BR122024000357A2 - Anticorpo humano isolado que se liga especificamente a cd46, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso de um anticorpo, ácido nucleico e vetor - Google Patents

Anticorpo humano isolado que se liga especificamente a cd46, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso de um anticorpo, ácido nucleico e vetor Download PDF

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antibodies
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Bin Liu
Yang Su
Scott Bidlingmaier
Christopher R. Behrens
Namkyung Lee
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The Regents Of The University Of California
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Abstract

ANTICORPO HUMANO ISOLADO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A CD46, IMUNOCONJUGADO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO E VETOR Em várias modalidades, são proporcionados anticorpos anti-CD46 humanos que são internalizados e entram em células tumorais através da via da macropinocitose, bem como conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) desenvolvidos a partir destes anticorpos para ter como alvo o diagnóstico e/ou a terapia de tumores que sobre-expressam CD46.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício e prioridade do documento USSN 62/049.973, depositado em 12 de setembro de 2014, que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
DECLARAÇÃO ACERCA DOS DIREITOS SOBRE AS INVENÇÕES FEITAS SOB A PESQUISA E DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO FEDERAL
[002] Este trabalho foi suportado em parte pelas Concessões N°: R01 CA118919, R01 CA129491, e R01 CA171315 de The National Institutes of Health. O Governo possui certos direitos sobre esta invenção.
ANTECEDENTES
[003] Devido à facilidade de acessibilidade, antígenos de superfície de célula tumoral são alvos valiosos para o desenvolvimento terapêutico. O espaço do epítopo na superfície celular é altamente complexo. Antígenos relevantes podem incluir proteínas glicosiladas e outros produtos modificados pós-traducionalmente que podem não ser prontamente preditos a partir de estudos de número de cópias genômicas ou níveis de expressão de mRNA (Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Kobata e Amano (2005) Immunol. Cell Biol. 83: 429-439; Birkle et al. (2003) Biochimie (Paris) 85: 455-463; Hakomori (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 491: 369 402; Hanisch, F. G. (2001) O-Glycosylation of the mucin type. Biol. Chem. 382, 143-1 49; Ugorski e Laskowska (2002) Acta Biochim. Pol. 49: 303-311).
[004] A identificação de epítopos de superfície de célula tumoral permite que a produção de anticorpos alcance a ligação específica a células neoplásicas, uma capacidade que pode ser utilizada em aplicações tais como indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ver, por exemplo, Clynes et al. (2000) Nat. Med. 6: 443-446), ou inibição da sinalização de vias envolvidas em migração, crescimento, e sobrevida de célula tumoral (ver, por exemplo, McWhirter et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 103: 1041-1 046; Fuh et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 6625 6631). Além disso, anticorpos que têm como alvo a internalização de epítopos de tumor podem ser explorados para alcançar a entrega intracelular eficaz e específica de citotoxinas, agentes citostáticos, fármacos quimioterápicos e/ou outros agentes de modulação de tumor (ver, por exemplo, Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Nielsen et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1591: 109-118; Pirollo et al. (2006) Hum. Gene Ther. 17: 117-124; Song et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:709-717; Liu et al. (2002) J. Mol. Biol. 315: 1063-1073).
[005] A apresentação de anticorpo em fagos foi amplamente usada para desenvolver anticorpos específicos ao câncer (ver, por exemplo, Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704710; Liu e Marks (2000) Anal. Biochem. 286: 119-128; 15. Marks et al. (1992) Biotechnology (N. Y.) 10: 779-783; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Sharon et al. (2005) J. Célula. Biochem. 96: 305-313; Silacci et al. (2005) Proteomics 5: 2340 -2350; Gao et al. (2003) J. Immunol. Methods 274: 185-197; Lekkerkerker e Logtenberg (1999) J. Immunol. Met., 231: 53-63; de Kruif et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 92: 3938-3942; Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21 769-21 776). Uma biblioteca de anticorpo em fagos combinatória serve como uma fonte de repertório de forma aleatória que pode ser usada para sondar variações neoplásicas na superfície de células de câncer (ver, por exemplo, Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Geuijen et al. (2005) Eur. J. Cancer 41: 178-187; Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161; Cai e Garen (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 6537-6541). Selecionar bibliotecas de anticorpo em fagos diretamente em linhagens de célula de câncer possibilita a identificação de anticorpos que têm como alvo o tumor sem conhecimento prévio de antígenos alvo ver, por exemplo, (Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704710; Gao et al. (2003) J. Immunol. Methods 274: 185-197; Geuijen et al. (2005) Eur. J. Cancer 41: 178-187; Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161).
[006] Embora numerosos anticorpos tenham sido encontrados por esta abordagem, o processo de triagem contra linhagens celulares não proporciona uma imagem ideal do quanto específico estes anticorpos serão para células de câncer reais em populações de paciente. Nem proporciona necessariamente uma indicação de se os anticorpos internalizarão in vivo ou não.
SUMÁRIO
[007] Em várias modalidades, são proporcionados anticorpos anti-CD46 humanos que são internalizados e entram em células tumorais através da via da macropinocitose, bem como conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) desenvolvidos a partir destes anticorpos para ter como alvo o diagnóstico e/ou a terapia de tumores que sobre-expressam CD46.
[008] Várias modalidades contempladas no presente documento podem incluir, mas não precisam ser limitadoas a, um ou mais dos seguintes:
[009] Modalidade 1: Um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a CD46 e é internalizado em uma célula que expressa ou que sobre-expressa CD46, em que: o dito anticorpo é um anticorpo que se liga especificamente a células que expressam ou sobre-expressam um CD46, em que o dito anticorpo se liga especificamente a um epítopo ligado por um ou mais anticorpos selecionados a partir do grupo que consiste em YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY, YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa; e o dito anticorpo é internalizado na dita célula via macropinocitose.
[010] Modalidade 2: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo se liga ao domínio 1 e/ou domínio 2 de CD46.
[011] Modalidade 3: O anticorpo, de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que o dito anticorpo não se liga ao domínio 3 e/ou domínio 4 de CD46.
[012] Modalidade 4: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-3, em que as ditas células que expressam ou sobre-expressam um CD46 são células de câncer.
[013] Modalidade 5: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-4, em que as ditas células que expressam ou sobre-expressam um CD46 são células de câncer de próstata.
[014] Modalidade 6: O anticorpo, de acordo com a modalidade 5, em que o dito anticorpo se liga a células de uma linhagem celular selecionada a partir do grupo que consiste em células DU145, células PC3, e células LnCaP.
[015] Modalidade 7: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que o dito anticorpo se liga a uma célula de tumor de próstata com uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 510 nM quando medida em células de tumor de próstata vivas por FACS.
[016] Modalidade 8: O anticorpo, de acordo com a modalidade 7, em que o dito anticorpo se liga a uma célula de tumor de próstata com uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 3 nM quando medida em células de tumor de próstata vivas por FACS.
[017] Modalidade 9: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, em que o dito anticorpo é uma imunoglobulina substancialmente intacta.
[018] Modalidade 10: O anticorpo, de acordo com a modalidade 9, em que o dito anticorpo compreende uma IgA, IgE, ou IgG.
[019] Modalidade 11: O anticorpo, de acordo com a modalidade 9, em que o dito anticorpo compreende uma IgG1.
[020] Modalidade 12: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, em que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga especificamente a células que expressam ou sobre-expressam um CD46.
[021] Modalidade 13: O anticorpo, de acordo com a modalidade 12, em que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em Fv, Fab, (Fab')2, (Fab')3, IgGΔCH2, e um minicorpo.
[022] Modalidade 14: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, em que o dito anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.
[023] Modalidade 15: O anticorpo, de acordo com a modalidade 14, em que a região VL do dito anticorpo é unida à região VH do dito anticorpo por um ligante de aminoácido que varia em comprimento de cerca de 3 aminoácidos até cerca de 15 aminoácidos.
[024] Modalidade 16: O anticorpo, de acordo com a modalidade 14, em que a região VL do dito anticorpo é unida à região VH do dito anticorpo por um ligante de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO:43), GGGGS GGGGS (SEQ ID NO:67), GGGGS (SEQ ID NO:68), GS GGGGS GGGGS GGS GGGGS (SEQ ID NO:69), SGGGGS (SEQ ID NO:70), GGGS (SEQ ID NO:71), VPGV (SEQ ID NO:72), VPGVG (SEQ ID NO:73), GVPGVG (SEQ ID NO:74), GVG VP GVG (SEQ ID NO:75), VP GVG VP GVG (SEQ ID NO:76), GGSSRSS (SEQ ID NO:77), e GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:78).
[025] Modalidade 17: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com YS5 para se ligar em CD46.
[026] Modalidade 18: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com YS5F para se ligar em CD46.
[027] Modalidade 19: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com YS5v1D para se ligar em CD46.
[028] Modalidade 20: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com SB1HGNY para se ligar em CD46.
[029] Modalidade 21: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS12 para se ligar em CD46.
[030] Modalidade 22: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete 3G7RY para se ligar em CD46.
[031] Modalidade 23: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS6 para se ligar em CD46.
[032] Modalidade 24: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS1 para se ligar em CD46.
[033] Modalidade 25: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS3 para se ligar em CD46.
[034] Modalidade 26: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS4 para se ligar em CD46.
[035] Modalidade 27: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS8 para se ligar em CD46.
[036] Modalidade 28: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS7 para se ligar em CD46.
[037] Modalidade 29: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS9 para se ligar em CD46.
[038] Modalidade 30: O anticorpo, de acordo com qualquer das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete YS10 para se ligar em CD46.
[039] Modalidade 31: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com YS11 para se ligar em CD46.
[040] Modalidade 32: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com 3G7HY para se ligar em CD46.
[041] Modalidade 33: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com 3G7NY para se ligar em CD46.
[042] Modalidade 34: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com 3G7 para se ligar em CD46.
[043] Modalidade 35: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com SB2 para se ligar em CD46.
[044] Modalidade 36: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com 2C8 para se ligar em CD46.
[045] Modalidade 37: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compete com UA8capa para se ligar em CD46.
[046] Modalidade 38: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3, e/ou VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY, YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e UA8capa.
[047] Modalidade 39: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS5.
[048] Modalidade 40: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS5.
[049] Modalidade 41: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS5.
[050] Modalidade 42: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5.
[051] Modalidade 43: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5.
[052] Modalidade 44: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5.
[053] Modalidade 45: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS5 humano.
[054] Modalidade 46: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS5 humana.
[055] Modalidade 47: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS5F.
[056] Modalidade 48: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS5F.
[057] Modalidade 49: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS5F.
[058] Modalidade 50: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5F.
[059] Modalidade 51: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5F.
[060] Modalidade 52: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5F e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5F.
[061] Modalidade 53: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS5F humano.
[062] Modalidade 54: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS5F humana.
[063] Modalidade 55: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS5F.
[064] Modalidade 56: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS5F.
[065] Modalidade 57: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS5F.
[066] Modalidade 58: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5F.
[067] Modalidade 59: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5F.
[068] Modalidade 60: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5F e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5F.
[069] Modalidade 61: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS5F humano.
[070] Modalidade 62: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS5F humana.
[071] Modalidade 63: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS5V1D.
[072] Modalidade 64: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS5V1D.
[073] Modalidade 65: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS5V1D.
[074] Modalidade 66: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5V1D.
[075] Modalidade 67: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5V1D.
[076] Modalidade 68: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5V1D e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5V1D.
[077] Modalidade 69: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS5V1D humano.
[078] Modalidade 70: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS5V1D humana.
[079] Modalidade 71: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo SB1HGNY.
[080] Modalidade 72: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo SB1HGNY.
[081] Modalidade 73: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo SB1HGNY.
[082] Modalidade 74: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo SB1HGNY.
[083] Modalidade 75: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo SB1HGNY.
[084] Modalidade 76: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo SB1HGNY e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo SB1HGNY.
[085] Modalidade 77: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de SB1HGNY humano.
[086] Modalidade 78: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de SB1HGNY humana.
[087] Modalidade 79: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS12.
[088] Modalidade 80: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS12.
[089] Modalidade 81: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS12.
[090] Modalidade 82: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS12.
[091] Modalidade 83: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS12.
[092] Modalidade 84: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS12 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS12.
[093] Modalidade 85: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS12 humano.
[094] Modalidade 86: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS12 humana.
[095] Modalidade 87: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo 3G7RY.
[096] Modalidade 88: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo 3G7RY.
[097] Modalidade 89: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo 3G7RY.
[098] Modalidade 90: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7RY.
[099] Modalidade 91: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7RY.
[100] Modalidade 92: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7RY e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7RY.
[101] Modalidade 93: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de 3G7RY humano.
[102] Modalidade 94: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de 3G7RY humana.
[103] Modalidade 95: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS6.
[104] Modalidade 96: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS6.
[105] Modalidade 97: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS6.
[106] Modalidade 98: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS6.
[107] Modalidade 99: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS6.
[108] Modalidade 100: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS6 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS6.
[109] Modalidade 101: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS6 humano.
[110] Modalidade 102: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS6 humana.
[111] Modalidade 103: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS1.
[112] Modalidade 104: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS1.
[113] Modalidade 105: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS1.
[114] Modalidade 106: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS1.
[115] Modalidade 107: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS1.
[116] Modalidade 108: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS1 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS1.
[117] Modalidade 109: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS1 humano.
[118] Modalidade 110: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS1 humana.
[119] Modalidade 111: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS3.
[120] Modalidade 112: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS3.
[121] Modalidade 113: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS3.
[122] Modalidade 114: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS3.
[123] Modalidade 115: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS3.
[124] Modalidade 116: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS3 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS3.
[125] Modalidade 117: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS3 humano.
[126] Modalidade 118: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS3 humana.
[127] Modalidade 119: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS4.
[128] Modalidade 120: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS4.
[129] Modalidade 121: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS4.
[130] Modalidade 122: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS4.
[131] Modalidade 123: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS4.
[132] Modalidade 124: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS4 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS4.
[133] Modalidade 125: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS4 humano.
[134] Modalidade 126: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS4 humana.
[135] Modalidade 127: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS8.
[136] Modalidade 128: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS8.
[137] Modalidade 129: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS8.
[138] Modalidade 130: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS8.
[139] Modalidade 131: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS8.
[140] Modalidade 132: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS8 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS8.
[141] Modalidade 133: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS8 humano.
[142] Modalidade 134: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS8 humana.
[143] Modalidade 135: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS7.
[144] Modalidade 136: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS7.
[145] Modalidade 137: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS7.
[146] Modalidade 138: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS7.
[147] Modalidade 139: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS7.
[148] Modalidade 140: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS7 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS7.
[149] Modalidade 141: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS7 humano.
[150] Modalidade 142: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS7 humana.
[151] Modalidade 143: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS9.
[152] Modalidade 144: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS9.
[153] Modalidade 145: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS9.
[154] Modalidade 146: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS9.
[155] Modalidade 147: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS9.
[156] Modalidade 148: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS9 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS9.
[157] Modalidade 149: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS9 humano.
[158] Modalidade 150: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS9 humana.
[159] Modalidade 151: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS10.
[160] Modalidade 152: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS10.
[161] Modalidade 153: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS10.
[162] Modalidade 154: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS10.
[163] Modalidade 155: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS10.
[164] Modalidade 156: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS10 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS10.
[165] Modalidade 157: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS10 humano.
[166] Modalidade 158: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS10 humana.
[167] Modalidade 159: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo YS11.
[168] Modalidade 160: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo YS11.
[169] Modalidade 161: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo YS11.
[170] Modalidade 162: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS11.
[171] Modalidade 163: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS11.
[172] Modalidade 164: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS11 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS11.
[173] Modalidade 165: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de YS11 humano.
[174] Modalidade 166: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de YS11 humana.
[175] Modalidade 167: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo 3G7HY.
[176] Modalidade 168: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo 3G7HY.
[177] Modalidade 169: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo 3G7HY.
[178] Modalidade 170: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7HY.
[179] Modalidade 171: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7HY.
[180] Modalidade 172: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7HY e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7HY.
[181] Modalidade 173: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de 3G7HY humano.
[182] Modalidade 174: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de 3G7HY humana.
[183] Modalidade 175: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo 3G7NY.
[184] Modalidade 176: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo 3G7NY.
[185] Modalidade 177: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo 3G7NY.
[186] Modalidade 178: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7NY.
[187] Modalidade 179: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7NY.
[188] Modalidade 180: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7NY e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7NY.
[189] Modalidade 181: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de 3G7NY humano.
[190] Modalidade 182: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de 3G7NY humana.
[191] Modalidade 183: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo 3G7.
[192] Modalidade 184: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo 3G7.
[193] Modalidade 185: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo 3G7.
[194] Modalidade 186: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7.
[195] Modalidade 187: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7.
[196] Modalidade 188: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 3G7 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 3G7.
[197] Modalidade 189: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de 3G7 humano.
[198] Modalidade 190: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de 3G7 humana.
[199] Modalidade 191: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo SB2.
[200] Modalidade 192: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo SB2.
[201] Modalidade 193: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo SB2.
[202] Modalidade 194: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo SB2.
[203] Modalidade 195: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo SB2.
[204] Modalidade 196: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo SB2 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo SB2.
[205] Modalidade 197: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de SB2 humano.
[206] Modalidade 198: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de SB2 humana.
[207] Modalidade 199: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo 2C8.
[208] Modalidade 200: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo 2C8.
[209] Modalidade 201: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo 2C8.
[210] Modalidade 202: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 2C8.
[211] Modalidade 203: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 2C8.
[212] Modalidade 204: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo 2C8 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 2C8.
[213] Modalidade 205: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de 2C8 humano.
[214] Modalidade 206: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de 2C8 humana.
[215] Modalidade 207: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, e/ou VH CDR2, e/ou VH CDR3 do anticorpo UA8capa.
[216] Modalidade 208: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VL CDR1, e/ou VL CDR2, e/ou VL CDR3 do anticorpo UA8capa.
[217] Modalidade 209: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VLCDR2, e VL CDR3 do anticorpo UA8capa.
[218] Modalidade 210: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo UA8capa.
[219] Modalidade 211: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo UA8capa.
[220] Modalidade 212: O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o dito anticorpo compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo UA8capa e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo UA8capa.
[221] Modalidade 213: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é um scFv de UA8capa humano.
[222] Modalidade 214: O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, em que o dito anticorpo é uma IgG de UA8capa humana.
[223] Modalidade 215: Um imunoconjugado incluindo um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214 unido a um efetor em que o dito efetor é selecionado a partir do grupo que consiste em um segundo anticorpo, um marcador detectável, uma citotoxina ou agente citostático, um lipossoma contendo um fármaco, um radionuclídeo, um fármaco, um pró-fármaco, uma partícula viral, um citocina, e um quelato.
[224] Modalidade 216: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a uma citotoxina.
[225] Modalidade 217: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 216, em que o dito anticorpo é unido a uma citotoxina selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina da Difteria, uma exotoxina de Pseudomonas, uma ricina, uma abrina, saporina, e uma timidina quinase.
[226] Modalidade 218: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a um fármaco citotóxico e/ou citostático.
[227] Modalidade 219: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 216, em que o dito anticorpo é unido diretamente ou através de um ligante a um ou mais dos seguintes: o dito fármaco um lipídio ou lipossoma contendo o dito fármaco; um carreador de fármaco polimérico incluindo o dito fármaco; e um carreador de fármaco de nanopartículas incluindo o dito fármaco.
[228] Modalidade 220: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é um fármaco anticâncer.
[229] Modalidade 221: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor de microtúbulos, um agente de dano ao DNA, e um inibidor de polimerase.
[230] Modalidade 222: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 221, em que o fármaco compreende um inibidor de tubulina.
[231] Modalidade 223: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 222, em que o fármaco compreende um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em um auristatina, Dolastatina-10, derivados sintéticos do produto natural Dolastatina-10, e maitansina ou um derivado de maitansina.
[232] Modalidade 224: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 222, em que o fármaco compreende um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em Monometilauristatina F (MMAF), Auristatina E (AE), Monometilauristatina E (MMAE), vcMMAE, e vcMMAF.
[233] Modalidade 225: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 222, em que o fármaco compreende uma maitansina selecionada a partir do grupo que consiste em Mertansina (DM1), DM3, e DM4.
