CN1245629C - 基于荧光偏振的黄曲霉素均相检测法及其试剂盒 - Google Patents

基于荧光偏振的黄曲霉素均相检测法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于测定农产品中黄曲霉素的均相检测法，该方法使用荧光偏振技术。使用一种溶剂从农产品样品中提取黄曲霉素。通过将提取物、示踪剂和黄曲霉素特异性单克隆抗体相混合得到一混合物。示踪剂能够与单克隆抗体结合以产生能够检测的荧光偏振变化。示踪剂通过适合的荧光团与黄曲霉素肟共轭得到。测量混合物的荧光偏振。通过测量一系列已知浓度的黄曲霉素溶液的荧光偏振得到标准曲线，利用该标准曲线计算混合物中黄曲霉素的浓度。

Description

基于荧光偏振的黄曲霉素均相检测法及其试剂盒
发明背景
1.发明领域
本发明涉及霉菌毒素的检测领域。尤其涉及一种均相检测法，其通过改变荧光偏振以监测农产品中存在的黄曲霉素。
2.相关文献描述
黄曲霉素是由Aspergillus flavus方式生成的霉菌毒素1。黄曲霉素已经被发现很长时间了，但是其致癌作用在19世纪60年代后期才被首次发现。不同类型的黄曲霉素，包括B1，B2，G1，和G2以及许多其它类型存在于多种人类食品中，诸如谷类食品、谷粒和花生制品9，11。黄曲霉素B1是所有类型中毒性最大、存在最广泛的一种。接触黄曲霉素会提高原发性肝细胞癌症的发生率7。
由于黄曲霉素的毒性和致癌性，人们已经设计出多种定量测定农产品中黄曲霉素含量的分析方法1-4，6，8。这些检测方法的一个难题是黄曲霉素的强疏水性，其在水溶剂中溶解度很差。因此，通常采用含水的有机溶剂混合物提取样品中的黄曲霉素。
另一个难题是大多数常用检测方法，包括TLC和HPLC10，在提取之后需要进一步的清除步骤和衍生化以除去干扰物质。ELISA方法检测得相对快，但由于需要多种清洗步骤、液相转移和培养时间以及清除步骤因而难于定量。
因此，需要获得一种快速测定农产品中的黄曲霉素、便于操作且可以定量分析的检测方法。
发明概述
本发明的首要方案在于提供一种测定农产品中黄曲霉素的均相检测法。从样品中提取黄曲霉素，将提取物与示踪剂和抗体混合得到一混合物。抗体是黄曲霉素的特异性抗体。示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟。示踪剂能够与抗体结合而产生可探测到的荧光偏振变化。测量混合物的荧光偏振并与标准曲线相比较。
本发明的检测方法进一步包括下述步骤：提供多个黄曲霉素标准溶液，每个所述黄曲霉素标准溶液具有不同的黄曲霉素已知浓度；在每个所述多个黄曲霉素标准溶液中加入所述示踪剂和所述抗体以提供多个标准混合物；以及测量每个所述多个标准混合物的荧光偏振以提供多个对应于已知黄曲霉素浓度的标准荧光偏振数值。
本发明的第二个主要方案在于提供一种测定农产品中黄曲霉素的检测试剂盒。该检测试剂盒包括一种抗体和一种示踪剂，每个含量至少适于一次测试，并适于包装。抗体是黄曲霉素的特异性抗体。示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟。示踪剂能够与抗体结合而产生可探测到的荧光偏振变化。
附图简要说明
图1为一系列浓度的黄曲霉素在一定时间内的荧光偏振变化的曲线图，其与本发明的一个实施方案相一致。
图2为不含黄曲霉素的样品的一系列浓度的甲醇溶液在一定时间内的荧光偏振变化的曲线图，其利用表1数据所绘制，与本发明的一个实施方案相一致。
图3为黄曲霉素荧光偏振检测的标准曲线，其利用表2数据绘制，与本发明的一个实施方案相一致。
图4为HPLC测得的样品的黄曲霉素浓度相对于从图3标准曲线所计算的黄曲霉素浓度的曲线图，其与本发明的一个实施方案相一致。
图5为标定的(spiked)黄曲霉素样品浓度相对于荧光偏振测定值所计算的黄曲霉素浓度的曲线图，其与本发明的一个实施方案相一致。
图6为荧光偏振检测黄曲霉素的标准曲线，采用该曲线获得表6和7的数据，其与本发明的一个实施方案一致。
优选的实施方案描述
本发明的优选实施方案提供了一种测定农产品中黄曲霉素的比较简单的均相检测方法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术已成功地用于多种物质的检测中，其中包括蛋白质、酶、药物、DNA、激素、肽和抗体。
