ES2269776T3 - Metodo de llenado de un pocillo en un sustrato. - Google Patents
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Abstract
Método para llenar un pocillo con un líquido, en el que se aplica un líquido en un sustrato que comprende un pocillo en una posición que no coincide con el pocillo, y tras llenarse, el pocillo se sella con un medio de cubierta, caracterizado porque - para llenar el pocillo, se aplica líquido a un primer sitio situado entre un segundo sitio en el que está situado un lado frontal del medio de cubierta aplicado sobre el sustrato y el pocillo no cubierto por el medio de cubierta, - se mueve el lado frontal del medio de cubierta en la dirección del líquido que se aplicó y del pocillo, tomando así con él el líquido con el que se está llenando el pocillo, y - tras haber pasado el lado frontal del medio de cubierta el pocillo, el medio de cubierta se lleva a una tercera posición estacionaria con el fin de sellar el pocillo lleno de líquido.
Description
Método de llenado de un pocillo en un
sustrato.
La presente invención se refiere a un método de
llenado de un pocillo con un líquido, en el que el líquido se aplica
en un sustrato que comprende un pocillo en una posición que no
coincide con el pocillo, y el pocillo tras el llenado se sella con
un medio de cubierta.
Se conoce generalmente un método de este tipo
para llenar micromatrices que se usan para diversos ensayos, tales
como ensayos enzimáticos y de ADN. Debido a la pequeña cantidad de
líquido en un pocillo, el efecto de evaporación es relativamente
grande. Con el fin de evitar la evaporación, puede colocarse un
medio de cubierta tal como un cubreobjetos sobre los pocillos.
Un problema consiste en que antes de tomar una
medición han de llevarse a cabo varias operaciones, por ejemplo,
llenar un pocillo con una cantidad medida de líquido, cubrir el
pocillo llenado con el líquido (todo esto preferiblemente sin
desarrollarse burbujas de aire) y comenzar la medición. Esto último
a menudo requiere operaciones que conllevan mucho tiempo, dado que
para diversas técnicas de medición tales como las técnicas de
medición ópticas sólo hay un pequeño espacio alrededor de un
sustrato y, por este motivo, a menudo es imposible llenar el
sustrato mientras está montado. Además, para muchos ensayos, la
reacción comenzará tan pronto como se llene el pocillo con
líquido.
Es el objeto de la invención proporcionar un
método del tipo mencionado en el preámbulo mediante el cual es
posible comenzar a medir más rápidamente.
Para este fin, el método según la invención se
caracteriza porque
- -
- para llenar el pocillo, se aplica líquido a un primer sitio situado entre un segundo sitio en el que está situado un lado frontal del medio de cubierta aplicado sobre el sustrato y el pocillo no cubierto por el medio de cubierta,
- -
- se mueve el lado frontal del medio de cubierta en la dirección del líquido que se aplicó y del pocillo, tomando así con él el líquido con el que se está llenando el pocillo, y
- -
- tras haber pasado el lado frontal del medio de cubierta el pocillo, el medio de cubierta se lleva a una tercera posición estacionaria con el fin de sellar el pocillo lleno de líquido.
Sorprendentemente, es posible empujar hacia
delante un líquido que va a introducirse en un pocillo, para llenar
los pocillos rápidamente y sellarlos. Todo esto se realiza en una
única operación, que también es favorable para la aplicación
opcional (semi)automatizada del método según la invención. La
presente invención hace posible llevar a cabo un ensayo cuantitativo
en una muestra, sin tener que pipetear exactamente el volumen de la
muestra. Tras llenar y cubrir un pocillo según la invención, el
pocillo contiene una cantidad conocida con precisión determinada por
las dimensiones del pocillo. Apartándose de un volumen relativamente
grande con una superficie relativamente pequeña, se reduce la
evaporación. Inmediatamente después del momento en que se llena el
pocillo, se sella en ese momento mediante el medio de cubierta, de
modo que esto también reduce el efecto de evaporación. Esto es
claramente diferente al llenado de pocillos individuales con líquido
de muestra por medio de una pipeta, electropulverización y
similares. En la presente solicitud, se entiende que un pocillo es
cualquier cavidad en el sustrato independientemente de su forma.
