BRPI0501751B1

BRPI0501751B1 - processo de eletroforese capilar e estojo de análise de eletroforese capilar em solução livre de constituintes protéicos

Info

Publication number: BRPI0501751B1
Application number: BRPI0501751-3A
Authority: BR
Inventors: Frédéric Robert; Denis Simonin
Original assignee: Sebia
Priority date: 2004-05-10
Filing date: 2005-05-09
Publication date: 2020-10-27
Also published as: DK1596192T3; FR2869995B1; EP1596192A1; CN1727887B; PT1596192E; JP2005326407A; US20050274616A1; JP4693484B2; CY1113490T1; ES2397156T3; AR048735A1; BRPI0501751A; SI1596192T1; CN1727887A; PL1596192T3; FR2869995A1; US7906001B2; EP1596192B1

Abstract

PROCESSO DE ELETROFORESE CAPILAR, PROCESSO DE SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE, PROCESSO DE SEPARAÇÃO ELETROFORÉTICA, COMPOSIÇÃO PARA ELETROFORESE CAPILAR E ESTOJO DE ANÁLISE. A presente invenção trata de um processo de eletroforese capilar em solução livre a pH alcalino para a análise de amostras que comportam constituintes protéicos, sendo um (ou mais) constituinte(s) lipoprotéico(s), caracterizado pelo fato de comportar pelo menos uma etapa em que se introduz a amostra em um tubo capilar que contém um tampão de análise, tampão de análise esse que comporta ainda pelo menos um aditivo do tipo tensoativo aniônico capaz de interação hidrófoba com o (ou os) constituinte(s) lipoprotéico(s) e de modificar sua mobilidade eletroforética. E la trata ainda de uma composição para eletroforese capilar bem como de um estojo de análise dos constituintes protéicos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção trata de um processo para a separação de proteínas e peptídeos por eletroforese capilar, bem como das composições de tampão que comportam um aditivo útil para essa separação, na presença de lipoproteínas na amostra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Costuma-se analisar a taxa de proteínas em líquidos biológicos como soro para fins analíticos e, em particular, diagnósticos e separar habitualmente proteínas por eletroforese, tanto por eletroforese em gel como por eletroforese capilar. Um dos interesses da eletroforese capilar reside no fato de que são necessárias pequeníssimas quantidades de líquidos biológicos para ser analisados. Além disso, a separação por essa técnica pode ser muito rápida, pelo fato ser possível utilizar voltagens fortes sem que a amostra se aqueça muito durante a separação.

[003] Para a separação das proteínas séricas, efetua-se de modo clássico a eletroforese capilar com tampões alcalinos. Usualmente, os perfis protéicos obtidos comportam cinco ou seis frações que correspondem aos constituintes protéicos que são a fração albumina, as frações oci- e oc2- globulina, a fração β-globulina, ou as frações βi- e β2-globulina, a fração y- globulina. Cada uma dessas frações comporta uma ou mais proteínas séricas.

[004] Essas separações podem ser feitas, em eletroforese capilar, em particular por meio de tampões de análise e técnicas tais como descritos nas patentes US Re 36.011, EP 0.518.475 ou EP 1.229.325 e EP 1.258.724.

[005] A separação das proteínas séricas é, porém às vezes insuficiente.

[006] De fato, por “constituinte protéico”, entende-se aqui não apenas os constituintes protéicos que são as frações ou-; az- β- ou βi e β2; e y- globulina, mas também os constituintes lipoprotéicos que são principalmente as a-lipoproteínas, β-lipoprcteinas e pre-β-lipoproteinas também chamadas HDL, LDL e VLDL para “Lipoproteína de alta densidade”, “Lipoproteína de baixa densidade” e “Lipoproteína de densidade muito baixa”, respectivamente. Ora, os perfis são muitas vezes imprecisos em particular por causa dessas lipoproteínas e principalmente da β-lipoproteina e da preβ-lipoproteina, que aparecem na zona dos perfis que correspondem às ou- e otz-globulinas e β-i-globulina.

