BRPI0211116B1 - ensaio homogêneo e kit de ensaio para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas - Google Patents

Abstract

"ensaio homogêneo e kit de ensaio para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas". um ensaio homogêneo para determinar o teor de aflatoxina em produtos agrícolas usa a técnica de polarização de fluorescência. um solvente é usado para extrair aflatoxinas de uma amostra do produto agrícola. uma mistura é preparada combinando-se o extrato com um rastreador e com um anticorpo monoclonal especifico para aflatoxina. o rastreador é capaz de ligar ao anticorpo monoclonal para produzir uma mudança detectável em polarização de fluorescência. o rastreador é preparado conjugando-se uma oxima de aflatoxina a um fluoroforo adequado. a polarização de fluorescência da mistura é medida. a concentração de aflatoxina da mistura pode ser calculada usando uma curva padrão obtida medindo-se a polarização de fluorescência de uma série de soluções de aflatoxina de concentração conhecida.

Description

“ENSAIO HOMOGÊNEO E KIT DE ENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM PRODUTOS AGRÍCOLAS”.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção Esta invenção diz respeito ao campo de ensaios de micotoxina. Mais particularmente, esta invenção diz respeito a um ensaio homogêneo que usa mudanças na polarização de fluorescência para detectar a presença de aflatoxinas em produtos agrícolas. 2. Descrição da Técnica Relacionada As aflatoxinas são micotoxinas produzidas pelos mofos Aspergillus flavus\ As aflatoxinas foram conhecidas durante um longo tempo, mas sua carcinogenicidade foi primeiro detectada nos idos de 19604. Várias formas de aflatoxina, incluindo Bi, B2, Gi, e G2 e muitas outras, foram encontradas em muitas formas de alimentos para ser humano, tais como produtos de cereais, grãos e amendoim9,11. A aflatoxina Bi é a mais tóxica e a mais abundante de todas. Uma exposição às aflatoxinas foi associada com *7 uma incidência aumentada de carcinoma hepatocelular primário .

Devido a sua toxicidade e carcinogenicidade, vários métodos analíticos foram planejados para determinar quantitativamente a quantidade de aflatoxina em produtos agrícolas1"4’6’8. Uma dificuldade com tais ensaios é que as aflatoxinas são muito hidrofóbicas e portanto muito insolúveis em solventes aquosos. Assim, as misturas de solvente orgânico com água no geral foram usadas para extrair as aflatoxinas das amostras.

Outra dificuldade é que a maioria dos ensaios comuns, incluindo TLC e HPLC10, requer etapas de limpeza prolongadas e derivatização depois da extração de modo a livrar-se das substâncias de interferência. Os métodos ELISA são relativamente mais rápidos mas são difíceis para quantificar devido a várias etapas de lavagem, transferências líquidas e tempos de incubação e etapas de limpeza.

Conseqüentemente, há uma necessidade quanto a um ensaio para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas que seja rápido, simples para aplicar, e que possa render resultados quantitativos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto principal, a presente invenção fornece um ensaio homogêneo para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas. A aflatoxina é extraída a partir de uma amostra, e o extrato é combinado com um rastreador e um anticorpo para fornecer uma mistura. O anticorpo é específico para aflatoxina. O rastreador compreende uma oxima de aflatoxina conjugada a um fluoroforo. O rastreador é capaz de ligar ao anticorpo para produzir uma mudança detectável na polarização de fluorescência. A polarização de fluorescência da mistura é medida e comparada a uma curva padrão.