[234] Modalidade 226: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 221, em que o fármaco compreende um agente de dano ao DNA.
[235] Modalidade 227: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 226, em que o fármaco compreende um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em uma caliqueamicina, uma duocarmicina, e uma pirrolobenzodiazepinas.
[236] Modalidade 228: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 227, em que o fármaco compreende uma caliqueamicina ou um análogo de caliqueamicina.
[237] Modalidade 229: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 227, em que o fármaco compreende uma duocarmicina.
[238] Modalidade 230: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 229, em que o fármaco compreende uma duocarmicina selecionada a partir do grupo que consiste em duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, Ciclopropilbenzoindol duocarmicina (CC-1065), Centanamicina, Raquelmicina, Adozelesina, Bizelesina, e Carzelesina.
[239] Modalidade 231: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 227, em que o fármaco compreende uma pirrolobenzodiazepina ou um dímero de pirrolobenzodiazepina.
[240] Modalidade 232: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 231, em que o fármaco compreende um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em Antramicina (e dímeros da mesma), Mazetramicina (e dímeros da mesma), Tomaimicina (e dímeros da mesma), Protracarcina (e dímeros da mesma), Quicamicina (e dímeros da mesma), Neotramicina A (e dímeros da mesma), Neotramicina B (e dímeros da mesma), DC-81 (e dímeros da mesma), Sibiromicina (e dímeros da mesma), Porotramicina A (e dímeros da mesma), Porotramicina B (e dímeros da mesma), Sibanomicina (e dímeros da mesma), Abeimicina (e dímeros da mesma), SG2000, e SG2285.
[241] Modalidade 233: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 221, em que o fármaco compreende um inibidor de polimerase.
[242] Modalidade 234: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 233, em que o dito fármaco compreende um inibidor de poli(ADP-ribose) polimerase (PARP).
[243] Modalidade 235: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 234, em que o dito fármaco compreende um inibidor de poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) selecionado a partir do grupo que consiste em Iniparibe (BSI 201), Talazoparibe (BMN-673), Olaparibe (AZD-2281), Olaparibe, Rucaparibe (AG014699, PF-01367338), Veliparibe (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB- 290, e 3-aminobenzamida.
[244] Modalidade 236: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em auristatina, dolastatina, colquicina, combretastatina, e inibidores de mTOR/PI3K.
[245] Modalidade 237: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoruracila (5-FU), capecitabina, 5-trifluorometil-2'-desoxiuridina, metotrexato de sódio, raltitrexede, pemetrexede, citosina Arabinosídeo, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6- tioguanina (6-TG), pentostatina, fosfato de fludarabina, cladribina, floxuridina (5-fluoro-2), inibidor de ribonucleotídeo redutase (RNR), ciclofosfamida, neosar, ifosfamida, tiotepa, 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitosoureia (BCNU), 1,-(2- cloroetil)-3-ciclohexil-lnitrosoureia, metila (CCNU), hexametilmelamina, bussulfano, procarbazina HCL, dacarbazina (DTIC), clorambucila, melfalano, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, bendamustina, carmustina, clorometina, dacarbazina (DTIC), fotemustina, lomustina, manossulfano, nedaplatina, nimustina, prednimustina, ranimustina, satraplatina, semustina, estreptozocina, temozolomida, treossulfano, triaziquona, trietileno melamina, tioTEPA, tetranitrato de triplatina, trofosfamida, uramustina, doxorubicina, citrato de daunorubicina, mitoxantrona, actinomicina D, etoposídeo, topotecana HCL, teniposídeo (VM-26), irinotecana HCL (CPT-11), camptotecina, belotecana, rubitecana, vincristina, sulfato de vinblastina, tartrato de vinorelbina, sulfato de vindesina, paclitaxel, docetaxel, nanopartícula de paclitaxel, abraxane, ixabepilona, larotaxel, ortataxel, tesetaxel, e vinflunina.
[246] Modalidade 238: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida, docetaxel, doxorubicina, erlotinibe, etoposídeo, gemcitabina, mesilato de imatinibe, irinotecano, metotrexato, sorafinibe, sunitinibe, topotecana, vinblastina, e vincristina.
[247] Modalidade 239: O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 218-219, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido retinoico, um derivado de ácido retinoico, doxirubicina, vinblastina, vincristina, ciclofosfamida, ifosfamida, cisplatina, 5-fluoruracila, um derivado de camptotecina, interferon, tamoxifeno, e taxol. Em certas modalidades, o composto anticâncer é selecionado a partir do grupo que consiste em abraxane, doxorubicina, pamidronato dissódico, anastrozol, exemestano, ciclofosfamida, epirubicina, toremifeno, letrozol, trastuzumabe, megestroltamoxifeno, paclitaxel, docetaxel, capecitabina, acetato de goserelina, e ácido zoledrônico.
[248] Modalidade 240: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a um quelato incluindo um isótopo selecionado a partir do grupo que consiste em 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113In, 97Ru, 62Cu, 64lCu, 52Fe, 52Mn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, and 111Ag.
[249] Modalidade 241: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a um emissor alfa.
[250] Modalidade 242: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 241, em que o dito emissor alfa é bismuto 213.
[251] Modalidade 243: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a um lipídio ou um lipossoma complexado com ou contendo um fármaco anticâncer.
[252] Modalidade 244: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 215, em que o dito anticorpo é unido a um marcador detectável.
[253] Modalidade 245: O imunoconjugado, de acordo com a modalidade 244, em que o dito anticorpo é unido a um marcador detectável selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador radioativo, um marcador radiopaco, um marcador de MRI, e um marcador de PET.
[254] Modalidade 246: Uma formulação farmacêutica, em que a dita formulação inclui: um excipiente farmaceuticamente aceitável e um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214; e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 215-245.
[255] Modalidade 247: A formulação farmacêutica, de acordo com a modalidade 246, em que a dita formulação é uma formulação de dosagem unitária.
[256] Modalidade 248: A formulação, de acordo com qualquer uma das modalidades 246-247, em que a dita formulação é formulada para administração através de uma via selecionada a partir do grupo que consiste em administração oral, administração nasal, administração retal, injeção intraperitoneal, injeção intravascular, injeção subcutânea, administração transcutânea, e injeção intramuscular.
[257] Modalidade 249: Um método de inibição do crescimento e/ou proliferação de uma célula que expressa ou sobre-expressa CD46, o dito método incluindo: colocar em contato a dita célula de câncer com um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214; e/ou colocar em contato a dita célula de câncer com um imunoconjugado incluindo um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214 unido a um efetor que tem atividade citostática e/ou citotóxica.
[258] Modalidade 250: O método, de acordo com a modalidade 249, em que o dito método compreende colocar em contato a dita célula de câncer com um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214.
[259] Modalidade 251: O método, de acordo com a modalidade 249, em que o dito método compreende colocar em contato a dita célula de câncer com um imunoconjugado incluindo um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214 unido a um efetor que tem atividade citostática e/ou citotóxica.
[260] Modalidade 252: O método, de acordo com as modalidades 249-251, em que a dita célula é uma célula de câncer.
[261] Modalidade 253: O método, de acordo com a modalidade 252, em que a dita célula é uma célula de câncer que sobre-expressa CD46.
[262] Modalidade 254: O método, de acordo com a modalidade 252, em que a dita célula de câncer é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de rim, câncer pancreático, mesotelioma, linfoma, câncer de fígado, câncer urotelial, câncer de estômago, mieloma múltiplo, glioblastoma multiforme, glioma, neuroblastoma, e câncer de colo do útero.
[263] Modalidade 255: O método, de acordo com a modalidade 252, em que a dita célula de câncer é uma célula de câncer de próstata.
[264] Modalidade 256: O método, de acordo com a modalidade 255, em que a dita célula de câncer é uma célula de um câncer de próstata resistente à castração.
[265] Modalidade 257: O método, de acordo com a modalidade 252, em que a dita célula de câncer é uma célula de um mieloma múltiplo.
[266] Modalidade 258: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 252-257, em que a dita célula é uma célula metastática.
[267] Modalidade 259: O método, de acordo com a modalidade 258, em que a dita célula metastática é uma metástase óssea, uma metástase de fígado, uma metástase de bexiga, e/ou uma metástase linfonodal.
[268] Modalidade 260: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 252-258, em que a dita célula é uma célula de tumor sólido.
[269] Modalidade 261: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249, e 251-260, em que o dito efetor compreende um radionuclídeo e/ou um fármaco citostático.
[270] Modalidade 262: O método, de acordo com a modalidade 261, em que o dito efetor compreende um ou mais dos seguintes: um fármaco citotóxico e/ou citostático; um lipídio ou lipossoma contendo um fármaco citotóxico e/ou citostático; um carreador de fármaco polimérico incluindo um fármaco citotóxico e/ou citostático; e um carreador de fármaco de nanopartículas incluindo um fármaco citotóxico e/ou citostático.
[271] Modalidade 263: O método, de acordo com a modalidade 262, em que o dito fármaco é um fármaco anticâncer.
[272] Modalidade 264: O método, de acordo com a modalidade 263, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em auristatina, dolastatina, colquicina, combretastatina, e inibidores de mTOR/PI3K.
[273] Modalidade 265: O método, de acordo com a modalidade 263, em que o dito fármaco é monometil auristatina F.
[274] Modalidade 266: O método, de acordo com a modalidade 263, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoruracila (5-FU), capecitabina, 5-trifluorometil- 2'-desoxiuridina, metotrexato de sódio, raltitrexede, pemetrexede, citosina Arabinosídeo, 6- mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina (6-TG), pentostatina, fosfato de fludarabina, cladribina, floxuridina (5-fluoro-2), inibidor de ribonucleotídeo redutase (RNR), ciclofosfamida, neosar, ifosfamida, tiotepa, 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitosoureia (BCNU), 1,-(2- cloroetil)-3-ciclohexil-lnitrosoureia, metila (CCNU), hexametilmelamina, bussulfano, procarbazina HCL, dacarbazina (DTIC), clorambucila, melfalano, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, bendamustina, carmustina, clorometina, dacarbazina (DTIC), fotemustina, lomustina, manossulfano, nedaplatina, nimustina, prednimustina, ranimustina, satraplatina, semustina, estreptozocina, temozolomida, treossulfano, triaziquona, trietileno melamina, tioTEPA, tetranitrato de triplatina, trofosfamida, uramustina, doxorubicina, citrato de daunorubicina, mitoxantrona, actinomicina D, etoposídeo, topotecana HCL, teniposídeo (VM-26), irinotecana HCL (CPT-11), camptotecina, belotecana, rubitecana, vincristina, sulfato de vinblastina, tartrato de vinorelbina, sulfato de vindesina, paclitaxel, docetaxel, nanopartícula de paclitaxel, abraxane, ixabepilona, larotaxel, ortataxel, tesetaxel, e vinflunina.
[275] Modalidade 267: O método, de acordo com a modalidade 263, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida, docetaxel, doxorubicina, erlotinibe, etoposídeo, gemcitabina, mesilato de imatinibe, irinotecano, metotrexato, sorafinibe, sunitinibe, topotecana, vinblastina, e vincristina.
[276] Modalidade 268: O método, de acordo com a modalidade 263, em que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido retinoico, um derivado de ácido retinoico, doxirubicina, vinblastina, vincristina, ciclofosfamida, ifosfamida, cisplatina, 5-fluoruracila, um derivado de camptotecina, interferon, tamoxifeno, e taxol. Em certas modalidades, o composto anticâncer é selecionado a partir do grupo que consiste em abraxane, doxorubicina, pamidronato dissódico, anastrozol, exemestano, ciclofosfamida, epirubicina, toremifeno, letrozol, trastuzumabe, megestroltamoxifeno, paclitaxel, docetaxel, capecitabina, acetato de goserelina, e ácido zoledrônico.
[277] Modalidade 269: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 262-268, em que o dito fármaco é conjugado ao dito anticorpo.
[278] Modalidade 270: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 262-268, em que o dito fármaco está contido em um lipídio ou lipossoma unido ao dito anticorpo.
[279] Modalidade 271: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 262-268, em que o dito fármaco está contido em um carreador polimérico e/ou de nanopartículas unido ao dito anticorpo.
[280] Modalidade 272: O método, de acordo com a modalidade 249, e 251-260, em que o dito efetor compreende uma citotoxina.
[281] Modalidade 273: O método, de acordo com a modalidade 272, em que a dita citotoxina é selecionada a partir do grupo que consiste em toxina da Difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, saporina, e timidina quinase.
[282] Modalidade 274: O método, de acordo com a modalidade 249, em que o dito efetor compreende um radionuclídeo.
[283] Modalidade 275: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-274, em que o dito imunoconjugado ou anticorpo é administrado em uma composição farmacêutica incluindo um carreador farmacêutico aceitável.
[284] Modalidade 276: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-275, em que a dita administração compreende administrar a um ser humano.
[285] Modalidade 277: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-275, em que a dita administração compreende administrar a um mamífero não humano.
[286] Modalidade 278: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-277, em que a dita administração compreende administrar parenteralmente.
[287] Modalidade 279: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-277, em que a dita administração compreende administrar em um tumor ou um sítio cirúrgico.
[288] Modalidade 280: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-279, em que o dito imunoconjugado é administrado como uma terapia adjunta à cirurgia e/ou radioterapia.
[289] Modalidade 281: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 249-279, em que o dito anticorpo e/ou imunoconjugado é administrado em conjunto com um outro fármaco anticâncer e/ou um hormônio.
[290] Modalidade 282: O método, de acordo com a modalidade 281, em que o dito anticorpo e/ou imunoconjugado é administrado em conjunto com abiraterona e/ou enzalutamida.
[291] Modalidade 283: O método, de acordo com a modalidade 282, em que as ditas células compreendem células de câncer de próstata.
[292] Modalidade 284: O método, de acordo com a modalidade 283, em que as ditas células de câncer de próstata compreendem células neuroendócrinas de câncer de próstata (NEPC).
[293] Modalidade 285: O método, de acordo com a modalidade 283, em que as ditas células de câncer de próstata compreendem células metastáticas de câncer de próstata resistente à castração (mCRPC) resistentes à abiraterona (Abi) ou enzalutamida (Enz).
[294] Modalidade 286: Um método de detecção de uma célula de câncer de um câncer que expressa ou sobre-expressa CD46, o dito método incluindo: colocar em contato a dita célula de câncer com um imunoconjugado incluindo um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-214 unido a um marcador detectável; e detectar a presença e/ou localização do dito marcador detectável onde a presença e/ou localização é um indicador da localização e/ou presença de uma célula de câncer.
[295] Modalidade 287: O método, de acordo com a modalidade 286, em que o dito marcador compreende um marcador selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador radioativo, um marcador radiopaco, um marcador de MRI, um marcador de PET, e um marcador de SPECT.
[296] Modalidade 288: O método, de acordo com a modalidade 286, em que o dito marcador detectável é selecionado a partir do grupo que consiste em um emissor gama, um emissor de pósitrons, um emissor de raios X, um emissor alfa, e um emissor de fluorescência.
[297] Modalidade 289: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 286-288, em que a dita célula de câncer é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de rim, câncer pancreático, mesotelioma, linfoma, câncer de fígado, câncer urotelial, câncer de estômago, mieloma múltiplo, glioma, neuroblastoma, e câncer de colo do útero.
[298] Modalidade 290: O método, de acordo com a modalidade 289, em que a dita célula de câncer é uma célula de câncer de próstata.
[299] Modalidade 291: O método, de acordo com a modalidade 290, em que a dita célula de câncer é uma célula de um câncer de próstata resistente à castração.
[300] Modalidade 292: O método, de acordo com a modalidade 289, em que a dita célula de câncer é uma célula de um mieloma múltiplo.
[301] Modalidade 293: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 286-292, em que a dita colocação em contato compreende administrar o dito imunoconjugado a um mamífero não humano.
[302] Modalidade 294: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 286-292, em que a dita colocação em contato compreende administrar o dito imunoconjugado a um ser humano.
[303] Modalidade 295: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 286-294, em que a dita detecção compreende detectar o dito marcador in vivo.
[304] Modalidade 296: O método, de acordo com a modalidade 295, em que a dita detecção compreende usar um método de detecção selecionado a partir do grupo que consiste em raios X, PET, SPECT, MRI, e CAT.
[305] Modalidade 297: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 286-294, em que a dita detecção compreende detectar o dito marcador ex vivo em uma biópsia ou uma amostra derivada de uma biópsia.
[306] Modalidade 298: Um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo de acordo com qualquer de acordo com as modalidades 1-214.
[307] Modalidade 299: Um vetor de expressão incluindo o ácido nucleico de acordo com a modalidade 298.
[308] Modalidade 300: Uma célula incluindo o vetor de expressão de acordo com a modalidade 299.
DEFINIÇÕES
[309] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável na presente invenção para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácidos que ocorrem naturalmente. O termo inclui também variantes na ligação peptídica tradicional que une os aminoácidos que constituem o polipeptídeo.
[310] Os termos “ácido nucleico” ou “oligonucleotídeo” ou equivalentes gramaticais referidos no presente documento se referem a pelo menos dois nucleotídeos ligados covalentemente entre si. Um ácido nucleico da presente invenção é preferencialmente de cadeia simples ou de cadeia dupla e irá geralmente conter ligações de fosfodiéster, embora em alguns casos, como delineado abaixo, sejam incluídos análogos de ácido nucleico que podem ter cadeias principais alternativas, compreendendo, por exemplo, fosforamida (1993) Tetrahedron 49(10):1925) e referência aqio; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; e Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; e Patente US n° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 :2321, ligações de O- metilfoforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), e cadeias principais e ligações de ácido nucleico de peptídeo (ver Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Outros ácidos nucleicos análogos àqueles com cadeias principais positivas (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097; cadeias principais não-iônicas (Patentes US N° 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 e 4,469,863; Angew. (1991) Chem. Int. Ed. English 30:423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui e P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) e cadeias principais de não-ribose, incluindo aquelas descritas nas patentes US N° 5.235.033 e 5.034.506, e Capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui e P. Dan Cook. Ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos também são incluídos dentro da definição de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp169-176). Vários análogos de ácido nucleico são descritos em Rawls, C & E News 2 de junho de 1997 página 35. Estas modificações da cadeia principal de ribose-fosfato podem ser feitas para facilitar a adição de frações adicionais como marcadores, ou para aumentar a estabilidade e meia-vida dessas moléculas em ambientes fisiológicos.
[311] O termo “resíduo” como usado no presente documento se refere aos aminoácidos naturais, sintéticos ou modificados.
[312] Como utilizado no presente documento, um “anticorpo” se refere a uma proteína consistindo em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como uma miríade de genes da região variável da imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[313] Uma unidade estrutural típica de imunoglobulina (anticorpo) é conhecida por compreender um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par possuindo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) e uma cadeia “pesada” (cerca de 5070 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem a estas cadeias leve e pesada respectivamente.
[314] Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)’2, um dímero de Fab que por si só é uma cadeia leve unida a VH- CH1 por uma ligação dissulfeto. O F(ab)’2 pode ser reduzido em condições suaves para quebrar a ligações dissulfeto na região de dobradiça convertendo assim o dímero (Fab’)2 em um monómero Fab’. O monômero Fab’ é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (ver, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpos). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um especialista irá compreender que esses fragmentos Fab’ podem ser sintetizados novamente quer quimicamente quer utilizando metodologia de DNA recombinante. Deste modo, o termo anticorpo, como usado no presente documento, inclui também fragmentos de anticorpos produzidos pela modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados novamente utilizando metodologias de DNA recombinante. Certos anticorpos preferidos incluem anticorpos de cadeia única (anticorpos que existem como uma única cadeia polipeptídica), mais preferencialmente anticorpos Fv de cadeia única (sFv ou scFv) nos quais uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável são unidas (diretamente ou através de um ligante peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo. O anticorpo Fv de cadeia simples é um heterodímero VH-VL ligado covalentemente que pode ser expresso a partir de um ácido nucleico incluindo sequências codificadoras de VH e VL, quer ligadas diretamente quer ligadas por um ligante que codifica um peptídeo. Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Enquanto as VH e VL estão ligadas a cada uma como uma única cadeia polipeptídica, os domínios VH e VL associam-se não covalentemente. As primeiras moléculas de anticorpo funcional a serem expressas na superfície do fago filamentoso foram Fvs de cadeia única (scFv), no entanto, as estratégias de expressão alternativas também foram bem-sucedidas. Por exemplo, as moléculas Fab podem ser apresentadas em fagos se uma das cadeias (pesada ou leve) é fundida à proteína do capsídeo g3 e a cadeia complementar exportada para o periplasma como uma molécula solúvel. As duas cadeias podem ser codificadas em replicons iguais ou diferentes; o ponto importante é que as duas cadeias do anticorpo em cada conjunto de molécula Fab pós-translacionalmente e o dímero é incorporado na partícula do fago através de ligação de uma das cadeias a, por exemplo, g3p (ver, por exemplo, Patente US n°: 5733743). Os anticorpos scFv e várias outras estruturas que convertem as cadeias de polipeptídeo leves e pesadas agregadas naturalmente, mas quimicamente separadas de uma região V do anticorpo em uma molécula que se dobra em uma estrutura tridimensional substancialmente semelhante à estrutura de um sítio de ligação ao antígeno são conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, as Patentes US N° 5.091.513, 5.132.405 e 4.956.778). Os anticorpos particularmente preferidos devem incluir todos os que foram exibidos no fago (por exemplo, scFv, Fv, Fab e Fv ligado a dissulfeto (Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8:1323-1331).
