BRPI0509828B1 - Composição de estimulação da resposta imune compreendendo nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido - Google Patents

Composição de estimulação da resposta imune compreendendo nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido Download PDF

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Carlos Gamazo De La Rasilla
Maria Luisa Sanz Larruga
Marta Ferrer Puga
Beatriz SAN ROMÁN ABERASTURI
Hesham H. A. Salman
Sara Gómez Martínez
Javier Ochoa Repáraz
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Abstract

COMPOSIÇÃO DE ESTIMULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE COMPREENDENDO NANOPARTÍCULAS COM BASE EM ÉTER MALEICO VINIL METIL E COPOLÍMERO ANIDRIDO, compreende uma composição para a estimulação de uma resposta imune em um indivíduo compreende nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido. As referidas nanopartículas podem ainda conter um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante, o que pode estar contido na parte interna das referidas nanopartículas e/ou, pelo menos de forma parcial, revestir a superfície das referidas nanopartículas, e opcionalmente um agente de ligação cruzada. A composição para a estimulação de uma resposta imune é útil como um adjuvante na imunoterapia e nas vacinas.

Description

A presente patente de privilégio de invenção relaciona-se com o uso de nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido, opcionalmente contendo um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante, como adjuvantes em imunoterapias e vacinas. A invenção também se relaciona a composições que estimulam a resposta imune compreendendo as referidas nanopartículas.
Como se sabe, há antígenos altamente imunogênicos que são capazes de induzir a respostas imunes de proteção em um indivíduo, ao passo que há outros antígenos que não induzem à referida resposta de proteção ou que induzem a uma resposta imune muito fraca. Geralmente, a resposta imune do hospedeiro a um antígeno fracamente imunogênico pode ser estimulada por intermédio da administração conjunta de um adjuvante.
Adj uvantes
Um adjuvante é qualquer substância que aumenta a resposta imune a um antígeno com o qual ela é misturada. Os adjuvantes agem principalmente por intermédio de três mecanismos: i) formando um depósito de antígeno ou de alérgeno no local da aplicação da vacina a partir do que o produto biologicamente ativo será liberado durante um período de tempo variável; ii) fornecendo o antígeno ou alérgeno às células que apresentam o antígeno; e iii) induzindo à secreção de interleucina.
Alguns exemplos clássicos de adjuvantes são os seguintes: sais de alumínio (Al-hidrogel) e catecolaminas, (que melhoram uma resposta de Th2), e o lipopolissacarídeo de bactérias gram-negativas e determinadas seqüências de CpG (as quais melhoram a Resposta de Thl) . Por outro lado, numerosos estudos demonstram que determinados vetores não biológicos, tais como as micropartículas (partículas esféricas de natureza polimérica que revestem uma substância) ou lipossomos (vesículas esféricas com uma cavidade central aquosa revestida por um número variável de filmes bimoleculares de fosfolipídios e colesterol) também podem agir como adjuvantes [Eldridge et al. , Infect Immun, 59 (1991) 2978-2986; 0'Hagan et al. , Vaccine, 18 (2000) 1793-1801; Murillo et al., Vaccine, 30 (2001) 4099-4106] .
Um outro tipo de vetores não biológicos que podem ser considerados para seu uso como adjuvantes são os sistemas coloidais de partículas sólidas como menos de um micrômetro em tamanho, também denominados nanopartículas, as quais são subdivididas em nanosferas de matriz e nanocápsulas vesiculares [Orecchioni e Irache, Formes pharmaceutiques pour application locale. Lavoisier Tech e Doc., Paris, (1996) 441-457], Nanocápsulas são sistemas vesiculares formados por uma cavidade interna que é circundada por uma membrana ou parede de polímero. Nanosferas são formas de matriz, formadas por uma rede de polímeros tridimensionais. Em ambos os casos, as moléculasda substância biologicamente ativa podem ser dissolvidas, presas ou ligadas à estrutura macromolecular (nas nanosferas) ou encapsuladas pela membrana do polímero (nas nanocápsulas), e isso pode ainda ser absorvido na superfície da nanopartícuia.
A distribuição de nanopartículas no organismo é, em geral, dependente de suas características físico-químicas (principalmente as propriedades de tamanho e de superfície) que determinam sua interação com o meio biológico. Portanto, são formas farmacêuticas que são particularmente interessantes como adjuvantes de imunoterapia ou vacina para a administração de antígenos e/ou alérgenos.
Em geral, os potenciais mais importantes providos por estes vetores de origem não biológica são os seguintes [Couvreur & Puisieux. Adv. Drug Del. Rev., 10 (1993) 141-162]: (i) eles protegem o material encapsulado de inativação química, enzimática ou imunológica no local de ação e na administração; (ii) eles melhoram o transporte da molécula ativa biologicamente a localidades difíceis de serem alcançadas e sua penetração na célula; (iii) eles prolongam o tempo de residência da droga no organismo e controlam sua liberação; (iv) eles aumentam a especificidade da ação por intermédio de concentração seletiva, efetiva e regular do material encapsulado no alvo celular e/ou molecular; e (v) eles aumentam a estabilidade do material que eles incorporaram durante a fabricação, o transporte e o armazenamento do produto medicinal.
Uso dos Adjuvantes na Vacinação
O uso dos adjuvantes da partícula na forma de emulsões, micropartículas, ISCOMS ou lipossomos foi anteriormente avaliado por diversos grupos de investigação [revisão: Singh et al. , Int J Parasitology 33 (2003) 469-478].
A captura de antígeno por "células que apresentam antígenos" aumenta quando estes antígenos são associados a partículas poliméricas ou são nestes incluídos. Poliésteres biodegradáveis e biocompatíveis foram utilizados em humanos e animais durante muitos anos como sistemas de liberação de antígeno de forma controlada [Okada et al. , J Pharm Sei, 12 (1995) 1-99; Putney et al., Nat Biotechnol, 16 (1998) 153-157]. Ao contrário de adjuvantes de alumínio, as micropartículas são eficazes na indução de respostas imunes celulares e citotóxicas em camundongos [Nixon et al., Vaccine 14 (1996) 1523-1530; Maloy et al . , Immunology 81(1994) 661-667; Moore et al. , Vaccine 13 (1995) 1741-1749]. Imunização oral com micropartículas em camundongos induz a potentes respostas imunes no nível sistêmico e da mucosa, em comparação com os antígenos encapsulados [Chalacombe et al., Immunology 176 (1992) 164-168; Eldridge et al., J Control Rei 11 (1990) 205-214; 0'Hagan et al., Novel Delivery
Systems for Oral Vaccines (1994) 175-205] . Esta habilidade é o resultado desta internalização por células especializadas do tecido linfóide associado à mucosa [O'Hagan, J Anat, 189 (1996) 477-482] . A imunização da mucosa com diferentessistemas particulados demonstrou sua eficácia contra patógenos diferentes, tais como Bordetella pertussis [Chaill et al., Vaccine 13 (1995) 455-462; Jones et al., Vaccine 15(1997) 814-817; Shahin et al., Infect Immun, 63 (1995) 1195-1200; Conway et al. , Vaccine 19 (2001) 1940-1950] , Chlamidia trachomatis [Whit turn-Hudson et al., Nat Med 2 (1996) 1116-1121], Salmonella
Typhimurium [Allaoui-Attarki et al., Infect Immun 65 (1997) 853-857] e Brucella [Murillo et al., Vaccine, 19 (2001) 4099-4106].
Uso dos Adjuvantes em Imunoterapia
Doenças alérgicas são uma patologia emergente causada por uma resposta imune adversa (reação de hipersensibilidade) a macromoléculas intrisicamente inócuas, denominadas alérgenos. Esta hipersensibilidade afeta cerca de 30% da população no mundo todo, principalmente em países industrializados. Esta é a causa de doenças como, por exemplo, a rinite alérgica, asma extrínseca, alergias por alimentos e alergias a drogas e a insetos [Settipane et al . , Allergy Proc, 15 (1994) 21-25].
Na Espanha, a prevalência deste tipo de doenças na população de 4 a 17 anos de idade é de 13,3%; entre elas, 6,4% aparecem como asma bronquial, com a taxa de mortalidade devido à asma na Espanha sendo de 1,5/100.000 habitantes.
A teoria mecanística da causa de doenças alérgicas argumenta que elas ocorrem devido a um equilíbrio alterado entre os dois tipos fundamentais de respostas que podem ser geradas depois da ativação das células auxiliares T: Thl e Th2. Citocinas presentes no meio do lado de fora da célula afetam de um modo determinante a diferenciação de células T imaturas (ThO), de forma tal que a presença de interleucina 12 (IL-12), interferon gama (IFN- y) , interleucina 18 (IL-18) e interferon alfa (IFN-α),induze à diferenciação em direção à Thl, o que principalmente será caracterizado pela produção de grandes quantidades de IFN-y, e, em um grau menor, de interleucina 2 (IL-2) e interferon beta (IFN-β). A subseqüente estimulação de células B neste tipo de resposta aumentará a produção de IgG2a, IgG2b e IgG3. Por outro lado, caso a célula ThO esteja em um ambiente no qual a interleucina 4 (IL-4) e prostaglandina E2 (PGE2) forem predominantes, a diferenciação em direção à Th2 será induzida, sendo caracterizada pela síntese de grandes quantidades de IL-4, interleucina 5 (IL-5) e interleucina 13 (IL-13) , e pela síntese de IgGl e IgE, um biótipo diretamente envolvido no processo de desencadeamento [Hannah et al., Ann Rev Immunol, 21 (2003) 579-628].
A importância da predominância de Th2, uma resposta do tipo específico alergênico em doenças alérgicas foi corroborada por um grande número de estudos [Romagnani, Ann Rev Immunol, 12 (1994) 227; Bousquet et al., Allergy, 53 (1998) 1-42; Majori et al., Clin Exp Allergy, 30 (2000) 341-347], Foi demonstrado tanto em modelos de animais como no homem, que as células com um fenótipo de Th2 são as únicas células capazes de reconhecerem diretamente peptídeos alergênicos e participarem na produção de IgE por células B, ativação e produção de mastócito, assim como a maturação e a ativação de eosinófilos [Cohn et al. , Pharmacology e Therapeutics, 88 (2000) 187-196].
Portanto, a predominânciafuncional de células de Th2 sobre células de Thl levaria à resposta alérgica, ao passo que a predominância funcional de células de Thl sobre células de Th2 a inibiria [Martin et 5 al., Alergol Inmunol Clin, 17 (2002) 104-110].
Outros estudos reivindicam que a inibição de uma predominância de resposta de Th2 com Thl poderia levar ao desenvolvimento de doenças auto-imunes, de forma que seria mais correto melhorar uma regulagem 10 imune do equilíbrio de Thl e Th2 por meio do aumento da população de células T reguladoras (Tr) e IL-10, e fator β de crescimento da célula T (TGF-β). Isso levaria à síntese de anticorpos IgG4 e IgA (mediadores de resposta não inflamatória) e à supressão de produção de IgE por células B 15 [Akdis et al., Immunology, 103 (2001) 131-136; Akdis et al.,J Clin Invest, 102 (1998) 98-106; Blaser et al. , Int Arch
Allergy Immunol, 117 (1998) 1-10]. Estudos recentesreafirmam a importância de IL-10 na inativação da célula Th2 (Grunig et al. , J Exp Med, 185 (1997) 1089-1099; Adachi et 20 al. , Int Arch Allergy Immunol, 118 (1999) 391-394], e até mesmo foi descoberto que a administração in vivo de IL-10 tem conseqüências benéficas em animais alérgicos [Zuany- Amorim et al. , J Clin Invest, 95 (1995) 2644-2651; Stampfli et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Hall 25 et al., Vaccine, 21 (2003) 549-561]. Isso permite asuposição de que IL-10 desempenha um importante papel regulador na característica de hiperreatividade da célulaTh2 em pacientes alérgicos.
O IL-10 pode ter importantes implicações fisiopatológicas com relação a doenças inflamatórias de contra-ação (doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, etc.), determinadas infecções virais(hepatite C, infecções induzidas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), etc.), ou até mesmo inibindo efeitos colaterais no transplante de órgãos. Portanto, a aplicação direta de IL-10, ou ainda o uso de adjuvantes que estimulam a produção de IL-10, poderia ter um imenso impacto 10 sobre o tratamento destas doenças [Asadullah et al. ,
Pharmacol Rev, 55, (2003) 241-269]. Está atualmente sendoestudado como possível tratamento para doenças auto-imunes, tais como a artrite reumatóide [Feldman et al. , Annu Rev Immunol (1996) 397-440; Katsikis et al. , J Exp Med (1994) 15 1517-1527; Chomarat et al. , J Immunol (1995) 1432-1439], 0papel antiinflamatório e regulador da citocina, portanto, torna-se essencial tanto nas respostas excessivas de Thl (doenças auto-imunes) e Th2 (alergia).
O tratamento de doençasalérgicas pode, essencialmente, ser abordado de três diferentes maneiras: (i) evitar todo contato com o alérgeno;(ii) usar drogas ant ihistamínicas, e (iii) por meio de imunoterapia. Mantendo a idéia na mente de que as duas primeiras medidas são ocasionalmente não aplicáveis, a 25 imunoterapia seria o método de controle mais adequado.
Imunoterapia específica com alérgenos foi definida como a administração repetida de alérgenos aos pacientes com distúrbios de saúde mediados por
IgE para os propósitos de prover proteção contra sintomas alérgicos e reações inflamatórias associadas à exposição natural a estes alérgenos [Jutel, M., J Inmunol, 154 (1995) 4178-4194].
Este tratamento alternativotem como meta a melhoria da predominância funcional da resposta de Thl no que se refere à resposta de Th2, a qual inibirá a sintomatologia alérgica. Esta modulação em direção à Thl também é aplicável em outros processos tais como 10 controle por meio de vacinação contra parasitas intracelulares bacterianos (tais como Brucella e Salmonella).
