BRPI0416861B1

BRPI0416861B1 - dispositivo de definição de volume de amostra, e, método para separar e diluir um pequeno volume definido de uma amostra de líquido

Info

Publication number: BRPI0416861B1
Application number: BRPI0416861A
Authority: BR
Inventors: Ingemar Berndtsson
Original assignee: Boule Medical Ab
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2016-07-19
Also published as: BRPI0416861A; CN1886644B; SE0303157D0; CA2545956A1; ES2371344T3; EA008565B1; SE526330C2; ZA200600448B; AU2004293739A1; PL1687612T3; UA83084C2; CN1886644A; EA200600769A1; US7521256B2; ATE526570T1; DK1687612T3; SE0303157L; WO2005052553A1; EP1687612A1; EP1687612B1

Abstract

"método para separar pelo menos um pequeno volume definido de uma amostra líquida de um volume indefinido relativamente grande de dita amostra, e, dispositivo de definição de volume de amostra". um método e um dispositivo para separar um pequeno volume definido de uma amostra liquida de um volume um indefinido relativamente grande de amostra. em uma superfície de um primeiro corpo (10) é fornecida, pelo menos, uma cavidade (12) que tem dito pequeno volume definido. o volume relativamente grande de amostra é aplicado sobre a superfície e para o interior da cavidade. uma borda raspadora (15) é movida em relação à superfície e à cavidade, raspando com isto um volume do volume relativamente grande a partir da superfície, deixando dito pequeno volume definido na cavidade.

Description

^DISPOSITIVO DE DEFINIÇÃO DE VOLUME DE AMOSTRA. E, MÉTODO PARA SEPARAR E DILUIR UM PEQUENO VOLUME DEFINIDO DE UMA AMOSTRA DE LÍQUIDO” A presente invenção é relativa a um método e um dispositivo para definir um pequeno volume de uma amostra líquida separando-a de um volume indefinido relativamente grande de dita amostra, e sendo útil, por exemplo, em teste de sangue para fornecer um volume definido de maneira precisa de uma amostra de sangue.

Em teste de sangue, é de importância crucial definir um volume preciso de uma amostra de sangue, uma vez que tal volume definido de forma precisa é mais tarde utilizado para certos testes. O volume definido de maneira precisa de amostra de sangue é normalmente diluído por um volume precisamente definido de um diluente ou um agente lisante (antiséptico) para obter uma diluição de tipicamente 1: 400 quando células brancas do sangue estão envolvidas e, tipicamente 1 : 40.000 quando se trata de contagem de células vermelhas do sangue (RBC), neste último caso, a diluição normalmente tendo lugar em duas etapas. É obvio que medição de volumes de amostra e diluição de volumes líquidos devem ser realizadas em uma maneira precisa e que possa ser repetida de tal modo que nao apenas um grau correto de diluição possa sempre ser garantido, mas também que uma mistura total e uniforme dos dois volume seja assegurada. Aparentemente, a medição precisa de volumes de amostra é a etapa mais crítica no procedimento de diluição, uma vez que os volumes envolvidos são extremameme pequenos comparados aos volumes correspondentes de diluente. Um volume de amostra típico no estado da técnica de dispositivos de teste de sangue é 20 micro! itros.

Dispositivos no estado da técnica freqüentemenie utilizam válvulas giratórias para definir um volume de amostra a ser diluído. Exemplos de tais dispositivos estão divulgados na WO 98/22,797, WO 99/01742 e WO 03/44.488. Uma válvula giratória compreende um corpo de válvula cilíndrico acomodado de maneira rotativa dentro de uma abertura cilíndrica correspondente de uma carcaça de válvula. Um canal de medição, que tem um volume definido, se estende entre posições opostas na periferia do corpo de válvula. Girando o corpo de válvula entre posições definidas, as extremidades opostas do canal de medição são colocadas em comunicação com bocas de diversos canais na abertura cilíndrica do corpo de válvula. Com isto, em uma posição de rotação da carcaça de válvula, o canal de medição pode ser enchido com o volume definido de uma mostra que escoa entre duas bocas opostas do primeiro canal na periferia interna da abertura cilíndrica. Quando da rotação para uma outra posição de rotação, separando com isto o volume definido das duas bocas opostas do primeiro canal e simultaneamente colocando as extremidades opostas do canal de medição em comunicação com duas bocas opostas de segundos canais na periferia interna da abertura cilíndrica, é possibilitada a lavagem do canal de medição com um líquido de diluição para conseguir uma relação de diluição desejada.

