BRPI0208573B1 - Processo para modificar biomassa de plantas - Google Patents

Abstract

,"processo para modificar biomassa de plantas" são proporcionados polinucleotídeos recombinantes e processos para modificar o fenótipo de uma planta. em modalidades preferidas, o fenótipo modificado é uma biomassa de planta. a modificação de biomassa de planta leva a produções melhoradas para culturas folhosas, por exemplo. o processo compreende alterar os níveis de um fator de transcrição que é introduzido na planta ou que é endógeno à planta para obter uma planta com mais biomassa.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA MODIFICAR BIOMASSA DE PLANTAS (51) Int.CI.: A01H 5/00; C07H 21/04; C12N 5/04; C12N 15/29; C12N 15/82 (30) Prioridade Unionista: 30/03/2001 US 09/823,676 (73) Titular(es): MENDEL BIOTECHNOLOGY, INC.

(72) Inventor(es): JIANG CAI-ZHONG

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO

PARA MODIFICAR BIOMASSA DE PLANTAS.

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente U.S. N^e de Série 09/823.676, depositado em 30 de março de 2001.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se ao campo da biologia de plantas. Mais particularmente, a presente invenção pertence a composições e processos para modificar uma planta fenotipicamente.

Fundamentos da Invenção

O aumento da biomassa de uma planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa de folhas pode aumentar a produção de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, aumentar a biomassa de folhas pode ser utilizado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Pelo aumento da biomassa de plantas, podem ser obtidos níveis aumentados de produção dos produtos provenientes das plantas. Folhas de tabaco, em particular, foram empregadas como fábricas de plantas para gerar tais produtos. Além do mais, pode ser desejável aumentar as produções de colheitas de plantas aumentando a fotossíntese total das plantas. Um aumento na fotossíntese total de plantas é alcançado tipicamente aumentando a área de folhas da planta. Pode ser utilizada capacidade fotossintética adicional para aumentar a produção derivada de tecidos particulares de planta, incluindo as folhas, raízes, frutos ou sementes. Adicionalmente, a aptidão de modificar a biomassa de folhas pode ser útil para permitir o desenvolvimento de uma planta sob intensidade diminuída de luz ou sob elevada intensidade de luz. A modificação da biomassa de outro tecido, tal como de raízes, pode ser útil para melhorar a aptidão da planta de se desenvolver sob condições ambientais severas, incluindo seca ou perda de nutrientes, pelo fato das raízes poderem se desenvolver mais profundamente no solo.

Portanto, a presente invenção proporciona um processo para modificar a biomassa de plantas pela modificação do tamanho ou do número de folhas ou sementes de uma planta.

• ·

Sumário da Invenção

Sob um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em: (a) uma seqüência de nucleotídeos codifi5 cando um polipeptídeo compreendendo uma seqüência selecionada entre SEQ ID NO: 2, 4, 6, e 8, ou uma seqüência complementar de nucleotídeos do mesmo; (b) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo uma variante conservadoramente substituída de um polipeptídeo de (a); (c) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma seqüência selecionada entre os de SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7, ou uma seqüência complementar de nucleotídeos da mesma; (d) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo substituições silenciosas em uma seqüência de nucleotídeos de (c); (e) uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas substancialmente de um lado a outro do comprimento intei15 ro de uma seqüência de nucleotídeos de um ou mais de: (a), (b), (c), ou (d); (f) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de qualquer um de (a) - (e); (g) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma subseqüência ou fragmento de qualquer um de (a) - (f), subseqüência ou fragmento esse que codifica um polipeptídeo tendo atividade biológica que modifique a biomassa de plantas; (h) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 40 % de identidade de seqüência de uma seqüência de nucleotídeos de qualquer um de (a) - (g); (i) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 85 % de identidade de seqüência de uma seqüência de nucleotídeos de qualquer um de (a) - (g); (j) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 40 % de identidade de seqüência de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8; (k) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de seqüência de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8; (I) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um domínio conservado de um polipeptídeo tendo pelo menos 65 % de identidade de seqüência de um domínio conservado de um polipeptídeo de SEQ

ID NO: 2, 4, 6 ou 8; (m) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um fa-

··· ··· tor de transcrição de planta compreendendo um fragmento tendo 6 aminoácidos consecutivos de uma região de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 fora do domínio conservado; (n) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 85 % de identidade de seqüência de (m); (o) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um fator de transcrição de planta compreendendo um fragmento tendo 8 aminoácidos consecutivos de uma região de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 fora do domínio conservado; e (p) uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 85 % de identidade de seqüência de (o). Seqüências homólogas, paralogs, ortologs e/ou homologs conforme aqui descritos ou mencionados nas Tabelas também são especificamente incluídas nos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Q polinucleotídeo recombinante pode compreender adicionalmente um promotor constitutivo, induzível, ou específico de tecido operacionalmente ligado à seqüência de nucleotídeo. A invenção também se refere a composições compreendendo pelo menos dois dos polinucleotídeos acima descritos.

Sob um segundo aspecto, a invenção é um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo uma subseqüência de pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos codificados pelo polinucleotídeo recombinante ou isolado acima descrito. Esses polinucleotídeos e polipeptídeos são úteis para a modificação de biomassa de planta, tanto pelo aumento como pela diminuição do tamanho das folhas, das raízes, das flores, das sementes, dos pedúnculos ou similares.

Sob outro aspecto, a invenção é uma planta transgênica compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos recombinantes acima descritos. Ainda sob outro aspecto, a invenção é uma planta com níveis alterados de expressão de um polinucleotídeo acima descrito ou uma planta com níveis de expressão ou atividade alterada de um polipeptídeo acima descrito. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um vetor de clonagem ou de expressão compreendendo o polinucleotídeo isolado ou recombinante acima descrito ou células compreendendo o vetor de clonagem ou de expressão.

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Ainda sob um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição produzida pela incubação de um polinucleotídeo da invenção com uma nuclease, uma enzima de restrição, uma polimerase; uma polimerase e um iniciador; um vetor de clonagem, ou com uma célula.

Além do mais, a invenção refere-se a um processo para produzir uma planta tendo uma biomassa de planta modificada. O processo compreende alterar a expressão de um polinucleotídeo isolado ou recombinante da invenção ou alterar a expressão ou atividade de um polipeptídeo da invenção em uma planta para produzir uma planta modificada, e selecionar a planta modificada em função da biomassa aumentada ou diminuída.

Sob outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para identificar um fator que é modulado por ou interage com um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da invenção. O processo compreende expressar um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo em uma planta e identificar pelo menos um fator que seja modulado por ou interaja com o pov lipeptídeo. Em uma concretização, o processo para identificar fatores de modulação ou de interação é por detecção da ligação pelo polipeptídeo a uma seqüência de promotor, ou por detecção de interações entre uma proteína adicional e o polipeptídeo em um sistema de levedura de dois híbridos, ou pela detecção da expressão de um fator por hibridização a uma microrrede, por hibridização substrativa ou por exibição diferencial.

Em ainda outro aspecto, a invenção é um processo para identificar uma molécula que modula a atividade ou expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de interesse. O processo compreende colocar a molé25 cuia em contato com uma planta compreendendo o polinucleotídeo ou polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da invenção e monitorar um ou mais dos níveis de expressão do polinucleotídeo na planta, o nível de expressão do polipeptídeo na planta, e a modulação de uma atividade do polipeptídeo na planta.

Em, ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um sistema integrado, meio de computador ou legível por computador, compreendendo um ou mais cordões de caráter correspondentes a um polinucleotídeo da

··· ·· • · invenção, ou a um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo. O sistema integrado, meio de computador ou legível por computador, pode compreender uma ligação entre um ou mais cordões de seqüência a um fenótipo de biomassa modificado.

Em ainda outro aspecto, a invenção é um processo para identificar uma seqüência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotídeos da invenção, ou um ou mais polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos. O processo compreende proporcionar um banco de dados de seqüências e consultar o banco de dados de seqüências com uma ou mais seqüências alvo correspondentes a um ou mais polinucleotídeos ou ao um ou mais polipeptídeos para identificar um ou mais membros de seqüência do banco de dados que exiba similaridade ou homologia de seqüência a uma ou mais seqüências alvo.

Breve Descrição da Listagem de Seqüências e dos Desenhos

A Listagem de Seqüências proporciona seqüências exemplificativas de polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Essas seqüências podem ser empregadas para modificar a biomassa da planta.

A Figura 1 mostra os alinhamentos dos polipeptídeos para G1073 (SEQ ID N~ 1 e 2), G2789 (SEQ ID N— 3 e 4), G1945 (SEQ ID N— 5 e 6) e G2155 (SEQ ID N— 7 e 8) mostrando regiões dos polipeptídeos com identidade de seqüência.

A Figura 2 mostra que plantas superexpressando G1073 têm um peso fresco, peso seco e produção aumentada de sementes (maior do que 150 %) quando comparadas com plantas que não superexpressa G1073.

A Figura 3 contém fotografias de uma planta superexpressando

G10783 e uma planta tipo selvagem (peso) e demonstra que plantas superexpressando G1073 têm uma biomassa aumentada quando comparadas a plantas de controle ou referência.

Descrição Detalhada

Cada uma das referências, documentos e fontes de informação aqui listados é especificamente incorporado neste pedido e pode ser considerada para fazer ou utilizar a invenção.

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A presente invenção refere-se a polinucleotídeos ou a polipeptídeos, por exemplo, para modificar fenótipos de plantas. Em particular, os polinucleotídeos ou polipeptídeos são úteis para modificar a biomassa de plantas quando os níveis de expressão dos polinucleotídeos ou os níveis de expressão ou os níveis de atividade dos polipeptídeos são alterados em comparação com aqueles encontrados em uma planta do tipo selvagem. A biomassa de plantas pode ser quer diminuída, quer aumentada ou quer feita induzível sob condições específicas utilizando os polinucleotídeos ou polipeptídeos desta invenção.

Os polinucleotídeos da invenção codificam fatores de transcrição de planta. Os fatores de transcrição de planta são derivados, por exemplo, de Arabidopsis thaliana e podem pertencer, por exemplo, a uma ou mais das seguintes famílias de fator de transcrição: a família de fator de transcrição do domínio AP2 (APETALA2) (Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol. Chem.

379: 633 - 646); a família de fator de transcrição MYB (Martin and Paz-Ares (1997) Trends Genet. 13: 67 - 73); a família de fator de transcrição de domínio MADS (Riechmann and Meyerowitz (1997) Biol. Chem. 378: 1079 1101); a família de proteínas WRKY (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 563 - 571); a família de proteínas de repetição de ancirina (Zhang et al., (1992) Plant Cell 4: 1575 - 1588); a família de proteínas miscelâneas (MISC) (Kim et al., (1997) Plant J. 11: 1237 - 1251; a família de proteínas dedo, de zinco (Z) (Klug and Schwabe (1995) FASEB J. 9597 604); a família das proteínas homeobox (HB) (Buerglin in Duboule (1994) Guidebook to the Homeobox Genes, Oxford University Press); as proteínas de ligação a elemento-CAAT (Forsburg and Guarente (1989) Genes Dev. 3: 1166 - 1178); as proteínas de ligação a promotor escamoso (SPB) (Klein et al., (1996) Mol. Gen. Genet. 1996 250: 7 - 16); a família de proteínas NAM; as proteínas IAA/AUX (Rouse et al., (1998) Science 279: 1371 - 1373); a família de proteínas HLH/MYC (Littlewood et al., (1994) Prot. Profile 1: 639 30 709); a família de proteínas de ligação a DNA (DBP) (Tucker et al., (1994)

EMBO J. 13: 2994 - 3002; a família bZIP de fatores de transcrição (Foster et al., (1994) FASEB J. 8: 192 - 200); a família da proteína BPF-1 (Box P-

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·· ·· binding factor) (da Costa e Silva et al., (1993) Plant J, 4: 125 - 135); a família das proteínas de ouro (GLD) (Hall et al., (1998) Plant Cell 10: 925 - 936); e a família de proteínas AT-hook (Aravind et al., (1998) Nucl. Acid Res. 26: 4413 a 4421). Fatores de transcrição exemplificativos da presente invenção estão listados na Listagem de Seqüências.

Adieionalmente aos processos para modificar um fenótipo de planta pelo emprego de um ou mais polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção aqui descritos, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção têm uma diversidade de utilizações adicionais. Essas utilizações incluem seu uso na produção recombinante (isto é, expressão) de proteínas, como reguladores de expressão de gene de plantas, como sondas de diagnóstico para a presença de ácidos nucléicos complementares ou parcialmente complementares (incluindo para a detecção de ácidos nucléicos de codificação natural), como substratos para reações adicionais, por exemplo, reações de mutação, reações PCR, ou similares, ou como substratos para clonagem, por exemplo, incluindo reações de digestão ou de ligação, e para a identificação de moduladores exógenos e endógenos dos fatores de transcrição. DEFINIÇÕES

Um polinucleotídeo é uma seqüência de ácido nucléico compreendendo uma pluralidade de resíduos nucleotídeos polimerizados, por exemplo, pelo menos cerca de 15 resíduos nucleotídeos consecutivos polimerizados, opcionalmente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos cerca de 50 nucleotídeos consecutivos. Em muitos casos, um polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo (ou proteína) ou um domínio ou um fragmento do mesmo. Adieionalmente, o polinucleotídeo pode compreender um promotor, um íntron, uma região realçadora, um sítio de poliadenilação, um sítio de iniciação de tradução, regiões 5‘ ou 3' não-traduzidas, um gene repórter, um marcador selecionável, uma etiqueta de purificação, ou similares. O polinucleotídeo pode ser DNA ou RNA de filamente simples ou de filamento duplo. O polinucleotídeo compreende opcionalmente bases modificadas ou uma cadeia principal modificada. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA • · · • · · • · «i ou RNA genômico, um transcrito (tal como um mRNA), um cDNA, um produto PCR, um DNA clonado, um DNA ou RNA sintético, ou similares. O polinucleotídeo pode compreender uma seqüência tanto em orientações de sentido como anti-sentido.

Um polinucleotídeo recombinante é um polinucleotídeo que não se encontra em seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos não encontrada na natureza, ou o polinucleotídeo encontra-se em um contexto outro do que aquele em que é naturalmente encontrado, por exemplo, separado de seqüências de nucleotídeos corn os quais o mesmo se encontra tipicamente em proximidade na natureza, ou adjacente (ou contíguo com) às seqüências de nucleotídeos com os quais o mesmo não se encontra tipicamente em proximidade. Por exemplo, a seqüência em questão pode ser clonada em um vetor, ou de outro modo recombinada com um ou mais ácidos nucléicos adicionais.

Um polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo tanto de ocorrência natural como recombinante, que está presente fora da célula na qual é tipicamente encontrado na natureza, tanto purificado como não. Opcionalmente, um polinucleotídeo isolado é submetido a um ou mais procedimentos de enriquecimento ou de purificação, por exemplo, lise celular, extração, centrifugação, precipitação, e similar.

Um polipeptídeo recombinante é um polipeptídeo produzido por tradução de um polinucleotídeo recombinante. Um polipeptídeo isolado, seja um polipeptídeo de ocorrência natural ou um recombinante, é mais enriquecido em (ou fora de) uma célula do que o polipeptídeo no seu estado natural em uma célula do tipo selvagem, por exemplo, mais do que 5 % enriquecido, mais do que cerca de 10 % enriquecido, ou mais do que cerca de 20 %, ou mais do que cerca de 50 %, ou mais, enriquecido, isto é, alternativamente designado: 105 %, 110 %, 120 %, 150 %, 300 % ou mais, enriquecido em relação ao tipo selvagem padrão em 100 %. Um tal enriquecimento não é o resultado de uma resposta natural de uma planta do tipo selvagem. Alternativamente, ou adicionalmente, o polipeptídeo isolado é separado dos outros componentes celulares com os quais está tipicamente associado, por

··♦ ··· ··]) exemplo, por qualquer dos processos aqui apresentados de purificação de proteína.

O termo planta transgênica refere-se a uma planta que contém material genético não encontrado em uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. O material genético pode incluir um transgene, um evento de mutagênese insercional (tal como por transposon ou mutagênese insercional T-DNA), uma seqüência de marcação de ativação, uma seqüência mutada, um evento recombinante homólogo ou uma seqüência modificada por quimeroplastia. Tipicamente, o material genético precedente foi introduzido na planta por manipulação humana.