Embora o uso de diferentes vetores não biológicos, como, por exemplo, nanopartículas, 15 como adjuvantes na imunoterapia ou em vacinas para a administração de antígenos e/ou alérgenos tenha sido descrito, há ainda uma necessidade de prover adjuvantes alternativos àqueles atualmente existentes para ospropósitos de aumentar o arsenal de possibilidades para 20 fabricação de vacinas e composições para a imunoterapia. De forma vantajosa, os referidos adjuvantes devem ser úteis para serem utilizados na imunização ou imunoterapia por meio de administração via oral sem a necessidade de uso de doses muito altas de alérgeno e antígeno. Conforme se sabe, a 25 despeito de suas vantagens em potencial, a imunização oral para propósitos terapêuticos ou profiláticos deve confrontar diversos obstáculos, visto que a dose do princípio ativoimunogênico ou alergênico requerida para um efeito clínico benéfico é extremamente alta devido a uma perda de potência imunogênica. Portanto, geralmente devido à poucaestabilidade do alérgeno ou do antígeno no tratogastrintestinal (condições de pH e presença de enzimas 5 hidrolíticas), as doses devem sempre ser muito mais altas (até 200 vezes mais altas) do que aquelas normalmente utilizadas de forma subcutânea [Taudorf et al., J Allergy Clin Immunol (1987) 153-161; Creticos et al . , J Allergy Clin Immunol (1990) 165]. Além do mais, a mucosa gastrintestinal 10 age como uma barreira um tanto quanto impermeável contra a absorção destas macromoléculas.
Surpreendentemente, foi agora descoberto que aquelas nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido, opcionalmente 15 contendo um alérgeno ou antígeno e/ou um agente imunoestimulante, têm a capacidade de estimularem ou aumentarem a resposta imune quando são administradas a um indivíduo, o que permite seu uso em imunoterapias e vacinas. As referidas nanopartículas são estáveis na administração 20 oral, têm boas características bioadesivas e podem, portanto, ser utilizadas na imunização ou na imunoterapia através de diferentes vias de administração, incluindo a via oral, sem necessidade de utilização de tais altas doses de alérgeno ou de antígeno, como aquelas mencionadas no estado 25 da arte. Além do mais, as referidas nanopartículas têm baixa toxicidade, são biodegradáveis e fáceis de serem produzidas. Nanopartículas de copolímero anidrido e metil vinil étermaleico
O pedido de patente WO 02/069938, o qual pertence ao mesmo requerente, revela nanopartícuias de copolímero anidrido e metil vinil éter maleico (PVM/MA) , um processo para sua obtenção e seu uso 5 como carreadoras de drogas. O referido copolímero de PVM/MA consiste, estruturalmente, em dois grupos funcionais diferenciados que têm diferentes características desolubilidade: um grupo de éster hidrofóbico e um grupo anidroso. 0 grupo carboxílico é um agente solubilizante, 10 visto que tende a dissolver o polímero quando este é ionizado, e o grupo do éster é hidrofóbico, visto que retarda a penetração de água no polímero [Heller et al. , J Appl Polym Sei, 22 (1978) 1991-2009]. Copolímeros sintéticos de PVM/MA têm aplicações muito diferentes. Gantrez® AN é 15 amplamente utilizado como um elemento de aumento na espessura e agente de criação de flóculos, adesivo dental, excipiente em comprimidos de administração via oral, excipiente em patches transdérmicos, etc. Por outro lado, o uso destes copolímeros para liberação controlada de drogas 20 foi revelado [Heller et al. , J Appl Polym Sei, 22 (1978)1991-2009] e, em formas de matriz, para a liberação tópica de drogas no olho [Finne et al. , J Pharm Sei, 80 (1991) 670- 673; Finne et al., Int J Pharm, 78 (1992) 237-241].Nanopartículas com base emPVM/MA têm características bioadesivas [Arbós et al. , Int JPharm, (2002) 129-136] de forma que, quando sãoadministradas por via oral, elas podem interagir com ospatches Peyer, que contêm 20% de todos os linfócitos do organismo, e desencadeiam uma resposta imune ampliada no que se refere àqueles antígenos e/ou alérgenos administrados em solução aquosa.Nanopartículas com base emPVM/MA são sistemas coloidais que são capazes de reterem substâncias ativas biologicamente por meio do seguinte: (i) solução ou aprisionamento dentro da estrutura macromolecular ou matriz, (ii) ligação covalente da droga com os grupos de anidrido de copolímero e (iii) adsorção de processosmediados por ligações fracas. A extrema reatividade do copolímero de PVM/MA, devido aos grupos do ciclo anidrido, também contribui com sua habilidade de prender moléculas, drogas ou outras substâncias. O pedido de patente WO 02/069938 revela o uso do referido copolímero denanopartículas de PVM/MA como carreadoras para drogas, especialmente 5-fluouridina, ganciclovir e oglionucleotídeo anti-senso ISIS 2922.
O objeto da presente invenção é o de prover uma resposta imune que estimula a composiçãoem um indivíduo útil como um adjuvante em imunoterapia e vacinas, estável quando administrada por via oral, que tem boas características bioadesivas para sua interação com mucosas, capaz de transportar opcionalmente um alérgeno ou antígeno e/ou um agente imunoestimulante e deliberar os referidos produtos de uma maneira controlada, e portanto útil em imunização ou imunoterapia por diferentes vias de administração, inclusive por viaoral.
De forma surpreendente, foi agora descoberto que as nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido, opcionalmente contendo um alérgeno ou antígeno e/ou um agenteimunoestimulante, o qual tem a habilidade de estimular ou melhorar a resposta imune quando são administradas a um indivíduo, o que permite seu uso em imunoterapia e vacinas. Foi particularmente descoberto que as referidas nanopartículas são fáceis de serem produzidas, têm boas 10 características bioadesivas, têm toxicidade baixa e são biodegradáveis (ou seja, elas dissolvem-se ou degradam-se em um período de tempo que é aceitável para a aplicação desejada, neste caso, terapia in vivo, logo que são expostas a uma solução fisiológica de pH 6-9 e uma temperatura 15 compreendida entre 25°C e 40°C).
Portanto, em um aspecto, a invenção relaciona-se a uma resposta imune que estimula a composição compreendendo nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido. As referidas 20 nanopartículas podem ainda conter um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante, o qual pode estar contido no interior das referidas nanopartículas e/ou pelo menos parcialmente revestindo a superfície das referidas nanopartículas. Se 25 assim for desejado, os referidos caminhos metabólicos também podem conter um agente de ligação cruzada. A referida composição pode opcionalmente estar em formaliofilizada.
Em um outro aspecto, a invenção relaciona-se à vacina ou composição de imunoterapia compreendendo a referida resposta imune que estimula a composição. Em uma configuração em particular, a referida 5 vacina ou composição de imunoterapia é uma formulação adequada para administração oral, ao passo em que uma outra configuração em particular, a referida vacina ou composição de imunoterapia é uma formulação adequada for administração parenteral.Em um outro aspecto, ainvenção relaciona-se ao uso da referida resposta imune que estimula a composição na fabricação da vacina ou composição de imunoterapia.
Em um outro aspecto, a 15 invenção relaciona-se ao uso da referida resposta imune que estimula a composição na fabricação de uma composição farmacêutica para a estimulação seletiva da resposta imune Thl, ou na fabricação da composição farmacêutica para a estimulação seletiva da resposta imune Th2, ou na fabricação 20 da composição farmacêutica para o estímulo balanceado das respostas imunes Thl e Th2.
Em um outro aspecto, a invenção relaciona-se a um processo para a produção de uma resposta imune que estimula a composição compreendendo as 25 referidas nanopartículas com base em PVM/MA e um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante compreendendo a adição do referido alérgeno ou antígeno e/ou agenteimunoestimulante a uma solução orgânica compreendendo o referido copolímero de PVM/MA antes da realização da dissolução com uma solução hidroalcóolica, ou, de forma alternativa, incubando o referido alérgeno ou o referido antígeno e/ou com o referido agente imunoestimulante com asreferidas nanopartículas de PVM/MA. O referido processo pode ainda compreender a eliminação de solvente orgânico adicional e/ou etapas de purificação, assim como etapas paraestabilizar as nanopartículas obtidas por meio do uso de agentes de ligação cruzada. 0 referido processo pode 10 opcionalmente compreender uma etapa de liofilização adicional.a figura 1 mostra um gráfico que representa a ovalbumina liberada (%) a partir das formulações NP-I, NP- II, NP-III e NP-IV com o passar do tempo (dias);a figura 2 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgGl,IgG2a) após a imunização intradérmica de camundongos Balb/c com uma solução sem ovalbumina (OVA) , a ovalbumina é adsorbida em ali-hidrogel (OVA-Alum), e nanopartículas vazias (NP), NP-I, NP-11, NP-III e NP-IV com o passar do tempo;a figura 3 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgGl,IgG2a) depois de imunização por via oral decamundongos Balb/c com uma solução semovalbumina (OVA), e nanopartículas vazias (NP), NP-I, NP-II, NP-III e NP-IV com o passar do tempo; a figura 4 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgGl, IgG2a) depois de imunização por via oral de camundongos Balb/c com doses encapsuladas diferentes de ovalbumina (NP-III25 e NP-III50) e nanopartículas vazias (NP) com o passar do tempo;a figura 5 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgGl) após a imunização intradérmica de camundongos Balb/c com uma solução ovalbumina (OVA), a ovalbumina é adsorbida em ali-hidrogel (OVA- Alum), e nanopartículas vazias (NP), NP-I, NP- III, NP-V, NP-VI e NP-VII com o passar do tempo;a figura 6 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgG2a) após a imunização intradérmica de camundongos Balb/c com uma solução sem ovalbumina (OVA), a ovalbumina é adsorbida em ali-hidrogel (OVA- Alum) , e nanopartículas vazias (NP), NP-I, NP- III, NP-V, NP-VI e NP-VII com o passar do tempo.a figura 7 mostra um gráfico que representa a concentração sérica de IL-10 após a imunização intradérmica de camundongos Balb/c com solução sem ovalbumina (OVA) , a ovalbumina adsorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum), e nanopartículas vazias (NP), NP-I, NP-III, NP-V, NP-VI e NP-VII com o passar do tempo; a figura 8 mostra um gráfico que representa os níveis de anticorpos específicos anti-ovalbumina (IgGl,IgG2a) após a imunização intradérmica de • camundongos Balb/c com ovalbumina adsorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum) , OVASAL e solução ovalbumina (OVA) com o passar do tempo;a figura 9 mostra o resultado da separação do extrato de HE por meio de eletroforese com gel poliacrilamida de sulfato dodecil de sódio (SDS-PAGE) e Coloração Coomassie para proteínas (10 μg do extrato por poço);a figura 10 mostra o resultado de análise de enxugamento por mata-borrão imune do extrato de HE antes (A) e depois (B) do encapsulamento, usando uma mistura de soros de galinhas infectadas;a figura 11 é um gráfico que ilustra os resultados de um experimento de proteção intraperitoneal em camundongos Balb/c com uma dose letal de 102 de unidades de formação de colônia (CFU) de S. enteritidis 3934;a figura 12 mostra um gráfico em barras que representa IFN-y (A) e a liberação de IL-4 (B) por parte de células do baço de camundongos Balb/c reestimuladas com extrato de HE; ea figura 13 mostra um gráfico em barras que representa o resultado de uma ELISA indireta nos soros de camundongos Balb/c em comparação com o extrato de HE, usando anticorpos de IgGl e IgG2a.
Surpreendentemente, foi agora descoberto que as nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido, opcionalmente contendo um alérgeno ou antígeno e/ou um agente imunoestimulante, têm a 5 capacidade de estimularem ou melhorarem a resposta imune quando são administradas a um indivíduo, o que permite seu uso em imunoterapias e vacinas.
O termo "indivíduo", conforme é utilizado no presente documento, inclui qualquer animal 10 que tenha um sistema imune, preferivelmente mamíferos, mais preferivelmente, seres humanos.
Em um aspecto, a invenção relaciona-se a uma resposta imune que estimula a composição, doravante, no presente, composição da invenção, 15 compreendendo nanopartículas de copolímero anidrido maleico e metil vinil éter. As referidas nanopartículas podem ainda compreender um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante, o que pode ser contido na parte interna das referidas nanopartículas e/ou, pelo menos de forma 20 parcial, revestindo a superfície das referidas nanopartículas. Se assim for desejado, as referidas nanopartículas também podem conter um agente de ligação cruzada.
Tal como é usado nesta 25 descrição, o termo "nanopartículas" é usado para designar sistemas coloidais do tipo de partícula sólida com um tamanho inferior a 1,0 micrômetro, preferivelmente na ordem de 10 a 900 nanômetros (nm), e inclui nanosferas de matriz e nanocápsulas vesiculares. Em uma configuração em particular, as referidas nanopartículas têm um tamanho médio que é igual ou inferior a 400 nm.
As nanopartículas presentes na 5 composição da invenção compreendem um copolímero anidrido de metil vinil éter maleico, também denominado poli(metil vinil éter-co-maleico anidrido) ou PVM/MA. O referido copolímero de PVM/MA é um produto conhecido que pode ser obtido por intermédio de métodos convencionais, por exemplo, por 10 intermédio de polimerização de acetileno com anidrido maleico, ou pode ser obtido no mercado. Neste sentido, a empresa International Specialty Products (ISP) produz Copolímeros de PVM/MA que têm diferentes pesos moleculares comercializados sob o nome comercial Gantrez® AN. Em geral, 15 de modo a colocar a presente invenção em prática, o peso molecular do referido copolímero de PVM/MA pode variar dentro de uma faixa de valores muito ampla, preferivelmente entre 100 e 2.400 KDa, mais preferivelmente entre 200 e 2.000 KDa. Em uma variante da invenção, um copolímero de 20 PVM/MA com um peso molecular compreendido entre 180 e 250 kDa é preferencial.