[315] O termo “se liga especificamente”, como usado no presente documento, quando se refere a uma biomolécula (por exemplo, proteína, ácido nucleico, anticorpo etc.), se refere a uma reação de ligação que é determinante da presença da biomolécula em população heterogênea de moléculas (por exemplo, proteínas e outros produtos biológicos). Assim, sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio no caso de um anticorpo ou condições de hibridação rigorosas no caso de um ácido nucleico), o ligando ou anticorpo especificado se liga à sua molécula “alvo” específica e não se liga em uma quantidade significativa a outras moléculas presentes na amostra.
[316] A frase “inibição da proliferação de uma célula que expressa CD46”, como no presente documento utilizada, se refere à capacidade de um anticorpo anti-CD46 ou imunoconjugado descrito no presente documento diminuir, de preferência, diminuir estatisticamente significativamente a proliferação de uma célula que expressa CD46 em relação à proliferação na ausência do anticorpo ou imunoconjugado. Em uma modalidade, a proliferação de uma célula que expressa CD46 (por exemplo, uma célula cancerosa) pode ser diminuída em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou pelo menos 30 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 %, ou 100 %, quando as células são postas em contato com o anticorpo ou a sua porção de ligação ao antígeno ou um imunoconjugado no presente documento descrito, em relação à proliferação medida na ausência do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo ou imunoconjugado (controle). A proliferação celular pode ser ensaiada utilizando técnicas reconhecidas na técnica que medem a taxa de divisão celular, a fração das células dentro de uma população de células submetida à divisão celular e/ou taxa de perda celular de uma população celular devido à diferenciação terminal ou morte celular (por exemplo, usando um ensaio de brilho de título celular ou incorporação de timidina).
[317] A frase “inibição da migração de células que expressam CD46”, como no presente documento utilizada, se refere à capacidade de um anticorpo anti-CD46 ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo ou um imunoconjugado descrito no presente documento para diminuir, de preferência, diminuir estatisticamente significativamente a migração de uma célula que expressa CD46 em relação à migração da célula na ausência do anticorpo. Em uma modalidade, a migração de uma célula que expressa CD46 (por exemplo, uma célula cancerosa) pode ser diminuída em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou pelo menos 30 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 %, ou 100 %, quando as células são postas em contato com o anticorpo ou a sua porção de ligação ao antígeno ou imunoconjugado do mesmo, em relação à migração da célula medida na ausência do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo ou imunoconjugado do mesmo (controle). A migração celular pode ser ensaiada utilizando técnicas reconhecidas na técnica. Em várias modalidades, é contemplado que os anticorpos e/ou os seus imunoconjugados descritos no presente documento podem inibir a migração de células (por exemplo, células cancerosas como descrito no presente documento) que expressam ou sobre- expressam CD46.
[318] O termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo (ou simplesmente “porção de anticorpo”), como usado no presente documento, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, domínio 1 e/ou domínio 2 de CD46). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um dAb incluindo domínios VH e VL; (vi) um fragmento dAb (ver, por exemplo, Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vii) um dAb que consiste em um domínio VH ou VL; e (viii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) ou (ix) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem opcionalmente ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, possam ser codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma única cadeia proteica na qual os pares das regiões VL e V- formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv), ver por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser englobados no termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica e os fragmentos são triados para utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
[319] O termo “anticorpo monoclonal” como usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações naturais que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando qualquer técnica reconhecida no assunto e os descritos no presente documento, como, por exemplo, um método de hibridoma, como descrito por Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495, um animal transgênico, como descrito, por exemplo, (ver por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859), métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US N°. 4.816.567), ou usando bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628, e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanos e anticorpos humanizados e podem ocorrer naturalmente ou podem ser produzidos de forma recombinante.
[320] O termo “anticorpo recombinante” se refere aos anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina (por exemplo, genes de imunoglobulina humana) ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca recombinante de anticorpos combinatórios (por exemplo, sequências contendo anticorpo humano) usando exibição de fago, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam a divisão de sequências de genes de imunoglobulina (por exemplo, genes de imunoglobulina humana) para outras sequências de DNA. Esses anticorpos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagênese in vitro e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências V- e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpos humanos in vivo.
[321] O termo “imunoglobulina quimérica” ou anticorpo se refere a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espécie. Imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos podem ser construídos, por exemplo, por engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulina pertencentes a diferentes espécies.
[322] O termo “anticorpo humano”, como usado no presente documento, destina-se a incluir anticorpos com regiões variáveis em que ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana como descrito, por exemplo, por Kabat et al. (Ver Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH N° 91-3242). Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo “anticorpo humano”, como utilizado no presente documento, não pretende incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.
[323] O anticorpo humano pode ter pelo menos um ou mais aminoácidos substituídos por um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de aminoácido que aumenta a atividade que não é codificada pela sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana. Tipicamente, o anticorpo humano pode ter até vinte posições substituídas por resíduos de aminoácidos que não fazem parte da sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em uma modalidade específica, estas substituições estão dentro das regiões CDR como descrito em detalhe abaixo.
[324] O termo “imunoglobulina humanizada” ou “anticorpo humanizado” se refere a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma imunoglobulina humanizada ou cadeia de anticorpos (isto é, pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). O termo “cadeia de imunoglobulina humanizada” ou “cadeia de anticorpo humanizado” (isto é, uma “cadeia leve de imunoglobulina humanizada” ou “cadeia pesada de imunoglobulina humanizada”) se refere a uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo (isto é, uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) tendo uma região variável que inclui uma região de estrutura variável substancialmente a partir de uma imunoglobulina ou anticorpo humano e regiões determinantes de complementaridade (CDR) (por exemplo, pelo menos uma CDR, preferencialmente duas CDRs, mais preferencialmente três CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humano, e inclui ainda regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma região ou porção constante, no caso de uma cadeia leve, e preferencialmente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). O termo “região variável humanizada” (por exemplo, “região variável de cadeia leve humanizada” ou “região variável de cadeia pesada humanizada”) se refere a uma região variável que inclui uma região estrutural variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humano e regiões determinantes de complementaridade (CDR) substancialmente a partir de uma imunoglobulina ou anticorpo não humano.
[325] Como usado no presente documento, um “anticorpo heterólogo” é definido em relação ao organismo não humano transgênico ou planta que produz esse anticorpo.
[326] Um “anticorpo isolado”, como usado no presente documento, pretende referir-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos possuindo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD46 está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente aos antígenos diferentes de CD46). Além disso, um anticorpo isolado é tipicamente substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma modalidade, uma combinação de anticorpos monoclonais “isolados” com especificidades de ligação CD46 diferentes é combinada em uma composição bem definida.
[327] Como usado no presente documento, “isotipo” se refere à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada por genes da região constante de cadeia pesada. Em uma modalidade, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é de um isotipo selecionado de um isotipo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal da invenção é do isotipo IgG1. Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal da invenção é do isotipo IgG2.
[328] Um “antígeno” é uma entidade (por exemplo, uma entidade ou peptídeo proteáceo) à qual se liga um anticorpo ou a sua porção de ligação ao antígeno. Em várias modalidades da presente invenção, um antígeno é CD46, por exemplo, como apresentado em uma célula (por exemplo, uma célula cancerosa CD46 positiva).
[329] O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” se refere a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos por exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem técnicas na técnica e os descritos no presente documento, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[330] Também estão contemplados no presente documento anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto como os anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa descritos no presente documento. Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados utilizando técnicas de rotina como um imunoensaio, por exemplo, mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, isto é., um ensaio de ligação competitiva. A ligação competitiva é determinada em um ensaio em que a imunoglobulina sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como o domínio 1 e/ou o domínio 2 de CD46. São conhecidos vários tipos de ensaios de ligação competitiva, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al. (1983) Meth. Enzymol., 9:242); EIA de biotina- avidina direto de fase sólida (ver Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); ensaio marcado direto de fase sólida, ensaio sanduíche marcado direto de fase sólida (ver, por exemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcador de fase sólida usando, por exemplo, marcador 125I (ver, por exemplo, Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1):7); EIA de biotina- avidina direto de fase sólida (Cheung et al. (1990) Virology 176:546); e RIA marcado direto. (Moldenhauer et al. (1990) Scand J. Immunol. 32:77). Tipicamente, esse ensaio envolve o uso de antígeno purificado (por exemplo, domínio 1 e/ou domínio 2 de CD46) ligado a uma superfície sólida ou células portadoras de qualquer destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcador ligada à superfície sólida ou às células na presença da imunoglobulina de teste. Normalmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo concorrente está presente em excesso, inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 % 70-75 % ou mais.
[331] Como usado no presente documento, os termos “ligação específica”, “liga especificamente”, “ligação seletiva” e “liga seletivamente”, significam que um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, exibe afinidade apreciável por um antígeno ou epítopo particular e, geralmente, não exibe reatividade cruzada significativa com outros antígenos e epítopos. Ligação “apreciável” ou preferencial inclui a ligação com uma afinidade de pelo menos (KD igual a ou menor que) 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, ou 10-11 M. Afinidades maiores que 10-9 M, de preferência maiores que 10-10 M são mais preferenciais. Os valores intermediários daqueles no presente documento expostos também se destinam a estar dentro do escopo da presente invenção e uma afinidade de ligação preferida pode ser indicada como uma faixa de afinidades, por exemplo, 106 M a 10-11 M, preferencialmente 10-7 M ou 10-8 M a 10-10 M. Um anticorpo que “não exibe uma reatividade cruzada significativa” é aquele que não se ligará de forma apreciável a uma entidade indesejável (por exemplo, uma entidade proteica indesejável). Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína CD46 (por exemplo, domínio 1 e/ou domínio 2), mas não reagirá significativamente com outras moléculas e proteínas ou peptídeos não CD46. A ligação específica ou seletiva pode ser determinada de acordo com qualquer meio reconhecido na técnica para determinar essa ligação, incluindo, por exemplo, de acordo com a análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva.
[332] O termo “KD”, como utilizado no presente documento, pretende referir-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica ou à afinidade de um anticorpo para um antígeno. Em uma modalidade, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção se liga a um antígeno (por exemplo, domínio 1 e/ou domínio 2 de CD46) com uma afinidade (KD) de 5 nM ou melhor (isto é, ou menos), 40 nM ou 30 nM ou 20 nM ou 10 nM ou menos), como medido utilizando um ensaio de ressonância de plásmon de superfície ou um ensaio de ligação celular. Em uma modalidade específica, um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção se liga a um CD46 com uma afinidade (KD) de 5 nM ou melhor (por exemplo, 4 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1 nM ou menos), como medido por um ensaio de ressonância de plásmon de superfície ou um ensaio de ligação celular. Em outras modalidades, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo liga um antígeno (por exemplo, CD46) com uma afinidade (KD) de aproximadamente menos de 10-10 M, ou 100 x 10-11 M, ou 10 x 10-11 M, ou ainda menor usando células do tumor de próstata vivas por FACS.
[333] O termo “Koff”, como usado no presente documento, tem por objetivo se referir à dissociação constante para a dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno.
[334] O termo “EC50”, como usado no presente documento, se refere à concentração de um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo ou um imunoconjugado no presente documento descrito, que induz uma resposta, quer em um ensaio in vitro ou in vivo, que é 50 % da resposta máxima, ou seja, o meio do caminho entre a resposta máxima e a linha de base.
[335] O termo “ocorrência natural”, como usado no presente documento como aplicado a um objeto, se refere ao fato de um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência polinucleotídica que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem em laboratório é de ocorrência natural.
[336] O termo “modificar”, ou “modificação”, como usado no presente documento, pretende referir-se à alteração de um ou mais aminoácidos nos anticorpos ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos. A alteração pode ser produzida adicionando, substituindo ou eliminando um aminoácido em uma ou mais posições. A alteração pode ser produzida utilizando técnicas conhecidas, como mutagênese por PCR. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo identificado utilizando os métodos da invenção pode ser modificado, para assim modificar a afinidade de ligação do anticorpo ou a sua porção de ligação ao antígeno a CD46.
[337] Em certas modalidades “substituições de aminoácidos conservativas” nas sequências dos anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento, ou seja, modificações de sequências de nucleotídeos e aminoácidos que não anulam a ligação do anticorpo codificado pela sequência nucleotídica ou que contêm a sequência de aminoácidos, ao antígeno, por exemplo, CD46. As substituições de aminoácidos conservadoras incluem a substituição de um aminoácido em uma classe por um aminoácido da mesma classe, em que uma classe é definida por propriedades de cadeia lateral de aminoácidos físico-químicas comuns e frequências de substituição elevadas em proteínas homólogas encontradas na natureza, conforme determinado, por exemplo, por uma matriz de troca de frequência Dayhoff padrão ou matriz BLOSUM. Seis classes gerais de cadeias laterais de aminoácidos foram categorizadas e incluem: Classe I (Cys); Classe II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Classe III (Asn, Asp, Gln, Glu); Classe IV (His, Arg, Lys); Classe V (Ile, Leu, Val, Met); e Classe VI (Phe, Tyr, Trp). Por exemplo, a substituição de um Asp por outro resíduo de classe III como Asn, Gln ou Glu, é uma substituição conservadora. Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-CD46 é de preferência substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma classe. Métodos de identificação de substituições conservativas de nucleotídeos e aminoácidos que não eliminam a ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell et al. (1993) Biochem. 32:1180-1187; Kobayashi et al. (1999) Protein Eng. 12(10):879-884; e Burks et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417).
[338] O termo “substituição não-conservadora de aminoácidos” se refere à substituição de um aminoácido em uma classe por um aminoácido de outra classe; por exemplo, substituição de um Ala, um resíduo de classe II, por um resíduo de classe III como Asp, Asn, Glu ou Gln.
[339] Em outra modalidade, as mutações (conservadoras ou não conservadoras) podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma sequência codificadora de anticorpo anti-CD46, como por mutagênese por saturação, e os anticorpos modificados resultantes podem ser rastreados quanto à atividade de ligação.
[340] Uma “sequência de consenso” é uma sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleotídeos) que ocorrem com maior frequência em uma família de sequências relacionadas (ver, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha 1987). Em uma família de proteínas, cada posição na sequência de consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente naquela posição na família. Se dois aminoácidos ocorrerem com a mesma frequência, podem ser incluídos na sequência de consenso. Uma “estrutura de consenso” de uma imunoglobulina se refere a uma região de estrutura na sequência de imunoglobulina de consenso.
[341] Similarmente, a sequência de consenso para as CDR pode ser derivada por alinhamento ótimo das sequências de aminoácidos de CDR de anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento.
[342] Para os ácidos nucleicos, o termo “homologia substancial” indica que dois ácidos nucleicos, ou suas sequências designadas, quando idealmente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas, em pelo menos cerca de 80 % dos nucleotídeos, normalmente pelo menos cerca de 90 % a 95 % e mais preferencialmente pelo menos cerca de 98 % a 99,5 % dos nucleotídeos. Alternativamente, existe homologia substancial quando os segmentos hibridam sob condições de hibridação seletiva, para o complemento da cadeia.
[343] A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de homologia = # de posições idênticas/# total de posições x 100), levando em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada intervalo, que necessitam de ser introduzido para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação das sequências e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
[344] A identidade percentual entre duas sequências nucleotídicas pode ser determinada utilizando o programa GAP no software GCG, utilizando uma matriz NWSgapdna. A matriz CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos também pode ser determinada utilizando o algoritmo de Meyers e Miller (1989) CABIOS, 4:11-17, que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453 que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG, utilizando quer uma matriz Blossum 62 quer uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[345] As sequências de ácido nucleico e de proteína do no presente documento contemplado podem ainda ser utilizadas como uma “sequência de consulta” para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeos de BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteína de BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos desfasados para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utilizam programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser utilizados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST).
[346] As composições de ácido nucleico no presente documento descritas (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam a totalidade ou uma porção de um anticorpo anti- CD46 ou imunoconjugado) enquanto frequentemente em uma sequência nativa (exceto para sítios de restrição modificados e semelhantes), a partir de cDNA, genômico ou as suas misturas podem ser mutadas, de acordo com técnicas padrão para proporcionar sequências variantes. Para sequências de codificação, estas mutações podem afetar a sequência de aminoácidos como desejado. Em particular, são contempladas sequências de DNA substancialmente homólogas ou derivadas de comutadores V, D, J, constantes nativos e outras dessas sequências no presente documento descritas (onde “derivado” indica que uma sequência é idêntica ou modificada a partir de outra sequência).
[347] O termo “ligada de maneira funcional” se refere a uma sequência de ácido nucleico colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou um líder secretor está ligado de maneira funcional ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, “ligado de maneira funcional” significa que as sequências de DNA que estão ligadas são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, os adaptadores oligonucleotídicos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional. Um ácido nucleico está “ligado de maneira funcional” quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência. Em relação às sequências reguladoras de transcrição, ligado de maneira funcional significa que as sequências de DNA que estão ligadas são contíguas e, quando necessário juntam duas regiões de codificação de proteínas, contíguas e em quadro de leitura. Para sequências de comutação, ligado de maneira funcional indica que as sequências são capazes de efetuar a recombinação do comutador.
[348] O termo “vetor”, como usado no presente documento, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA circular de filamento duplo em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, deste modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de maneira funcional. Esses vetores são referidos no presente documento como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. Os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que desempenham funções equivalentes.
[349] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira), como usado no presente documento, pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. Deve-se compreender que esses termos se destinam a referir não apenas à célula do indivíduo específica, mas também a progênie dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a influências de mutação ou ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula progenitora, mas está ainda incluída no escopo do termo “célula hospedeira” como usado no presente documento.
[350] Os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento”, como usado no presente documentos, se referem às medidas terapêuticas ou preventivas no presente documento descritas. Os métodos de “tratamento” empregam a administração a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo que precisa do mesmo), um anticorpo anti-CD46 ou porção de ligação ao antígeno ou um imunoconjugado compreendendo esse anticorpo ou porção de ligação ao antígeno no presente documento descrito. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo diagnosticado com e/ou sob tratamento para um câncer CD46 positivo (por exemplo, câncer de próstata) de modo a prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas da doença ou distúrbio ou para prolongar a sobrevivência de um indivíduo além do esperado na ausência desse tratamento.
[351] Os termos “câncer” e “canceroso” se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Um câncer CD46 positivo se refere a um câncer caracterizado por células que expressam ou sobre-expressam CD46. Os cânceres CD46 ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, câncer do ovário, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer da próstata, câncer do cólon, câncer do rim e câncer pancreático.