Em um segundo aspecto principal, a presente invenção fornece um kit de ensaio para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas. O kit de ensaio compreende um anticorpo e um rastreador, cada um em uma quantidade adequada para pelo menos um ensaio, e acondicionamento adequado. O anticorpo é específico para aflatoxina. O rastreador compreende uma oxima de aflatoxina conjugada a um fluoroforo. O rastreador é capaz de ligar ao anticorpo para produzir uma mudança detectável na polarização de fluorescência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico que mostra a mudança na polarização de fluorescência com o tempo para uma faixa de concentrações de aflatoxina, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 2 é um gráfico que mostra a mudança na polarização de fluorescência com o tempo para uma amostra que não contenha nenhuma aflatoxina e uma faixa de concentrações de metanol, usando os dados da Tabela 1, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 3 é uma curva padrão para um ensaio de polarização de fluorescência para aflatoxinas, usando os dados da Tabela 2, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 4 é um gráfico que compara a concentração de aflatoxina de amostras como medido usando HPLC com a concentração de aflatoxina como calculada da curva padrão da Figura 3, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 5 é o gráfico que compara a concentração de aflatoxina de amostras reforçadas com a concentração de aflatoxina calculada a partir das medições de polarização de fluorescência, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 6 é uma curva padrão para um ensaio de polarização de fluorescência para aflatoxinas, usado para obter os dados nas Tabelas 6 e 7, de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

As formas de realização preferidas da presente invenção fornecem um ensaio homogêneo relativamente simples para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas que é fundamentado nas medições de polarização de fluorescência. A técnica de polarização de fluorescência foi utilizada com êxito em vários ensaios envolvendo proteínas, enzimas, medicamentos, DNA, hormônios, peptídeos e anticorpos. O princípio por trás da técnica de polarização de fluorescência é como segue. As sondas fluorescentes tendo baixo peso molecular têm valores de polarização baixos devido a sua rotação rápida, enquanto que as sondas fluorescentes com peso molecular mais alto têm polarização mais alta devido a sua rotação mais lenta. Assim o valor de polarização de um fluoroforo aumenta na ligação a uma molécula maior. Outra informação sobre a técnica de polarização de fluorescência é fornecida nas Patentes US N- 5.427.960 e 5.976.820 e em Nasir, M. S. e Jolley, Μ. E., “Fluorescence Polarization: A analytical tool for Immunoassay and Drug Discovery,” Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999, 2, 177 a 190, cujas referências são aqui incorporadas por referência.

Na presente invenção, a aflatoxina extraída de uma amostra compete com um rastreador fluorescente na presença de um anticorpo monoclonal, dando origem desse modo, a uma mudança na polarização fluorescente que é dependente da concentração de aflatoxina.

As formas de realização preferidas da presente invenção fornecem um ensaio homogêneo para aflatoxina que é sensível, rápido, simples, e barato. Também pode ser portável ao campo e render resultados quantitativos. 1. Materiais e Métodos Dois anticorpos monoclonais de aflatoxina diferentes foram usados nestes estudos. Um anticorpo monoclonal de aflatoxina adquirido da Sigma (catálogo η2 A-9555) foi usado no trabalho de desenvolvimento de ensaio inicial, mas foi descoberto ter sensibilidade ao metanol. Em trabalho posterior, um anticorpo monoclonal, disponível do Dr. Chris Maragos da Agricultural Research Unit of the United States Department of Agriculture (Peoria, Illinois), foi usado porque foi verificado ser estável em metanol. O uso deste anticorpo monoclonal foi relatado em Chris M. Maragos e Vicki S. Thompson, “Fiber-optic Immunosensor for Mycotoxins,” Natural Toxins 7: 371 a 376 (1999), que é aqui incorporado por referência. Além disso, muitos outros anticorpos monoclonais para aflatoxinas são conhecidos. Ver, por exemplo, Patente US N2 4.835.100.

As amostras de milho que foram naturalmente contaminadas com aflatoxinas, e amostras de pipoca livre de aflatoxina foram adquiridas do Trilogy Analytical Laboratory, Inc. (Washington, Missouri). O Trilogy também forneceu uma mistura de Aflatoxina Bi/B2/Gi/G2 (7/1/3/1). A

Aflatoxina Bi pura, foi obtida da Sigma.

