BRPI0608796A2

BRPI0608796A2 - composições de bacuquiol e métodos para a preparação das mesmas

Info

Publication number: BRPI0608796A2
Application number: BRPI0608796-5A
Authority: BR
Inventors: Qi Jia; Mei-Feng Hong
Original assignee: Unigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2010-01-26
Also published as: KR20160055972A; KR101431060B1; CN101217968B; WO2006122160A3; JP2008540551A; KR101802415B1; EP1881839A4; EP1881839A2; JP5443754B2; KR20130125411A; KR20080016609A; US20160022602A1; WO2006122160A2; US20210154155A1; BRPI0608796B8; CN101217968A; BRPI0608796B1; HK1120743A1; US20110223267A1; US20060251749A1

Abstract

COMPOSIçõES DE BACUQUIOL E MéTODOS PARA A PREPARAçãO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a composições de bacuqujol (UP246) tendo níveis baixos de impurezas, particularmente impurezas de furanocumarina. A presente invenção refere-se ainda a métodos melhorados para o isolamento, purificação e análise de composições de bacuquiol. Finalmente, a presente invenção refere-se a métodos para usar as composições de bacuquiol purificadas e formulações das mesmas para a prevenção e tratamento de várias doenças e condições mediadas por ciclooxigenase (COX), lipoxigenase (LOX), condições inflamatórias secundárias e várias infecções microbianas. Os métodos desta invenção são compreendidos de administrar a um hospedeiro em necessidade deste uma quantidade eficaz da composição desta invenção juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE BACUQUIOL E MÉTODOS DE FABRICAR AS MESMAS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições de bacuquiol e compostos relacionados a estas tendo níveis baixos de impurezas, particularmente impurezas de furanocumarina. A presente invenção fornece métodos melhorados para o isolamento, purificação e análise de composições de bacuquiol. Finalmente, a presente invenção fornece métodos para usar as composições de bacuquiol purificadas e formulações destas para a prevenção e tratamento de várias doenças e condições mediadas por ciclooxigena-se (COX), lipoxigenase (LOX), condições inflamatorias secundárias e várias infecções microbianas.

Antecedentes da Invenção

Bacuquiol, a estrutura do qual é ilustrada abaixo, é um composto fenólico tendo um único grupo hidroxila no anel aromático e uma cadeia de hidrocarboneto insaturada. Ele foi isolado das sementes de Psoralea coryli-folia L. (Luguminosae) e da parte aérea de Psoralea glandulosa L. (Papilio-naceae).

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Bacuquiol

O bacuquiol, extraído da planta Psoralea corylifolia, foi mostrado ter atividade antitumor, antioxidante (Haraguchi et al. (Set. de 2002) Phyto-ther Res. 16(6):539-544), citotóxica ((Dez. de 1989) Yakugaku Zasshi. 109(12):962-965), antimicrobiana (Newton et al. (Jan. de 2002) J Ethno-pharmacol. 79(1):57-67) e hepatoprotetiva (Cho ef a/(Nov. de 2001) Planta Med. 67(8):750-751). Ele também foi mostrado ser um inibidor de topoisome-rase II (Sun ef al. (Mar. de 1998) J Nat Prod. 61(3):362-366). O bacuquiol inibe a atividade de PTP1B em uma maneira dependente de dose, exibindovalores de IC5o de 20,8 +/- 1,9 uM (Kim et al. (Jan. de 2005) Planta Med. 71(1):87-99). A preparação e avaliação In vitro de bacuquiol radioiodado como um agente antitumor foram relatadas por Batap et al. ((Mar. de 2005) Appl Radiat Isot. 62(3):389-393). A cadeia terpenóide do bacuquiol foi relatada ser crítica à sua atividade antioxidante (Adhikari et al. (Set. de 2003) Chem ResToxicol. 16(9):1062-1069).

O bacuquiol também foi relatado como sendo um composto útil para o desenvolvimento de agentes antibacterianos contra patógenos orais e como tendo grande potencial para o uso em aditivos alimentícios e líquido para limpeza bucal para prevenir e tratar a cárie dental (Katsura et al. (Nov. de 2001) Antimicrob Agents Chemother. 45(11):3009-3013). O Racionamento guiado por atividade antiinflamatória e antipirética dos extratos ativos de Psoralea corylifolia resultou no isolamento de bacuquiol juntamente com outros três compostos ativos: ciclobacuquióis A e B e angelicina. (Backhouse etal. (Nov. de 2001) J Ethnopharmacol. 78(1):27-31). Bacuquiol supostamente controla funções leucocíticas tais como produção, migração e desgranulação de eicosanóide no sítio inflamatóno e é um inibidor fraco de PLA2 secretário e intracelular. Ele dependentemente da dose reduz a formação de LTB4 e TXB2 por neutrófilos humanos e microssomos de plaqueta, respectivamente (Ferrandiez et al. (Set. de 1996) J Pharm Pharmacol. 48(9):975-980.). Ele também inibe a expressão do gene de oxido nítrico sintase induzível por intermédio da inativação de fator-kappaB de transcrição nuclear em macrófa-gos RAW 264,7. (Pae et al. (Set. de 2001) International Immunopharmacol. 1 (9-10):1849-1855). A inibição de peroxidação de lipídeo mitocondrial por bacuquiol também foi relatada (Haraguchi et al. (Ago. de 2000) Planta Med. 66(6):569-571). O isolamento e atividade anti-hiperglicêmica de bacuquiol isolado de Otholobium pubescens (Fabaceae) é descrito por Krenisky et al. em Biol Pharm Buli. (Out. de 1999) 22(10):1137-1140). Finalmente, um extrato bruto referido como agente de Buguzhi, contendo bacuquiol, assim como, vários outros compostos do tipo cumarina foram relatados como promotores da cura óssea (US2004/0043089A1).

Bacuquiol, portanto, é um produto natural biologicamente ativotendo muito potencial para o uso na prevenção e tratamento de várias doenças e condições. Entretanto, existe correntemente várias limitações associadas com o uso deste composto devido principalmente a sua concentração baixa em fontes naturais, assim como a presença de componentes tóxicos coexistentes. Um dos problemas principais relacionados ao uso de composições de bacuquiol isoladas de plantas no gênero Psoralea é a presença de psoralenos, tais como psoraleno e isopsoraleno, as estruturas dos quais são apresentadas abaixo. Psoralenos, também conhecidos como furanocumari-nas, são metabólitos secundários que ocorrem naturalmente em plantas, incluindo muitos frutos e vegetais.

Psoraleno Isopsoraleno Vários riscos à saúde foram associados com o manejo, aplicação tópica e ingestão de plantas contendo psoraleno e psoralenos sintéticos. Psoralenos são bem-conhecidos serem agentes fototóxicos, que aumentama sensibilidade da pele à radiação ultravioleta e promovem câncer de pele (Epstein (1999) Med. Surg. 18(4):274-284). Psoraleno foi mostrado induzir inibição de crescimento em ratos (Diawara etal. (1997) Câncer Lett. 114(1-2: 159-160). Toxicidade gonadal de extratos brutos de plantas Psoralea foi diretamente ligada com a ruptura do eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal (Takizawa et al. (2002) J. Toxicological Sciences 27(2):97-105). Administração oral dos psoralenos, bergapteno (5-metoxipsoraleno) e xantotoxina (8-metoxipsoraleno) na dieta de ratos fêmeas reduziu índices de natalidade, o número de sítios de implantação, filhotes, corpo lúteo, peso uterino total e nulo, e níveis de estrogênio circulante em uma maneira dependente de dose (Diawara et al. (1999) J. Biochem. Molecular Toxicology 13(3/4): 195-203). Psoralenos também foram mostrados induzir os mRNAs das enzimas do fígado CYP1A1 e UGT1A6, sugerindo que o metabolismo realçado de estro-gênios por psoralenos pode explicar a toxicidade reprodutiva e a redução observada de função folicular ovariana e ovulação (Diawara et aí. (Maio a Junho de 2003) Pediatr Pathol Mol Med. 22(3):247-58.) Psoraleno e isopso-raleno respondem por cerca de 0,1 a 2% do peso seco de sementes de Pso-ralea e cerca de 1 a 20% do peso em etanol e outros extratos brutos de solvente orgânico. Permanece uma necessidade para um método para remover compostos tóxicos, tais como psoraleno e isopsoraleno, assim como outras cumarinas de modo a realçar a pureza e segurança de composições de ba-cuquiol, particularmente aquelas isoladas de fontes de planta.

A liberação e metabolismo de ácido araquidônico (AA) da membrana celular resulta na geração de metabólitos pró-inflamatórios por vários caminhos diferentes. Discutivelmente, dois dos caminhos mais importantes para inflamação são mediados pelas enzimas lipoxigenase (LOX) e ciclooxigenase (COX). Estes são caminhos paralelos que resultamna geração de leucotrienos e prostaglandinas, respectivamente, que desempenham papéis importantes no início e progressão da resposta inflamatória. Estes compostos vasoativos são quimiotaxinas, que promovem infiltração de células inflamatórias em tecidos e servem para prolongar a resposta inflamatória.

A inibição da enzima COX é o mecanismo de ação atribuído à maioria dos fármacos antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDS). Existem duas isoformas distintas da enzima COX (COX-1 e COX-2), que compartilham aproximadamente 60% de homologia de seqüência, mas diferem em perfis de expressão e função. COX-1 é uma forma constitutiva da enzima,que foi ligada à produção de prostaglandinas fisiologicamente importantes, que ajudam a regular funções fisiológicas normais, tais como agregação de plaqueta, proteção de função celular no estômago e manutenção da função renal normal. (Dannhardt e Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36:109-26). A segunda isoforma, COX-2, é uma forma da enzima que é induzível por cito-cinas pró-inflamatórias, tais como interleucina-1f3 (IL-1(3) e outros fatores de crescimento. (Herschmann (1994) Câncer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie etal. (1992) Drugs Dev. Res. 25:249-65). Esta isoforma catalisa a produçãode prostaglandina E2 (PGE2) do ácido araquidônico (AA).

Inibidores que demonstram especificidade dupla para COX eLOX teriam o benefício óbvio de inibir caminhos múltiplos do metabolismo deácido araquidônico. Tais inibidores bloqueariam os efeitos inflamatórios deprostaglandinas (PG), assim como, aqueles de leucotrienos múltiplos (LT)limitando-se sua produção. Isto inclui a vasodilatação, vasopermeabilidade eefeitos quimiotáticos de PGE2, LTB4, LTD4 e LTE4, também conhecidascomo a substância de reação lenta de anafilaxia. Destes, LTB4 tem osefeitos quimiotáticos e quimiocinéticos mais potentes. (Moore (1985) emProstanoids: pharmacological, physiological and clinicai relevance,Cambridge University Press, N.Y., páginas 229-230).

Porque o mecanismo de ação de inibidores de COX sobrepõeaquele de NSAID's mais convencionais, os inibidores de COX são usadospara tratar muitos dos mesmos sintomas, incluindo dor e intumescimentoassociado com inflamação em condições de pele transitórias e doençascrônicas em que a inflamação desempenha um papel crítico.Conseqüentemente, as enzimas responsáveis por gerar estes mediadoresde inflamação tornaram-se os alvos no desenvolvimento de vários farmacosnovos intencionados no tratamento de inflamação, que contribuem para apatogênese de doenças tais como artrite reumatóide, osteoartrite e doençade Alzheimer.