[007] A Depositante descobriu agora que utilizando um tensoativo aniônico como aditivo ao tampão de análise era possível obter uma separação melhorada e particularmente um perfil mais limpo na zona das ai-, 0C2- e βi- globulinas do perfil eletroforético. Esses aditivos são escolhidos entre os tensoativos aniônico capaz de interações hidrofóbicas com um ou mais constituintes lipoprotéicos, e em particular os resíduos hidrófobos das lipoproteínas. Eles podem conferir a esse ou esses constituintes lipoprotéicos uma ou mais cargas negativas. Eles podem modificar, e em particular diminuir sua mobilidade eletroforética em relação à dos outros constituintes protéicos.

[008] Nas concentrações baixas de aditivo utilizadas de acordo com a presente invenção, concentrações muito baixas em relação às concentrações utilizadas para esses aditivos em outras aplicações, os perfis obtidos em eletroforese capilar podem apresentar picos mais limpos, isentos de sobreposições, em particular no que se refere às frações oci e 0C2, como mostram os exemplos. Esse fato tem um grande interesse para a exploração dos perfis de amostras de soro hiperlipêmicas em particular, e apresenta um interesse certo igualmente na análise de amostras normolipêmicas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] Assim, a presente invenção trata de um processo de eletroforese capilar em solução livre a pH alcalino para a análise de amostras que comportam constituintes protéicos, sendo um (ou mais) constituinte(s) lipoprotéico(s), no qual se introduz uma amostra em um tubo capilar que contém um tampão de análise, tampão de análise esse que comporta ainda pelo menos um aditivo de tipo tensoativo aniônico capaz de interação hidrofóbica o(s) constituinte(s) lipoprotéico(s). Esse aditivo é capaz de conferir a esse (ou esses) constituinte(s) lipoprotéico(s) uma ou mais cargas negativas e modificar a mobilidade eletroforética, em relação à dos outros constituintes protéicos não lipídicos.

[010] Essa etapa é em geral seguida da separação dos constituintes protéicos por migração e detecção dos constituintes.

[011] A presente invenção trata ainda de um processo de separação por eletroforese dos constituintes protéicos de amostras que comportam pelo menos albumina e as frações on-, az- e βi-globulina, bem como lipoproteínas, em um tampão de análise, no qual o tampão de análise comporta ainda pelo menos um aditivo tensoativo aniônico capaz de interação hidrofóbica com as lipoproteínas.

[012] A presente invenção trata ainda de um processo de separação eletroforética, por eletroforese capilar em solução livre a pH alcalino, dos constituintes protéicos de uma amostra líquida que comporta lipoproteínas, processo esse no qual a amostra que comporta os referidos constituintes é passada em um capilar que contém um tampão de análise que comporta ainda pelo menos um aditivo capaz de interagir especificamente com as lipoproteínas; o aditivo pode ser um tensoativo aniônico que comporta uma parte hidrofóbica, como uma cadeia alquila com C10 a C20, e uma parte aniônica que possui uma carga negativa forte e um pH superior a 9.

[013] O aditivo de tipo tensoativo aniônico é utilizado em concentrações baixas no tampão, de modo que a interação fica fraca na albumina e os outros constituintes protéicos não lipídicos e particularmente centrada nas lipoproteínas, o que é chamado aqui de “específica das proteínas”. De fato, para essa interação específica com as lipoproteínas, é preferível utilizar o aditivo do tipo tensoativo aniônico em concentrações baixas. Essas concentrações dependem, para cada tensoativo aniônico, de sua afinidade com as lipoproteínas, de um lado, e de sua afinidade com a albumina e os outros constituintes protéicos não lipídicos, de outro lado. A concentração ótima é portanto diferente para cada tensoativo. Ela pode ser da ordem de menos de 1 mM no tampão, por exemplo, da ordem de 0,001 a 0,2 mM, de preferência superior a 0,01 e inferior a 0,1 mM, por exemplo compreendida entre 0,01 mM e 0,09 mM.

[014] A Depositante constatou, em particular para o SDS, que uma concentração de cerca de 0,05 mM não provoca um deslocamento suficiente dos constituintes lipoprotéicos e que uma concentração superior a 0,2 mM deforma os perfis (diminuição das frações β2 e ou para 0,25 mM) e conduz mesmo a 0,5 mM a uma deformação total dos perfis.