As medições de polarização de fluorescência foram feitas na temperatura ambiente usando um instrumento de polarização de fluorescência Sentry-FP de tubo único (Diachemix Corp.). 2. Preparação de Rastreador de Aflatoxina Em um frasco de fundo redondo de 10 ml adaptado com um agitador magnético e um condensador, Aflatoxina B! (5 mg, 0,016 mmol, Sigma) e hemicloridreto de O-carboximetil-hidroxilamina (41 mg, 0,19 mmol, Sigma) foram misturados com 1,2 ml de etanol absoluto. A esta solução, 230 μΐ de uma solução de NaOH 2 M (0,46 mmol) foram adicionados com agitação, e a solução submetida ao refluxo durante 3 horas. A solução resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente, concentrada em um evaporador rotativo, e diluída a 1,5 ml com água. As gotas de NaOH 1 N foram adicionadas para ajustar o pH a ~ 9, e a solução foi lavada com acetato de etila (usando duas porções de cerca de 3 ml cada). A camada aquosa foi acidificada com HC1 6 M a um pH ~ 2, e a mistura resultante foi armazenada a 0o C em um refrigerador. Algum precipitado sólido, que foi separado e seco. A TLC em sílica usando acetato de etila:MeOH:NH4OH (32:17:5) forneceu uma mancha maior a Rf ~ 0,5 correspondendo ao produto de oxima.

Uma solução de THF a 20 μΐ de (Aflatoxina Bi)-0-carboximetiloxima, preparada como descrito acima, foi misturada com 20 μΐ de dicicloexilcarbodiimida (DCC) em cloreto de metileno (10 mg/ml) e 200 μΐ de cloreto de metileno. Depois de 2 a 3 minutos, uma solução de THF de 20 μΐ de fluoresceinamina (isômero 2, 10 mg/ml) foi adicionada. A reação foi realizada durante a noite na temperatura ambiente. Como um controle, a mesma reação também foi conduzida sem a oxima de aflatoxina. A TLC dos produtos (usando CHCl3:Me0H:CH3C02H, 40:10:3) apresentou muitas manchas. Uma mancha a Rf ~ 0,7 foi descoberta ser ausente na corrida de TLC do controle. Este rastreador foi coletado, dissolvido em MeOH, e depois diluído em tampão de modo a fornecer uma intensidade de ~ 400.000 unidades de fluorescência relativas quando 10 μΐ desta solução de rastreador foram adicionados a 1 ml do tampão.

Foi observado que este rastreador forneceu uma polarização estável de ~ 40 mP. Depois de adicionar 10 μΐ de anticorpo diluído 1/50 (Sigma, A-9555) para fornecer uma diluição final de 1/5.000, a polarização aumentou lentamente até - 230 mP em um período de cinco minutos.

De modo a confirmar a reatividade, 1 ml de tampão foi tomado e misturado com 10 μΐ de anticorpo e 10 μΐ de Aflatoxina Bi (0,8 mg/ml). A mistura foi mantida na temperatura ambiente durante cinco minutos e depois desenvolvida no instrumento de FP. Depois que 10 μΐ de rastreador foram adicionados, a polarização de fluorescência diminuiu de - 230 mP a ~ 41 mP.

Um rastreador de Aflatoxina E*! diferente foi preparado usando uma reação similar mas com fluoresceinamina (isômero 1) como o fluoroforo. O rastreador resultante mostrou menos sensibilidade do que quando a fluoresceinamina (isômero 2) foi usada como o fluoroforo. Especificamente, a polarização de partida (~ 32 mP) mudou apenas para -140 mP quando o anticorpo foi adicionado.