Condições de pele transitórias incluem tratamento de inflamaçãoassociada com abrasões secundárias ou dermatite de contato, assim como,condições de pele que são diretamente associadas com os caminhos deprostaglandina e leucotrieno, tais como hiperpigmentação de pele, manchasde idade, vitiligo, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, carcinoma, mela-noma, e outros cânceres de pele em mamífero. O uso de inibidores de COXfoi expandido para incluir doenças, tais como lúpus eritematoso sistêmico(SLE) (Goebel et ai (1999) Chem. Res. Toxicol. 12:488-500; Patrono et al.(1985) J. Clin. Invest. 76:1011-1018), assim como condições reumáticas dapele, tais como esclerodermia. Inibidores de COX também são usados parao alívio de condições inflamatórias de pele que não são de origem reumáti-ca, tais como psoríase, em que a redução da inflamação que resulta da su-perprodução de prostaglandinas pode fornecer um benefício direto. (Fogh etaí. (1993) Acta Derm Venerologica 73:191-193). Recentemente a superex-pressão de 5-lipoxigenase na pele de pacientes com esclerose sistêmica foirelatada. Isto tem levado à sugestão de que o caminho de LOX pode ser designificância na patogênese de esclerose sistêmica e pode representar umalvo terapêutico válido. (Kowal-Bielecka (2001) Arthritis Rheum. 44(8): 1865).Finalmente, a atividade enzimática aumentada tanto da COX-2 quanto da 5-LOX no sítio de injeções de alérgeno sugere o potencial para usar inibidoresde COX/LOX duplos para tratar os sintomas tanto das fases iniciais quantotardias da resposta alérgica da pele. (Church (2002) Clin. Exp. Allergy.32(7): 1013).

Prostaglandinas e leucotrienos também desempenham papéisimportantes nos processos fisiológicos e patológicos de ferimentos,queimaduras, escaldadura, acne, infecções microbianas, dermatite, e muitasoutras doenças e condições da pele. A ativação de uma cascata pró-inflamatória depois das queimaduras térmicas ou químicas com atividadesde ciclooxigenase e lipoxigenase significantemente elevadas são bem-documentadas e desempenham um papel importante no desenvolvimento desintomas severos e disfunção imune subsequentes que podem levar afalência múltipla dos órgãos. (Schwacha (2003) Bums 29(1 ):1; He (2001) J.Burn Care Rehabila. 22(1 ):58).

Além do seu uso como agentes antiinflamatórios, um outro papelpotencial para inibidores de COX é no tratamento de câncer. A superexpres-são de COX foi demonstrada em várias malignidades humanas e inibidoresde COX foram mostrados serem eficazes no tratamento de animais com tu-mores de pele. Embora o mecanismo de ação não seja completamente en-tendido, a superexpressão de COX foi mostrada inibir apoptose e aumentara invasividade de tipos de célula tumorigênica. (Dempke etal. (2001) J. Can.Res. Clin. Oncol. 127:411-17; Moore e Simmons (2000) Current Med. Chem.7:1131-1144). A produção super-regulada de COX foi implicada na geraçãode ceratose actínica e carcinoma de célula escamosa na pele. Quantidadesaumentadas de COX também foram encontradas em lesões produzidas pordano no DNA. (Buckman et al. (1998) Carcinogenesis 19:723). Portanto,controle de expressão ou função de proteína de COX pareceriam levar auma diminuição na resposta inflamatória e a progressão eventual ao câncer.De fato, inibidores de COX tais como indometacina e Celebrex® foram des-cobertos serem eficazes no tratamento de eritema induzido por UV e forma-ção de tumor. (Fischer (1999) Mol. Carcinog. 25:231; Pentland (1999) Carci-nogenesis 20:1939). Recentemente, a superexpressão de lipoxigenase tam-bém foi mostrada ser relacionada ao desenvolvimento de tumor epidérmico(Muller (2002) Câncer Res. 62(16):4610) e carcinogênese do melanoma(Winer (2002) Melanoma Res. 12(5):429). Os metabólitos do ácido araqui-dônico (AA) gerados de caminhos de lipoxigenase desempenham papéisimportantes em transdução de sinal relacionada ao crescimento do tumorsugerindo que a inibição de caminhos de lipoxigenase deva ser um alvo váli-do para prevenir a progressão do câncer. (Cuendet (2000) Drug MetabolDrug Interact 17(4):109; Steele (2003) Mutat Res. 523-524:137). Assim, ouso de agentes terapêuticos tendo atividade inibitória de COX/LOX duplaoferece vantagens significantes na quimioprevenção de câncer.

Acne é uma doença crônica da unidade pilossebácea caracteri-zada por produção em excesso de sebo pelas glândulas sebáceas, escama-ção epitelial folicular, proliferação bacteriana e inflamação. Desequilíbriohormonal, infecção microbiana e inflamação são três dos principais fatoresassociados com o início de acne (Toombs (2005) Dermatol. Clin. 23(3):575-581; Nishijima et al. (2000) J. Dermatol. 27(5):318-323). Agentes terapêuti-cos correntes para a prevenção e tratamento de acne incluem agentes anti-inflamatórios, tais como retinóides, agentes antimicrobianos e fármacoshormonais. (Leyden (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 49(3 Suppl):S200).

A espécies bacterianas principais associadas com acne sãoPropionibacterium acnes e Staphylococcus epidermidis gram-positiva (Perrye Lambert (2006) Lett. Appl. Microbiol. 42(3):185-188). Agentes terapêuticoscorrentes incluem peróxido de benzoíla e outros fármacos antimicrobianos,tais como Ampicilina e Gentamicina (Fermandez et al. (2005) Expert Rev.Anti Infect Ther. 3(4):557-591). Infelizmente, resistência ao fármaco tanto porPropionibacterium acnes quanto por Staphylococcus epidermidis foi relatada(Nishijima et ai (2000) J. Dermatol. 27(5):318-323).

A aplicação tópica de farmacos antiinflamatorios, tais comoretinóides (Millikan (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 4(2):75) e o ácido salicílicoinibidor de COX (Lee (2003) Dermatol Surg 29(12):1196) também foramclinicamente demonstrados serem uma terapia eficaz e segura para otratamento de acne. Adicionalmente, o uso de farmacos antiinflamatoriosnão esteroidais (NSAIDs) são bem-documentados como agentesterapêuticos para dermatoses comuns e incomuns, incluindo acne, psoríase,queimadura de sol, eritema nodoso, crioglobulinemia, síndrome de Sweet,mastocitose sistêmica, urticária, livedóide e vasculite nodular. (Friedman(2002) J. Cutan Med. Surg. 6(5):449).

Doença periodontal é uma inflamação e infecção de algumas outodas as estruturas de suporte dos dentes (gengiva, cimento, ligamentoperiodontal, osso alveolar e outros tecidos que circundam os dentes).Gengivite (gengiva) e periodontite (gengiva e osso) são as duas formasprincipais de doença periodontal. De acordo com a National Oral Informationdistribuída pelo National Institute of Dental and Craniofacial Research, umaestimativa de 80 por cento de adultos Americanos correntemente têmalguma forma de doença periodontal. Doença periodontal é iniciada quandouma película se forma em um dente ou dentes limpos. Esta película atraibactérias aeróbicas gram-positivas (principalmente actinomicetos eestreptococos), que aderem ao dente formando placa. Dentro de dias aplaca engrossa, as bactérias subjacentes desprovidas de oxigênio ebastonetes e espiroquetas anaeróbicos dotados de motilidade começam apovoar a área subgengival. Endotoxinas liberadas pelas bactériasanaeróbicas causam inflamação, destruição do tecido da gengiva e aindaperda óssea. Existe quatro estágios primários de doença periodontal quepodem ser caracterizados como indicado abaixo. O impacto destrutivo dadoença periodontal vai além da saúde e higiene dental, em que lesõesmicroscópicas que resultam da doença periodontal foram encontradas nofígado, rins, e cérebro de algumas pessoas afetadas.

Quatro Estágios da Doença Periodontal

Grau 1 Inflamação

Grau 2 Inflamação, edema, hemorragia gengival em sondagem

Grau 3 Inflamação, edema, hemorragia gengival em sondagem, erupção pustular - perda óssea leve a moderada

Grau 4 Inflamação, edema, hemorragia gengival em sondagem, erupção pustular, mobilidade - perda óssea severa

Métodos correntes para tratar doença periodontal são limitadoscom controle da infecção sendo o objetivo principal. (Genco et aí. (1990) emContenporary Periodontics, The C.V. Mosby Company, St. Louis, páginas361-370.). Agentes antimicrobianos ou antiplaca comuns incluem clorexidi-na, Triclosan, fluoreto estanoso, Listerine, peróxido de hidrogênio, cloreto decetilpiridínio e alcalóides sanguinarina. Solução para enxágüe bucal antimi-crobiana de prescrição, pastilhas anti-séptica, gel antibiótico/microesferas, esupressor de enzima-doxiciclina são as opções não mecânicas/físicas prefe-ridas para tratar e controlar doença periodontal. Infelizmente, não existe cor-rentemente nenhuma medicação periodontal única que funcione tanto paracontrolar a inflamação assim como inibir a infecção.

Deve ser entendido que tanto a descrição geral antecedentequanto a descrição detalhada seguinte são exemplares e explicativas ape-nas e não são restritivas da invenção como reivindicado.

Sumário da Invenção

A presente invenção inclui uma composição nova de matériacompreendida de bacuquiol, que é substancialmente isenta de impurezas,particularmente impurezas de furanocumarina. Esta composição de matériatambém é referida aqui como UP256. Em algumas modalidades, a composi-ção é obtida da família de plantas incluindo, mas não limitada a Lugumino-sae, Papilionaceae, Lauraceae e Magnoliaceae. Em outras modalidades, acomposição é obtida de uma planta ou plantas selecionadas do gênero deplantas incluindo, mas não limitado a Psorlea, Sassafras, Magnolia e As-tractylodes. Em modalidades preferidas, a planta é selecionada do grupoincluindo, mas não limitado a Psoralea corilylifolia L. (Luguminosae) ou Pso-ralea glandulosa L. (Papilionaceae). A composição da invenção pode serobtida da planta inteira ou de uma ou mais partes individuais da planta inclu-indo, mas não limitadas às sementes, caules, casca, ramos, tubérculos, raí-zes, casca de raiz, brotos jovens, rizomas, flores e outros órgãos reproduti-vos, folhas e outras partes aéreas.

A quantidade de bacuquiol na composição pode estar na faixade cerca de 14 a 100 por cento em peso (%) dependendo do método de ex-tração e da extensão de purificação do extrato bruto. Em uma modalidade aquantidade de bacuquiol na composição está na faixa de 30% a 100%. Emoutras modalidades a quantidade de bacuquiol na composição é selecionadado grupo consistindo em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%. Em uma modalidade preferida,a quantidade de bacuquiol na composição é de aproximadamente 30%.