[015] Assim, os compostos úteis como aditivo para tampão de análise em eletroforese capilar da presente invenção capazes de interação hidrofóbica específica com as lipoproteínas podem ser tensoativos aniônicos tais como os utilizados em MECC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography), mas a uma concentração nitidamente inferior à sua concentração micelar crítica. Na presente invenção, esses compostos são utilizados em EC em solução livre como indicado acima. Há um aporte de cargas negativas nas lipoproteínas por interação hidrofóbica entre os resíduos hidrófobos dessas lipoproteínas e a parte hidrofóbica desses compostos, daí uma migração mais lenta dessas lipoproteínas em relação à das outras proteínas. Uma das conseqüências é a separação melhorada das frações ou, 02 e βi, e as lipoproteínas migrando para fora das zonas em que migram habitualmente, ou seja, para as zonas ou, 02 e β-i. Eles são também utilizados em uma concentração inferior às concentrações descritas em EP 1.229.325.

[016] Além disso, a presente invenção trata das composições de eletrólito para a eletroforese capilar que comportam, em um suporte aceitável, pelo menos um tampão e um aditivo de tipo tensoativo aniônico tal como definido acima, capaz de fazer migrar as lipoproteínas para fora das zonas em que elas migram habitualmente, em particular para fora das zonas das frações ou, 012 e βi.

[017] Como se pode ver nos exemplos, o uso de aditivos de acordo com a presente invenção permite uma separação muito melhorada das frações protéicas cu, oc2 e β-i, por deslocamento das lipoproteínas para fora da zona própria a essas frações. Ele permite com isso melhorar a exatidão e a precisão da análise quantitativa das proteínas séricas, em relação às análises realizadas com os tampões usuais. Os aditivos são particularmente úteis para a análise de amostras biológicas ricas em β- lipoproteína e pr0β-lipoproteina.

[018] Finalmente, a presente invenção tem por objeto estojos (ou kits) de análise dos constituintes protéicos em uma amostra biológica, que compreende pelo menos um tampão de análise e um aditivo de tipo tensoativo aniônico, capaz de fazer migrar as lipoproteínas para fora das zonas em que elas migram habitualmente, em particular para fora das zonas das frações αi, az e βi e/ou que comporta uma parte hidrofóbica, como uma cadeia alquila com C10 a C20, e uma parte aniônica que possui uma carga negativa forte em um pH superior a 9 e/ou uma ou mais solução(ões) de lavagem dos capilares e/ou tiras de diluição e/ou um (ou mais) diluente(s) da amostra a ser analisada. Nesse kit, o tampão e o os aditivo(s) e diluente(s) podem ser armazenado(s) separadamente para ser misturados extemporaneamente, ou armazenados em mistura. Esse kit compreende eventualmente indicações de uso para realizar a análise.

[019] Outras características e vantagens da presente invenção aparecerão na leitura da descrição detalhada que será feita a seguir, dos exemplos e figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] A figura 1 representa um eletroferograma de um soro humano analisado por eletroforese capilar utilizando um tampão de acordo com o documento EP 1 229 325.

[021] A figura 2 mostra um eletroferograma do mesmo soro analisado por eletroforese capilar utilizando o mesmo tampão que comporta, porém, ainda um aditivo tensoativo aniônico de acordo com a presente invenção.

[022] As figuras 3A, 3B, 3C e 3D representam os eletroferogramas de um mesmo soro normolipêmico, realizado por EC, utilizando um mesmo tampão com adição de 0; 0,05; 0,07 e 0,25 mM de SDS respectivamente.

[023] As figuras 4A, 4B, 4C e 4D representam os electroforegramas de uma mesmo soro hiperlipêmico, realizado em EC, utilizando um mesmo tampão com adição de 0; 0,05; 0,07 e 0,25 mM de SDS respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[024] As condições de realização de uma eletroforese capilar EC são conhecidas do técnico no assunto. Elas podem comportar habitualmente uma lavagem dos capilares com uma solução de lavagem, uma lavagem com tampão de análise, uma ou mais diluição(ões) eventual(ais) da amostra, a injeção da amostra, a migração e a detecção. Essas etapas podem ser realizadas por autômatos.