Os rastreadores de Aflatoxina B! também foram preparados usando outros derivados de amina de fluoresceína como o fluoroforo. Os resultados são resumidos como segue. Quando 5-aminoacetil- amidofluoresceína (5AAF) foi usado, o rastreador resultante teve uma polarização de fluorescência de - 30 mP, que aumentou até - 65 mP quando o anticorpo foi adicionado. Quando 5-(5-aminopentil)-tioureidil fluoresceína (5,5APTF) foi testado como o fluoroforo, o rastreador teve uma polarização de fluorescência de - 35 mP, que aumentou até - 102 mP na adição de anticorpo. A fluoresceína tiosemicarbazida (FTSC), 4-aminometil fluoresceína, e 5-aminometil fluoresceína foram também testados, mas estes fluoroforos não resultaram em nenhum produto ativo, isto é, eles não apresentaram nenhuma mudança significante na polarização de fluorescência na ligação ao anticorpo. Portanto, foi concluído a partir destes estudos que o isômero 2 de fluoresceinamina forneceu os melhores resultados para este anticorpo. 3. Desenvolvimento do ensaio O anticorpo de aflatoxina foi adquirido da Sigma (A-9555) e usado para desenvolvimento do ensaio inicial depois diluindo-o (1/150.000) em PBSA-BGG (pH ~ 7,5), que é uma solução tampão de fosfato contendo 1 grama por litro de azida de sódio e 9 gramas por litro de cloreto de sódio, com gamaglobulina bovina (BGG) presente em uma concentração de 100 pg/ml. 1 ml da solução de anticorpo foi misturado com 50 μΐ de uma solução tendo uma concentração conhecida de aflatoxina Bj livre em metanol/água (70/30). As concentrações de Aflatoxina Bi variando de 0 a 40 ppb foram usadas. Depois de tomar uma medição em branco, 10 μΐ de rastreador diluído, preparado como descrito acima usando fluoresceinamina (isômero 2) como o fluoroforo, foram adicionados, e a mudança na polarização de fluorescência foi monitorada durante 10 minutos. Os resultados são mostrados na Figura 1.

Visto que as aflatoxinas são tipicamente extraídas de amostras agrícolas usando uma mistura de um solvente orgânico e água, o efeito do metanol no anticorpo de Aflatoxina da Sigma (A-9555) foi estudado. Especificamente, 1 ml de solução de anticorpo diluída foi misturado com uma concentração conhecida de metanol. Depois de medir um branco, o rastreador foi adicionado (rastreador de fluoresceinamina do isômero 2 de oxima de Aflatoxina Bi descrito acima), e a polarização de fluorescência foi medida com o tempo. Os resultados são resumidos na Tabela 1 abaixo e na Figura 2. ________ TABELA 1 Estes resultados mostram que a polarização de fluorescência diminui conforme a concentração de metanol aumenta, e, para uma concentração de metanol dada, a polarização de fluorescência aumenta com o tempo. Assim, embora o próprio rastreador fosse estável em metanol e solventes orgânicos relacionados durante um período prolongado de tempo, esses resultados sugerem que este anticorpo é sensível ao metanol. Como um resultado, embora este anticorpo tenha sensibilidade para o uso em um ensaio com base na polarização de fluorescência para aflatoxinas, é preferível usar um anticorpo que é mais estável em metanol de modo a produzir resultados mais confiáveis. Foi verificado que o anticorpo monoclonal disponível do Dr. Chris Maragos of the Agricultural Research Unit of the United States Department of Agriculture (Peoria, Illinois) teve a estabilidade desejada em metanol. 4. Ensaio FP para Aflatoxinas em Amostras de Milho Naturalmente Contaminadas As amostras de milho que foram naturalmente contaminadas com aflatoxinas foram adquiridas do Trilogy Analytical Laboratory, Inc. (Washington, Missouri). A aflatoxina foi extraída de cada 20 g de amostra de grão triturado usando 100 ml de mistura de MeOH/água (70/30) em duplicata agitando-se cada amostra de tempo em tempo durante cerca de 30 minutos.

Os extratos foram filtrados através de um papel de filtro fino e armazenado em frascos lacrados na temperatura ambiente para análise.