Uma impureza inclui qualquer substância que é indesejada nacomposição de bacuquiol. Tipicamente, as impurezas presentes nas compo-sições de bacuquiol são um resultado do processo utilizado para produzi-las,incluindo tanto isolamento de fontes naturais quanto métodos sintéticos. Porexemplo, no isolamento de bacuquiol de impurezas de fontes naturais incluifuranocumarinas, tais como psoraleno, isopsoraleno e outros componentesdo tipo cumarina.

A presente invenção também inclui métodos melhorados paraisolar e purificar composições brutas de bacuquiol e compostos relacionadosobtidos de fontes naturais. O método melhorado para isolar e purificar estascomposições inclui as etapas de extração dos compostos de uma fonte deplanta, hidrólise do extrato bruto com uma solução básica, e purificação porum método incluindo mas não limitado à cromatografia em coluna, extraçãoseguida por cristalização, partição de solvente, recristalização ecombinações destas. Extratos brutos purificados nesta maneira sãoessencialmente isentos de impurezas de furanocumarina tais comopsoraleno e isopsoraleno. Assim, a fototoxicidade potencial, irritação tópica,carcinogenicidade, e toxicidade reprodutiva associadas com estescompostos são essencialmente eliminadas. A pureza destas composições aseguir do isolamento e purificação pelos métodos da presente invenção estáem uma faixa selecionada de cerca de 27% a 100%.

Também incluído na presente invenção é um método para anali-sar composições de bacuquiol, que possibilita a detecção e quantificação deimpurezas. Nesta modalidade da invenção, o método para analisar composi-ções de bacuquiol é compreendido da etapa de analisar as ditas composi-ções por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Análise por HPLCpossibilita a quantificação dos vários componentes na mistura e também for-nece um meio para rastrear bacuquiol, psoraleno, isopsoraleno e outroscomponentes naturais em plantas Psoralea para guiar os processos de ex-tração, hidrólise e purificação.

A presente invenção também inclui métodos para a prevenção etratamento de doenças e condições mediadas por COX e LOX da pele, bo-ca, dentes e gengiva. O método para prevenir e tratar doenças e condiçõesmediadas por COX e LOX da pele, boca, dentes e gengiva é compreendidode administrar, preferivelmente topicamente, a um hospedeiro em necessi-dade deste uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo ba-cuquiol, que é substancialmente isenta de impurezas de furanocumarina jun-tamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como observado a-cima, a quantidade de bacuquiol na composição está na faixa de 27% a100%. Em modalidades preferidas a quantidade de bacuquiol na composi-ção é de aproximadamente 30%. Também como observado acima, em mo-dalidades preferidas, o bacuquiol é isolado de uma planta ou plantas no gê-nero Psorlea de plantas.

Doenças ou condições mediadas por COX e LOX da pele inclu-em, mas não são limitadas a, acne, caspa, queimadura de sol, queimadurastérmicas, ferimentos tópicos, condições inflamatórias secundárias causadaspor infecções fúngicas, microbianas e virais, vitiligo, lúpus eritematoso sis-têmico, psoríase, carcinoma, melanoma, assim como outros cânceres depele em mamíferos, dano à pele que resulta de exposição à radiação ultravi-oleta (UV), produtos químicos, calor, vento e ambientes secos, rugas, peleflácida, linhas de expressão e olheiras, dermatite e outras condições relacio-nadas à alergia da pele. Doenças e condições mediadas por COX/LOX daboca, dentes e gengiva, incluem, mas não limitam-se a doenças periodon-tais, condições pré cancerosas orais, cânceres orais, e outras malignidadesorais, gengiva e dentes sensíveis, seqüelas, pulpites, irritação, dor e infla-mação causada pela implantação física de dentaduras orais, trauma, lesões,bruxismo e outros ferimentos secundários na boca, na gengiva ou na língua,placa e cálculo dentais, descalcificação dos dentes, proteólise e cárie (dete-rio ração).

A presente invenção ainda inclui métodos para a prevenção etratamento de outras doenças e condições mediadas por COX e LOX, inclu-indo mas não limitadas à dor e rigidez da articulação geral, carência de mo-bilidade e perda de função física devido às condições patológicas de osteo-artrite e artrite reumatóide, eólicas menstruais, arteriosclerose, obesidade,diabete, doença de Alzheimer, reação alérgica respiratória, insuficiência ve-nosa crônica, psoríase, cefaléia tensional crônica, cefaléias do tipo enxaque-ca, doença inflamatória intestinal, câncer de próstata e outros tumores sóli-dos.

O método para prevenir e tratar as ditas doenças e condiçõesmediadas por COX e LOX é compreendido de administrar a um hospedeiroem necessidade deste uma quantidade eficaz de uma composição compre-endendo bacuquiol, que é substancialmente isenta de impurezas de furano-cumarina juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Comoobservado acima, a quantidade de bacuquiol na composição está na faixa de27% a 100%. Em modalidades preferidas a quantidade de bacuquiol nacomposição é de aproximadamente 30%. Também como observado acima,em modalidades preferidas, o bacuquiol é isolado de uma planta ou plantasno gênero Psorlea de plantas.

Ainda incluídos na presente invenção são métodos para a pre-venção e tratamento de doenças e condições da pele, boca, dentes ou gen-giva mediadas por infecções microbianas, incluindo mas não limitadas àsinfecções bacterianas, virais e fúngicas, o dito método compreendendo ad-ministrar a um hospedeiro em necessidade deste uma quantidade eficaz deuma composição farmacêutica compreendida de bacuquiol, que é substanci-almente isenta de impurezas de furanocumarina juntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável. Doenças e condições da pele, boca, gengiva edentes mediadas por infecções microbianas incluem, mas não são limitadasà caspa, acne, pé-de-atleta, doenças periodontais, selecionadas do grupoconsistindo em cárie, gengivite, periodontite, pulpites, condições periodontaiscausadas pela implantação física de dentaduras orais, trauma, lesões, bru-xismo, processos neoplásticos e outros degenerativos; matéria branca, pelí-culas, placas dentais, cálculo e manchas.

Em uma modalidade, a bactéria é selecionada de Propionibacte-rium acnes ou Staphylococcus epidermidis.

As composições desta invenção podem ser administradas porqualquer método conhecido a uma pessoa versada na técnica. Os modos deadministração incluem, mas não são limitados a, administração enteral (o-ral), administração parenteral (intravenosa, subcutânea, e intramuscular) eaplicação tópica. Em modalidades preferidas as composições são adminis-tradas topicamente. O método de prevenção e tratamento de acordo comesta invenção compreende administrar interna ou topicamente a um pacienteem necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz uma com-posição compreendida de bacuquiol, que é substancialmente isenta de impu-rezas, particularmente impurezas de furanocumarina.

Deve ser entendido que tanto a descrição geral antecedentequanto a descrição detalhada seguinte são exemplares e explicativas ape-nas e não são restritivas da invenção como reivindicado.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 ilustra o cromatograma de HPLC de um extrato repre-sentativo de plantas Psoralea. Duas furanocumarinas - psoraleno e isopsora-leno estão presentes em uma quantidade igual no extrato.

A figura 2 ilustra os cromatogramas de HPLC de extratos dePsoralea antes (figura 2A) e depois (figura 2B) da reação de hidrólise do hi-dróxido de sódio.

A figura 3 representa o cromatograma de HPLC de uma amostrade UP256 (MH-258-07-01) compreendida de 31% de bacuquiol.

A figura 4 representa o cromatograma de HPLC de uma amostrade UP256 (MH-258-07-01) compreendida de 41 % de bacuquiol.

A figura 5 representa o cromatograma de HPLC de uma amostrade UP256 (MH-258-12- 08) compreendida de 99% de bacuquiol.

A figura 6 representa graficamente uma curva de resposta dedose da inibição da atividade da enzima 5-lipoxigenase (5-LO) por umacomposição de UP256 (Ne MH-258-12-08 -•-) em relação ao controle positi-vo - NDGA (—)

Descrição Detalhada da Modalidade Preferida

A presente invenção inclui composições de bacuquiol (UP246)tendo níveis baixos de impurezas. Incluídos na presente invenção são méto-dos melhorados para o isolamento e purificação de composições de bacu-quiol. Também incluído na presente invenção é um método para analisarcomposições de bacuquiol, que possibilita a detecção e quantificação devárias impurezas. Ainda incluído nesta invenção é um método para usar ascomposições de bacuquiol purificadas e formulações destas para a preven-ção e tratamento de várias doenças e condições mediadas por ciclooxigena-se (COX), lipoxigenase (LOX), condições inflamatórias secundárias e váriasinfecções microbianas.

Vários termos são usados aqui para referir-se aos aspectos dapresente invenção. Para auxiliar na clarificação da descrição dos componen-tes desta invenção, as definições seguintes são fornecidas.

Deve ser observado que o termo entidade "um" ou "uma" refere-se a um ou mais desta entidade. Como tal, os termos "um" ou "uma", "um oumais" e "pelo menos um" são usados permutavelmente aqui.

"Bacuquiol" como usado aqui refere-se ao composto tendo afórmula seguinte:Bacuquiol

em que a ligação dupla central pode ser eis ou trans. Compostos fenólicosestruturalmente relacionados ao bacuquiol também são incluídos dentro des-ta definição.

Como usado aqui o termo "impureza" inclui qualquer substânciaque não é desejada na composição de bacuquiol, tipicamente que resulta doisolamento de bacuquiol de fontes naturais. O termo impureza inclui, mas énão limitado a compostos de furanocumarina selecionados do grupo incluin-do mas não limitado a psoraleno, isopsoraleno e outras impurezas do tipocumarina. Impurezas também referem-se a impurezas que resultam de pro-cessos sintéticos para obter estas composições.

[027] "Terapêutico" como usado aqui, inclui tratamento e/ou profilaxia.Quando usado, terapêutico refere-se a seres humanos assim comooutros animais.

"Dose ou quantidade farmacêutica ou terapeuticamente efica-zes" refere-se a um nível de dosagem suficiente para induzir um resultadobiológico desejado. Este resultado pode ser o alívio dos sinais, sintomas oucausas de uma doença ou qualquer outra alteração de um sistema biológicoque é desejado.

"Placebo" refere-se à substituição da dose ou quantidade farma-cêutica ou terapeuticamente eficaz, dose suficiente para induzir uma biológi-ca desejada que pode aliviar os sinais, sintomas ou causas de uma doençacom uma substância não ativa.

Um "hospedeiro" ou "paciente" é um paciente vivo, ser humanoou animal, em que as composições descritas aqui são administradas. Assim,a invenção descrita aqui pode ser usada para aplicações veterinárias assimcomo humanas e os termos "paciente" ou "hospedeiro" não devem ser inter-pretados em uma maneira limitante. No caso de aplicações veterinárias, asfaixas de dosagem podem ser determinadas como descrito abaixo, conside-rando o peso corporal do animal.

Observe que por todo este pedido várias citações são forneci-das. Cada citação é especificamente incorporada aqui por referência em suatotalidade.