Embora funcionando bem, devido à sua relativa complexidade, válvulas giratórias não são adequadas para a produção em massa desejável para a produção econômica de equipamento descartável para teste de sangue. A presente invenção deseja fornecer um método simples e confiável para separar, pelo menos, um pequeno volume definido de uma amostra líquida a partir de um volume indefinido relativamente grande de dita amostra, bem como um dispositivo igualmente simples, confiável e econômico para realizar um método particularmente adequado para produção reproduzível em massa. O método de acordo com a presente invenção envolve as etapas de fornecer em uma superfície de um primeiro corpo, pelo menos, uma cavidade que tem dito pequeno volume definido; aplicar dito volume relativamente grande de dita amostra sobre dita superfície e para o interior de dita pelo menos uma cavidade, movendo relativamente dito primeiro corpo e um meio raspador, de modo que dito meio raspador passe por dita pelo menos uma cavidade, raspando dela com isto um volume de dito volume relativamente grande e deixando dito pequeno volume definido em dita pelo menos uma cavidade. O dispositivo de acordo com a presente invenção para realizar o método inclui um primeiro corpo a um segundo corpo. Em uma sua superfície o primeiro corpo tem, pelo menos, uma cavidade (depressão, entalhe, indentação, cavidade, gravação, crestamento) que tem dito volume definido. O segundo corpo inclui uma borda relativamente deslizável ao longo de dita superfície sobre a cavidade, separando com isto, ou raspando, um volume excessivo de amostra de dita superfície, deixando o volume definido dentro da cavidade.

Configurações da presente invenção serão descritas agora daqui em diante sendo feita referência aos desenhos que acompanham, nos quais: Figuras 1 a e b são vistas em corte esquemático, que mostram o princípio de um dispositivo de acordo com a invenção mostrada em uma primeira e segunda posição, respectivamente;

Figura 2 é uma vista em perspectiva que mostra, de maneira esquemática, uma primeira configuração principal do dispositivo;

Figura 3 é uma vista similar, que mostra uma segunda configuração principal do dispositivo;

Figura 4 é uma vista similar, que mostra uma terceira configuração principal do dispositivo;

Figuras 5a e b são vistas similares àquelas de acordo com as Figuras la e b, porém mostrando também um elemento de vedação entre os dois corpos;

Figura 5c é uma ampliação de uma porção da Figura 5b Figura 6 é uma vista em planta, que mostra uma configuração de um elemento de vedação;

Figura 7a é uma vista similar à Figura 1, porém que mostra uma configuração alternativa do dispositivo, que tem um corpo separado para acomodar uma amostra;

Figura 7b é uma vista em plana do corpo separado da Figura 7a;

Figuras 8a, b e c são vistas similares às Figuras la e b, porém mostrando três etapas consecutivas na operação de um dispositivo que tem um raspador separado; e Figuras 9a - e mostram diversos exemplos de configurações de desenhos de cavidade. O princípio de um dispositivo que configura a presente invenção está mostrado particularmente nas Figuras la e b.

Um primeiro corpo 10 tem uma superfície 11 na qual é fornecida uma cavidade 12 que tem um pequeno volume definido de maneira precisa. Um volume relativamente grande indefinido 13 de uma amostra, tal como uma amostra de sangue, é aplicado sobre a superfície 11, de tal modo que seja assegurado que a cavidade está cheia com a mostra.

Um segundo corpo 14 tem uma borda 15 que encontra a superfície 11 do primeiro corpo, Os corpos 10 e 14 são relativamente deslizáveis ao longo da superfície 11 como indicado por uma seta A, de modo que a borda ao passar pela cavidade raspa ou cisalha um volume 16 da amostra ao longo da superfície 11, deixando apenas o pequeno volume de amostra definido de maneira precisa 17, dentro da cavidade 12. Esta situação está mostrada na Figura 1 b.