Os padrões foram preparados em MeOH/água (70/30) diluindo-se um concentrado de Aflatoxina Bi/B2/Gi/G2 (7/1/3/1) fornecido pelo Trilogy em várias concentrações. 40 μΐ de cada amostra ou padrão foram misturados em 1 ml de solução de anticorpo (1/150.000 em tampão PBSA-BGG) em um tubo de teste. O anticorpo usado foi o anticorpo resistente a metanol fornecido por Dr. Chris Maragos. Depois de desenvolver cada amostra, 10 μΐ de rastreador foram adicionados em cada tubo, as amostras foram incubadas durante 15 minutos na temperatura ambiente, e depois a polarização de fluorescência foi medida para cada tubo. O rastreador que foi usado foi o rastreador de fluoresceinamina do isômero 2 de Aflatoxina B] descrito acima. Uma curva padrão foi delineada usando valores duplicados. Os valores de polarização de fluorescência para os padrões são mostrados abaixo na Tabela 2 e na Figura 3. TABELA 2 A concentração de aflatoxina em cada amostra de milho foi depois calculada a partir da curva padrão. Os resultados são resumidos na Tabela 3 abaixo. TABELA 3 Estas amostras também foram analisadas usando tanto o protocolo de polarização de fluorescência descrito acima quanto pelas técnicas de HPLC padrão, e as concentrações de aflatoxina determinadas usando essas duas técnicas foram comparadas. Os resultados são resumidos abaixo na Tabela 4 e na Figura 4, exceto para os resultados de uma amostra que teve um nível muito alto de contaminação de aflatoxina. Esses resultados mostram uma boa correlação entre HPLC e FP (r2 = 0,97). TABELA 4 5. Análise de Aflatoxina em Amostras de Pipoca 20 g de amostras trituradas de pipoca livre de aflatoxina foram reforçadas com uma mistura de Aflatoxina Bi/B2/Gi/G2 (7/1/3/1) a uma concentração conhecida. A análise de polarização de fluorescência foi realizada em duplicata em cada extrato como relatado acima. A concentração de aflatoxina de cada amostra foi calculada a partir da polarização de fluorescência medida média, usando uma curva de calibração, e comparada com a concentração reforçada conhecida. Os resultados são resumidos na Tabela 5 abaixo e na Figura 5. Neste estudo, a amostra reforçada a 320 ppb foi diluída 1/10 para a medição da polarização de fluorescência. TABELA 5 Estes resultados mostram uma boa correlação entre valores teóricos e os resultados obtidos usando o ensaio de polarização de fluorescência da presente invenção (r2 = 0,996). Entretanto, os resultados da polarização de fluorescência de forma coerente subestimaram a concentração de aflatoxina real. Uma explanação é que as amostras naturalmente contaminadas tiveram principalmente Bi e algum B2, mas nenhum Gi e G2, ao passo que as amostras de pipoca foram reforçadas com uma mistura de Bi/B2/Gi/G2 em uma razão 7/1/3/1.