[352] O termo “quantidade eficaz”, como usado no presente documento, se refere a essa quantidade de um anticorpo anti- CD46 ou uma sua porção de ligação ao antígeno e/ou um imunoconjugado do mesmo, que é suficiente para efetuar o tratamento, prognóstico ou diagnóstico de uma doença associada com o crescimento e/ou proliferação de células CD46 positivas (por exemplo, um câncer CD46 positivo), como no presente documento descrito, quando administrado a um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz irá variar dependendo do indivíduo e condição de doença a ser tratada, do peso e idade do indivíduo, da gravidade da condição de doença, da forma de administração e semelhantes, que pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica. As dosagens para administração podem variar, por exemplo, cerca de 1 ng a cerca de 10.000 mg, cerca de 5 ng a cerca de 9.500 mg, cerca de 10 ng a cerca de 9.000 mg, cerca de 20 ng a cerca de 8.500 mg, cerca de 30 ng a cerca de 7.500 mg, cerca de 40 ng a cerca de 7.000 mg, cerca de 50 ng a cerca de 6.500 mg, cerca de 100 ng a cerca de 6.000 mg, cerca de 200 ng a cerca de 5.500 mg, cerca de 300 ng a cerca de 5.000 mg, cerca de 400 ng a cerca de 4.500 mg, cerca de 500 ng a cerca de 4.000 mg, cerca de 1 μg a cerca de 3.500 mg, cerca de 5 μg a cerca de 3.000 mg, cerca de 10 μg a cerca de 2.600 mg, cerca de 20 μg a cerca de 2.575 mg, cerca de 30 μg a cerca de 2.550 mg, cerca de 40 μg a cerca de 2.500 mg, cerca de 50 μg a cerca de 2.475 mg, cerca de 100 μg a cerca de 2.450 mg, cerca de 200 μg a cerca de 2.425 mg, cerca de 300 μg a cerca de 2.000, cerca de 400 μg a cerca de 1,175 mg, cerca de 500 μg a cerca de 1.150 mg, cerca de 0,5 mg a cerca de 1.125 mg, cerca de 1 mg a cerca de 1,100 mg, cerca de 1,25 mg a cerca de 1.075 mg, cerca de 1.5 mg a cerca de 1.050 mg, cerca de 2.0 mg a cerca de 1.025 mg, cerca de 2,5 mg a cerca de 1.000 mg, cerca de 3,0 mg a cerca de 975 mg, cerca de 3,5 mg a cerca de 950 mg, cerca de 4,0 mg a cerca de 925 mg, cerca de 4,5 mg a cerca de 900 mg, cerca de 5 mg a cerca de 875 mg, cerca de 10 mg a cerca de 850 mg, cerca de 20 mg a cerca de 825 mg, cerca de 30 mg a cerca de 800 mg, cerca de 40 mg a cerca de 775 mg, cerca de 50 mg a cerca de 750 mg, cerca de 100 mg a cerca de 725 mg, cerca de 200 mg a cerca de 700 mg, cerca de 300 mg a cerca de 675 mg, cerca de 400 mg a cerca de 650 mg, cerca de 500 mg, ou cerca de 525 mg a cerca de 625 mg, de um anticorpo anti-CD46 descrito no presente documento e/ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, e/ou imunoconjugado do mesmo como no presente documento descrito. Os regimentos de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ideal. Uma quantidade eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais (isto é, efeitos colaterais) de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno da mesma são minimizados e/ou compensados pelos efeitos benéficos.
[353] O termo “paciente” inclui seres humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[354] Como usado no presente documento, o termo “indivíduo” inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com câncer. Em uma modalidade específica, o indivíduo é um ser humano. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis etc.
[355] Um “efetor” se refere a qualquer molécula ou combinação de moléculas cuja atividade se deseja liberar/localizar e/ou localizar na célula. Os efetores incluem, mas não estão limitados a marcadores, citotoxinas, enzimas, fatores de crescimento, fatores de transcrição, anticorpos, fármacos etc.
[356] A frase “inibição do crescimento e/ou proliferação”, por exemplo, células cancerosas inclui entre outras coisas induzir apoptose celular ou outros mecanismos de morte celular, reduzindo a invasão das células, retardando as células em um ponto no ciclo celular e semelhantes.
[357] O termo “imunoconjugado” se refere a um anticorpo ligado a um ou mais efetores ou a uma pluralidade de anticorpos ligados a um ou mais efetores. O termo “imunoconjugado” pretende incluir efetores quimicamente conjugados aos anticorpos bem como anticorpos expressos como uma proteína de fusão em que o anticorpo (ou uma parte dele) está diretamente ligado ou ligado através de um ligante a um efetor peptídico ou a um efetor compreendendo um peptídeo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[358] A Figura 1A mostra regiões de CDR e estrutura de VH para YS5 (SEQ ID NO:1), YS5F (SEQ ID NO:2), YS5vlD (SEQ ID NO:3), SB1HGNY (SEQ ID NO:4), YS12 (SEQ ID NO:5), 3G7RY (aka 3G8) (SEQ ID NO:6), YS6 (SEQ ID NO:7), YS1 (SEQ ID NO:8), YS3 (SEQ ID NO:9), YS4 (SEQ ID NO:10), YS8 (SEQ ID NO:11), YS7 (SEQ ID NO:12), YS9 (SEQ ID NO:13), YS10 (SEQ ID NO:14), YS11 (SEQ ID NO:15), 3G7HY (SEQ ID NO:16), 3G7NY (SEQ ID NO:17), 3G7 (SEQ ID NO:18), SB2 (SEQ ID NO:19), 2C8 (SEQ ID NO:20), e UA8capa (SEQ ID NO:21). Figura. 1B mostra regiões de CDR e estrutura de VL para YS5 (SEQ ID NO:22), YS5F (SEQ ID NO:23), YS5vlD (SEQ ID NO:24), SB1HGNY (SEQ ID NO:25), YS12 (SEQ ID NO:26), 3G7RY (aka3G8) (SEQ ID NO:27), YS6 (SEQ ID NO:28), YS1 (SEQ ID NO:29), YS3 (SEQ ID NO:30), YS4 (SEQ ID NO:31), YS8 (SEQ ID NO:32), YS7 (SEQ ID NO:33), YS9 (SEQ ID NO:34), YS10 (SEQ ID NO:35), YS11 (SEQ ID NO:36), 3G7HY (SEQ ID NO:37), 3G7NY (SEQ ID NO:38), 3G7 (SEQ ID NO:39), SB2 (SEQ ID NO:40), 2C8 (SEQ ID NO:41), e UA8capa (SEQ ID NO:42).
[359] Figura 2. Medição de KD de YS5 IgG1 em células Du- 145. YS5 foi incubado com células Du-145 a 4 °C de um dia para o outro e a ligação foi analisada por FACS. Valores médios de intensidade de fluorescência (MFI) foram ajustado por curva com o uso de Prism (GraphPad) para gerar um valor de KD estimado de 2,19+/- 0,73 nM.
[360] Figura 3. Medição de KD de YS12 IgG1 em células Du- 145. YS12 foi incubado com células Du-145 a 4 °C de um dia para o outro e a ligação foi analisada por FACS. Valores de MFI foram ajustados por curva com o uso de Prism (GraphPad) para gerar um valor de KD estimado de 0,043+/- 0,019 nM.
[361] Figura 4. Nossos anticorpos anti-CD46 se ligam, ambos, a CD46 de humano e macaco cinomolgo. Análises de FACS foram realizadas em células de CHO transfectadas com CD46 de humano (painel à esquerda) e de macaco cinomolgo (painel à direita). O resultado para YS5 é mostrado, mas todos os nossos anticorpos se ligam, ambos, a CD46 de humano e de cinomolgo. Ctr IgG: uma IgG1 de humano não ligante. Ctr: CHO coradas com anticorpos secundários apenas.
[362] Figura 5. Medição de KD de YS5 em células de CHO transfectadas com CD46 de humano. YS5 foi incubado com células de CHO-huCD46 a 4 °C de um dia para o outro e a ligação foi analisada por FACS. Valores de MFI foram ajustados por curva com o uso de Prism (GraphPad) para gerar um valor de KD estimado de 0,867+/- 0,299 nM.
[363] Figuras 6. Medição de KD de YS5 em células de CHO transfectadas com CD46 de macaco cinomolgo. YS5 foi incubado com Células de CHO-cinoCD46 a 4 °C de um dia para o outro e a ligação foi analisada por FACS. Valores de MFI foram ajustados por curva com o uso de Prism (GraphPad) para gerar um valor de KD estimado de 1,952+/- 0,508 nM.
[364] Figuras 7. Mapeamento de epítopos por ensaio de competição. A ligação de FACS em células Du145 com ou sem UA20Fc como um concorrente. UA20Fc versus UA20Fc serve como um controle para a competição completa. YS5, YS12 e 3G8 (isto é, 3G7 aka 3G8) mostrou um padrão de competição diferente do que o de SB1HGNY, definindo assim dois grupos com epítopos não sobrepostos.
[365] Figuras 8. Competição com a proteína H do vírus do sarampo de cepa de Edmonston. A ligação de anticorpos a células Du-145 na presença ou ausência de excesso de fusão de Fc-proteína H recombinante foi medida por FACS. Proteína H-Fc versus proteína H-Fc foi feita como um controle positivo (competição total), contra o qual os valores de MFI foram normalizados para gerar o índice de competição normalizado. Um anticorpo de ligação a células Du-145 e não ligante a CD46 foi usado como controle negativo (ausência de competição).
[366] Figura 9. Internalização por macropinocitose. YS5 IgG1 foi incubada com a linhagem de células Du-145 de câncer de próstata metastático resistente à castração juntamente com o indicador de macropinocitose ND70-TRITC (Life Technologies) durante 4h e 24h respectivamente. A co- localização foi analisada por microscopia confocal com fluorescência Olympus.
[367] Figura 10. Estudo imuno-histoquímico de anticorpos anti-CD46 no painel padrão de FDA de tecidos congelados para avaliação de anticorpos terapêuticos. O sombreamento indica níveis de coloração positiva, sendo os trofoblastos placentários os mais fortes. Os sinais na área não sombreada são fracos ou não detectáveis.
[368] Figura 11. Análise por HPLC de conjugados de fármaco de anticorpo anti-CD46. YS5 IgG1 foi conjugada com monometil auristatina (MMAF) via ligante mc-vc-pab e analisada por HIC. O número acima dos picos indica o número de moléculas de fármaco. Em média, cerca de três moléculas de fármaco foram conjugadas com uma molécula de IgG.
[369] Figura 12. Curva de morte para linhagens de células de câncer de próstata LNCaP-C4-2b.
[370] Figura 13. Curva de morte de anti-CD46 ADC (YS5) sobre a linhagem de células de câncer de próstata metastático resistente à castração Du-145.
[371] Figura 14. Morte de tumores in vivo por anti-CD46 (YS5) ADC utilizando modelos de xenoenxerto de câncer de próstata subcutâneos. As células LNCaP-C4-2B foram implantadas subcutaneamente em camundongos SCID. A injeção começou no dia 12 com 5 mg/kg de ADC e quatro injeções foram administradas (a cada 4-5 dias). Os camundongos no grupo anti-CD46 ADC estão sendo monitorados durante um período prolongado de pós-tratamento. N = 6.
[372] Figura 15. CD46 é altamente expresso na linhagem de células de mieloma múltiplo RPMI8226. O anticorpo anti- CD46 se liga tanto ao câncer de próstata (LNCaP) como a células de mieloma múltiplo enquanto o anticorpo anti-PSMA J591 se liga apenas a células de câncer de próstata.
[373] Figura 16. Anti-CD46 ADC (YS5) mata as células RPMI8226 in vitro. Ctr ADC: uma IgG1 humana não ligante conjugada com MMAF.
[374] Figura 17. Atividade de anti-CD46 (YS5) ADC in vivo. As células de RPMI8226-Luc foram injetadas i.v. em camundongos NSG para criar xenoenxerto de tumor disseminado. CD46-MMAF: YS5 ADC; IgG-MMAF: controle ADC. Um total de 4 injeções foram administradas a cada 4 dias. O tratamento começou no dia 10. Três camundongos no grupo tratado com bortezomib não duraram até o dia 31.
[375] Figura 18. Análise de Kaplan-Meier de dados de sobrevivência para camundongos que transportam o xenoenxerto RPMI8226 após tratamento com ADC YS5.
[376] Figura 19. Curva de morte de anti-CD46 (YS5) ADC sobre a linhagem de células de câncer colorretal HT29.
[377] Figura 20. anti-CD46 ADC (YS5) em xenoenxerto MM1S.
[378] Figura 21. Análise de Kaplan-Meier de camundongos portadores de xenoenxertos MM1.S ortometastáticos após tratamento com ADC. 100 % dos camundongos tratados com 4 mg/kg de ADC anti-CD46 sobreviveram até o final da experiência (dia 212). A injeção começou no dia 10 após implante. O anti-CD46 foi injetado numa dose única de 4 mg/kg ou 4 vezes em dois níveis de dosagem (0,8 mg/kg e 4 mg/kg). O ADC de controle (Ctr ADC) foi injetado 4 vezes a 4 mg/kg.
[379] Figura 22. Curva de morte de anti-CD46 (YS12) ADC sobre a linhagem de células de câncer colorretal HT29.
[380] Figura 23. Curva de morte do anti-CD46 (SB1HGNY) ADC sobre a linhagem de células de câncer colorretal HT29.
[381] Figura 24. Curva de morte de anti-CD46 YS5 ADC sobre a linhagem de células de câncer pancreático MiaCaPa2.
[382] Figura 25. Curva de morte do anti-CD46 YS5 ADC sobre linhagem de células de mesotelioma M28.
[383] Figura 26. Curva de morte de anti-CD46 YS5 ADC sobre a linhagem de células de câncer do ovário OVCAR3.
[384] Figura 27. ADC anti-CD46 não tem efeito sobre as células BPH-1. As células BPH-1 expressam níveis muito baixos de CD46 e não são afetadas pelo ADC YS5.
[385] Figura 28. ADC Anti-CD46 (YS5) em células HS27. As células Hs27 foram semeadas a 3.000 células por cavidade.
[386] Figura 29. ADC anti-CD46 (YS5) apresenta pouca toxicidade nas células T CD3+ normais. 10.000 células T CD3+ foram semeadas em placas de 96 cavidades e incubadas com concentrações variáveis de ADCs YS5 a 37 °C durante 96 h. A viabilidade celular foi avaliada por CCK-8 (Kit de contagem de células-8) (Dojindo).
[387] Figura 30. ADC anti-CD46 não tem efeito sobre PBMCs esgotadas de CD14 normais. 10.000 células foram semeadas em placas de 96 cavidades, e incubadas com concentrações variáveis de ADC a 37 °C durante 98H. A viabilidade celular foi determinada pelo kit de contagem CCK8.
[388] Figura 31. Avaliação de toxicidade de ADC anti- CD46 em camundongos transgênicos que expressam CD46 de humano. Após injeção i.v. de 6 mg/kg de anti-CD46 e ADC de controle, os camundongos foram acompanhados durante 14 dias, sacrificados e os principais órgãos colhidos para exames histológicos.
[389] Figura 32 mostra que ADC CD46 é eficaz no modelo de xenoenxerto de câncer de próstata intrafemoral. A linhagem de células mCRPC LnCaP-C4-2B que transportou um repórter de luciferase de pirilampo foi injetada no fémur de camundongos. ADC CD46 (YS5-mcvcpab-MMAF) foi injetado no dia 7 a cada 4 dias para um total de 4 injeções. Os camundongos foram monitorados após o tratamento até o dia 65. ADC Ctr: uma IgG1 não ligada conjugada com MMAF (ctr IgG-mcvcpab-MMAF).
[390] Figura 33 ilustra a expressão de CD46 no câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Os espécimes de tecido de próstata foram retirados de pacientes que se tornaram resistentes ao bloqueio hormonal. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[391] Figura 34 ilustra metástase óssea de mCRPC. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[392] Figura 35 ilustra a metástase dos nódulos linfáticos de mCRPC. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[393] Figura 36 ilustra metástase da bexiga de mCRPC. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[394] Figura 37 mostra que o CD46 é altamente expresso pela linhagem de células neuroendócrinas do câncer de próstata H660. Painel à esquerda: análise FACS. Ctr: mAb não ligante. Painel à direita: A análise por Western blot confirma a expressão de CD46 e a expressão do marcador neuroendócrino NSE pelas células H660.
[395] Figura 38. Mostra internalização do anticorpo anti- CD46 pela linhagem de células neuroendócrinas de câncer de próstata H660. YS5 IgG1 foi incubada com células H660 de um dia para o outro. As células foram fixadas, permeadas, coradas e obtidas por microscopia confocal. Uma única fatia confocal é mostrada. O anticorpo anti-CD46 é internalizado e co-localizado com LAMP1, o marcador de lisossoma.
[396] Figura 39 mostra que ADC CD46 mata células H660. A concentrações variáveis de ADC CD46 (YS5-mcvcpab-MMAF) foram incubadas com a linhagem de células neuroendócrina H660 a 37°C durante 7 dias. O ensaio de Calceína AM foi usado para avaliar a viabilidade. Ctr ADC: uma IgG1-mcvcpab-MMAF não ligante.
[397] Figura 40 mostra que o tratamento da linhagem de células de câncer de próstata metastático resistente à castração LNCaP-C4-2B com 10 μM de abiraterona (ABI) durante 7 dias causou a suprarregulação da expressão de CD46 na superfície celular como medido por FACS. MFI: intensidade média de fluorescência.
[398] Figura 41. Mostra que as células LNCaP C4-2B tratadas com abiraterona (Abi) são mais sensíveis a ADC CD46. As células LNCaP-C4-2B foram incubadas com abiraterona durante 7 dias, lavadas e continuaram incubadas com ADC CD46 em meio que não continha abiraterona durante mais 96 horas. C4-2B_CD46 ADC: células LNCaP C4-2B incubadas com ADC CD46 (YS5-mcvcpab-MMAF) sem exposição prévia a abiraterona (EC50 = 169 pM). Células C4-2B ABI_CD46 ADC: LNCaP com exposição prévia a abiraterona incubadas com ADC CD46 (EC50 = 21 pM). Ctr ADC: uma IgG1 não ligada conjugada com MMAF.
[399] Figura 42 ilustra a suprarregulação da superfície celular CD46 na linhagem de células neuroendócrinas H660 após tratamento com enzima (ENZ). As células H660 foram tratadas com enzalutamida 10 μM durante 7 dias e analisadas por FACS para expressão de antígeno de superfície celular. O CD46 é altamente expresso por H660, enquanto o antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) é apenas detectável. Além disso, a exposição a enzalutamida causou uma suprarregulação da expressão de CD46 na superfície das células tumorais. MFI: intensidade média de fluorescência.
[400] Figura 43 mostra que o CD46 é altamente expresso no câncer colorretal primário. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America). As imagens foram tiradas usando um microscópio digital em dois níveis de amplificação (4x e 20x).
[401] Figura 44 mostra que CD46 é altamente expresso em câncer colorretal metastatizado para o fígado. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America). As imagens foram tiradas usando um microscópio digital em dois níveis de amplificação (4x e 20x).
[402] Figura 45 mostra que CD46 é altamente expresso em câncer colorretal metastatizado para o nódulo linfático. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America). As imagens foram tiradas usando um microscópio digital em dois níveis de amplificação (4x e 20x).
[403] Figura 46 mostra que o CD46 é altamente expresso no câncer colorretal metastatizado para a bexiga. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America). As imagens foram tiradas usando um microscópio digital em dois níveis de amplificação (4x e 20x).
[404] Figura 47 mostra que CD46 é altamente expresso em mesotelioma como demonstrado por imuno-histoquímica de coloração com CD46 em mesotelioma. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[405] Figura 48 mostra que CD46 é altamente expresso em câncer pancreático. As setas indicam células tumorais (apenas regiões tumorais seletivas são indicadas). O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[406] Figura 49 mostra que o CD46 é superexpresso por glioblastoma multiforme (GBM) como ilustrado pela análise imuno-histoquímica da coloração com CD46 em GBM e cérebro normal. Nenhuma coloração de CD46 foi observada no cérebro humano normal, mas observou-se forte coloração em amostras de GBM. O anticorpo CD46 anti-humano de coelho H-294 (Santa Cruz Biotechnology) foi usado para a coloração, seguido pela detecção com o sistema Envision+ (Dako North America).
