é um grupo hidrocarboneto C1-C50 linear, ramificado ou cíclico, aromáticoou não, saturado ou insaturado, opcionalmente interrompido pelo menos porum heteroátomo, em que dito grupo hidrocarboneto compreende uma alquila,uma alquilenila ou uma alquinila, preferivelmente uma aquila ou umalquileno, que pode ser substituído por um ou diversos substituintesselecionados do grupo consistindo de: uma alquila, uma alquilenila, umaalquinila, um epoxialquila, uma arila, um heterociclo, uma alcóxi, uma acila,um álcool, um grupo carboxílico (-COOH), um éster, uma amina, um aminogrupo (-NH2), um amido (-CONH2), uma imina, uma nitrila, uma hidroxila (-OH), um grupo aldeído (-CHO), um halogênio, uma halogenoalquila, um tiol(-SH), uma tioalquila, uma sulfona, um sulfóxido, e uma combinação deles.
Um "grupo isostérico" refere-se a elementos, gruposfuncionais, substituintes, moléculas ou íons tendo diferentes fórmulasmoleculares, mas exibindo propriedades físicas similares ou idênticas. Porexemplo, CF3 é um grupo isostérico of CH3. Tipicamente, dois gruposisostéricos têm volumes e formatos similares ou idênticos.
Em um forma de realização particular, Y pode ser um radicalselecionado do grupo consistindo de um nucleosídeo, um nucleotídeo, umoligonucleotídeo, um ácido nucléico, um amino ácido, a peptídeo, umaproteína, um monossacarídeo, um oligossacarídeo, um polissacarídeo, umácido graxo, um lipídio simples, um lipídeo complexo, um ácido fólico, umácido tetraidrofólico, um ácido fosfórico, um inositol, uma vitamina, umacoenzima, um flavonóide, um aldeído, um epóxido e uma haloidrina.
Em uma forma de realização, o grupo R5 e o componente -CR3Rt-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (I) são na configuração Z (ou eis). Emoutra forma de realização, o grupo R5 e o componente -CR3RrA-[POOB]n,-POOY de Fórmula (I) são na configuração E (ou trans). Tanto quanto éobservado aqui (vide Exemplos) aquele ativador de células T γδ de fórmula(I), em que o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY são naconfiguração Z, tem atividade significativamente maior na ativação dascélulas T γδ do que do que na configuração E, a configuração Z sendopreferida.
Em um forma de realização particular, os substituintes comodefinidos acima são substituídos por pelo menos um dos substituintesespecificados acima.
Preferivelmente, os substituintes são selecionados do grupoconsistindo de: uma (Ci-C6)alquila, uma (C2- C6)alquilenila, uma (C2-C6)alquinila, uma (C2-C6)epoxialquila, uma arila, um heterociclo, um (Cl-C6)alcóxi, uma (C2-C6)acila, um (Ci-C6) álcool, um grupo carboxílico (-COOH),um (C2-C6)éster, uma (Ci-C6)amina, um amino grupo (-NH2), um amido (-CONH2), uma (Ci-C6)Imina, uma nitrila, uma hidroxila (-OH), um grupoaldeído (-CHO), um halogênio, uma (CrC6)halogenoalquila, um tiol (-SH),uma (Ci_C6)tioalquila, um (Cl-C6)sulfona, um (Ci.C6)sulfóxido, e umacombinação deles.Mais Preferivelmente, os substituintes são selecionados dogrupo consistindo de: uma (Ci-C6)alquila, uma (C2-C6)epoxialquila, uma (C2-C6)alquilenila, um (Ci-C6)alcóxi, uma (C2-C6)acila, uma (CiC6)álcool, um(C2-C6)éster, uma (CrC6) amina, uma (Ci_C6)imina, uma hidroxila, um grupoaldeído, um halogênio, uma (Cr C6)halogenoalquila, e uma combinaçãodeles.
Ainda mais preferivelmente, os substituintes são selecionadosdo grupo consistindo de: uma (C3-C6)epoxialquila, um (Ci-C3)alcóxi, uma(C2-C3)acila, um (CrC3)álcool, um (C2-C3)éster, uma (Ci-C3)amina, uma (CrC3)imina, uma hidroxila, um halogênio, uma (Ci-C3)halogenoalquila, e umacombinação deles.
Preferivelmente, dito grupo hidrocarboneto é um grupo (C3-C25)hidrocarboneto, mais preferivelmente um grupo (C5-Cio) hidrocarboneto.
No contexto da presente invenção, o termo "alquila" maisespecificamente significa um grupo tal como metila, etila, propila, isopropila,butila, isobutila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, undecila,dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecila, heptadecila,octadecila, nonadecila, eicosila, heneicosila, docosila e suas outras formasisoméricas. (Ci-C6)aquila mais especificamente significa metila, etila, propila,isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, hexila e suas outras formasisoméricas. (Ci-C3)aquila mais especificamente significa metila, etila, propila,ou isopropila.
O termo "alquenila" refere-se a um grupo alquila definido aquiantes, tendo pelo menos uma ligação etileno insaturada e o termo "alquinila"refere-se a um grupo alquila definido acima, tendo pelo menos uma ligaçãoacetileno insaturada. (C2-C6)alquileno inclui etenila, propenila (1-propenila ou2-propenila), 1- ou 2-metilpropenila, uma butenila (1-butenila, 2-butenila, ou3-butenila), uma metilbutenila, uma 2-etilpropenila, uma pentenila (1-pentenila, 2-pentenila, 3-pentenila, 4-pentenila), uma hexenila (1-hexenila, 2-hexenila, 3-hexenila, 4-hexenila, 5-hexenila), e suas outras formas isoméricas.(C2-C6)alquinila inclui etinila, 1-propinila, 2-propinila, 1-butinila, 2-butinila,3-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-pentinila, 4-pentinila, 1-hexinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4-hexinila, ou 5-hexinila e suas outras formas isoméricas.
O termo "epoxialquila" refere-se um grupo alquila definidoaqui antes tendo um grupo epóxido. Mais particularmente, (C2-C6)epoxiaquilainclui epoxietila, epoxipropila, epoxibutila, epoxipentila, epoxiexila e suasoutras formas isoméricas. (C2-C3)epoxiaquila inclui epoxietila e epoxipropila.
Os grupos "arila" são hidrocarbonetos aromáticos mono-, bi-ou tricíclicos, tendo de 6 a 18 átomos de carbono. Exemplos incluem umgrupo fenila, a-naftila, β-naftila ou antracenila, em particular.
Grupos "heterociclo" são grupos contendo 5 a 18 anéiscompreendendo um ou mais heteroátomos, preferivelmente 1 a 5heteroátomos endocíclicos. Eles podem ser mono, bi ou tricíclicos. Elespodem ser aromáticos ou não. Preferivelmente e mais especificamente paraR5, eles são heterociclos aromáticos. Exemplos de heterociclos aromáticosincluem grupos heterpiridina, piridazina, pirimidina, pirazina, furano, tiofeno,pirrol, oxazol, tiazol, isotiazol, imidazol, pirazol, oxadiazol, triazol, tiadiazol etriazina. Exemplos de biciclos incluem, em particular, grupos quinolina,isoquinolina e quinazolina (para dois anéis de 6-membros) e indol,benzimidazol, benzoxazol, benzotiazol e indazol (para um anel de 6 membrose um anel de 5 membros). Heterociclos não-aromáticos compreendem, emparticular, piperazina, piperidina, etc.
Os grupos "alcóxi" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, ligados à molécula por uma ligação -O- (éter). (Ci-C6)alcóxi incluimetóxi, etóxi, propilóxi, butilóxi, pentilóxi, hexilóxi e suas outras formasisoméricas. (Ci-C3)alcóxi inclui metóxi, etóxi, propilóxi, e isopropilóxi.
Os grupos "alcila" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, ligados à molécula por um grupo CO-(carbonila). (C2-C6)acilainclui cetila, propilacila, butilacila, pentilacila, hexilacila e suas outras formasisoméricas. (C2-C3)acila inclui cetila, propilacila e isopropilacila.
Os grupos "álcool" correspondem aos grupos alquila definidosacima, contendo pelo menos um grupo hidroxila. O álcool pode ser primário,secundário ou terciário. (Ci-C6)álcool inclui metanol, etanol, propanol,butanol, pentanol, hexanol e suas outras formas isoméricas. (Ci.C3)álcoolinclui metanol, etanol, propanol e isopropanol.
Os grupos "éster" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, ligados à molécula por uma ligação COO- (éster). (C2-Cg) ésterinclui metiléster, etiléster, propiléster, butiléster, pentiléster e suas outrasformas isoméricas. (C2-C3)éster inclui metiléster e etiléster.
Grupos "amina" correspondem aos grupos alquila definidosacima, ligados à molécula por uma ligação -N-(amina). (Ci_C6)amina incluimetilamina, etilamina, propilamina, butilamina, pentilamina, hexilamina esuas outras formas isoméricas. (Ci-C3)amina inclui metilamina, etilamina, epropilamina.
Grupos "imina" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, tendo uma ligação (-C=N-). (Ci-C6)imina inclui metilimina,etilimina, propilimina, butilimina, pentilimina, hexilimina e suas outrasformas isoméricas. (Ci-C3)Imina inclui metilimina, etilimina, e propilimina.
O halogênio pode ser Cl, Br, I, ou F, mais preferivelmente Br ou F.
Grupos "halogenoalquila" correspondem aos grupos alquiladefinidos aqui antes, tendo pelo menos um halogênio. Os grupos podem sermonoalogenados ou polialogenados, contendo os mesmos ou diferentesátomos de halogênio. Por exemplo, o grupo pode ser uma trifluoroalquila(CF3-R). (Ci-C6)halogenoalquila inclui halogenometila, halogenoetila,halogenopropila, halogenobutila, halogenopentila, halogenoexila e suas outrasformas isoméricas. (Ci-C3)halogenoaquila inclui halogenometila,halogenoetila, e halogenopropila.
Grupos "tioalquila" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, ligados à molécula por uma ligação -S- (tioéter). (Ci-C6)tioaquilainclui tiometila, tioetila, tiopropila, tiobutila, tiopentila, tioexila e suas outrasformas isoméricas. (Ci-C3)tioaquila inclui tiometila, tioetila, e tiopropila.
Grupos "sulfona" correspondem aos grupos alquila definidosaqui antes, ligados à molécula por uma ligação -SOO- (sulfona). (CrC6)sulfona inclui metilsulfona, etilsulfona, propilsulfona, butilsulfona,pentilsulfona, hexilsulfona e suas outras formas isoméricas. (Ci-Cs)Sulfonainclui metilsulfona, etilsulfona e propilsulfona.