荧光偏振技术的原理如下：具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大。关于荧光偏振技术的进一步信息在美国专利号5,427,960和5,976,820以及Nasir，M.S.和Jolley，M.E.，″Fluorescence Polarization：An analytical tool for hnmunoassay and DrumgDiscovery，″Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening，1999，2，177-190中有记载，这些文献在此作为参考而引用。
本发明中，从样品中提取到的黄曲霉素在单克隆抗体存在下与荧光示踪剂相竞争，由此而引起荧光偏振度的变化，该变化随黄曲霉素浓度的改变而改变。
本发明的优选实施方案提供了一种黄曲霉素的均相检测法，该方法灵敏、快速、简单且成本低。该方法也可以进行便携式现场操作(field-portable)且可得到定量结果。
                        1.材料和方法
该研究使用了两种不同的黄曲霉素单克隆抗体。购自Sigma(catalog no.A-9555)的一种黄曲霉素单克隆抗体用于起初测试的开发性工作中，但发现其对甲醇敏感。在后期工作中，从美国农业部(Peoria，Illinois)农业研究所的Dr.Chris Maragos得到的一种单克隆抗体，由于其在甲醇中稳定而被采用。这种单克隆抗体的应用在Chris M.Maragos和Vicki S.Thompson，″Fiber-opticImmunosensor for Mycotoxins，″Natural Toxins 7：371-376(1999)中已有报导，将此文献作为参考而引用。此外，还有很多其它的黄曲霉素单克隆抗体，参见，如美国专利号为4,835,100的专利。
被黄曲霉素天然污染的玉米样品和没有被黄曲霉素污染的爆米花(popcom)都购自Trilogy Analytical Laboratory，Inc.(Washington，Missouri)。Trilogy还提供了黄曲霉素B1/B2/G1/G2(7/1/3/1)混合物。纯的黄曲霉素B1购自Sigma。
荧光偏振测定在室温下进行，采用单管Sentry-FP荧光偏振仪(DiachemixCorp.)测定。
                        2.黄曲霉素示踪剂的制备
在装有磁搅拌器和冷凝器的10ml圆底烧瓶中，加入与1.2ml绝对乙醇(absolute ethanol)混合的黄曲霉素B1(5mg，0.016mmol，Sigma)和O-羧甲基-羟基氨基半盐酸(41mg，0.19mmol，Sigma)。一边搅拌一边向该溶液中加入230μl的2MNaOH溶液(0.46mmol)，然后使溶液回流3个小时。所得溶液再在室温下搅拌过夜，用旋转蒸发仪浓缩后，用水稀释至1.5ml。逐滴加入1N NaOH，调节PH至9左右，用乙酸乙酯洗涤溶液(洗涤两次，每次约3ml)。用6M HCl酸化水层至pH约为2左右，所得混合物在冰箱中于0℃下储存。分离固体沉积物并干燥。用硅胶TLC，展开相为乙酸乙酯∶甲醇∶氨水(32∶17∶5)，显示肟产物的主斑点，其Rf值约为0.5。
将上述制备的(黄曲霉素B1)-O-羧甲基肟的20μl THF溶液与20μl二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液(10mg/ml)混合于200μl的二氯甲烷中。2-3分钟后，加入20μl荧光素胺(fluoresceinamine)的THF溶液(异构体2，10mg/ml)。在室温下，使反应过夜。在黄曲霉素肟不存在的情况下，进行同样的反应作为对照反应。产物的TLC(利用CHCl3∶MeOH∶CH3CO2H，40∶10∶3展开)显示了多个斑点。对照反应中缺少Rf～0.7的斑点。收集示踪剂，并溶于甲醇中，然后用缓冲液稀释10μl的示踪剂溶液至1ml，其相对荧光强度为～400,000单元(unit)。