[025] Condições de realização de uma eletroforese capilar são por exemplo as condições apropriadas para utilizar o autômato Capillarys (Sebia).

[026] A título de aditivo para tampão útil de acordo com a presente invenção e capaz de interação com a parte hidrofóbica das lipoproteínas, pode-se citar os compostos que comportam um pólo aniônico que possui uma carga negativa forte em pH alcalino e uma parte hidrofóbica.

[027] A cadeia alquila hidrofóbica pode ser composta de pelo menos uma cadeia alquila com Cio a C24, ramificada ou não, que comporta pelo menos uma parte linear de cerca de 10 átomos de carbono, em particular 10 a 20 átomos de carbono. Como o técnico poderá compreender facilmente, essa parte hidrofóbica poderá comportar resíduos ou funções que não modificam essencialmente seu caráter hidrófobo.

[028] O pólo aniônico pode ser constituído por um ou mais grupos ou funções químicas da seguinte lista: sulfonatos, carboxilatos, sulfatos e fosfatos.

[029] Pode-se assim citar em particular os tensoativos aniônicos como os Cio-C24-alquil-mono-, di- ou tri-sulfatos, os Cio-C24-alquil-mono-di- ou tri-sulfonatos, os Cio-C24-alquil-mono-di- ou tri-carboxilatos, Cio-C24-alquil-mono- di- ou tri-fosfatos e os C10-C24 alquilcarboxi-sulfonatos, - sulfatos e -fosfatos, e em particular os C10 a C24-alquilsulfatos.

[030] Os di- e tri-carboxilatos, di- e tri-sulfonatos, di- ou tri- sulfatos e di- ou tri-fosfatos, e carboxi-sulfonatos, -sulfatos e -fosfatos acima são assim combinações de uma ou mais funções carboxilatos, sulfatos, sulfonatos ou fosfatos com cadeias alquilas de 10 a 24 átomos de carbono.

[031] Entre os tensoativos aniônicos citados acima, preferem-se os C10-C24 monoalquilsulfatos, particularmente os C10 a C20 alquilsulfatos e entre eles os C10 a C16 alquilsulfatos.

[032] Esses compostos são conhecidos em si e estão disponíveis no comércio. Eles podem estar em forma ácida ou em forma de sais em particular sais de metais alcalinos.

[033] Prefere-se particularmente o dodecilsulfato e mais precisamente 0 dodecilsulfato de sódio (SDS).

[034] Nas denominações acima, os radicais alquila são de preferência lineares.

[035] Os aditivos de tipo tensoativos aniônicos definidos acima podem também ser utilizados em mistura.

[036] Além disso, os aditivos de tipo tensoativo aniônico podem vantajosamente ser utilizados em presença de aditivos conhecidos por interagir com a albumina, melhorando a distância entre a ai-globulina e a albumina tais como descritos no documento EP 1.229.325.

[037] Entre os aditivos citados no documento EP 1 229 325 acima por sua interação com a albumina, preferem-se os CΘ a C10 alquilsulfonatos e entre os Cε a C10 alquilsulfonatos, prefere-se particularmente o octanossulfonato que melhora consideravelmente a legibilidade dos perfis em virtude da separação entre a ai-globulina e a albumina.

[038] Por “amostra” de acordo com a presente invenção, entende-se a amostra biológica a ser analisada, previamente diluída com uma solução de diluição apropriada ou do tampão de análise, por exemplo, ou pura.

[039] Como amostra, pode-se analisar qualquer líquido biológico de pacientes sadios ou doentes. Assim, os líquidos biológicos humanos podem ser um soro normal ou não, e também sangue hemolisado, plasma, urina ou fluido cérebro-espinal. Além das amostras biológicas humanas, pode-se analisar amostras de origem animal. As amostras podem também ser proteínas sintéticas, e o processo da presente invenção pode então ter objetivos de controle da produção, por exemplo.

[040] Os aditivos de acordo com a presente invenção são particularmente úteis para as análises de soro, e a separação de proteínas séricas, em amostras humanas.

[041] Nas amostras de soro, as proteínas séricas que vão ser separadas são a albumina e as frações ou-; OC2-; β (ou βi- e β2-); e y-globulina, e as a-lipoproteínas, β-lipoproteinas e preβ-lipoproteinas, particularmente as β- lipoproteínas e preβ-lipoproteinas. Essas denominações podem incluir os constituintes protéicos de todos os subtipos dessas classes.