Uma planta transgênica pode conter um vetor ou cassete de expressão. O cassete de expressão compreende tipicamente uma seqüência codificando um polipeptídeo operavelmente ligado a (isto é, sob controle regulador de) seqüências constitutivas ou reguladoras induzíveis apropriadas que possibilitam a expressão de polipeptídeo. O cassete de expressão pode ser introduzido em uma planta por transformação ou por criação após transformação de uma planta original. Um planta refere-se a uma planta integral assim como a uma parte de planta, tal como semente, fruto, folha, ou raiz, tecido de planta, células de planta ou qualquer outro material de planta, por exemplo, um explante de planta, assim como a progênie da mesma, e a sistemas in vitro que imitam componentes ou processos bioquímicos ou celulares em uma célula.

A frase expressão ectópica ou expressão alterada em referência a um polinucleotídeo indica que a configuração de expressão em, por exemplo, uma planta ou tecido transgênico, é diferente da configuração de expressão em uma planta selvagem ou em uma planta de referência da mesma espécie. Por exemplo, o polinucleotídeo ou polipeptídeo é expresso em um tipo de célula ou de tecido outro que um tipo de célula ou de tecido em que a seqüência é expressa na planta do tipo selvagem, ou por expressão em um tempo diferente do tempo em que a seqüência é expressa na planta do tipo selvagem, ou por resposta a diferentes agentes induzíveis, tais como hormônios ou sinais ambientais, ou em diferentes níveis de expressão

• ·

• α ·· · ··· *·· • A • · · • -t • · · • * (tanto mais elevados como mais baixos) em comparação com aqueles encontrados em uma planta do tipo selvagem. O termo também se refere a configurações de expressão alteradas que são produzidas pelo abaixamento dos níveis de expressão abaixo do nível de detecção ou peia abolição completamente da expressão. A configuração de expressão resultante pode ser transiente ou estável, constitutiva ou induzível. Com referência a um polipeptídeo, o termo expressão ectópica ou expressão alterada pode adicionalmente se relacionar a níveis alterados de atividade resultando de interações dos polipeptídeos com moduladores exógenos ou endógenos ou de interações com fatores ou como resultado da modificação química dos polipeptídeos.

O termo fragmento ou domínio, em relação a um polipeptídeo, refere-se a uma subseqüência do polipeptídeo. Em alguns casos, o fragmento ou domínio é uma subseqüência do polipeptídeo, que desempenha pelo menos uma função biológica do polipeptídeo intacto substancialmente da mesma maneira, ou em uma extensão similar, como o faz o polipeptídeo intacto. Por exemplo, um fragmento de polipeptídeo pode compreender um motivo ou domínio funcional estrutural reconhecível tal como um domínio de ligação a DNA que se une a uma região promotora de DNA, um domínio de ativação ou um domínio para interações proteína-proteína. Os fragmentos podem variar em tamanho de uns poucos, como 5, 6 ou 8 aminoácidos, a todo o comprimento do polipeptídeo intacto, mas são preferivelmente de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento. Com referência a uma seqüência de nucleotídeo, um fragmento refere-se a qualquer subseqüência de um polinucleotídeo, tipicamente, de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos consecutivos, codificando 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos, por exemplo, preferivelmente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50, de qualquer uma das seqüências ai proporcionadas. Um fragmento pode consistir ou compreender nucleotídeos codificando fora de um domínio conservado conhecido existir em um fator de transcrição particular pertencente a uma família de fatores de trans-

··· ··· • · * · · ······ • · · · · • · · · · • · · · · ··· · ·· crição, por exemplo.

O termo traço refere-se à característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou material ou célula particular de planta. Em alguns casos, essa característica é visível ao olho humano, tal como uma semente ou tamanho da planta, ou pode ser determinada por técnicas bioquímicas disponíveis, tal como o teor de proteína, amido ou óleo de sementes ou folhas ou pela observação do nível de expressão de genes, por exemplo, pelo emprego de análise Northern, RT-PCR, análises de expressão de gene em microrrede ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por observações agrícolas tais como tolerância a estresse, produção ou tolerância a patógeno.

Modificação de traço refere-se a uma diferença detectável em uma característica em uma planta expressando ectopicamente um polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção em relação a uma planta não o fazendo assim, tal como uma planta do tipo selvagem. A modificação de traço pode ser avaliada quantitativamente. Por exemplo, a modificação de peculiaridade pode vincular um aumento ou diminuição de pelo menos cerca de 2 % em uma peculiaridade observada (diferença), pelo menos uma diferença de cerca de 5 %, pelo menos uma diferença de cerca de 10 %, pelo menos uma diferença de cerca de 20 %, pelo menos uma diferença de cerca de 30 %, pelo menos de cerca de 50 %, pelo menos cerca de 70 %, ou pelo menos cerca de 100 %, pelo menos cerca de 300 % ou mesmo uma diferença maior. É fato conhecido que pode haver uma variação natural no traço modificado. Portanto, a modificação observada vincula uma alteração da distribuição normal do traço nas plantas comparada com a distribuição observada em uma planta do tipo selvagem.

POLIPEPTÍDEOS E POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona, entre outras coisas, fatores de transcrição (TFs), e polipeptídeos de fator de transcrição homólogos, e poli30 nucleotídeos isolados ou recombinantes codificando os polipeptídeos. Esses polipeptídeos e polinucleotídeos podem ser empregados para modificar uma biomassa de planta.

Polinucleotídeos exemplificativos codificando os polipeptídeos da invenção foram identificados na Arabidopsis thaliana do banco de dados GenBank utilizando programas e parâmetros de análise de seqüências publicamente disponíveis. As seqüências inicialmente identificadas foram então adicionalmente caracterizadas para identificar seqüências compreendendo cordões especificados de seqüência correspondendo a motivos de seqüência presentes em famílias de fatores de transcrição conhecidos. As seqüências de polinucleotídeo atendendo a tais critérios foram confirmadas como fatores de transcrição.

Polinucleotídeos adicionais da invenção foram identificados por triagem de Arabidopsis thaliana e/ou outras bibliotecas de cDNA de plantas com sondas correspondendo a fatores de transcrição conhecidos sob condições de baixa severidade de hibridização. Seqüências adicionais, incluindo seqüências codificadoras de comprimento integral foram subseqüentemente recuperadas pela rápida amplificação pelo procedimento de extremidades de cDNA (RACE), utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante. Quando necessário, são realizados diversos ciclos de RACE para isolar as extremidades 5' e 3'. O comprimento integral de cDNA foi então recuperado por uma reação da cadeia polimerase (PCR), extremidade a extremidade, de rotina utilizando iniciadores específicos nas extremidades isoladas 5' e 3'. Seqüências exemplificativas estão proporcionadas na Listagem de Seqüências.

Os polinucleotídeos da invenção foram expressos ectopicamente em plantas superexpressas ou de eliminação e foram observadas alterações na biomassa de plantas. Portanto, os polinucleotídeos e polipeptídeos podem ser empregados para melhorar (aumentar ou diminuir) a biomassa de plantas.

Produzindo polinucleotídeos

Os polinucleotídeos da invenção incluem seqüências que codifi30 cam fatores de transcrição e polipeptídeos de fatores de transcrição homólogos e seqüências complementares aos mesmos, assim como fragmentos únicos de seqüência codificadora, ou seqüência complementar à mesma.

I

Tais polinucleotídeos podem ser, por exemplo, DNA ou RNA, mRNA, cRNA, RNA sintético, DNA genômico, cDNA, DNA sintético, oligonucleotídeos, etc. Os polinucleotídeos são tanto de filamento duplo como de filamento simples, e incluem tanto seqüências sentido (isto é, codificadoras) como seqüências anti-sentido (isto é, não-codificadoras, complementares). Os polinucleotídeos incluem a seqüência codificadora de um fator de transcrição, ou polipeptídeo de fator de transcrição homólogo, isoladamente, em combinação com seqüências codificadoras adicionais (por exemplo, uma etiqueta de purificação, um sinal de localização, como uma proteína de fusão, como uma pré10 proteína, ou similar), em combinação com seqüências não-codificadoras (por exemplo, íntrons ou inteins, elementos reguladores tais como promotores, realçadores, terminadores, e similares), e/ou em um vetor ou ambiente hospedeiro em que o polinucleotídeo codificando um fator de transcrição ou polipeptídeo de fator de transcrição homólogo é um gene endógeno ou exóge15 no.

Existe uma variedade de processos para a produção de polinucleotídeos da invenção. Os procèdimentos para identificar e isolar clones de DNA são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, e estão descritos em, por exemplo, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Te20 chniques in Enzymoloqy, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2^a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (Sambrook) e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds,, Current Protocols, uma sociedade mista (joint venture) en25 tre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado através de 2000) (Aüsubel).

Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por uma diversidade de processos de amplificação in vitro adaptados à presente invenção por seleção apropriada de iniciadores específicos ou degenerados. Exemplos de protocolos suficientes para dirigir pessoas versadas através de processos de amplificação in vitro, incluindo a reação da cadeia polimerase (PCR), a reação de ligase em cadeia (LCR), amplifica14

ção Qbeta replicase e outras técnicas mediadas por polimerase de RNA (por exemplo, NASBA), por exemplo, para a produção dos ácidos nucléicos homólogos da invenção são encontrados em Berger, Sambrook, e Ausubel, assim como Mullis et al., (1987) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds.) Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis). Processos melhorados para clonar in vitro ácidos nucléicos amplificados estão descritos em Wallace et al., Patente U.S. N° 5.426.039. Processos melhorados para amplificar ácidos nucléicos grandes por PCR estão sumarizados em Cheng et al., (1994) Nature 369: 684 - 685 e as referências lá citadas, em que são gerados amplicons por PCR, de até 40 kb. Alguém versado perceberá que essencial mente qualquer RNA pode ser convertido em um DNA de filamento duplo adequado para digestão com restrição, expansão por PCR e seqüenciamento utilizando transcriptase reversa e uma polimerase. Ver, por exemplo, Ausubel, Sambrook e Berger, todos supra.

Alternativamente, polinucleotídeos e oligonucleotídeos da invenção podem ser montados a partir de fragmentos produzidos por processos de síntese em fase sólida. Tipicamente, fragmentos de até aproximadamente 100 bases são sintetizados individualmente e então ligados enzimaticamente ou quimicamente para produzir uma seqüência desejada, por exemplo, um polinucleotídeo codificando todo ou parte de um fator de transcrição. Por exemplo, síntese química utilizando o processo da fosforamidita é descrito, por exemplo, por Beaucage et al., (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859 - 69; e Matthes et al (1984) EMBO J. 3: 801 - 5. De acordo com tais processos, oligonucleotídeos são sintetizados, purificados anelados à sua fita complementar, ligados e então opcionalmente clonados em vetores adequados. E, se assim desejado, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser solicitados por encomenda de diversos fornecedores comerciais. SEQÜÊNCIAS HOMÓLOGAS

Seqüências homólogas, isto é, que compartilham significativa identidade ou similaridade de seqüência, àquelas proporcionadas na Listagem de Seqüências, derivadas da Arabidopsis thaliana ou de outras plantas à escolha também são um aspecto da invenção. As seqüências homólogas

podem ser derivadas de qualquer planta incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas e, em particular, espécies de plantas particularmente importantes agricolamente incluindo, mas não limitadas a, culturas tais como soja, trigo, milho, batata, algodão, arroz, semente oleosa de colza (incluindo canola) girassol, alfafa, cana-de-açúcar e grama; ou frutos e vegetais, tais como banana, amora silvestre, mirtilo, morango e amora, cantalupo, cenoura, couveflor, café, pepino, beringela, uvas, espécie de melão (honeydew), alface, manga, melão, cebola, mamão, ervilhas, pimentas, abacaxi, espinafre, abóbora, milho doce, tabaco, tomate, melancia, frutas rosáceas (tais como maçã, pêssego, pêra, cereja e ameixa) e vegetais brassicáceas (tais como brócolis, repolho, couve-flor, couve de Bruxelas e couve-rábano). Outras culturas, frutos e vegetais cujo fenótipo pode ser alterado incluem cevada, centeio, painço, sorgo, groselha, abacate, frutas cítricas tais como laranjas, limões, toranja e tangerinas, alcachofra, cerejas, nozes tais como nogueira e amendoim, chicória, alho-poró, raízes, tais como araruta, beterraba, mandioca, nabo, rabanete, inhame, e batata-doce, e feijões. As seqüências homólogas também podem ser derivadas de espécies de madeira, tais como pinho, álamo e eucaliptos.

Os fatores de transcrição que são homólogos às seqüências listadas compartilham tipicamente pelo menos cerca de 35 % de identidade de seqüência de aminoácidos. Fatores de transcrição mais de perto relacionados podem compartilhar pelo menos cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 % ou cerca de 80 % ou cerca de 90 % ou cerca de 95 % ou cerca de 98 % ou mais de identidade de seqüência com as seqüências listadas. Os fatores que estão mais próximos relacionados às seqüências listadas compartilham, por exemplo, pelo menos cerca de 85 %, cerca de 90 % ou cerca de 95 % ou mais de identidade de seqüência com as seqüências listadas. Ao nível de nucleotídeo, as seqüências compartilham tipicamente pelo menos cerca de 40 % de identidade de seqüência de nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 % ou cerca de 80 % de identidade de seqüência, e mais preferivelmente cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 % ou cerca de 97 % ou

mais de identidade de seqüência a uma ou mais das seqüências listadas. A degeneração do código genético possibilita variações maiores na seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo enquanto que mantendo a seqüência de aminoácidos da proteína codificada. Domínios conservados dentro de uma família de fator de transcrição podem apresentar um grau mais elevado de homologia de seqüência, tal como pelo menos 65 % de identidade de seqüência incluindo substituições conservadoras, e preferivelmente pelo menos 80 % de identidade de seqüência. Domínios conservados exemplificativos da presente invenção incluem, por exemplo, para G1073 (SEQ ID NO: 1 e 2), resíduos aminoácidos 35 até 40 ou 42 até 48 que são conservadas em cada uma das seqüências G2789 (SEQ ID NO: 3 e 4), G1945 (SEQ ID NO: 5 e 6) e G2155 (SEQ ID NO: 7 e 8). Os fatores de transcrição da invenção também podem conter 5, 6, 8, 10 ou 12 aminoácidos consecutivos das seqüências de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 em que aminoácidos consecutivos são tomados de uma região fora do domínio conservado. Os polinucleotídeos tendo pelo menos 90 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 75 %. ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 40 % de identidade de seqüência com aqueles codificando os fatores de transcrição acima também estão incluídos nesta invenção.

Ortologs e Paraloqs

São conhecidos diversos processos diferentes por aqueles versados na técnica para identificar e definir essas seqüências funcionalmente homólogas. Estão descritos três processos gerais para definir paralogs e ortologs; um paralog ou ortolog pode ser identificado por um ou mais processos abaixo descritos.

Ortologs e paralogs são genes evolucionariamente relacionados que têm seqüências similares e funções similares. Paralogs são genes relacionados dentro de uma única espécie e são mais provavelmente um resultado de duplicação de gene, enquanto que ortologs são genes relacionados em diferentes espécies derivados de uma molécula ancestral comum antes da especificação.

Dentro de uma única espécie de planta, a duplicação de gene

··· · ··· · · · pode ocasionar duas cópias de um gene particular, dando lugar a dois ou mais genes com seqüências similares e funções similares conhecidos como paralogs. Um paralog é portanto um gene similar com uma função similar dentro da mesma espécie. Paralogs tipicamente se agregam entre si ou no mesmo clade (um grupo de genes similares), conforme é mostrado quando uma filogenia de família de genes é analisada utilizando programas tal como CLUSTAL (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673 - 4680; Higgins et al., (1996) Methods Enzymol. 266: 383 - 402). Grupos de genes similares também podem ser identificados utilizando análise BLAST em pares (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351 - 360). Por exemplo, um clade de fatores de transcrição de domínio MADS muito similares a partir de Arabidopsis todos compartilham uma função comum em tempo de florescência (Ratcliffe et al., (2001) Plant Physiol. 126: 122 - 132), e um grupo de fatores de transcrição de domínio AP2 muito similares proveniente de Arabi15 dopsis são envolvidos na tolerância de plantas ao congelamento (Gilmour et al., (1998) Plant J. 16: 433 - 442). A análise de grupos de genes similares com função similar que caiam dentro de um clade pode fornecer subseqüências que são particulares ao clade. Essas subseqüências, conhecidas como seqüências de consenso, podem ser utilizadas não somente para defi20 nir as seqüências dentro de cada clade, mas definir funções desses genes, porquanto os genes dentro de cada clade tipicamente compartilham a mesma função. (Ver também, por exemplo, Mount, D. W. (2001) Bioinformatics: Sequence and Genome Analvsis Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, página 543).