Grupos "Sulfóxido" correspondem aos grupos alquiladefinidos aqui antes, ligados à molécula por uma ligação grupo -SO-(sulfóxido). (Ci_C6)sulfóxido inclui metilsulfóxido, etilsulfóxido,propilsulfóxido, butilsulfóxido, pentilsulfóxido, hexilsulfóxido e suas outrasformas isoméricas. (Ci-Cs)Sulfoxido inclui metilsulfóxido, etilsulfóxido,propilsulfóxido e isopropilsulfóxido.
"Heteroátomo" indica N, S, ou O.
"Nucleosídeo" inclui denosina, timina, uridina, citidina eguanosina.
Em um forma de realização particular, o grupo hidrocarbonetoé uma cicloalquilenila tal como um ciclopentadieno ou uma fenila, ou umheterociclo tal como um furano, um pirrol, um tiofeno, um tiazol, umimidazol, um triazol, uma piridina, uma pirimidina, um pirano, ou umapirazina. Preferivelmente, a cicloalquilenila ou o heterociclo é selecionado dogrupo consistindo de um ciclopentadieno, um pirrol ou um imidazol. Em umaforma de realização preferida, a cicloalquilenila ou o heterociclo é substituídopor um álcool. Preferivelmente, dito álcool é um (Ci-C3)álcool.
Em uma outra forma de realização, o grupo hidrocarboneto éuma alquilenila com uma ou diversas duplas ligações. Preferivelmente, ogrupo alquilenila tem uma dupla ligação. Preferivelmente, o grupo alquilenilaé um grupo (C3-Cio)alquilenila, mais preferivelmente um grupo (C4-C7)alquilenila. Preferivelmente, dito grupo alquilenila é substituído por pelomenos um grupo funcional. Mais preferivelmente, o grupo funcional éselecionado do grupo consistindo de um hidróxi, um (Ci-C3)alcóxi, umaldeído, uma (C2-C3)acila ou um (C2-C3)éster. Em uma forma de realizaçãomais preferida, o grupo hidrocarboneto é butenila substituída por um grupo -CH2OH. Opcionalmente, dito grupo alquenila pode ser a isoforma trans (E)ou eis (Z), mais preferivelmente uma isoforma trans (Z). Em um exemplo, ogrupo alquilenila é (E ou Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila. Em uma forma derealização particular, o composto é pirofosfonato de (E ou Z) 5-hidróxi-3-metilpent-3-enila ou pirofosforamidato de (E ou Z) 4-hidróxi-2-metil-but-2-enila.
Em uma forma de realização adicional, o grupo hidrocarbonetoé um grupo alquila substituído por uma acila. Mais preferivelmente, o grupohidrocarboneto é um grupo (C4-C7)alquila substituído por uma (Ci-C3)acila.
Em uma outra forma de realização preferida particular, R éselecionado do grupo consistindo de:
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que η é um inteiro de 2 a 20, R1 é um grupo (C1-C3) alquila, e R2 é uma(C1-C3) alquila halogenada, uma (Ci-C3)alcóxi-(Ci-C3)alquila, uma (CrC3)acila halogenada ou uma (Ci-C3)alcóxi-(C2-C3)acila. Preferivelmente, Ri éum grupo metila ou etila, e R2 é uma metila halogenada (-CH2-X, X sendo umhalogênio), uma (C2-C3)acetila halogenada ou (Ci-C3)alcóxi-acetila. A metilaou acetila halogenada pode ser mono, di ou tri-halogenada. Preferivelmente, ηé um inteiro de 2 a 10, ou de 2 a 5. Em uma forma de realização maispreferida, η é 2. Em uma forma de realização muitíssimo preferida, η é 2, Ri éuma metila e R2 é uma metila halogenada, mais preferivelmente uma metilamono-halogenada, ainda mais preferivelmente uma bromometila ouiodometila. Em uma forma de realização particularmente preferida, η é 2, Ri éuma metila, R2 é uma bromometila. Em uma forma de realização muitíssimopreferida, R é 3-(bromometil)-3-butanol-l-ila.
<formula>formula see original document page 23</formula>
em que η é um inteiro do 2 a 20, e Ri é um grupo metila ou etila.Preferivelmente, η é um inteiro do 2 a 10, ou de 2 a 5. Em uma mais preferidaforma de realização, η é 2 e R1 é uma metila.
<formula>formula see original document page 23</formula>
em que R3, R4, e R^, idênticos ou diferentes, são hidrogênio ouum (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupo isostérico, W' é CH ou N, e R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, uma (Ci-C3)álcool, ou um (C2- C3)éster. Maispreferivelmente, Re é uma metila e R3 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente,R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais preferivelmente, R5 é -CH2-OH. mais preferivelmente, W é CH. Opcionalmente, a dupla ligaçãoentre W e C é em conformação trans (E) ou eis (Z). Mais preferivelmente, adupla ligação entre W e C é em conformação trans (E).
O grupo Y pode permitir o projeto de um promedicamento.Portanto, Y é grupo enzimoinstável, que pode ser clivado em regiõesparticulares. O grupo Y pode também ser grupo de alvejamento. Em umaforma de realização preferida, Y é OCat+, um grupo -A-R ou um radicalselecionado do grupo consistindo de um nucleosídeo, um monossacarídeo, umepóxido e uma haloidrina. Preferivelmente, Y é um grupo enzimoinstável.Preferivelmente, Y é O-Cat+, um grupo —Α-R, ou um nucleosídeo. Em umaprimeira forma de realização preferida, Y é CXCat+. Em uma segunda formade realização preferida, Y é um nucleosídeo.
Em uma forma de realização preferida, Cat+ é H+, Na+, NH41",K+, Li+, (CH3CH2)SNH+, lisina ou qualquer outro cátion aceitávelfarmaceuticamente adequado.
Em uma forma de realização preferida, A é O, NH, CHF, CF2ou CH2. Preferivelmente, A é O, NH ou CH2. Mais preferivelmente, A é O, ouCH2. Ainda mais preferivelmente, A é O.
Em uma forma de realização preferida, B é O ou NH. Maispreferivelmente, B é O.
Em uma forma de realização preferida, m é 1 ou 2. Maispreferivelmente, m é 1.
Em uma forma de realização preferida, R3, R6 e R4 sãohidrogênio.
Em uma forma de realização preferida, R5 é -CH2-OH, -CHO,-CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais preferivelmente, R5 é -CH2-OH.
Em uma forma de realização preferida, R7 é CH3 ou um seugrupo isostérico, tal como CH2F, CF2H ou CF3. Mais preferivelmente, R7 éCH3.
Em um outro aspecto, dito ativador é um compostoselecionado do grupo consistindo de:
Um composto de Fórmula (II):
<formula>formula see original document page 24</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) um cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
<formula>formula see original document page 24</formula>m é um inteiro de 1 a 3;
B é O, NH5 ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado;
A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2, ou qualquer outro grupoisostérico;
R7 é um grupo (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupoisostérico tal como CF3;
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupo isostérico tal como CF3;
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci-C3)álcool, ou um(C2-C3)éster; e
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais preferivelmente, A é O.Mais preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente, R7 é CH3ou um seu grupo isostérico. Mais preferivelmente, R7 é CH3. Preferivelmente,R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais preferivelmente, R5 é -CH2-OH. Preferivelmente, Y é O-Cat+. Preferivelmente, m é 1.Preferivelmente, B é 0. Em uma forma de realização, o grupo R5 e ocomponente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (II) são na configuraçãoE (ou trans). Em uma forma de realização preferida, o grupo R5 e ocomponente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (II) são na configuraçãoZ (ou eis).
* Um composto de Fórmula (III):
<formula>formula see original document page 25</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro do 1 uma 3;B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz do ser hidrolisado;
A é O, NH, CHF3 CF2 ou CH2, ou qualquer outro grupoisostérico tal como CF3;
R7 é um grupo (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupoisostérico tal como CF3;
R3, e R4, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci.C3)alquila ou qualquer outro grupo isostérico tal como CF3;
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci-C3)álcool, ou um(C2-C3)éster; e
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais preferivelmente, A é O.
Mais preferivelmente, R3 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente, R5 é -CH2-OH5 -CHO, -CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais preferivelmente, R5 é -CH2-OH.
Preferivelmente, Y é O-Cat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O.
Preferivelmente, R7 é CH3 ou um seu grupo isostérico, tal como CH2F, CF2Hou CF3. Mais preferivelmente, R7 é CH3. Em uma forma de realização, ogrupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (m) são naconfiguração E (ou trans). Em uma forma de realização preferida, o grupo R5e o componente -CR3Rt-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (III) são naconfiguração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (IV):
<formula>formula see original document page 26</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,A é Ο, NH, CHF, CF2 ou CH2, e
W é C-R6 ou Ν;
R7 é um grupo (Ci.C3)alquila ou qualquer outro grupoisostérico tal como CF
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupo isostérico, e
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais preferivelmente, A é O.
Mais preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente, R7 é CH3ou um seu grupo isostérico. Mais preferivelmente, R7 é CH3. Preferivelmente,Y é O-Cat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O. Em uma formade realização, o grupo -CH2-OH e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOYde Fórmula (IV) são na configuração E (ou trans). Em uma forma derealização preferida, o grupo -CH2-OH e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (IV) são na configuração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (V):
<formula>formula see original document page 27</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2,
W é C-R6 ou N;
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são hidrogênio ou grupo(C1-C3)alquila ou um grupo isostérico,
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Cl-C3)álcool, ou um(C2-C3)éster, e
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais preferivelmente, A é O.Mais preferivelmente, R3, R^eR4 são hidrogênio. Preferivelmente, R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO-OCH3. Mais preferivelmente, R5 é -CH2-OH.Preferivelmente, Y é OCat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O.Em uma forma de realização, o composto de Fórmula (V) é na configuração E(ou trans). Em uma forma de realização preferida, o composto de Fórmula (V)é na configuração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (VI):
<formula>formula see original document page 28</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2; e
W é C-R6 ou N;
R3, R4, e Ré, idênticos ou diferentes, são hidrogênio ou grupo(C1-C3)alquila ou um grupo isostérico,
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, A é O ou CH2. Mais preferivelmente, A é O.
Mais preferivelmente, R3, R^ e R4 são hidrogênio. Preferivelmente, Y é O"Cat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O. Em uma forma derealização, o composto de Fórmula (VI) é na configuração E (ou trans). Emuma forma de realização preferida, o composto de Fórmula (VI) é naconfiguração Z (ou eis).* Um composto de Fórmula (VII):
<formula>formula see original document page 29</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
W é C-R6 ou N;
R7 é um grupo (Ci-C3)alquila ou um grupo isostérico tal como CF3,
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, sãó um hidrogênio ou um
(c1-C3)grupo alquila ou um grupo isostérico tal como CF3,
R8 é H ou F,
R9 é H ou F,
Y é definido como na Fórmula (I), e
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci-C3)álcool, ou um
(C2-C3)éster.
Preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente,R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO- OCH3, mais preferivelmente -CH2-OH. Preferivelmente, R7 é CH3 ou um seu grupo isostérico, maispreferivelmente CH3. Preferivelmente, Y é 0'Cat+. Preferivelmente, m é 1.
Preferivelmente, B é O. Preferivelmente, R8 e R9 são hidrogênio. Em umaforma de realização, o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOYde Fórmula (VII) são na configuração E (ou trans). Em uma forma derealização preferida, o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOYde Fórmula (VII) são na configuração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (VIII):<formula>formula see original document page 30</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
R7 é um grupo (Ci-C3)alquila ou um grupo isostérico tal comoCF3,
R3, R4, e Ri, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)alquila ou um grupo isostérico tal como CF3,
Y é definido como na Fórmula (I), e
R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci-C3)álcool, ou um(C2-C3)éster.
Preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente,R5 é -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3 ou -CO- OCH3, mais preferivelmente -CH2-OH. Preferivelmente, R7 é CH3 ou um seu grupo isostérico, maispreferivelmente CH3. Preferivelmente, Y é 0'Cat+. Preferivelmente, m é 1.Preferivelmente, B é O. Em uma forma de realização, o grupo R5 e ocomponente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (VIII) são naconfiguração E (ou trans). Em uma forma de realização preferida, o grupo R5e o componente -CRsRrA-ITOOB^-POOY de Fórmula (VIII) são naconfiguração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (IX):
<formula>formula see original document page 30</formula>em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
W é C-R6 ou N;
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são hidrogênio, umagrupo (C1-C3)alquila ou um grupo isostérico tal como CF3,
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente,Y é O-Cat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O. Em uma formade realização, o composto de Fórmula (EX) é na configuração E (ou trans).Em uma forma de realização preferida, o composto de Fórmula (IX) é naconfiguração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (X):
<formula>formula see original document page 31</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
W é C-R6 ou N; R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, sãohidrogênio, uma grupo (Ci-C3)alquila ou um grupo isostérico tal como CF3,
R8 é H ou F, R9 é H ou F, e Y é definido como na Fórmula (I).Preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente, Y é CTCat+.Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O. Preferivelmente, R8 e R9 sãohidrogênio. Em uma forma de realização, o composto de Fórmula (X) é naconfiguração E (ou trans). Em uma forma de realização preferida, o compostode Fórmula (X) é na configuração Z (ou eis).
* Um composto de Fórmula (XI):
<formula>formula see original document page 32</formula>
em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);
m é um inteiro de 1 a 3,
B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz de ser hidrolisado,
W é C-R6 ou N;
R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são hidrogênio, umgrupo(Ci-C3)alquila ou um grupo isostérico tal como CF3, e
Y é definido como na Fórmula (I).
Preferivelmente, R3, R6 e R4 são hidrogênio. Preferivelmente,Y é CTCat+. Preferivelmente, m é 1. Preferivelmente, B é O. Em uma formade realização, o composto de Fórmula (XI) é na configuração E (ou trans).
Em uma forma de realização preferida, o composto de Fórmula (XI) é naconfiguração Z (ou eis).
Em outras formas de realização, o ativador células T γδ é umcomposto de Fórmula (XII) ou (XII1):
<formula>formula see original document page 32</formula>
pirofosfato de (Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoHAngelilPP)
<formula>formula see original document page 32</formula>pirofosfato de (E)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoHTiglilPP)
Em outras formas de realização, o ativador células T γδ é umcomposto de Fórmula (XIII) ou (ΧΙΙΓ):
<formula>formula see original document page 33</formula>
pirofosfonato de (Z)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enila (também referido como C-HAngelilPP)
<formula>formula see original document page 33</formula>
pirofosfonato de (E)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enila (também referido como C-HTiglilPP)
Em outras formas de realização, o ativador das células T γδ éum composto de Fórmula (XIV) ou (XIV'):
<formula>formula see original document page 33</formula>
pirofosforamidato de(Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoN-HAngelilPP)
<formula>formula see original document page 33</formula>
pirofosforamidato de (E)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enila (também referido comoN-HTiglilPP)
Em outras formas de realização, o ativador células T γδ é umcomposto de Fórmula (XV):
<formula>formula see original document page 34</formula>
em que Cat+ e A são definidos como na Fórmula (I); X é H e Z é CH3(deoxiribonucleosídeo é timidina) ou X é OH e Z é H (ribonucleosídeo éuridina)
Em uma forma de realização, o composto de Fórmula (XV) éna configuração E (ou trans). Em uma forma de realização preferida, ocomposto de Fórmula (XV) é na configuração Z (ou eis).
Síntese
Como um princípio geral para métodos exemplificativos, umcomponente alquila é preparado em uma primeira etapa e acoplado a umcomponente contendo fósforo. Para fins de simplicidade, os seguintesesquemas são mostrados para compostos em que Y é O-Cat+. Se um diferentegrupo Y for desejado, este pode ser preparado em uma outra etapa como aquidescrito.
Dependendo do tipo e reatividade dos grupos funcionaisprovidos pelo componente alquila (representado por R no exame abaixo), umapessoa hábil na arte é capaz de adaptar os exemplos de síntese apresentadosaqui, se necessário incluindo as fases de proteção/desproteção dos gruposfuncionais sensíveis ou aqueles que podem interagir com a reação deacoplamento.
A etapa de acoplamento é geralmente a etapa crítica parasíntese e purificação. Numerosos exemplos para acoplamento são providoscomo segue, dependendo da identidade de uma posição A.Os monoésteres de fosfato de Fórmula I ou II, em que A é O eem que Y é O-Cat+, podem ser preparados usando-se uma etapa deacoplamento de acordo com as consições similares àquelas descritas emqualquer uma das publicações: Davisson et al. (1984) e Davisson et al. (1987)e US Patente No. 6.660.723 de Belmant et al., cujas descrições sãoincorporadas aqui por referência.
Os monoésteres de fosforamidato de Fórmula I ou II, em queA é NH e onde Y é O-Cat+, podem ser preparados usando-se uma etapa deacoplamento de acordo com condições similares àquelas descritas emqualquer uma das publicações: Cox et al. (2002) e Sato et al. (1990) e pedidosde patente PCT copendentes nos. PCT/IB2004/004311 e 60/579.237 deBelmant et al., cujas descrições são incorporadas aqui por referência.
Os monoésteres de fosfonato monoésters de Fórmula I ou II,em que A é CH2 e em que Y é O-Cat+, podem ser preparados usando-se umaetapa de acoplamento de acordo com condições similares àquelas descritasnas publicações: Valentijn (1991); Cox et al (2002), pedidos de patenteprovisória US 60/629.069, 60/564.959 de Tiollier, e publicação de patentePCT no. WO 03/050128, cujas descrições são incorporadas aqui porreferência.
Os monoésteres de difluoro e monofluorofosfonato de fórmulaI ou II, em que A é CF ou CF2 e onde Y é O-Cat+, podem ser preparadosutilizando-se uma etapa de acoplamento de acordo com condições similaresàquelas descritas nas publicações: Cox et al. (2002), Waschbusch et al. (1997)e Burton et al. (1989), cujas descrições são incorporadas aqui por referência.
Os fosfoésteres de angelil podem ser purificados por AHPLCde fase inversa preparativa em C18, de acordo com o método informado porZhang & Poulter (1993), por cromatografia preparativa sobre gel de sílicausando-se eluentes de isopropanol amoníaco, de acordo com os métodos dapublicação de Patente Internacional no. WO 03/050128, depositada em 5 dedezembro de 2002 para compostos tendo uma boa estabilidade química emmeio básico (fosfonato e angelil fosfoésteres), ou por cromatografia sobrecelulose Davisson et al. (1984). As descrições das referências acima sãoincorporadas aqui por referência.
Os compostos compreendendo um nucleosídeo como grupo Ypodem ser preparados, por exemplo, pelas seguintes reações,
<formula>formula see original document page 36</formula>
Reação Aou
<formula>formula see original document page 36</formula>
Reação B
onde -O-V for um bom grupo de partida, começando com V escolhido, porexemplo, dentre tosila, tosila, mesila, triflila, brosila ou bromo, PP representao grupo pirofosfato, PPP representa o grupo trifosfato, R-A- tem o significadoacima mencionado e Nucl é um nucleosídeo. Preferivelmente, Nucl-O-V éselecionado do grupo consistindo de: 5'-0-Tosiladenosina, 5'-O-Tosiluridina,5'-0-Tosilcitidina, 5'-0-Tosiltimidina ou 5'-0-Tosil-2'-deoxiadenosina.
Dependendo do tipo e reatividade dos grupos funcionaisprovidos por Υ, o profissional é capaz de adaptar os seguintes exemplos, senecessário incluindo as fases de proteção/não-proteção dos grupos funcionaissensíveis ou daqueles que podem interagir com a reação de acoplamento.
Por exemplo, para o composto com R como mostrado abaixo,o procedimento de reação pode ser o seguinte:
<formula>formula see original document page 36</formula>
onde PG representa um grupo de proteção da função álcool e onde -O-V é umbom grupo de partida, começando com V escolhido, por exemplo, dentretosila, mesila, triflila, brosila ou bromo, PP representa o grupo pirofosfato eNucl é um nucleosídeo. Preferivelmente, Nuel-O-V é selecionado do grupoconsistindo de: 5'-0-Tosiladenosina, 5'-0-Tosiluridina, 5'-0-Tosilcitidina, 5'-O-Tosiltimidina ou 5'-0-Tosil-2'-deoxiadenosina, como descrito em Davissonet al, (1987), cuja descrição é incorporada aqui por referência.
O pH neutro é uma reação de substituição nucleófila, que podeser realizada em condições similares às descritas por Davisson et al, (1987); eDavisson et al. (1986), cujas descrições são incorporadas aqui por referência.
Esta reação pode também ser usada para preparar o compostocompreendendo um monossacarídeo como grupo Y. Neste caso, Nucl-O-V ésubstituído por MonoSac-O-V, em que Monosac é monossacarídeo. Porexemplo, é possível utilizar-se o grupo MonoSac-O-Y correspondente aocomposto Metil-6-O-tosil-alfa-D-galactopiranosídeo, como descrito napublicação de Nilsson e Mosbach (1980), cuja descrição é incorporada aquipor referência, ou ao composto de triflato de manose, comercialmentedisponível.