[042] A título de tampão de análise, pode-se citar qualquer tampão de análise conhecido, adaptado à separação desejada, e útil em eletroforese em geral, e em eletroforese capilar em particular. A título de exemplo, pode-se citar os tampões borato, fosfato e carbonato, os tampões à base de ácido aminado e os tampões ditos biológicos. Pode-se citar em particular o tampão Capillarys B1B2+ (Sebia).

[043] Como tampão biológico, pode-se citar os tampões conhecidos com os nomes de Bis-TRIS (2-bis[2-hidroxietil]amino-2-hidroximetil- 1,3-propanodiol), ADA (ácido N-[2-acetamido]-2-iminodiacético, ACES (ácido 2- [2-acetamino]-2-aminoetanossulfônico, PIPES (ácido 1,4- piperazinadietanossulfônico), MOPSO (ácido 3-[N-morfolino]-2- hidroxipropanossulfônico), Bis-TRIS PROPANO (1,3- bis[tris(hidroximetil)metilaminopropano]), BES (ácido N,N-bis[2-hidroxietil]-2- aminoetanossulfônico), MOPS (ácido 3-[N-morfolino]propanossulfônico, TES (ácido 2-[2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etilamino]etanossulfônico), HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]-piperazina-N’-(2-etanossulfônico), DIPSO (ácido 3-N,N-bis(2- hidroxietilamino-2-hidroxipropanossulfônico), MOBS (ácido 4-N- morfolinobutanossulfônico), TAPSO (ácido 3[N-tris-hidroximetil-metilamino]-2- hidroxipropanossulfônico), TRIS (2-amino-2-[hidroximetil]-1,3-propanodiol, HEPPSO (ácido N-[2[hidroxietil)piperazina-N’-[2-hidroxipropanossulfônico), POPSO (ácido piperazina-N,N-bis[2-hidroxipropanossulfônico, TEA (trietanolamina), EPPS (ácido N-[2-hidroxietil]-piperazina-N’-[3- propanossulfônico]), TRICINA (N-tris[hidroximetil]metilglicina), GLI-GLI (diglicina), BICINA (N,N-bis[2-hidroxietil]-glicina), HEPBS (ácido N-[2- hidroxietil]piperazina-N’-[4-butanossulfônico), TAPS (ácido N- tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanossulfônico, AMPD (2-amino-2-metil-1,3- propanodiol), TABS (ácido N-tris[hidroximetil]metil-4-amino butanossulfônico) AMPSO (ácido 3-[(1,1 -dimetil-2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanossulfônico, CHES (ácido 2-(N-ciclo-hexilamino)etanossulfônico, CAPSO (ácido 3-[ciclo- hexilamino]-2-hidroxi-1 -propanossulfônico, AMP (2-amino-2-metil-propanol), CAPS (ácido 3-ciclo-hexilamino-1 -propanossulfônico) ou CABS (ácido 4-[ciclo- hexilamino]-1-butanossulfônico, de preferência AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS ou CABS.

[044] Em eletroforese capilar a pH alcalino, o pH do tampão de análise está compreendido entre 8 e 12, de preferência entre 9 e 11, e de modo particularmente preferido possui um valor de aproximadamente 10.

[045] Os tampões de análise de acordo com a presente invenção podem comportar ainda pelo menos um composto que modifica o pH. A título de modificador de pH, pode-se utilizar um composto escolhido entre o hidróxido de lítio, o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, o hidróxido de rubídio, o hidróxido de césio, o hidróxido de frâncio, o hidróxido de mono-, di-, th- ou tetra- alquil amónio que possui de 1 a 8 átomos de carbono na porção alquila.

[046] De acordo com a presente invenção, os tampões de análise são utilizados nas condições e concentrações habituais, ou seja, da ordem de 10 a 500 mM, de preferência de 20 a 400 mM.