Especificação, a produção de novas espécies a partir de espécies originais, também pode dar lugar a dois ou mais genes com seqüência similar e função similar. Esses genes, chamados de ortologs, muitas vezes têm uma função idêntica dentro de suas plantas hospedeiras e são muitas vezes intercambiáveis entre espécies sem perder a função. Pelo fato de plantas terem ancestrais comuns, muitos genes em qualquer espécie de planta têm um gene ortólogo em outra espécie de planta. Uma vez tenha sido construída uma árvore filogênica para uma família de genes de uma • · • · · •·· ··· ··· espécie utilizando um programa tal como CLUSTAL (Thompson et al., (1994)

Nucleic Acids Res. 22: 4673 - 4680; Higgins et al., (1996) Methods Enzymol.

266: 383 - 402), seqüências ortólogas potenciais podem ser colocadas na árvore filogenética e sua relação aos genes da espécie de interesse pode ser determinada. Uma vez tenha sido definido o par ortolog, a função do ortolog de teste pode ser determinada pela determinação da função do ortolog de referência.

Os ortologs também podem ser identificados por análise BLAST em pares por alinhamento de um jogo de seqüências de referência contra um jogo de seqüências de teste. As seqüências de teste com o casamento mais de perto a uma seqüência particular de referência, conforme determinado pelo valor P da análise BLAST, podem ser tomadas e alinhadas individualmente contra o jogo de seqüências de referência. A seqüência individual de teste ou pode casar muito bem com a seqüência particular de referência, caso esse em que é provável que seja um ortolog, ou não, caso esse em que pode não ser um ortolog.

Um caminho adicional de identificação de um ortolog pela identificação de uma seqüência consenso dentro de um ortolog candidato. Utilizando a análise BLAST em pares, ou programas tal como programa de ali20 nhamento CLUSTAL, podem ser identificados jogos de genes similares, ou clades. As subseqüências particulares que definem aspectos comuns dentro de um clade particular podem ser derivados a partir de um alinhamento daquelas seqüências. Os ortologs devem ter a seqüência consenso, ou uma seqüência: similar à seqüência consenso. Os ortologs também podem ter uma seqüência consenso fora de um domínio conservado, o que pode ser particular para aquela família de seqüências ortólogas.

Ortologs correspondentes podem formar ponte na divisão monocotiledônea/dicotiledônea do reino vegetal e pares de genes ortólogos podem ser identificados em arroz e Arabidopsis, milho e Arabidopsis e Anti30 rhinnum e milho. Por exemplo, Peng et al., mostraram que um mutante do gene Arabidopsis chamado Gibberellin Insensitive (GAI; mutante chamado gai) codificou um fator de transcrição o qual conferiu uma redução na capa19

cidade de resposta do gibberellin na planta nativa (Peng et al., 1997 Genes and Development 11: 3194 - 3205). Adicionalmente, Peng et al., mostraram subseqüentemente que a proteína GAI do Arabidopsis possui uma identidade de resíduos aminoácidos de 62 % com a proteína Rht-D1a de trigo e identidade de resíduos aminoácidos de 62 % com o milho d8. Peng et al., mostraram que plantas transgênicas de arroz contendo um alelo GAI mutante dão respostas reduzidas a gibberellin e são nanicas, imitando a variedade de trigo nanico do qual o gene Rht-D1a mutante foi isolado. Peng et al., ensinou que a proteína GAI de Arabidopsis é um ortólogo das proteínas do trigo Rht-D1 a e milho d8. (Peng et al., 1999 Nature 400: 256 - 261.)

Adicionalmente, Fu et al., (2001 Plant Cell 13: 1791 - 1802), Nandi et al., (2000 Curr. Biol. 10: 215 - 218), Coupland (1995 Nature 377: 482 - 483), e Weigel and Nilsson (1995 Nature 377: 482 - 500) mostraram que um fator de transcrição de Arabidopsis expresso em uma espécie exógena de planta elicita a mesma ou resposta fenotípica muito similar. Além do mais, Kater et al., (1998 Plant Cell 10: 171 - 182), Mandei et al., (1992 Cell 71: 133 - 143), Suzuki et al., (2001 Plant J. 28: 409 - 418) mostraram que um fator de transcrição expresso em outra espécie de planta elicita a mesma ou resposta fenotípica muito similar da seqüência endógena, como muitas vezes previsto em estudos iniciais de fatores de transcrição de Arabidopsis em Arabidopsis.

A Tabela 1 (anexa a este pedido) lista um sumário de seqüências ortólogas e homólogas identificadas utilizando BLAST (programa tblastx) e os dados de resultado BLAST padrão gerados por uma pesquisa. A primeira coluna mostra o identificador de seqüência de polinucleotídeo (SEQ ID NO), a segunda coluna mostra o cDNA identificador de fator de transcrição (ID do Gene), a terceira coluna mostra o Número de Acesso ao GenBank (GenBank Accession Number) da seqüência de polinucleotídeo ortólogo ou homólogo identificado na pesquisa BLAST (ID da Seqüência de Teste), a quarta coluna mostra o valor de probabilidade calculado de que a identidade de seqüência é devido ao acaso (Probabilidade da Menor Soma), a quinta coluna identifica a espécie de planta da Seqüência de Teste (Espé20

cie da Seqüência de Teste), e a sexta coluna mostra a anotação do GenBank para a seqüência identificada em uma pesquisa BLAST (Anotação do GenBank da Seqüência de Teste).

A Tabela 2 (anexa a este pedido) lista seqüências ortólogas e 5 homólogas identificadas utilizando BLAST (programa tblastx) e os dados de resultado BLAST padrão gerados por uma pesquisa. A primeira coluna mostra o identificador de seqüência de polinucleotídeo (SEQ ID NO), a segunda coluna mostra o cDNA identificador de fator de transcrição (ID do Gene), a terceira coluna mostra o Número de Acesso ao GenBank (GenBank Acces10 sion Number) do polinucleotídeo ortólogo ou homólogo (ID da Seqüência de Teste), a quarta coluna mostra a anotação do GenBank para a seqüência identificada em uma pesquisa BLAST (Anotação do GenBank da Seqüência de Teste), a quinta coluna mostra o quadro de leitura da seqüência de Teste codificando a seqüência ortóloga ou homóloga (Quadro de Leitura), a sexta coluna mostra o valor calculado de pontuação das seqüências alinhadas (Pontuação Alta), a sétima coluna mostra o valor calculado de probabilidade de que a identidade de seqüência é devida ao acaso (Probabilidade da Menor Soma), e a oitava coluna mostra o número de regiões na Seqüência de Teste que se alinha com uma seqüência da SEQ ID NO: (N).

Identificação de Ácidos Nucléicos por Hibridização

Os polinucleotídeos homólogos às seqüências ilustradas na Listagem de Seqüências podem ser identificados por uma diversidade de vias conhecidas por alguém versado na técnica, por exemplo, por hibridização entre si sob condições severas ou altamente severas. Polinucleotídeos de fita simples hibridizam quando se associam baseados em uma diversidade de forças físico-químicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão de solvente, empilhamento de bases e similares. A severidade de uma hibridização reflete o grau de identidade de seqüência dos ácidos nucléicos envolvidos, de modo que quanto maior a severidade, o mais simi30 lares são as duas fitas de polinucleotídeo. A severidade é influenciada por uma diversidade de fatores, incluindo temperatura, concentração salina e composição, aditivos orgânicos e não-orgânicos, solventes, etc., presentes

« · • € ♦ • · · r '· · · · · • · · · ·· · tanto nas soluções de hibridização e lavagem e incubações (e número), conforme descrito em mais detalhe nas referências acima citadas.

Um exemplo de condições severas de hibridização para a hibridização de ácidos nucléicos complementares que têm mais do que 100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou Northern blot é de cerca de 5 °C a 20 °C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica a uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50 % das seqüências alvo hibridizam a uma sonda perfeitamente emparelhada. As moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condições severas hibridizam tipicamente a uma sonda baseada tanto no cDNA inteiro como em porções selecionadas, por exemplo, a uma subseqüência única, do cDNA sob condições de lavagem de 0,2 x SSC a 2,0 x SSC, 0,1 % SDS a 50 - 65 °C, por exemplo, 0,1 x SSC, 0,1 % SDS a 65 °C. Para a identificação de homólogos menos de perto relacionados, podem ser realizadas lavagens a uma temperatura mais baixa, por exemplo 50 °C. Em geral, a severidade é aumentada em elevando a temperatura de lavagem e/ou diminuindo a concentração de SSC.

Como outro exemplo, podem ser selecionadas condições severas tais de modo que um oligonucleotídeo que é perfeitamente complementar ao oligonucleotídeo codificador hibridize ao oligonucleotídeo codificador com uma proporção de sinal pelo menos 5 a 10 x maior do que ruído do que a proporção para hibridização do oligonucleotídeo perfeitamente complementar a um ácido nucléico codificando um fator de transcrição conhecido como a data de arquivamento da aplicação. Podem ser selecionadas condições tais que seja observada uma proporção sinal para ruído maior na análise particular que está sendo utilizada, por exemplo, cerca de 15 x, 25 x, 35 x, 50 x ou mais. Conseqüentemente, o ácido nucléico objeto hibridiza ao único oligonucleotídeo codificador com pelo menos um sinal 2 x maior para ruído em comparação à hibridização do oligonucleotídeo codificante a um ácido nucléico codificando um polipeptídeo conhecido. Novamente, proporções maiores de sinal para ruído podem ser selecionadas, por exemplo, cerca de 5 x, 10 x, 25 x, 35 x, 50 x ou mais. O sinal particular irá depender do marca22

dor utilizado na análise relevante, por exemplo, um marcador fluorescente, um marcador colorimétrico, um marcador radioativo, ou similares.

Alternativamente, polipeptídeos homólogos de fator de transcrição podem ser obtidos por triagem de uma biblioteca de expressão utilizan5 do anticorpos específicos para um ou mais fatores de transcrição. Com o fator de transcrição revelado e as seqüências homólogas de ácido nucléico de fator de transcrição, o(s) peptídeo(s) codificado(s) pode(m) ser expresso^) e purificado(s) em um sistema de expressão heterólogo (por exemplo, E. coli) e utilizado para gerar anticorpos (monoclonais ou policlonais) especí10 ficos para o(s) polipeptídeo(s) em questão. Os anticorpos também podem ser criados contra peptídeos sintéticos derivados de seqüências de aminoácidos de fator de transcrição, ou homólogo de fator de transcrição. Processos para criar anticorpos são bem-conhecidos na técnica e estão descritos em Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratory, New York. Tais anticorpos podem ser então utilizados para triagem de uma biblioteca de expressão produzida a partir da planta da qual se deseja clonar homólogos adicionais de fator de transcrição, utilizando processos acima descritos. Os cDNAs selecionados podem ser confirmados por seqüenciamento e atividade enzimática.

VARIAÇÕES DE SEQÜÊNCIA

Pode ser facilmente percebido por aqueles versados na técnico, que qualquer um de uma diversidade de seqüências de polinucleotídeos é capaz de codificar os fatores de transcrição e polipeptídeos homólogos de fator de transcrição. Devido à degeneração do código genético, muitos poli25 nucleotídeos diferentes podem codificar polipeptídeos idênticos e/ou substancialmente similares adicionalmente àquelas seqüências ilustradas na Listagem de Seqüências.

Por exemplo, a Tabela 3 ilustra, por exemplo, que os códons AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, e TCT todos codificam o mesmo aminoácido:

serina. Conseqüentemente, em cada posição na seqüência em que exista um códon codificando serina, qualquer uma das seqüências de trinucleotídeos acima pode ser utilizada sem alterar o polipeptídeo codificado.

Tabela 3

Aminoácidos	Códon
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	TGC	TCT
Ácido Aspártico	Asp	D	GAC	GAT
Ácido glutâmico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	TTC	TTT
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGT
Histidina	His	H	CAC	CAT
Isoleucina	lie	I	ATA	ATC	ATT
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	TTA	TTG	CTA	CTC	CTG	CTT
Metionina	Met	M	ATG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAT
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCT
Glutamina	Gin	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGT
Serina	Ser	S	AGC	AGT	TCA	TCC	TCG	TCT
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACT
Valina	Vai	V	GTA	GTC	GTC	GTT
Triptofano	Trp	w	TGG
Tirosina	Tyr	Y	TAC	TAT

As altrerações de seqüYência que não mudam a seqüência de aminoácidos codificada pelo polinucleotídeo são chamadas de variações silenciosas. Com a exceção dos códons ATG e TGG, codificando metioni5 na e triptofano, respectivamente, qualquer um dos códons possíveis para o mesmo aminoácido pode ser substituído por uma diversidade de técnicas, por exemplo, mutagênese sítio dirigida, disponível na técnica. Conseqüentemente, qualquer uma e todas tais variações de uma seqüência selecionada da tabela acima são uma característica da invenção.

Adicionalmente às variações silenciosas, outras variações conservadoras que alteram um, ou uns poucos aminoácidos no polipeptídeo codificado, podem ser realizadas sém alterar a função do polipeptídeo, es24

sas variantes conservadoras são, do mesmo modo, uma característica da invenção.

Por exemplo, substituições, deleções e inserções introduzidas nas seqüências proporcionadas na Listagem de Seqüências também são consideradas pela invenção. Tais modificações de seqüências podem ser engenheiradas em uma seqüência por uma mutagênese sítio dirigida (Wu (ed.) Meth. Enzvmol. (1993) vol. 217, Academic Press) ou pelos outros processos observados abaixo. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos simples; as inserções usualmente são da ordem de cerca de 1 a

10 resíduos aminoácidos; e as deleções variam desde cerca de 1 a 30 resíduos. Em concretizações preferidas, as deleções ou as inserções são feitas em pares adjacentes, por exemplo, uma deleção de dois resíduos ou inserção de dois resíduos. Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas para chegar a uma seqüência.

As mutações que são feitas no polinucleotídeo codificando o fator de transcrição não colocam a seqüência fora do quadro de leitura e não devem criar regiões complementares que poderíam produzir estrutura secundária de mRNA. Preferivelmente, o polipeptídeo codificado pelo DNA desempenha a função desejada.

Substituições conservadoras são aquelas em que pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácidos tenha sido removido e um resíduo diferente colocado no lugar. Tais substituições, de um modo geral, são feitas de acordo com a Tabela 4 quando for desejado manter a atividade da proteína. A Tabela 4 mostra aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido em uma proteína e que são tipicamente vistos como substituições conservadoras.

Tabela 4

Resíduo	Substituições Conservadoras
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin; His
Asp	Glu

Tabela 4 (Continuação)

Resíduo	Substituições Conservadoras j
Gin	Asn
Cys	Ser i
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn; Gin
lie	Leu; Vai
Leu	lie; Vai
Lys	Arg; Gin
Met	Leu; lie
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr; Gly
Thr	Ser; Vai
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Vai	lie; Leu

Substituições que são menos conservadoras do que aquelas na Tabela 4 podem ser selecionadas tomando resíduos que diferem mais significativamente em seu efeito na manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de placa ou hélice, (b) a carga ou a hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. As substituições que em geral se espera que produzam as maiores alterações nas propriedades da proteína são aquelas em que (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seriia ou treonila, é substituído por ou substitui um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; (b) uma cisteína ou prolina é substituída por ou substitui qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histidila, é substituído por ou substitui um resíduo eletronegativo, por exemplo, gluta15 mila ou aspartila; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por ou substitui um não tendo cadeia

lateral, por exemplo, glicina.