A presente invenção inclui uma composição nova de matériacompreendida de bacuquiol, que é substancialmente isenta de impurezas,particularmente impurezas de furanocumarina. Esta composição de matériatambém é referida aqui como UP256. Em algumas modalidades, a composi-ção é obtida de uma planta ou plantas selecionadas do gênero Psorlea deplantas. Em modalidades preferidas a planta é selecionada do grupo incluin-do, mas não limitado a Psoralea corylifolia L. (Luguminosae) ou Psoraleaglandulosa L. (Papilionaceae). A composição da invenção pode ser obtida daplanta inteira ou de uma ou mais partes individuais da planta incluindo, masnão limitadas a sementes, caules, casca, ramos, tubérculos, raízes, cascade raiz, brotos jovens, rizomas, flores e outro órgãos reprodutivos, folhas eoutras partes aéreas.

Uma impureza inclui qualquer substância que é indesejada nacomposição de bacuquiol. Tipicamente, as impurezas presentes nas compo-sições de bacuquiol são um resultado do processo utilizado para produzi-las,incluindo tanto isolamento de fontes naturais quanto métodos sintéticos. Porexemplo, no isolamento de bacuquiol de impurezas de fontes naturais inclu-em furanocumarinas, tais como psoraleno, isopsoraleno e outros componen-tes tipo cumarina.

A presente invenção também inclui métodos melhorados paraisolar, analisar e purificar composições brutas de bacuquiol obtidas a partirde fontes naturais. O método melhorado para isolar e purificar estas compo-sições inclui as etapas de extração do composto de uma fonte de planta,hidrólise do extrato bruto com uma solução básica, e purificação por ummétodo incluindo mas não limitado à cromatografia em coluna, extraçãoseguida por cristalização, partição de solvente, recristalização e combina-ções destas. Extratos brutos purificados nesta maneira estão essencialmen-te isentos de impurezas de furanocumarina tais como psoraleno e isopsora-leno.

Um método para analisar composições de bacuquiol usandocromatografia líquida de alta pressão (HPLC) é descrito no Exemplo 1 (Ta-bela 1). Análise por HPLC possibilita a quantificação dos vários componen-tes na mistura e também fornece um meio para rastrear bacuquiol, psorale-no, isopsoraleno e outros componentes naturais em plantas Psoralea paraguiar os processos dê extração, hidrólise e purificação.

A eficiência da extração de bacuquiol das fontes de planta foiavaliada usando seis sistemas de solvente orgânico diferentes sob dois con-juntos de condições de extração como descrito no Exemplo 2. Os resultadossão apresentados na Tabela 2. Com referência à Tabela 2, pode ser obser-vado que bacuquiol pode ser extraído de plantas Psoralea com qualquernúmero de solventes orgânicos e/ou combinações destes. A quantidade debacuquiol nos vários extratos variou de um máximo de 29,1% a 13,7% empeso. Foi determinado que a extração com éter de petróleo forneceu o ba-cuquiol de pureza mais alta no extrato bruto com boa recuperação. Um cro-matograma de HPLC representativa de um extrato bruto é ilustrado na Figu-ra 1. Com referência a esta figura pode ser observado que o extrato brutocontinha bacuquiol assim como as impurezas de furanocumarina psoralenoe isopsoraleno. O exemplo 3 descreve uma extração em grande escala cométer de petróleo a 70°C.

A eficácia da purificação dos extratos de bacuquiol brutos porcromatografia em coluna é demonstrada no Exemplo 4. Oito tipos diferentesde resinas foram avaliados especificamente quanto à sua capacidade paraseparar bacuquiol de impurezas de furanocumarina. Tanto sílica-gel quantoresinas CG-161 demonstraram separação satisfatória. Separaçãocromatográfica em coluna de extratos de planta brutos em uma escalaindustrial, entretanto, tipicamente não é economicamente provável visto queela requer equipamento e reagentes caros e pessoal experiente, semmencionar a capacidade de carga extremamente baixa destas amostrasdevido à complexidade de extratos de planta brutos.

Os exemplos 5 a 7 descrevem um método novo, econômico paraseparar bacuquiol de impurezas de furanocumarina, o dito método compre-endendo o tratamento de composições contendo as ditas impurezas comuma base. Como ilustrado pelo esquema seguinte, usando NaOH para pro-pósitos de ilustração, o tratamento com base abre o anel de lactona das fu-ranocumarinas, desse modo convertendo-as nos sais correspondentes deácidos carboxílicos, que depois podem ser facilmente separados do restanteda mistura por uma variedade de métodos.

A solução básica pode ser selecionada de qualquer base quepode ser usada para abrir anéis de lactona, incluindo, mas não limitada ahidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio e hidróxido delítio. A solução pode ser selecionada para ter concentração e valores de pHdiferentes para maximizar a conversão ao sal ácido. A mistura de reaçãotambém pode ser aquecida sob temperatura e pressões diferentes para ma-ximizar a taxa de reação, eficiência e rendimento.

O curso da reação pode ser seguido por HPLC para garantir aconversão completa das cumarinas em seus sais do ácido carboxílico res-pectivos. Os cromatogramas de HPLC da composição bruta antes e depoisda hidrólise são ilustrados nas Figuras 2A e B. Na conclusão da reação(como determinada por HPLC), a solução de reação pode ser processadausando vários métodos, incluindo mas não são limitados à extração em cro-matografia em coluna seguido por cristalização, partição de solvente, recris-talização ou combinações destas. Extratos brutos purificados nesta maneirasão essencialmente isentos de impurezas de furanocumarina tais como pso-raleno e isopsoraleno.

Com referência aos Exemplos 5 a 7, na hidrólise sob uma varie-dade de condições seguido por partição de solvente, as furanocumarinas,psoraleno e isopsoraleno, são efetivamente removidas da composição debacuquiol. Adicionalmente, a pureza de bacuquiol é realçada de cerca de 10a 30% a 30% a 50%. Solventes orgânicos que podem ser usados para parti-ção de solvente incluem, mas não são limitados a éter de petróleo, acetatode etila, éter etílico, hexano, clorofórmio, propanol, butanol, e cloreto de me-tileno, assim como outros solventes orgânicos imiscíveis em água.

Em uma modalidade, que é descrita no Exemplo 7, a mistura dereação bruta é carregada diretamente em uma coluna seguido por eluiçãocom um solvente polar. De acordo com esta modalidade composiçõescompreendidas de 70% a 100% de bacuquiol podem ser obtidas. NoExemplo 7, a seguir da hidrólise a mistura de reação bruta foi carregadadiretamente em uma coluna CG-161 cd seguido por eluição com metanolpara fornecer bacuquiol altamente puro (aproximadamente 99%). Outrostipos de resinas que podem ser usadas de acordo com esta modalidadeincluem, mas não são limitados a XAD (Amerlite), CG-71/CG-161 ou outrotipo de resinas de poliestireno; resinas de troca de íon e sílica-gel. A colunapode ser eluída com solventes selecionados do grupo incluindo, mas nãolimitados à água, metanol/água, etanol/água, acetona/água eacetonitrila/água assim como outras combinações de solventes polares. Édigno de nota que a capacidade de carga da coluna depois da hidrolisefosse muito mais alta do que antes da hidrolise. Adicionalmente, a cor destascomposições de bacuquiol isentas de furanocumarina altamente puras, foimarrom claro e elas foram muito estáveis com respeito tanto a cor quanto acomposição do agente ativo, tornando-as particularmente adequadas paraformulação, armazenagem e aplicações cosméticas.

Em modalidades alternativas, a mistura de reação bruta primeiropode ser extraída com um solvente orgânico seguido por outra purificaçãopor cromatografia e/ou partição de solvente e/ou recristalização. Como ob-servado acima, dependendo do método de extração e extensão de outrascomposições de bacuquiol de purificação compreendidas entre cerca de30% e 100% são facilmente obteníveis.

A presente invenção inclui métodos para usar as composiçõesde bacuquiol purificadas e formulações destas para a prevenção etratamento de várias doenças e condições mediadas por ciclooxigenase(COX), lipoxigenase (LOX), condições inflamatórias secundárias e váriasinfecções microbianas. As propriedades biológicas e segurança destascomo UP256, foram avaliadas como descrito nos Exemplos 8 a 11.

No Exemplo 8, uma composição altamente pura de UP256 (MH-258-12-08, 99% de pureza) foi testada quanto à inibição tanto das enzimasCOX-1 quanto COX-2. UP256 mostrou atividade inibitória potente para am-bas as enzimas. A IC5o para COX-1 foi determinada ser de 2,34 |a,M, enquan-to IC5o para COX-2 foi quantificada em 78 (iM. Assim, esta composição for-nece uma modulação mais balanceada das enzimas COX-1 e COX-2 do queinibidores de COX convencionais. Por exemplo, aspirina, um inibidor seletivode COX-1, que é mais do que 150 vezes mais eficaz contra COX-1 versusCOX-2, causa efeitos colaterais gastrointestinais. Reciprocamente, Vioxx®,Celebrex® e Bextra®, que são inibidores de COX-2 seletivos tendo 50 a 200vezes mais potência contra COX-2, não causam muito dano gastrointestinal,entretanto, estes fármacos seletivos de COX-2 aumentam riscos cardiovas-culares. A composição nova da matéria descrita aqui por outro lado fornecea melhor modulação do caminho eicosanóide sem a irritação estomacal cau-sada por NSAIDs seletivos de COX-1 e riscos cardiovasculares apresenta-dos por inibidores seletivos de COX-2.

Também é significante que o mecanismo de ação para a inibiçãode COX por UP256 seja completamente diferente do que aquele de NSAIDs.Aspirina, Vioxx®, Celebrex® e Bextra® irreversivelmente ligam-se à enzimaCOX através de ligações covalentes para formar complexos de enzima-inibidor firmemente ligados. Esta interação muda completamente o sítio ativoda enzima e a bolsa lateral e destrói a enzima. (Walker e Kurumbal et al.(2001) Biochem. 357:709-718). UP256, por outro lado, inibe a enzima COXatravés de uma ligação mais fraca e reversível. Neste processo interativo, aestrutura e função da enzima COX não são irreversivelmente alteradas oque resulta em um perfil de tolerância e segurança muito melhor.

O Exemplo 9 descreve um ensaio de inibição de LOX. A inibiçãode LOX resulta em uma diminuição no acúmulo de leucotrienos fagocíticos,que são diretamente associados com os sintomas de inflamação crônica, etambém reduz efeitos colaterais gastrointestinais potenciais. Tal eficácia édemonstrada no Exemplo 9. Com referência ao Exemplo 9, a composição deUP256 altamente pura, MH-258-12-08 (99% de pureza) foi testada em dupli-cata em quatro concentrações contra a enzima 5-lipoxigenase humana (5-LO ou 5-LOX). A atividade inibitória de COX-2 foi confirmada por medição deresposta de dose e IC5o (a concentração necessária para inibir 50% da ativi-dade da enzima). A curva de resposta de dose é representada na Figura 6.

A IC5o para inibição de LOX foi determinada ser de 3,41 jj.M. Assim, UP256fornece o benefício adicional de reduzir significativamente a produção deleucotrieno. Esta redução na produção de leucotrieno é de longe superioraos fármacos antiinflamatórios não esteroidais tradicionais tais como ibupro-feno.