O uso do referido copolímero de PVM/MA é muito vantajoso devido ao fato de que é amplamente utilizado na tecnologia farmacêutica devido a sua 25 baixa toxicidade (LD 50 = 8-9 g/kg por via oral) e sua excelente biocompatibilidade. Além do mais, é fácil de obter e pode reagir com outras substâncias hidrofílicas devido a seus grupos funcionais, sem ter de recorrer aos reagentes orgânicos usuais (derivados de glutaraldeído e carbodiimida) com importante toxicidade [Arbós et al., J. Controlled Rei., 83 (2002) 321-330]. 0 copolímero de PVM/MA é insolúvel em um meio aquoso, mas o grupo do anidrido apresenta neste as hidrólises, gerando grupos carboxílicos. A solução é lenta e depende das condições nas quais é produzida. Devido à disponibilidade de grupos funcionais em PVM/MA, a ligação covalente de moléculas com grupos nucleofílicos, tais como hidroxils ou aminas, ocorre por intermédio de simples incubação em um meio aquoso. As referidas nanopartículas de PVM/MA também têm propriedades bioadesivas [Arbós et al., Int J Pharm, (2002) 129-136], assim sendo, quando administradas por via oral, elas podem interagir com os Patches de Peyer, os quais contêm 20% de todos os linfócitos do organismo, e desencadeiam uma resposta imune ampliada no que se refere aos antígenos e/ou alérgenos administrados em solução aquosa.
Em uma configuração em particular, a composição da invenção compreende nanopartículas com base em PVM/MA que têm falta de um antígeno ou alérgeno e um agente imunoestimulante. As referidas nanopartículas são denominadas nanopartículas "vazias" nesta descrição e podem ser facilmente obtidas por intermédio de um processo, como, por exemplo, aquele que é revelado no pedido de patente WO 02/069938, cujo conteúdo completo está, no presente documento, incorporado por referência. Por meio de ilustração, as referidas nanopartículas vazias são facilmente preparadas por meio de dissolução com uma fase hidroalcoólica de uma solução de um copolímero de PVM/MA em acetona. As nanopartículas formadas podem ser deixadas em uma suspensão aquosa estável ou elas podem ser liofilizadas. Um agente de ligação cruzada pode, 5 opcionalmente, ser adicionado. Virtualmente, qualquer agente de ligação cruzada contendo um ou mais grupos funcionais que podem reagir com o grupo dos anidridos do copolímero de PVM/MA pode ser usado, de forma vantajosa, um poliamino ou um carboidrato, tal como um aminoácido, uma proteína, um - 10 ose, um -osídeo, etc., por exemplo, lisina, arginina, histidina, proteínas hidrossolúveis, poli-L-lisina, poli-L- arginina, etc., preferivelmente 1,3-diaminopropano.
As referidas nanopartículas vazias podem agir como um adjuvante na vacinação ou na 15 imunoterapia quando administradas em conjunto com vacinas ou composições para imunoterapia (composiçõesimunoterapêuticas) contendo um antígeno ou um alérgeno, respectivamente, produzindo uma resposta imune que estimula o efeito depois da administração da vacina ou da composição 20 imunoterapêutica e das nanopartículas vazias. A figura 12 mostra como a administração de nanopartículas vazias induz à secreção de quantidades significativas de IFN-y- A administração combinada de uma vacina ou de uma composição imunoterapêutica e das nanopartículas pode ser feita de 25 forma simultânea ou seqüencialmente, em momentos diferentes, em qualquer ordem, ou seja, em primeiro ligar, a vacina ou composição imunoterapêutica pode ser administrada, e, em seguida, as nanopartículas ou vice versa. Alternativamente, a referida vacina ou composição imunoterapêutica e as referidas nanopartículas podem ser administradas de forma simultânea. A vacina ou composição imunoterapêutica e as nanopartículas também podem ser administradas na mesma composição ou em diferentes composições. A dose da nanopartícuia vazia a ser administrada pode variar dentro de um amplo intervalo, como, por exemplo, entre cerca de 0,01 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre 0,1 e 2 mg/kg de peso corporal.
Em uma outra configuração em particular, a composição da invenção compreende nanopartículas com base em PVM/MA carregadas com um alérgeno ou um antígeno e/ou com um agente imunoestimulante.
Em uma variante desta invenção, a composição da invenção compreende nanopartículas com base em PVM/MA carregada com um alérgeno ou com um antígeno, em que as referidas nanopartículas com base em PVM/MA compreendem um alérgeno ou um antígeno.
Como é usado nesta descrição, o termo "alérgeno" refere-se à substância à qual um indivíduo é sensível e que causa uma reação imune, como, por exemplo, extratos de pólen alergenóicos, extratos de insetos alergenóicos, alimentos alergenóicos ou extratos de produtos alimentares, componentes presentes na saliva, tenazes ou ferrões de insetos que induzem a uma reação de sensibilidade em um indivíduo, componentes presentes em plantas que induzem à reação de sensibilidade em um indivíduo, etc. Portanto, por exemplo, extratos de proteína do pólen, como, por exemplo, pólen de gramíneas (Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa), extratos de outras 5 gramíneas (como, por exemplo, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), ou pólen de árvore (como, por exemplo, Olea europea, Platanus sp. , Cupressus sp.), etc., podem ser utilizados. Extratos de 10 proteína de insetos, como, por exemplo, extratos em pó de acarídeos (como, por exemplo, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), etc., 15 também podem ser usados. Outros extratos de alérgenos podem ser obtidos a partir de fungos e epitélio animal (Alternaria alternate, Cladosporium herbarum, epitélio de cão, epitélio de gato, epitélio de cavalo, mistura de pena, Penicillium notatum, etc.), assim como de componentes alimentícios, etc.
Virtualmente, qualquer alérgeno pode ser utilizado na preparação de nanopartículas carregadas com alérgenos da composição da invenção; não obstante, em uma configuração em particular, o referido alérgeno é a ovalbumina (OVA), a proteína que é amplamente utilizada como um modelo 25 alergênico experimental.
Como é usado nesta descrição, o termo "antígeno" refere-se a um produto imunogênicorecombinante ou nativo obtido a partir de um organismo maior ou de um microorganismo, como, por exemplo, uma bactéria, um vírus, um parasita,*um protozoário, um fungo, etc., contendo um ou mais elementos determinantes antigenóicos, como, por exemplo, componentes estruturais do referido organismo;toxinas, como, por exemplo, exotoxinas, etc. Praticamente qualquer antígeno pode ser utilizado na preparação das nanopartículas carregadas com antígeno da composição da invenção; não obstante, em uma configuração em particular, o referido antígeno é o extrato de HE de Salmonella 10 enteritidis.
Como se sabe, Salmonella enteritidis é o agente causai de gastroenterite humana mais frequentemente detectado em envenenamento de alimentos (60% dos casos em que foi possível isolar o agente) . Aves e 15 produtos derivados de aves são reconhecidos como o principal reservatório de Salmonella e a fonte mais importante de infecção de Salmonella enteritidis em seres humanos. A infecção é uma zoonose transmitida pela ingestão de alimentos contaminados ou água, e é atualmente uma pandemia.
Para controlar a salmonelose, tanto a Organização Mundial da Saúde (OMS) quanto a União Européia estabeleceram as diretrizes para a monitoração e erradicação da infecção pela Salmonella enteritidis em aves, visto que os benefícios para a população humana são evidentes. Antibióticos, exclusão 25 competitiva, seleção genética de aves e vacinas, assim como condições de higiene melhoradas de granjas de criação de aves, foram utilizados em controle de Salmonella em aves.
Destas medidas, é amplamente aceito que a mais prática seria a vacinação, visto ser a mais fácil e menos custosa de se aplicar. Embora as vacinas atenuadas in vivo e in vitro (bacterianas) estejam atualmente sendo usadas, ambas são um tanto quanto ineficazes em granjas de criação (galinhas eoutras espécies de aves) [Zhang-Barber et al. , Vaccine, 17 (1999) 2538-2545]. Além de sua baixa eficácia, a grandedesvantagem de vacinas in vivo é sua virulência em potencialem animais imunodeprimidos, assim como sua possível reversão de estados invasivos. Além do mais, elas devem ser 10 administradas parenteralmente e elas interferem nos testesde diagnósticos sorológicos tradicionais. As bactérias inativadas (bacterinas) não apresentam riscos de virulência residual, nem induzem a uma resposta imune celular. A administração do potente adjuvante é necessária e múltiplas 15 doses impulsionadoras são necessárias. Uma alternativa seria o uso de vacinas subcelulares que são capazes de estimular uma resposta imune adequada contra a infecção causada pela Salmonella enteritidis. Embora um alto grau de proteção tenha sido descrito para estas vacinas no nível 20 experimental, como as bacterinas, elas requerem múltiplas doses impulsionadoras de modo a obter um grau aceitável de proteção [Powell, Pharm Res, 13 (1996) 1777-1785]. Por outro lado, se forem administradas por via oral, passam por desnaturalização e degradação no trato gastrintestinal 25 [Langer et al . ; Adv Drug Deliv. Rev, 28 (1997) 97-119], de forma que este tipo de vacinas deve ser administrado parenteralmente, com a subsequente logística e os obstáculos econômicos que isso implica. Antígenos de Salmonella enteritidis podem ser encapsulados nas nanopartículas de PVM/MA anteriormente, no presente documento, descritos para o propósito de resolver estas desvantagens.0 alérgeno ou o antígenopresente nesta variante da composição da invenção pode pelo menos parcialmente revestir a superfície das referidas nanopartículas e/ou estarem contidas no interior das referidas nanopartículas. Em uma configuração em particular, o referido alérgeno ou antígeno reveste toda ou parte dasuperfície das referidas nanopartículas. Esta configuração é útil para estimular de forma seletiva uma resposta de Th2 no indivíduo. Em uma outra configuração em particular, o referido alérgeno ou antígeno é encapsulado dentro das referidas nanopartículas de PVM/MA. Esta configuração é útilpara estimular uma resposta equilibrada de Thl e Th2, ou com uma resposta predominante de Thl.
Nanopartículas de PVM/MA carregadas com um alérgeno ou um antígeno podem ser facilmente obtidas por intermédio de um processo similaràquele revelado no pedido de patente WO 02/069938. Por meio de ilustração, as referidas nanopartículas carregadas com um alérgeno ou com um antígeno podem ser facilmente preparadas por meio de dissolução com uma fase líquida, por exemplo, uma fase hidroalcoólica, como uma fase líquida formada poretanol e água, da solução de um copolímero de PVM/MA em um solvente orgânico, como, por exemplo, um solvente orgânico polar, por exemplo, a acetona. As nanopartículas formadassão deixadas em suspensão aquosa ou são liofilizadas.
Dependendo do momento em que o alérgeno ou o antígeno for adicionado, diferentes formulações serão obtidas com diferentes disposições do alérgeno ou antígeno (vide as formulações identificadas como NP I, NP II, NP III, NP IV e 5 NP HE 3 934 nos Exemplos 1 e 6) . Por meio de ilustração, quando for desejável que o alérgeno ou antígeno faça o revestimento de toda ou parte da superfície dananopartícula, em seguida, o referido alérgeno ou o referido antígeno é incubado, depois de haver evaporado os solventes 10 orgânicos. De forma similar, quando for desejável que o alérgeno ou antígeno seja encapsulado dentro das referidas nanopartículas, então o referido alérgeno ou o referido antígeno é incubado, cujo alérgeno ou antígeno é disperso em um solvente, preferivelmente o solvente no qual a solução de 15 copolímero de PVM/MA é encontrado, ou pode ser misturado com o referido solvente, como um solvente orgânico preferivelmente polar, ou um solvente que possa ser misturado com a solução do solvente do polímero, por exemplo, a acetona, antes de adicionar a referida fase 20 líquida usada para dissolver a solução do copolímero de PVM/MA. Se assim for desejado, um agente de ligação cruzada pode, opcionalmente, ser adicionado, como anteriormente, no presente documento, mencionado em relação a nanopartículas vazias.
Mais especialmente, em umoutro aspecto, a invenção relaciona-se a um processo para a produção da composição da invenção que compreende nanopartículas de copolímero de PVM/MA carregadas com um 28/77alérgeno ou com um antígeno, em que as referidas nanopartículas de copolímero de PVM/MA compreendem urn alérgeno ou um antígeno, com o referido processo consistindo nas seguintes etapas:a) dissolução de uma solução orgânica de um copolímero de PVM/MA dissolvida em um solvente orgânico com uma solução hidroalcoólica;b) remoção dos solventes orgânicos para obter nanopartículas; ec) adição do referido alérgeno ou o referido antígeno ao referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA antes de dissolver o referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA ou alternativamente incubar o referido alérgeno ou o referido antígeno com as referidas nanopartículas obtidas naetapa b).
O solvente orgânico no qual o copolímero de PVM/MA é dissolvido pode ser qualquer solvente em que o referido copolímero for solúvel, tipicamente um solvente polar, como uma cetona, por exemplo, acetona. A 20 fase líquida usada para a realização da referida dissolução pode ser qualquer solução hidroalcóolica compreendendo álcool e água, por exemplo, etanol e água, por exemplo, álcool e água de grau farmacêutico (água purificada ou água para injeção, de acordo com a aplicação) . De forma 25 vantajosa, a proporção da solução hidroalcóolica e da solução do copolímero fica compreendida entre 1:1 e 1:10, preferivelmente 1:4. Então os solventes orgânicos sãoremovidos por intermédio de qualquer método convencional, por exemplo, por intermédio de evaporação a pressão reduzida, e as nanopartículas são, instantaneamente, formadas no meio, sob a ocorrência da suspensão leitosa aquosa estável.