观察到该示踪剂可以提供～40mP的稳定偏振。加入10μl的1/50稀释的抗体(Sigma，A-9555)得到最终的稀释液1/5,000，在5分钟内其偏振度慢速增加至～230mP。
为了确认其反应性，取1ml的缓冲液，并与10μl的抗体和10μl(0.8mg/ml)的黄曲霉素B1相混合。混合物在室温下保持5分钟，然后作为空白溶液调节FP仪器，再加入10μl的示踪剂，荧光偏振从～230mP减小至～41mP。
用类似反应制备各种采用荧光素胺(异构体1)作为荧光团的黄曲霉素B1示踪剂。所得示踪剂的灵敏性低于荧光素胺(异构体2)作为荧光团的示踪剂。具体而言，当加入抗体时，起始偏振(～32mP)仅变成～140mP。
也可用其它的荧光素胺衍生物作为荧光团制备黄曲霉素B1示踪剂。结果总结如下。当使用5-氨基乙酰-氨基荧光素(5AAF)作为荧光团时，得到的示踪剂具有～30mP的荧光偏振，加入抗体时增至～65mP。当使用5-(5-氨基戊基)-硫脲基荧光素(5，5APTF)作为荧光团，示踪剂具有～35mP的荧光偏振，其加入抗体后增至～102mP。也尝试了荧光素胺基硫脲(FTSC)、4-氨基甲基荧光素和5-氨基甲基荧光素作为荧光团，但都没有得到活性产物，也就是说与抗体结合后荧光偏振没有产生显著变化。因此，从上述研究中可以得出结论，荧光素胺的异构体2与该抗体作用的结果最好。
                    3.检测研究发展过程
将购自Sigma(A-9555)的黄曲霉素抗体用PBSA-BGG(pH～7.5)稀释(1/150,000)后用于起初的检测研究中，该稀释液为含有1g/l叠氮化钠和9g/l氯化钠以及100μg/ml牛γ球蛋白(BGG)的磷酸盐缓冲液。将1ml的抗体溶液与50μl不含黄曲霉素B1的甲醇/水(70/30)已知浓度的溶液相混合。所用的黄曲霉素B1的浓度从0至40ppb而变化。在空白液测试完成后，加入10μl稀释后的示踪剂，该示踪剂采用荧光素胺(异构体2)作为荧光团，根据上述方法而制备，监测10分钟荧光偏振的变化。结果如图1所示。
由于黄曲霉素是用有机溶剂和水的混合溶剂从农产品样品中提取到的，因此研究了甲醇对于购自Sigma(A-9555)的黄曲霉素抗体的作用。特异地，将1ml稀释后的抗体溶液与已知浓度的甲醇相混合。空白液测试后，加入示踪剂(如上所述的黄曲霉素B1肟-异构体2荧光素胺示踪剂)，测试一定时间的荧光偏振。结果总结于下列表1与图2中。
表1
  时间(分钟)   50ml甲醇   40ml甲醇   30ml甲醇   20ml甲醇   10ml甲醇   50ml水
  0.5   32.0   49.70   88.80   56.70   73.20   46.30
  1.0   91.0   105.40   74.40   117.60   128.40   129.80
  1.5   117.0   126.20   126.30   143.00   156.70   165.40
  2.0   145.9   140.50   139.30   157.70   170.40   178.60
  2.5   150.4   152.50   154.30   168.90   179.20   188.30
  3.0   161.3   161.50   167.50   176.70   186.80   194.30
  3.5   165.5   165.70   170.30   181.90   192.10   199.60
  4.0   168.1   175.40   178.60   186.10   195.50   202.30
  4.5   179.6   177.10   185.10   191.30   198.70   205.40
  5.0   189.3   179.10   186.80   195.50   202.10   208.30
  5.5   186.1   185.80   187.10   198.40   204.50   209.80
  6.0   186.6   187.00   190.40   198.00   205.60   210.60