SEQÜÊNCIAS MODIFICADORAS ADICIONAIS DA INVENÇÃO - MUTAÇÃO/EVOLUÇÃO FORÇADA

Adicionalmente a gerar substituições silenciosas ou conservadoras conforme notado acima, a presente invenção inclui opcionalmente processos para modificar as seqüências da Listagem de Seqüências. Nos processos, são utilizados processos de modificação de ácido nucléico ou proteína para alterar as seqüências dadas para produzir seqüências novas e/ou para modificar quimicamente ou enzimaticamente seqüências dadas para mudar as propriedades dos ácidos nucléicos e proteínas.

Assim, em uma concretização, dadas seqüências de ácidos nucléicos são modificadas, por exemplo, de acordo com processos de mutagênese padrão ou evolução artificial para produzir seqüências modificadas. Por exemplo, Ausubel, supra, proporciona detalhes adicionais sobre processos de mutagênese. Processos de evolução artificial forçada estão descritos, por exemplo, por Stemmer (1994) Nature 370: 389 a 391, e Stemmer (1994) Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 10747 a 10751. Muitos outros processos de evolução e mutação também estão disponíveis e presumidos como fazendo parte do conhecimento do praticante.

Similarmente, alteração química ou enzimática de ácidos nucléicos e polipeptídeos expressos pode ser realizada por processos padrão. Por exemplo, a seqüência pode ser modificada por adição de lipídeos, açúcares, peptídeos, compostos orgânicos ou inorgânicos, pela inclusão de nucleotídeos ou aminoácidos modificados, ou similares. Por exemplo, técnicas de modificação de proteína estão ilustradas em Ausubel, supra. Detalhes adicionais sobre modificações químicas e enzimáticas podem ser aqui encontrados. Esses processos de modificações podem ser utilizados para modificar qualquer seqüência, ou para modificar qualquer seqüência produzida pelos diversos processos de modificação por mutação e evolução artificial aqui notados.

Conseqüentemente, a invenção proporciona a modificação de qualquer ácido nucléico dado por mutação, evolução, modificação química

ou enzimática, ou outros processos disponíveis, assim como para produtos produzidos pela prática de tais processos, por exemplo, utilizando as seqüências daqui como substrato de partida para as diversas abordagens de modificação.

Por exemplo, podem ser utilizadas seqüências otimizadas codificadoras contendo códons preferidos por um hospedeiro particular procariótico ou eucariótico, por exemplo, para aumentar a taxa de translação ou para produzir transcritos de RNA recombinante tendo propriedades desejáveis, tais como uma meia-vida mais longa, em comparação com transcritos pro10 duzidos utilizando uma seqüência não-otimizada. Códons de interrupção de translação também podem ser modificados para refletir preferência de hospedeiro. Por exemplo, códons preferidos de interrupção para S. cerevisiae e mamíferos são TAA e TGA, respectivamente. O códon preferido de interrupção para plantas monocotiledôneas é TGA, enquanto que insetos e E. coli preferem utilizar TAA como o códon de interrupção.

As seqüências de polinucleotídeo da presente invenção também podem ser engenheiradas com a finalidade de alterar uma seqüência codificadora por uma diversidade de razões, incluindo mas não limitados a, alterações que modificam a seqüência para facilitar clonagem, processamento e/ou expressão do produto de gene. Por exemplo, alterações são introduzidas opcionalmente utilizando técnicas que são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, mutagênese sítio dirigida, para inserir novos sítios de restrição, para alterar configurações de glicosilação, para mudar preferência por códon, para introduzir sítios de ligação, etc.

Adicionalmente, um fragmento ou domínio derivado de qualquer um dos polipeptídeos da invenção pode ser combinado com domínios derivados de outros fatores de transcrição ou domínios sintéticos para modificar a atividade biológica de um fator de transcrição. Por exemplo, um domínio de ligação de DNA derivado de um fator de transcrição da invenção pode ser combinado com o domínio de ativação de outro fator de transcrição ou com um domínio sintético de ativação. Um domínio de ativação de transcrição auxilia a iniciação da transcrição de um sítio de ligação de DNA. Exemplos

incluem a região de ativação de transcrição de VP16 ou GAL4 (Moore et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 376 a 381; e Aoyama et al., (1995) Plant Cell 7: 1773 a 1785), peptídeos derivados de seqüências bacterianas (Ma and Ptashne (1987) Cell 51: 113 a 119) e peptídeos sintéticos (Giniger and Ptashne, (1987)) Nature 330: 670 a 672).

EXPRESSÃO E MODIFICAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS

Tipicamente, as seqüências de polinucleotídeo da invenção são incorporadas em moléculas de DNA recombinante (ou RNA) que direcionam a expressão de polipeptídeos da invenção em células hospedeiras apropriadas, plantas transgênicas, sistemas de translação in vitro, ou similares. Devido à degeneração inerente do código genético, seqüências de ácidos nucléicos que codificam substancíalmente a mesma ou uma seqüência de aminoácido funcionalmente equivalente podem ser substituídas por qualquer uma seqüência listada para proporcionar a clonagem e a expressão do homólogo relevante.

Vetores, Promotores e Sistemas de Expressão

A presente invenção inclui constructos recombinantes compreendendo uma ou mais das seqüências de ácido nucléico daqui. Os constructos compreendem tipicamente um vetor, tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus (por exemplo, um vírus de planta), um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), ou similares, dentro do qual uma seqüência de ácido nucléico da invenção foi inserida, em uma orientação para adiante ou inversa. Sob um aspecto preferido desta concretização, o constructo compreende adicionalmente seqüências de regulação, incluindo, por exemplo, um promotor, operavelmente ligado à seqüência. É conhecido grande número de vetores e promotores adequados por aqueles com conhecimento na técnica, e os mesmos são comercialmente disponíveis.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares úteis nisto, incluindo a utilização e produção de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes, incluem Berger, Sambrook e Ausubel, supra.

Qualquer uma das seqüências identificadas pode ser incorporada em um

cassete ou vetor, por exemplo, para expressão em plantas. Diversos vetores de expressão adequados para transformação estável de células de planta ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos incluindo aqueles descritos em Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant

Molecular Biology, Academic Press, e Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers. Exemplos específicos incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, assim como aqueles descritos por Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl. Acid Res. 12:8711 a 8721, Klee (1985) Bio/Technoloqy

3: 637 a 642, para plantas dicotiledôneas.

Altemativamente, podem ser utilizados vetores não-Ti para transferir o DNA para plantas monocotiledôneas e células pela utilização de técnicas de entrega de DNA livre. Tais processos podem envolver, por exemplo, a utilização de lipossomas, eletroporação, bombardeio com micro15 projeteis, cristais capilares (whiskers) de carbureto de silício, e vírus. Pela utilização desses processos, podem ser produzidas plantas transgênicas, tais como trigo, arroz (Christou (1991) Bio/Technoloqy 9: 957 a 962) e milho (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603 a 618). Um embrião imaturo também pode ser um bom tecido alvo para monocotiledôneas para técnicas de entrega direta de DNA pela utilização da pistola de partículas (Weeks et al., (1993) Plant Physiol 102: 1077 a 1084; Vasil (1993) Bio/Technology 10: 667 a 674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37 a 48, e para transferência de DNA mediada por Agrobacterium (Ishida et al., (1996) Nature Biotech. 14: 745 a 750).

Tipicamente, vetores de transformação de plantas incluem uma ou mais seqüências clonadas codificadoras de planta (genômico ou cDNA) sob o controle transcricional de seqüências reguladoras 5' e 3' e um marcador dominante selecionável. Tais vetores de transformação de planta também contêm tipicamente um promotor (por exemplo, uma região reguladora controlando expressão induzível ou constitutiva, ambientalmente ou desenvolvimentalmente regulada, ou célula ou tecido específica), um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (tal como

sítios de ligação de íntron), um sítio de terminação de transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.

Exemplos de promotores constitutivos de plantas que podem ser úteis para expressar a seqüência TF incluem: o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 355, que confere expressão constitutiva de alto nível na maior parte de tecidos de plantas (ver, por exemplo, Odel et al., (1985) Nature 313: 810); o promotor de nopalina sintase (An et al., (1988) Plant Physiol. 88: 547); e o promotor octopina sintase (Fromm et al., (1989) Plant Cell 1: 977).

Pode ser utilizada uma diversidade de promotores de genes de plantas que regulam a expressão de gene em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos, desenvolvimentais e, de uma maneira tecido específica ou preferencial, podem ser utilizados para expressão de uma seqüência TF em plantas. A escolha de um promotor é em grande parte, baseada no fenótipo de interesse e é determinada por fatores tais como tecido (por exemplo, semente, fruto, raiz, pólen, tecido vascular, flor, carpelo, etc.), induzibilidade (por exemplo, em resposta a ferimento, calor, frio, seca, luz, patógenos, etc.), período, estágio de desenvolvimento, e similares. Numerosos promotores conhecidos foram caracterizados e podem ser favoravelmente empregados para promover a expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma planta ou célula transgênica de interesse. Por exemplo, promotores específicos de tecido incluem: promotores específicos de semente (tais como o promotor napin, faseolin ou DC3 descritos na Patente norte-americana No. 5.773.697), promotores específicos de fruto que são ativos durante o amadurecimento de frutos (tais como o promotor dru 1 (Patente norte-americana No. 5.783.393), ou o promotor 2A11 (Patente norteamericana No. 4.943.674) e o promotor poligalacturonase de tomate (Bird et al., (1988) Plant Mol. Biol. 11: 651), promotores específicos de raiz, tais como aqueles descritos nas Patentes norte-americanas Nos. 5.618.988, 5.837.848 e 5.905.186, promotores pólen ativos tais como PTA29, PTA26 e PTA13 (Patente norte-americana No. 5.792.929), promotores ativos em tecido vascular (Ftingli and Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37: 977 e 988), especí• · · · · ·

fico de flor (Kaiser et al., (1995) Plant Mol. Biol. 28: 231 a 243), pólen (Baerson et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947 a 1959), carpelos (Ohl et al., (1990) Plant cell 2: 837 a 848), pólen e óvulos (Baerson et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255 a 267), promotores auxin induzíveis (tais como aquele descrito em van der Kop et al., (1999) Plant Mol, Biol. 39: 979 a 990 ou Baumann et al., (1999) Plant Cell 11: 323 a 334), promotor citocinina induzível (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743 a 753), promotores sensíveis à giberelina (Shi et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053 a 1060, Willmott et al., (1998) 38: 817 a 825) e similares. Promotores adicionais são aqueles que elicitam expressão em resposta ao calor (Ainley et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22: 13 a 23), luz (por exemplo, o promotor rbcS-3A de ervilha, Kuhlmeier et al., (1989) Plant Cell 1: 471, e o promotor rbcS de milho, Schaffner and Sheen (1991) Plant Cell 3: 997); ferimento (por exemplo, wunl, Siebertz et al., (1989) Plant Cell 1: 961); patógenos (tais como o promotor

PR-1 descrito em Buchel et al., (1999) Plant Mol, Biol. 40: 387 a 396, e o promotor PDF1.2 descrito em Manners et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071 - 80), e compostos químicos, tais como jasmoniato de metila ou ácido salicílico (Gatz et al., (1997) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89 à 108). Adicionalmente, o período da expressão pode ser controlado pela utili20 zação de promotores, tais como aqueles atuando na senescência (Gan and Amasino (1995) Science 270: 1986 a 1988); ou desenvolvimento tardio de sementes (Odell et al., (1994) Plant Physiol. 106: 447 a 458).

Vetores de expressão de plantas também podem incluir sinais de processamento de RNA que podem estar posicionados dentro, na direção oposta (upstream) ou na mesma direção (down-stream) da seqüência codificadora. Adicionalmente, os vetores de expressão podem incluir seqüências reguladoras adicionais da região não traduzida 3' de genes de plantas, por exemplo, uma região terminadora 3' para aumentar a estabilidade de mRNA do mRNA, tal como a região teminadora Pl-ll da batata ou as regiões temi30 nadoras 3' octopina ou nopalina sintase.

Elementos Adicionais de Expressão

Sinais específicos de iniciação podem auxiliar na tradução efici32

ente de seqüências codificadoras. Esses sinais podem incluir, por exemplo, o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Em casos em que uma seqüência codificadora, seu códon de iniciação e seqüências na direção oposta são inseridas no vetor de expressão apropriado, podem não ser ne5 cessários sinais adicionais de controle de tradução. Entretanto, em casos em que somente é inserida uma seqüência codificadora (por exemplo, uma seqüência codificadora de proteína madura), ou uma porção da mesma, podem ser proporcionados separadamente sinais de controle transcricional exógenos incluindo o códon de iniciação ATG. O códon de iniciação é pro10 porcionado no quadro correto de leitura para facilitar a transcrição. Elementos transcricionais exógenos e códons de iniciação podem ser de diversas origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência de expressão pode ser realçada pela inclusão de realçadores apropriados ao sistema celular em uso.

Hospedeiros de Expressão

A presente invenção também refere-se a células hospedeiras que são transduzidas com vetores da invenção, e a produção de polipeptídeos da invenção (incluindo fragmentos dos mesmos) por técnicas recombinantes. As células hospedeiras são geneticamente engenheiradas (isto é, são introduzidos ácidos nuciéicos, por exemplo, transduzidos, transformados ou transfectados) com os vetores desta invenção, que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão compreendendo os ácidos nuciéicos relevantes daqui. O vetor é opcionalmente um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, ácidos nuciéicos nus, etc. As células hos25 pedeiras engenheiradas podem ser cultivadas em um meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para a ativação de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação do gene relevante. As condições de cultivo, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas antériormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evi30 dente para aqueles versados na técnica e nas referências aqui citadas, incluindo Sambrook e Ausubel.

A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, tal como

uma célula de levedura, ou uma célula de planta, ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. Protoplastos de planta também são úteis para algumas aplicações. Por exemplo, os fragmentos de DNA são introduzidos nos tecidos de plantas, células de planta cultivadas ou protoplastos de plantas, por processos padrão incluindo eletroporação (Fromm et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5824, infecção por vetores virais, tais como o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Hohn et al., (1982) Molecular Bioloqy of Plant Tumors. (Academic Press, New York) pp. 549 a 560; U.S. 4.407.956), penetração balística de alta velocidade por pequenas partículas com o ácido nucléico tanto dentro da matriz de pequenas contas ou partículas, como na superfície (Klein et al., (1987) Nature 327: 70 a 73), utilização de pólen como vetor (WO 85/01856), ou utilização de Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes carregando um plasmídeo T-DNA em que são clonados fragmentos de DNA. O plasmídeo T15 DNA é transmitido a células de planta pela infecção por Agrobacteium tumefaciens, e uma porção é estavelmente integrada no genoma da planta (Horsch et al., (1984) Science 233: 496 a 498; Fraley et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803).

A célula pode incluir um ácido nucléico da invenção que codifica um polipeptídeo, em que as células expressam um polipeptídeo da invenção. A célula também pode incluir seqüências de vetores, ou similares. Além do mais, células e plantas transgênicas que incluem qualquer polipeptídeo ou ácido nucléico acima ou ao longo desta descrição, por exemplo, produzida por transdução de um vetor da invenção, são uma característica adicional da invenção.

Para a produção de proteínas recombinantes em longo prazo com elevada produção, pode ser utilizada expressão estável. Células hospedeiras transformadas com uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção são opcionalmente cultivadas sob condições ade30 quadas para expressão e recuperação da proteína codificada a partir da cultura de células. A proteína ou fragmento da mesma produzida por uma célula recombinante pode ser secretada, ligada por membrana, ou contida

intracelularmente, dependendo da seqüência e/ou do vetor utilizado. Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, vetores de expressão contendo polinucleotídeos codificando proteínas maduras da invenção podem ser projetados com seqüências de sinal que direcionam a secreção de polipeptídeos maduros através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica.