[407] Figura 50 ilustra a inibição in vivo de crescimento de xenoenxerto de mesotelioma (M28) por ADC CD46. YS5- mcvcpab-MMAF foi injetado a cada 3-4 dias a 5 mg/kg durante um total de 5 vezes (indicado por setas). Os volumes de tumor foram medidos por paquímetro. YSC10 é uma IgG1 humana não ligante de controle.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[408] Em várias modalidades, são fornecidos vários novos anticorpos anti-CD46. Os anticorpos prototípicos descritos no presente documento foram identificados por uma combinação de seleções na superfície celular e CD46 recombinante utilizando técnicas de exibição de fagos e de leveduras. Estes anticorpos são internalizados pela via de macropinocitose seletiva do tumor, sem a necessidade de reticulação e localiza-se nos lisossomas, o que os torna bem adequados para o desenvolvimento de conjugados de fármacos e anticorpos (ADCs) e outros agentes terapêuticos alvos que utilizam a liberação de carga útil intracelular.
[409] Os anticorpos descritos no presente documento são anticorpos que se ligam aos domínios 1 e 2 da molécula CD46, não aos domínios de ligação ao complemento principais 3 e 4, e assim não bloqueiam diretamente a cascata do complemento normal.
[410] O mapeamento de epítopos finos também mostrou diferenças nos sítios de contato com antigênico entre os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento e os anticorpos UA20 e 2B10 descritos no Pedido de Patente PCT n° PCT/US2008/076704 e no Pedido de Patente US copendente US 14/205101 respectivamente. Testados em células de CHO transfectadas com cDNA de CD46 de macaco cinomolgo, verificou-se que os nossos anticorpos anti-CD46 se ligam a um epítopo conservado entre macaco cinomolgo e humano, identificando assim uma espécie apropriada para estudo de toxicologia reguladora.
[411] Usando o painel de tecido humano congelado aprovado pela FDA para a avaliação de anticorpos terapêuticos, verificou-se que os epítopos de CD46 ligados por anticorpos aos anticorpos descritos no presente documento são expressos em níveis baixos em praticamente em nenhum tecido exceto para trofoblastos placentários e, em menor grau, no epitélio prostático. Por outro lado, determinou-se que CD46 é superexpresso por uma variedade de tumores incluindo, mas não se limitando a, câncer de próstata, mieloma múltiplo, câncer colorretal, câncer pancreático, mesotelioma, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do ovário, câncer do fígado, glioma, neuroblastoma etc.
[412] Dado que o CD46 está localizado no cromossoma 1q32.2, e o ganho de 1q foi observado num amplo espectro de cânceres humanos, é provável que seja um excelente alvo para o desenvolvimento da terapia de anticorpos para várias malignidades. Os conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs) utilizando os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento foram construídos e verificou-se que eles matam linhagens de células de câncer que superexpressam CD46 in vitro incluindo, mas não se limitando a, câncer de próstata metastático resistente à castração, mieloma múltiplo, câncer colorretal, mesotelioma, câncer do ovário etc. Mais importante ainda, os ADCs anti-CD46 descritos no presente documento se mostraram potentes na atividade antitumoral in vivo, reduzindo significativamente as cargas de tumor em modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistentes à castração e mieloma múltiplo. Acredita-se que esta potente atividade antitumoral seja aplicável a outros modelos de tumores que superexpressam CD46 também. Os estudos descritos no presente documento validam, assim, CD46 como um antígeno de superfície de células tumorais útil para o desenvolvimento terapêutico alvo. Adicionalmente, os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento podem ser usados em diagnósticos complementares para estratificação de pacientes e monitoramento de resultados de tratamento.
[413] Em vista destas descobertas, acredita-se que os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento se ligam especificamente e são internalizados em células que expressam ou superexpressam CD46. Como o CD46 é expresso/superexpresso por vários tipos de câncer incluindo, mas não se limitando a câncer do ovário, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer de próstata, câncer do cólon, câncer do rim, mesotelioma do câncer pancreático, linfoma, câncer do fígado e câncer do colo do útero, estes anticorpos podem ser usados para direcionar e se internalizar especificamente nestas e em outras células cancerosas CD46 positivas.
[414] Em certas modalidades, estes anticorpos podem ser usados sem efetores fixos para a sua atividade citotóxica e/ou citostática e/ou antiproliferativa intrínseca em células (particularmente células de câncer). Em certas modalidades estes anticorpos podem ser ligados a um ou mais efetores (por exemplo, segundo anticorpo, um marcador detectável, uma citotoxina, um lipossoma contendo um fármaco, um radionuclídeo, um fármaco, um pró-fármaco, uma partícula viral, uma citocina, um quelato etc.) para assim formar um imunoconjugado que se ligará e internalizará especificamente em células cancerosas que expressam ou superexpressam CD46. Em determinadas modalidades, vários efetores serão fixos a um único anticorpo, ou em certas modalidades, vários anticorpos serão fixos a um único efetor, ou em certas modalidades, um único anticorpo será fixo a um único anticorpo.
[415] Em várias modalidades são fornecidos métodos de uso destes anticorpos e/ou imunoconjugados. Em certas modalidades dos métodos envolvem o contato de uma célula que expressa ou superexpressa CD46 (por exemplo, uma célula de câncer, tais como uma célula de câncer do ovário, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer do rim, uma célula de câncer do pâncreas, etc.) com o construto resultando na internalização do construto (ou uma porção do mesmo) na célula e, desse modo, fornecendo o efetor para célula alvo. Em certas modalidades o "contato" compreende administrar o anticorpo ou o construto a um sujeito (por exemplo, um ser humano ou um mamífero não humano) que precisa do mesmo.
Anticorpos que se ligam a CD46
[416] Foram descobertos anticorpos que se ligam especificamente a CD46, em particular, os domínios 1 e/ou 2, e que são internalizados pela próstata (e outras células de câncer positivas para CD46) in situ, por exemplo, quando a célula cancerígena está no microambiente do tecido. Tal como indicado acima, tais anticorpos são úteis para direcionar cânceres quando usados sozinhos, ou quando ligados a um efetor para formar um "efetor alvo".
[417] Assim, em certas modalidades, um anticorpo isolado que é fornecido o qual se liga especificamente a CD46 e que é internalizado em uma célula que expressa ou superexpressa CD46 (por exemplo, uma célula de câncer de próstata) através de macropinocitose. Em várias modalidades, o anticorpo se liga ao domínio 1 e/ou ao domínio 2 de CD46. Em várias modalidades, o anticorpo não se liga ao domínio 3 e/ou ao domínio 4 de CD46.
[418] Os anticorpos designados no presente documento como YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e UA8capa (ver, por exemplo, Tabela 1) são anticorpos prototípicos ilustrativos. Em certas modalidades os anticorpos que compreendem CDR1 de VL e/ou CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL e/ou CDR1 de VH e/ou CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um ou mais destes anticorpos são contemplados. Em certas modalidades os anticorpos que compreendem o domínio de VH e/ou o domínio de VL de um ou mais destes anticorpos são contemplados. São também contemplados os anticorpos que competem pela ligação a CD46 com um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa.
[419] As sequências de aminoácidos dos domínios de anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa são mostradas na Tabela 1 (ver Exemplo 1). Tabela 1. Novas sequências de anticorpo anti-CD46 humano. YS5 e YS5F diferem por um aminoácido em CDR1 de VH (L versus F). YS5 e YS5vlD têm VH idêntica, mas uma diferença de aminoácidos em CDR2 de VL (N versus D). 3G7HY, 3G7NY, 3G7RY (aka 3G8) e 3G7 têm uma diferença de resíduo em CDR3 de VH, mas VLs inteiramente diferentes. YS6 e 3G7 têm VH idêntico, mas VL diferente.
[420] Em várias modalidades os anticorpos no presente documento contemplados excluem expressamente os anticorpos que compõem as três CDRs de VH e/ou as três CDRs de VL dos anticorpos 3051.1, G12FC3, M6c42b, 4F3YW, M40pr146, UA20, UA8, 585II41, 585II41.1, 585II56, 3076, 3051, M49R, RCI-14, II79_4, II79_3, T5II-4B.1, T5II-4B.2, RCI-11, RCI-20, CI- 11A, CI-14A, S95-2 que estão descritos no documento PCT/US2008/076704 (WO 2009/039192) e/ou o anticorpo mPA7. As sequências de aminoácidos das cadeias de VH e de VL destes anticorpos e as CDR compreendendo estes domínios estão apresentadas no documento PCT/US2008/076704 e as sequências de aminoácidos destes domínios são reproduzidas a seguir na Tabela 2. Tabela 2. Anticorpos excluídos. A sequência mostrada abaixo são anticorpos scFv (as regiões de VL e de VH ligadas por um ligante (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:43), no entanto, será reconhecido que outras formas de anticorpo compreendendo as CDR (ou domínios de VH e/ou de VL) são igualmente excluídas
[421] Utilizando as sequências de aminoácidos previstas os anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e UA8capa, numerosas formas de anticorpos podem ser preparadas, por exemplo, como descrito abaixo. Tais formas incluem, mas não se limitam a uma imunoglobulina (por exemplo, de comprimento completo) substancialmente intacta (por exemplo, uma IgA, IgE, IgG e semelhantes), um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fv, Fab, (Fab')2, (Fab’)s, IgGΔCH2, um minicorpo, e semelhantes), um anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv), um diacorpo, um monobloco, uma aficorpo e semelhantes.
[422] Será reconhecido que, quando os anticorpos são anticorpos de cadeia simples, os domínios de VH e VL que compreendem tais anticorpos podem ser ligados diretamente uns aos outros ou por um ligante peptídico. Ligantes peptídicos ilustrativos incluem, mas não se limitam a, GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO:43), GGGGS GGGGS (SEQ ID NO:67), GGGGS (SEQ ID NO:68), GS GGGGS GGS GGGGS (SEQ ID NO:69), SGGGGS (SEQ ID NO:70), GGGS (SEQ ID NO:71), VPGV (SEQ ID NO:72), VPGVG (SEQ ID NO:73), GVPGVG (SEQ ID NO:74), GVG VP GVG (SEQ ID NO:75), VP GVG VP GVG (SEQ ID NO:76), GGSSRSS (SEQ ID NO:77), e GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:78), e semelhantes.
[423] Tal como acima indicado, em várias modalidades, o anticorpo se liga (por exemplo, se liga especificamente a CD46 (por exemplo, domínios 1 e/ou 2). Tipicamente, os anticorpos no presente documento contemplado irão se ligar especificamente a células de câncer de próstata, incluindo, mas não se limitando a, células de um a linhagem de células selecionada do grupo que consiste em células DU145, células PC3, e células LnCaP. Em certas modalidades, o anticorpo se liga a uma célula de tumor da próstata com uma afinidade maior do que (KD menor que) cerca de 5 nM quando medido em células de tumor da próstata por FACS. Em certas modalidades, a afinidade é maior do que (KD menor que) cerca de 1 nM, ou a cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM, ou cerca de 10 pM, ou cerca de 1 pM.
[424] Utilizando a informação da sequência no presente documento fornecida anticorpos compreendendo uma ou mais das CDRs compreendendo, por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e UA8capa, ou anticorpos compreendendo o(s) domínio(s) de VH e/ou de VL destes anticorpos podem ser facilmente preparados utilizando métodos convencionais (por exemplo, métodos de síntese química e/ou métodos recombinantes de expressão) bem conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, como descrito abaixo.
[425] Além disso, outros anticorpos específicos de câncer de próstata "relacionadas" podem ser identificados por rastreio de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo (por exemplo, que competem com um ou mais dos anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa para se ligar a CD446 e/ou a uma célula que expressa ou superexpressa CD46, por exemplo, uma célula de câncer de próstata) e/ou por modificação dos anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa no presente documento identificados para produzir bibliotecas de anticorpos modificados e, em seguida, rastreando novamente os anticorpos na biblioteca quanto a ligação melhorada e/ou internalização em células que expressam ou superexpressam CD46, por exemplo, células de câncer de próstata.
Identificação de outros anticorpos que se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s) de CD46 como YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa.
[426] Tendo identificado CD46, especialmente os domínios um e/ou dois como um alvo de anticorpos útil e anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e UA8capa como anticorpos prototípicos úteis, outros anticorpos "relacionados" que se ligam a CD46 e, de preferência, que são internalizados através de macropinocitose podem ser prontamente identificados por rastreio de anticorpos que se ligam aos domínios 1 e/ou 2 de CD46, por exemplo, através do aumento (por exemplo, anticorpos monoclonais) que se ligam especificamente aos domínios 1 e/ou 2 de CD46. Além disso, ou em alternativa, outros anticorpos que se ligam a CD46 e que são internalizados por macropinocitose podem ser identificados por rastreio para anticorpos que reagem de forma cruzada com um ou mais dos anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa, por exemplo, no epítopo ligado por YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa, e para anticorpos que reagem de forma cruzada com um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa para a ligação a uma célula de câncer de próstata (por exemplo, as células CaP, células PC3, etc.), e/ou com um anticorpo idiotípico produzido contra anticorpo YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa.
Anticorpos monoclonais.
[427] Os anticorpos monoclonais que se ligam aos domínios 1 e/ou 2 de CD46, de preferência, de ligação ao epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa podem ser produzidos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas, tais como a técnica de hibridação de células somáticas padrão descrita por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnica de exibição em fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos humanos. Em modalidades particulares, os anticorpos são anticorpos monoclonais completamente humanos.
[428] Assim, em uma modalidade, um método do hibridoma é usado para produzir um anticorpo que se liga a CD46, de preferência, ligação ao domínio 1 e/ou domínio 2 de CD46. Neste método, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado pode ser imunizado com um antígeno adequado de modo a induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se irão ligar especificamente ao antígeno usado para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos podem ser fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Depois de identificadas, as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos padrões (Id.). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites num animal. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados a partir do meio de cultura, fluido de ascites, ou soro, por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[429] Em uma outra modalidade, os anticorpos e porções de anticorpos que se ligam aos domínios 1 e/ou 2 de CD46 podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos geradas utilizando as técnicas descritas em, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554, Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628, Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597, Hoet et al (2005) Nature Biotechnol., 23: 344-348; Patentes US N° 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al. ; Patentes US N° 5.427.908 e 5.580.717 de Dower et al. ; Patentes US N° 5.969.108 e 6.172.197 de McCafferty et al.; e Patentes US N° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 de Griffiths et al.Além disso, a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (faixa de nM) por embaralhamento de cadeia (Marcas et al. (1992) Bio/Technology, 10: 779-783), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al. (1993) Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266) podem também ser usadas.
[430] Em uma modalidade particular, o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a CD46, de preferência, ligando-se ao epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa é produzido utilizando a técnica de exibição em fagos descrita por Hoet et al., Supra. Esta técnica envolve a geração de uma biblioteca de Fab humano que tem uma combinação única de sequências de imunoglobulinas isoladas a partir de doadores humanos e um anticorpo tendo diversidade sintética nas CDR de cadeia pesada é gerado. A biblioteca é então rastreada para os Fabs que se ligam a CD46, de preferência, que competem para a ligação com um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa.
[431] Em ainda outra modalidade, os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CD46, de preferência, compreendendo o epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo (ver, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg e Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, Harding e Lonberg (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 764: 536-546, e Patentes US N° 5, 545, 806; 5, 569, 825; 5, 625, 126; 5, 633,425; 5, 789, 650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; e 5,770,429; todas de Lonberg e Kay; Patente US n° 5,545,807 de Surani et al.; Publicação PCT N° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos de Lonberg e Kay; e Publicação PCT n° WO 01/14424 de Korman et al.).
[432] Em uma outra modalidade, os anticorpos humanos dirigidos contra o CD46, de preferência, que se ligam a epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa pode ser criado usando um camundongo que transporta sequências de imunoglobulinas humanas em transgenes e transcromossomas, tais como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada de humano e um transcromossoma cadeia leve de humano (ver, por exemplo, a publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al.).
[433] Os sistemas animais transgênicos alternativos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti- CD46 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo chamado de XenoMouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais como os camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes N° 5.939.598.; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 de Kucherlapati et al.
[434] Os sistemas animais transcromossômicos alternativos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-CD46 no presente documento contemplados. Por exemplo, os camundongos que transportam tanto um transcromossoma humano de cadeia pesada como um transcromosoma humano de cadeia leve podem ser usados; tal como descrito em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Além disso, vacas que transportam transcromossomas humanos de cadeia pesada e leve têm sido descritas na técnica (ver, por exemplo, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894) e podem ser usadas para produzir os anticorpos anti-CD46 CCP1.
[435] Em ainda outra modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente a CD46, de preferência, que se ligam ao epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa podem ser preparados utilizando uma planta transgênica e/ou células de plantas cultivadas (tais como, por exemplo, tabaco, milho e lentilha) que produzem tais anticorpos. Por exemplo, as folhas de tabaco transgênicas que expressam anticorpos ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser usadas para produzir tais anticorpos, por exemplo, utilizando um promotor indutível (ver, por exemplo, Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118). Além disso, o milho transgênico pode ser usado para expressar tais anticorpos e porções de ligação de antígeno dos mesmos (ver, por exemplo, Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147). Os anticorpos também podem ser produzidos em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas, incluindo porções de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia simples (scFv’s), por exemplo, com o uso de sementes de tabaco e tubérculos de batata (ver, por exemplo, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109). Métodos de produção de anticorpos ou porções de ligação ao antígeno em plantas podem também ser encontrados em, por exemplo, Fischer et al. (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108, Ma et al. (1995) Trends Biotechnol. 13: 522-527, Ma et al. (1995) Plant Physiol. 109: 341-346; Whitelam et al. (1994) Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944, e Patentes US N°. 6.040.498 e 6.815.184.
[436] A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais ou porções dos mesmos que se ligam a CD46, de preferência que se ligam ao epítopo ligado por um ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa preparados utilizando qualquer técnica, incluindo aquelas no presente documento descritas, pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). A afinidade de ligação de um anticorpo monoclonal ou uma porção do mesmo também pode ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et al. (1980) Anal. Biochem., 107:220.
Reatividade cruzada com anticorpos anti-idiotípicos.
[437] A idiotipo representa o sítio de ligação ao antígeno altamente variável de um anticorpo e é imunogênico em si. Durante a geração de uma resposta imune mediada por anticorpo, um indivíduo irá desenvolver anticorpos contra o antígeno, assim como os anticorpos anti-idiotípicos, cujo sítio de ligação imunogênica (idiotipo) mimetiza o antígeno.
[438] Os anticorpos anti-idiotípicos podem ser produzidos contra as regiões variáveis dos anticorpos no presente documento identificados (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, ee/ou UA8capa) utilizando métodos padrões bem conhecidos dos versados na técnica. Resumidamente, os anticorpos anti- idiotípicos podem ser produzidos por injeção dos anticorpos desta invenção, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, CDRs) em um animal provocando, assim, os antissoros contra vários determinantes antigênicos do anticorpo, incluindo determinantes da região idiotípica.
[439] Os métodos para a produção de anticorpos anti- analito são bem conhecidos na técnica. Antígenos de grandes pesos moleculares (superiores a aproximadamente 5000 Daltons) podem ser injetados diretamente no animal, enquanto os compostos de baixo peso molecular (inferiores a aproximadamente 5000 Daltons) são, de preferência, acoplados a um veículo imunogênico de elevado peso molecular, normalmente uma proteína, para torná-las imunogênicas. Os anticorpos produzidos em resposta à imunização podem ser usados como soro, fluido de ascites, uma fração de imunoglobulina (Ig), uma fração de IgG, ou como material de monoespecífico purificado por afinidade.
[440] Os anticorpos anti-idiotípicos policlonais podem ser preparados por imunização de um animal com os anticorpos da presente invenção preparados como descrito acima. Em geral, é desejável imunizar um animal o qual é de espécies e alotipo-combinado com o animal a partir do qual o anticorpo (por exemplo, biblioteca de exibição de fagos) foi derivado. Isto minimiza a produção de anticorpos dirigidos contra determinantes não idiotípicos. O antissoro assim obtido é, então, normalmente absorvido extensivamente contra soro normal a partir da mesma espécie a partir da qual a biblioteca de fagos foi derivada, eliminando, assim, os anticorpos dirigidos contra determinantes não-idiotípicos. A absorção pode ser conseguida passando o antissoro através de um gel formado por reticulação de proteínas de soro normais (não imunes) com glutaraldeído. Os anticorpos com especificidade anti-idiotípica vão passar diretamente através do gel, ao passo que aqueles com especificidade para determinantes idiotípicos irão se ligar ao gel. Proteínas de soro não imunes de imobilização sobre um suporte de polissacarídeo insolúvel (por exemplo, Sepharose) também fornecem uma matriz adequada para a absorção.