A adição do referido alérgenoou do antígeno ao copolímero de solução orgânica de PVM/MA antes de dissolver o referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA permite a obtenção de nanopartículas em que o alérgeno ou o antígeno está contido dentro das referidasnanopartículas. De forma vantajosa, o referido alérgeno ou antígeno é adicionado, dissolvido ou dispersado no mesmo solvente orgânico que o da solução orgânica do copolímero de PVM/MA, ou então, passível de ser misturado ao referido solvente, como um solvente orgânico polar, por exemplo,acetona. Alternativamente, a incubação do referido alérgeno ou do referido antígeno com as nanopartículas obtidas na etapa b) permite a obtenção de nanopartículas em que o alérgeno ou antígeno reveste toda ou parte da superfície externa das referidas nanopartículas. Em uma configuração emparticular, a incubação do alérgeno ou antígeno com as nanopartículas é feita em um meio aquoso.
Se assim for desejado, um agente de ligação cruzada pode, opcionalmente, seradicionado, de forma a melhorar a estabilidade dananopartícuia, como anteriormente, no presente documento, mencionado em relação a nanopartículas vazias.
As nanopartículas obtidascarregadas com alérgeno ou antígeno podem ser purificadas por meios convencionais, como, por exemplo, por intermédio de centrifugação, ultracentrifugação, filtração tangencial ou evaporação, incluindo o uso de vácuo.Por fim, se assim fordesejado, nanopartículas carregadas com alérgeno ou antígeno podem ser liofilizadas para seu armazenamento e preservação a longo prazo. Agentes citoprotetores padrões podem ser utilizados, preferivelmente a uma concentração compreendida entre 0,1 e 10% por peso com relação ao peso total da 10 composição, para facilitar a liofilização.
Nanopartículas carregadas com alérgeno ou antígeno podem agir como um adjuvante na vacinação ou imunoterapia e produzir uma resposta imune que estimula o efeito após sua administração ao indivíduo, como 15 é mostrado nos Exemplos 3-6.
As doses de nanopartículas carregadas com alérgeno ou antígeno a serem administradas podem variar dentro de uma faixa de valores ampla, por exemplo, entre cerca de 0,01 e cerca de 10 mg/kg de peso 20 corporal, preferivelmente, entre 0,1 e 2 mg/kg de peso corporal.
Em uma outra variante desta invenção, a composição da invenção compreende nanopartículas com base em PVM/MA carregadas com um agente 25 imunoestimulante, em que as referidas nanopartículas com base em PVM/MA compreendem um agente imunoestimulante.
Como é usado nesta descrição, o termo "agente imunoestimulante" ou "imunomodulador" refere-se a um produto que é capaz de especialmente ou não especialmente melhorar a resposta imune, por exemplo, proteínas ou peptídeos que estejam funcionando como adjuvantes naturais que estimulam a resposta do sistema imune ao alérgeno ou antígeno, lipopolissacarídeos bacterianos, componentes da parede da célula de Bactérias gram-positivas (por exemplo, dipeptídeo muramil (MDP)), seqüências de DNA CpG, extratos de plantas, principalmente extratos de plantas de saponina, etc. Virtualmente qualquer agente imunoestimulante pode ser utilizado na preparação de agente nanopartículas carregadas com imunoestimulantes da composição da invenção; não obstante, em uma configuração em particular, o referido agente imunoestimulante é o lipossacarídeo bruto de Brucella ovis.
O referido agente imunoestimulante pode pelo menos parcialmente revestir a superfície das referidas nanopartículas e/ou estar contido no interior das referidas nanopartículas. Em uma configuração em particular, o referido agente imunoestimulante reveste toda ou parte da superfície das referidas nanopartículas de PVM/MA, ao passo que em uma outra configuração em particular, o referido agente imunoestimulante é encapsulado dentro das referidas nanopartículas de PVM/MA.
As nanopartículas de PVM/MA carregadas com agente imunoestimulante podem facilmente ser obtidas por intermédio de um processo similar àquele, anteriormente, no presente documento, descrito em relação à preparação de nanopartículas de PVM/MA carregadas com um alérgeno ou com um antígeno, entretanto, substituindo o referido alérgeno ou antígeno pelo agente imunoestimulante. Assim sendo, dependendo do momento em que o agente imunoestimulante for adicionado, diferentes formulações serão obtidas com diferentes disposições destas (vide Exemplo 1 ou 4) . Por meio de ilustração, quando é desejável que o agente imunoestimulante faça o revestimento de toda ou parte da superfície da nanopartícuia, então o referido agente imunoestimulante é incubado depois de haver evaporado os solventes orgânicos. De forma similar, quando for desejável que o agente imunoestimulante seja encapsulado dentro das referidas nanopartículas, então o referido agente imunoestimulante é incubado, cujo agente é disperso ou dissolvido em um solvente, de forma vantajosa o solvente em que a solução de copolímero de PVM/MA é encontrada, ou for passível de ser misturada com o referido solvente, como um solvente orgânico preferivelmente polar, ou um solvente que possa ser misturado com a solução do solvente do polímero, por exemplo, acetona, antes de adicionar a referida fase líquida usada para dissolver a solução do copolímero de PVM/MA. Se assim for desejado, um agente de ligação cruzada pode, opcionalmente, ser adicionado, como anteriormente, no presente documento, mencionado em relação a nanopartículas vazias.
Se assim for desejado, um agente de ligação cruzada pode, opcionalmente, ser adicionado, de forma a melhorar a estabilidade da nanopartícuia, como anteriormente, no presente documento, mencionado em relação a nanopartículas vazias.
Nanopartículas carregadas com agente imunoestimulante podem ser purificadas por meios convencionais como anteriormente, no presente documento, mencionadas em relação às nanopartículas carregadas com alérgeno ou antígeno. Se assim for desejado, as nanopartículas carregadas com agente imunoestimulante também podem ser liofilizadas com o uso de agentes citoprotetores padrões, preferivelmente a uma concentração compreendida entre 0,1 e 10% por peso no que diz respeito ao peso total da composição.
Nanopartículas carregadas com agente imunoestimulante podem agir como um adjuvante na vacinação ou imunoterapia e produzir uma resposta imune que estimule o efeito depois de sua administração ao indivíduo.
A dose de nanopartículas carregadas com agente imunoestimulante a ser administrada pode variar dentro de um amplo intervalo, como, por exemplo, entre cerca de 0,01 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre 0,1 e 2 mg/kg de peso corporal.
Em uma outra variante desta invenção, a composição da invenção compreende nanopartículas com base em PVM/MA carregadas com um alérgeno ou um antígeno e com um agente imunoestimulante, em que as referidas nanopartículas de PVM/MA compreendem um alérgeno ou um antígeno e um agente imunoestimulante.
O alérgeno ou o antígeno assimcomo o agente estimulante presentes nesta variante da composição da invenção podem, pelo menos parcialmente, revestir a superfície das referidas nanopartículas e/ouestarem contidos no interior das referidas nanopartículas.
Em uma configuração em particular, o referido alérgeno ou antígeno reveste toda ou parte da superfície das referidas nanopartículas, ao passoque o agente imunoestimulante está contido dentro das 10 referidas nanopartículas, tendo descoberto que esta configuração em particular permite a realização do estímulo de forma seletiva de uma resposta de Th2 no indivíduo.
Em uma outra configuração em particular, o referido alérgeno ou antígeno é encapsulado 15 dentro das referidas nanopartículas de PVM/MA, ao passo que o referido agente estimulante reveste, pelo menos parcialmente, a superfície das referidas nanopartículas. Esta configuração é particularmente interessante para o estímulo da resposta equilibrada de Thl e Th2, ou de forma 20 predominante uma resposta de Thl.
Em uma outra configuração em particular, tanto o alérgeno ou antígeno e o agente imunoestimulante são encapsulados dentro das referidas nanopartículas de PVM/MA.
Nanopartículas de PVM/MAcontendo um alérgeno ou um antígeno e um agente imunoestimulante podem ser facilmente obtidos por intermédiode um processo similar àquele descrito anteriormente, no presente documento. Dependendo do momento no qual o alérgeno ou o antígeno e o agente imunoestimulante forem adicionados, diferentes formulações serão obtidas com diferentes disposições dos referidos produtos. Por meio de ilustração, quando for desejável que o agente imunoestimulante faça o revestimento de toda ou parte da superfície da nanopartícula, então o referido agente imunoestimulante é incubado, depois de haver evaporado os solventes orgânicos. De forma similar, quando for desejável que o agente imunoestimulante seja encapsulado dentro das referidas nanopartículas, então o referido agente imunoestimulante é incubado, cujo agente imunoestimulante é disperso ou dissolvido em um solvente, de forma vantajosa o solvente em que a solução de copolímero de PVM/MA é encontrada, ou for passível de ser misturada com o referido solvente, como um solvente orgânico preferivelmente polar, ou um solvente que possa ser misturado com a solução do solvente do polímero, por exemplo, acetona, antes de adicionar a referida fase líquida usada para dissolver a solução do copolímero de PVM/MA. De forma similar, quando for desejável que o alérgeno ou antígeno faça o revestimento de toda ou parte da superfície da nanopartícula, então o referido alérgeno ou o referido antígeno é incubado, depois de haver evaporado os solventes orgânicos. De forma similar, quando for desejável que o alérgeno ou antígeno seja encapsulado dentro das referidas nanopartículas, então o referido alérgeno ou o referido antígeno é incubado, cujo alérgeno ou antígeno é disperso ou dissolvido em um solvente, preferivelmente o solvente no qual o copolímero de solução PVM/MA é encontrado, ou pode ser misturado com o referido solvente, como um solvente orgânico preferivelmente polar, ou um solvente que possa ser misturado com a solução do solvente do polímero, por exemplo, a acetona, antes de adicionar a referida fase líquida usada para dissolver a solução do copolímero de PVM/MA. De forma similar, quando for desejável que o alérgeno ou antígeno e o agente imunoestimulante sejam encapsulados dentro das referidas nanopartículas, então o referido alérgeno ou o referido antígeno é incubado, opcionalmente misturado com o referido agente imunoestimulante, cujo alérgeno ou antígeno é disperso ou dissolvido em um solvente, preferivelmente o solvente no qual o copolímero de solução PVM/MA é encontrado, ou pode ser misturado com o referido solvente, como um solvente orgânico preferivelmente polar, ou um solvente que possa ser misturado com o solvente da solução do polímero, por exemplo, a acetona, antes de adicionar a referida fase líquida usada para dissolver a solução do copolímero de PVM/MA. Em qualquer caso, se assim for desejado, um agente de ligação cruzada pode, opcionalmente, ser adicionado às nanopartículas obtidas, de forma a melhorar sua estabilidade, como anteriormente, no presente documento, mencionado em relação a nanopartículas vazias.a
Mais especialmente, em um outro aspecto, a invenção relaciona-se a um processo para a produção de uma composição da invenção que compreendenanopartículas de copolímero de PVM/MA carregadas com um alérgeno ou com um antígeno e com um agente imunoestimulante, em que as referidas nanopartículas de copolímero de PVM/MA compreendem um alérgeno ou um antígeno e um agente imunoestimulante, com o referido processo consistindo nas seguintes etapas:a) dissolução de uma solução orgânica de um copolímero de PVM/MA dissolvida em um solvente orgânico com uma solução hidroalcoólica;b) remoção dos solventes orgânicos para obter nanopartículas; e c) adição do referido alérgeno ou do referido antígeno e/ou o referido agente imunoestimulante ao referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA antes de dissolver o referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA ou alternativamente incubar o referido alérgeno ou o referido antígeno ou o referido agente imunoestimulante com as referidas nanopartículas obtidas na etapa b).
As etapas a) e b) são realizadas de uma forma similar àquela descrita, anteriormente, no presente documento, em relação ao processo produzindo a composição da invenção compreendendo copolímero de nanopartículas de PVM/MA carregado com um alérgeno ou com um antígeno. A etapa c) é realizada de uma maneira similar àquela descrita anteriormente, no presente documento, em relação ao referido processo, entretanto, fazendo as modificações correspondentes para a adição do agente imunoestimulante, seja ao referido copolímero de solução orgânica de PVM/MA antes de dissolver a referida solução orgânica do copolímero de PVM/MA, opcionalmente com o alérgeno ou antígeno, ou alternativamente incubando o referido agente imunoestimulante com as referidas nanopartículas obtidas na etapa b), opcionalmente revestida em parte com o referido alérgeno ou antígeno, de acordo com o que foi acima discutido.
Se assim for desejado, um agente de ligação cruzada para opcionalmente ser adicionado para melhorar a estabilidade das nanopartículas obtidas. As nanopartículas obtidas carregadas com alérgeno ou antígeno e com agente imunoestimulante podem ser purificadas por meios convencionais, como, por exemplo, por intermédio de centrifugação, ultracentrifugação, filtração tangencial ou evaporação, incluindo o uso de vácuo.
Por fim, se assim for desejado, nanopartículas carregadas com alérgeno ou antígeno podem ser liofilizadas para seu armazenamento e preservação a longo prazo. Agentes crioprotetores padrões podem ser utilizados, preferivelmente a uma concentração compreendida entre 0,1 e 10% por peso no que diz respeito ao peso total da composição, para facilitar a liofilização.
As nanopartículas carregadas com um alérgeno ou com um antígeno e com um agente imunoestimulante podem agir como um adjuvante na vacinação ou imunoterapia e produzir uma resposta imune que estimule o efeito depois de sua administração ao indivíduo, como é mostrado nos Exemplos 3-6.