O Exemplo 10 descreve um experimento designado para deter-minar a atividade antimicrobiana de UP256. Com referência ao Exemplo 10,UP256 foi testada em duplicata em oito concentrações quanto a inibição deseis micróbios diferentes. Foi descoberto que UP256 inibiu dois micróbiosespecíficos, Propionibacterium acnes e Staphylococcus epidermidis gram-positiva, em uma concentração mínima eficaz de 1 u.g/ml_. Ambos destesmicróbios estão diretamente associados com acne, dermatite, e outras infec-ções de pele. UP256 também mostrou inibição moderada de Trichophytonmentagrophytes em uma concentração de 30 [ig/mL Nenhuma inibição foiobservada para Epidermophyton floccosum, Microsporum canis ou Pityros-porumovale.

UP256, em concentrações de 30% e 70%, foi testada quanto àtoxicidade aguda em camundongos como descrito no Exemplo 10. Os ca-mundongos testados foram fornecidos com uma oral diariamente de 2 g/kgdurante 14 dias. Os camundongos não mostraram efeitos adversos em ter-mos de ganho de peso e química sangüínea. Adicionalmente, nenhuma toxi-cidade foi observada em qualquer um dos órgãos principais testados. Emconclusão, dados de peso, exame de sangue e histológicos, não foram dife-rentes para o grupo de tratamento do que para o grupo de controle. Nenhumefeito adverso foi observado no estudo de quatorze dias. Assim, pode serconcluído que UP256 tem um perfil de segurança sólido.

Finalmente, UP256 tem um coeficiente de partição de log P =6,13. O coeficiente de partição de um composto químico fornece uma medi-da termodinâmica de seu equilíbrio de hidrofilicidade/lipofilicidade e assimsua biodisponibilidade potencial. Ter um coeficiente de partição de 6,13 sig-nifica que este composto tem penetração e biodisponibilidade de membranacelular altas quando formulado em um sistema de liberação.

A presente invenção portanto inclui métodos para a prevenção etratamento de doenças e condições mediadas por COX e LOX da pele, bo-ca, dentes e gengiva. O método para prevenir e tratar doenças e condiçõesmediadas por COX e LOX da pele, boca, dentes e gengiva é compreendidode administrar, preferivelmente topicamente, a um hospedeiro em necessi-dade deste, uma quantidade eficaz de uma composição compreendendobacuquiol, que é substancialmente isenta de impurezas de furanocumarinajuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como observadoacima, a quantidade de bacuquiol na composição está na faixa de 27% a100%. Em modalidades preferidas a quantidade de bacuquiol na composi-ção é de aproximadamente 30%. Também como observado acima, em mo-dalidades preferidas, o bacuquiol é isolado de uma planta ou plantas no gê-nero Psorlea de plantas.

Doenças ou condições mediadas por COX e LOX da pele inclu-em, mas não são limitadas a, acne, caspa, queimadura de sol, queimadurastérmicas, ferimentos tópicos, condições inflamatorias secundárias causadaspor infecções fúngicas, microbianas e virais, vitiligo, lúpus eritematoso sis-têmico, psoríase, carcinoma, melanoma, assim como outros cânceres depele em mamíferos, dano à pele que resulta de exposição à radiação ultravi-oleta (UV), produtos químicos, calor, vento e ambientes secos, rugas, peleflácida, linhas de expressão e olheiras, dermatite e outras condições relacio-nadas à alergia da pele. Doenças e condições mediadas por COX/LOX daboca, dentes e gengiva, incluem, mas não limitadas à doenças periodontais,condições pré cancerosas orais, cânceres orais, e outras malignidades orais,gengiva e dentes sensíveis, seqüelas, pulpites, irritação, dor e inflamaçãocausadas pela implantação física de dentaduras orais, trauma, lesões, bru-xismo e outros ferimentos secundários na boca, na gengiva ou na língua,placa e cálculo dentais, descalcificação dos dentes, proteólise e cárie (dete-rioração).

A presente invenção ainda inclui métodos para a prevenção etratamento de outras doenças e condições mediadas por COX e LOX, inclu-indo mas não limitados à dor e rigidez da articulação geral, carência de mo-bilidade e perda de função física devido a condições patológicas de osteoar-trite e artrite reumatóide, eólicas menstruais, arteriosclerose, obesidade, dia-bete, doença de Alzheimer, reação alérgica respiratória, insuficiência venosacrônica, psoríase, cefaléia tensional crônica, cefaléias do tipo enxaqueca,doença inflamatória intestinal, câncer de próstata e outros tumores sólidos.

Ainda incluídos na presente invenção são métodos para a pre-venção e tratamento de doenças e condições da pele, boca, dentes ou gen-giva mediadas por infecçoes microbianas, incluindo mas não limitadas a in-fecçoes bacterianas, virais e fúngicas, o dito método compreendendo admi-nistrar a um hospedeiro em necessidade deste uma quantidade eficaz deuma composição farmacêutica compreendida de bacuquiol, que é substanci-almente isento de impurezas de furanocumarina juntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável. Doenças e condições da pele, boca, gengiva edentes mediadas por infecçoes microbianas incluem, mas não são limitadasà caspa, acne, pé-de-atleta, doenças periodontais, selecionadas do grupoconsistindo em cárie, gengivite, periodontite, pulpites, condições periodontaiscausadas pela implantação física de dentaduras orais, trauma, lesões, bru-xismo, processos neoplásticos e outros degenerativos; matéria branca, pelí-culas, placas dentais, cálculo e manchas.

As composições desta invenção podem ser administradas porqualquer método conhecido a uma pessoa versada na técnica. Os modos deadministração incluem, mas não são limitados a, administração enteral (o-ral), administração parenteral (intravenosa, subcutânea, e intramuscular) eaplicação tópica. Em modalidades preferidas as composições são adminis-tradas topicamente. O método de prevenção e tratamento de acordo comesta invenção compreende administrar internamente ou topicamente a umpaciente em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma composição compreendida de bacuquiol, que é substancialmente isentade impurezas, particularmente impurezas de furanocumarina.

O método de prevenção e tratamento de acordo com esta inven-ção compreende administrar sistêmica ou topicamente a um hospedeiro emnecessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de UP256 (ba-cuquiol) sintetizada e/ou isolada de uma única planta ou plantas múltiplas eum veículo farmaceuticamente aceitável. A pureza da UP256 inclui, mas nãoé limitada a 30% a 100%, dependendo da metodologia usada para obter epurificar o composto. Em uma modalidade preferida, doses de UP256 umaquantidade eficaz, não tóxica geralmente selecionada da faixa de 0,001% a100% com base no peso total da formulação tópica e/ou 0,001 a 200 mg porquilograma com base no peso corporal total do hospedeiro. Pessoas habili-tadas na técnica usando teste clínico de rotina são capazes de determinardoses ideais para a doença particular que é tratada.

A presente invenção inclui uma avaliação de composições dife-rentes de UP256 (bacuquiol) sintetizada e/ou isolada de uma única planta ouplantas múltiplas e um veículo farmaceuticamente aceitável usando modelosde enzima, receptor, microbianos e outros in vitro e in vivo para otimizar aformulação e obter a atividade fisiológica desejada. As composições destainvenção podem ser administradas por qualquer método conhecido a umapessoa versada na técnica. Os modos de administração incluem, mas nãosão limitados a, administração enteral (oral), administração parenteral (intra-venosa, subcutânea, e intramuscular) e aplicação tópica. O método de tra-tamento de acordo com esta invenção compreende administrar interna outopicamente a um paciente em necessidade deste uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de UP256 (bacuquiol) sintetizada e/ou isolada de uma únicaplanta ou plantas múltiplas, em que o dito bacuquiol é substancialmente i-sento de impurezas de furanocumarina. Em uma única modalidade a com-posição é administrada topicamente. Métodos para administração tópica in-cluem, mas não são limitados a uma pasta de dentes, gel, ungüento, líquidopara limpeza bucal, goma de mascar, tinturas, bebidas e assim como outrasformulações farmacêuticas conhecidas. Quando formulada em uma pasta dedentes, o teor da composição pode estar na faixa de 0,1 a 2 por cento empeso (%) de bacuquiol.

As composições da presente invenção podem ser formuladascomo composições farmacêuticas, que incluem outros componentes taiscomo um excipiente, um adjuvante, e/ou um veículo farmacêutico e/ou cos-meticamente aceitáveis. Por exemplo, composições da presente invençãopodem ser formuladas em um excipiente que o hospedeiro a ser tratadopossa tolerar. Um excipiente é uma substância inerte usada como um diluen-te ou veículo para um fármaco. Exemplos de tais excipientes incluem, masnão são limitados à água, tampões, solução salina, glicerina, sílica hidratada,propileno glicol, oxido de alumínio, carragenina, goma de celulose, dióxidode titânio, solução de Ringer, solução de dextrose, manitol, solução de Hank,conservantes e outras soluções de sal aquosas fisiologicamente balancea-das. Veículos não aquosos, tais como óleos fixos, óleo de gergelim, oleatode etila, ou triglicerídeos também podem ser usados. Outras formulaçõesúteis incluem suspensões contendo agentes de realçadores de viscosidade,tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextrano. Excipientestambém podem conter quantidades menores de aditivos, tais como EDTA,DDTA dissódico, BHA, BHT, citrato de diamônio, ácido nordiidroguaiarético,gaiato de propila, gluconato de sódio, metabissulfito de sódio, t-butil hidro-quinona, SnCk, H2O2, e 2,4,5-triidroxibutirofenona, vitamina C, vitamina E eoutras substâncias que realçam isotonicidade e estabilidade química. Exem-plos de substâncias para ajustar o pH da formulação incluem hidróxido de só-dio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, trifosfato de pentassódio, piro-fosfato de tetrassódio, lauril sulfato de sódio, peróxido de cálcio, tampão defosfato, tampão de bicarbonato, tampão de tris, histidina, citrato, e glicina, oumisturas destes, enquanto exemplos de flavorizantes incluem, mas não sãolimitados a timerosal, m- ou o-cresol, formalina, extratos de fruta e álcool ben-zílico. Formulações padrão podem ser líquidas ou sólidas, que podem ser ab-sorvidas em um líquido adequado como uma suspensão ou solução para ad-ministração. Assim, em uma formulação não líquida, o excipiente pode com-preender dextrose, albumina sérica humana, conservantes, etc, à qual águaestéril ou solução salina podem ser adicionadas antes da administração.Em uma modalidade da presente invenção, a composição tam-bém pode incluir um adjuvante ou um veículo. Adjuvantes são tipicamentesubstâncias que geralmente realçam a resposta biológica de um mamífero aum agente bioativo específico. Adjuvantes adequados incluem, mas não sãolimitados a, adjuvante de Freund; outros componentes de parede da célulabacteriana; sais com base em alumínio, cálcio, cobre, ferro, zinco, magnésio,estanho; sílica; polinucleotídeos; toxóides; proteínas de soro; proteínas derevestimento viral; outras preparações derivadas de bactéria; interferon gama;adjuvantes de copolímero de bloco, tais como adjuvante Titermax de Hunter(Vaxcel.®., Inc. Norcross, Ga.); adjuvantes de Ribi (disponíveis da Ribi Immu-noChem Research, Inc., Hamilton, Mont.); e saponinas e seus derivados, taiscomo Quil A (disponível da Superfos Biosector A/S, Denmark). Veículos sãotipicamente compostos que aumentam a meia-vida de uma composição tera-pêutica no hospedeiro tratado. Veículos adequados incluem, mas não sãolimitados a, formulações de liberação controlada poliméricas, implantes bio-degradáveis, lipossomos, bactérias, vírus, óleos, ésteres, e glicóis.