这些结果显示荧光偏振随甲醇浓度的增加而降低，而且对于同一甲醇浓度，荧光偏振随时间延长而增加。因此，尽管示踪剂本身在甲醇和相关的有机溶剂中能稳定存在较长时间，但这些结果显示该抗体对于甲醇是敏感的。结果是该抗体在用于基于荧光偏振的黄曲霉素检测中具有敏感性，优选使用在甲醇中更稳定的抗体以获得更可靠的结果。从美国农业部(Peoria，Illinois)农业研究所的Dr.Chris Maragos得到的一种单克隆抗体在甲醇中具有理想的稳定性。
      4.FP检测法检测被天然污染的玉米样品中的黄曲霉素
天然污染黄曲霉素的玉米样品购自Trilogy Analytical Laboratory，Inc.(Washington，Missouri)。用两份100ml的甲醇/水(70/30)混合溶剂分别提取两份20g粉碎的玉米粒样品中的黄曲霉素，不连续振摇各样品约30分钟。用细过滤纸过滤提取物并在室温下储存于封口瓶中以待分析。
用甲醇/水(70/30)稀释Trilogy提供的黄曲霉素B1/B2/G1/G2(7/1/3/1)制成各种浓度的标准溶液。在试管中将40μl每个样品或标准品混合至1ml抗体溶液(PBSA-BGG缓冲液中1/150,000)。所使用的抗体是Dr.Chris Maragos提供的耐受甲醇的抗体。每个样品作为空白液测试后，各试管中加入10μl的示踪剂，在室温下温育样品15分钟，然后测试各试管的荧光偏振。使用的示踪剂为如上所述的黄曲霉素B1肟-异构体2荧光素胺示踪剂。用两次所得的数据绘制标准曲线。标准品的荧光偏振数值在下列表2和图3中所示。
表2
  黄曲霉素浓度(ppb)   mP(第一次测试)   mP(第二次测试)
  0.0   153.0   160.0
  10.0   134.0   135.0
  20.0   128.0   130.0
  40.0   97.0   96.0
  60.0   78.0   79.0
  80.0   71.0   72.0
  100.0   67.0   67.0
  160.0   64.0   60.0
然后利用标准曲线计算每个玉米样品中的黄曲霉素浓度。结果总结于下列表3中。
表3
  样品   mP(第一次测试)   mP(第二次测试)   计算的黄曲霉素浓度(ppb)
  1   163.0   159.0   0
  2   143.5   135.0   8.99
  3   80.0   75.5   69
  4   92.0   90.5   47
  5   98.0   112.5   32.61
  9   73.5   76.5   75.16
  7   75.5   71.0   79.94
  8   83.0   87.0   56
  10   125.0   124.5   17.35
  11   146.5   146.0   5.4
同时用上述荧光偏振法和标准HPLC技术对这些样品进行分析，比较两种技术测定的黄曲霉素浓度。除了其中一个样品污染有极高浓度的黄曲霉素以外，所有结果总结于下列表4和图4中。结果显示了HPLC和FP之间的良好相关性(r2＝0.97)。
表4
  HPLC测定的黄曲霉素浓度(ppb)   FP测定的黄曲霉素浓度(ppb)
  0.50   0.0
  10.20   9.0
  56.40   69.0
  41.50   47.0
  33.30   32.6
  47.10   56.0
  60.80   75.0
  75.00   80.0
  13.01   5.4
        5.爆米花(Popcorn)样品中黄曲霉素的分析
20g不含黄曲霉素的爆米花(popcorn)粉碎样品采用黄曲霉素B1/B2/G1/G2(7/1/3/1)混合物标定(spike)成已知浓度。如上所述对于每个提取物进行两次荧光偏振分析。根据标准曲线，从测试的荧光偏振平均值计算每个样品的黄曲霉素浓度，并与已知标定(spike)的浓度相比较。结果总结于下列表5和图5中。在该研究中，将标定的样品浓度320ppb稀释1/10以便进行荧光偏振测定。
表5