Esta definición también incluye pocillos alargados, que también
pueden denominarse como canal. En esencia, tales canales discurren
paralelos a la superficie del sustrato.
Preferiblemente, se utiliza un medio de cubierta
que tiene un espesor de al menos 0,5 mm, más preferiblemente de al
menos 0,8 mm y lo más preferiblemente de al menos 1,2 mm.
Tal medio de cubierta garantiza que el líquido
se empuja hacia delante de manera eficaz. Al mismo tiempo, la
rigidez del medio de cubierta aumenta con el espesor creciente de
modo que el medio de cubierta se adhiere mejor al sustrato.
Si el líquido es hidrófilo, se usa un medio de
cubierta según una realización preferida, cuyo lado que da hacia
fuera del sustrato cerca de la parte frontal del medio de cubierta
es hidrófobo y viceversa.
Esto ayudará a evitar que parte del líquido se
desplace sobre la parte superior del medio de cubierta en vez de
empujarse hacia delante. Esta realización es especialmente eficaz si
se está usando un medio de cubierta delgado.
Según una realización preferida, se usa entonces
un medio de cubierta cuyo lado hidrófilo que da hacia el sustrato
tiene en uno de sus extremos una superficie con una parte
hidrófoba.
El efecto de tal parte de superficie en el
extremo que antes del deslizamiento está más próximo al pocillo, es
que es necesario menos líquido (acuoso) para llenar el pocillo.
Esta parte de superficie puede hacerse
hidrófoba, por ejemplo, mediante silanización pero también aplicando
una pasta hidrófoba tal como grasa de silicona. Tal grasa no se
disuelve en el líquido acuoso y tiene la ventaja adicional de que
puede contribuir a evitar la evaporación. Además, facilita el
deslizamiento de un medio de cubierta sobre el sustrato.
Un problema adicional es que durante y tras el
llenado del pocillo, se transfiere reactivo o analito de un pocillo
a otro debido a flujo o difusión. Ventajosamente, el pocillo se
llena y se sella tan rápidamente que los reactivos no pueden escapar
del pocillo. Ventajosamente, se presiona el medio de cubierta al
menos en una tercera posición contra el sustrato con una fuerza de
al menos 1 kg/cm^{2}.
Esto reduce la transferencia de líquido o
reactivos por flujo y/o difusión. También se demostró que era
posible aplicar tal fuerza, e incuso una fuerza de 15 kg/cm^{2}
durante el movimiento desde la primera posición hasta la tercera
posición. Esto ayuda adicionalmente a limitar la transferencia de
líquido o reactivos por flujo y/o difusión.
Preferiblemente, el medio de cubierta usado es
un medio de cubierta cuyo borde del lado que da hacia el sustrato y
el lado frontal del medio de cubierta está redondeado en al menos
una parte del mismo, y el líquido en contacto con este
redondeamiento se mueve en la dirección del líquido aplicado y el
pocillo, arrastrando el líquido con el que va a llenarse el
pocillo.
Tal redondeamiento ayuda a arrastrar el líquido
y facilita el llenado del pocillo. Tal redondeamiento es
particularmente adecuado para el medio de cubierta en el que el
líquido está en contacto con la altura total (espesor) del medio de
cubierta. El borde formado entre el lado que da hacia fuera del
sustrato y el lado frontal es en tal caso preferiblemente liso de
manera sustancial, es decir, forma un ángulo cerrado por el que,
debido a los efectos de cohesión, no puede pasar fácilmente un
líquido.
Ventajosamente, en un único sustrato, se llena
un primer pocillo con un primer líquido y un segundo pocillo con un
segundo líquido, se aplican el primer y segundo líquido en primeros
sitios no solapantes respectivos, y se dota el medio de cubierta con
una indentación entre los primeros sitios no solapantes.
En lugar de esto o además de lo mismo, se llena
un primer pocillo en un único sustrato con un primer líquido y un
segundo pocillo con un segundo líquido, aplicándose el primer
líquido y el segundo líquido en primeros sitios no solapantes
respectivos, y se dota al menos un órgano seleccionado de i) el lado
superior del sustrato y ii) el lado inferior del medio de cubierta
entre los primeros sitios no solapantes, con una barrera elevada
mientras que el otro órgano en la misma posición tiene una hendidura
complementaria en la que puede alojarse la barrera, de modo que
cuando se llenan el primer y segundo pocillos, la barrera se desliza
a través de la hendidura.