IDENTIFICAÇÃO DE FATORES ADICIONAIS

Um fator de transcrição proporcionado pela presente invenção também pode ser utilizado para identificar moléculas endógenas e exógenas adicionais que podem afetar um fenótipo ou traço de interesse. Por um lado, tais moléculas incluem compostos orgânicos (moléculas pequenas ou grandes) e/ou inorgânicos que afetam a expressão de (isto é, regulam) um fator de transcrição particular. Altemativamente, tais moléculas incluem moléculas endógenas que são atuadas em um nível transcricional por um fator de transcrição da invenção para modificar um fenótipo, como desejado. Por exemplo, os fatores de transcrição podem ser empregados para identificar um ou mais genes na mesma direção com o qual está sujeito a um efeito regulador do fator de transcrição. Em uma abordagem, um fator de transcrição ou homólogo de fator de transcrição da invenção é expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula, tecido ou explante de planta transgênica, e produtos de expressão, tanto RNA como proteína, de alvos prováveis ou randômicos são monitorados, por exemplo, por hibridização a uma microrrede de sondas de ácidos nucléicos correspondentes a genes expressos em um tipo de tecido ou célula de interesse, por eletroforese em gel de duas dimensões de produtos de proteína, ou por qualquer outro processo conhecido na arte para avaliar a expressão de produto de genes no nível de RNA ou de proteína. Altemativamente, um fator de transcrição da invenção pode ser utilizado para identificar seqüências de promotor (isto é, sítios de ligação) envolvidos na regulação de um alvo na mesma direção. Após identificar uma seqüência de promotor, as interações entre o fator de transcrição e a seqüência do promotor podem ser modificadas mudando nucleotídeos específicos na seqüência do promotor ou aminoácidos específi35 • · . · «»······«. \/\0/ ·*·<»·· · · · • · · ·

cos no fator de transcrição que interagem com a seqüência do promotor para alterar um traço da planta. Tipicamente, sítios de ligação de DNA de fator de transcrição são identificados por análises de deslocamento de gel. Após identificar as regiões do promotor, as seqüências de regiões de promotor podem ser empregadas em redes de DNA de filamento duplo para identificar moléculas que afetam as interações dos fatores de transcrição com seus promotores (Bulyk et al., (1999) Nature Biotechnoloqy 17: 573 a 577).

Os fatores de transcrição identificados também são úteis para identificar proteínas que modificam a atividade do fator de transcrição. Tal modificação pode ocorrer por modificação covalente, tal como por fosforilação, ou por interações proteína-proteína (homo ou heteropolímero). Pode ser empregado qualquer processo adequado para detecção de interações proteína-proteína. Entre os processos que podem ser empregados estão coimunoprecipitação, reticulação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas, e o sistema de dois híbridos de levedura.

O sistema de dois híbridos de levedura detecta interações de proteína in vivo e está descrito em Chien et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 9578 a 9582 e é comercialmente disponível da Clontech (Paio Alto, Calif.). Em um tal sistema, são construídos plasmídeos que codificam duas proteínas híbridas: uma consiste do domínio de ligação de DNA de uma proteína ativadora de transcrição fundida ao polipeptídeo TF e o outro consiste no domínio de ativação da proteína ativadora de transcrição fundida a uma proteína desconhecida que é codificada por um cDNA que foi recombinado em um plasmídeo como parte de uma biblioteca de cDNA. O plasmídeo de fusão de domínio de ligação de DNA e a biblioteca de cDNA são transformados em uma cepa da levedura Saccharomyces cerevisiae que contém um gene repórter (por exemplo, lacZ) cuja região reguladora contém o sítio de ligação do ativador de transcrição. Qualquer proteína híbrido da pode não ativar isoladamente a transcrição do gene repórter. A interação das duas proteínas híbridas reconstitui a proteína ativadora funcional e resulta na expressão do gene repórter, que é detectado por uma análise para o gene repórter produto. Então, os plasmídeos da biblioteca responsáveis

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por expressão de gene repórter são isolados e seqüenciados para identificar as proteínas codificadas pelos plasmídeos da biblioteca. Após identificar as proteínas que interagem com os fatores de transcrição, podem ser realizadas análises para compostos que interferem com as interações TF proteínaproteína.

IDENTIFICAÇÃO DE MODULADORES

Adieionalmente às moléculas intracelulares acima descritas, podem ser identificadas moléculas extracelulares que alteram a atividade ou expressão de um fator de transcrição, tanto diretamente como indiretamente. Por exemplo, os processos podem exigir, primeiro, colocar uma molécula candidata em contato com uma planta ou célula de planta. A molécula pode ser introduzida por administração tópica, tal como borrifamento ou embebimento de uma planta, e então é monitorado o efeito da molécula sobre a expressão ou atividade do polipeptídeo TF ou a expressão do polinucleotídeo. Alterações na exposição do polipeptídeo TF podem ser monitoradas por utilização de anticorpos policlonais ou monoclonais, eletroforese em gel ou similares. Alterações na expressão da seqüência de polinucleotídeo correspondente podem se detectadas pela utilização de microrredes, Northerns, PCR quantitativo, ou outras técnicas para monitorar alterações na expressão de mRNA. Essas técnicas são exemplificadas em Ausubel et al., (eds) Current Protocols in Molecular Bioloqv, John Wiley & Sons (1998). Tais alterações nos níveis.de expressão podem ser correlacionadas com traços modificados de planta e as moléculas assim identificadas podem ser úteis para embebimento ou borrifamento de frutos, vegetais e culturas de grãos para modificar traços em plantas.

Essencialmente, qualquer composição disponível pode ser testada quanto à atividade modulatória de expressão ou atividade de qualquer ácido nucléico ou polipeptídeo daqui. Assim, bibliotecas disponíveis de compostos tais como compostos químicos, polipeptídeos, ácidos nucléicos e similares podem ser testados quanto à atividade modulatória. Muitas vezes, compostos moduladores em potencial podem ser dissolvidos em soluções aquosas ou orgânicas (por exemplo, com base em DMSO) para a fácil en37

trega a células ou plantas de interesse em que a atividade do modulador é para ser testada. Opcionalmente, as análises são projetadas para triagem de grandes bibliotecas de composições de moduladores pela automação das etapas de análise e proporcionando compostos provenientes de qualquer fonte para análises, que são tipicamente realizadas em paralelo (por exemplo, em formatos de microtitulação ou em placas de microtitulação, em análises robóticas).

Em uma concretização, métodos de triagem de alto desempenho envolvem proporcionar uma biblioteca combinatorial contendo um grande número de compostos em potencial (compostos moduladores em potencial). Tais bibliotecas químicas combinatórias são, então, submetidas à triagem em uma ou mais análises, conforme aqui descrito, para identificar aqueles membros da biblioteca (espécies ou subclasses químicas particulares) que apresentam uma atividade característica desejada. Os compostos assim identificados podem servir como compostos alvo.

Uma biblioteca química combinatorial pode ser, por exemplo, uma coleção de compostos químicos diversos gerados por síntese química ou síntese biológica. Por exemplo, uma biblioteca química combinatorial, tál como uma biblioteca de polipeptideo é formada pela combinação de um jogo de blocos de construção química (por exemplo, em um exemplo, aminoácidos) em cada modo possível para um dado comprimento de composto (isto é, o número de aminoácidos em um composto polipeptideo de um dado comprimento). Bibliotecas exemplificativas incluem bibliotecas de peptídeos, bibliotecas de ácidos nucléicos, bibliotecas de anticorpos (ver, por exemplo, Vaughn et al., (1996) Nature Biotechnoloqy. 14(3): 309 a 314 e PCT/US 96/10287), bibliotecas de carboidratos (ver, por exemplo, Liang et al., Sciençe (1996) 274: 1520 a 1522 e Patente norte-americana No. 5.593.853), bibliotecas de ácidos nucléicos de peptídeos (ver, por exemplo, Patente norteamericana No. 5.539.083), e bibliotecas de pequenas moléculas orgânicas (ver, por exemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN Jan 18, página 33 (1993); isoprenóides, Patente norte-americana No. 5.569.588; tiazolidinonas e metatiazanonas, Patente norte-americana No. 5.549.974; pirrolidinas, Patentes

norte-americanas Nos. 5.525.735 e 5.519.134; compostos morfolino, Patente norte-americana No. 5.506.337) e similares.

A preparação e triagem de bibliotecas combinatoriais ou outras são bem-conhecida por aqueles versados na técnica. Tais bibliotecas quími5 cas combinatoriais incluem, mas não são limitadas a, bibliotecas de peptídeos (ver, por exemplo, Patente norte-americana No. 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487 a 493 (1991) e Houghton et al., Nature 354: 84 a 88 (1991)). Também podem ser utilizadas outras químicas para a geração de bibliotecas de diversidades químicas.

Adicionalmente, conforme observado, geralmente encontra-se disponível equipamento para a triagem de compostos para a triagem de alto desempenho, por exemplo, utilizando qualquer um de diversos sistemas robóticos bem-conhecidos que também foram desenvolvidos para químicas em fase de solução, úteis em sistemas de análises. Esses sistemas incluem estações de trabalho automatizadas incluindo um aparelho automatizado de síntese e sistemas robóticos utilizando braços robóticos. Qualquer um dos recursos acima é adequado para utilização com a presente invenção, por exemplo, para a triagem de alto desempenho de moduladores em potencial. A natureza e implementação de modificações a esses recursos (se houver) de modo que possam operar conforme aqui discutido, será evidente para pessoas versadas na técnica relevante.

De fato, sistemas integrados de triagem de alto desempenho estão comercialmente disponíveis. Esses sistemas automatizam tipicamente procedimentos integrados incluindo todas as pipetações de amostras e rea25 gentes, dispensação de líquidos, incubações por tempos controlados, e leituras finais da microplacas em detector(es) apropriado(s) para a análise. Esses sistemas configuráveis proporcionam alto desempenho e rápida partida assim como alto grau de flexibilidade e particularização. Similarmente, também encontram-se comercialmente disponíveis implementações microfluídi30 cas de triagem.

Os fabricantes de tais sistemas proporcionam protocolos detalhados para os diversos altos desempenhos. Assim, por exemplo, a Zymark

Corp. proporciona boletins técnicos descrevendo sistemas de triagem para detectar a modulação de transcrição de gene, ligação de ligando, e similares. Os sistemas integrados daqui, adicionalmente a proporcionar o alinhamento de seqüências e, opcionalmente, a síntese de ácidos nucléicos relevantes, podem incluir em tal triagem, aparelho para identificar moduladores que têm um efeito sobre um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos de acordo com a presente invenção.

Em algumas análises é desejável ter controles positivos para assegurar que os componentes da análise estejam operando adequadamente. Pelo menos dois tipos de controles positivos são apropriados. Isto é, ativadores ou inibidores transcricionais podem ser incubados com células/plantas/etc. em uma amostra da análise, e o resultante aumento/diminuição na transcrição pode ser detectado por determinação do aumento resultante na expressão de RNA/proteína, etc., de acordo com os processos daqui. Pode ser percebido que moduladores também podem ser combinados com ativadores ou inibidores transcricionais para encontrar moduladores que inibam a ativação transcricional ou repressão transcricional. Qualquer expressão dos ácidos nucléicos e proteínas daqui ou quaisquer ácidos nucléicos ou proteínas adicionais ativados pelos ácidos nucléicos ou proteínas daqui, ou ambos, podem ser monitorados.

Em uma concretização, a invenção proporciona um processo para identificar composições que modulam a atividade ou expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção. Por exemplo, um composto de teste, tanto uma molécula pequena ou grande, é colocado em contato com uma célula, planta (ou tecido de planta ou explante), ou composição compreendendo o polinucleotídeo ou polipeptídeo de interesse e um efeito resultante sobre a célula, planta (ou tecido ou explante) ou composição é avaliado por monitoramento, tanto direta como indiretamente, de um ou mais de: nível de expressão do polinucleotídeo ou polipeptídeo, atividade (ou modulação da atividade) do polinucleotídeo ou polipeptídeo. Em alguns casos, pode ser detectada uma alteração em um fenótipo de planta em seguida ao contato de uma planta (ou célula de planta, ou tecido ou explante) com o modu-

• · • · lador putativo, por exemplo, por modulação da expressão ou atividade de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção.

SUBSEQÜÉNCIAS

Também são contempladas as utilizações de polinucleotídeos, 5 também aqui referidos como oligonucleotídeos, tendo tipicamente pelo menos 12 bases, preferivelmente pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 20, 30, ou 50 bases, que hibridizam sob condições pelo menos altamente severas (ou condições ultra-severas ou ultra-ultra-severas) a uma seqüência de polinucleotídeo acima descrita. Os polinucleotídeos podem ser utilizados como sondas, iniciadores, agentes de sentido e anti-sentido, e similares, de acordo com os processos observados supra.

Subseqüências dos polinucleotídeos da invenção, incluindo fragmentos de polinucleotídeo, e oligonucleotídeos são úteis como sondas e iniciadores de ácido nucléico. Um oligonucleotídeo adequado para utilização como sonda ou iniciador é de pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento, mais freqüentemente de pelo menos 18 nucleotídeos, freqüentemente pelo menos cerca de 21 nucleotídeos, freqüentemente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, ou cerca de 40 nucleotídeos, ou mais de comprimento. Uma sonda de ácido nucléico é útil em protocolos de hibridização, por exemplo, para identificar homólogos adicionais de polipeptídeos da invenção, incluindo protocolos para experimentos em microrredes. Iniciadores podem ser anelados a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento alvo de DNA, e então estendido ao longo do filamento alvo de DNA por uma enzima de

DNA polimerase. Pares de iniciadores podem ser utilizados para amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros processos de amplificação de ácido nucléico. Ver Sambrook e Ausubel, supra.

Adicionalmente, a invenção inclui um polipeptídeo isolado ou re30 combinante incluindo uma subseqüência de pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos codificados pelos polinucleotídeos recombinantes ou isolados da invenção. Por exemplo, tais polipeptídeos, ou domínios ou fragmen41

• · · ··· ··· tos dos mesmos, podem ser utilizados como imunógenos, por exemplo, para produzir anticorpos específicos para a seqüência do polipeptídeo, ou como sondas para detectar uma seqüência de interesse. Uma subseqüência pode variar em tamanho desde cerca de 15 aminoácidos de comprimento até e incluindo o comprimento integral do polipeptídeo.

PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS

Modificação de Traços

Os polinucleotídeos da invenção são empregados favoravelmente para produzir plantas transgênicas com diversos traços, ou caracte10 rísticas, que tenham sido modificadas de uma maneira desejada, por exemplo, para melhorar a biomassa de plantas. Por exemplo, a alteração dos níveis de expressão ou configurações (por exemplo, configurações de expressão espacial ou temporal) de um ou mais fatores de transcrição (ou homólogos de fator de transcrição) da invenção, em comparação com os níveis da mesma proteína encontrada em uma planta tipo selvagem, pode ser utilizada para modificar um traço de planta. Um exemplo ilustrativo de modificação de traço, biomassa melhorada de planta, pela alteração de níveis de expressão de um fator de transcrição particular é descrito adicionalmente nos Exemplos e na Listagem de Seqüências.

Abordagens Anti-sentido e Co-supressão

Adicionalmente à expressão dos ácidos nucléicos da invenção como reposição de genes ou ácidos nucléicos de modificação de fenótipo de plantas, os ácidos nucléicos também são úteis para supressão sentido e anti-sentido de expressão, por exemplo, para infra-regular a expressão de um ácido nucléico da invenção, por exemplo, como um mecanismo adicional para modular fenótipo de planta. Isto é, os ácidos nucléicos da invenção, ou subseqüências ou seqüências anti-sentido dos mesmos, podem ser utilizados para a expressão em bloco de ácidos nucléicos homólogos de ocorrência natural. Diversas tecnologias de sentido e anti-sentido são conhecidas na técnica, por exemplo, conforme apresentado em Lichtenstein and Nellen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University, Oxford, England. Em geral, seqüências de sentido e anti-sentido são introduzidas em uma célula, onde as mesmas são opcionalmente amplificadas, por exemplo, por transcrição. Tais seqüências incluem tanto seqüências simples de oligonucleotídeos como seqüências catalíticas, tais como ribozimas.