Esta reação pode ser usada para preparar o compostocompreendendo um oligossacarídeo como grupo Y. Neste caso, Nucl-O-V ésubstituído por OligoSac-O-V, em que OligoSac é um oligossacarídeo. Porexemplo, é possível utilizar-se o grupo oligoSac-O-Y correspondente aocomposto 6A-0-p-Toluenossulfonil-P-ciclodextrina, como descrito napublicação (Organic syntheses, Vol. 77, ρ 225-228, cuja descrição éincorporada aqui por referência).
Esta reação pode ser usada para preparar um compostocompreendendo um polissacarídeo como grupo Y. Neste caso, Nucl-O-V ésubstituído por poliSac-O-V, em que poliSac é um polissacarídeo. Porexemplo, é possível utilizar-se o grupo poliSac-O-Y, correspondendo aopolissacarídeo tosilado, como descrito na publicação de Nilsson et al., (1981);e Nilsson e Mosbach, (1980), cujas descrições são incorporadas aqui porreferência. Esta técnica de acoplamento baseada na ativação dos gruposhidroxila de um suporte de polissacarídeo por tosilação permite oacoplamento covalente em um meio aquoso ou orgânico.
Esta reação pode também ser usada para preparar compostocompreendendo um derivado de aldeído como grupo Y, escolhendo-se, emvez de Nucl, um derivado incluindo uma função aldeído protegida na formade um grupo acetal ou qualquer outro protegendo esta função.
Alternativamente, os compostos compreendendo umnucleosídeo como grupo Y podem ser preparados pela seguinte reação:
<formula>formula see original document page 38</formula>
em que PPP representa o grupo trifosfato, A é O ou NH comR-AH representando um álcool primário (R-OH) ou uma amina primária (R-NH2), DMF é dimetilformamida e Nucl é um nucleosídeo. Esta reação podeser realizada em condições similares àquelas descritas por Knorre et al. (1976)ou por Bloom et al., Patente U.S. No. 5.639.653 (1997), cuja descrição éincorporada aqui por referência, de um álcool e um nucleosídeo com fórmulaNucl-O-PPP.
Por exemplo, para o composto com R como mostrado abaixo,o procedimento de reação pode ser o seguinte:
<formula>formula see original document page 38</formula>
em que PG representa um grupo de proteção da função álcool, UTP éTrifosfato de Uridina, PPP representa o grupo trifosfato, DMF édimetilformamida e Nucl é um nucleosídeo.
Esta reação pode também ser aplicada à preparaçãooligonucleotídeos 5'-trifosfato γ-ésteres, como indicado pelos autores dapublicação Knorre et ai. (1976).
Os compostos compreendendo um ácido nucléico como grupoY, mais particularmente um ácido ribonucléico, podem ser preparados emcondições similares àquelas descritas na publicação de F. Huang et ai. (1997).Os autores descrevem um método universal de RNA catalítico, que éaplicável a qualquer molécula compreendendo um grupo fosfato de terminallivre. Os compostos estruturalmente relacionados com o grupo fosfoaloidrina,tais como pirofosfato de isopentenila ou pirofosfato de tiamina, são usados oumencionados por estes autores (vide p. 8968 de F. Huang et al. (1997)). Devetambém ser citado que as condições experimentais para o procedimento deacoplamento (em particular condições de pH) descritas na seção "Reaction ofIsolate 6 pppRNA with phosphate containing Nucleophiles" são compatíveiscom a presença de uma função haloidrina.
Os compostos compreendendo um amino ácido, um peptídeoou um derivado de proteína como grupo Y podem ser obtidos utilizando-se abem conhecida reatividade de sua amina primária ou função tiol em umafunção epóxido (reação Sn2). Este tipo de acoplamento classicamente envolveum grupo intermediário ainda chamado "ligador" contendo uma funçãoepóxido. Um exemplo de um procedimento de reação empregando-se estetipo de acoplamento é provido pelo seguinte esquema,
<formula>formula see original document page 39</formula>
Reação Dem que PP representa o grupo pirofosfato, R-A tem osignificado acima mencionado e R'-SH é um amino ácido, um peptídeo ouum derivado de proteína. A primeira fase pode ser realizada em condiçõessimilares àquelas descritas por Davisson et al. (1987) e Davisson et al. (1986),cujas descrições são incorporadas aqui por referência, a partir do sal detetrabutilamônio do composto inicial e compostos comercialmentedisponíveis, tais como tosilato de glicidila ou epicloroidrina. Esta reação podetambém ser realizada com compostos de trifosfato. Alternativamente, umaamina primária R'-NH2 pode ser usada em vez de R'-SH. Sem a reação comR'-SH, a primeira reação pode ser usada para preparar compostocompreendendo um derivado de epóxido.
Alternativamente, os compostos compreendendo um aminoácido, um peptídeo ou um derivado de proteína como grupo Y podem serpreparados pela seguinte reação:
<formula>formula see original document page 40</formula>
Reação E
em que PPP representa o grupo trifosfato, PP representa o grupo pirofosfato,P representa o grupo fosfato, R-A tem o significado acima mencionado e R'-NH é um amino ácido, um peptídeo ou um derivado de proteína. A reaçãopode ser realizada em condições similares àquelas descritas por Knorre et al.(1976), cuja descrição é incorporada aqui por referência, do composto (R-A-PPP) e um amino ácido, peptídeo ou proteína com fórmula R-NH2. Estareação envolve a proteção das funções sensíveis do composto R-NH2 ou podereagir com a carbodiimida (em particular, a função carboxila).
Os sais de tri ou tetra-n-butilamônio do ácido fosfórico,pirofosfórico, trifosfórico, tetra-fosfórico ou polifosfórico podem serpreparados de ácidos correspondente comercialmente disponíveis. Osderivados com uma estrutura relacionada, tais como derivados do ácidometanotrifosfônico descritos na publicação de Liu et al. (1999), cuja descriçãoé incorporada aqui por referência, podem também ser preparados de acordocom o procedimento de reação.
As reações acima mencionadas podem ser extrapoladas em ummuito grande espectro de moléculas ou biomoléculas, utilizando-se areatividade das funções hidroxila, amina, fosfato ou tiol. Desse modo, osderivados de inositol podem ser preparados de acordo com as reações A ou B,pela ativação da função hidroxila. Os derivados do ácido fólico (vitamina B9)ou ácido tetraidrofólico podem ser preparados de acordo com as reações D ouE apelando para a reatividade da função amina primária.
Naturalmente, outros tipos de acoplamento podem serconsiderados e o profissional pode ter acesso a uma grande escolha dereações.
Esse modo, o acoplamento por fosforilação dos grupos ácidocarboxílico ou fenol pode ser usado para a formação do ácido graxo, lipídeoou certos derivados de flavonóide.
Avaliação da atividade dos compostos
Os fosfoésteres de angelil e tiglil podem ser produzidos exvivo ou in vitro. Eles podem ser purificados ou de outro modo artificialmenteproduzidos (p. ex., por síntese química ou por processo microbiológico). Osfosfoésteres de angelil de acordo com a presente invenção são preferivelmentecapazes de ativar os linfócitos T Vy9/VÔ2. Em uma forma de realizaçãopreferida, o composto é capaz de seletivamente ativar os linfócitos TVy9/VÔ2, indicando que o composto tem uma ação seletiva em relação apopulações de células específicas e essencialmente não ativa diretamenteoutros sub-títulos de célula T, tais como células T Vôl. Tal seletividade,como descrito no presente pedido, sugere que os compostos preferidos podemcausar uma ativação seletiva ou alvejada da proliferação ou atividadebiológica dos linfócitos de T Vy9/V52.Os fosfoésteres de angelil preferivelmente aumentam aatividade biológica ou provocam a proliferação das células T γδ,preferivelmente aumentando a ativação das células T γδ, particularmenteaumentando a secreção de citocina das células T γδ ou aumentando aatividade citolítica das células T γδ, estimulando ou não também aproliferação ou expansão das células T γδ. Portanto, os fosfoésteres de angelilou tiglil são administrados em uma quantidade e sob condições suficientespara aumentar a atividade das células T γδ em um indivíduo, preferivelmenteem uma quantidade e sob condições suficientes para aumentar a secreção dacitocina pelas células T γδ e/ou aumentar a atividade citolítica das células Tγδ. A secreção da citocina e a atividade citolítica, bem como a proliferaçãodas células T γδ podem ser avaliadas utilizando-se qualquer ensaio in vitroapropriado.
Muitíssimo preferivelmente, as células T γδ referidas nopresente relatório são células T WNbl e preferivelmente os angelil e tigilifosfoésteres regulam a atividade das células T Vy9/Vò2.
Em um exemplo, a ativação da células T γδ pode ser avaliadaadministrando-se um composto a um indivíduo (humano ou primata não-humano) e avaliando-se a ativação ou proliferação das células T νγ9/νδ2.Em uma expansão de protocolo exemplificativo de células T Vy9/V52 apopulação é avaliada: um angelil fosfoéster é administrado a um primata não-humano, tal como um macaco cynomolgus por infusão intravenosa (umaadministração por infusão lenta, 50 ml durante 30 minutos), em combinaçãocom IL-2 (0,9 milhão de unidades duas vezes diariamente por injeçãosubcutânea por 5 dias); linfócitos γδ periféricos são analisados por citometriade fluxo em sangue total de macaco, após duplo tingimento com anticorpoanti-CD3-PE e anticorpos anti-Vgama9-FITC e/ou anticorpos anti Vd2 e ascélulas são contadas por citometria de fluxo. Expansão pico da população decélulas T Υγ9/Υδ2 é observada entre os dias 3 e 8, geralmente em torno dosdias 4-6 após administração de um angelil fosfoéster.
Quaisquer outros testes adequados podem ser usados paraavaliar a proliferação celular. A avaliação da proliferação de linfócitosperiféricos γδ pode geralmente ser analisada por citometria de fluxo sobresangue total (por exemplo, sangue total obtido de um macaco), após duplotingimento com anticorpo anti-CD3-PE e anticorpos anti-Vgama9-FITC e/ouanticorpos anti Vd2 (CD3-PE: clone SP34, BD Biosciences Pharmingen, LePont de Claix, França). Anti Vgama 9, clone 7B6 é um monoclonalconstruído para Vgama 9 humano, que tem reação cruzada com as células demacaco cynomolgus. E purificado por cromatografia de afinidade em proteínaA e acoplado a FITC. 50 μΐ de sangue de macaco são incubados 15 min emRT com 5 μl de anti-CD3-PE e 6 μl de anti-delta2-FITC ou 10 μΐ deanticorpos anti-gama9-FITC. Os anticorpos são lavados com 3 ml IX PBS,centrifugados por 4 min em 1300 rpm em RT e o sobrenadante é descartado.Os glóbulos vermelhos são lisados com o reagente OptiLyse C(Mmmunotech-Beckman-Coulter, Marseilles, França) de acordo cominstruções do fabricante. Na etapa final, os glóbulos brancos tingidos sãorecuperados por centrifugação e ressuspensos em 300 μΐ PBS + 0,2% PFA.Imediatamente antes da análise, 50 μΐ de Flow Cont™ Fluorospheres(Immunotech-Beckman-Coulter, Marseilles, França) são adicionados àscélulas para contagem do número absoluto das populações de interesse.