Ambos métodos permiten que se llenen los
pocillos de un sustrato con diferentes líquidos.
Según una realización favorable, el medio de
cubierta comprende al menos dos lados frontales, estando formado al
menos un lado frontal por una pared de una hendidura provista en
ángulos rectos con respecto a la dirección de movimiento en el lado
inferior del sustrato, y llenándose un primer pocillo en un único
sustrato con un primer líquido y un segundo pocillo con un segundo
líquido, aplicándose el primer líquido y el segundo líquido en
primeros sitios no solapantes respectivos, de tal manera que el
pocillo del primer líquido y el pocillo del segundo líquido estén en
el segundo primer sitio, tras lo cual se coloca el medio de cubierta
sobre el sustrato y posteriormente se mueve sobre el sustrato con el
fin de llenar el primer pocillo y el segundo pocillo.
De esta manera, los pocillos que están
sustancialmente en la dirección extendida del otro, pueden llenarse
simultáneamente con diferentes líquidos.
Con el fin de sellar eficazmente un pocillo tras
haberse desplazado el medio de cubierta hasta la tercera posición,
se prefiere tanto para el sustrato como para el medio de cubierta
que se doten con grupos funcionales que pueden formar un enlace
químico o físico con los grupos funcionales con los que están en
contacto.
Por ejemplo, puede dotarse un componente con
grupos amino y el otro con grupos epoxi. Pueden encontrarse diversos
grupos funcionales bastante fácilmente en la bibliografía con
respecto a la inmovilización de proteínas y otras moléculas en una
superficie, por tanto, un experto habitual en la técnica no requiere
una explicación adicional.
La invención también se refiere a un medio de
cubierta para la aplicación del método según una de las
reivindicaciones 11 a 14, así como a un sustrato para la aplicación
del método según una de las reivindicaciones 11 a 14.
La presente invención se aclarará ahora con
referencia a una realización explicativa y el dibujo, en el que
Las figuras 1a y 1b muestran respectivamente una
vista lateral de un sustrato con un medio de cubierta según la
invención, y una vista desde arriba del medio de cubierta y el
sustrato;
las figuras 2a y b muestran una vista lateral en
sección transversal de un sustrato con un medio de cubierta según la
invención para la aplicación de diferentes líquidos en diferentes
pocillos (antes y después); y
la figura 3 muestra una vista desde arriba de un
sustrato con un medio de cubierta según la invención.
La figura 1 muestra un sustrato 1 dotado con dos
series 2, 3, series 2, 3 que consisten en pocillos 4. El sustrato 1
también está dotado con hendiduras 5', 5'', que como los pocillos 4
se han dotado convenientemente en el sustrato 1 por medio de ataque
químico. Según una posible realización de la invención, las
hendiduras 5', 5'' son adecuadas para introducir el líquido A en los
pocillos 4. En lugar de esto, o además de lo mismo, es posible,
según una realización alternativa, proporcionar un recubrimiento
lineal, por ejemplo un recubrimiento hidrófilo que tiene una
afinidad superior por el líquido. En lugar de eso, este sitio puede
estar delimitado por dos líneas de recubrimiento por las que el
líquido tiene menos afinidad. En el caso de que se esté aplicando un
líquido acuoso, es posible por ejemplo usar aerosol de Teflon. Esto
puede realizarse bastante fácilmente protegiendo el sitio en el que
va a aplicarse el líquido por medio de, por ejemplo, un trozo
rectangular de papel. Tras haberse aplicado el líquido A, se
desplaza un medio 6 de cubierta situado sobre el sustrato en la
dirección de los pocillos. En la figura 1, los pocillos 4 de la
serie 2 ya están llenos.
El lado del medio 6 de cubierta que da hacia el
sustrato y el lado del sustrato 1 que da hacia el medio 6 de
cubierta son completamente lisos de modo que una vez puesto sobre el
sustrato, el medio 6 de cubierta puede moverse de manera
equidistante con respecto al sustrato 1, y el líquido A de muestra
puede empujarse desde la hendiduras 5', 5'' hacia los pocillos 4.