[441] Os anticorpos anti-idiotípicos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de Kohler et al. (1975) Nature 256: 495. Em particular, os anticorpos anti- idiotípicos monoclonais específicos podem ser preparados utilizando tecnologia de hibridoma, que compreende a fusão (1) de células de baço de um camundongo imunizado com o antígeno ou conjugado transportador de hapteno de interesse (ou seja, os anticorpos ou desta invenção ou suas subsequências) a (2) uma linhagem de células de mieloma de camundongo que foi selecionada quanto à resistência a um fármaco (por exemplo, 8-azaguanina). Em geral, é desejável usar uma linhagem de células de mieloma que não secreta uma imunoglobulina. Várias dessas linhagens são conhecidas na técnica. Uma linhagem de células geralmente preferencial é P3X63Ag8.653. Esta linhagem de células está depositada em American Type Culture Collection como CRL-1580.
[442] A fusão pode ser realizada na presença de polietileno glicol de acordo com métodos estabelecidos (ver, por exemplo, Monoclonal Antibodies, R. Kennett, J. McKearn & K. Bechtol, eds. N.Y., Plenum Press, 1980, e Current Topics in Microbiology & Immunology, Vol. 81, F. Melchers, M. Potter & N. L. Warner, eds., N.Y., Springer-Verlag, 1978). A mistura resultante de células fundidas e não fundidas é plaqueada em meio seletivo de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Nestas condições, apenas as células híbridas irão crescer.
[443] Quando o crescimento suficiente das células ocorreu, (tipicamente 10-14 dias após a fusão), o meio de cultura foi colhido e rastreado quanto a presença de anticorpo anti-analito idiotípico monoclonal, por qualquer um de um número de métodos que incluem RIA em fase sólido e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima. As células a partir das cavidades de cultura contendo anticorpo com a especificidade desejada são então expandidas e novamente clonadas. As células destas culturas que permanecem positivas para o anticorpo de interesse são então normalmente transmitidas como tumores de ascites em camundongos iniciados com pristano histocompatíveis e suscetíveis.
[444] O fluido de ascites é colhido tocando a cavidade peritoneal, testado de novo para o anticorpo, e purificado como descrito acima. Se uma linhagem de mieloma não secretora é usada na fusão, a purificação por afinidade do anticorpo monoclonal não é geralmente necessária uma vez que o anticorpo já é homogêneo no que diz respeito às suas características de ligação ao antígeno. Tudo o que é necessário é isolá-lo a partir de proteínas contaminantes em ascites, ou seja, para produzir uma fração de imunoglobulina.
[445] Em alternativa, as linhagens de células híbridas de interesse podem ser cultivadas em culturas de tecidos isentas de soro e o anticorpo recolhido a partir do meio de cultura. Em geral, este é um método menos desejável para obtenção de grandes quantidades de anticorpo, porque o rendimento é baixo. Também é possível passar as células por via intravenosa em camundongos e colher o anticorpo a partir do soro. Este método não é geralmente preferencial por causa da pequena quantidade de soro que pode ser obtida por sangria e por causa da necessidade de purificação extensa de outros componentes do soro. No entanto, alguns hibridomas não irão crescer como tumores de ascites e, portanto, um dos seguintes métodos alternativos de obtenção de anticorpos deve ser usado.
Reatividade cruzada com o YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa.
[446] Em uma outra abordagem, os anticorpos que se ligam a CD46 podem ser identificados pelo fato de eles se ligaram ao mesmo epítopo que os anticorpos "prototípicos"da presente invenção (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa). Para identificar tais anticorpos, não é necessário isolar o epítopo em questão. Em certas modalidades, pode-se rastrear, por exemplo, bibliotecas de anticorpos para anticorpos que competem com os anticorpos prototípicos da presente invenção para a ligação e/ou internalização por uma célula de câncer de próstata (por exemplo, uma célula CaP, uma célula PC3 etc.), e/ou para a ligação a CD46.
[447] Os métodos de rastreio de bibliotecas para ligação ao epítopo e/ou para ligação e/ou internalização de células são bem conhecidos dos versados na técnica. Em certas modalidades, os anticorpos da próstata com reatividade cruzada mostram pelo menos 60 %, de preferência, 80 %, com mais preferência 90 %, e com mais preferência, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % de reatividade cruzada com um ou mais dos anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa descritos no presente documento.
Métodos de exibição de fagos para selecionar outros anticorpos anti-CD46 "relacionados".
[448] Utilizando as sequências conhecidas para os anticorpos YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa e/ou outros anticorpos específicos da próstata, uma variedade de métodos de exibição de fagos (ou exibição de levedura) pode ser usada para gerar outros anticorpos que se ligam especificamente a CD46, de preferência, que se ligam ao epítopo ligado por YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa, com a mesma ou até mesmo maior afinidade.
Métodos de Embaralhamento de Cadeia.
[449] Uma abordagem para a criação de variantes de anticorpos tem sido para substituir o gene de VH ou VL original com um repertório de genes V para criar novos parceiros (embaralhamento de cadeias) (Clackson et al. (1991) Nature. 352: 624-628) em uma biblioteca de exibição de fagos ou de exibição de levedura. Usando o embaralhamento de cadeias e a exibição em fagos, a afinidade de um fragmento de anticorpo scFv humano que se liga ao hapteno feniloxazolona (phOx) foi aumentada de 300 nM e 1 nM (300 vezes) (Marcos et al. (1992) Bio/Technology 10: 779- 783).
[450] Assim, por exemplo, para alterar a afinidade de um anticorpo anti-CD46 no presente documento descrito, um repertório de genes de scFv mutante pode ser criado contendo um gene VH do anticorpo prototípico YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa (por exemplo, como mostrado na Figura 2) e um repertório gene de VL humano (embaralhamento de cadeia leve). O repertório de genes scFv pode ser clonado em um vetor de exibição de fagos, por exemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133-4137) ou outros vetores, e após transformação uma biblioteca de transformantes é obtida.
[451] Da mesma forma, para embaralhamento de cadeia pesada, um repertório de genes scFv mutante pode ser criado contendo um gene VL do anticorpo prototípico YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa (por exemplo, como mostrado na Figura 2) e um repertório de genes VH de humano (embaralhamento de cadeia pesada). O repertório de genes de scFv pode ser clonado em um vetor de exibição em fagos, por exemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133-4137) ou outros vetores, e após transformação uma biblioteca de transformantes é obtida.
[452] As bibliotecas resultantes podem ser rastreadas contra o alvo relevante (por exemplo, CD46) e/ou reatividade cruzada com YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa.
Mutagênese sítio dirigida para melhorar a afinidade de ligação.
[453] A maioria dos antígenos que entram em contato com cadeias laterais de aminoácidos está normalmente localizada nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três em VH (CDR1, CDR2 e CDR3) e três em VL (CDR1, CDR2 e CDR3) (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.,196: 901-917; Chothia et al. (1986) Science, 233: 755-8; Nhan et al. (1991) J. Mol. Biol., 217: 133-151). Estes resíduos contribuem para a maior parte de ligações energéticas responsáveis pela afinidade do anticorpo ao antígeno. Em outras moléculas, a mutação de aminoácidos que entram em contato com o ligante tem demonstrado ser um meio eficaz de aumento da afinidade de uma molécula de proteína ao seu parceiro de ligação (Lowman et al. (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578; Wells (1990) Biochemistry, 29: 8509-8516). A mutagênese sítio dirigida de CDRs e o rastreio contra as células de câncer de próstata, em particular, para a ligação a CD46, por exemplo, tal como descrito no presente documento nos exemplos, pode produzir anticorpos com afinidade de ligação melhorada.
Randomização de CDR para produzir scFv humano com maior afinidade.
[454] Em uma extensão mutagênese sítio dirigida simples, bibliotecas de anticorpos mutantes podem ser criadas onde CDR parciais ou inteiras são randomizadas (VL de CDRl CDR2 e/ou CDR3 e/ou VH de CDR1, CDR2 e/ou CDR3). Em uma modalidade, cada CDR é randomizada em uma biblioteca separada, utilizando um anticorpo conhecido (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa) como um modelo. As sequências de CDR de mutantes de afinidade mais elevada a partir de cada uma das bibliotecas de CDR são combinadas para se obter um aumento aditivo na afinidade. Uma abordagem semelhante tem sido usada para aumentar a afinidade de hormônio de crescimento humana (hGH) para o receptor de hormônio do crescimento mais de 1500 vezes a partir de 3,4 x 10-10 de 9,0 x 10-13 M (Lowman et al. (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578).
[455] A CDR3 de VH muitas vezes ocupa o centro da bolsa de ligação e, portanto, as mutações nesta região são propensas a resultar em um aumento na afinidade (Clackson et al. (1995) Science, 267: 383-386). Em uma modalidade, resíduos de CDR3 de VH são randomizados (ver, por exemplo, Schier et al. (1996) Gene, 169: 147-155; Schier and Marks (1996) Human Antibodies and Hybridomas. 7: 97-105, 1996; e Schier et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567).
Outras modificações de anticorpos.
[456] Em uma modalidade, as sequências de anticorpos parciais derivadas do anticorpo YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa podem ser usadas para produzir anticorpos estruturalmente e funcionalmente relacionados. Por exemplo, os anticorpos interagem com antígenos alvos predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade de cadeias pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácidos nas CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Uma vez que as sequências de CDRs são responsáveis pela maioria das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente através da construção de vetores de expressão que incluem as sequências de CDR do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado em sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; e Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033). Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicas que incluem sequências de genes de anticorpos da linhagem germinativa.
[457] Assim, uma ou mais características estruturais de um anticorpo anti-CD46 da invenção, tais como as CDRs, podem ser usadas para criar anticorpos anti-CD46 estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional de, por exemplo, o anticorpo YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa, por exemplo, ligação e internalização em células de câncer da próstata.
[458] Em uma modalidade particular, uma ou mais regiões de CDR de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, regiões 2C8, e/ou UA8capa (por exemplo, CDR1, e/ou CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de VL) é combinada de forma recombinante com regiões de estrutura humanas conhecidas e CDRs para criar anticorpos anti-CD46 adicionais de forma recombinante por engenharia. As regiões de estrutura variáveis de cadeias leve e pesada podem ser derivadas das mesmas sequências de anticorpo ou de diferentes sequências de anticorpo.
[459] É bem conhecido na técnica que os domínios de CDR3 de cadeia pesada e leve de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno (ver, por exemplo, Hall et al. (1992) J. Immunol., 149: 1605-1612; Polymenis et al. (1994) J. Immunol., 152: 5318-5329; Jahn et al. (1995) Immunobiol., 193:400-419; Klimka et al. (2000) Brit. J. Cancer, 83: 252-260; Beiboer et al. (2000) J. Mol. Biol, 296: 833-849; Rader et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915; Barbas et al. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116: 2161-2162; Ditzel et al. (1996) J. Immunol., 157: 739-749). Portanto, em determinadas modalidades, os anticorpos são gerados incluindo as CDR3s de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos particulares no presente documento descritas (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8, e/ou UA8capa). Portanto, em determinadas modalidades, os anticorpos são gerados incluindo CDR1s de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos particulares descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa). Os anticorpos podem incluir, ainda, outras CDRs de cadeia pesada e/ou cadeia leve dos anticorpos da presente invenção (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa).
[460] Em certas modalidades, as regiões de CDR1, 2 e/ou 3 dos anticorpos modificados descritos acima podem compreender a(s) sequência(s) de aminoácidos exata(s) tal como os no presente documento divulgados (por exemplo, CDRs de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa). No entanto, o vereado na técnica irá apreciar que alguns desvios a partir das sequências de CDR exatas podem ser possíveis, enquanto ainda mantendo a capacidade do anticorpo para se ligar eficazmente a CD46 (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos). Consequentemente, em uma outra modalidade, o anticorpo manipulado pode ser composto de uma ou mais CDRs que são, por exemplo, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 99,5 % idênticas a uma ou mais CDRs do anticorpo YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e /ou UA8capa.
[461] Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de uma CDR podem ser alterados para modificar a ligação para alcançar uma taxa de associação de ligação mais favorecida. Usando esta estratégia, um anticorpo com ultraelevada afinidade de ligação, por exemplo, 1010 M-1 ou mais, pode ser obtido. Técnicas de maturação de afinidade bem conhecidas na técnica e aquelas no presente documento descritas, podem ser usadas para alterar a(s) região(ões) CDR, seguido de rastreio das moléculas de ligação resultantes para a mudança desejada na ligação. Portanto, à medida que a(s) CDR(s) é(são) alterada(s), as mudanças na afinidade de ligação, bem como na imunogenicidade podem ser monitoradas e classificadas de tal modo que um anticorpo otimizado para a melhor ligação combinadas e baixa imunogenicidade é obtido.
[462] Em adição a, ou em vez de, modificações dentro das CDRs, as modificações também podem ser feitas dentro de uma ou mais das regiões de estrutura, FR1, FR2, FR3 e FR4, das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo, desde que estas modificações não eliminem a afinidade de ligação do anticorpo.
[463] Em uma outra modalidade, o anticorpo é ainda modificado com respeito à função efetora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer, por exemplo. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido na região de Fc, permitindo, assim, a formação de ligações de dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou aumento da morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), (ver, por exemplo, Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176: 1191-1195; Shopes (1992) J. Immunol. 148: 2918-2922). Os anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral melhorada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais (ver, por exemplo, Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53: 2560-2565). Alternativamente, um anticorpo que tem regiões de Fc duplas pode ser manipulado e pode assim ter lise de complemento e capacidades de ADCC melhoradas (ver, por exemplo, Stevenson et al. (1989) AntiCancer Drug Design 3: 219-230).
Produção de Anticorpos.
[464] Em várias modalidades, os anticorpos descritos no presente documento podem ser produzidos por meio de síntese química ou podem ser expressos de forma recombinante.
Síntese Química.
[465] Usando a informação de sequência fornecida no presente documento, os anticorpos específicos para CD46 descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa), ou variantes dos mesmos, podem ser quimicamente sintetizados usando métodos bem conhecidos de síntese peptídica. A síntese em fase sólida na qual o aminoácido C-terminal da sequência está ligado a um suporte insolúvel, seguido por adição sequencial dos aminoácidos restantes na sequência, é um método preferido para a síntese química de anticorpos com uma única cadeia. Técnicas para a síntese em fase sólida são descritas por Barany e Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis; páginas 3-284 em The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 21492156 e Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.
Expressão Recombinante de Anticorpos Específicos para Câncer de Próstata.
[466] Em determinadas modalidades, os anticorpos específicos para CD46 descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa), ou variantes dos mesmos, são expressos de forma recombinante usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, usando a informação de sequência de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa fornecida no presente documento, os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo desejado podem ser preparados de acordo com uma série de métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Os ácidos nucleicos são transfectados em células hospedeiras que, então, expressam o anticorpo desejado ou uma cadeia do mesmo.
[467] Métodos de clonagem molecular para atingir estas finalidades são conhecidos na técnica. Uma grande variedade de métodos de clonagem e amplificação in vitro é adequada para a construção de ácidos nucleicos recombinantes. Exemplos destas técnicas e instruções suficientes para orientar aqueles versados na técnica de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2aed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook); e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre a Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1994) (Ausubel). Métodos de produção de imunoglobulinas recombinantes também são conhecidos na técnica. Ver, Cabilly, Patente US N° 4.816.567; e Queen et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033. Além disso, protocolos detalhados para a expressão de anticorpos também são fornecidos por Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710, Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161, e assim por diante.
Criação de Outras Formas de Anticorpos.
[468] Usando as sequências conhecidas e/ou identificadas (por exemplo, sequências VH e/ou VL) dos anticorpos com uma única cadeia fornecidas no presente documento, outras formas de anticorpos podem ser facilmente criadas. Tais formas incluem, porém sem limitações, anticorpos multivalentes, anticorpos completos, scFv, (scFv')2, Fab, (Fab')2, anticorpos quiméricos e assim por diante.
Criação de Homodímeros.
[469] Por exemplo, para criar anticorpos (scFv')2, dois anticorpos anti-CD46 são unidos, seja por meio de um ligante (por exemplo, um ligante de carbono, um peptídeo etc.) ou através de uma ponte de dissulfeto, por exemplo, entre duas cisteínas. Assim, por exemplo, para criar um scFv ligado por dissulfeto, um resíduo de cisteína pode ser introduzido através de mutagênese sítio-dirigida no carbóxi término dos anticorpos descritos no presente documento.
[470] Um scFv pode ser expresso a partir desta construção, purificado por IMAC e analisado através de filtração em gel. Para produzir dímeros de (scFv')2, a cisteína é reduzida por meio de incubação com 3- mercaptoetanol a 1 mM e metade do scFv bloqueado mediante adição de DTNB. scFvs bloqueados e não bloqueados são incubados juntos para formar (scFv')2 e o material resultante pode ser analisado através de filtração em gel. A afinidade do dímero resultante pode ser determinada usando métodos convencionais, por exemplo, pelo BIAcore.
[471] Em uma modalidade ilustrativa, o dímero de (scFv')2 é criado ao unir os fragmentos de scFv'através de um ligante, por exemplo, através de um ligante peptídico. Isto pode ser conseguido por uma grande variedade de meios bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma abordagem é descrita por Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (ver também documento WO 94/13804).
[472] Observe que, usando as sequências de VH e/ou VL fornecidas no presente documento, dímeros de Fab e F(ab')2 também podem ser prontamente preparados. Fab é uma cadeia leve unida a VH-CH1 através de uma ligação de dissulfeto e pode ser facilmente criado usando métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. O F(ab)'2 pode ser produzido pela dimerização do Fab, por exemplo, conforme descrito acima para o dímero de (scFv')2.
Anticorpos Quiméricos.
[473] Os anticorpos considerados no presente documento incluem anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie correspondente ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (ver, por exemplo, Patente US N° 4.816.567; Morrison et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci USA 81: 6851-6855, etc.).
[474] Embora os anticorpos prototípicos fornecidos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa) sejam anticorpos totalmente humanos, anticorpos quiméricos são considerados, em particular quando tais anticorpos devem ser usados em outras espécies que não seres humanos (por exemplo, em aplicações veterinárias). Os anticorpos quiméricos são anticorpos que compreendem porções de duas espécies diferentes (por exemplo, uma porção humana e uma porção não humana). Tipicamente, a região antigênica combinada (ou região variável) de um anticorpo quimérico é derivada a partir de uma fonte de uma espécie e a região constante do anticorpo quimérico (a qual confere a função efetora biológica à imunoglobulina) é derivada de outra fonte. Um grande número de métodos de geração de anticorpos quiméricos é bem conhecido por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Patentes US Nos: 5.502.167, 5.500.362, 5.491.088, 5.482.856, 5.472.693, 5.354.847, 5.292.867, 5.231.026, 5.204.244, 5.202.238, 5.169.939, 5.081.235, 5.075.431 e 4.975.369 e pedido PCT WO 91/0996).
[475] Em geral, os procedimentos usados para produzir anticorpos quiméricos consistem nas seguintes etapas (a ordem de algumas etapas pode ser trocada entre si): (a) identificação e clonagem do segmento gênico correto que codifica a porção de ligação a antígeno da molécula de anticorpo; este segmento gênico (conhecido como região VDJ, variável, de diversidade e de união para as cadeias pesadas ou região VJ, variável, de união para as cadeias leves, ou simplesmente como região V ou variável ou regiões VH e VL) pode estar na forma de cDNA ou genômica; (b) clonagem dos segmentos gênicos que codificam a região constante humana ou parte desejada da mesma; (c) ligação da região variável à região constante, de modo que o anticorpo quimérico completo seja codificado em uma forma transcrita e traduzível; (d) ligação desta construção em um vetor que contém um marcador selecionável e regiões de controle gênicas, tais como promotores, intensificadores e sinais de adição de poli (A); (e) amplificação desta construção em uma célula hospedeira (por exemplo, bactérias); (f) introdução do DNA em células eucariotas (transfecção), mais frequentemente linfócitos de mamíferos; e cultura da célula hospedeira sob condições adequadas para expressão do anticorpo quimérico.