Em uma modalidade, a composição é preparada como uma for-mulação de liberação controlada, que libera lentamente a composição dapresente invenção no hospedeiro. Como usado aqui, uma formulação deliberação controlada compreende uma composição da presente invenção emum veículo de liberação controlada. Veículos de liberação controlada ade-quados serão conhecidos àqueles habilitados na técnica. Formulações deliberação controlada preferidas são biodegradáveis (isto é, bioerodível).

Os agentes terapêuticos da presente invenção são administra-dos topicamente por quaisquer meios adequados, conhecidos àqueles ver-sados na técnica para administrar topicamente composições terapêuticasincluindo, mas não limitadas a como um ungüento, gel, loção, ou base decreme ou como uma emulsão, como um emplastro, curativo ou máscara,uma gaze não aderente, uma bandagem, um chumaço de algodão ou umatoalha de pano. Tal aplicação tópica pode ser localmente administrada aqualquer área afetada, usando quaisquer meios padrão conhecidos paraadministração tópica. Uma composição terapêutica pode ser administradaem uma variedade de formas de dosagem unitária dependendo do métodode administração. Para modos particulares de liberação, uma composiçãoterapêutica da presente invenção pode ser formulada em um excipiente dapresente invenção. Um reagente terapêutico da presente invenção pode seradministrado a qualquer hospedeiro, preferivelmente aos mamíferos, e maispreferivelmente aos seres humanos. O modo particular de administraçãodependerá da condição a ser tratada.

Em uma modalidade, um ungüento adequado é compreendidoda concentração desejada de UP256 (bacuquiol) que é uma quantidade efi-caz, não tóxica geralmente selecionada da faixa de 0,001% a 100% combase no peso total da formulação tópica, de 65% a 100% (preferivelmente75% a 96%) de parafina mole branca, de 0% a 15% de parafina líquida, e de0% a 7% (preferivelmente 3 a 7%) de lanolina ou um derivado de equivalen-te sintético desta. Em uma outra modalidade o ungüento pode compreenderuma matriz de parafina líquida de polietileno.

Em uma modalidade, um creme adequado é compreendido deum sistema emulsificante juntamente com a concentração desejada deUP256 (bacuquiol) sintetizada e/ou isolada de uma única planta ou plantasmúltiplas como fornecido acima. O sistema emulsificante é preferivelmentecompreendido de 2 a 10% de álcoois de polioxietileno (por exemplo a mistu-ra disponível sob a marca registrada Cetomacrogol® 1000), de 10 a 25% deálcool estearílico, de 20 a 60% de parafina líquida, e de 10 a 65% de água;juntamente com um ou mais conservantes, por exemplo de 0,1 a 1% deN,N"-metilenobis[N'-[3-(hidroximetil)-2,5-dioxo-4-imidazolidinil]uréia] (dispo-nível sob o nome Imidurea USNF), de 0,1 a 1% de 4-hidroxibenzoatos dealquila (por exemplo a mistura disponível da Nipa Laboratories sob a marcaregistrada Nipastat), de 0,01 a 0,1% de 4-hidroxibenzoato de butila sódico(disponível da Nipa Laboratories sob a marca registrada Nipabutyl sodium),e de 0,1 a 2% de fenoxietanol.

Em uma modalidade, um gel adequado é compreendido de umsistema semi-sólido em que uma fase líquida é limitada dentro de uma ma-triz polimérica tridimensional com um grau alto de reticulação. A fase líquidapode ser compreendida de água, juntamente com a quantidade desejada deUP256 (bacuquiol), de 0 a 20% de aditivos miscíveis em água, por exemploglicerol, polietileno glicol, ou propileno glicol, e de 0,1 a 10%, preferivelmentede 0,5 a 2%, de um agente espessante, que pode ser um produto natural, porexemplo tragacanto, pectina, carragenina, ágar e ácido algínico, ou um com-posto sintético ou semi-sintético, por exemplo metilcelulose e carboxipolimeti-leno (carbopol); juntamente com um ou mais conservantes, por exemplo de0,1 a 2% de 4-hidroxibenzoato de metila (metil parabeno) ou fenoxietanol-diferencial. Uma outra base adequada, é compreendida da quantidade dese-jada de UP256 (bacuquiol), juntamente com de 70 a 90% de polietileno glicol(por exemplo, ungüento de polietileno glicol contendo 40% de polietileno glicol3350 e 60% de polietileno glicol 400, preparado de acordo com o FormulárioNacional U.S. (USNF)), de 5 a 20% de água, de 0,02 a 0,25% de um antioxi-dante (por exemplo hidroxitolueno butilado), e de 0,005 a 0,1% de um agen-te quelante (por exemplo ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA)).

O termo parafina mole como usado acima abrange a parafinamole branca e parafina mole amarela bases de creme ou ungüento. O termolanolina abrange gordura de lã nativa e gordura de lã purificada. Derivadosde lanolina incluem em particular lanolinas que foram quimicamente modifi-cadas de modo a alterar suas propriedades físicas ou químicas e equivalen-tes sintéticos de lanolina incluem em particular compostos e misturas sintéti-cos ou semi-sintéticos que são conhecidos e usados nas técnicas farmacêu-ticas e cosméticas como alternativas para lanolina e podem, por exemplo,ser referidos como substitutos de lanolina.

Um equivalente sintético adequado de lanolina que pode ser usa-do é o material disponível sob a marca registrada Softisan® conhecido comoSoftisan 649. Softisan 649, disponível da Dynamit Nobel Aktiengesellschaft, éum éster de glicerina de ácidos graxos vegetais naturais, de ácido isoesteáricoe de ácido adípico; suas propriedades são debatidas por H. Hermsdorf emFette, Seifen, Anstrichmittel, Issue N2 84, N2 3 (1982), páginas 3-6.

As outras substâncias mencionadas aqui acima como constituin-tes de bases de ungüento ou creme adequados e suas propriedades sãodebatidas em trabalhos de referência padrão, por exemplo farmacopéia.Cetomacrogol 1000 tem a fórmula CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH, em que mpode ser 15 ou 17 e n pode ser 20 a 24. Hidroxitolueno butilado é 2,6-di-terc-butil-p-cresol. Nipastat é uma mistura de 4-hidroxibenzoatos de metila, etila,propila e butila.

As composições da invenção podem ser produzidas por técnicasfarmacêuticas convencionais. Assim as composições anteriormente mencio-nadas, por exemplo, podem convenientemente ser preparadas misturando-se simultaneamente em uma temperatura elevada, preferivelmente de 60 a70°C, a parafina mole, parafina líquida se presente, e lanolina ou derivadoou equivalente sintético deste. A mistura depois pode ser resfriada até atemperatura ambiente, e, depois da adição do sal de cálcio cristalino hidra-tado de mupirocina, juntamente com o corticosteróide e quaisquer outrosingredientes, agitada para garantir dispersão adequada.

Indiferente da maneira de administração, a dose específica écalculada de acordo com o peso corporal aproximado do hospedeiro. Outradistinção dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriadapara o tratamento envolvendo cada uma das formulações acima menciona-das é rotineiramente feita por aqueles versado na técnica e está dentro doescopo de tarefas rotineiramente realizadas por eles sem experimentaçãoindevida, especialmente considerando a informação de dosagem e ensaiosdescritos aqui. Estas dosagens podem ser determinadas através do uso dosensaios estabelecidos para determinar dosagens utilizadas em combinaçãocom dados de resposta de dose apropriados.

Deve ser observado que a invenção descrita aqui pode serusada para aplicações veterinárias assim como humanas e que o termo"hospedeiro" não deve ser interpretado em uma maneira limitante. No casode aplicações veterinárias, as faixas de dosagem podem ser determinadascomo descrito acima, considerando o peso corporal do animal.

Exemplos

Os exemplos seguintes são fornecidos para propósitos ilustrati-vos apenas e não são intencionados a limitar o escopo da invenção.Exemplo 1. Método para a quantificação de bacuquiol psoraleno e isopsora-leno por HPLC

A quantidade de bacuquiol, psoraleno e isopsoraleno nos extra-tos, frações, e a composição nova gerada como descrito abaixo foi quantifi-cada por uma cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) usando um de-tectar PhotoDiode Array (HPLC/PDA) e uma coluna Luna Fenil-hexil (250mm x 4,6 mm). Os compostos alvejados foram eluídos da coluna usando umgradiente de água em acetonitrila (ACN) de 36% a 100% de ACN duranteum período de 12 minutos, seguido por 100% de ACN durante três minutos.

As condições de HPLC detalhadas usadas são apresentadas na Tabela 1.Um cromatograma da separação por HPLC é representado na Figura 1. Oscompostos alvejados foram identificados e quantificados com base no tempode retenção e área de pico UV usando bacuquiol puro, psoraleno e isopsora-leno comercialmente disponíveis como padrões de quantificação. Os temposde retenção para o bacuquiol, psoraleno e isopsoraleno foram de 18,19 mi-nutos, 7,33 minutos e 7.95 minutos, respectivamente.

Tabela 1. Condições de HPLC para Quantificação de Bacuquiol, Psoraleno eIsopsoraleno

<table>table see original document page 32</column></row><table>Exemplo 2. Métodos gerais para a extração de bacuquiol das plantas Psoralea

Agitador de Pulso

A um frasco foi adicionado solvente (100 ml_) e pó de sementede Psoralea corylifolia (10 g) e a mistura foi agitada em um Agitador de Pul-so na temperatura ambiente durante uma hora. A mistura depois foi passadaatravés de um filtro e o filtrado coletado. O processo de extração foi repetidomais uma vez com solvente fresco, os filtrados foram combinados, o solven-te removido em um rotoevaporador e o resíduo foi seco sob alto vácuo.

Refluxo

A um frasco foi adicionado solvente (50 ml_) e pó de semente dePsoralea corylifolia (10 g) e a mistura foi submetida ao refluxo durante 40min. A solução depois foi filtrada e o processo de extração foi repetido maisduas vezes com solvente fresco. Os filtrados foram combinados e o solventefoi evaporado para obter um extrato seco.

Seguindo os métodos de extração acima, material de planta deamostra foi extraído com os solventes seguintes: diclorometano (DCM),EtOAc, acetona, MeOH, éter de petróleo (PE 35 a 60°C) e éter de petróleo(PE 60 a 90°C). Os extratos depois foram analisados por análise de HPLCcomo descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

<table>table see original document page 33</column></row><table>Exemplo 3. Extração em grande escala de bacuquiol das plantas Psoralea

Pó de semente de Psoralea corylifolia (2 kg) e 9 litros de éter depetróleo (pet.) (PE 60 a 90°C) foram girados em um frasco de 20 L em umrotoevaporador a 70°C em um banho de água durante uma hora. A soluçãodepois foi decantada em um recipiente separado e o solvente foi removidosob vácuo. Solvente fresco foi adicionado na biomassa e o processo de ex-tração foi repetido mais três vezes. Os extratos foram combinados e evapo-rados para produzir 335 g, de um extrato bruto (MH-258-01-01) tendo 21%de bacuquiol e 3% de psoraleno/isopsoraleno em peso.