Para testar esta explanação, a reatividade cruzada destas aflatoxinas foi investigada. Aflatoxina B]5 B2, Gi e G2 foram adquiridas da Sigma e individualmente diluídas em uma mistura de metanol/água (70/30) para dar uma faixa de concentrações, isto é, 10, 25, 40, 80, e 100 ppb. A curva padrão mostrada na Figura 6 foi obtida realizando-se o ensaio de polarização de fluorescência aqui descrito nas soluções de Aflatoxina B}. A Tabela 6 e a Tabela 7 mostram os resultados para Aflatoxina Gj e G2, respectivamente, calculando as concentrações de aflatoxina a partir da curva de calibração da Figura 6. TABELA 6 Estes resultados mostram que as concentrações de Aflatoxina Gi e G2 são subestimados quando elas são calculadas a partir de uma curva de calibração obtida da Aflatoxina Bi sozinha. Mais particularmente, tanto a Aflatoxina Gi quanto a G2 reagem cruzado com Aflatoxina B] apenas até o grau de 30 a 40 %. Isto pode explicar a subestimação da concentração de aflatoxina observada nas amostras de pipoca reforçadas. 6. Kit de ensaio Os materiais usados para realizar o ensaio da presente invenção estão preferivelmente disponíveis na forma de conjunto. O conjunto preferivelmente inclui uma quantidade de solução de extração para extrair aflatoxina das amostras de grão ou outros produtos, rastreador e anticorpo em uma quantidade adequada para pelo menos um ensaio, junto com acondicionamento adequado e instruções para o uso. O rastreador e o anticorpo podem ser fornecidos em solução, como uma dispersão líquida, ou como um pó substancialmente seco (por exemplo, na forma liofilizada). O acondicionamento adequado pode ser qualquer matriz ou material sólidos, tais como vidro, plástico, papel, folha metálica, e outros, capazes de segurar separadamente dentro de limites fixos o tampão, o rastreador, e o anticorpo. Por exemplo, o solvente de extração, rastreador, e anticorpo monoclonal podem ser fornecidos como soluções em garrafas ou frascos rotulados separados fabricados de vidro ou plástico. O anticorpo é específico para aflatoxinas e é preferivelmente um anticorpo monoclonal. Mais preferivelmente, o anticorpo monoclonal é estável no solvente de extração. O rastreador compreende um fluoroforo conjugado a uma oxima de aflatoxina, preferivelmente (Aflatoxina Bi)-0-carboximetiloxima. Os fluoro foros adequados incluem fluoresceinamina (isômero 1), fluoresceinamina (isômero 2), 5-aminoacetilamidofluoresceína (5AAF), 5-(5-aminopentil)-tioureidil fluoresceína (5,5APTF). Outros fluoroforos podem ser usados, contanto que o rastreador resultante seja capaz de ligar com o anticorpo para produzir uma mudança detectável na polarização de fluorescência. Preferivelmente o fluoroforo é a fluoresceinamina. Mais preferivelmente, o fluoroforo é a fluoresceinamina (isômero 2). O solvente de extração é preferivelmente uma mistura de um solvente orgânico, tal como metanol ou acetonitrila, em água. Mais preferivelmente, o solvente de extração é uma mistura metanol/água (70/30). 7. Referências (1) Langone, J. J.; Vunakis, Η. V. “Aflatoxin Bl: Specific antibodies and their use in radioimmunoassays.” J. Natl. Câncer Inst. 1976, 56,591 a 595. (2) Sizaret, P.; Malaveille, C.; Montesano, R.; Frayssinet, C. “Detection of Aflatoxins and related metabolites by radioinimunoassay.” J.

Natl. Câncer Inst. 1982, 69, 1375 a 1381. (3) Whitaker, T.; Horwitz, W.; Albert, R.; Nesheim, S. “Variability associated with analytical methods used to measure aflatoxin in agricultural commodities.” J. AO AC Int. 1996, 79, 476 a 485. (4) Wilson, T. J.; Romer, T. R. “Mycotoxins: Use of the mycosep multifunctional cleanup column for liquid chromatographic determination of Aflatoxins in agricultural products.” J. Assoe. Off. Anal. Chem. 1991,74, 951 a 956. (5) Newbeme, P. M.; Butler, W. H. Câncer Res. 1969,29,236 a 250. (6) Trucksess, M. W.; Stack, Μ. E.; Nesheim, S.; Page, S. W.; Albert, R. H.; Hansen, T. J.; Donahue, K. F. “Immunoaffmity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography posteolumn derivatization for determination of aflatoxins in com, peanuts and peanut butter: Collaborative study.” J. Assoe. Off. Anal. Chem. 1991, 74, 81 a 88. (7) Wild, C. P.; Pionneau, F. A.; Montesano, R.; Mutiro, C. F.; Chetsanga, C. J. “Aflatoxin detection in human breast milk by immunoassay.” Int. J. Câncer. 1987, 40, 328 a 333. (8) Trucksess, M. W.; Stack, Μ. E.; Nesheim, S.; Albert, R. H.; Romer, T. R. “Multifunctional column coupled with liquid chromatography for determination of aflatoxins Bl, B2, G1 and G2 in com, almonds, brazil nuts, peanuts and pistachio nuts: Collaborative study.” J. AO AC. Int. 1994, 77, 1512 a 1521. (9) Campbell, T. C.; Stoloff, L. “Implication of mycotoxins for human health” J. Agr. Food Chem. 1974, 22, 1006 a 1014. (10) Seitz, L. M. “Comparison of methods of aflatoxin analysis by high-pressure liquid chromatography.” J. Chromatogr. 1975,104, 81 a 91. (11) Asao, T.; Buchi, G.; Abdel-kader, Μ. M.; Chang, S. B.; Wick, E. L.; Wogan, G. N. “The strueture of Aflatoxins B and Gi.” J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 882 a 886.