A dose de nanopartículas carregadas com um alérgeno ou um antígeno e com um agente imunoestimulante a ser administrada pode variar dentro de um amplo intervalo, como, por exemplo, entre cerca de 0,01 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre 0,1 e 2 mg/kg de peso corporal.4
Se assim for desejado, a composição da invenção pode estar na forma liofilizada ou em uma forma adequada para a administração para sua administração oral ou parenteral. A liofilização é realizada por intermédio de métodos convencionais, opcionalmente na presença de agentes crioprotetores convencionais, por exemplo, sacarose, manitol, trealose, glicerol, lactose, sorbitol, polivinilpirrolidona, etc., preferivelmente a uma concentração compreendida entre 0,1 e 10% por peso no que diz respeito ao peso total da composição. De modo a fabricar as diferentes formas de administração adequadas para sua administração oral ou parenteral, excipientes aceitáveis e carreadores adequados para a fabricação da forma farmacêutica de administração desejada serão usados. Informações a respeito dos referidos carreadores e excipientes, assim como informações a respeito das referidas formas de administração adequadas para a administração oral ou parenteral da composição da invenção podem ser encontradas em tratadas de farmácia Galênica.
Conforme mencionado anteriormente, a composição da invenção produz uma resposta imune que estimula ou melhora o efeito depois de administração ao indivíduo, de forma que possa ser utilizadacomo um adjuvante em vacinas ou imunoterapia. De fato, a composição da invenção tem a capacidade de estimular de forma seletiva um dos dois caminhos de resposta imune (Thl ou Th2) ou ainda ambos os caminhos de uma maneira simultânea e balanceada, de forma que pode ser usada em formulações de vacina ou imunoterapêuticas, de acordo com a resposta que deve ser estimulada. Por meio de ilustração, dependendo dos mecanismos de patogenicidade do organismo de que o antígeno se origina (intracelular ou extracelular, toxina dependente, flagelo dependente, etc.), estímulo da resposta de Thl (intracelular, como no caso de Brucella, Salmonella, etc.) ou a resposta Th2 (extracelular, como no caso de Staphylococcus, Escherichia coli, bactérias enterotoxigênicas, etc.) é geralmente necessário para a formulação de uma vacina. De forma similar, por meio de ilustração, a indução à tolerância é necessária para uma formulação imunoterapêutica pela presença dos dois tipos de resposta, ou seja, induzindo às respostas de Thl e Th2 de uma forma equilibrada. Geralmente, para estimular uma resposta de Th2 seletiva, as formulações conterão nanopartículas de PVM/MA completamente ou parcialmente revestidas com o alérgeno ou antígeno, ao passo que para estimular a resposta de Thl e Th2 de uma forma equilibrada, ou com uma predominância de resposta de Thl, as formulações conterão nanopartículas de PVM/MA em que o antígeno ou alérgeno ficará encapsulado e as referidas nanopartículas incluirão, de forma vantajosa, um agente de ligação cruzada. Em qualquer dos casos anteriormente mencionados, as nanopartículas podem incluir um agente imunoestimulante se assim for desejado.
Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma vacina ou uma composição de imunoterapia compreendendo uma quantidade efetiva em termos terapêuticos de uma resposta imune que estimula a composição (composição da invenção) juntamente com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A referida composição da vacina ou imunoterapia pode estar em qualquer forma de administração farmacêutica a ser administrada por qualquer via, como, por exemplo, por via oral, parenteral, retal, etc. Em uma configuração em particular, a referida composição da vacina ou imunoterapia é uma forma farmacêutica de administração oral, ao passo que em uma outra configuração em particular, a referida composição da vacina ou imunoterapia é uma forma farmacêutica de administração parenteral, por exemplo, intramuscular (i.m.), subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.), etc. Uma revisão das diferentes formas de dosagem de administração para drogas em geral e os processos para a fabricação destas pode ser encontrada no livro "Tratado de Farmacia Galénica", por C. Faulí i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
A composição da invenção presente na referida vacina ou composição de imunoterapia provida por esta invenção compreende nanopartículas de PVM/MA. As referidas nanopartículas podem ainda conter um alérgeno ou um antígeno e/ou um agente imunoestimulante, o qual pode estar contido no interior das referidas nanopartículas e/ou pelo menos parcialmente revestindo a superfície das referidas nanopartículas. De forma similar, as referidas nanopartículas podem opcionalmente conter um agente de ligação cruzada.
Em uma configuração emparticular, a composição da invenção presente na referida composição da vacina ou imunoterapia provida por esta invenção compreende nanopartículas vazias de PVM/MA que opcionalmente incorporam um agente de ligação cruzada. Neste caso, a composição da invenção é administrada em combinação 10 com a vacina ou composições imunoterapêuticas contendo um antígeno ou um alérgeno, respectivamente, produzindo uma resposta imune que estimula o efeito depois da administração da referida vacina ou composição imunoterapêutica e as nanopartículas vazias. A administração combinada da referida 15 vacina ou composição imunoterapêutica e das nanopartículas vazias pode ser feita de forma simultânea ouseqüencialmente, em momentos diferentes, em qualquer ordem, ou seja, em primeiro lugar, a vacina ou composição imunoterapêutica pode ser administrada, e, em seguida, asnanopartículas vazias ou vice versa. Alternativamente, a referida vacina ou composição imunoterapêutica e as referidas nanopartículas podem ser administradas de forma simultânea. Neste caso, a vacina ou composição imunoterapêutica e as nanopartículas vazias podem ser 25 administradas na mesma composição ou em diferentes composições.
Em uma outra configuração emparticular, a composição da invenção presente na referida vacina ou composição de imunoterapia provida por esta invenção compreende nanopartículas de PVM/MA em que as referidas nanopartículas de PVM/MA ainda compreendem um alérgeno ou um antígeno, e um agente de ligação cruzada se 5 assim for desejado.
Em uma outra configuração em particular, a composição da invenção presente na referida vacina ou composição de imunoterapia provida por esta invenção compreende nanopartículas de PVM/MA em que as 10 referidas nanopartículas de PVM/MA ainda compreendem um agente imunoestimulante, e um agente de ligação cruzada se assim for desejado.
Em uma outra configuração em particular, a composição da invenção presente na referida 15 vacina ou composição de imunoterapia provida por esta invenção compreende nanopartículas de PVM/MA em que as referidas nanopartículas de PVM/MA ainda compreendem um alérgeno ou um antígeno e um agente imunoestimulante, e um agente de ligação cruzada se assim for desejado.
A vacina ou composição deimunoterapia fornecida por esta invenção compreende uma composição da invenção em uma quantia terapeuticamente eficaz, ou seja, em uma quantia que é adequada para a melhoria ou estímulo da resposta imune. Portanto, a 25 quantidade de composição da invenção presente na composição da vacina ou imunoterapia fornecida por esta invenção pode variar dentro de uma ampla faixa de valores, dependendo de, entre outros fatores, o tipo de nanopartículas (vazia ou carregada com alérgeno ou antigenos e/ou com agente imunoestimulante), etc. Não obstante, em uma configuração em particular, a invenção fornece a composição da vacina ou imunoterapia compreendendo: Componente % por peso com relação ao totalNanopartículas de PVM/MA 84 - 99,998%Agente de ligação cruzada 0,001 - 1%Alérgeno ou antígeno 0,001 - 15%
A referida vacina ou composição de imunoterapia pode opcionalmente conter um agente crioprotetor em uma quantidade suficiente de forma a proteger as nanopartículas durante o processo de liofilização.
Em uma configuração em particular, o referido alérgeno compreende um extrato de pólen alergenóico, um extrato de inseto alergenóico ou um extrato de produto alimentício alergenóico.
Em uma outra configuração em particular, o referido antígeno compreende um extrato imunogênico de um organismo, por exemplo, um extrato de membrana de Salmonella spp.
Conforme mencionadoanteriormente, a composição da invenção tem a capacidade de produzir uma resposta imune que estimula ou melhora o efeito depois da administração ao indivíduo, de forma que pode ser usada como um adjuvante em vacinas ou imunoterapia, e mais especialmente ela tem a capacidade de estimular de forma seletiva um dos dois caminhos de resposta imune (Thl ou Th2) ou até mesmo ambos os caminhos de uma forma simultânea e equilibrada.
Portanto, em um outro aspecto, a invenção relaciona-se ao uso da composição da invenção na 5 fabricação da composição da vacina ou imunoterapia.
Em um outro aspecto, a invenção relaciona-se ao uso da composição da invenção na fabricação da composição farmacêutica para o estímulo seletivo ou predominante ou melhoria da resposta imune de Thl.Em um outro aspecto, ainvenção relaciona-se ao uso da composição da invenção na fabricação da composição farmacêutica para o estímulo seletivo ou predominante ou melhoria da resposta imune de Th2 .
Em um outro aspecto, ainvenção relaciona-se ao uso da composição da invenção na fabricação da composição farmacêutica para o estímulo equilibrado ou melhoria das respostas imunes de Thl e Th2.
O uso da composição da 20 invenção para vacinação e imunoterapia tem diversas vantagens, visto que compreende o seguinte:- Uso de formas farmacêuticas que sejam biodegradáveis em condições normais do organismo, e que sejam fabricadas a partir de polímeros e materiais aceitos na prática 25 farmacêutica e médica;- Administração de preparações de imunoterapia e vacinação com base em nanopartícula que protege o alérgeno ou antígeno encapsulado de sua inativação prematura; - Fabricação de uma preparaçao de imunoterapia e vacina, com base no uso de nanopartículas, o que mostra a liberação sustentada com o passar do tempo; o período de tempo durante o qual a liberação controlada ocorrerá dependerá das condições microambientais pertencendo ao local de administração; •- Administração de um adjuvante de nanopartícula com base em nanopartículas, devido a suas características (inocuidade, biodegradabilidade, avirulência), pode estar susceptível ao uso em humanos e animais para os propósitos imunoterapêuticos e de vacinação através de diferentes vias de administração; e- Administração de um adjuvante de nanopartícula com base em nanopartículas, as quais, devido a seu potencial bioadesivo no trato gastrintestinal, torna a administração oral uma possível via de administração.Os seguintes exemplos ilustram a invenção e não devem ser considerados como limitando-a. EXEMPLOS
Os seguintes exemplos descrevem a produção de diferentes tipos de nanopartículas com base em PVM/MA os quais, opcionalmente, contêm alérgeno ou antígenos e/ou um agente imunoestimulante, e eles manifestam a capacidade das referidas nanopartículas de agirem como um adjuvante na imunoterapia ou vacinação. Processo de Produção de Nanopartícula em Geral
O processo de produção geral de nanopartícula de PVM/MA compreende a dissolução do *referido copolímero em acetona seguida da adição de etanol. Um volume similar de água é adicionado à solução resultante, de forma tal que as nanopartículas são instantaneamente formadas no meio, sob a aparência da suspensão leitosa.
Então, os solventes orgânicos (etanol e acetona) são removidos por intermédio de evaporação sob pressão reduzida, com as partículas permanecendo em uma suspensão aquosa estável [Arbos et al, J Control Rei, 83 (2002) 321-330].
Dependendo do momento em que os alérgenos ou antígenos forem 10 adicionados e, quando aplicáveis, o agente imunoestimulante, diferentes formulações serão obtidas com diferentes disposições destas (vide Exemplos 1, 5 e 6) . Como no exemplo:A. De modo a obter formulações contendo o alérgeno ou o antígeno encapsulado dentro das nanopartículas (formulaçõesNP I e NP VI): a incubação com o alérgeno ou antígeno a ser encapsulado é realizada depois de haver evaporado os solventes orgânicos.B. De modo a obter formulações contendo o alérgeno ou o antígeno que reveste totalmente ou parcialmente a superfície 20 externa das nanopartículas (formulações NP II, NP III, NPIV, NP V, NP VII, OVASAL e NP HE) : o alérgeno ou antígeno é incubado disperso em acetona antes da adição de etanol e de água.
A próxima etapa consiste na 25 adição do agente de ligação cruzada, o qual, neste caso, era o 1,3-diaminopropano, às formulações NP III, NP V, NP VII, OVASAL, NP HE (5 pg/mg de polímero em todas elas) e NP IV (10 pg/mg polímero).
As formulações NP-V, NP-VI e NP-VII contêm um agente imunoestimulante que consiste no lipopolissacarideo bruto (R-LPS) de Brucilla ovis. Brevemente, para ser incorporado, no caso de formulação NP 5 V, a incubação com o referido agente imunoestimulante é realizada depois de haver evaporado os solventes orgânicos, ao passo que no caso das formulações NP VI e NP VII, o R-LPS é incubado antes da adição do etanol e da água (vide Exemplos 1.4.2, 1.4.3 e 1.4.4).
A purificação da nanopartículaé realizada por intermédio de ultracentrifugação. Por fim, as nanopartículas purificadas são liofilizadas para seu armazenamento e preservação a longo prazo.
Caracterização da Nanopartícula
O potencial zeta e o tamanhoda nanopartícula foram determinados em um Zetamaster (Instrumentos Malvern/Optilas, Espanha).
O conteúdo de proteína encapsulado (princípio ativo) foi determinado por intermédio 20 do teste de proteína de ácido microbicinconínico (Micro BCA, Pierce, EUA).
O lipopolissacarideo bruto de Brucella ovis (R-LPS) adsorvido ou encapsulado nas nanopartículas foi quantificado indiretamente por meio da 25 medição de um de seus marcadores exclusivos, o KDO (ácido 3- deoxi-D-mano-oct-2-ulosônico) , pelo método de ácido tiobarbitúrico [Warren, J Biol Chem, 243 (1959) 1971-1975]. Anti-OVA, Citocina e Determinação de Anticorpo IL-10
Anticorpos anti-OVA do soro foram analisados pelo ELISA com conjugados anti-IgGl e anti- IgG2a (Sigma-Aldrich Chemie, Alemanha). Brevemente, para realizar este teste, 96 placas de poço (EB, Thermo 5 Labsystems, Vantaa, Finlândia) foram utilizados em que 1 μg de ovalbumina por poço foi fixado a 4 °C durante 15 horas; subseqüentemente 5 lavagens de 1 minuto cada foram realizadas em uma lavadora ELISA (Thermo Labsystems, Vantaa, Finlândia), os soros foram adicionados em diluições em 10 série, começando a partir do 1:40, eles foram incubados a37 °C durante 4 horas e 5 lavagens de 1 minuto foram subseqüentemente realizadas; o conjugado foi então incubado durante 2 horas com peroxidase, 5 lavagens adicionais de 1 minuto foram realizadas, o substrato [ABTS (2,2'-azino- 15 bis(ácido 3-etilbenzeno-tiazolina-6-sulfônico) (Sigma-
Aldrich Chemie, Alemanha)] foi adicionado e a leitura foi realizada a 405 nm em um leitor da placa (iEMS Reader MF, Labsystems, Vantaa, Finlândia) depois de 30 minutos da incubação a temperatura ambiente.As citocinas (IFN-y, IL-4)foram analisadas pelos kits ELISA (Biosource, EUA) nos sobrenadantes com origem no reestímulo da célula do baço de camundongos previamente imunizados.