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Por exemplo, uma redução ou eliminação da expressão (isto é, um knock-out, de um fator de transcrição ou de um polipeptídeo homólogo de fator de transcrição em uma planta transgênica, por exemplo, para modificar uma traço da planta, pode ser obtida pela introdução de uma construção anti-sentido correspondente ao polipeptídeo de interesse como um cDNA. Para supressão anti-sentido, o fator de transcrição ou cDNA homólogo é disposto em orientação inversa (em relação à seqüência de codificação) em relação à seqüência do promotor no vetor de expressão. A seqüência introduzida não precisa ter o comprimento integral do cDNA ou gene, e não precisa ser idêntica ao cDNA ou gene encontrado no tipo de planta a ser transformado. Tipicamente, a seqüência anti-sentido tem somente que ser capaz de hibridizar ao gene alvo ou RNA de interesse. Assim, onde a seqüência introduzida for de comprimento menor, será necessário um maior grau de homologia à seqüência do fator de transcrição endógeno para supressão anti-sentido efetiva. Conquanto possam ser utilizadas seqüências anti-sentido de diversos comprimentos, preferivelmente, a seqüência antisentido introduzida no vetor deve ser de pelo menos 30 nucleotídeos de comprimento, e supressão anti-sentido melhorada será tipicamente observada com o aumento do comprimento da seqüência anti-sentido. Preferivelmente, o comprimento da seqüência anti-sentido no vetor deve ser maior do que 100 nucleotídeos. A transcrição de um constructo anti-sentido conforme descrita resulta na produção de moléculas de RNA que são o complemente inverso de moléculas de mRNA transcritas do gene de fator de transcrição endógeno na célula da planta.

A supressão da expressão de gene de fator de transcrição endógeno também pode ser conseguida utilizando uma ribozima. Ribozimas são moléculas de RNA que possuem atividade endorribonuclease altamente específica. A produção e utilização de ribozimas são descritas na Patente

norte-americana No. 4.987.071 e Patente norte-americana No. 5.543.508. Seqüências sintéticas de ribozima incluindo RNAs anti-sentido podem ser utilizadas para conferir atividade de divagem de RNA no RNA anti-sentido, de modo que as moléculas de mRNA endógenas que hibridizam ao RNA anti-sentido sejam clivadas, o que por sua vez, leva a uma inibição antisentido realçada de expressão de gene endógeno.

Vetores em que o RNA codificado por um fator de transcrição ou cDNA homólogo de fator de transcrição seja superexpresso também podem ser utilizados para obter co-supressão de um gene endógeno correspondente, por exemplo, da maneira descrita na Patente norte-americana No. 5.231.020, concedida a Jorgensen. Tal co-supressão (também chamada de supressão sentido) não requer que todo o cDNA de fator de transcrição seja introduzido nas células de planta, nem requer que a seqüência introduzida seja exatamente idêntica ao gene endógeno de fator de transcrição de interesse. Entretanto, da mesma maneira que com supressão anti-sentido, a eficiência supressiva será realçada com o aumento da especificidade da hibridização, por exemplo, com o aumento de comprimento da seqüência introduzida, e/ou com o aumento da similaridade de seqüência entre a seqüência introduzida e o gene endógeno de fator de transcrição.

Vetores expressando uma forma não-traduzível do mRNA de fator de transcrição, (por exemplo, seqüências compreendendo um ou mais códons de interrupção, ou mutação sem sentido) também podem ser utilizados para suprimir a expressão de um fator de transcrição endógeno, desse modo reduzindo ou eliminando sua atividade e modificando um ou mais traços. Processos para produzir tais constructos estão descritos na Patente norte-americana No. 5,583.021. Preferivelmente, tais constructos são feitos pela introdução de um códon prematuro de interrupção no gene de fator de transcrição. Altemativamente, uma traço de planta pode ser modificada por silenciamento de gene utilizando RNA de filamento duplo (Sharp (199) Genes and Development 13: 139 a 141).

Outro processo para abolir a expressão de um gene é pela inserção de mutagênese utilizando o T-DNA de Agrobacterium tumefaciens.

Após geração dos mutantes de inserção, os mutantes podem ser submetidos à triagem para identificar aqueles contendo a inserção em um fator de transcrição ou gene homólogo de fator de transcrição. Plantas contendo um único evento de inserção transgênica no gene desejado podem ser cruzadas para gerar plantas homozigotas para a mutação (Koncz et al., (1992) Methods in Arabidopsis Research, World Scientific).

Alternativamente, um fenótipo de planta pode ser alterado pela eliminação de um gene endógeno, tal como um fator de transcrição ou homólogo de fator de transcrição, por exemplo, por recombinação homóloga (Kempin et al.. (1997) Nature 389: 802).

Um traço de planta também pode ser modificado pela utilização do sistema cre-lox (por exemplo, conforme descrito na Patente norteamericana No. 5.658.72). Um genoma de planta pode ser modificado para incluir primeiro e segundo sítios lox que são, então, contatados com uma recombinase Cre. Se os sítios lox estão na mesma orientação, a seqüência de DNA interveniente entre os dois sítios é excisada. Se os sítios lox estão na orientação oposta, a seqüência interveniente é invertida.

Os polinucleotídeos e polipeptídeos desta invenção também podem ser expressos em uma planta na ausência de um cassete de expressão pela manipulação do nível de atividade ou de expressão do gene endógeno por outros meios. Por exemplo, pela expressão ectopicamente de um gene por marcação de ativação T-DNA (Ichikawa et al., (1997) Nature 390: 698 a 701; Kakimoto et al., (1996) Science 274: 982 a 985). Esse processo vincula a transformação de uma planta com um marcador de gene contendo realça25 dores transcricionais múltiplos e uma vez o marcador tenha sido inserido no genoma, a expressão de uma seqüência codificando gene flanqueador torna-se desregulada. Em outro exemplo, o aparelho transcricional em uma planta pode ser modificado de modo a aumentar os níveis de transcrição de um polinucleotídeo da invenção (Ver, por exemplo, Publicações PCT WO 96/

06166 e WO 98/53057 que descrevem a modificação da especificidade de ligação de DNA de proteínas com dedo de zinco (zinc finger protein) pela mudança de aminoácidos particulares no motivo de ligação de DNA).

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A planta transgênica também pode incluir o aparelho celular ou mecanismos necessários para expressar ou alterar a atividade do polipeptídeo codificado por um gene endógeno, por exemplo, pela alteração do estado de fosforilação do polipeptídeo para mantê-lo no estado ativado.

As plantas transgênicas (ou células de planta, ou explantes de planta, ou tecidos de planta) incorporando os polinucleotídeos da invenção e/ou expressando os polipeptídeos da invenção podem ser produzidas por uma diversidade de técnicas bem-estabelecidas conforme acima descrito. Em seguida à construção de um vetor, mais tipicamente um cassete de expressão, incluindo um polinucleotídeo, por exemplo, codificando um fator de transcrição ou homólogo de fator de transcrição, da invenção, podem ser utilizadas técnicas padrão para introduzir o polinucleotídeo em uma planta, uma célula de planta, um explante de planta ou um tecido de planta de interesse. Opcionalmente, a célula, explante ou tecido de planta podem ser regenerados para produzir uma planta transgênica.

A planta pode ser qualquer planta superior, incluindo plantas gimnospermas, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Protocolos adequados estão disponíveis para Leguminosae (alfafa, soja, trevo, etc.), Umbelliferae (cenoura, aipo, parnsip), Cruciferae (repolho, rabanete, colza, brócolis, etc), Cucurbitaceae (melões e pepino), Gramineae (trigo, milho, arroz, cevada, painço, etc), Solanaceae (batata, tomate, tabaco, pimentas, etc.), e diversas outras culturas. Ver protocolos descritos em Ammirato et al., (1984) Handbook of Plant Cell Culture - Crop Species. Macmillan Publ. Co.; Shimamoto et al., (1989) Nature 338: 274 a 276; Fromm et al., (1990) Bio/Technoloqy 8: 833 a 839; e Vasil et al., (1990) Bio/Technoloqy 8: 429 a 434.

A transformação e regeneração de células tanto de plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas é agora rotina, e a seleção da técnica de transformação mais apropriada é determinada pelo praticante. A escolha do processo irá variar com o tipo de planta a ser transformada; aqueles versados na técnica reconhecerão a adequabilidade de processos particulares para dados tipos de plantas. Processos adequados podem incluir, mas não

são limitados a: eletroporação de protoplastos de plantas; transformação mediada por lipossoma; transformação mediada por polietileno glicol (PEG); transformação utilizando vírus; microinjeção de células de plantas, bombardeamento de células de planta com microprojéteis; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Transformação significa a introdução de uma seqüência de nucleotídeo em uma planta de modo a causar expressão estável ou transiente da seqüência.

Exemplos de sucesso da modificação de características de plantas por transformação com seqüências clonadas que servem para ilustrar o conhecimento atual nesse campo da tecnologia, e que são aqui incorporados para fins de referência, incluem: Patentes U.S. Nos. 5.571.706; 5.677.175; 5.510.471; 5570.386; 5.507.945; 5.589.615; 5.750.871;

5.268.526; 5.780.708; 5.538.880; 5.773.269; 5.736.369 e 5.610.042.

Em seguida à transformação, as plantas são preferivelmente selecionadas utilizando um marcador dominante selecionável incorporado no vetor de transformação. Tipicamente, um tal marcador irá conferir resistência a antibiótico ou herbicida nas plantas transformadas, e a seleção dos transformantes pode ser realizada pela exposição das plantas a concentrações apropriadas do antibiótico ou herbicida.

Apos as plantas transformadas serem selecionadas e desenvolvidas à maturidade, são identificadas aquelas plantas mostrando um traço modificado. O traço modificado pode ser qualquer um dos traços acima descritos. Adicionalmente, a confirmação de que o traço modificado é devido a mudanças em níveis ou atividade de expressão do polipeptídeo ou polinucleotídeo da invenção, pode ser determinada pela análise da expressão de mRNA utilizando Northern blots, RT-PCR ou microrredes, ou expressão de proteína utilizando immunoblots ou Western blots ou análises de deslocamento em gel.

SISTEMAS INTEGRADOS - IDENTIDADE DE SEQÜÊNCIA

Adicionalmente, a presente invenção pode ser um sistema integrado, meio de computação ou capaz de ser lido por computação, que compreende uma instrução aplicada para determinar a identidade de uma ou

mais seqüências em um banco de dados. Adicionalmente, a instrução aplicada pode ser utilizada para gerar ou identificar seqüências que atendam a quaisquer critérios especificados. Além do mais, a instrução aplicada pode ser utilizada para associar ou ligar certos benefícios funcionais, tal como uma biomassa melhorada de planta, com uma ou mais seqüências identificadas.

Por exemplo, a instrução aplicada pode incluir, por exemplo, uma comparação de seqüência ou outro programa de alinhamento, por exemplo, um programa disponível tal como, por exemplo, a Wisconsin

Package Versão 10.0, tal como BLAST, FASTA, PILEUP, FINDPATTERNS ou similares (GCG, Madison, Wl). Podem ser pesquisadas seqüências de bancos de dados públicas tais como GenBank, EMBL, Swiss-Prot e PIR ou seqüências de bancos de dados privadas tais como PhytoSeq (Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA).

O alinhamento de seqüências para comparação pode ser realizado pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, pelo método de pesquisa por similaridade de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:

2444, por implementações computadorizadas desses algoritmos. Após o alinhamento, comparações de seqüências entre dois (ou mais) polinucleotídeos ou polipeptídeos são realizadas tipicamente por comparação de seqüências das duas seqüências ao longo de uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência. A janela de comparação pode ser um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150 posições contíguas. Uma descrição do método é proporcionada em Ausubel et al., supra.

Pode ser utilizada uma diversidade de métodos para determinar relações de seqüências, incluindo alinhamento manual e alinhamento e análise auxiliados por seqüência de computador. Essa última abordagem é uma abordagem preferida na presente invenção, devido ao desempenho aumen-

tado proporcionado por métodos auxiliados por computador. Conforme observado acima, está disponível uma diversidade de programas de computador para realizar o alinhamento de seqüências, ou pode ser produzido por alguém versado.

Um algoritmo exemplificativo que é adequado para a determinação da porcentagem de identidade de seqüência é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 15: 4503 a 410 (1990). Software para executar a análise BLAST está publicamente disponível, por exemplo, através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esse algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de seqüência de alta contagem (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência em questão, que tanto casam como satisfazem alguma contagem limiar T de valor positivo quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. T é referido como a contagem limiar de palavra vizinha (Altschul et al., supra). Esses acerto de palavras vizinhas atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo os mesmos. Os acertoss de palavra são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência tão longe quanto a contagem de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. Contagens cumulativas são calculadas utilizando, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa para um par de resíduos que casam; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos que não casam; sempre < 0). Para seqüências de aminoácidos, é utilizada uma matriz de contagem para calcular a contagem cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é parada quando: a contagem cumulativa de alinhamento cai fora pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a contagem cumulativa cai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de contagem negativa; ou o final de cada seqüência é atingido. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M

• · ·· · * * · · • * · · • » · · • · · • · · * • · · ·····« • · · · • · · · · • · · · · • · · · · ··· ··· ··« = 5, Ν = -4, e uma comparação de ambos os filamentos. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff & Heinkoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:

10915).

Adicionalmente para calcular a porcentagem de identidade de seqüência, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 a 5787). Uma medida de similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual um casamento entre duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorre ao acaso. Por exemplo, um ácido nucléicô é considerado similar a uma seqüência de referência (e, portanto, neste contexto, homólogo) se a probabilidade de menor soma em uma comparação do teste de ácido nucléicô para o ácido nucléicô de referência é menor do que cerca de 0,1, ou menos do que cerca de 0,01, e mesmo menos do que cerca de 0,001. Um exemplo adicional de um algoritmo de alimhamento de seqüência útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de seqüências múltiplas a partir de um grupo de seqüências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos, aos pares. O programa pode alinhar, por exemplo, até 300 seqüências de um comprimento máximo de 5.000 letras.

O sistema integrado, ou computador inclui tipicamente uma interface de entrada de usuário permitindo um usuário ver seletivamente um ou mais registros de seqüência correspondendo a um ou mais cordões de caracteres, assim como um conjunto de instruções que alinha a um ou mais cordões de caracteres entre si ou com um cordão adicional de caracteres para identificar uma ou mais regiões de similaridade de seqüência. O sistema pode incluir uma ligação de um ou mais cordões de caracteres com fenótipo ou função gene particular. Tipicamente, o sistema inclui um elemento de saída legível pelo usuário que exibe um alinhamento produzido pelo conjunto de instruções de alinhamento.

Os processos desta invenção podem ser implementados em um ambiente de computação localizado ou distribuído. Em um ambiente distribuído, os processos podem ser implementados em um único computador compreendendo processadores múltiplos ou em uma multiplicidade de computadores. Os computadores podem ser ligados, por exemplo, através de um barramento comum, mas mais preferivelmente os computadores são nós em uma rede. A rede pode ser uma rede generalizada ou um local dedicado ou rede de área estendida e, em certas concretizações preferidas, os computadores podem ser componentes de uma Intranet ou uma Internet.

Portanto, a invenção proporciona processos para identificar uma seqüência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotídeos conforme aqui observado, ou um ou mais polipeptídeos alvo codificados pelos polinucleotídeos, ou de outro modo aqui observado e pode incluir ligar ou associar um dado fenótipo de planta ou função gene com uma seqüência. Nos processos, é proporcionada uma seqüência de banco de dados de (localmente ou através de uma Internet ou Intranet) e é feita uma consulta à seqüência de banco de dados utilizando as seqüências relevantes daqui e fenótipos de plantas ou funções gene associados.

Quaisquer seqüências daqui podem ser inseridas no banco de dados, antes ou após consultar o banco de dados. Isto proporciona tanto a expansão do banco de dados como, se feito antes da etapa de consulta, a inserção de seqüências de controle no banco de dados. As seqüências de controle podem ser detectadas pela consulta para assegurar a integridade geral tanto do banco de dados como da consulta. Conforme observado, a consulta pode ser feita utilizando uma interface baseada em navegador de rede. Por exemplo, o banco de dados pode ser um banco de dados público centralizado tais como os aqui mencionados, e a consulta pode ser feita a partir de um terminal ou computador remoto através de uma Internet ou Intranet.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são destinados a ilustrar mas não limitar a presente invenção.