Exemplo 4. Avaliação de vários métodos cromatoqráficos para purificar ex-tratos de bacuquiol

Vários métodos cromatográficos para purificar o extrato de sol-vente bruto (MH-206-70-1) isolado das sementes de Psoralea corylifolia u-sando o método descrito no Exemplo 2, foram avaliados para determinar opotencial para usar cromatografia em coluna como um meio de obter bacu-quiol de pureza alta isento de contaminação por furanocumarinas, particu-larmente contaminação por psoraleno/isopsoraleno. Brevemente, cada car-tucho de coluna vazio (ID de 1,3 cm e capacidade de 20 ml_, da Bio-Rad) foiempacotado com um diferente e eluído com solventes diferentes em umatentativa para separar as impurezas de furanocumarina do bacuquiol. Asfrações (10 ml_ por fração) foram coletadas em tubos de teste e analisadascom placas de TLC em sílica-gel desenvolvendo com 20% de EtOAc/éter depetróleo. Os compostos alvejados, bacuquiol, psoraleno e isopsoraleno fo-ram identificados com base em seus tempos de retenção, que foram deter-minados usando soluções padrão. Os resultados são apresentados na Tabe-la 3.Tabela 3. Sumário da separação cromatográfica em coluna de bacuquiol dasfuranocumarinas em extrato brutos de Psoralea corylifolia

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Exemplo 5. Hidrolise de um extrato de éter de petróleo isolado das sementesde Psoralea corylifolia

Um extrato de éter de petróleo (25 g; MH-258-01-01), isoladodas sementes de Psoralea corylifolia como descrito no Exemplo 3, foi mistu-rado com 500 mL de uma solução de NaOH (56,5 mM) em um frasco defundo redondo de 1 L. A solução foi submetida ao refluxo em uma manta deaquecimento durante uma hora. Uma porção pequena da solução foi tomadado frasco periodicamente e analisada por HPLC como descrito no Exemplo1. A reação foi interrompida depois da análise de HPLC e mostrou que ospicos para psoraleno e isopsoraleno desapareceram completamente. A mis-tura de reação depois foi resfriada até a temperatura ambiente para produziruma solução marrom escuro tendo um teor de sólido de aproximadamente36 mg/mL (MH-258-10-01).

A 20 mL da solução de hidrólise (MH-258-10-01) em um funilseparatorio (150 mL) foi adicionado DCM (20 mL). A mistura foi agitada du-rante 10 min e as camadas foram deixadas separar. A camada de DCM foiremovida do fundo do funil separatorio e a extração foi repetida mais umavez com 20 mL de DCM fresco. As camadas orgânicas foram combinadas, eo solvente removido por evaporação rotativa sob vácuo para produzir 118mg de uma composição (MH-258-07-01), que continha 31% de bacuquiol efoi isenta de contaminantes de furanocumarina (figura 3).

A 20 mL da solução de hidrólise (MH-258-10-01) em um funil se-paratório (150 mL) foi^adicionado éter de petróleo (20 mL). A mistura foi agita-da durante 10 min. e as camadas foram deixadas separar. A camada de éterde petróleo foi removida do topo do funil separatorio e a extração foi repetidamais uma vez com 20 mL de éter de petróleo fresco. As camadas orgânicasforam combinadas e o solvente removido por evaporação rotativa sob vácuopara produzir 136 mg de uma composição (MH-258-07-02), que continha 41%de bacuquiol e foi isenta de contaminantes de furanocumarina (figura 4).

Exemplo 6. Hidrólise de um extrato de metanol isolado das sementes dePsoralea corylifolia

Um extrato de metanol seco (MH-293-68-01), isolado das semen-tes de Psoralea corylifolia como descrito no Exemplo 2, foi misturado com 1 Lde uma solução de NaOH (44 g de NaOH em água Dl) em um béquer de 2 Lem um agitador/placa quente. A solução foi agitada enquanto em ebuliçãodurante duas horas. Água foi adicionada ao béquer conforme necessário paramanter o volume total em cerca de 1200 mL. Depois de duas horas, a soluçãofoi deixada esfriar até a temperatura ambiente, depois do tempo este que 600mL foram transferidos para um funil separatório. Éter de petróleo (250 mL) foiadicionado e a mistura foi agitada durante 10 min. e as camadas foram deixa-das separar. A camada de éter de petróleo foi removida do topo do funil sepa-ratório e a extração foi repetida (3x) com solvente fresco. Os extratos orgâni-cos foram combinados e o solvente removido por evaporação rotativa sob vá-cuo para produzir 2,25 g de uma composição (MH-293-74-01), que continha51 % de bacuquiol e foi isenta de contaminantes de furanocumarina.

Exemplo 7. Hidrólise do extrato de éter de petróleo isolado das sementes dePsoralea corylifolia seguido por purificação por cromatografia em coluna

Um extrato de éter de petróleo (25 g; MH-258-01-01), isoladodas sementes de Psoralea corylifolia como descrito no Exemplo 3, foi mistu-rado com 500 mL de uma solução de NaOH (56,5 mM) em um frasco defundo redondo de 1 L. A solução foi submetida ao refluxo durante uma hora.Uma porção pequena da solução foi tomada do frasco periodicamente e ana-lisada por HPLC como descrito no Exemplo 1. A reação foi deixada procederaté que a análise de HPLC mostrou que os picos para psoraleno e isopsora-lenp desapareceram completamente. A mistura de reação depois foi resfriadaaté a temperatura ambiente para produzir uma solução marrom escuro tendoum teor de sólido de aproximadamente 36 mg/mL (MH-258-10-01).

150 mL desta solução (MH-258-10-01) foram carregados em umacoluna CG-161cd pré preparada. A coluna pré preparada (5 x 13 cm) continha300 mL de resina CG-161cd, que foi equilibrada com 4 volumes de coluna deágua Dl. O material de carga (MH258-10-01) foi alimentado no topo da colunae eluído com 2500 mL de água Dl para levar a coluna ao pH 7, seguido por2500 mL de 70% de MeOH/água e 4500 mL de 90% de MeOH/água para eluiro bacuquiol. O eluente foi monitorado por TLC até que o bacuquiol fossecompletamente eluído da coluna. Frações contendo apenas bacuquiol (2L)foram combinadas e evaporadas sob vácuo para remover o solvente. Usandoeste método, bacuquiol altamente puro (2,3 g) (99% puro, MH-258-12-08 e -09), isento de contaminação por furanocumarina foi obtido. (Vide Figura 5).Frações de bacuquiol mais iniciais e mais tardias também foram coletadas,combinadas e evaporadas sob vácuo. Destas frações, uma composição (MH-258-12-07 e -10) foi obtida em uma quantidade de 2,4 gramas, que continha70% de bacuquiol isento de contaminação por furanocumarina. A capacidadede carga da coluna CG-161cd foi estimada como 400 ml_ da solução de hidró-lise bruta por litro de resina CG-161cd. Depois da separação, a coluna CG-161 cd foi recuperada por lavagem com Clorox seguido com MeOH e 4 volu-mes de coluna de água Dl. Ela pode ser reutilizada durante vários anos.

Exemplo 8. Inibição de COX-1 e COX-2 por bacuquiol purificado

De modo a triar quanto aos compostos que inibiram a atividadede COX-1 e COX-2, um ensaio in vitro, de produção alta foi desenvolvidoque utilizou a inibição da atividade de peroxidase de ambas as enzimas.(Needleman et ai (1986) Annu Rev Biochem. 55:69). Brevemente, a compo-sição ou composto examinado foi titulado contra uma quantidade fixa de en-zimas COX-1 e COX-2. Um cromóforo de peróxido, clivável foi incluído noensaio para visualizar a atividade de peroxidase de cada enzima na presen-ça de ácido araquidônico como um cofator. Tipicamente, ensaios foram rea-lizados em um formato de 96 cavidades. Cada inibidor, tomado de uma solu-ção de estoque de 10 mg/mL em 100% de DMSO, foi testado em triplicatana temperatura ambiente usando a faixa seguinte de concentrações: 0, 0,1,1,5, 10, 20, 50, 100, e 500 ug/mL A cada cavidade, 150 |iL de 100 mM deTris-HCI, pH 7,5 foram adicionados junto com 10 jiL de 22 \M de Hematinadiluído em tampão de tris, 10 jiL de inibidor diluído em DMSO e 25 unidadesda enzima COX-1 ou COX-2. Os componentes foram misturados durante 10segundos em uma plataforma rotativa, seguido pela adição de 20 \iL de 2mM de dicloridrato de N,N,NN-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) e 20 jllLde 1,1 mM de ácido araquidônico para iniciar a reação. A placa foi agitadadurante 10 segundos e depois incubada 5 minutos antes da leitura da absor-bância em 570 mm. A concentração do inibidor vs. % de inibição foi plotadae a IC5o determinada tomando-se o ponto quase-máximo ao longo do iso-terma e cruzando a concentração no eixo X. A IC50 depois foi normalizadaao número de unidades de enzima no ensaio. Uma amostra de bacuquiol depureza alta (99%) (MH-258-08 foi testada quanto à inibição tanto de COX-1quanto de COX-2. Os resultados são resumidos na Tabela 4 seguinte.

Tabela 4. Inibicão de atividade de COX por bacuquiol Nome do Composto COX-1 (IC50) COX-2 (IC50)

MH-258-08 (99% de bacuquiol) 2,34 |iM 5,78 |iM

Exemplo 9. Inibição de 5-lipoxiqenase por bacuquiol purificado (MH-258-12-08)

Como observado acima, um dos caminhos mais importantes en-volvidos na resposta inflamatória é produzido por lipoxigenases não heme,contendo ferro (5-LOX, 12-LOX, e 15-LOX), que catalisam a oxidação deácidos graxos tais como AA para produzir os hidroperóxidos 5-, 12- e 15-HPETE, que depois são convertidos a leucotrienos. Um Ensaio de Inibiçãode Lipoxigenase foi realizado usando um método publicado (Carter et al.(1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 256(3):929-937, Safayhi et al. (2000) PlantaMedica. 66:110-113). 5-LOX foi isolada de células PBML humanas e ácidoaraquidônico foi utilizado como um substrato. O artigo de teste e controlepositivo foram dissolvidos em 1% de DMSO. HBSS (solução de sal balance-ada de Hank) foi usada como o tampão de incubação. O tempo de pré-incubação foi de 15 minutos a 37°C, seguido por 15 min. De incubação namesma temperatura. Este ensaio detecta a formação de LTB4 com quantifi-cação de EIA. Bacuquiol altamente puro (99% de bacuquiol, NQ MH258-12-08) foi testado em duplicata em concentrações de 10 |iM, 1 |iM, 0,1 |iM, e 10nM em relação a um controle positivo -NDGA em cinco concentrações. Acurva de resposta de dose é ilustrada na Figura 6. A IC50 para inibição de 5-LOX por bacuquiol (99% puro) foi de 3,41 |xM.