Na prática, o segundo corpo 14 tem uma superfície 18 que começa na borda 15 e voltada para e que encontra a superfície 11 do primeiro corpo em uma maneira estanque a fluido. Para a finalidade de diluir o pequeno volume de amostra definido de maneira precisa 17, dois canais 19, 20 se estendem através do segundo corpo, e abrem em sua superfície 18 em posições que possibilitam comunicação direta respectiva com a cavidade 12, como mostrado na Figura lb. Os canais estão mostrados se estendendo em uma forma em V de maneira convergente no sentido da superfície 18. Evidentemente, os canais podem se estender em outras direções no sentido da superfície 11 e da cavidade 12 nela, incluindo direções de canal reciprocamente paralelas.

Condutos 21, 22 indicados por linhas interrompidas conectam um respectivo dos canais 19, 20 com um respectivo dos receptáculos 23, 24. O receptáculo 23 está mostrado na Figura la para conter um volume definido de um líquido 25, tal como um diluente ou um agente anti-séptico. Quando os primeiro e segundo corpos estão na posição relativa mostrada na Figura lb, escoamento do líquido 25 a partir do receptáculo 23, através do conduto 21, será dirigido para o interior da cavidade 12, com isto lavando seu volume 17 de amostra, e trazendo-o através do conduto 22 para o interior do receptáculo 24, para fornecer nele um volume de amostra diluída que tem uma relação de diluição definida. O volume de amostra diluída pode ser feito escoar diversas vezes para frente e para trás entre os dois receptáculos para assegurar mistura e diluição adequadas, porém testes mostraram que uma lavagem já fornece um resultado satisfatório.

Dependendo do tipo de teste a ser realizada e da relação de diluição desejada, a cavidade pode ter, tipicamente, um volume entre 0,5 e 10 microlitros, mesmo se for bastante possível fornecer volumes de cavidade de, por exemplo, entre 0,02 e 20 microlitros.

Na prática, pode ser útil fornecer mais do que uma cavidade na superfície do corpo 10, por exemplo, uma cavidade relativamente pequena, por exemplo de 0,5 microlitros e uma cavidade relativamente grande, por exemplo, 10 microlitros, possibilitando com isto diluição simultânea em duas relações de diluição diferentes. Esta é a configuração preferencial da invenção com relação à análise de sangue.

Exemplos de dispositivos que configuram esta possibilidade estão mostrados nas Figuras 2 - 4. A configuração da Figura 2 compreende uma carcaça em forma de bloco 25 (segundo corpo) que tem nela uma fenda 26. Um deslizador 27 (primeiro corpo) tem em uma superfície superior 28 uma pequena cavidade menor 29 e uma cavidade maior 30. A fenda tem uma borda 31 que encontra de maneira próxima a superfície 28. Dois pares de canais convergentes 32, 33 e 34, 35 se estendem através da carcaça 25 e abrem uma superfície da fenda 26 em localizações respectivas que correspondem às posições das cavidades 29, 30. Assim, um volume de amostra indefinido, não mostrado, aplicado sobre a superfície 28 será cisalhado pela borda 31 durante o deslizamento do deslizador 27 para o interior da fenda como indicado por uma seta B, deixando dois volumes de amostra definidos de maneira precisa das cavidades 29, 30 para serem diluídos como explicado em conexão com as Figuras la e b.

Na Figura 3 o primeiro corpo tem um corpo em forma de disco 36 que tem uma superfície 37, uma cavidade menor 38 e uma cavidade maior 39. O segundo corpo é, da mesma forma, um corpo em forma de disco 40, que tem em sua circunferência uma porção recorte que fornece acesso à superfície 37 do primeiro corpo, e também fornece, pelo menos, uma borda 41 que encontra a superfície 37. Dois pares de canais convergentes 42, 43 e 44, 45 se estendem através do corpo 40 e abrem em sua superfície que encontra o corpo 37 em localizações respectivas que correspondem às posições das cavidades 38, 39. Assim, um volume indefinido, não mostrado, de uma amostra é aplicado sobre a superfície 37 e será cisalhado pela borda 31 quando da rotação relativa dos dois corpos, como indicado por uma seta C, deixando dois volumes de amostra definidos de maneira precisa das cavidades 38 e 39 para serem diluídos como explicado em conexão com as Figuras la e b.