Preferivelmente, um angelil fosfoéster é capaz de regular aatividade de uma célula T γδ em uma população de clones de células γδΤ emcultura. O angelil fosfoéster é mais preferivelmente capaz de regular aatividade de uma população de células T γδ de clones de células T γδ emcultura em concentração, preferivelmente quando o angelil fosfoéster estápresente em cultura em uma concentração de menos do que 100 mM. Em umexemplo, a produção ou liberação de citocina é avaliada. As Vg9Vd2 sãosabidos produtoras de TNFa e IFNy in vitro, na administração do angelilfosfoéster. Pouco após o tratamento com angelil fosfoéster, as amostras desoros são coletadas de um indivíduo e são avaliadas por ELISA específicopara TNFa ou IFNy.
A Regulação da atividade de uma célula Τγδ pode ser avaliadapor qualquer meio adequado, preferivelmente avaliando-se a secreção decitocina, muitíssimo preferivelmente a secreção de TNFot, como descritoaqui. Métodos para obter-se uma população de clones de células T γδ puros édescrito em Davodeau et al. (1993) e Moreau et ai. (1986), cuja descrição éincorporada aqui por referência.
Em um ensaio exemplar, a secreção da citocina pode serdeterminada de acordo com os métodos descritos em Espinosa et al. (2001a),descrevendo a medição da liberação de TNF-α em um bioensaio usando-secélulas sensíveis a TNFa. Resumidamente, 10 CÉLULAS γδΤ/poço foramincubadas com estímulo mais 25 unidades de IL2/poço em 100 μΐ de meio decultura durante 24 h a 37 0C. Em seguida, 50 μΐ de sobrenadante foramadicionados a 50 μΐ de células WEHI revestidas a 3 χ IO4 células/poço emmeio de cultura mais actinomicina D (2 μg/ml) e LiCl (40 mM) e incubadaspor 20 h a 37 0C. A viabilidade das células sensíveis a TNFa e medidas comum ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniltetrazólio. 50μl de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (Sigma; 2,5mg/ml em solução salina tamponada com fosfato) por poço foram adicionadose, após 4 h de incubação a 37 0C, 50 μΐ de tampão de solubilização (20%SDS, 66% dimetil formamida, pH 4,7) foram adicionados e a absorvência(570 nm) foi medida. Os níveis de liberação de TNFa foram então calculadospor uma curva padrão obtida usando-se rTNF-α humano purificado(PeproTech, Inc., Rocky Hill5 NJ). Interferon-γ liberado por células T ativadasfoi medido por um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima sanduíche. 5 χ104 células γδΤ/poço foram incubadas com estímulo mais 25 unidades deIL2/poço em 100 μΐ de meio de cultura durante 24 h a 37 0C. Em seguida, 50μl de sobrenadante foram colhidos para ensaio imunoabsorvente ligado porenzima, empregando-se anticorpos monoclonais de camundongo(BIOSOURCE, Camarillo, CA).
Um ensaio preferido para atividade citolítica é um ensaio deliberação 51Cr. Em ensaios exemplificativos, a atividade citolítica das célulasT γδ é medida em relação linhagens de células alvo normais e tumoraisautólogas, ou linhagens de células alvo sensíveis de controle, tais comolinhagem de células alvo resistentes Daudi e de controle, tais como ensaio deliberação Raji in 4h 51Cr. Em um exemplo específico, células alvo foramusadas em quantidades de 2x10 células/poço e rotuladas com 100 μΟΐ jlCrpor 60 minutos. A relação Efetor/Alvo (E/T) variou de 30:1 a 3,75:1. A Iiseespecífica (expressa como percentagem) é calculada usando-se a fórmulapadrão [(liberação experimental-espontânea / liberação total-espontânea) χ 100].
Uso de fosfoéster de acordo com a presente invenção
A invenção refere-se a uma composição farmacêuticacompreendendo um angelil ou tiglil fosfoéster, de acordo com a presenteinvenção. Mais particularmente, dita composição farmacêutica compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz de um angelil ou tiglil fosfoéster,opcionalmente junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. A presenteinvenção refere-se a um angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presenteinvenção como um medicamento. Também abrangido pela invenção é o usode um angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção, para amanufatura de uma preparação farmacêutica, preferivelmente para otratamento de um câncer, uma doença infecciosa uma doença autoimune ouuma doença alérgica.
Em um aspecto, a invenção descreve um método para regular aatividade das células T γδ em um indivíduo humano, dito métodocompreendendo a etapa de administrar, em pelo menos um tratamento, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um angelil ou tiglil fosfoéster deacordo com a presente invenção, opcionalmente junto com um veículofarmaceuticamente aceitável. Mais particularmente, dito método ativa ouestimula a atividade das células T γδ em um indivíduo humano.
Em uma forma de realização particular, a quantidade de ditoangelil ou tiglil fosfoéster é suficiente para expandir a população de células Tγδ em um indivíduo, para alcançar pelo menos 10%, 15%, 20%, 30%, 40%,50% ou 60%, ou entre 30 - 90% de linfócitos circulantes totais. Em outraforma de realização, a quantidade de dito angelil ou tiglil fosfoéster ésuficiente para induzir aumento de pelo menos 10 vezes na população decélulas T γδ de um indivíduo. Preferivelmente, dita população de células T γδé avaliada entre o dia 4 e dia 8 em seguida a administração de dito angelilfosfoéster, mais preferivelmente no dia 5, 5 ou 7 em seguida à administraçãode dito angelil fosfoéster. Preferivelmente, dita população de células T γδ éavaliada por citometria de fluxo. Preferivelmente, ditas células T γδ sãocélulas T νγ9/νδ2.
Em uma forma de realização preferida, a invenção refere-se aum método para tratar um câncer, uma doença infecciosa, uma doençaautoimune ou uma doença alérgica em um indivíduo, dito métodocompreendendo a etapa de administrar, em pelo menos um tratamento, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um angelil ou tiglil fosfoéster deacordo com a presente invenção, opcionalmente junto com um veículofarmaceuticamente aceitável.
Nos métodos e usos acima, o indivíduo é preferivelmente umindivíduo humano, tal como um indivíduo tendo um câncer, uma doençainfecciosa, uma doença autoimune ou uma doença alérgica. A invenção é, narealidade, adequada para tratar todas as condições causadas por ou associadascom a presença de células patológicas que são sensíveis a Iise de células T γδ.
A invenção é particularmente adequada para estimular aimunidade anti-tumor de um indivíduo tendo um tumor sólido ouhematopoiético. Preferivelmente, dito tumor é selecionado do grupoconsistindo de tumores do pulmão, colorretal, próstata, mama ou cabeçaepidermóide ou pescoço. Em um aspecto preferido da invenção, dito tumor éum câncer renal, preferivelmente um câncer renal metastático.Alternativamente, dito tumor é selecionado do grupo consistindo de ummelanoma, câncer ovariano, câncer de pâncreas, neuroblastoma, câncer decabeça ou pescoço, câncer de bexiga, câncer renal, câncer do cérebro e câncergástrico. Em formas de realização preferidas, os compostos podem ser usadospara o tratamento de câncer como descrito no Pedido de Patente InternacionalNo. WO 2004050096, cuja descrição é incorporada aqui por referência.
A invenção é também adequada para estimular uma respostaimune anti-viral em um indivíduo. Por exemplo, o composto da presenteinvenção pode ser usado para o tratamento de um indivíduo tendo umainfecção por um vírus selecionado de HIV, CMV, EBV, vírus influenza,HPV, HCV e HBV.
Os compostos da presente invenção são também adequados emmétodos de estimular uma resposta imune em um indivíduo tendo umainfecção por um patógeno causando tuberculose, malária, tularemia,colibacilose etc.
Os compostos da presente invenção são também adequados emmétodos de tratamento (p. ex., para estimular uma resposta imune em) umindivíduo tendo uma doença auto-imune, tal como diabetes, esclerosemúltipla, artrite reumatóide etc. ou um indivíduo tendo uma doença alérgica,incluindo asma, hiperresponsividade das vias aéreas etc. Em formas derealização preferidas, os compostos são usados em indicações terapêuticas ede acordo com os ensinamentos da Publicação de Patente Internacional No.WO 2000US0026684, depositado em 28 de setembro de 2000 por Gelfand,Born, Lahn e Kanehiro; Publicação de Patente International no. WO00/00182, depositada em 24 de junho de 1999 por Jomaa; e Publicação dePatente Internacional No. W02005/102385 by Tiollier, cuja descrição de cadauma das referências sendo incorporada aqui por referência.
Preferivelmente, a dosagem (administração única) de umcomposto de angelil fosfoéster de acordo com a presente invenção paratratamento é entre cerca de 1 μ§;1<£ e cerca de 1,2 g/kg.
Será observado que as dosagens acima, relacionadas com umgrupo de compostos, e que cada composto particular podem variar em dosesótimas, como mais descrito aqui para compostos exemplares. Contudo, oscompostos são preferivelmente administrados em uma dose suficiente parasignificativamente aumentar a atividade biológicas células T γδ ou parasignificativamente aumentar a população de células T γδ em um indivíduo.Dita dose é preferivelmente administrada ao humano por administraçãointravenosa (i.v.) durante 2 a 180 min, preferivelmente 2 a 120 min, maispreferivelmente durante cerca de 5 a cerca de 60 min ou, muitíssimopreferivelmente, durante cerca de 30 min ou durante cerca de 60 min.
Em compostos exemplares preferidos, um composto deFórmula I a XVIII é administrado em uma dosagem (administração única)entre cerca de 1 μg/kg e cerca de 1,2 g/kg, preferivelmente entre cerca de 10μg/kg e cerca de 1,2 g/kg, mais preferivelmente entre cerca de 20 μg/kg ecerca de 100 mg/kg. Muitíssimo preferivelmente, a dosagem (administraçãoúnica) para tratamento de três semanas ou quatro semanas (tratamento cadatrês semanas ou cada terceira semana) é entre cerca de 1 μg/kg e cerca de 1,2g/kg, preferivelmente entre cerca de 10 μg/kg e cerca de 20 mg/kg, maispreferivelmente entre cerca de 10 μg/kg e cerca de 100 mg/kg. Esta dose épreferivelmente administrada ao humano por administração intravenosa (i.v.)durante 2 a 180 min, preferivelmente 2 a 120 min, mais preferivelmentedurante cerca de 5 a cerca de 60 min, ou muitíssimo preferivelmente cerca demin ou durante cerca de 60 min.Os ingredientes ativos podem ser administrados através dediferentes vias, tipicamente por injeção ou administração oral. A injeção podeser realizada em vários tecidos, tais como por administração intravenosa,intraperitoneal, intra-arterial, intra-muscular, intra-dérmica, subcutânea etc.Vias de administração preferidas para os ativadores são intravenosa e intra-muscular. Vias de administração preferidas para a citocina são subcutânea,intravenosa e intra-muscular.