O IL-10 foi analisado em sorosdo sangue previamente centrifugado a 800 x g durante 10 minutos, por um kit ELISA (Biosource, EUA).Eletroforese de Gel de Poliacrilamida Dedocilsulfato de Sódio (SDS-PAGE)
O perfil de proteína das amostras foi determinado pelo SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685], em uma concentração de 15% de 37.5:1acrilamida:bisacrilamida (Biorad), em 125 mM Tris-HCl (pH 5 6,8) e 0,1% SDS no gel. A solução tampão do eletrodo usadacontinha 30 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM glicina e 0,1% SDS. A amostra foi tratada a 100°C durante 10 minutos em 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% glicerol, 2% SDS, 5% β-mercaptoetanol e 0,002% bromofenol azul. A eletroforese foi realizada em 10 géis de 8 x 7 cm com uma intensidade constante de 15 mA/gel.
Os géis foram coloridos com azul Coomassie [King, Anal Biochem, 71 (1976) 223-230] . Para este fim, eles foram incubados em ácido tricloroacético a 3% em água durante 1 hora para sua fixação. A coloração foi realizada com uma 15 solução de azul Coomassie a 0,25% em metanol a 50% e ácido acético a 10% durante 1 hora e foi descolorido em metanol a 50% e ácido acético a 20% até que as amostras se tornaram visíveis. Os aparentes pesos moleculares dos componentes da amostra foram determinados em comparação com sua mobilidade 20 eletroforética com um padrão de marcador de peso molecular (Rainbow, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) contendo miosina (220 kDa), fosforilase b (97 kDa), albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa) e 25 sisozima (14,3 kDa).
Imunização por mata-borrão
A imunização por mata-borrão foi realizada de acordo com um protocolo previamente descrito [Towbin & Staehelin, Proc Natl Acad Sci USA, 76 (1979) 4350-4354]. Brevemente, depois da individualizaçãodas amostras de SDS-PAGE, os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose de tamanho de poro de 0,4 5 μm 5 (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha). A transferência foi realizada com o uso do método semi-seco por intermédio do Trans-Blot® SD, sistema de célula de transferência semi- kseca (Bio-Rad, Richmond, EUA) a 200 mA, 5 V durante 30 ■ minutos, em uma solução tampão de transferência de 25 mMTris-HCl (pH 8,3), 192 mM glicina e metanol a 10%.
EXEMPLO 1 Imunoterapia
Preparação e Caracterização de ovalbumina das Nanopartículas com Base em Copolímero (PVM/MA) de Metil Vinil Éter Maleico Anidrido
A proteína escolhida foi aovalbumina (OVA), visto que ela é amplamente usada como um modelo alergênico experimental.
A ovalbumina representa mais de 50% do conteúdo de proteína de claras de ovos. É uma 20 fosfoglicoproteína monomérica que tem 385 aminoácidos, com um peso molecular de 43 a 45 kDa [Johnsen e Elsayed, Mol Immunol, 27 (1990) 821]. A ovalbumina é a proteína do ovo que tem a capacidade alergênica mais alta, imediatamente induzindo à hipersensibilidade do tipo I mediada por IgE.
O processo descrito abaixo éválido para a preparação de formas de dosagens coloidais do tipo de nanopartícula que podem ser usadas para imunoterapia. 1.1 Preparação de Nanopartículas Vazias (NP)100 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] são dissolvidos em 5 mL de acetona. Subseqüentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase com agitação magnética. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 10 mL.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas vazias obtidas (NP) têm um tamanho médio inferior a 200 nm e uma carga de superfície de - 45,1 mV (vide Tabela 1).1.2 Preparação de Nanopartículas Revestidas com Ovalbumina (NP I)0 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] são dissolvidos em 5 mL de acetona. Subseqüentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase com agitação magnética. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 5 mL. Esta solução é incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com 5 mL de uma solução aquosa de ovalbumina contendo 10 mg de proteína.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas obtidas (NP I) têm um tamanho médio inferior a 3 00 nm, uma carga de superfície de - 61,3 mV e um conteúdo de ovalbumina de 54.7 μg/mg de polímero (vide Tabela 1).1.3 Preparação de Nanopartículas com Ovalbumina Encapsulada (NP II, NP III e NP IV)0 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] são dissolvidos em 4 mL de acetona, ao passo que, por outro lado, 5 mg de ovalbumina são dispersos em 1 mL de acetona por intermédio de ultrasonicação (Microson™) ou banho ultrasônico durante 1 minuto com resfriamento. A dispersão de ovalbumina é adicionada à suspensão do polímero e é agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Subsequentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase com agitação magnética. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 1.4 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 10 mL. As nanopartículas obtidas têm OVA encapsuladas (NP II). No caso das formulações NP III e NP IV, o agente de ligação cruzada seria neste momento adicionado: 0,05 mL e 0,1 mL de uma solução de 1,3-diaminopropano a 1%, respectivamente.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas obtidas têm um tamanho médio inferior a 300 nm, uma carga de superfície de - 41,4 mV no caso de NP-II, -50.8 mV em NP-III e - 57,5 mV em NP IV, e um conteúdo de ovalbumina próximo a 30 μg/mg de polímero (vide Tabela 1).1.5 Preparação de Nanopartículas Revestidas com Ovalbumina e Lipossacarídeo Bruto Brucella ovis (NP V, NP VI e NP VII) 1.4.1 Extração e Caracterização do Complexo de Lipossacarídeo Bruto Brucella ovis
O extrato utilizado é Lipossacarídeo Bruto Brucella ovis (R-LPS). R-LPS foi obtido por intermédio de um método anteriormente descrito (Galanos et al, Eur. J. Biochem. (1969), 245-249). Depois de fazer a cultura da bactéria, Brucella ovis, estas são novamente suspensas em etanol absoluto mexendo a 4 °C da noite para o dia em um recipiente fechado. As células são, em seguida, centrifugadas (6.000 x g, 20 minutos, 4 °C) e novamente suspensas em acetona com agitação durante 12 horas a 4 °C em um recipiente fechado. Subseqüentemente, as células são coletadas por meio de centrifugação (6.000 x g, 20 minutos, 4 °C) , elas são novamente suspensas em etil éter e elas são mantidas a temperatura ambiente de 3 a 4 horas com agitação magnética. Em seguida, elas são centrifugadas novamente (6.000 x g, 20 minutos, 4°C) e são evaporadas até secarem. De modo a proceder com a extração, as células são misturadas até a homogeneização com petróleo-clorofórmio-fenol éter a uma proporção de 8:5:2, respectivamente. A mistura é centrifugada (8.000 x g, 15 minutos, temperatura ambiente) e o sobrenadante é coletado. 0 grânulo é novamente extraído sob as mesmas condições mais duas vezes. Todos os sobrenadantes são colocados em um reservatório e os éteres de petróleo e de clorofórmio são evaporados em um rotavapor. O resíduo fenólico é precipitado com água destilada e centrifugado (8.000 x g, 30 minutos, temperatura ambiente) . E, em seguida, lavado mais duas vezes com fenol e duas vezes novamente com etil éter. Depois da última centrifugação, os elementos remanescentes de etil éter são removidos sob vácuo, o grânulo é novamente suspenso em água deionizada e é dialisado. Por fim, o conteúdo do saco de diálise é centrifugado (100.000 x g, 6 horas, 4 °C) , o grânulo énovamente suspenso em água deionizada e é liofilizado.
A quantidade de R-LPS é determinada por meio da medição de um de seus comercializadores exclusivos, KDO, por intermédio do método do ácido tiobarbitúrico.1.4.2 Nanopartículas com Ovalbumina Encapsulada e Brucella ovis R-LPS na Superfície (NP V)100 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido [Gantrez® AN 119] são dissolvidos em 4 mL de acetona, ao passo que por outro lado 5 mg de ovalbumina são dispersos em 1 mL de acetona por intermédio de ultrassonicação (Microson™) ou banho ultrassónico durante 1 minuto com resfriamento. A dispersão de ovalbumina é adicionada à co-suspensão do polímero e é agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Subseqüentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase com agitação magnética. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 9 mL. Esta solução é incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com 1 mL de uma dispersão aquosa (anteriormente ultrassonicada durante um minuto) contendo 1 mg de Brucella ovis R-LPS.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas obtidas (NP V) têm um tamanho médio inferior a 3 00 nm, uma carga de superfície de - 46,1 mV, um conteúdo de ovalbumina de 64,1 μg/mg de polímero e 15,2 μg de R-LPS/mg de polímero (vide Tabela 1) .1.4.3 Nanopartículas com Brucella ovis R-LPS Encapsuladas e Ovalbumina na Superfície (NP VI)0 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido [Gantrez® AN 119] são dissolvidos em 4 mL de acetona, ao passo que por outro lado 1 mg de Brucella ovis R-LPS é disperso em 1 mL de acetona por intermédio de ultrassonicação (Microson™) ou banho ultrassónico durante 1 minuto com resfriamento. A dispersão de R-LPS é adicionada à co-suspensão do polímero e é agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Subsequentemente, 10 mLde etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase com agitação magnética. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 5 mL. Esta solução é incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com 5 mL de uma solução aquosa contendo 5 mg de ovalbumina.
A solução é individualizadapara punficaçao por intermedie de ultracentrifugação (20 minutos a 27,000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha 5 todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas obtidas (NPVI) têm um tamanho médio inferior a 300 nm, uma carga de superfície de - 56,9 mV, um conteúdo de ovalbumina de 68,5 μg/mg de polímero e 12,1 μg de R-LPS/mg de polímero (vide 10 Tabela 1).1.4.4 Nanopartículas com Ovalbumina Encapsulada e Brucella ovis R-LPS (NP VII)100 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido [Gantrez® AN 119] são 15 dissolvidos em 3 mL de acetona, ao passo que por outro ladomg de ovalbumina são dispersos em 1 mL de acetona por intermédio de ultrassonicação (Microson™) ou banho ultrassónico durante 1 minuto com resfriamento, e 1 mg de Brucella ovis R-LPS é disperso em 1 mL de acetona, também 20 por intermédio de ultrassonicação com resfriamento. A dispersão de ovalbumina é adicionada à dispersão de R-LPS, e esta mistura é adicionada à co-suspensão do polímero e agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Subseqüentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada 25 são adicionados a esta fase com agitação magnética. Amistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 10 mL.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 5 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em água ou em uma solução aquosa de sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícuia é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
As nanopartículas obtidas (NPVI1) têm um tamanho médio inferior a 3 00 nm, uma carga de superfície de - 46,1 mV, um conteúdo de ovalbumina de 54,7 μg/mg de polímero e 13,8 μg de R-LPS/mg de polímero (vide Tabela 1) . 1.5 Caracterização da Nanopartícula
A caracterização físico-química das diferentes formulações é mostrada na Tabela 1.De acordo com os resultados coletados, foi observado que, quando as nanopartículas eram revestidas com Ovalbumina (NP I e NP VI) , o tamanho aumenta 20 e o potencial zeta torna-se negativo, ao passo que, se a ovalbumina estiver, na maior parte, no lado interno das nanopartículas (NP II, NP III, NP IV, NP V e NP VII), o tamanho, assim como o potencial zeta, não varia em comparação com as nanopartículas vazias (NP) .
Por outro lado foi observadoque tamanhos aumentados de nanopartícula como a quantidade de agente de ligação cruzada adicionada aumentada, e a quantidade de ovalbumina levemente diminuída.
A presença de R-LPS na superfície da nanopartícula cria um aumento na quantidade de ovalbumina encapsulada (NP V versus NP II), ao passo que se a R-LPS estiver em sua maior parte dentro das nanopartículas, a quantidade de ovalbumina adsorvida não varia (NP VI versus NP I). Tabela 1
Caracterização Físico-Química das diferentes formulações (com Dados Expressos como Média ± Desvio Padrão, n=10)
Figure img0001
nanopartículas foi de cerca de 70%.
EXEMPLO 2
Teste de ovalbumina In Vitro - Liberação das NanopartículasDe modo a avaliar uma liberação de ovalbumina in vitro, as nanopartículas foram incubadas em 1 mL de PBS (Salina Com Solução Tampão de Fosfato, pH 7,4) em tubos "Eppendorf" a uma concentração aproximada de 8 mg/mL. Os tubos foram incubados em um fornoa 37°C com rotação e em intervalos de tempo predeterminado as amostras foram centrifugadas a 26,500 x g durante 20 minutos, coletando o sobrenadante para sua análise subsequente. A ovalbumina liberada foi medida no sobrenadante pelo método do ácido bicinconínico.
A curva de liberação de ovalbumina obtida é mostrada na figura 1; é observado que na formulação NP I a ovalbumina é liberada mais rapidamente do que nas formulações NP II, NP III e NP IV, as quais apresentam um perfil de liberação similar. Isso ocorre devido ao fato de que, na formulação NP, I a ovalbumina é adsorvida na parte externa das nanopartículas, de forma que sua liberação inicial (manifestação repentina) é muito mais pronunciada do que das outras formulações, em que parte da ovalbumina é encapsulada (NP II, III e IV) . Por outro lado, nos perfis de liberação para NP II, NP III e NP IV, pode ser observado que, conforme a quantidade de agente de ligação cruzada aumenta, a porcentagem de ovalbumina liberada levemente diminui.