  标定的黄曲霉素浓度(ppb)   mP   计算的黄曲霉素浓度(ppb)
  0   178   0.47
  10   169   5.79
  10   168   6.43
  20   157   14.60
  20   159   13.16
  30   148   23.30
  40   142   31.12
  80   129   57.72
  160   122   94.74
  320   152   189
这些结果显示了理论值和用本发明的荧光偏振检测法获得的结果具有良好的相关性(r2＝0.996)。然而，荧光偏振结果总是比实际的黄曲霉素浓度偏低。一种解释是天然污染的样品主要含有黄曲霉素B1，和一部分的B2，但不含有G1和G2，而爆米花(popcorn)样品是用B1/B2/G1/G2的混合物以7/1/3/1比率进行标定的。
为了验证这种解释，对于这些黄曲霉素的交互反应性进行研究。用甲醇/水(70/30)混合物将购自Sigma的黄曲霉素B1，B2，G1和G2分别稀释为一系列的浓度，即10，25，40，80，和100ppb。按本发明方法对于黄曲霉素B1溶液进行荧光偏振检测，绘制图6的标准曲线。表6和表7分别显示了从图6的标准曲线中计算的黄曲霉素G1和G2的结果。
表6
  黄曲霉素G1浓度(ppb)   mP   计算的黄曲霉素浓度(ppb)
  10   143   3.75
  25   130   9.06
  40   115   16.44
  80   101   25.16
  100   99   26.61
表7
  黄曲霉素G2浓度(ppb)   mP   计算的黄曲霉素浓度(ppb)
  10   144   3.37
  25   133   7.76
  40   113   17.56
  80   101   25.16
  100   98   27.35
这些结果显示当黄曲霉素G1和G2的浓度是从只有黄曲霉素B1制得的标准曲线计算所得时，其数值要偏低。具体而言，黄曲霉素G1和G2与单独的黄曲霉素B1交互反应程度为30-40％。这可以作为标定的爆米花(popcorn)样品的黄曲霉素浓度偏低的解释。
                        6.检测试剂盒
本发明所用的检测材料优选能以试剂盒的形式获得。试剂盒优选包括一定量的用于从谷粒或其它产品样品中提取黄曲霉素的提取溶液、示踪剂和抗体，上述物质的量至少适于一次检测，以及合适的包装和使用说明。示踪剂和抗体可以以溶液、液体分散体(liquid dispersion)或干粉末的形式(如，冻干粉末形式)提供。
合适的包装可以是任何固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、金属箔及其类似物，能够在固定的空间内分别盛放缓冲液、示踪剂和抗体。例如，提取溶剂、示踪剂和单克隆抗体可以是溶液形式，其分别在标有标签的玻璃或塑料瓶或小瓶中存放。
抗体是黄曲霉素特异性抗体，且优选为单克隆抗体。更有选为在提取溶剂中具稳定性的单克隆抗体。
示踪剂包括与黄曲霉素肟共轭的荧光团，优选为(黄曲霉素B1)-O-羧甲基肟。适宜的荧光团包括荧光素胺(异构体1)，荧光素胺(异构体2)，5-氨基乙酰-氨基荧光素(5AAF)，5-(5-氨基戊基)-硫脲基荧光素(5，5APTF)。也可以使用其它的荧光团，只要所得示踪剂能够与抗体相结合产生可检测到的荧光偏振变化。优选的荧光团为荧光素胺。最优选的荧光团为荧光素胺(异构体2)。
提取溶剂优选为有机溶剂如甲醇或乙腈与水的混合物。最优选的提取溶剂是甲醇/水(70/30)的混合物。
                        7.参考文献
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(7)Wild，C.P.；Pionneau，F.A.；Montesano，R.；Mutiro，C.F.；Chetsanga，C.J.″Aflatoxin detection in human breast milk byimmunoassay.″Int.J.Cancer.1987，40.328-333.