Tras esto se sellan inmediatamente los pocillos 4 llenos mediante el
medio 6 de cubierta. El líquido A sobrante puede eliminarse por
soplado con la ayuda de una pistola de aire (presión de
aproximadamente 4-5 bares). Antes de eso, y
preferiblemente durante la eliminación del líquido sobrante, puede
ejercerse una fuerza de sujeción si es necesario, que es
adecuadamente de 2-3 kg/cm^{2}. La eliminación del
líquido garantiza que cualquier fuerza de tensión superficial no
producirá que este líquido se escape entre el medio 6 de cubierta y
el sustrato 1, lo que aumentaría el espesor de la capa de líquido
entre el medio 6 de cubierta y el sustrato 1. Una capa de líquido
muy delgada garantiza que incluso sin una fuerza de sujeción, el
medio de cubierta sellará los pocillos 4 por medio de adhesión
durante un tiempo de medición de, por ejemplo, 5-10
minutos. Para la realización de las mediciones, los pocillos 4
pueden contener reactivos que pueden disolverse en el líquido A con
el que se han llenado los pocillos. La presencia de una capa delgada
de líquido minimiza el intercambio (por difusión) de cualquier
reactivo presente posiblemente de un pocillo a un pocillo adyacente.
Finalmente, se evita de manera eficaz la evaporación de un líquido
durante la medición con el método descrito.
El medio 6 de cubierta y el sustrato 1 también
están limpios (libres de polvo) y, en el caso de líquidos A acuosos
A, preferiblemente al menos en los lados del sustrato 1 y el medio 6
de cubierta que dan el uno al otro, son hidrófilos. No obstante, en
el caso de los líquidos A acuosos, el extremo del lado del medio 6
de cubierta que da hacia el sustrato 1 está, según una realización
preferida, cerca de los pocillos 4 hidrófobos. De esta forma puede
evitarse que se requiera relativamente mucha muestra A líquida para
llenar los pocillos 4. Según una realización sencilla, el extremo
del lado que da hacia el sustrato 1 se hace hidrófobo con la ayuda
de grasa de silicona. La cantidad de grasa de silicona utilizada se
mantiene en un mínimo (es decir, se aplica un recubrimiento muy
delgado). El uso de una hendidura 5 no es un requisito esencial e
incluso puede ser indeseable. El líquido A se aplica preferiblemente
al lado frontal del medio 6 de cubierta, orientado hacia los
pocillos 4. De esta forma todavía es posible esparcir el líquido A
transversalmente. Dicho lado frontal es preferiblemente
hidrófilo.
La velocidad a la que el medio 6 de cubierta va
a moverse con relación al sustrato 1 depende de los materiales
utilizados y del líquido A utilizado, así como los componentes,
tales como tensioactivos, comprendidos en él. No obstante, un
experto en la técnica puede determinar fácilmente una velocidad
adecuada. Si el porcentaje de pocillos 4 que comprenden aire
atrapado es superior al deseable, la velocidad debe reducirse o
deben utilizarse pocillos con una pared redondeada o con menos
pendiente (éstos se llenan más fácilmente). El sustrato 1 y el medio
6 de cubierta pueden fabricarse de cualquier material que sea
esencialmente inerte (con relación al líquido A), tal como
poliestireno, vidrio o materiales que puedan tratarse utilizándose
técnicas conocidas de la industria de semiconductores.
Cerca del lado del sustrato en el extremo
frontal, el medio 6 de cubierta tiene un borde 7, que
preferiblemente está dotado con redondeamiento (indicado mediante la
línea de puntos). Esto permite que los pocillos 4 se llenen
eficazmente con líquido. Un método práctico de llenado de pocillos
se realiza tal como sigue:
1) Un vidrio Pyrex (1 x 0,8 cm) que tiene un
espesor de 1 mm se limpia tratándolo con un detergente y enjuagando
bien con agua desmineralizada.
2) El vidrio Pyrex se coloca sobre un sustrato
semiconductor. El sustrato semiconductor está dotado con una capa
hidrófila de SiO_{2} y preferiblemente de nitruro de silicio. El
sustrato semiconductor está dotado con pocillos de 400 x 400 \mum
que tienen una profundidad de 50 \mum.