A invenção fornece um método de regular a atividade dascélulas T γδ em um indivíduo mamífero, o método compreendendoadministrar a um indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de umangelil ou tiglil fosfoéster de acordo com o ciclo de tratamento em que aatividade das células T γδ, preferivelmente a taxa de células T γδ (número decélulas T γδ) é permita retornar para taxa substancialmente basal antes de umasegunda administração do composto. Como ainda descrito aqui, em formas derealização preferidas, pelo menos cerca de uma semana, porém maispreferivelmente pelo menos cerca de duas semanas, são necessárias para ataxa de células T γδ do paciente retornar à taxa substancialmente basal.
Ciclos mais curtos do que cerca de 7 dias podem não permitirestímulo adequado da atividade das células T γδ. O curso de um ciclopreferido é um ciclo de pelo menos 1 semana, porém mais preferivelmentepelo menos um ciclo de 2-semanas (pelo menos cerca de 14 dias) ou, maispreferivelmente, pelo menos 3 semanas ou 4 semanas, embora ciclos emqualquer parte entre 2 semanas e 4 semanas sejam preferidos. Tambémeficazes e contemplados são ciclos de até 8 semanas, por exemplo, 5 semanas,6 semanas, 7 semanas ou 8 semanas.
Em uma forma de realização preferida, a administração doangelil ou tiglil fosfoéster ocorre no primeiro dias de um ciclo de 2 semanas a4 semanas (isto é, um ciclo de repetição de cerca de 14 a 28 dias). Em umaforma de realização preferida, o angelil fosfoéster é administrado somente noprimeiro dia do ciclo de 2 semanas a 4 semanas ou, preferivelmente, 3 semanas.
Como mencionado, um indivíduo preferivelmente será tratadopor pelo menos dois ciclos ou, mais preferivelmente, por pelo menos trêsciclos. Em outro aspecto, o tratamento pode continuar por um número maiorde ciclos, por exemplo, pelo menos 4, 5, 6 ou mais ciclos podem serconsiderados.
Opcionalmente, um angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com apresente invenção pode também ser usado em combinação com uma citocina,particularmente para o tratamento de câncer. Preferivelmente, dita citocina é ainterleucina 2 (IL-2) (Proleukin™, Chiron, Emeryville CA, USA) ou qualquerseu fragmento, variante ou seu análogo biologicamente ativo, isto é, qualquerfragmento, variante ou análogo capaz de ligar-se ao receptor IL-2 e de induzirativação de células T γδ no método desta invenção. Em outras formas derealização, a citocina é uma interleucina 7 ou uma interleucina 15.Preferivelmente, dito angelil ou tiglil fosfoéster e dito polipeptídeo deinterleucina são administrados separadamente ao indivíduo.
Portanto, os métodos da invenção compreendem administrarainda uma citocina, em um aspecto preferido uma citocina pode seradministrada, em que dita citocina é capaz de aumentar a expansão de umapopulação de células T γδ tratada com um composto de angelil ou tiglilfosfoéster, preferivelmente em que a citocina é capaz de induzir umaexpansão de uma população de células T γδ, que é maior do que a expansãoresultante da administração do composto de angelil ou tiglil fosfoéster naausência de dita citocina. Uma citocina preferida é um polipeptídeo deinterleucina-2.
Uma citocina tendo atividade indutora de proliferação decélulas T γδ, muitíssimo preferivelmente o polipeptídeo de interleucina-2, éadministrada em baixas doses, tipicamente durante um período de tempocompreendido entre 1 e 10 dias. O angelil fosfoéster é preferivelmenteadministrado em uma única dose e tipicamente no início de um ciclo.
Preferivelmente, o polipeptídeo de interleucina-2 é administrado em uma dosediária compreendida entre 0,2 e 2 MU por dia, mesmo mais preferivelmenteentre 0,2 e 1,5 MU, mais preferivelmente entre 0,2 e 1 MU. A dose diária decitocina, preferivelmente um polipeptídeo de interleucina-2, é administradacomo uma única injeção ou em duas injeções.
Em aspectos preferidos, uma citocina, muitíssimopreferivelmente IL-2, é administrada diariamente por até cerca de 10 dias,preferivelmente por um período entre cerca de 3 e 10 dias, ou muitíssimopreferivelmente por cerca de 7 dias. Preferivelmente, a administração dacitocina começa no mesmo dia (p. ex., dentro de 24 horas) comoadministração do ativador de células T γδ. Por exemplo, em um aspecto, acitocina é administrada cada dia, enquanto em outros aspectos a citocina nãoprecisa ser administrada cada dia. Quanto a citocina é administrada pro cercade 7 a cerca de 14 dias, um ciclo de tratamento de 4-semanas é preferido.
Quando o primeiro componente é administrado por cerca de 4 dias, um ciclode tratamento diário de 3 semanas é preferido. Em formas de realizaçãopreferidas, os compostos podem ser usados de acordo com qualquer um dosmétodos descritos no Pedido de Patente Internacional No. WO 2004050096,cuja descrição é incorporada aqui por referência.
Os métodos e tratamentos acima podem ser usados sozinhosou em combinação com outros agentes ou tratamentos ativos. Por exemplo,para o tratamento de tumores, a invenção pode ser usada cm combinação comoutros agentes ou tumores anti-tumor, tais como quimioterapia, radioterapiaou terapia genética.
A invenção também refere-se a um produto compreendendoum angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção e umpolipeptídeo de interleucina-2, para uso separado, para regular a atividade dascélulas T γδ em um indivíduo mamífero.
A invenção refere-se a uma composição vacinaicompreendendo um angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presenteinvenção. A invenção também refere-se ao uso de um angelil ou tiglilfosfoéster de acordo com a presente invenção, como um adjuvante de vacina.
Desta maneira, a presente invenção descreve métodos ecomposições para intensificar e/ou aumentar a resposta imune contra umantígeno em mamífero, notavelmente um humano, envolvendo a imunizaçãoconjunta do mamífero com (i) uma composição compreendendo um antígenoe (ii) um adjuvante compreendendo um composto de angelil ou tiglilfosfoéster de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, ditacomposição compreendendo um antígeno consiste de um patógeno,microorganismo ou parasita morto, inativado ou atenuado. Em outro aspecto,dita composição compreende um antígeno, preferivelmente compreende umpolipeptídeo, lipídeo, polissacarídeo, glicoproteína, glicolipídeo ou antígenode ácido nucléico enriquecido ou purificado. Preferivelmente, ditacomposição compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 antígenosdistintos, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 polipeptídeosdistintos ou ácidos nucléicos codificando tais polipeptídeos. Em formas derealização preferidas, os compostos podem ser usados como descrito noPedido de Patente Provisória U.S. No. 60/564.959, depositado em 26 de abrilde 2004, cuja descrição é incorporada aqui por referência.
A composição adjuvante compreenderá uma quantidade eficazde um composto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presenteinvenção, dita quantidade sendo uma quantidade eficaz permitindo a eliciaçãode uma resposta humoral, a eliciação de uma resposta de linfócito Tcitotóxido (CTL) ou eliciação de tanto uma resposta humoral como umaresposta CTL da composição adjuvante com respeito a pelo menos umantígeno. Preferivelmente, o composto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordocom a presente invenção está presente em uma quantidade eficaz paraproduzir um maior efeito imunológico na eliciação de uma resposta humoral,uma resposta de linfótico T citotóxico (CTL) ou tanto uma resposta humoralcomo uma resposta CTL, quando administrado conjuntamente com umantígeno que não aquele efeito imunológico produzido quando dito antígeno éadministrado na ausência do adjuvante.
O componente antigênico da composição pode ser selecionadode virtualmente qualquer antígeno, determinante antigênico ou hapteno deinteresse médico ou veterinário e, particularmente, para aqueles antígenospara os quais um aumento da imunogenicidade é desejado.
Portanto, a presente invenção diz respeito ao uso de umcomposto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção,mais preferivelmente dos compostos de Fórmulas I a XV, como um adjuvantede vacina. A presente invenção refere-se ainda a uma composição de vacinacompreendendo um antígeno ou uma combinação de antígenos e umcomposto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção,mais preferivelmente os compostos de Fórmulas I a XV. Preferivelmente, ditacomposição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de antígenoe uma resposta imune intensificando ou imune resposta aumentando aquantidade do angelil ou tiglil fosfoéster. Preferivelmente, dita composição devacina evita uma infecção microbiana. Dita infecção microbiana é causadapor um micróbio selecionado do grupo consistindo de vírus, fungos, parasitas,levedura, bactérias e protozoários. Em uma forma de realização particular,dita composição de vacina é composição de vacina BCG. Alternativamente,dita composição de vacina evita ou é um tratamento contra um tumor.
A presente invenção refere-se ainda a um kit de vacinacompreendendo um recipiente adequado, contendo uma composição devacina de acordo com a presente invenção, mais particularmentecompreendendo um antígeno ou uma combinação de antígeno e um compostode angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção, maispreferivelmente os compostos de Fórmulas I a XV. Opcionalmente, ditavacina pode compreender dois recipientes adequados separados, um contendoo antígeno ou a combinação de antígenos e o outro contendo um composto deangelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção, maispreferivelmente os compostos de Fórmula I a XV. Opcionalmente, ditorecipiente pode ser uma seringa. Alternativamente, dito kit de vacinacompreende um ou dois recipientes e uma seringa.
A presente invenção diz respeito a um método de melhorar apotência de uma vacina em um indivíduo ou de imunizar um indivíduo contrauma doença, mais particularmente uma infecção microbiana, compreendendoas etapas de:
administrar a dito indivíduo uma composição compreendendoum antígeno ou uma combinação de antígenos; e
conjuntamente, administrar a dito indivíduo um composto deangelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção, maispreferivelmente os compostos de Fórmulas I a XV, mais particularmenteuma sua quantidade intensificadora da resposta imune. Preferivelmente, ocomposto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção,quando administrado conjuntamente com uma composição compreendendoum antígeno, é administrado em uma quantidade suficiente para aumentaruma resposta imune em relação àquela observada com dita composiçãocompreendendo um antígeno, na ausência do angelil fosfoéster.