EXEMPLO 3
Quantificação de Produção de Anticorpo Anti-OVA depois da Imunização com Ovalbumina em Camundongos BALB/c65 camundongos BALB/c foram imunizados, sendo divididos em 13 grupos de acordo com o regime de administração.
Os controles usados não continham solução de ovalbumina (OVA) (10 μg por via intradérmica e 25 μg por via oral), nanopartículas vazias (NP) (por via intradérmica e por via oral) e ovalbumina adsorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum) (10 μg por via intradérmica), como o controle positivo indutor de resposta Th2, caracterizado pelos altos tituladores IgGl [Faquim-Mauro et al, Int Immunol, 12 (2000) 1733-1740].
Os grupos remanescentes foram inoculados por via intradérmica (10 μg OVA) ou por via oral (25 μg OVA) , com os diferentes tratamentos sendo os seguintes:a) Solução de Ovalbumina (OVA) por via intradérmicab) Solução de Ovalbumina (OVA) por via oralc) Ovalbumina absorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum) por via intradérmicad) Nanopartículas vazias (NP) por via intradérmicae) Nanopartículas vazias (NP) por via oral
Nanopartículas revestidas com Ovalbumina (NP I) por via intradérmicag) Nanopartículas revestidas com Ovalbumina (NP I) por via oralh) Nanopartículas com Ovalbumina Encapsulada (NP II) porvia intradérmicai) Nanopartículas com Ovalbumina Encapsulada (NP II) porvia oralj) Nanopartículas com ligação cruzada com 1,320 diaminopropano com Ovalbumina encapsulada (NP III e NP IV) por via intradérmicak) Nanopartículas com ligação cruzada com 1,3- diaminopropano com Ovalbumina encapsulada (NP III e NP IV) por via oral- Extrações de sangue sucessivasforam realizadas nos dias 7, 14, 28 e 35 depois daimunização. Os soros para cada um dos grupos foram coletados e congelados a - 80 °C para sua análise subsequente.
Os níveis de anticorpos anti- OVA (IgGl e IgG2a) foram determinados nos diferentes soros por intermédio de ELISA e os dados mostrados nas Figures 2 e 3 foram obtidos. Foi observado que as nanopartículas que 5 continham ovalbumina (NP I, NP II, NP III e NP IV) ou revestiam as nanopartículas ou as encapsulavam, aumentaram a resposta imune no que se refere à ovalbumina na solução. No dia 14 após a administração, as referidas formulações de nanopartícula são capazes de aumentar o titulador IgGl 10 em soros de camundongos em 3 ou 6 unidades logarítmicas, dependendo do tipo. Por outro lado, os camundongos aos quais OVA-Alum foi administrado tiveram uma ausência de anticorpos IgG2a no soro durante todo o experimento, ao passo que os camundongos aos quais 15 foi administrado NP III alcançaram um titulador de 5120 no dia 35 após a imunização.
Isso indica que, em geral, as referidas formulações de NP (NP I, NP II, NP III e NP IV) são capazes de ampliar as características de tituladores de 20 anticorpos tanto de Thl como de Th2, mas a formulação NP III, em particular, é a mais imunogênica.
Por outro lado, se os tituladores dos camundongos do grupo de NP III forem comparados com aqueles do grupo de NP IV, pode ser observado 25 que há uma ligação cruzada ideal (Exemplo 2, último parágrafo), visto que, embora tenham curvas de IgGl similares, os tituladores de IgG2a para NP III são levementemaiores do que no caso de NP IV.
Com relação aos resultados obtidos em camundongos que receberam administração via oral, foi observado que a única formulação que induziu a níveis passíveis de serem quantificados de anticorpos de IgGl e 5 IgG2a foi NP III (figura 3).
Depois de verificar isso, sob estas circunstâncias experimentais, a formulação NP III foi a mais eficaz, tendo sido realizado um estudo similar, modificando a dose de administração de NP III. Neste caso, 10 as seguintes formulações foram administradas (por via oral) aos animais:a) Nanopartículas vazias (NP)b) 25 μg de ovalbumina encapsulada com nanopartículas com ligação cruzada com 1,3-diaminopropano com Ovalbumina 15 Encapsulada (NP III-25)c) 50 μg de ovalbumina encapsulada com nanopartículas com ligação cruzada com 1,3-diaminopropano com Ovalbumina Encapsulada (NP III-50)
Neste caso, os resultados 20 obtidos (figura 4) mostram que os níveis de IgG2a anti-OVA no soro foram significativamente superiores quando a dose era de 50 μg. EXEMPLO 4
Quantificação de Anticorpo Anti-OVA e Produção de 25 Interleucina 10 (IL-10) após a administração de Nanopartículas de ovalbumina com Brucella ovis Lipossacarídeo40 camundongos BALB/c foramimunizados, divididos em 8 grupos de acordo com a forma de administração. A todos os grupos foi administrado o tratamento por via intradérmica (10 μg de ovalbumina). Desta vez, os diferentes tratamentos eram os seguintes: a) Solução de Ovalbumina (OVA)b) Ovalbumina absorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum) c) Nanopartículas vazias (NP)d) Nanopartículas revestidas com Ovalbumina (NP I)e) Nanopartículas com ligação cruzada com 1,3-diaminopropano com Ovalbumina Encapsulada (NP III)10 f) Nanopartículas com ligação cruzada com 1,3-diaminopropano com Ovalbumina encapsulada e revestidas com Brucella ovis R-LPS (NP V) g) Nanopartículas com Brucella ovis R-LPS encapsulada e revestidas com Ovalbumina (NP VI)h) Nanopartículas com ligação cruzada com 1,3-diaminopropano com Ovalbumina e Brucella ovis R-LPSencapsulada (NP VII)
O grupo que recebeu administração de ovalbumina adsorvida em ali-hidrogel por 20 via intradérmica (OVA-Alum) foi tomado como sendo o controle positivo do experimento.
Sucessivas extrações de sangue foram realizadas nos dias 7, 14, 28, 35, 42 e 49 após a imunização. As amostras foram processadas (vide Exemplo 3) e 25 os resultados foram obtidos e estão incluídos nas Figuras 5 e 6.Resposta de IgGl (figura 5):NP III, NP V e NP VII induziram a altos níveis de IgGl de uma maneira muito mais rápida e mais intensa do que a formulação de controle (OVA-Alum). Somente 49 dias após a administração, as formulações com base em nanopartícula e ocontrole (OVA-Alum) apresentam níveis similares. Por fim, R-LPS na superfície da nanopartícula não parece ter um efeito sobre a indução dos níveis de IgGl.Por outro lado, NP I também apresenta um forte potencial para indução de produção de anticorpo IgGl. Além do mais, como no caso anterior, este 10 fenômeno é mais rápido e mais intenso do que na formulação de controle. Quando o R-LPS está associado dentro de nanopartículas revestidas com OVA, uma significativa redução no titulador de IgGl do soro com relação ao NP I e às formulações de controle é observada.Resposta de IgG2a: A figura 6mostra os tituladores de IgG2a do soro do camundongo. Neste caso, nenhuma das formulações de controle (OVA, NP, OVA- Alum) induz a tituladores de anticorpo. Entretanto, formulações com OVA encapsulada foram capazes de prover 20 altos tituladores de IgG2a, principalmente quando o R-LPS foi absorvido na parte externa das nanopartículas (formulação NP V) . Por outro lado, o NP I parece ser muito mais eficaz que o NP VI quanto à indução da resposta de Thl medida no titulador de IgG2a no soro.IL-10: A figura 7 mostra osníveis de IL-10 no soro, os quais são determinados por intermédio de um kit ELISA (Biosource, Camarillo, EUA). Neste caso, os controles não foram capazes de induzir nem a uma secreção de IL-10 no soro. Entretanto, todas as formulações de nanopartícula, a um grau menor ou maior, induziram à secreção desta cotocina. A formulação com Ovalbumina adsorvida na superfície de NP (NP I) permitiu a 5 indução de um pico de IL-10 mais rapidamente do que as formulações restantes. Entretanto, a associação de LPS (NP VI) retardou de forma significativa (14 dias) a secreção de cotocina. Por outro lado, NP III mostrou ser a formulação mais eficaz para a indução de IL-10 no soro, causando aelevação a níveis que foram duas vezes mais altos do que comrelação ao NP I, embora fosse retardado, com o passar dotempo, em uma semana. A associação de R-LPS emnanopartículas encapsuladas OVA (NP V e NP VII) permitiu a indução de níveis mais discretos de IL-10, entretanto, com 15 um máximo de duas semanas após a administração. Este potencial das formulações de induzir a níveis significativos de IL-10 sugere seu uso como possíveis tratamentos para doenças caracterizadas pelos desequilíbrios no balanço de Thl/Th2 devido à força reguladora desta cotocina [Zuany- 20 Amorim et al, J Clin Invest, 95 (1995) 2644-2651; Stampfliet al, Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Hall et al, Vaccine, 21 (2003) 549-561].
EXEMPLO 5
Preparação, Caracterização e Administração de Nanopartículas 25 com Extrato de ChE de Salmonella enteritidis5.1 Extração do Extrato de ChE de Salmonella enteritidis0 extrato bacteriano de ChE(extrato caotrópico) foi obtido seguindo um protocolo previamente descrito por Altman et al. (Altman et al. , Biochem J. (1982) 505-513) . Inóculos de Salmonellaenteritidis em seu estágio estacionário foram incubados em frascos contendo 400 mL de meio de BHI (Brain HeartInfusion, Difco Lab., Detroit, USA), a 37°C, 48 horas, sem agitação. As células foram subsequentemente centrifugadas (7.000 x g, 30 minutos) e lavadas com PBS (Salina com Solução Tampão de Fosfato; 10 mm; pH 7,4). O extrato bacteriano foi obtido depois do tratamento do grânulocelular em 3M KSCN/PBS com agitação magnética (lh, temperatura ambiente), e subseqüente centrifugação (35.000 x g, 30 minutos) . 0 sobrenadante, que está contido no extrato de ChE, foi coletado e dializado em primeiro lugar contra o PBS e em seguida, contra a água deionizada. Foi, por fimliofilizado e preservado a 4 °C até seu uso posteriormente.5.2 Preparação de Nanopartículas com Ovalbumina e ChE de Salmonella enteritidis (OVASAL)100 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido [Gantrez® AN 119] são 20 dissolvidos em 3 mL de acetona, ao passo que por outro ladomg de ovalbumina e 5 mg de extrato de ChE são dispersos em 2 mL de acetona por intermédio de ultrassonicação (Microson™) durante 1 minuto com resfriamento. A dispersão de ovalbumina e ChE é adicionada à suspensão do polímero e 25 esta é agitada durante 30 minutos em temperatura ambiente.
Subsequentemente, 10 mL de etanol e 10 mL de água deionizada são adicionados a esta fase sob agitação magnética. Amistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o volume final é ajustado com água a 10 mL. Em seguida, eles são incubados com 0,1 mL de 5 uma solução a 1% de 1,3-diaminopropano.
A solução é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (20 minutos a 27.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em uma solução aquosa de 10 sacarose a 5%. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada.5.3 Quantificação de Produção de Anticorpo Anti-OVA depois da Imunização com Ovalbumina em Camundongos BALB/c15 camundongos foram15 imunizados por via intradérmica com 10 μg de ovalbumina e eles foram divididos em 3 grupos diferentes de acordo com o tratamento recebido:a) Solução de ovalbumina (OVA)b) Ovalbumina absorvida em ali-hidrogel (OVA-Alum)c) Nanopartículas de ovalbumina e ChE de Salmonella enteritidis (OVASAL)Depois da administração das diferentes formulações, foi extraído sangue do plexo retroorbital nos dias 7, 14, 28, 35, 42 e 49, e as amostras 25 foram processadas como indicado no Exemplo 3. Os resultados I obtidos são mostrados na figura 8. Surpreendentemente, a OVASAL aumentou de maneira considerável o titulador de IgGl, ao passo que o titulador de IgG2a permaneceu em níveis muito baixos. Isso indica que esta formulação é capaz de melhorar somente a resposta de Th2, a qual também era mais rápida e mais intensa do que a que foi para a formulação de controle (OVA-Alum). Estes resultados levam a pensar a respeito da 5 provável aplicação como um adjuvante em vacinas onde a obtenção de altos níveis de anticorpos ou contra-toxinas secretadas pelos microorganismos for de interesse. Também pode ser aplicável que em determinada doença autoimune . caracterizada por ter a resposta de Thl que sejaexcessivamente alta em fases agudas.
EXEMPLO 6
Preparação e Caracterização de Nanopartículas Biodegradáveis com o Extrato de HE de Salmonella enteritidis (NP HE 3934)* 6.1 Extração e caracterização do Complexo de Antígeno deíSalmonella enteritidis de HE 39340 antígeno usado é o extrato de superfície de S. enteritidis denominado HE (Extrato de Salina Quente) devido ao fato de que ele libera o complexo de antígeno em um meio de salina e com calor. Este HE contém 20 fosfolipídios, as proteínas da superfície e lipopolissacarídeo liso (S-LPS) . O extrato de HE foi obtido por intermédio de um método anteriormente descrito [Gamazo et al. , Infect. Immun. (1989) 1419-1426]. Depois de fazer a cultura da bactéria, Salmonella enteritidis 3934, em frascos w 25 contendo Caldo de Soja Tripticase (TSB), as bactérias foram • centrifugadas a 7.000 x g durante 30 minutos e foram lavadas * duas vezes com solução salina. As células vivas foramnovamente suspensas em solução salina (10 g de células úmidas em 100 mL) e é aquecida a 100 °C em vapor em fluxo durante 15 minutos. Depois da centrifugação (12.000 x g, 10 minutos), o sobrenadante é dialisado durante 5 dias em comparação com diversas mudanças com água deionizada. 0 5 material dialisado é ultra centrifugado durante 4 horas a 60.000 x g, e o grânulo (HE) é novamente suspenso em água deionizada, liofilizado e armazenado a temperatura ambiente.