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Claims (18)

1.一种用于测定农产品中黄曲霉素的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：
从样品中提取黄曲霉素，得到提取物；
将所述提取物与示踪剂和抗体混合，得到一混合物，所述抗体为黄曲霉素特异性抗体，所述示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟，所述示踪剂能够与所述抗体结合以产生能够检测的荧光偏振变化；
测量所述混合物的荧光偏振以获得荧光偏振测量值；以及
将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值与已知黄曲霉素浓度相对应。
2.权利要求1的检测法，其中所述从样品中提取黄曲霉素得到提取物的步骤包括步骤：
粉碎所述样品以提供粉碎的样品；以及
将所述粉碎的样品在提取溶剂中振摇预定的时间。
3.权利要求2的检测法，其中所述提取溶剂由有机溶剂和水组成。
4.权利要求3的检测法，其中所述有机溶剂为甲醇。
5.权利要求1的检测法，其中所述荧光团选自荧光素胺、5氨基乙酰-氨基荧光素或5-(5-氨基戊基)-硫脲基荧光素。
6.权利要求5的检测法，其中所述荧光团为荧光素胺的异构体。
7.权利要求6的检测法，其中所述荧光团为荧光素胺的异构体2。
8.权利要求1的检测法，其中所述黄曲霉素肟为(黄曲霉素B1)-O-羧甲基肟。
9.权利要求1的检测法，其进一步包括下述步骤：
提供多个黄曲霉素标准溶液，每个所述黄曲霉素标准溶液具有不同的黄曲霉素已知浓度；
在每个所述多个黄曲霉素标准溶液中加入所述示踪剂和所述抗体以提供多个标准混合物；以及
测量每个所述多个标准混合物的荧光偏振以提供多个对应于已知黄曲霉素浓度的标准荧光偏振数值。
10.权利要求9的检测法，其中所述特征性荧光偏振数值为所述标准荧光偏振数值之一。
11.一种用于测定农产品中黄曲霉素的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
一种抗体和一种示踪剂，每种数量都至少适用于一次检测，以及合适的包装，所述抗体对于黄曲霉素是特异性的，所述示踪剂包括与荧光团共轭的黄曲霉素肟，所述示踪剂能够与所述抗体结合以产生可检测的荧光偏振变化。
12.权利要求11的检测试剂盒，其进一步包括用于从样品中提取黄曲霉素的提取溶剂。
13.权利要求12的检测试剂盒，其中所述提取溶剂由有机溶剂和水组成。
14.权利要求13的检测试剂盒，其中所述有机溶剂为甲醇。
15.权利要求11的检测试剂盒，其中所述荧光团选自荧光素胺、5-氨基乙酰-氨基荧光素或5-(5-氨基戊基)-硫脲基荧光素。
16.权利要求15的检测试剂盒，其中所述荧光团为荧光素胺。
17.权利要求16的检测试剂盒，其中所述荧光团为荧光素胺的异构体2。
18.权利要求11的检测试剂盒，其中所述黄曲霉素肟为(黄曲霉素B1)-O-羧甲基肟。
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