Na Figura 4 o primeiro corpo é um corpo cilíndrico 46 que tem em sua superfície periférica 47 uma cavidade menor 48 e uma cavidade maior 49. O segundo corpo é um corpo em forma de bloco 50, que tem uma superfície 51 conformada de maneira cônica em conformidade com a superfície cilíndrica 47. Uma borda 52 da superfície 51 encontra a superfície 47. Dois pares de canais convergente 53, 54 e 55, 56 se estendem através do corpo 50 e abrem em sua superfície 51 que encontra o corpo 47 em localizações respectivas que correspondem às posições das cavidades 48, 49. Assim, um volume de uma amostra não definido, não mostrado, aplicado sobre a superfície 47 será cisalhado pela borda 52 quando da rotação relativa dos dois corpos, como indicado por uma seta D, deixando dois volumes definidos de maneira precisa de amostra das cavidades 48 e 49 a serem diluídos como explicado em conexão com as Figuras la e b.

Para obter vedação adequada, é conveniente fornecer um elemento de vedação 57 entre os dois corpos 10 e 14, como mostrado nas Figuras 5a e b e, mais aproximadamente na Figura 5c.

Nesta configuração, uma borda 57' do elemento de vedação toma o lugar da borda 15 do segundo corpo 14 na configuração principal das Figuras la e b, separando assim o volume de amostra dentro da cavidade 12, do restante da amostra. O elemento de vedação é acomodado dentro de um recesso conformado de maneira correspondente 58 no corpo 14', fornecendo assim uma vedação ao redor da cavidade e das bocas dos condutos 19, 20. O elemento de vedação tem um furo vazado, ou abertura 59, que fornece comunicação entre os dois canais 19, 20 e a cavidade 12 na posição de deslizamento relativo dos corpos 14' e 10 mostrado nas Figuras 5b e c. 0 segundo corpo 14' tem uma porção recorte 60, assim guiando e aprisionando o volume de amostra maior 13 quando do movimento relativo entre os dois corpos (Figura 5b). A porção recorte termina em uma fenda relativamente estreita 61 (Figura 5c) logo antes da borda ativa 57' do elemento de vedação 57.

Como ainda visto na Figura 5c, a porção 57" do elemento de vedação 57, localizada entre a abertura 59 e a borda 57', tem uma largura w que excede a largura d da cavidade 12. Com isto está assegurado que a boca da cavidade é completamente vedada quando a porção 57" do elemento de vedação passa sobre ela quando de movimento relativo dos dois corpos.

Como uma alternativa ao elemento de vedação mostrado nas Figuras 5a e b que tem paredes laterais direcionadas perpendicularmente à superfície 11 do primeiro corpo 10, a abertura 59 está mostrada na Figura 5 c para ter paredes laterais 59' inclinadas aproximadamente em conformidade com a inclinação dos canais 19 e 20. A Figura 6 mostra uma configuração de um elemento de vedação 62, útil para vedação das duas cavidades, por exemplo, a cavidade relativamente pequena 29 e a cavidade relativamente grande 30, na configuração de acordo com a Figura 2. Apenas para a finalidade de ilustração, as localizações destas cavidades estão mostradas na Figura 2 com linhas tracejadas. O elemento de vedação tem duas aberturas 63, 64. Para fornecer vedação de ambas as aberturas durante todo o movimento relativo do corpo 27 e o elemento de vedação, este último é substancialmente conformado em L, isto é, as aberturas são alinhadas, porém a borda ativa do elemento de vedação é dividida em duas porções borda 62', 62", de tal modo que as porções respectivas do elemento de vedação localizadas entre as aberturas e as porções bordas tem larguras diferentes W1 e W2, respectivamente, ambas sendo maiores do que a respectiva largura da cavidade respectiva dl, d2, respectivamente.