[476] Os anticorpos de várias especificidades de ligação a antígeno distintas foram manipulados por estes protocolos para produzir proteínas quiméricas (por exemplo, anti- TNP: Boulianne et al. (1984) Nature, 312: 643) e antígenos antitumorais (ver, por exemplo, Sahagan et al. (1986) J. Immunol. 137: 1066). Do mesmo modo, foram obtidas várias funções efetoras diferentes ligando novas sequências àquelas que codificam a região de ligação a antígeno. Algumas destas incluem enzimas (Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604), regiões constantes de imunoglobulina de outra espécie e regiões constantes de outra cadeia de imunoglobulina (Sharon et al. (1984) Nature 309: 364; Tan et al. (1985) J. Immunol 135: 3565-3567).
[477] Em determinadas modalidades, um vetor de DNA recombinante é usado para transfectar uma linhagem de células que produz um anticorpo anti-CD46 (por exemplo, um específico para câncer de próstata). O novo vetor de DNA recombinante contém um "gene de substituição"para substituir a totalidade ou uma porção do gene que codifica a região constante da imunoglobulina na linhagem de células (por exemplo, um gene de substituição pode codificar toda ou uma porção de uma região constante de uma imunoglobulina humana, uma classe específica de imunoglobulina ou uma enzima, uma toxina, um peptídeo biologicamente ativo, um fator de crescimento, inibidor ou um peptídeo de ligação para facilitar a conjugação a um fármaco, toxina ou outra molécula, etc.), e uma "sequência alvo" que permite a recombinação homóloga direcionada com sequências de imunoglobulina dentro da célula produtora de anticorpos.
[478] Em outra modalidade, um vetor de DNA recombinante é usado para transfectar uma linhagem de células que produz um anticorpo que tem uma função efetora desejada (por exemplo, uma região constante de uma imunoglobulina humana), caso no qual o gene de substituição contido no vetor recombinante pode codificar a totalidade ou uma porção de uma região de um anticorpo específico para câncer de próstata da presente invenção e a sequência alvo contida no vetor recombinante permite a recombinação homóloga e a modificação do gene direcionado dentro da célula produtora de anticorpos. Em qualquer uma das modalidades, quando apenas uma porção da região variável ou constante é substituída, o anticorpo quimérico resultante pode definir o mesmo antígeno e/ou ter a mesma função efetora, mas ser alterado ou aprimorado de modo que o anticorpo quimérico possa demonstrar uma maior especificidade antigênica, maior constante de afinidade de ligação, aumento da função efetora ou aumento da secreção e produção pela linhagem de células produtora de anticorpos etc.
[479] Independentemente da modalidade praticada, os processos de seleção para DNA integrado (através de um marcador de seleção), triagem para produção de anticorpos quiméricos e clonagem celular podem ser usados para se obter um clone celular que produz o anticorpo quimérico.
[480] Assim, um pedaço de DNA que codifica uma modificação para um anticorpo monoclonal pode ser orientada diretamente para o local do gene de imunoglobulina expresso dentro de uma linhagem de células B ou hibridoma. As construções de DNA para qualquer modificação particular podem ser feitas para alterar o produto proteico de qualquer linhagem de células monoclonal ou hibridoma. O nível de expressão do anticorpo quimérico deve ser maior quando o gene está em sua localização cromossômica natural e não em uma posição aleatória. Métodos detalhados para a preparação de anticorpos quiméricos (humanizados) podem ser encontrados na Patente US N° 5.482.856.
Anticorpos Humanos Intactos.
[481] Em outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD46 intactos, totalmente humanos (por exemplo, específicos para câncer de próstata). Tais anticorpos podem ser prontamente produzidos de um modo análogo à produção de anticorpos quiméricos humanos. Neste caso, em vez de usar uma função de reconhecimento derivada, por exemplo, de um murino, a função de reconhecimento totalmente humana (por exemplo, VH e VL) dos anticorpos descritos no presente documento é usada.
Diacorpos.
[482] Em determinadas modalidades, diacorpos que compreendem um ou mais dos domínios VH e VL descritos no presente documento são considerados. O termo "diacorpos" se refere a fragmentos de anticorpo que têm, tipicamente, dois sítios de ligação a antígeno. Os fragmentos compreendem, tipicamente, um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Usando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, nos documentos EP 404 097; WO 93/11161, e Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.
Unicorpos.
[483] Em determinadas modalidades, usando a informação de sequência fornecida no presente documento, os anticorpos anti-CD46 podem ser construídos como unicorpos. Unicorpos são a tecnologia de anticorpos que produz um formato de anticorpo estável, menor, com uma janela terapêutica mais longa antecipada do que determinados formatos de anticorpos pequenos. Em determinadas modalidades, os unicorpos são produzidos a partir de anticorpos IgG4 eliminando a região de dobradiça do anticorpo. Ao contrário do anticorpo IgG4 de tamanho completo, o fragmento de meia molécula é muito estável e é denominado um unicorpo. Reduzir pela metade a molécula de IgG4 deixa apenas uma área no unicorpo que pode se ligar a um alvo. Métodos de produção de unicorpos são descritos em detalhes na Publicação PCT WO2007/059782, a qual é no presente documento incorporada por referência na íntegra (ver também Kolfschoten et al. (2007) Science 317: 1554-1557).
Aficorpos.
[484] Em determinadas modalidades, a informação de sequência fornecida no presente documento é usada para construir moléculas de aficorpo que se ligam à CD46. As moléculas de aficorpo são uma classe de proteínas de afinidade com base em um domínio de proteína de 58 resíduos de aminoácidos derivado a partir de um dos domínios de ligação a IgG da proteína estafilocócica A. Este domínio de três feixes de hélice tem sido usado como uma base para a construção de bibliotecas combinatórias de fagemídeos a partir da qual variantes de aficorpos que têm como alvo as moléculas desejadas podem ser selecionadas usando a tecnologia de exibição em fagos (ver, por exemplo, Nord et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-777; Ronmark et al. (2002) Eur. J. Biochem., 269: 2647-2655). Detalhes de aficorpos e métodos de produção são conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Patente US N° 5.831.012, a qual é no presente documento incorporada por referência na íntegra).
[485] Será reconhecido que os anticorpos descritos acima podem ser fornecidos como anticorpos inteiros intactos (por exemplo, IgG) ou fragmentos de anticorpos, anticorpos com uma única cadeia, usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, embora o anticorpo possa ser essencialmente de qualquer espécie de mamífero, para reduzir a imunogenicidade, é desejável usar um anticorpo que é da espécie na qual o anticorpo e/ou o imunoconjugado devem ser usados. Em outras palavras, para uso em um ser humano, é desejável usar um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
Medição da Afinidade de Ligação do Anticorpo/Polipeptídeo.
[486] Conforme explicado acima, a seleção de uma maior avidez possível envolve a medição da afinidade do anticorpo pelo antígeno alvo (por exemplo, CD46, especialmente o epítopo ligado por uma ou mais de YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa). Métodos para fazer tais medições são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, por exemplo, a Kd do anticorpo é determinada a partir da cinética de ligação, por exemplo, para a célula alvo em um BIAcore, um biossensor com base em ressonância de plasma em superfície. Para esta técnica, o antígeno ou célula é acoplada a um chip sensor derivatizado capaz de detectar alterações na massa. Quando o anticorpo é passado sobre o chip sensor, o anticorpo se liga ao antígeno, resultando em um aumento na massa que é quantificável. A medição da taxa de associação como uma função da concentração de anticorpo pode ser usada para calcular a constante de taxa de associação (kon). Após a fase de associação, tampão é passado sobre o chip e a taxa de dissociação de anticorpo (koff) determinada. A kon é, tipicamente, medida na faixa de 1,0 x 102 a 5,0 x 10-6 e a koff na faixa de 1,0 x 10-1 a 1,0 x 10-6. A constante de equilíbrio Kd é, muitas vezes, calculada como koff/kon e, assim, é tipicamente medida na faixa de 105 a 10-12. As afinidades medidas deste modo se correlacionam bem com as afinidades medidas em solução por meio de titulação por extinção de fluorescência.
Imunoconjugados que Compreendem YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa ou Outros Anticorpos Anti-CD46.
[487] Os anticorpos anti-CD46 protótipos (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa) descritos no presente documento se ligam especificamente e são internalizados por células de câncer de próstata e por outras células cancerosas positivas para CD46. Os anticorpos podem ser usados isoladamente como agentes terapêuticos (por exemplo, para inibir o crescimento e/ou proliferação de uma célula de câncer de próstata) ou podem ser acoplados a um efetor formador de imunoconjugados que permitem a distribuição eficiente e específica do efetor (por exemplo, citotoxinas, etiquetas, radionuclídeos, ligantes, anticorpos, fármacos, lipossomas, nanopartículas, partículas virais, citocinas e assim por diante) a várias células cancerosas que expressam CD46 (por exemplo, células isoladas, células metastáticas, células de tumores sólidos, etc.).
[488] Imunoconjugados anti-CD46 podem ser formados por meio de conjugação dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos descrito no presente documento a um efetor (por exemplo, um marcador detectável, um outro agente terapêutico etc.). Os agentes adequados incluem, por exemplo, um agente citotóxico ou citostático (por exemplo, um agente quimioterápico), uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas) e/ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
[489] Em determinadas modalidades, o efetor compreende um marcador detectável. Marcadores detectáveis adequados incluem, porém sem limitações, marcadores radiopacos, nanopartículas, marcadores de PET, marcadores de MRI, marcadores radioativos e assim por diante. Entre os radionuclídeos úteis em várias modalidades da presente invenção, emissores gama, emissores de positrons, emissores de raios X e emissores de fluorescência são adequados para localização, diagnóstico e/ou classificação de estágios e/ou terapia, enquanto emissores beta e alfa e agentes de captura de elétrons e nêutrons, tais como boro e urânio, também podem ser usados para terapia.
[490] Os marcadores detectáveis podem ser usados em conjunto com um detector externo e/ou um detector interno e constituem um meio de localizar e/ou visualizar de forma eficaz células de câncer de próstata. Tal detecção/visualização pode ser útil em vários contextos incluindo, porém sem limitações, ambientes pré-operatórios e intra-operatórios. Assim, em determinadas modalidades, a presente invenção se refere a um método de detecção intra- operatória de cânceres de próstata no corpo de um mamífero. Estes métodos envolvem, tipicamente, a administração, ao mamífero, de uma composição que compreende, em uma quantidade suficiente para detecção por um detector (por exemplo, uma sonda de detecção de radiação gama), um anticorpo específico para câncer de próstata marcado com um marcador detectável (por exemplo, anticorpos da presente invenção marcados com um radioisótopo, por exemplo, 161Tb, 123I, 125I e assim por diante) e, depois de permitir que a substância ativa seja absorvida pelo tecido alvo e, de preferência após eliminação do marcador do sangue, sujeição do mamífero a uma técnica de radioimunodetecção na área relevante do corpo, por exemplo, usando uma sonda de detecção gama.
[491] Em determinadas modalidades, o anticorpo ligado ao marcador pode ser usado na técnica de cirurgia rádio- orientada, em que tecidos relevantes no corpo de um indivíduo podem ser detectados e localizados de forma intra-operatória por meio de um detector, por exemplo, uma sonda de detecção de radiação gama. O cirurgião pode, no intra-operatório, usar esta sonda para encontrar tecidos nos quais a absorção do composto marcado com um radioisótopo, isto é, por exemplo, um emissor de fótons gama de baixa energia, tenha ocorrido. Em determinadas modalidades, tais métodos são particularmente úteis na localização e remoção de cânceres secundários produzidos por células metastáticas a partir de um tumor primário.
[492] Além de marcadores detectáveis, determinados efetores preferidos incluem, porém sem limitações, citotoxinas (por exemplo, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina da difteria e assim por diante) ou fármacos ou pró-fármacos citotóxicos, caso no qual a molécula quimérica pode atuar como um agente de morte celular potente que tem como alvo especificamente a citotoxina para as células de câncer de próstata.
[493] Em ainda outras modalidades, o efetor pode incluir um lipossoma que encapsula um fármaco (por exemplo, um fármaco anticâncer, tal como abraxane, doxorrubicina, pamidronato dissódico, anastrozol, exemestano, ciclofosfamida, epirrubicina, toremifeno, letrozol, trastuzumabe, megestrol tamoxifeno, paclitaxel, docetaxel, capecitabina, acetato de goserelina, ácido zoledrônico, vinblastina, etc.), um antígeno que estimula o reconhecimento da célula ligada por componentes do sistema imune, um anticorpo que se liga especificamente a componentes do sistema imune e os dirige para o câncer de próstata e assim por diante.
Efetores Ilustrativos. Composições de Imagiologia.
[494] Em determinadas modalidades, os imunoconjugados anti-CD46 podem ser usados para dirigir marcadores detectáveis a um local de tumor. Isto pode facilitar a detecção e/ou localização de tumores. Eles podem ser eficazes para a detecção de tumores primários ou, em determinadas modalidades, tumores secundários produzidos, por exemplo, por células metastáticas da próstata. Em determinadas modalidades, o componente efetor do imunoconjugado compreende um marcador "radiopaco", por exemplo, um marcador que pode ser facilmente visualizado usando raios X. Materiais radiopacos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os materiais radiopacos mais comuns incluem iodeto, brometo ou sais de bário. Outros materiais radiopacos também são conhecidos e incluem, porém sem limitações, derivados orgânicos de bismuto (ver, por exemplo, Patente US N° 5.939.045), poliuretanos radiopacos (ver, por exemplo, Patente US N° 5.346.981), compósitos de organobismuto (ver, por exemplo, Patente US N° 5.256.334), complexos poliméricos de bário radiopacos (ver, por exemplo, Patente US N° 4.866.132) e assim por diante.
[495] Os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento podem ser acoplados diretamente à porção radiopaca ou podem ser ligados a um "pacote" (por exemplo, um quelato, um lipossoma, uma micropérola polimérica, uma nanopartícula etc.) que traz, contém ou compreende o material radiopaco, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[496] Além de marcadores radiopacos, outros marcadores também são adequados para uso. Marcadores detectáveis adequados para uso em imunoconjugados incluem qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Marcadores úteis incluem esferas magnéticas (por exemplo, DynabeadsTM), corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, Taxas Red, rodamina, proteína fluorescente verde e assim por diante), marcadores radioativos (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e outras comumente usadas em um ensaio ELISA) e marcadores colorimétricos, tais como ouro coloidal ou grânulos de vidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.), nanopartículas, pontos quânticos e assim por diante.
[497] Em determinadas modalidades, marcadores radioativos adequados incluem, porém sem limitações, 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 64lCu, 52Fe, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh e 111Ag.
[498] Meios de detecção de tais marcadores são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Assim, por exemplo, determinados radiomarcadores podem ser detectados usando filmes fotográficos, detectores de cintilação, imagiologia por PET, MRI e assim por diante. Os marcadores fluorescentes podem ser detectados usando um fotodetector para detectar a iluminação emitida. Os marcadores enzimáticos são, tipicamente, detectados fornecendo à enzima um substrato e detectando o produto da reação produzido pela ação da enzima sobre o substrato e marcadores colorimétricos são detectados simplesmente visualizando o marcador colorido.
Radiossensibilizantes.
[499] Em outra modalidade, o efetor pode compreender um radiossensibilizante que aumenta o efeito citotóxico de radiação ionizante (por exemplo, conforme pode ser produzido por 60Co ou uma fonte de raios X) em uma célula. Numerosos agentes radiossensibilizantes são conhecidos e incluem, porém sem limitações, compostos derivados de benzoporfirina (ver, por exemplo, Patente US N° 5.945.439), óxidos de 1,2,4-benzotriazina (ver, por exemplo, Patente US N° 5.849.738), determinados compostos que contêm diaminas (ver, por exemplo, Patente US N° 5.700.825), BCNT (ver, por exemplo, Patente US N° 5.872.107), radiossensibilizantes derivados de amida de ácido nitrobenzoico (ver, por exemplo, Patente US N° 4.474.814), vários derivados heterocíclicos (ver, por exemplo, Patente US N° 5.064.849), complexos de platina (ver, por exemplo, Patente US N° 4.921.963) e assim por diante.
Emissores alfa.
[500] Em determinadas modalidades, o efetor pode incluir um emissor alfa, isto é, um isótopo radioativo que emite partículas alfa. Foi recentemente mostrado que emissores alfa são eficazes no tratamento de câncer (ver, por exemplo, McDevitt et al. (2001) Science 294: 1537-1540; Ballangrud et al. (2001) Cancer Res. 61: 20082014;Borchardt et al. (2003) Cancer Res. 63: 508450). Emissores alfa adequados incluem, porém sem limitações, Bi, 213Bi, 211At e assim por diante.
Quelatos.
[501] Muitos dos produtos farmacêuticos e/ou radiomarcadores descritos no presente documento podem ser fornecidos como um quelato. A molécula de quelação é, tipicamente, acoplada a uma molécula (por exemplo, biotina, avidina, estreptavidina etc.) que se liga especificamente a um epítopo marcador ligado a um anticorpo anti-CD46 (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa) descrito no presente documento.
[502] Grupos de quelação são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em determinadas modalidades, os grupos de quelação são derivados de ácido etileno diamino tetra acético (EDTA), ácido dietileno triamina penta acético (DTPA), ácido ciclo-hexil 1,2-diamina tetra acético (CDTA), etileno glicol-ácido O,N,N-bis(hidroxibenzil)- etilenodiamina-N,N'-diacético (HBED), ácido trietileno tetramina hexa-acético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-N,N',N",N"'-tetra-acético (DOTA), ácido hidroxietildiamina triacético (HEDTA), ácido 1,3,8,11-tetra- azaciclotetradecano-N,N',N",N"'-tetra-acético (TETA), DTPA substituído, EDTA substituído e assim por diante.
[503] Exemplos de determinados quelantes preferidos incluem 2-iminotiolanos e 2-iminotiaciclo-hexanos não substituídos ou substituídos, em particular 2-imino-4- mercaptometiltiolano.
[504] Um agente de quelação, ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-N,N,N",N'"-tetra-acético (DOTA), é de particular interesse em virtude de sua capacidade de quelar uma série de metais diagnóstica e terapeuticamente importantes, tais como radionuclídeos e radiomarcadores.
[505] Conjugados de DOTA e proteínas, tais como anticorpos, foram descritos. Por exemplo, a Patente US N° 5.428.156 descreve um método para conjugar DOTA a anticorpos e fragmentos de anticorpo. Para preparar estes conjugados, um grupo ácido carboxílico de DOTA é convertido em um éster ativo que pode reagir com um grupo amina ou sulfidrila no anticorpo ou fragmento de anticorpo. Lewis et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 565-576, descreve um método similar no qual um grupo carboxila de DOTA é convertido em um éster ativo e o DOTA ativado é misturado com um anticorpo, ligando o anticorpo ao DOTA através do grupo épsilon-amino de um resíduo de lisina do anticorpo, deste modo, convertendo um grupo carboxila de DOTA em uma porção amida.
[506] Em determinadas modalidades, o agente de quelação pode ser acoplado, diretamente ou através de um ligante, a um marcador de epítopo ou a uma porção que se liga a um marcador de epítopo. Conjugados de biotina e DOTA foram descritos (ver, por exemplo, Su (1995) J. Nucl. Med., 36 (Supl. 5): 154P, o qual descreve a ligação de DOTA à biotina através de derivados de biotina com cadeia lateral amino disponíveis, tais como DOTA -LC-biotina ou DOTA-benzil-4-(6- amino-caproamida)-biotina). Yau et al., documento WO 95/15335, descrevem um método de produção de compostos de nitro-benzil-DOTA que podem ser conjugados com biotina. O método compreende uma reação de ciclização através de projeção transitória de um grupo hidróxi; tosilação de uma amina; desproteção do grupo hidróxi transitoriamente protegido; tosilação do grupo hidróxi desprotegido; e ciclização de tosilato intramolecular. Wu et al. (1992) Nucl. Med. Biol, 19 (2): 239-244 descreve uma síntese de agentes de quelação macrocíclicos para a marcação radioativa de proteínas com 111In e 90Y. Wu et al. produziram um conjugado de DOTA-biotina marcado para estudar a estabilidade e biodistribuição de conjugados com avidina, uma proteína modelo para estudos. Este conjugado foi feito usando uma hidrazida de biotina, a qual continha um grupo amino livre para reagir com um derivado de DOTA ativado gerado in situ.