[047] Os aditivos de acordo com a presente invenção são utilizados em concentrações definidas acima, baixas em relação às concentrações descritas no documento EP 1.229.325 no que se refere à sua interação com a albumina. De modo geral, ela é da ordem de 0,001 a 0,2 mM, de preferência 0,01 a 0,09 mM, e no caso do SDS, ela é inferior à que provocaria uma interação muito forte com a albumina e os outros constituintes protéicos não lipídicos, ou seja, que perturbaria demasiadamente o perfil.

[048] Os aditivos dedicados mais especificamente de modo conhecido à interação com a albumina são utilizados em concentrações que variam de 0,1 mM a 500 mM, sem todavia ultrapassar sua concentração micelar crítica no tampão de análise. Esse valor de concentração micelar crítica ocorre para os aditivos que são tensoativos.

[049] Quando o octanossulfonato é utilizado, sua concentração no tampão é da ordem de 1 a 10 mM, e de preferência 2,5 a 5 mM.

[050] Seu uso na presença de SDS pode permitir a interferência no efeito do SDS sobre o deslocamento dos picos em particular na zona albumina.

[051] Além disso, o tampão pode comportar um ou mais aditivo(s) próprio(s) para aumentar a força iônica.

[052] A título de tais aditivos para tampão capazes de aumentar a força iônica do eletrólito, pode-se citar os compostos escolhidos entre os cloretos, sulfatos, sulfonatos, carbonatos, carboxilatos, fluoretos ou fosfatos de metais alcalinos e suas misturas. Entre eles, preferem-se os cloretos, sulfatos ou sulfonatos, de metais alcalinos e suas misturas.

[053] De modo ainda mais preferido, utiliza-se o sulfato. De preferência, escolhem-se os sais de sódio, lítio e potássio. Entre os aditivos citados, o sulfato de sódio e/ou de lítio são os preferidos.

[054] As composições de tampão da presente invenção são preparadas de modo usual para composições de tampão de análise, ou seja, por adição de constituintes em forma líquida, ou sólida a ser diluída, a um suporte aceitável. De modo usual, o suporte é a água, destilada, ou desmineralizada.

[055] Do ponto de vista dos materiais utilizados para os capilares, eles são usuais em eletroforese capilar. Assim, pode-se utilizar capilares de sílica fundida. Seu diâmetro interno pode variar de 5 a 2 000 ^m. De modo preferido, utilizam-se de acordo com a presente invenção capilares de diâmetro inferior a 200 p.m, de preferência inferior a 100 um. Utilizam-se de preferência capilares com uma superfície interna não tratada. O técnico no assunto saberá adaptar a natureza do capilar e seu tamanho às necessidades da análise.

EXEMPLOS EQUIPAMENTO E MÉTODOS A) ELETROFORESE CAPILAR

[056] A eletroforese capilar de amostras clínicas é realizada com um aparelho de EC dotado de um capilar de sílica fundida com um diâmetro interno de 25 microns. A detecção é realizada a 200 nm. As amostras são colocadas no injetor de amostras do aparelho Capillarys (Sebia) e as amostras são injetadas automaticamente por injeção hidrodinâmica. A separação das amostras é realizada em menos de 5 minutos aplicando um campo elétrico de cerca de 400 V/cm. O capilar é lavado antes de cada análise com soda 0,25 M. e depois com o tampão de análise.

[057] Tampões de análise:

[058] Os produtos químicos utilizados são de grau analítico.

[059] O tampão borato 150 mM é preparado dissolvendo-se 9,3 g de ácido bórico (massa molar: 61,83 g/mol) em 1 I de água desmineralizada, e 5,1 g de soda (massa molar: 40,0 g/mol). A concentração final é de 150 mM e o pH é de 10,0.

B) AMOSTRAS CLÍNICAS

[060] Para a EC, o soro humano é diluído a 1/5 no tampão de análise.

EXEMPLO 1 (COMPARATIVO)

[061] Um tampão de análise borato é preparado do modo indicado acima.

[062] A eletroforese foi realizada de acordo com o método acima em um soro humano hiperlipêmico (Triglicérides: 5,73 g/l).

[063] Como mostra a figura 1, o eletroferograma obtido apresenta, da esquerda para a direita, seis picos sucessivos atribuídos respectivamente às frações albumina e oci, ci2, βi, β2 e y-globulina.