Na Figura 7a um corpo separado 65 é móvel ou colocado de maneira móvel deslizante entre o primeiro corpo 10 e o segundo corpo 14. Ele tem em sua superfície 65a voltada para o segundo corpo 14 uma abertura de acomodação de amostra 66 que se comunica através de um canal 67 com uma cavidade de sustentação de amostra 68 em sua superfície 65b voltada para o primeiro corpo 10. Assim, pelo menos uma porção de uma amostra de sangue, por exemplo, aplicada para o interior da abertura 66, será transferida para o interior da cavidade 67. Um furo vazado 69 se estende através do corpo 65.

Quando de movimento relativo do corpo 65 e dos primeiro e segundo corpos, uma porção do volume de amostra contido dentro da cavidade de sustentação de amostra 68 será aprisionado dentro da cavidade 12 no primeiro corpo 10, enchendo-a completamente. Uma borda traseira 68' da cavidade 68 irá atuar como uma borda raspadora, assegurando que quantidade supérfluas de amostra são removidas do volume de amostra a ser tratado em seguida. O furo vazado 69 fornece comunicação entre os canais 19 e 20 e a cavidade 12. Deveria ser observado aqui, que as dimensões relativas entre os diversos itens mostrados e descritos são apenas para finalidades ilustrativas.

Na configuração mostrada nas Figuras 8a - c, um raspador separado 70, que tem uma borda raspadora 70' é fornecido e utilizado para raspar a amostra supérflua da superfície 11 ao redor da cavidade 12. Nesta configuração os dois corpos 10 e 14 são inicialmente e durante a operação de raspagem (Figuras 8a e b) espaçados um do outro. Depois que a operação de raspagem está terminada, os dois corpos são feitos se aproximarem um do outro ao longo de um trajeto arqueado como indicado pela seta E na Figura 8 c, de modo a trazer os corpos para uma posição para realizar a operação de lavagem. A Figura 9 mostra diversas formas de configurações de cavidade. A Figura 9a mostra uma forma parcialmente esférica, a Figura 9b mostra um desenho de uma pluralidade de depressões substancialmente circulares, a Figura 9c mostra uma depressão quadrada ou piramidal, a Figura 9d mostra um número de sulcos paralelos e a Figura 9e mostra uma cavidade conformada retangular por meio de, por exemplo, gravação, crestamento, corte ou métodos similares de remoção de material.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Dispositivo de definição de volume de amostra para separar pelo menos um pequeno volume definido de uma amostra líquida a partir de um volume indefinido relativamente grande de dita mostra, dito dispositivo incluindo um primeiro corpo (10, 27, 36, 46) e um segundo corpo (14, 25, 40, 50, 57, 70) móveis um em relação ao outro, caracterizado pelo fato de: dito primeiro corpo (10, 27, 36, 46) ter pelo menos uma cavidade (12, 30, 39, 49) em uma sua superfície (11, 28. 37, 47), dita pelo menos uma cavidade tendo dito volume definido; e dito segundo corpo (14, 25, 40, 50, 57, 70) incluir uma horda (15, 31, 41, 52, 57', 70 ) deslizãvel ao longo de dita superfície sobre dita cavidade quando de movimento relativo de ditos corpos, o arranjo sendo tal, que um volume excessivo de dito volume indefinido de dita amostra, quando da deposição de dito volume definido de dita amostra sobre dita superfície, ser separado de dito volume indefinido quando de dito movimento relativo, deixando com isto dentro de dita cavidade um volume de dita amostra igual a dito volume definido,

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação I, caracterizado pelo fato de dita borda ser uma borda (15) do dito segundo corpo (14).

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação I, caracterizado pelo fato de dita borda ser uma borda (57') de um meio de vedação (57) carregado pelo dito segundo corpo (14').

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o dito corpo carregar dito meio de vedação (57) em uma sua superfície voltada para dita superfície de dito primeiro corpo (10).

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de dito meio de vedação ter uma abertura localizada oposta à dita cavidade (12) em uma posição deslizante relativa definida de ditos dois cotpos.

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de uma porção de dito meio de vedação (57) localizada entre dita abertura e dita sua borda (57') ter uma largura que segue aquela de dita cavidade (12).