3) Mediante la acción capilar se introducen de
0,1 a 0,2 \mul de agua entre el cubreobjetos de Pyrex y el
sustrato. La presencia de tal cantidad mínima de líquido hace que el
cubreobjetos de Pyrex se adhiera al sustrato mediante succión. Es
difícil de eliminar pero puede deslizarse.
4) Se pipetea un líquido de muestra (1 \mul)
delante de una fila de pocillos a una distancia del cubreobjetos de
Pyrex.
5) El cubreobjetos de Pyrex se empuja hacia la
dirección del líquido de muestra y los pocillos a una velocidad de
2-6 cm/s.
6) El cubreobjetos se presiona sobre el sustrato
con una fuerza de 2-3 kg/cm^{2} y un líquido de
muestra sobrante se elimina por soplado con la ayuda de una pistola
de aire (presión de 4 bares).
7) El sustrato con el cubreobjetos se sitúa en
un portaobjetos sobre una mesa X-Y-Z
bajo una lente objetivo.
En un experimento, se llenó una serie de 5 x 5
pocillos de 400 x 400 x 50 \mum (volumen total de 0,2 \mul)
utilizando sólo 0,5 \mul de líquido.
Los experimentos (reacciones coloradas en las
que los pocillos se recubrieron con una enzima) demostraron que el
arrastre en una dirección transversal a la dirección de movimiento
del medio de cubierta con relación al sustrato fue mínimo. Hubo
algún arrastre detectable entre los pocillos sucesivos en la
dirección de movimiento.
Se demostró que el método según la invención era
adecuado para llenar pocillos con un disolvente volátil tal como
etanol. Esto permite que el método según la invención se aplique
para reacciones de química combinatoria y potencialmente peligrosas
que son seguras de realizar a pequeña escala.
Para el experto habitual en la técnica será
obvio que es posible variar el presente método de muchas formas sin
apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, en particular si
un pocillo es relativamente profundo, es ventajoso utilizar un medio
6 de cubierta que no sea recto, por ejemplo, uno dentado o estriado,
en el que las cavidades dentadas o estriadas captan el líquido y el
medio 6 de cubierta con las cavidades se empuja sobre el pocillo 4.
Si tiene que llenarse una serie 2, la posición de las cavidades se
elige de manera que coincidan sustancialmente con los centros de los
pocillos. Si se desea, diferentes cavidades pueden contener
diferentes líquidos de muestra, de modo que puedan someterse a
ensayo simultáneamente diferentes líquidos de muestra.
Con el fin de aplicar una capa de pasta de
sellado hidrófoba, tal como grasa de silicona de una manera definida
y reproducible, puede hacerse uso de un esparcidor que, al menos en
un sitio, está en contacto con el sustrato mientras que se mueve
sobre el sustrato en una dirección de un exceso de pasta. El
esparcidor deja una estrecha hendidura entre el sustrato y el
esparcidor, hendidura estrecha que (y el ángulo en el que se mueve
el esparcidor) determina el espesor de la capa. El esparcidor
también puede estar dotado opcionalmente con un elemento de guía que
descansa contra un lado del sustrato.
La figura 2a muestra un sustrato 1 dotado con
varios pocillos 4. El medio 6 de cubierta está dotado con hendiduras
8, cada una de las cuales tiene una pared 9 frontal que empuja los
diversos líquidos A, B, C, D hacia delante. Cuando el medio 6 de
cubierta está en la tercera posición, los pocillos 4 se sellan. Los
pocillos 4 pueden comprender diversos reactivos W, X, Y, Z.
La figura 3 muestra una vista desde arriba de
las tres series 2, 3, 9 comprendidas por los pocillos 4', 4'' 4''',
que van a llenarse con diferentes líquidos A, B, C. Con el fin de
evitar que los líquidos, que durante el movimiento del medio de
cubierta se están esparciendo a lo largo del borde frontal, entren
en contacto entre sí, se proporcionan las cavidades 9, de manera que
los líquidos prácticamente se someten a diferentes medios 6 de
cubierta.
La aplicación de los líquidos y el movimiento de
los líquidos están automatizados preferiblemente mediante
dispensadores y accionadores.