A caracterização inclui a determinação de uma porcentagem de proteína elipopolissacarídeo. A determinação da quantidade deproteínas foi realizada pelo método Lowry. O extrato de antígeno de Salmonella enteritidis 3934 contém cerca de 31% de proteínas. A quantidade de LPS é indiretamente determinada por meio da medição de seus comercializadores 15 exclusivos, KDO, por intermédio do método do ácido tiobarbitúrico. 0,86 % de KDO, representando 65% de S-LPS, foi obtido por intermédio deste método.6.2 Produção e Caracterização Físico-Química das Nanopartículas com Extrato 3934 HE de Salmonella enteritidis 20 (NP HE 3934)
Em primeiro lugar, 100 mg do copolímero de metil vinil éter maleico anidrido são dissolvidos em 5 mL de acetona; HE de extrato de antígeno (4 mg), também novamente suspensos em 1 mL de acetona, é 25 adicionado a esta solução e é misturado com agitação magnética. Esta solução é deixada para ser incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente. 10 mL de etanol e por fim, o mesmo volume de água, foram subsequentemente, adicionados a esta fase. A mistura resultante é deixada para ser homogeneizada durante 5 minutos. A suspensão da nanopartícula é, em seguida, evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes orgânicos sejam removidos e o 5 volume final é ajustado com água a 10 mL.
A suspensão é individualizada para purificação por intermédio de ultracentrifugação (10 minutos a 35.000 x g) . Os sobrenadantes são removidos e o resíduo é novamente suspenso em uma solução aquosa de 10 sacarose a 5% w/v. Por fim, a suspensão resultante da nanopartícula é liofilizada, permitindo que esta mantenha todas suas propriedades intactas.
A fórmula resultante da suspensão da nanopartícula antes da liofilização é a 15 seguinte:Copolímero de metil vinil éter maleico anidrido (Gantrez® AN-119) 1.0 % w/vExtrato de antígeno 0.4% w/vSacarose 5.0% w/vÁgua f.i. q.s. 10 mL[f.i.: para injeção; q.s.: quantidade suficiente para]
O tamanho e a carga da superfície das nanopartículas são determinados antes do processo de liofilização. As nanopartículas obtidas têm um 25 tamanho médio inferior a 2 00 nm e a carga de superfície líquida negativa (- 20,1 ± 3,2 mV) . A produção do processo de produção foi obtida por meio da determinação de seu peso depois do processo de liofilização. Começando com 100 mg de copolímero, a quantidade transformada em nanopartícula ao final do processo foi determinada e foi expressa como uma porcentagem no que diz respeito à massa inicial do copolímero.
O extrato foi quantificado edetectado pelo método do ácido bicinconínico para aquelefim, antes da adição do agente de ligação cruzada, umaalíquota (1 mL) da suspensão da nanopartícula é tomada. As nanopartículas são divididas por meio de adição de 0,1 NNaOH, e esta mistura é analisada por meio do métodocolorimétrico de ácido bicinconínico com relação a proteínas antes da validação do método. A validação foi conduzida com o extrato dissolvido em nanopartículas vazias divididas em 0,1 N NaOH. A solução de ácido bicinconínico, juntamente com 15 sulfato cúprico a 5% a uma proporção de 100:2 é adicionado à amostra; a mistura é mantida a 37°C durante meia hora e é, em seguida, medida espectrofotometricamente a 562 nm.
A carga do extrato é expressa como sendo a quantidade do extrato em μg por mg de 20 nanopartículas e a eficácia do encapsulamento é determinada pela relação da quantidade encapsulada total do extrato com a quantidade inicial.
A tabela 2 mostra a carga do extrato de antígeno em nanopartículas (μg do extrato/mg B 25 nanopartícula) e eficácia do encapsulamento (%).. Tabela 2Características Físico-Químicas de Gantrez® AN 119Nanopartículas Carregadas com o Extrato de Antígeno
Figure img0002
a: A eficácia do encapsulamento refere-se à porcentagem de HE encapsulado, e foi calculada como sendo a quantidade de extrato de antígeno encapsulado vezes 100 e dividida pela quantia inicial.A figura 9 reflete o padrão daproteína de HE de S. enteritidis, no qual os diferentes componentes podem ser distinguidos: porinas (cerca de 36 kDa) , OmpA (34 kDa) e fimbriae SEF14 (14 kDa) e SEF21 (21 kDa) . Por intermédio de uma eletroforese de gel depoliacrilamida de dodecilsufato de sódio (SDS-PAGE) e imunização por mata-borrão foi confirmado que o extrato encapsulado preservou sua integridade e antigenicidade estrutural. Na figura 10, o perfil antigênico do extrato antes e depois do encapsulamento pode ser observado.
EXEMPLO 7
Estudo da Proteção Provida pela Vacina NP HE 3934 Administrada em Camundongos IntraperinotealmenteGrupos de camundongos BALB/c com nove semanas de idade, com cada grupo consistindo em 10animais, foram usados. A vacinação foi realizada com a preparação de vacina de nanopartícula (NP HE 3934) descrita no Exemplo 6 a uma proporção de 30 μg do extrato por animal, também incluindo como controles: i) a mesma quantidade das nanopartículas vazias correspondentes; ii) 30 μg/animal doextrato livre e não encapsulado de HE, iii) 200 μL da vacina « ►comercial Salenvac® (Intervet UK Limited, Walton, Inglaterra); iv) solução salina.Dez dias depois da vacinação, eles foram inoculados intraperitonealmente com uma doseletal de 102 CFU do cepo de S. enteritidis 3934, e foram realizadas contagens dos animais que morreram devido a salmonelose depois desta inoculação. Os resultados do experimento de proteção demonstram que a preparação da vacina com base em nanopartícula (NP HE 3934) protegida 10 contra a S. enteritidis subcutaneamente de um modo que é muito similar à vacina comercial Salenvac®, assim como o extrato de antígeno HE administrado livremente (HE Se 3934).
Os resultados mostram que o encapsulamento de extrato de HE em nanopartículas não 15 aumenta os níveis de proteção nos camundongos. Por outro lado, a imunização de camundongos com nanopartículas vazias induz a uma resposta imune não específica que provê proteção durante três semanas. Não obstante, deve ser indicado que a rota de administração do antígeno de HE, tanto na forma 20 livre como na encapsulada, era intraperitoneal. Estudos anteriores sugerem que a administração oral ou intranasal dos antígenos não encapsulados causaria sua degradação antes que eles pudessem alcançar seus locais de interação com as células que apresentam antígenos.
Além do mais, 10 dias depois- da vacinação, estudos sobre a imunidade provida pelas nanopartículas foram conduzidos no momento da infecção experimental, quantificando os níveis de produção de IFN-y e IL-4 (típicos de respostas imunes do tipo Thl e Th2, respectivamente) pelas células do baço nos camundongos (figura 12). A produção de anticorpos IgG2a e IgGl no sangue (Thl e Th2, respectivamente) também foi determinada (figura 5 13) .
Para estudar o equilíbrio imune de Thl/Th2 induzida pelo extrato livre e encapsulado de HEs no camundongo usados no estudo, os níveis de IFN- e IL-4 produzidos pelas células do baço dos animais imunizados 10 foram determinados (figura 12). 0 painel A shows os níveis induzidos de IFN- , indicando um aumento da referida produção nos camundongos imunizados com as nanopartículas (NP HE 3 934) . Em contraste, o painel B mostra como não há aumento significativo na produção de IL-4 nos camundongos 15 imunizados com o extrato livre de HE (HE 3934) e os camundongos imunizados com as nanopartículas de NP HE 3934. Em vista dos resultados obtidos, pode ser afirmado que o encapsulamento do extrato de HEs em nanopartículas favorece um crescimento na resposta do tipo Thl, refletida por um 20 aumento na produção de IFN-y, em comparação com a Th2.
A produção de anticorpos específicos contra o extrato de HEs de S. enteritidis 3934 em camundongos imunizados, foi estudada por intermédio de ELISA indireta (figura 13). Os camundongos não imunizados, 25 ou os camundongos imunizados com nanopartículas vazias (NP vazia) , não produziram anticorpos de IgG2a ou IgGl contra o extrato de HE de S. enteritidis 3934. Os níveis de IgG2adetectados foram superiores àqueles de IgGl em todos os soros de camundongos analisados pelo ELISA. Não obstante, um aumento na resposta sorológica nos camundongos imunizados com extrato encapsulado de HEs (NP HE 3934) em comparação com a resposta apresentada pelos camundongos imunizados com 5 extrato livre de HEs (HE 3934) não foi observado.
O IgG2a é um isótopo de anticorpo dominante nas respostas imunes de Thl, ao passo que IgGl tem a mesma função para respostas imunes de Th2, o que confirmaria os resultados obtidos no teste de liberação 10 de IFN- e IL-4, indicando que a administração intraperitoneal de nanopartículas com extrato de S. Hes enteritidis induz a uma resposta imune do tipo de Thl. Esta administração fornece um grau de proteção contra a salmonelose que é similar àquela observada quando o antígeno 15 livre é administrado. Não obstante, conforme previamente discutido, a aplicação destes antígenos não encapsulados através da mucosa não proveriam estes níveis de proteção observados neste experimento devido ao ácido e à degradação enzimática pela qual elas passariam em sua passagem através 20 do trato intestinal dos animais.Legenda das figuras
Figure img0003

Claims (23)

1. Composição estimulante da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico e um antígeno ou alérgeno, em que o referido antígeno compreende um extrato imunogênico de um microrganismo e o referido alérgeno compreende um extrato alergênico de pólen, um extrato alergênico de inseto, um extrato alergênico de produto alimentício, um extrato alergênico de fungos ou um extrato alergênico de epitélio animal, caracterizada pelo uso de nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico (PVM/MA) como adjuvante para a fabricação de uma vacina que compreende um antígeno ou para a fabricação de uma composição de imunoterapia compreendendo um alérgeno.
2. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as referidas nanopartículas à base de PVM/MA compreendem o referido alérgeno ou o referido antígeno.
3. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o referido alérgeno ou antígeno reveste pelo menos parcialmente a superfície das referidas nanopartículas e/ou está contido dentro das referidas nanopartículas.
4. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que as referidas nanopartículas à base de PVM/MA compreendem ainda um agente imunoestimulante.
5. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido agente imunoestimulante reveste pelo menos parcialmente a superfície das referidas nanopartículas e/ou está contido dentro das referidas nanopartículas.
6. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido alérgeno ou antígeno e agente imunoestimulante revestem pelo menos parcialmente a superfície das referidas nanopartículas e/ou estão contidas dentro das referidas nanopartículas.
7. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as referidas nanopartículas compreendem ainda um agente de reticulação.
8. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as referidas nanopartículas têm um tamanho médio igual ou inferior a 1,0 micrômetro, preferencialmente entre 10 e 900 nm, mais preferencialmente igual ou inferior a 400 nm.
9. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido copolímero de PVM/MA tem um peso molecular compreendido entre 100 e 2.400 kDa, preferencialmente entre 200 e 2.000 kDa, mais preferencialmente entre 180 e 250 kDa.
10. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida vacina ou composição de imunoterapia está em uma forma liofilizada.
11. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida vacina ou composição de imunoterapia está na forma de administração adequada para sua administração oral ou parenteral.
12. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida vacina ou composição de imunoterapia compreende: Componente % em peso em relação ao totalNanopartículas PVM/MA 84 a 99,998%Agente de reticulação 0,001 a 1%Alérgeno ou antígeno 0,001 a 15%.
13. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido alérgeno compreende um extrato de pólen alergênico, um extrato de inseto alergênico ou um extrato de produto alimentar alergênico.
14. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno compreende um extrato imunogênico de um organismo.
15. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o referido organismo é Salmonella spp., preferencialmente S. enteritidis.
16. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno é o extrato HE de S. enteritidis ou extrato ChE de S. enteritidis.
17. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico caracterizada pelo uso de nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico (PVM/MA) para a fabricação de uma composição para melhorar a resposta imune de um antígeno ou alérgeno co-administrado com ela.
18. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico caracterizada pelo uso de nanopartículas à base de um copolímero éter metil vinílico e anidrido maleico (PVM/ MA), em conjunto com um antígeno ou alérgeno, na fabricação de uma composição farmacêutica para a estimulação seletiva da resposta imune Th1, ou na fabricação de uma composição farmacêutica para a estimulação seletiva da resposta imune Th2, ou na fabricação de uma composição farmacêutica para a estimulação equilibrada das respostas imunes Th1 e Th2.
19. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 e 18, caracterizada pelo fato de que o referido alérgeno compreende um extrato de pólen alergênico, um extrato de inseto alergênico ou um extrato de produto alimentar alergênico.
20. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 e 18, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno compreende um extrato imunogênico de um organismo.
21. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o referido organismo é Salmonella spp., preferencialmente S. enteritidis.
22. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno é o extrato HE de S. enteritidis ou o extrato ChE de S. enteritidis.
23. Composição estimuladora da resposta imune compreendendo nanopartículas à base de um copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico caracterizada por ser um produto compreendendo separadamente: (i) uma composição compreendendo um alérgeno ou um antígeno e (ii) uma composição compreendendo nanopartículas à base de copolímero de éter metil vinílico e anidrido maleico (PVM/MA), como composição melhoradora da resposta imune em relação ao referido alérgeno ou antígeno, como combinação para sua administração simultânea ou sequencial a um indivíduo, para melhorar a resposta imune em relação ao referido alérgeno ou antígeno no dito indivíduo.
BRPI0509828-9A 2004-04-29 2005-04-28 Composição de estimulação da resposta imune compreendendo nanopartículas com base em éter maleico vinil metil e copolímero anidrido BRPI0509828B1 (pt)

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