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 adaptado para diluir dito pequeno volume definido de dita amostra, caracterizado pelo fato do meio (19, 20) para direcionar um líquido (25) para dentro e para fora de dita cavidade (12).

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de dito meio incluir meio de conduto oposto à dita pelo menos uma cavidade (12) em uma posição deslizante relativa definida de ditos corpos (10, 14; 10, 57).

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dito meio de conduto incluir primeiro meio de canal (19) direcionado no sentido de dita cavidade (12) e segundo meio de canal (20) direcionado a partir dela.

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do primeiro meio de receptáculo (23) para um líquido conectado a dito primeiro meio de conduto (19, 21) e segundo meio de receptáculo (27) para a amostra diluída conectado a dito segundo meio de conduto (20, 22).

11. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, particularmente para realizar análise de sangue, caracterizado pelo fato de duas cavidades (29, 30) que têm volumes diferentes.

12. Método para separar e diluir um pequeno volume definido de uma amostra de líquido, caracterizado pelo fato de compreender: (a) proporcionar um dispositivo conforme definido na reivindicação 1 que compreende um primeiro corpo incluindo pelo menos uma cavidade com um volume definido em uma superfície do dito primeiro corpo; o dito primeiro corpo sendo deslizável entre uma primeira localização e uma segunda localização; e um segundo corpo que tem uma superfície complementar a, e que encontra a dita superfície do dito primeiro corpo, e um par de canais que se estendem através do dito segundo corpo, cada um dos ditos canais tendo uma abertura na dita superfície do dito segundo corpo; quando o dito primeiro corpo está na dita segunda posição, o dito par de canais estando em comunicação direta com a dita cavidade do dito primeiro corpo; (b) aplicar um volume indefinido relativamente grande da dita amostra de líquido na dita cavidade, com um volume excessivo sobre a dita cavidade e sobre uma área da dita superfície do dito primeiro corpo em tomo da dita cavidade; (c) deslizar o dito primeiro corpo da dita primeira localização para a dita segunda localização, desse modo, uma borda do dito segundo corpo, que encontra a dita superfície do dito primeiro corpo, raspando o dito volume excessivo da dita amostra de líquido sobre a dita cavidade e deixando dentro da dita cavidade um volume da dita amostra de líquido igual ao dito volume definido da dita cavidade; e (d) lavar o dito volume definido da dita amostra de líquido retido na dita cavidade por um fluxo de um fluido de diluição a partir de um dos ditos canais para fora da dita cavidade e através de um outro dos ditos canais para formar uma amostra diluída.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito fluido diluente tem um volume definido, e a dita amostra diluída tem uma razão de diluição definida.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito dispositivo compreende ainda uma segunda cavidade com um segundo volume definido na dita superfície do dito primeiro corpo; e o dito segundo corpo que inclui um segundo par de canais que se estendem através do dito segundo corpo, cada um dos mesmos tendo uma abertura na dita superfície do dito segundo corpo; quando o dito primeiro corpo está na dita segunda localização, o dito segundo par de canais estando ern comunicação direta com a dita segunda cavidade; e em que o dito método compreende ainda: em (b) aplicar um segundo volume indefinido relativamente grande da dita amostra de líquido na dita segunda cavidade, com um volume excessivo sobre a dita segunda cavidade e sobre uma área da dita superfície do dito primeiro corpo em torno da dita segunda cavidade; em (c), quando deslizar o dito primeiro corpo a partir da dita primeira localização para a dita segunda localização» a dita borda da dita arranhões segundo corpo fora do dito volume excessivo da dita amostra de líquido sobre a dita segunda cavidade, e deixando no interior da dita segunda cavidade um volume da dita amostra líquida igual ao dito segundo volume definido da dita segunda cavidade; e em (d) lavar o dito segundo volume definido da dita amostra de líquido retida na dita segunda cavidade por um fluxo do dito fluido diluente a partir de um dos ditos segundo par de canais para fora da dita segunda cavidade e através de um outro dos ditos segundo par de canais para formar um segunda amostra diluída»

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as ditas amostras diluídas têm duas razões de diluição diferentes.