Preferivelmente, dita composição compreendendo um antígenocompreende um patógeno, microorganismo ou parasita morto, inativado ouatenuado. Em outro aspecto, dita composição compreendendo um antígenopreferivelmente compreende' um polipeptídeo, lipídeo, polissacarídeo,glicoproteína, glicolipídeo ou antígeno de ácido nucléico enriquecido oupurificado.A presente invenção também refere-se a um método deimunizar um indivíduo contra uma doença, mais particularmente umainfecção microbiana em um indivíduo, compreendendo administrar a ditoindivíduo (i) uma composição compreendendo um antígeno e (ii) umcomposto de angelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção,mais preferivelmente Fórmulas I a XV. Preferivelmente, o composto deangelil ou tiglil fosfoéster de acordo com a presente invenção é administradoem uma quantidade intensificadora da imune resposta. Preferivelmente, oangelil ou tiglil fosfoéster e a composição compreendendo um antígeno sãoadministrados como uma composição de vacina única em uma quantidadeterapeuticamente eficaz.
Preferivelmente, dito angelil ou tiglil fosfoéster é providoou administrado junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Emum primeiro aspecto, dita administração de dito antígeno ou combinaçãode antígenos e dito angelil ou tiglil fosfoéster são simultâneas. Em umsegundo aspecto, ditas administrações de dito antígeno ou combinação deantígenos e dito angelil ou tiglil fosfoéster são administradasseqüencialmente. Mais particularmente, dito angelil ou tiglil fosfoésterpode ser administrado antes de, concomitantemente com ou subseqüente àadministração de um antígeno ou uma combinação de antígenos a umindivíduo para fins de imunização. Preferivelmente, dito antígeno oucombinação de antígenos são antígenos microbianos, preferivelmenteantígenos virais, bacterianos, fúngicos, protozoários, de levedura ouparasita. Em uma forma de realização preferida, dito antígeno é umantígeno de Mycobacterium bovis. Opcionalmente, dito antígeno oucombinação de antígenos é um antígeno tumoral.
Outros aspectos e vantagens desta invenção serão descritos nosseguintes exemplos, que devem ser considerados como ilustrativos e nãolimitadores do escopo deste pedido.EXEMPLOS
Exemplo 1
Síntese de (E)-4-hidróxi-2-metil-but-2-enil pirofosfato
(Hidroxitiglil pirofosfato ou HTiglilIPP
A síntese de HTiglilPP foi realizada de acordo com o esquemaapresentado na Figura 1, partindo de 2-metil-2-viniloxirano.
Preparação de (E)-cloro-2-metilbut-2-en-l-ol:
16 ml (179 mmol) de T1CI4 foram adicionados sobnitrogênio a 360 ml de CH2CI2. A solução foi esfriada a 90 0C e umasolução de 10,0 g (119 mmol) de 2-metiI-2-viniloxirano em 50 ml deCH2CI2 foi adicionada em gotas, mantendo-se a temperatura abaixo de -80 0C. A solução vermelha foi então agitada a 80 0C por 2 horas e extintacom 600 ml de HCl 1M. A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foiextraída com 3 χ 500 ml de Et2O. As fases orgânicas combinadas foramsecadas sobre MgS04, filtradas e evaporadas a 350 mbar a 25 0C parafornecer 12,02 g (99,7 mmol, 84% de produção) de 4-cloro-2-metilbut-2-en-l-ol como um óleo amarronzado. O produto bruto foi diretamenteusado na etapa seguinte.
Preparação de (E)-2-(4-cloro-2-metilbut-2-en ilóxi)tetraídro-2H-pirano:
Em uma solução de 11,5 g (95,37 mmol) de 4-cloro-2-metilbut-2-en-l-ol em 120 ml de CH2Cl2 foram adicionados 26 ml (286,11mmol) de diidropirano (DHP). A solução foi esfriada a 0 0C e 2,4 g (9,53mmol) de sulfonato de piridínio p-tolueno (PPTS) foram adicionados emporções. A solução foi agitada por 3 horas a 0 0C. A fase orgânica foi lavadacom 3 χ 50 ml de água, secada sobre Na2SO^ filtrada e concentrada parafornecer o produto bruto. O produto bruto foi então purificado porcromatografia sobre gel de sílica, usando-se heptano/EtOAc (9/1) comoeluente. 12,35 g (60,33 mmol, produção 64%) do álcool alílico protegidoforam isolados como óleo incolor.Preparação de acetato de (E)-3-metil-4-(tetraídro-2H-piran-2-ilóxl)but-2-enila:
Em uma solução de I5Og (5 mmol) do álcool alílico protegido(E)-2-(4-cloro-2-metilbut-2-en-iIóxi)tetraídro-2H-pirano em 30 ml deDMF foram adicionados 820 mg (10 mmol) de acetato de sódio, seguido poruma quantidade catalítica de NaI (20 mg). A mistura de reação foi aquecida a80°C por 6 horas. A mistura de reação foi esfriada e vertida sobre 200 ml deágua. A solução foi extraída com 3 χ 50 ml de EtOAc. As fases orgânicascombinadas foram secadas sobre Na2SO4, filtradas e concentradas parafornecer o produto bruto. Este produto foi então purificado por cromatografiasobre gel de sílica empregando-se Heptano/EtOAc (8/2) como eluente. 463mg (2,03 mmol, 40%) de acetato de (E)-3-metil-4-(tetraídro-2H-piran-2-ilóxi)but-2-enila foram isolados como óleo incolor.
Preparação de acetato de (E)-4-bromo-3 -metilbut-2-enila
Em uma solução de 460 mg (2,0 mmol) de (E)-3-metil-4-(tetraídro-2H-pirano-2-ilóxi-but-2enil acetato em 20 ml de CH2Cl2 foiadicionada uma solução de 1,33 g (4 mmol) de CBr4 em 10 ml de CH2Cl2- Asolução foi esfriada a 0 0C e uma solução de 1,05 g (4 mmol) de trifenilfosfinafoi adicionada em gotas. A solução foi permitida aquecer à temperaturaambiente por 6 horas e agitada na mesma temperatura por mais 1 hora. Oprecipitado foi filtrado e o filtrado foi evaporado. O resíduo foi purificado porcromatografia sobre gel de sílica empregando-se Heptano /EtOAc (8/2) comoeluente. 314 mg (1,52 mmol, 76%) de (E)-4-bromo-3-metilbut-2-enilacetato foram isolados como óleo incolor.
Preparação de (E)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enil pirofosfato
Uma solução de 900 mg (4.35 mmol) of (E)-4-bromo-3-metilbut-2-enil acetato in 10 ml of CH3CN foi adicionada em gotas a umasolução de 5,9 g (6,52 mmol) de TTAPP em 15 ml de CH3CN. A mistura dereação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e o solvente foievaporado. O resíduo foi então passado através de coluna de resina Dowex50WX8 (forma NH/) e eluída com 2 volumes de 40 mM de solução aquosade NH4HCO3. A fração foi evaporada sob elevado vácuo a 40 - 45 0C. Oresíduo foi agitado com 4 - 5 ml de ÍP1OH/NH4OH 28% (1/1) e o sólidoinsolúvel foi filtrado. O filtrado foi cromatografado sobre gel de sílicausando-se iPrOH/N^OH 28% 1/1 como eluente. 197 mg (0,752 mmol, 17%)de (E)-hidróxi-2-metilbut-2-enil pirofosfato, sal de amônio foram isoladoscomo um sólido branco. Sob estas condições, a desproteção do componenteacetato (grupo de proteção álcool) ocorreu enquanto cromatografia sobre gelde sílica. A relação isomérica (E:Z) do produto purificado foi de 96:4 combase em análise de Cromatografia Iônica (HPAEC).
Cada estereoisômero E e Z de 4-hidróxi-2-metilbut-2-enilpirofosfato foi obtido como um composto puro por purificaçãocromatográfica (HPAEC) através de coluna IonPac® ASl 1, com múltiplaspassagens cromatográficas sendo combinadas.
Para fins de realizar o teste biológico, soluções aquosasneutras do produto foram esterilizadas por filtragem através de filtro de 0,2μm e armazenadas a -20 0C. No caso do teste realizado in vivo, as soluçõessão passadas antecipadamente através de uma coluna de resina catiônicaDOWEX 50WX8-200 (forma Na+) eluída por dois volumes de coluna de águadeionizada.
Exemplo 2
Síntese de (Z)-4-hidróxi-2-metil-but-2-enil pirofosfato(Hidroxiangelil pirofosfato ou HAngelilPP)
A síntese de (Z)-4-hidróxi-2-metilbut-2-enil pirofosfato(HAngelilPP) é realizada de acordo com o esquema ilustrado na Figura 2,partindo-se de álcool de propargila protegido-TBDMS. Para cada etapa desteesquema sintético, as seguintes referências podem ser usadas para mais orientação:Etapa a (formação de propargil éster de cloroformiato demetila): Andrew T. Koppisch et al, Organic Letters, Vol. 2 No. 2 (2000)p215-217; Michael S. Leonard e al, J. Org. Chem. (2004), 69, 2526- 2531;
Etapa b (adição estereossletiva conjugada de reagente dedimetilcobre-lítio em éster α,β acetilênico): E. J. Corey e John A.Katzenellenbogen, J. Am. Chem. Soe. (1969), 91, 1851-1852; Andrew T.Koppissch et al, Organic Letters, Vol. 2 No. 2 (2000) p215-217; Michael S.Leonard e al, J. Org. Chem. (2004), 69, 2526-2531;
Etapa c (redução de éster com hidreto de DIBAL): Andrew T.Koppisch et al, Organic Letters, Vol. 2 No. 2 (2000) p215-217; Michael S.Leonard et al, J. Org. Chem. (2004), 69, 2526-2531;
Etapa d: o álcool alílico é convertido em uma formaprotegida-THP por reação com diidropirano (DHP), em seguida aoprocedimento informado no exemplo 1 ou como descrito por Miyashita et al(Miyashita et al, J. Org. Chem. 42 (1977) 3772-3774);
Etapa e: (clivagem não acídica do grupo de proteção t-butildimetilsilila): E. J. Corey e A. Venkateswarlu, J. Am. Chem. Soe. (1972),94, 6190; condições alternativas para esta reação de desproteção podetambém ser encontrada em "Protective Grups in Organic Synthesis", TerceiraEdição, Theodora W. Greeno e Peter G. M. Wuts, publicado por John Wiley& Sons, Inc. (1999);
Etapa f (etapa de cloração): em um procedimento padrão,trietilamina é adicionada a uma solução do álcool alílico em CH2Cl2 a 25 0C.A resultante mistura de reação transparente é então tratada pela adição emgotas de cloreto de mesila durante 20 min. Após adição completa, a misturade reação é agitada em temperatura ambiente por pelo menos 1,5 h atécompleta conversão. A mistura de reação é lavada sucessivamente comsolução de NaHC03 aquosa saturada, HCl aquoso 0,1 M e água deionizada,em seguida concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto é purificadopor cromatografia utilizando-se SiO2 e um solvente de eluição de acetato deetila: heptano = 1:9;
Etapa g: a pirofosforilação do cloreto de angelil protegido-THP com difosfato hidrogenado de tris tetra-n-butilamônio (TTAPP) éconseguida observando-se o procedimento geral relatado por Poulter e co-trabalhadores (David T. Fox e C. Dale Poulter, J. Org. Chem.(2002), 67,5009-5010; Davisson V. J. et al., J. Org. Chem., 1986, 51, ρ 4768-4779. Adesproteção do grupo tetraidropiranila é conseguida por tratamento do ésterde pirofosfato com resina de troca de cátion DOWEX 50WX8 (forma H+) esubseqüente neutralização da solução ácida resultante com hidróxido deamônio.