EXEMPLO 2

[064] Ao tampão de análise do exemplo 1, adiciona-se SDS a uma concentração de 0,07 mM.

[065] A eletroforese é realizada como no Exemplo 1.

[066] Como mostra a figura 2, o eletroferograma obtido apresenta, da esquerda para a direita, seis picos sucessivos atribuídos respectivamente às frações albumina e oci, oc2, βi, β2 e y-globulina. Por comparação com o resultado do exemplo 1, a separação entre as duas frações apresenta uma melhora nítida. De fato, o pico identificado por uma seta e sobreposto no pico de alfa-1 (correspondente às pre-β-lipoproteinas) é eliminado do perfil.

EXEMPLO 3

[067] A eletroforese de um soro humano normolipêmico (triglicérides: 1,10 g/l) foi realizada como nos exemplos anteriores adicionando- se SDS ao tampão, em uma concentração de 0,00; 0,05; 0,07 e 0,25 mM.

[068] Os eletroferogramas obtidos apresentam da esquerda para a direita seis picos sucessivos atribuídos respectivamente às frações albumina e αi, oi2, βi, β2 e y-globulina. O quadro a seguir retoma os resultados obtidos.

EXEMPLO 4

[069] Procedeu-se como no exemplo 3 com um soro humano hiperlipêmico (triglicérides: 5,63 g/l). Os eletroferogramas obtidos apresentam, da esquerda para a direita, seis picos sucessivos atribuídos respectivamente às frações albumina e ai, 02, βi, β2 e y-globulina. O quadro a seguir retoma os resultados obtidos.

Claims

1. PROCESSO DE ELETROFORESE CAPILAR, em solução livre a pH alcalino para a análise de amostras que comportam constituintes proteicos, sendo um (ou mais) constituinte(s) lipoprotéico(s), caracterizado por compreender pelo menos uma etapa em que: a amostra é introduzida em um tubo capilar que contém um tampão de análise, o tampão de análise compreende ainda pelo menos dodecilsulfato de sódio como um aditivo do tipo tensoativo aniônico, sendo que a concentração do referido aditivo no tampão está compreendida entre 0,001 mM e 0,2 mM.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a separação dos constituintes por migração e a detecção desses constituintes.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela amostra ser biológica.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela amostra ser uma amostra de soro, sangue hemolisado, plasma, urina ou líquido céfalo-raquidiano.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos constituintes serem séricos.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos constituintes serem a albumina e as frações oci-, oc2- β- ou (βi- e β2-), y-globulina e os constituinte(s) lipoprotéico(s) serem a oc-lipoproteína, a β-lipoproteina e/ou a pre-β-lipoproteina.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela concentração de dodecilsulfato de sódio no tampão estar compreendida entre 0,01 mM e 0,09 mM.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela concentração de dodecilsulfato de sódio no tampão ser da ordem de 0,07 mM.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo tampão compreender ainda um aditivo de tipo octanossulfonato, em uma concentração do referido tampão compreendida entre 1 mM e 10 mM, de preferência 2,5 e 5 mM.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo pH do dito tampão de análise estar compreendido entre 9 e 11.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo capilar ser de sílica fundida.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo tampão de análise compreender ainda pelo menos um modificador de pH.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo modificador de pH ser escolhido entre o hidróxido de lítio, o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, o hidróxido de rubídio, o hidróxido de césio, o hidróxido de frâncio, o hidróxido de mono-, di-, tri- ou tetra-alquil amónio que possui de 1 a 8 átomos de carbono na porção alquila.

14. ESTOJO DE ANÁLISE DE ELETROFORESE CAPILAR EM SOLUÇÃO LIVRE DE CONSTITUINTES PROTÉICOS, incluindo um ou mais constituintes lipoprotéicos em uma amostra biológica, caracterizado por compreender pelo menos um tampão de análise e um aditivo de tipo tensoativo aniônico que é dodecilsulfato de sódio, e/ou uma ou mais solução(ões) de lavagem dos capilares e/ou um (ou mais) diluente(s) apropriado(s) e/ou tiras de diluição, sendo que a concentração de aditivo no tampão está compreendida entre 0,001 mM e 0,2 mM após mistura eventual do tampão e do aditivo.