EXEMPLO 1. IDENTIFICAÇÃO E CLONAGEM DE UM GENE DE COMPRIMENTO INTEGRAL

Seqüências putativas de fatores de transcrição (genômicas ou ESTs) relacionadas a fatores de transcrição conhecidos foram identificadas no Arabidopsis thaliana do banco de dados GenBank utilizando o programa de análise de seqüências tblastn utilizando parâmetros padrão e um limiar de corte de valor P de -4 ou -5 ou menor, dependendo do comprimento da seqüência consultada. Acertos de seqüências putativas de fatores de transcrição foram então submetidos a triagem para identificar aqueles contendo cordões particulares de seqüências. Se os acertos de seqüências continham tais cordões de seqüências, as seqüências foram confirmadas como fatores de transcrição.

Alternativamente, as bibliotecas de cDNA de Arabidopsis thaliana derivadas de tecidos ou tratamentos diferentes, ou de bibliotecas genômicas, foram submetidas à triagem para identificar novos membros de uma família de transcrição utilizando uma abordagem de hibridização de baixa severidade. Sondas foram sintetizadas utilizando iniciadores específicos de genes em uma reação PCR padrão (temperatura de anelamento de 60 °C) e marcadas com dCTP ³²P utilizando o High Prime DNA Labeling Kit (Boehinger Mannheim). Sondas purificadas radiomarcadas foram adicionadas a filtros imersos em meio de hibridização Church (0,5 M NaPO₄, pH 7,0, 7 % SDS, 1 % p/v soro albumina bovino) e hibridizadas durante a noite a 60 °C, com sacolejamento. Os filtros foram lavados duas vezes por 45 a 60 minutos com 1 x SCC, 1 % SDS, a 60 °C.

Para identificar seqüências adicionais 5' ou 3' de uma seqüência parcial de cDNA em uma biblioteca de cDNA, foram executadas amplificações rápidas de extremidades 5' e 3' de cDNA (RACE) utilizando o kit de amplificação de cDNA Marthon® (Clontech, Paio Alto, CA). De um modo geral, o processo vinculou primeiro isolar mRNA poli(A), executando a síntese dos primeiro e segundo filamento de cDNA para gerar cDNA de filamento duplo, embotar as extremidades de cDNA, seguido por ligação do Marathon® Adaptor ao cDNA para formar uma biblioteca de cDNA de duplo filamento,

adaptador-ligado.

Iniciadores gene específicos foram projetados para serem utilizados juntamente com iniciadores adaptadores específicos para ambas as reações RACE 5' e 3'. Iniciadores aninhados, ao invés de iniciadores únicos, fóram utilizados para aumentar a especificidade do POR. Utilizando reações RACE 5' e 3', foram obtidos fragmentos RACE 5' e 3', seqüenciados e clonados. O processo pode ser repetido até que as extremidades 5' e 3' do gene de comprimento integral são identificadas. Então, o cDNA de comprimento integral foi gerado por PCR utilizando iniciadores específicos para as extremidades 5'e 3'do gene por PCR extremidade a extremidade.

EXEMPLO II. CONSTRUÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO

A seqüência foi amplificada a partir de uma biblioteca genômica ou de cDNA utilizando iniciadores específicos para seqüências a montante e a jusante da região de codificação. O vetor de expressão foi pMEN20 ou pMEN65, que são ambos derivados do pMON316 (Sanders et al., (1987) Nucleic Acids Research 15: 1543 a 1548) e contêm promotor CaMV 35S para expressar transgenes. Para clonar a seqüência em um vetor, ambos pMEN20 e fragmento amplificado de DNA foram digeridos separadamente com enzimas de restrição Sall e Notl a 37 °C, por 2 horas. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % e visualizados por manchamento com brometo de etídeo. Os fragmentos de DNA contendo a seqüência e o plasmídeo linearizado foram excisados e purificados utilizando um kit de extração em gel Qiaquick (Qiagen, CA). Os fragmentos de interesse foram ligados em uma proporção de 3:1 (vetor para inserto). As reações de ligação utilizando DNA T4 ligase (New Englands Biolabs, MA) foram realizadas a 16 °C, por 16 horas. Os DNAs ligados foram transformados em células competentes da cepa DH5alfa de E. coli pela utilização do processo de choque térmico. As transformações foram plaqueadas em placas LB contendo 50 mg/L de canamicina (Sigma).

Colônias individuais foram desenvolvidas durante a noite em cinco mililitros de caldo LB contendo 50 mg/L de canamicina, a 37 °C. O DNA plasmídico foi purificado pela utilização de kits Qiaquick Minipreparação (Qi-

agen, CA).

EXEMPLO III. TRANSFORMAÇÃO DO AGROBACTERIUM COM O VETOR

DE EXPRESSÃO

Após ter sido construído o vetor plasmídico contendo o gene, o vetor foi utilizado para transformar células de Agrobacterium tumefaciens expressando os produto de genes. O estoque de células de Agrobacterium tumefaciens para transformação foi preparado conforme descrito por Nagel et al., (1990) FEMS Microbiol. Letts. 67: 325 a 328. A cepa ABI de Agrobacterium foi desenvolvida em 250 mL de meio LB (Sigma) durante a noite a 28 °C, com sacolejamento, até ser atingida uma absorbância (A₆oo) de 0,5 a 1,0. As células foram colhidas por centrifugação a 4.000 x g por 15 min a 4 °C. As células foram então ressuspensas em 250 pL de tampão resfriado (HEPES 1 mM, pH ajustado a 7,0 com KOH). As células foram novamente centrifugadas conforme acima descrito e ressuspensas em 125 pL de tampão resfriado. As células foram então centrifugadas e ressuspensas duas vezes mais no mesmo tampão HEPES conforme acima descrito a um volume de 100 pL e 750 pL, respectivamente. As células ressuspensas foram então distribuídas em alíquotas de 40 pL, rapidamente congeladas em nitrogênio líquido, e armazenadas a -80 °C.

As células de Agrobacterium foram transformadas com plasmídeos preparados como acima descrito seguindo o protocolo descrito por Nagel et al. Para cada constructo de DNA a ser transformado, 50 a 100 ng de DNA (de um modo geral ressuspenso em Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) foram misturados com 40 pL de células de Agrobacterium. A mistura DNA/células foi então transferida para uma cubeta com um afastamento entre eletrodos de 2 mm e submetida a uma carga de 2,5 kV dissipada a 25 pF e 200 pF utilizando um aparelho Gene Pulser II (Bio-Rad). Após eletroporação, as células foram imediatamente ressuspensas em 1,0 mL de LB e deixadas recuperar sem seleção de antibiótico, por 2 a 4 horas a 28 °C, em um incubador sacolejante. Apos recuperação, as células foram plaqueadas em meio seletivo de caldo LB contendo 100 pg/mL de espectinomicina (Sigma) e incubadas por 24 a 48 horas a 28 °C. Colônias isoladas foram então apa54

nhadas e inoculadas em meio fresco. A presença do constructo plasmídico foi verificada por amplificação de PCR e análise de seqüência.

EXEMPLO IV. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS COM

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETOR DE EXPRESSÃO

Após transformação de Agrobacterium tumefaciens com vetores plasmídicos contendo o gene, colônias isoladas de Agrobacterium foram identificadas, propagadas, e utilizadas para transformar plantas de Arabidopsis. Resumidamente, 500 mL de meio de cultura LB contendo 50 mg/L de canamicina foram inoculados com as colônias e desenvolvidos a 28 °C, com sacolejamento por 2 dias até ser atingida uma absorbância (A₆oo) de > 2,0. As células foram então colhidas por centrifugação a 4.000 x g por 10 min, e ressuspensas em meio de infiltração (1/2 X sais de Murashige and Skoog (Sigma), 1 X vitaminas B-5 Gamborg (Sigma), 5,0 % (p/v) de sacarose (Sigma), benzilamino purina 0,044 μΜ (Sigma), 200 μΙ_/ί de Silwet L-77 (Lehle Seeds) até ser atingida uma absorbância (A₆oo)de 0,8.

Antes da transformação, sementes de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) foram semeadas a uma densidade de ~ 10 plantas por pote de 10,2 mm (4) sobre um meio de cultivo em vasos Pro-Mix BX (Hummert Intenational) coberto com malha de fibra de vidro (18 mm X 16 m). As plantas foram desenvolvidas sob iluminação contínua (50 a 75 pE/m²/s) a 22 - 23 °C, com 65 a 70 % de umidade relativa. Após cerca de 4 semanas, talos de inflorescência primária (toras bolts) são cortados para encorajar o crescimento de múltiplos toras bolts secundárias. Após floração das toras secundárias maduras, as plantas foram preparadas para transformação por remoção de todos as síliquas (siliques) e flores abertas.

Os potes foram então imersos de cabeça para baixo em uma mistura de meio de infiltração de Agrobacterium conforme acima descrito, por 30 s, e colocados em seus lados para permitir drenagem, em uma superfície plana de 30,5 x 61 cm (T x 2') coberta com um invólucro de plástico. Após 24 h, o invólucro de plástico foi removido e os potes foram virados de pé. O procedimento de imersão foi repetido uma semana mais tarde, para um total de duas imersões por pote. Sementes foram então colhidas de cada

pote de transformação e analisadas seguindo o protocolo abaixo descrito.

EXEMPLO V. IDENTIFICAÇÃO DE TRANFORMANTES PRIMÁRIOS DE

ARABIDOPSIS

Sementes coletadas dos potes de transformação foram esterili5 zadas essencialmente como segue. As sementes foram dispersas em uma solução contendo 0,1 % (v/v) de Triton X-100 (Sigma) e H₂O estéril e foram lavadas sacudindo a suspensão por 20 min. A solução de lavagem foi então drenada e reposta com solução de lavagem fresca para lavar as sementes por 20 min, com sacolejamento. Após remoção da segunda solução de lava10 gem, foi adicionada às sementes uma solução contendo 0,1 % (v/v) de Triton X-100 e 70 % de etanol (Equistar) e a suspensão foi sacudida por 5 min. Após remoção da solução etanol/detergente, foi adicionada às sementes uma solução contendo 0,1 % (v/v) de Triton X-100 e 30 % (v/v) de alvejante (Clorox), e a suspensão foi sacudida por 10 min. Após remoção da solução alvejante/detergente, as sementes foram lavadas cinco vezes em H₂O estéril destilada. As sementes foram armazenadas na ultima água de lavagem a 4 °C por 2 dias no escuro antes de serem plaqueadas sobre meio de seleção de antibiótico (sais de 1 X Murashige e Skoog (pH ajustado a 5,7 com KOH 1 M), 1 X vitaminas B-5 Gamborg, fitagar a 0,9 % (Life Technologies), e 50 mg/L de canamicina. As sementes foram germinadas sob iluminação contínua (50 a 75 pE/m²/s) a 22 - 23 °C. Após 7 a 10 dias de desenvolvimento sob essas condições, foram visivelmente obtidos transformantes primários resistentes à canamicina (geração Ti). Essas mudas foram transferidas primeiro a placas de seleção frescas onde as mudas continuaram a se desen25 volver por mais 3 a 5 dias, e então para o solo (meio para plantar em potes Pro-MixBX).

Transformantes primários foram cruzados e foram coletadas as sementes de progênie (T₂); sementes resistentes à canamicina foram selecionadas e analisadas. Os níveis de expressão dos polinucleotídeos recombi30 nantes nos transformantes variou desde cerca de 5 % de aumento do nível de expressão a pelo menos 100 % de aumento do nível de expressão. Observações similares são feitas em relação ao nível de expressão de poli-

peptídeo.

EXEMPLO VI. IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS COM KNOCKOUTS DE GENE DE FATOR DE TRANSCRIÇÃO

A triagem de coleções de Arabidopsis mutagenizadas por inser5 ção para mutantes nulos em um gene alvo conhecido foi essencialmente conforme descrito em Krysan et al., (1999) Plant Cell 11: 2283 a 2290. Resumidamente, iniciadores gene específicos, aninhados em 5 a 250 pares de base uns aos outros, foram projetados a partir das regiões 5' e 3' de um gene alvo conhecido. Similarmente, conjuntos aninhados de iniciadores tam10 bém foram criados específicos para cada um dos T-DNA ou extremidades de transposons (as margens direita e esquerda). Foram utilizadas todas as combinações possíveis de iniciadores gene específicos e T-DNA/transposon para detectar por PCR, um evento de inserção dentro ou próximo do gene alvo. Os fragmentos amplificados de DNA foram então seqüenciados, o que permite a determinação precisa do ponto de inserção do T-DNA/transposõn em relação ao gene alvo. Os eventos de inserção dentro da seqüência de codificação ou de interveniência dos genes foram desconvolutados a partir de um agrupamento compreendendo uma pluralidade de eventos de inserção para uma planta mutante única para caracterização funcional. O proces20 so é descrito em mais detalhe em Yu and Adam, Pedido de Patente U.S. Número de Série 09/177.733, depositado em 23 de outubro de 1998. EXEMPLO VII. IDENTIFICAÇÃO DE SUPEREXPRESSOR OU PLANTAS

DE NOCAUTE DE GENES COM BIOMASSA DE PLANTA MODIFICADA

Foram realizados experimentos para identificar aqueles trans25 formantes ou knockouts que apresentaram um fenótipo de biomassa modificado. As plantas foram desenvolvidas sob condições de luz contínua a 20 25 °C. Para tais estudos, as folhas e sementes dos transformantes foram observadas quanto a um fenótipo modificado. Para a determinação do peso seco da planta, uma planta foi colocada em uma estufa por 3 dias a 65 a 70 °C.

Observaram-se que as plantas superexpressando G 1073 (SEQ

ID NO: 1 e 2) constitutivamente (três populações T2 independentes tendo 6 • · « · «·······» IA If .

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Identificaram-se genes adicionais que são relacionados a G1073 com base em identidade de seqüências e que são portanto adequados para aumentar a biomassa de planta. Os genes eram G2789 (SEQ ID NO: 3 e 4), G1945 (SEQ ID NO: 5 e 6), e G2155 (SEQ ID NO: 7 e 8). O G2789 compartilha 89 % de identidade ao longo de um domínio conservado de G1073 (resíduos de aminoácidos 33 através de 50 da SEQ ID NO: 2), enquanto que G1945 compartilha cerca de 89 % de identidade de seqüências ao longo do mesmo domínio e G2155 compartilha uma identidade de seqüências de 78 % ao longo daquele domínio. G2155 e G1945 compartilham uma identidade de seqüências de 83 % ao longo daquela região. Para confirmar que esses fatores de transcrição relacionados poderiam ser utilizados para modificar biomassa de planta, determinaram-se mudanças em biomassa de planta para os superexpressores G2155 ou G2789. Observaram-se que quando tanto G2155 como G2789 eram superexpressos em plantas, as plantas transformadas eram substancialmente maiores do que a planta do tipo selvagem.

Os genes ou seqüências selecionadas da Tabela 1 ou Tabela 2 também podem ser superexpressos ou nocauteados (knocked out) em uma planta para produzir uma planta com biomassa modificada. Preferivelmente, a seqüência selecionada (Seqüência de Teste) da Tabela 1 ou Tabela 2 é superexpressa na mesma espécie listada para as seqüências selecionadas, entretanto, pode ser utilizada outra espécie.

EXEMPLO VIII. IDENTIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS HOMÓLOGAS

Seqüências homólogas de Arabidopsis e espécies de plantas outras que Arabidopsis são identificadas utilizando ferramentas de pesquisa

de seqüência de banco de dados, tais como Basic local Alignment Search

Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 410; e Altschul et al., (1997) Nucl. Acid. Res. 25: 3389 a 3402). Os programas de análise de seqüências tblastx são empregados utilizando a matriz de contagem BLO5 SUM-62 (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A.

89: 10915 a 10919).