Para a finalidade de realizar o teste biológico, soluçõesaquosas neutras do produto são esterilizadas por filtragem através de filtro de0,2 μιη e armazenadas a -20 0C. No caso de teste realizado in vivo, assoluções são passadas antecipadamente através de uma coluna de resinacatiônica DOWEX 50WX8-200 (forma Na+) eluída por dois volumes decoluna de água deionizada.
Exemplo 3
Síntese de (Z)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enil pirofosfonato(Hidroxiangelil pirofosfonato ou C-HAngelilPP)
A síntese de (Z)-5-hidróxi-3-metilpent-3-enil pirofosfonato (C-HAngelilPP) é realizada de acordo com o esquema ilustrado na Figura 2 pelointermediário de clorometilbutenila protegido-THP (produto da etapa f), cujapreparação é descrita no exemplo 1.
As reações químicas da etapa h e etapa i, envolvendo oacoplamento do componente pirofosfonato, são realizadas seguindo-se oprocedimento de Valentijn et al para a preparação de análogos de FarnesilPirofosfato (Valentijn et al, Synlett (1991) 663-664):
Etapa i: O agente fosfonilante (metilfosfonomorfolidato deResposta de dosagem para compostos de HAngelilPP e HtiglilPPEnsaio de liberação de citocina
Células (células T Υγ9/Υδ2 humanas policlonais primárias,que foram expandidas in vitro e armazenadas congeladas no dia 12-15 deexpansão) são descongeladas e enxaguadas duas vezes e centrifugadas. Naeliminação do sobrenadante e ressuspensão das células, as células sãoincubadas por 24 h a 37 0C, na presença de IL2 100 IU/ml (concentraçãofinal). As células são lavadas e centrifugadas, em seguida ao que osobrenadante é eliminado e as células são ressuspensas e ajustadas àconcentração final adequada. As células são adicionadas aos poços de umaplaca de 96-poços.
Em uma fileira de poços é adicionada uma série de diluiçãopadrão de (R,S)-3-(bromometil)-3-butanol-l-il-difosfato (RjS-BrHPP). Oscompostos a serem testados, neste caso (E)-4-hidróxi-3-metil-2-butenilpirofosfato ((E)-HDMAPP) e os compostos de HAngelilPP e HTiglilPP dasérie de Angelil/Tiglil fosfoéster, são adicionados em poços experimentais,após diversas diluições.
Placas cheias são incubadas 24 h a 37 0C para estímulo dascélulas γδΤ com o composto de teste e compostos de referência, neste casoHAngelilPP e HTiglilPP, (RjS)-BrHPP e (E)-HDMAPP, como descritoabaixo. Após este tempo, 100 μΐ de sobrenadante de cultura são retirados paradosagem de TNFa. A medição da dosagem de TNFa liberada é realizadacomo descrito pela instrução dos fabricantes no kit de imunoensaio de enzimaTNFa (ref. 11121, Immunotech - Beckman Coulter). OD a 405 nm é lido, ODsendo proporcional à concentração de TNFa liberado no sobrenadante decultura. Os dados são processados com o software Excel, para comparar aconcentração do composto de teste versus concentração de TNFa e para ocálculo da EC50 para cada composto de teste.Bioatividade in vitro de HAngelilPP
A bioatividade do composto HAngelilPP foi avaliada usando-se um ensaio de liberação de TNFa, como descrito acima. A atividade in vitroé mostrada na Figura 3. Os compostos (R5S)-BrHPP e (E)-HDMAPP foramincluídos para fins de comparação. A EC50 in vitro foi então avaliada nesteteste de rastreamento, em que os ensaios anteriores com células calibradasempregando-se uma composição padrão de (R,S)-BrHPP apresentaram umaEC50 de cerca de 15 nM para o composto de referência (R5S)-BrHPP. Comoserá observado, quaisquer outros ensaios adequados, tais como ampliação decélula, podemser usados na avaliação dos compostos. A EC50 in vitro paraHAngelilPP (isômero Z) foi determinada como sendo de 0,85 nM e paraHTiglilPP (isômero E) foi de 15 nM, enquanto a EC50 in vitro para (E)-HDMAPP foi de 2,1 nM e a EC50 in vitro para (R5S)-BrHPP foi de 37,7 nM.Uma vez que o ensaio fornece um resultado relativo em vez de um valorEC50 absoluto, os resultados indicam que ambos os compostos H-AngelilPPe HTiglilPP são altamente potentes e que o isômero Z (H-AngelilPP) é ocomposto mais potente daqueles testados.
REFERÊNCIAS
Todas as referências citadas são incorporadas aqui porreferência.
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Claims (30)

1. Ativador de células T γδ, caracterizado pela fórmula (I):<formula>formula see original document page 70</formula>em que Cat+ representa um (ou diversos, idênticos ou diferentes) cátion(s)orgânico(s) ou mineral(ais) (incluindo próton);m é um inteiro de 1 a 3;B é O, NH, ou qualquer outro grupo capaz do ser hidrolisado;A é O, NH, CHF, CF2 ou CH2, ou qualquer outro grupoisostérico;W é C-R6 ou N;R7 é um grupo (Ci-C3)alquila ou um grupo (Ci-C3)alquila ouqualquer outro grupo isostérico tal como CF3;R3, R4, e R6, idênticos ou diferentes, são um hidrogênio ou umgrupo (Ci-C3)alquila ou qualquer outro grupo isostérico tal como CF3;R5 é uma (C2-C3)acila, um aldeído, um (Ci-C3)álcool, ou um(C2-C3)éster; eY = O-Cat+, um grupo Ci-C3alquila, um grupo -Α-R, em queR é um grupo hidrocarboneto C1-C50, linear, ramificado ou cíclico, aromáticoou não, saturado ou insaturado, opcionalmente interrompido pelo menos porum heteroátomo, em que dito grupo hidrocarboneto compreende uma alquila,uma alquilenila, ou uma alquinila, preferivelmente uma aquila ou umaalquileno, que pode ser substituído por um ou diversos substituintesselecionados do grupo consistindo de: uma alquila, uma alquilenila, umaalquinila, uma epoxialquila, uma arila, um heterociclo, um alcóxi, uma acila,um álcool, um grupo carboxílico (-COOH), um éster, uma amina, um aminogrupo (-NH2), um amido (-CONH2), uma imina, uma nitrila, uma hidroxila (-OH), um grupo (-CH0), um halogênio, uma halogenoalquila, um tiol (-SH),uma tioalquila, uma sulfona, um sulfóxido, e uma combinação deles;e em que o grupo R5 e o componente -CR3R4-A-[POOB]m-POOY de Fórmula (II) são na configuração Z (ou eis).
2. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de fórmula (II): <formula>formula see original document page 71</formula> em que Cat+, m, B, A, R5, R3, R4, R6, R7, e Y têm o mesmo significado que nareivindicação 1.
3. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de Fórmula (III): <formula>formula see original document page 71</formula> em que Cat+, m, B, A, R5, R3, R4, R7, e Y têm o mesmo significado que nareivindicação 1.
4. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de Fórmula (V): <formula>formula see original document page 71</formula> em que Cat+, m, B, A, W, R5, R3, R4, R6, e Y têm o mesmo significado que nareivindicação 1.
5. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de Fórmula (IV):<formula>formula see original document page 72</formula>em que Cat+, m, B, A, W, R5, R3, R4, R6, R7, e Y têm o mesmo significadoque na reivindicação 1.
6. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de Fórmula (VI):<formula>formula see original document page 72</formula>em que Cat+, m, B, A, W, R3, R4, R6, e Y têm o mesmo significado que nareivindicação 1.
7. Ativador de células T γδ de acordo qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de R5 ser -CH2-OH, -CHO, -CO-CH3Ou-CO-OCH3.
8. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de R5 ser -CH2-OH.
9. Ativador de células T γδ de acordo qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, 7 e 8, caracterizado pelo fato de R7 ser CH3 ou um seugrupo isostérico, tal como CH2F, CF2H ou CF3.
10. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de R7 ser CH3.
11. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de A ser O.
12. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de A ser NH.
13. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de A ser CHF5 CF2 ou CH2.
14. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de B ser O.
15. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de m ser 1.
16. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de Y ser O-Cat+ ou umnucleosídeo, preferivelmente CTCat+.
17. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto de fórmula (XII): <formula>formula see original document page 73</formula>
18. Ativador de células T γδ de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de ser um composto de fórmula (XIII) <formula>formula see original document page 73</formula>
19. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5, caracterizado pelo fato de dito ativador ser um composto deFórmula (XIV): <formula>formula see original document page 73</formula>
20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um ativador de células T γδ como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 19.
21. Ativador de células T γδ de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser um medicamento.
22. Uso de um ativador de células T γδ como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para amanufatura de uma composição farmacêutica para regular as células T γδ emum indivíduo humano.
23. Uso de um ativador de células T γδ como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para amanufatura de uma composição farmacêutica para tratar um indivíduosofrendo de ou susceptível de sofrer de um câncer, uma doença infecciosa,uma doença autoimune ou uma doença alérgica.
24. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de dito câncer ser um tumor sólido.
25. Uso de um ativador de células T γδ como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser comoum adjuvante de vacina.
26. Composição de vacina, caracterizada pelo fato decompreender um ativador de células T γδ como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 19, como um adjuvante de vacina.
27. Método de ativação de uma célula T γδ, caracterizado pelofato de compreender trazer uma célula T γδ em contato com um ativador decélulas T γδ como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de as células T γδ serem trazidas em contato com dito ativador decélulas T γδ in vitro.
29. Célula T γδ, caracterizada pelo fato de ser ativada deacordo com o método como definido nas reivindicações 27 ou 28.
30. Uso de uma célula T γδ como definida na reivindicação 29,caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma composiçãofarmacêutica.
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