Claims (12)

1. Ensaio homogêneo para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas, o dito ensaio homogêneo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: extrair aflatoxina de uma amostra para fornecer um extrato; combinar o dito extrato com um rastreador e um anticorpo para fornecer uma mistura, o dito anticorpo sendo específico para aflatoxina, o dito rastreador compreendendo uma oxima de aflatoxina conjugada ao isômero 2 de fluoresceinamina, o dito rastreador sendo capaz de ligar ao dito anticorpo para produzir uma mudança detectável na polarização de fluorescência; medir a polarização de fluorescência da dita mistura para obter uma polarização de fluorescência medida; e comparar a dita polarização de fluorescência medida com um valor de polarização de fluorescência caracterizado, o dito valor de polarização de fluorescência caracterizado correspondendo a uma concentração de aflatoxina conhecida.

2. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de extrair aflatoxina de uma amostra para fornecer um extrato compreende as etapas de: triturar a dita amostra para fornecer uma amostra triturada; e agitar a dita amostra triturada com um solvente de extração durante um tempo predeterminado.

3. Ensaio de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito solvente de extração compreende um solvente orgânico e água.

4. Ensaio de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é metanol.

5. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita oxima de aflatoxina é (Aflatoxina B])-0-carboximetiloxima.

6. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende as etapas de: fornecer uma pluralidade de soluções padrão de aflatoxina, cada uma das ditas soluções padrão de aflatoxina tendo uma concentração conhecida diferente de aflatoxina; adicionar o dito rastreador e o dito anticorpo a cada uma da dita pluralidade de soluções padrão de aflatoxina, de modo a fornecer uma pluralidade de misturas padrão; e medir a polarização de fluorescência de cada uma da dita pluralidade das ditas misturas padrão para fornecer uma pluralidade de valores de polarização de fluorescência padrão correspondendo às concentrações de aflatoxina conhecidas.

7. Ensaio de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito valor de polarização de fluorescência caracterizado é um dos ditos valores de polarização de fluorescência padrão.

8. Kit de ensaio para a determinação de aflatoxinas em produtos agrícolas, o dito kit de ensaio caracterizado pelo fato de que compreende: um anticorpo e um rastreador, cada um em uma quantidade adequada para pelo menos um ensaio, e acondicionamento adequado, o dito anticorpo sendo específico para aflatoxina, o dito rastreador compreendendo uma oxima de aflatoxina conjugada ao isômero 2 de fluoresceinamina, o dito rastreador sendo capaz de ligar ao dito anticorpo para produzir uma mudança detectável na polarização de fluorescência.

9. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um solvente de extração para extrair aflatoxina de uma amostra.

10. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito solvente de extração compreende um solvente orgânico e água.

11. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é metanol.

12. Kit de ensaio de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita oxima de aflatoxina é (Aflatoxina Bi)-0-carboximetiloxima.