Exemplo 10. Atividade antimicrobiana de bacuquiol purificado

A atividade antimicrobiana de uma amostra de bacuquiol alta-mente puro (99% puro; N9 MH-258-12-08) foi avaliada usando métodos pu-blicados (Modugno et al. (1994) Antimicrobial Agents & Chemoterapy38:2362-2368; Misiek et al. (1973) Antimicrobial Agents & Chemoterapy3:40-48). Brevemente, Staphylococcus epidermidis (Gram Positivo, ATCC12228) foi cultivado durante 20 horas a 37°C em meio Caldo Mueller-Hinton.Propionibacteriuin acnes (ATCC 6919) foi cultivado durante 2 dias a 37°Cem meio Reinforced Clostridial. O artigo de teste e controle positivo foramdissolvidos em 1% de DMSO com um volume de incubação de 1 mL O tempo de avaliação foi de 1 dia. A medição da turvação foi usada como o méto-do de quantificação. Uma amostra de bacuquiol altamente puro (99%; NeMH-258-12-08) foi testada em duplicata em concentrações de 100 ug/mL, 30ug/mL, 10 ug/mL, 3 ug/mL, 1 ug/mL, 0,3 ug/mL, 0,1 ug/mL e 0,03 ug/mL emrelação aos controles positivos - gentamicina em 0,1 ug/mL para Staphylo-coccus epidermidis e ampicilina em 0,1 ug/mL para Propionibacterium ac-nes, respectivamente. A inibição significante foi exibida por bacuquiol em 1ug/ml tanto contra Staphylococcus epidermidis quanto Propionibacteriumacnes. A amostra altamente pura de bacuquiol também inibiu a atividade deTrichophyton mentagrophytes (ATCC 9533) em uma concentração moderada de 30 ug/mL. Finalmente, nenhuma inibição foi observada para Epider-mophyton floccosum (ATCC 18397), Microsporum canis (ATCC 36299) ePhyrosporum ovale (ATCC 38593).

Exemplo 11. Avaliação de toxicidade aguda de bacuquiol purificado

Os estudos de Toxicidade Aguda foram concluídos testando doisníveis de pureza de bacuquiol (UP256) (uma amostra que foi aproximada-mente 20% pura e uma amostra que foi 99% pura). Quarenta camundongosICR fêmeas (Harlan) de 4 a 5 semanas de idade foram usados para o estudode 14 dias. Os camundongos foram administrados com 100 mL da doseaguda diariamente, aproximadamente 2 g/kg em peso por artigo de teste pordia. Os primeiros 10 camundongos receberam a composição contendo20,7% de bacuquiol, enquanto o segundo grupo de 10 camundongos rece-beu uma composição contendo 99% de bacuquiol. A composição de UP256foi colocada em suspensão em água e administrada através de uma seringa.Vinte camundongos foram administrados com água, como o grupo de con-trole. Os pesos de todos os camundongos foram medidos, incluindo valor dereferência, 3 pontos médios, e um ponto final. Também, o consumo de ali-mento e água foi observado para todos os grupos. Quaisquer condições desaúde ou comportamento anormais foram registrados no período de duassemanas. Uma necropsia de todos os camundongos foi concluída no dia 14e o sangue de todos os grupos foi coletado para uma triagem sangüíneacompleta. Dois camundongos selecionados aleatoriamente de cada um dosgrupos também tiveram tecidos do rim e fígado removidos para Histopatolo-gia. Todo o exame de sangue e exame patológico foram concluídos atravésda Antech Diagnostics.

O peso médio calculado para todos os grupos, incluindo contro-les, continuou a aumentar durante o período de estudo de duas semanas.

Nenhum camundongo mostrou uma diminuição no peso, e o consumo dealimento/água permaneceu o mesmo para todos os grupos. A agressão diri-gida ao investigador (isto é mordida) e dirigida um ao outro (isto é briga nagaiola) foi a única diferença significante no comportamento entre os camun-dongos tratados comparados aos camundongos de controle. Este é umcomportamento que seria esperado nos camundongos que recebem andro-gênio, um hormônio masculino. A necropsia de todos os camundongos nãomostrou anormalidades ou mudanças brutas em nenhum órgão. O exame desangue mostrou que os grupos tratados estavam normais em relação aoscontroles. Os níveis de proteína, enzima, e íon estavam dentro de valoresnormais para camundongos ICR. Os tecidos do rim e fígado foram enviadospara Histopatologia para avaliar quaisquer mudanças pequenas nos órgãose o relatório estabeleceu que mudanças significantes não estavam presentesno rim e os núcleos de hepatócito para o fígado estavam dentro dos limitesnormais para camundongos. Não existiu nenhuma inflamação ou evidênciasubstancial de neoplasia na seção de tecido examinada.

Em conclusão, todos os pesos, exame de sangue, e dados histo-lógicos, foram os mesmos para os camundongos tratados em relação aogrupo de controle. Nenhum efeito adverso foi observado no estudo de qua-torze dias para qualquer amostra de UP256. Portanto, pode ser concluídoque UP256 em ambos os níveis de pureza (20% e 99% de pureza) tem umperfil de segurança sólido.

Claims

1. Composição compreendida de bacuquiol, que é substancial-mente isenta de impurezas de furanocumarina.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o ditobacuquiol é isolado de uma planta.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a ditaplanta é selecionada do gênero Psoralea de plantas.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a ditaplanta é selecionada de Psoralea corylifolia L (Luguminosae) ou Psoraleaglandulosa L. (Papilionaceae).

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a ditacomposição é isolada de uma parte da planta selecionada de sementes,caules, casca, ramos, tubérculos, raízes, casca de raiz, brotos jovens, rizo-mas, flores e outros órgãos reprodutivos, folhas e outras partes aéreas e aplanta inteira.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a quan-tidade de bacuquiol na dita composição está na faixa de cerca de 27% e100% em peso.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que a quan-tidade de bacuquiol na dita composição é de pelo menos 30%.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que as di-tas furanocumarinas são selecionadas de psoraleno e isopsoraleno.

9. Método para a preparação de uma composição compreen-dendo bacuquiol que é substancialmente isenta de impurezas de furanocu-marina, o dito método compreendendo as etapas de:a) extrair uma planta contendo bacuquiol com um solvente orgâ-nico;b) tratar o extrato orgânico obtido na etapa a) com uma base; ec) purificar a mistura para obter uma composição de bacuquiolque é isenta das ditas impurezas.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o dito mé-todo de purificação é selecionado do grupo consistindo em cromatografia emcoluna, extração seguida por cristalização, partição de solvente, recristaliza-ção e combinações dos mesmos.

11. Método para prevenir e tratar doenças e condições mediadaspor ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX) da pele, dentes, boca ougengiva o dito método compreendendo administrar a um hospedeiro em ne-cessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêu-tica compreendida de bacuquiol que é substancialmente isenta de impurezasde furanocumarina.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a quanti-dade de bacuquiol na dita composição está na faixa de 27% to 100% empeso.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que as ditasdoenças e condições mediadas por COX e LOX da pele são selecionadas dogrupo consistindo, em queimadura de sol, queimaduras térmicas, acne, cas-pa, ferimentos tópicos, condições inflamatórias secundárias causadas porinfecções fúngicas, microbianas e virais, vitiligo, lúpus eritematoso sistêmico,psoríase, carcinoma, melanoma, assim como outros cânceres de pele emmamíferos, dano à pele que resulta da exposição à radiação ultravioleta(UV), produtos químicos, calor, vento e ambientes secos, rugas, pele flácida,linhas de expressão e olheiras, dermatite e outras condições relacionadas àalergia da pele.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, em que as doen-ças e condições da boca, gengiva e dentes são selecionadas do grupo con-sistindo em doenças periodontais, condições pré cancerosas orais, cânceresorais, e outras malignidades orais, gengiva e dentes sensíveis, seqüelas,pulpites, irritação, dor e inflamação causadas pela implantação física de den-taduras orais, trauma, lesões, bruxismo e outros ferimentos secundários naboca, na gengiva ou na língua, placa e cálculo dentais, descalcificação dosdentes, proteólise e cárie.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, em que as vias daadministração são selecionadas do grupo consistindo em administração tó-pica, por aerossol, supositório, intradérmica, intramuscular, e intravenosa.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a via daadministração é tópica.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a compo-sição é administrada usando uma gaze não aderente, uma bandagem, umcotonete, uma toalha de pano, um emplastro, uma máscara, um limpador,um anti-séptico, uma solução, um creme, uma loção, um ungüento, um gelou uma emulsão, um líquido, uma pasta, um sabão, ou um pó.

18. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a compo-sição farmacêutica é compreendida ainda de um excipiente convencionalque é farmacêutica, dermatológica e cosmeticamente adequado para a apli-cação tópica e opcionalmente um adjuvante, e/ou um veículo, e/ou um veí-culo de liberação regular ou controlada.

19. Método para a prevenção e tratamento de outras doenças econdições mediadas por COX e LOX, selecionadas do grupo consistindo emdor e rigidez da articulação geral, carência de mobilidade e perda da funçãofísica devido a condições patológicas de osteoartrite e artrite reumatóide,eólicas menstruais, arteriosclerose, obesidade, diabete, doença de Alzhei-mer, reação alérgica respiratória, insuficiência venosa crônica, psoríase, ce-faléia tensional crônica, cefaleias do tipo enxaqueca, doença inflamatóriaintestinal, câncer de próstata e outros tumores sólidos, o dito método com-preendendo administrar a um hospedeiro em necessidade deste uma quan-tidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendida de bacuquiolque é substancialmente isenta de impurezas de furanocumarina.

20. Método para prevenir e tratar doenças e condições da pele,boca, dentes ou gengiva mediadas por infecções microbianas, o dito métodocompreendendo administrar a um hospedeiro em necessidade do mesmouma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendida debacuquiol que é substancialmente isenta de impurezas de furanocumarina.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a dita in-fecção microbiana é selecionada do grupo consistindo em uma infecção bac-teriana, uma infecção viral ou uma infecção fúngica.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que as ditasbactérias são selecionadas de Propionibacterium acnes ou Staphylococcusepidermidis.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a ditacondição da pele, boca, dentes, ou gengiva é selecionada do grupo consis-tindo em caspa, acne, pé-de-atleta, ferimentos tópicos, doenças periodon-tais, selecionadas do grupo consistindo em cárie, gengivite, periodontite,pulpites, condições periodontais causadas pela implantação física de denta-duras orais, trauma, lesões, bruxismo, neoplasia e outros processos degene-rativos; matéria branca, películas, placas, cálculo e manchas dentais.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, em que as vias daadministração são selecionadas do grupo consistindo em administração tó-pica, por aerossol, supositório, intradérmica, intramuscular, e intravenosa.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a via daadministração é tópica.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a compo-sição é administrada usando uma gaze não aderente, uma bandagem, umcotonete, uma toalha de pano, um emplastro, uma máscara, um limpador,um anti-séptico, uma solução, um creme, uma loção, um ungüento, um gelou uma emulsão, um líquido, uma pasta, um sabão, ou um pó.

27. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a compo-sição farmacêutica é compreendida ainda de um excipiente convencionalque é farmacêutica, dermatológica e cosmeticamente adequado para a apli-cação tópica e opcionalmente um adjuvante, e/ou um veículo, e/ou um veí-culo de liberação regular ou controlada.