Seqüências homólogas identificadas de Arabidopsis são proporcionadas nas Tabelas 1 e 2, anexas a este pedido. A porcentagem de identidade de seqüências entre essas seqüências pode ser tão baixa quanto 47 %, ou mesmo uma identidade de seqüência mais baixa. O banco de dados inteiro GeneBankl NCBI foi filtrado quanto a seqüências de todas as plantas exceto Arabidopsis thaliana pela seleção de todas as entradas no banco de dados do GenBank NCBI associado com o ID taxonômico NCBI 33090 (Viridiplantae; todas as plantas) e excluindo entradas associadas com ID taxo15 nômico 3701 {Arabidopsis thaliana). Essas seqüências foram comparadas a seqüências representando genes de SEQ ID NO: 1 a 8 utilizando o algoritmo TBLASTX da Washington University (versão 2.0a19MP) na instalação padrão utilizando alinhamentos espaçados com o filtro desligado. Para cada gene de SEQ ID NO: 1 a 8, comparações individuais são comandadas por contagem de probabilidade (valor P), em que a contagem reflete a probabilidade de que um alinhamento particular ocorreu por acaso. Por exemplo, uma contagem de 3,6e-40 é 3,6 x 10-40. Adicionalmente a valores P, as comparações também podem ser contadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade reflete o grau em que dois segmentos de DNA ou proteína são idênticos ao longo de um comprimento particular.

A Tabela 1 (anexada a este pedido) lista um sumário de seqüências ortólogas e homólogas identificadas utilizando BLAST (programa tblastx) e os dados padrão de BLAST gerados a partir de uma pesquisa. A primeira coluna mostra o identificador de seqüência de polinucleotídeo (SEQ

ID NO), a segunda coluna mostra o identificador do cDNA de fator de transcrição (ID do Gene), a terceira coluna mostra o GenBank de n^Q de Acesso da seqüência de polinucleotídeo ortóloga ou homóloga identificada em uma

pesquisa BLAST (ID de Seqüência de Teste), a quarta coluna mostra o valor calculado da probabilidade de que a identidade de seqüência é devido ao acaso (Probabilidade da Menor Soma), a quinta coluna identifica a espécie de planta da Seqüência de Teste (Espécie de Seqüência de Teste), e a sexta coluna mostra a anotação do GenBank para a seqüência identificada em uma pesquisa BLAST (Anotação do GenBank de Seqüência de Teste).

A Tabela 2 (anexada a este pedido) lista seqüências ortólogas e homólogas identificadas utilizando BLAST (programa tblastx) e o resultado BLAST padrão geado por uma pesquisa. A primeira coluna mostra o identifi10 cador de seqüência de polinucleotídeo (SEQ ID NO), a segunda coluna mostra o identificador de cDNA de fator de transcrição (ID de Gene), a terceira coluna mostra o GenBank N^e de Acesso do polinucleotídeo ortólogo ou homólogo (ID da Seqüência de Teste), a quarta coluna mostra a anotação do GenBank para a seqüência identificada em uma pesquisa BLAST (Anota15 ção GenBank da Seqüência de Teste), a quinta coluna mostra o quadro de leitura da seqüência de teste codificando a seqüência ortóioga ou homóloga (Quadro de Leitura), a sexta coluna mostra o valor calculado da contagem das seqüências alinhadas (Contagem Alta), a sétima coluna mostra o valor calculado da probabilidade de que a identidade de seqüência é devido ao acaso (Probabilidade de Menor Soma), e a oitava coluna mostra o número de regiões na Seqüência de Teste que se alinham com uma seqüência da SEQ ID NO: (N).

. Todas as referências, publicações, patentes e outros documentos e fontes de informações daqui são integralmente incorporados para fins de referência para todas as finalidades. Conquanto a invenção tenha sido descrita com referência às concretizações e exemplos acima, deve se entendido que podem ser feitas diversas modificações sem afastamento do espírito da invenção.

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Tabela 1 (continuação)

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Tabela 1 (continuação)

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Tabela 1 (continuação)

SEQ ID ID do ID da Se- Probabilidade Espécies das Seqüên- Anotação de Seqüências de Teste do GenBank

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G1945 gi168237 0.68 [Helianthus annuus] proteína rica em hidroxiprolina.

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Tabela 2 (continuação)

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G1073 AW776082 AW776082 EST335147 DSIL Medicago truncatula... 3 522 8,80E-48

G1073 BF254863 BF254863 HVSMEf0005E05f semente de Hordeum vulgare 2 516 3.70E-47

SEQ ID do ID da Seqüên- Anotação da Seqüência de Teste do Genbank Qua- Conta- Probabilida-

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G1073 BH550963 BH550963 BOHQE85TR B0HQ Brassica oleracea ge... -3 458 3.80E-41 ώ 5 2 § S” φ Ό

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G1073 AV421337 AV421337 AV421337 planta jovem de Lotus japonicus... 2 145 3.60E-07

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G1073 BG645337 BG645337 EST506953 KV3 Medicago truncatula c... 3 143 1,60E-05

SEQ ID do ID da Seqüên- Anotação da Seqüência de Teste do Genbank Qua- Conta- ProbabilidaID NO Gene cia de Teste dro de gem de da MeLeitura Alta nor Soma

G1073 AW031261 AW031261 EST274636 calo de tomateiro, TAMU Lycop... 1 139 1.70E-05

G1073 AW164140 AW164140 Lirnpest200-626-g4 Ljrinp Lambda Hy... 1 128 2.20E-05

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G1073 BG856170 BG856170 1024044H01.y1 C. reinhardtii CC-169... -2 128 0,00069

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G1073 AP004562 AP004562 cromossoma 8 clone P04 de Oryza sativa... -1 121 0,017

G1073 AW720219 AW720219 LjNEST17b3r nódulo de Lótus japonicus... 1 113 0,021

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G1073 GI-2213534 DNA-proteína similar à de ligação PD1 -1 244 1,50E-20

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G1073 GI-13486631 proteína hipotética [Oryza sativa] 2 68 0,14

G1073 GI-728594 proteína rica em glicina, proteína de ligação de RNA -1 81 0,16

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G1073 GI-15624033 proteína hipotética [Oryza sativa] -2 66 0,36 • · · · · ·

103 • · ·

• ·

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CM CM CM

CM CM CM CM

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G2789 ΑΡ004319 ΑΡ004319 cromossomo 1 clone Β10 de Oryza sativa... 1 207 4,20E-29

G2789 BH439306 BH439306 BOHGL38TR BOHG Brassica oleracea ge... 1 346 4,30E-29 ··· ··· ···

Ί OQ ·♦ ··· · · · ·

IZd ·· · »······«· ·· · ·· ··· · ·· « ·· · ·· · ···· ··

SEQ ID do ID da Seqüên- Anotação da Seqüência de Teste do Genbank Qua- Conta- Probabilidacü i ε o

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G2789 AW348874 AW348874 GM210010A10G1 Gm-r1021 Glicina máx... -2 322 1.10E-26

G2789 BE496294 BE496294 NXCI-022-C11-F NXCI (Nsf Xylem Comp... 1 323 1.30E-26

124 ·:·

Tabela 2 (continuação)

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G2789 ΒΙ924382 ΒΙ924382 EST544271 flor dek tomateiro, botões 0-3 m... 3 295 1,20E-23

G2789 BE432188 BE432188 EST39817 fruto de tomate breaker, TiG... 3 292 2.40E-23

125 ·:· ) « · · · ·

SEQ ID do ID da Seqüên- Anotação da Seqüência de Teste do Genbank Qua- Conta- Probabilida<b 2 ^s § ·§” o c

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G2789 BE587763 BE587763 WHE0652-C06-E12ZM Secale cereale ro... 1 256 1.60E-19 ··· ··· · · ·

Tabela 2 (continuação)

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G2789 BE611882 BE611882 sr01b07.y1 Gm-c1049 CDN... de Glicina máx 1 122 8.40E-05

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G1945 ΑΡ003683 ΑΡ003683 Oryza sati va DNA genômico, cromossomo... 3 396 1,10E-33

G1945 AV411735 AV411735 AV411735 planta jovem de Lotus japonicus... 1 390 1,20E-33 ιη ιο ιο ιη • ··· · · · · ··· ··· ··· • · ♦··♦····· · ·

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G1945 BH550963 BH550963 BOHQE85TR B0HQ Brassica oleracea ge... -3 356 2,50E-30

G1945 BG583651 BG583651 EST485403 GVN Medicago truncatula c... 3 246 2.50E-30 * · · ·· • e · ··· ···

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• · · · · • · · * ·

152

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1

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G1945 AL508367 ΑΙ508367 AL508367 Hordeum vulgare Barke deve... 3 195 3,60E-13

G1945 AV917319 AV917319 AV917319 K. Sato cDNA não publicado I... 2 195 3,60E-13

G1945 BM371214 BM371214 EBro04-SQC03-M20-R IGF Cevada EBroO... 2 196 4,70E-13

H

153

SEQ ID do ID da Seqüên- Anotação da Seqüência de Teste do Genbank Qua- Conta- Probabilidaφ Φ σ δ 2 ·$

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G1945 BF636643 BF636643 NF091G07DT1F1055 Drought Medicago t... 1 181 1,40E-11

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G1945 BI931107 BI931107 EST550996 flor de tomateiro, 8 mm to pr... 1 171 1,70E-10

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G1945 BI928278 BI928278 EST548167 flor de tomateiro, 3 - 8 mm b... 1 171 3,20E-09

G1945 BI929489 BI929489 EST549378 flor de tomateiro, 3 - 8 mm b... 1 171 4.20E-09

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G1945 BG601044 BG601044 EST505939 cSTS cD... de Solanum tuberosum... 1 155 1.30E-08

G1945 AW760534 AW760534 sl51e09.y1 Gm-c1027 cDN... de Glicina máx 1 153 2.30Ε-Ό8

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G1945 AI507693 AI507693 sb10d09.y1 Gm-c1004 cDN... de Glicina máx 2 134 3,50E-06

G1945 AP004116 AP004116 cromossomo 2 clone 0J1 de Oryza sativa... 1 153 4,40E-06

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G1945 BG582452 BG582452 EST484197 GVN Medicago truncatula c... 3 131 0,00041

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G1945 BI934755 BI934755 EST554644 flor de tomateiro, anthesis L... 2 114 0,035

G1945 AI441147 AI441147 sa59d03.y1 Gm-c1004 CDN... de Glicina máx 3 99 0,037

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G1945 AI494950 AL494950 sa93a09.y1 Gm-c1004 cDN... de Glicina máx 1 96 0,15

G1945 BM341562 BM341562 MEST336-F03.T3 ISUM5-RN cD... de Zea mays... -1 106 0,16

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G1945 BG649667 BG649667 RHIZ2-82-C04.b1-A003 Rizoma2 (RHIZ... 1 104 0,23

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G1945 AY022615 AY022615 Oryza sativa microssatélite MRG4940... -3 92 0,28 ιη

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G1945 AV627762 AV627762 AV627762 Chlamydomonas reinhardtii... -3 90 0,33

G1945 BE438437 BE438437 WHE0019.C06R000701 ITEC WHE Trigo E... -2 95 0,33 ··· ··· ···

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G1945 BE601230 BE601230 PI1-90-E07.g1-A002 Induzido por patógeno... 1 104 0,36

G1945 AW307162 AW307162 sf53e10.y1 Gm-c1009 cDN... de Glicina máx -1 90 0,36 σθ

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G1945 BE398786 BE398786 WHE0025.G02F990702 ITEC WHE Trigo E... -2 90 0,37 φ

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G1945 BI317506 BI317506 saf66h01 .y1 Gm-c1078 cD.. de Glicina máx... -2 90 0,43

G1945 AF143968 AF143968 Pinus taeda microssatélite ΡΓΓΧ3019... -1 90 0,43

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169

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G1945 AY023673 AY023673 Oryza sativa microssatélite MRG5998... 3 90 0,45

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170

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G1945 BE398931 BE398931 WHE0028.A05F990514 ITEC WHE Trigo E... -3 90 0,48

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G1945 GI-5042445 AC007789-8 proteína hipotética 1 220 7,20Ε-17

G1945 GI-2213534 proteína de ligação de DNA similar a PD1 1 194 8,70E-14

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G1945 GI-310925 proteína 2 similar a extensina rica em cisteína 2 85 0,33

G1945 GI-539030 B48232 proteína similar a extensina rica em cisteína... 2 85 0,33

G1945 GI-6624712 este transcrito cobre na orient. divergente... -2 62 0,42 ··· ··· ···

175 φ······· • · · · · ·· < • · ···· · · • * ······· • · · · · · ·

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G1945 GI-435039 proteína de parede celular rica em prolina -2 78 0,96

G1945 GI-451544 proteína de parede celular rica em prolina -2 78 0,96

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G2155 AW980581 AW980581 EST391734 GVN Medicago truncatula c... 3 352 8,50E-30

G2155 BG583687 BG583687 EST485440 GVN Medicago truncatula c... 2 346 3,00E-29 l— «99 9 9 9

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G2155 BH430946 BH430946 BOHSM94TF BOHS Brassica oleracea ge... -1 256 1.20E-19

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G2155 BE330349 BE330349 so77e09.v1 Gm-c1045 cDN... de Glicina máx... 3 188 2,50E-12 bω ω

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G2155 BG240043 BG2400432 OV1-17-B12.b1-A002 Ovário 1 (0V1) So... 1 177 3.50E-11

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G2155 BE587763 BE587763 WHE0652-C06-E12ZM Secale cereale ro... 1 144 1.20E-07 t—

Tabela 2 (continuação)

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G2155 BM307331 BM307331 sak27h05.y1 Gm-c1075 cD... de Glicina máx... 1 134 1.60E-06

G2155 AV425818 AV425818 AV425818 Planta jovem de Lotus japonicus... 3 134 2,10E-06 r— r— r— i—

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C/3				O.	O.

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ω c

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<Φ ο

σφ ω

Tabela 2 (continuação)

C φ <φ 4-4 o rt ΓΤ Φ	co 00	CD LO	CD
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13 , Φ ι— C/3 Φ	σο	00	o
Ι-	00	00
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Ο Φ 23 C	LO Lf)	LO LO	LO LO
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LO	LO	LO	LO	LO
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LO	LO	in	LO	LO
CN	CN	CN	CN	CN
0	0	0	0	0
1—	r—	1—	1—	1—

G2155 GI-12328465 hypothetical protein [Oryza sativa] 3 55 0,999

G2155 GI-18461282 hypothetical protein [Oryza sativa] -1 71 0,9996

G2155 Gi-2129873 S67502 ABR18 protein - garden pea 2 54 . 0,9999

1/2

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende operacionalmente ligada a um promotor heterólogo uma sequência de nucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada entre aquelas de SEQ ID NO: 1, 3, 5 e

   7 e suas sequências degeneradas que geram as mesmas proteínas de SEQ ID No: 2, 4, 6 e 8, respectivamente.
2. 2. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um promotor constitutivo, induzível, ou tecido específico operavelmente ligado à sequência de nucleotídeo.
3. 3. Vetor de clonagem ou de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante conforme definido na reivindicação 1.
4. 4. Célula microbiana transformada caracterizada pelo fato de que compreende o vetor conforme definido na reivindicação 3.
5. 5. Célula microbiana transformada caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante conforme definido na reivindicação 1.
6. 6. Processo para produzir uma planta tendo uma biomassa modificada, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) introduzir em uma planta o polinucleotídeo

   Petição 870170071156, de 22/09/2017, pág. 32/36

   2/2 recombinante conforme definido na reivindicação 1 ou o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 3; e (ii) selecionar uma planta transgênica com biomassa aumentada quando comparada a uma planta do tipo selvagem.
7. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão do polinucleotídeo recombinante ou os níveis de expressão do polipeptídeo selecionado dentre os de SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8 são alterados na planta transgênica.
8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada pela comparação de área de folhas, produção de sementes, ou peso fresco em relação a uma planta de controle ou do tipo selvagem.

   Petição 870170071156, de 22/09/2017, pág. 33/36

   1/3

   FIG 1

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   2S2:«3

   0000 σ> çb ιο ιη 5* β Ξ *ο ΟΝΟ** *- CM *· CM 0 0 00 <0 Ο» ΙΟ ΙΑ Ν«Ο^Λ ΟΝΟ»* ** «Μ ·— CM 0000 (Ο Ο* ΙΟ *Α r* οο ό ιο ΟΝΟ* *· CM — «Μ 0000

   Aumento de Biomassa οιυθωηνθρ %

   Planta super expressando G1073 (SEQ ID NO: 1 e 2) apresenta FIG 3 biomassa aumentada comparada à planta do tipo silvestre