Claims (14)
1. Método para llenar un pocillo con un líquido,
en el que se aplica un líquido en un sustrato que comprende un
pocillo en una posición que no coincide con el pocillo, y tras
llenarse, el pocillo se sella con un medio de cubierta,
caracterizado porque
- -
- para llenar el pocillo, se aplica líquido a un primer sitio situado entre un segundo sitio en el que está situado un lado frontal del medio de cubierta aplicado sobre el sustrato y el pocillo no cubierto por el medio de cubierta,
- -
- se mueve el lado frontal del medio de cubierta en la dirección del líquido que se aplicó y del pocillo, tomando así con él el líquido con el que se está llenando el pocillo, y
- -
- tras haber pasado el lado frontal del medio de cubierta el pocillo, el medio de cubierta se lleva a una tercera posición estacionaria con el fin de sellar el pocillo lleno de líquido.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza un medio de cubierta que
tiene un espesor de al menos 0,5 mm, más preferiblemente de al menos
0,8 mm y lo más preferiblemente de al menos 1,2 mm.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque si el líquido es hidrófilo, se usa un
medio de cubierta, cuyo lado que da hacia fuera del sustrato cerca
de la parte frontal del medio de cubierta es hidrófobo y
viceversa.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque el medio de cubierta en el lado
hidrófilo que da hacia el sustrato tiene en uno de sus extremos una
superficie con una parte hidrófoba.
5. Método según la reivindicación 4,
caracterizado porque la parte de superficie hidrófoba
comprende una pasta hidrófoba.
6. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque al menos en una tercera
posición el medio de cubierta se presiona contra el sustrato con una
fuerza de al menos 1 kg/cm^{2}.
7. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el sustrato comprende una
serie de pocillos, se proporciona una hendidura en el sustrato
estando una componente direccional principal en ángulos rectos con
respecto a la dirección de movimiento del medio de cubierta, y se
introduce el líquido en la hendidura antes de transferirse a la
serie mediante el medio de cubierta que se mueve sobre la
hendidura.
8. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque cuando el medio de cubierta
está en la tercera posición, se elimina el líquido que rodea el
medio de cubierta.
9. Método según la reivindicación 8,
caracterizado porque la eliminación se produce mediante gas
comprimido.
10. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el medio de cubierta
utilizado es un medio de cubierta cuyo borde del lado que da hacia
el sustrato y el lado frontal del medio de cubierta es redondeado en
al menos una parte del mismo, y el líquido en contacto con este
redondeamiento se mueve en la dirección del líquido aplicado y el
pocillo, arrastrando el líquido con el que va a llenarse el
pocillo.
11. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque en un único sustrato, se
llena un primer pocillo con un primer líquido y un segundo pocillo
con un segundo líquido, aplicándose el primer líquido y el segundo
líquido en los primeros sitios no solapantes respectivos, y el medio
de cubierta está dotado con una indentación entre los primeros
sitios no solapantes.
12. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque se llena un primer pocillo
en un único sustrato con un primer líquido y un segundo pocillo con
un segundo líquido, aplicándose el primer líquido y el segundo
líquido en los primeros sitios no solapantes respectivos, y al menos
un órgano elegido de i) el lado superior del sustrato y ii) el lado
inferior del medio de cubierta entre los primeros sitios no
solapantes está dotado con una barrera elevada, mientras que el otro
órgano en la misma posición tiene una hendidura complementaria en la
que puede alojarse la barrera, de modo que cuando el primer y el
segundo pocillos se llenan, la barrera se desliza a través de la
hendidura.
13. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el medio de cubierta
comprende al menos dos lados frontales, estando formado al menos un
lado frontal por una pared de una hendidura proporcionada en ángulos
rectos con respecto a la dirección de movimiento en el lado inferior
del sustrato, y llenándose un primer pocillo en un único sustrato
con un primer líquido y un segundo pocillo con un segundo líquido,
aplicándose el primer líquido y el segundo líquido en los primeros
sitios no solapantes respectivos, de tal manera que el pocillo del
primer líquido y el pocillo del segundo líquido están en el segundo
primer sitio, tras lo cual el medio de cubierta se coloca sobre el
sustrato y posteriormente se mueve sobre el sustrato con el fin de
llenar el primer pocillo y el segundo pocillo.
14. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque tanto el sustrato como el
medio de cubierta están dotados con grupos funcionales que pueden
formar un enlace químico o físico con los grupos funcionales con los
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