Citotoxinas/Agentes Citostáticos.
[507] Os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa) podem ser usados para administrar uma variedade de fármacos citotóxicos e/ou citostáticos, incluindo fármacos terapêuticos, um composto que emite radiação, moléculas citotóxicas de origem vegetal, fúngica ou bacteriana, proteínas biológicas e misturas dos mesmos. Em determinadas modalidades, fármacos citotóxicos que atuam intracelularmente podem compreender fármacos citotóxicos os quais são, por exemplo, pequenas moléculas orgânicas, proteínas ou peptídeos citotóxicos, emissores de radiação incluindo, por exemplo, α-emissores de curto alcance, de elevada energia conforme descrito acima e assim por diante.
[508] Consequentemente, em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CD46 está ligado a um fármaco citotóxico/citostático. Em várias modalidades, o fármaco a ser usado para construir os ADCs incluem, porém sem limitações, inibidores de microtúbulos e agentes que danificam o DNA, inibidores de polimerase (por exemplo, o inibidor de polimerase II, α-amanitina) e assim por diante. Em determinadas modalidades, o anticorpo é conjugado com o fármaco diretamente ou através de um ligante enquanto, em outras modalidades, o anticorpo é conjugado com um veículo medicamentoso (por exemplo, um lipossoma que contém o medicamento, um veículo medicamentoso polimérico, um veículo medicamentoso de nanopartículas, um veículo medicamentoso lipídico, um veículo medicamentoso dendrimérico e assim por diante).
[509] Em determinadas modalidades, o fármaco compreende um inibidor de tubulina incluindo, porém sem limitações, auristatina, Dolastatina-10, derivados sintéticos do produto natural Dolastatina-10 e maitansina ou um derivado de maitansina.
[510] Em determinadas modalidades, o fármaco compreende uma auristatina. Em determinadas modalidades, a auristatina é selecionada a partir do grupo que consiste em: Auristatina E (AE), Monometilauristatina E (MMAE), Monometilauristatina F (MMAF), vcMMAE e vcMMAF.
[511] Em determinadas modalidades, o fármaco compreende uma maitansina. Maitansinas ilustrativas incluem, porém sem limitações, Mertansina (DM1); e um análogo de maitansina, tal como DM3 ou DM4.
[512] Em determinadas modalidades, o fármaco compreende um agente que interage com o DNA. Em determinadas modalidades, o agente que interage com o DNA inclui, porém sem limitações, caliqueamicinas, duocarmicinas, pirrolobenzodiazepinas (PBD) e assim por diante.
[513] Em uma modalidade ilustrativa, mas não limitativa, o fármaco compreende uma caliqueamicina. Caliqueamicinas têm como alvo o DNA e causam cisão da fita. Em determinadas modalidades, o fármaco compreende caliqueamicina ou um análogo de caliqueamicina. Análogos de caliqueamicina são descritos na Patente US N° 5.264.586, a qual é no presente documento incorporada por referência para os análogos de caliqueamicina descritos na mesma.
[514] Em outra modalidade ilustrativa, mas não limitativa, o fármaco compreende uma duocarmicina. Duocarmicinas são agentes que danificam o DNA capazes de exercer seu modo de ação em qualquer fase do ciclo celular. Os agentes que fazem parte desta classe de duocarmicinas normalmente têm potência na faixa de baixo picomolar. Duocarmicinas ilustrativas (por exemplo, análogos de duocarmicina) que podem ser usadas como efetores nas construções quiméricas consideradas no presente documento incluem, porém sem limitações, duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, Ciclopropilbenzoindol duocarmicina (CC-1065), Centanamicina, Raquelmicina, adozelesina, bizelesina, carzelesina e assim por diante.
[515] Em outra modalidade ilustrativa, mas não limitativa, o fármaco compreende uma pirrolobenzodiazepina. Em determinadas modalidades, o fármaco compreende um derivado sintético de duas pirrolobenzodiazepinas ligadas por um ligante flexível de polimetileno. Pirrolobenzodiazepinas (PBD) e dímeros de PBD são descritos na Patente US N° 7.528.126 B2, a qual é no presente documento incorporada por referência para os dímeros de PBD e pirrolobenzodiazepinas descritos na mesma. Em determinadas modalidades, a pirrolobenzodiazepina é selecionada a partir do grupo que consiste em: Antramicina (e dímeros da mesma), Mazetramicina (e dímeros da mesma), Tomaimicina (e dímeros da mesma), Protracarcina (e dímeros da mesma), Chicamicina (e dímeros da mesma), Neotramicina A (e dímeros da mesma), Neotramicina B (e dímeros da mesma), DC-81 (e dímeros da mesma), Sibiromicina (e dímeros da mesma), Porotramicina A (e dímeros da mesma), Porotramicina B (e dímeros da mesma), Sibanomicina (e dímeros da mesma), Abbeymicina (e dímeros da mesma), SG2000 e SG2285.
[516] Em determinadas modalidades, o fármaco compreende um inibidor de polimerase incluindo, porém sem limitações, inibidores de polimerase II, tal como α-amanitina, e inibidores de poli(ADP-ribose) polimerase (PARP). Inibidores de PARP ilustrativos incluem, porém sem limitações, iniparibe (BSI 201), Talazoparibe (BMN-673), Olaparibe (AZD- 2281), Olaparibe, Rucaparibe (AG014699, PF-01367338), Veliparibe (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB-290, 3- aminobenzamida e assim por diante.
[517] Em determinadas modalidades, o agente citotóxico/citostático compreende uma toxina de proteína ou peptídeo ou um fragmento da mesma. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas são exemplificados por um fragmento de toxina A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina da difteria, exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, abrina, cadeia, modecina, α-sacrina, determinadas proteínas de Aleurites fordii, determinadas proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAP, PAPII e PAP-S), inibidor de Morodica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogilina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos, por exemplo. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem, porém sem limitações, 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re e assim por diante.
[518] Em determinadas modalidades, as citotoxinas podem incluir, porém sem limitações, exotoxinas de Pseudomonas, toxinas de Difteria, ricina, abrina e derivados das mesmas. A exotoxina de Pseudomonas (PE) é uma proteína monomérica extremamente ativa (peso molecular de 66 kDa) secretada por Pseudomonas aeruginosa, a qual inibe a síntese de proteínas em células eucariotas através de inativação do fator de alongamento 2 (EF-2), catalisando sua ADP- ribosilação (catalisar a transferência da porção de ADP ribosila de NAD oxidado em EF-2).
[519] A toxina contém três domínios estruturais que atuam juntos para produzir a citotoxicidade. O domínio Ia (aminoácidos 1-252) media a ligação celular. O domínio II (aminoácidos 253-364) é responsável pela translocação para o citosol e o domínio III (aminoácidos 400-613) media a ribosilação do ADP do fator de alongamento 2, o qual inativa a proteína e provoca a morte celular. A função do domínio Ib (aminoácidos 365-399) permanece indefinida, embora uma grande parte dele, aminoácidos 365-380, possa ser eliminado sem perda de citotoxicidade. Ver Siegall et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14256-14261.
[520] Em determinadas modalidades, o anticorpo é ligado a uma molécula preferida na qual o domínio Ia (aminoácidos 1 a 252) é eliminado e os aminoácidos 365 a 380 foram eliminados do domínio Ib. Em determinadas modalidades, todo o domínio Ib e uma parte do domínio II (aminoácidos 350 a 394) podem ser suprimidos, em particular se as sequências eliminadas são substituídas por um peptídeo de ligação.
[521] Além disso, a PE e outras proteínas citotóxicas podem ser ainda modificadas usando mutagênese sítio-dirigida ou outros métodos conhecidos na técnica para alterar a molécula para uma aplicação particular desejada. Por exemplo, meios para alterar a molécula de PE de uma forma que não afeta substancialmente as vantagens funcionais conferidas pelas moléculas PE descritas no presente documento também podem ser usados e tais moléculas resultantes se destinam a ser abrangidas no presente documento.
[522] Métodos de clonagem de genes que codificam PE fundidos com vários ligantes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Siegall et al. (1989) FASEB J., 3: 2647-2652; e Chaudhary et al. (1987) Proc. Natl Acad. Sci USA., 84: 4538-4542).
[523] Assim como a PE, a toxina da difteria (DT) mata as células por ADP-ribosilação do fator de alongamento 2, deste modo, inibindo a síntese de proteínas. A toxina da difteria, no entanto, é dividida em duas cadeias, A e B, ligadas por uma ponte de dissulfeto. Em contraste com a PE, a cadeia B de DT, a qual está na extremidade carboxila, é responsável pela ligação ao receptor, e a cadeia A, a qual está presente na extremidade amino, contém a atividade enzimática (Uchida et al. (1972) Science, 175: 901-903; Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem., 248: 3838-3844).
[524] Em determinadas modalidades, os imunoconjugados de anticorpo-toxina de Difteria da presente invenção têm o domínio de ligação ao receptor nativo removido por meio de truncamento da cadeia B da toxina de difteria. Uma toxina de Difteria modificada ilustrativa é DT388, uma DT na qual a sequência do terminal carboxila que começa no resíduo 389 é removida (ver, por exemplo, Chaudhary et al. (1991) Bioch. Biophys Res Comm., 180: 545-551). Assim como as citotoxinas quiméricas de tipo PE, as moléculas de DT podem ser quimicamente conjugadas ao anticorpo específico para câncer de próstata, mas, em determinadas modalidades preferidas, o anticorpo será fundido à toxina de Difteria por meios recombinantes (ver, por exemplo, Williams et al.(1990) J. Biol. Chem. 265: 11885-11889).
Partículas Virais.
[525] Em determinadas modalidades, o efetor compreende uma partícula viral (por exemplo, um fago filamentoso, um vírus adenoassociado (AAV), um lentivírus e assim por diante). O anticorpo pode ser conjugado com a partícula viral e/ou pode ser expresso na superfície da partícula viral (por exemplo, um fago filamentoso). A partícula viral pode incluir adicionalmente um ácido nucleico que deve ser distribuído à célula alvo (por exemplo, câncer de próstata). O uso de partículas virais para distribuir ácidos nucleicos a células é descrito em detalhes nos documentos WO 99/55720, US 6.670.188, US 6.642.051 e US 6.669.936.
Outras Porções Terapêuticas.
[526] Outras moléculas efetoras adequadas incluem agentes farmacológicos ou sistemas de encapsulação que contêm vários agentes farmacológicos. Assim, em várias modalidades, é reconhecido que a molécula alvo (por exemplo, o anticorpo de direcionamento) pode ser diretamente ligada ou através de um ligante a um fármaco que tem de ser distribuído diretamente ao tumor.
[527] Tais fármacos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém sem limitações, anticorpos anticâncer (por exemplo, Herceptin), antimetabólitos, agentes alquilantes, inibidores de topoisomerase, agentes de que têm como alvo microtúbulos, inibidores de quinase, inibidores da síntese de proteína, análogos de somatostatina, glucocorticoides, aromatase, inibidores de mTOR, inibidores da proteína quinase B (PKB), fosfatidilinositol, inibidores de 3-quinase (PI3K), inibidores de quinase dependente de ciclina, moléculas antiTRAIL, inibidores de MEK e assim por diante. Em determinadas modalidades, os compostos anticâncer incluem, porém sem limitações, fluoruracila (5-FU), capecitabina/XELODA, 5- Trifluorometil-1,2'-desoxiuridina, metotrexato de sódio, raltitrexede/Tomudex, pemetrexede/Alimta®, arabinosídeo de citosina (citarabina, ara-C)/Tioguanina, 6-mercaptopurina (mercaptopurina, 6-MP), azatioprina/Azasan, 6-tioguanina (6- TG)/Purinethol (TEVA), pentostatina/Nipent, fosfato de fludarabina/Fludara®, cladribina (2-CdA, 2- clorodesoxiadenosina)/Leustatin, floxuridina (5-fluoro- 2)/FUDR (Hospira, Inc.), inibidor de ribonucleotídeo redutase (RNR), ciclofosfamida/Cytoxan (BMS), Neosar, ifosfamida/Mitoxana, tiotepa, BCNU - 1,3-bis(2-cloroetil)- 1-nitosourea, 1-(2-cloroetil)-3-ciclo-hexil-nitrosourea, metil CCNU, hexametilmelamina, busulfano/Myleran, procarbazina HCl/Matulane, dacarbazina (DTIC), clorambucil/Leukaran®, melfalano/Alkeran, cisplatina (cisplatina, CDDP)/cisplatina, carboplatina/Paraplatin, oxaliplatina/Eloxitan, bendamustina, carmustina, clorometina, dacarbazina (DTIC), fotemustina, lomustina, manosulfano, nedaplatina, nimustina, prednimustina, ranimustina, satraplatina, semustina, estreptozocina, temozolomida, treosulfano, triaziquona, trietileno melamina, tiotepa, tetranitrato de triplatina, trofosfamida, uramustina, cloridrato de doxorrubicina/DOXIL, citrato de daunorrubicina/Daunoxome®, mitoxantrona HCl/Novantrone, actinomicina D, etoposídeo/Vepesid, topotecano HCl/Hycamtin, teniposídeo (VM-26), irinotecano HCl (CPT-11)/Camptosar®, camptotecina, belotecano, rubitecano, vincristina, sulfato de vinblastina, tartarato de vinorelbina, sulfato de vindesina, paclitaxel/Taxol, docetaxel/Taxotere, nanopartículas de paclitaxel, Abraxane, ixabepilona, larotaxel, ortataxel, tesetaxel, vinflunina e assim por diante. Em determinadas modalidades, o(s) fármaco(s) anticâncer inclui(m) um ou mais fármacos selecionados a partir do grupo que consiste em carboplatina (por exemplo, PARAPLATIN®), cisplatina (por exemplo, PLATINOL®, PLATIRAN- AQ®), Ciclofosfamida (por exemplo, CYTOXAN®, NEOSAR®), docetaxel (por exemplo, Taxotere), doxorrubicina (por exemplo, Adriamicina), erlotinibe (por exemplo, TARCEVA®), Etoposídeo (por exemplo, VEPESID®), fluoruracila (por exemplo, 5-FUA ®), gemcitabina (por exemplo, GEMZAR®), mesilato de imatinib (por exemplo, GLEEVEC®), Irinotecano (por exemplo, CAMPTOSAR®), metotrexato (por exemplo, FOLEX®, MEXATE®, AMETHOPTERIN®), paclitaxel (por exemplo, TAXOL®, ABRAXANE®), Sorafinibe (por exemplo, NEXAVAR®), sunitinibe (por exemplo, SUTENT®), topotecano (por exemplo, HYCAMTIN®), vinblastina (por exemplo, VELBAN®), Vincristina (por exemplo, ONCOVIN®, VINCASAR PFS®). Em determinadas modalidades, o fármaco anticâncer compreende um ou mais fármacos selecionados a partir do grupo que consiste em ácido retinoico, um derivado de ácido retinoico, doxorrubicina, vinblastina, vincristina, ciclofosfamida, ifosfamida, cisplatina, 5-fluorouracila, um derivado de camptotecina, interferon, tamoxifeno e taxol. Em determinadas modalidades, o composto anticâncer é selecionado a partir do grupo que consiste em Abraxane, doxorrubicina, pamidronato dissódico, anastrozol, exemestano, ciclofosfamida, epirrubicina, toremifeno, letrozol, trastuzumabe, megestrol tamoxifeno, paclitaxel, docetaxel, capecitabina, acetato de goserelina, ácido zoledrônico, vinblastina etc.), uma molécula antissenso, um siRNA e assim por diante.
[528] Alternativamente, a molécula efetora pode compreender um sistema de encapsulação, tal como uma cápside viral, um lipossoma ou micelas que contém uma composição terapêutica, tal como um fármaco, um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico antissenso ou outro ácido nucleico que se pretende distribuir à célula) ou outro grupo terapêutico que é, de preferência, protegido contra exposição direta ao sistema circulatório. Meios de preparação de lipossomas ligados a anticorpos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Patente US N° 4.957.735, de Connor et al. (1985) Pharm. Ther., 28: 341-365 e assim por diante).
B) Ligação do Anticorpo ao Efetor.
[529] Aqueles versados na técnica reconhecerão que os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (também conhecido como 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8kapa) e a(s) molécula(s) efetora(s) podem ser unidos em qualquer ordem. Assim, quando o anticorpo é um polipeptídeo com uma única cadeia, a molécula efetora pode ser unida a um ou outro dos terminais amino ou carbóxi da molécula de direcionamento. O anticorpo também pode ser unido a uma região interna da molécula efetora, ou, inversamente, a molécula efetora pode ser unida a um sítio interno do anticorpo, contanto que a ligação não interfira com as respectivas atividades das moléculas.
[530] O anticorpo e o efetor podem ser ligados através de qualquer um de uma série de meios bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tipicamente, o efetor é conjugado, quer diretamente ou através de um ligante (espaçador), ao anticorpo. No entanto, em determinadas modalidades, onde a molécula efetora é ou compreende um polipeptídeo, é preferível expressar de forma recombinante a molécula quimérica como uma proteína de fusão com uma única cadeia.
Conjugação da Molécula Efetora ao Anticorpo.
[531] Em uma modalidade, o anticorpo específico para CD46 é quimicamente conjugado com a molécula efetora (por exemplo, uma citotoxina, um marcador, um ligante, um fármaco, um lipossoma etc.). Meios de conjugação química de moléculas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[532] O processo para a fixação de um efetor a um anticorpo variará de acordo com a estrutura química do efetor e/ou anticorpo. Polipeptídeos contêm, tipicamente, uma variedade de grupos funcionais; por exemplo, grupos ácido carboxílico (COOH) ou amina (-NH2) livres que estão disponíveis para reação com um grupo funcional adequado sobre uma molécula efetora para ligar o efetor aos mesmos.
[533] Alternativamente, o anticorpo e/ou o efetor pode ser derivatizado para expor ou ligar grupos funcionais reativos adicionais. A derivatização pode envolver a ligação de qualquer uma de uma série de moléculas ligantes, tais como aquelas disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.
[534] Um "ligante", conforme usado no presente documento, é uma molécula que é usada para unir a molécula de direcionamento à molécula efetora. O ligante é capaz de formar ligações covalentes tanto com a molécula de direcionamento quanto a molécula efetora. Ligantes adequados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém sem limitações, ligantes de carbono de cadeia linear ou ramificada, ligantes de carbono heterocíclicos ou ligantes peptídicos. Onde a molécula de direcionamento e a molécula efetora são polipeptídeos, os ligantes podem ser ligados aos aminoácidos constituintes através de seus grupos secundários (por exemplo, através de uma ligação de dissulfeto à cisteína). No entanto, em uma modalidade preferida, os ligantes serão unidos aos grupos alfa carbono amino ou carboxila dos aminoácidos terminais.
[535] Os imunoconjugados podem ser preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2- piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis(p-diazôniobenzoil)etilenodiamina), di-isocianatos (tal como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietilenotriaminopentacético marcado com Carbono-14 (MX-DTPA) é um exemplo ilustrativo, mas não limitativo, de um agente de quelação para conjugação, por exemplo, de um radionucleotídeo com o anticorpo (ver, por exemplo, documento WO1994/011026 (PCT/US1993/010953)).
[536] Em determinadas modalidades, a conjugação de efetores (por exemplo, fármacos, lipossomas etc.) ou ligantes ligados a efetores a um anticorpo ocorre em aminoácidos reativos acessíveis a solvente, tais como lisinas ou cisteínas que podem ser derivadas a partir da redução de ligações de dissulfeto intercadeia no anticorpo. Em determinadas modalidades, a conjugação de cisteína pode ocorrer após redução de quatro ligações de dissulfeto intercadeia.
[537] Em determinadas modalidades, a conjugação sítio- específica, em que um número conhecido de ligantes-fármacos são consistentemente conjugados a sítios definidos no anticorpo, pode ser realizada para produzir uma construção altamente homogênea. A proporção de fármaco-anticorpo (DAR) pode ser precisamente controlada e pode ser configurada a vários ligantes-fármacos produzindo, por exemplo, ADCs sítio-específicos com DAR de 2 ou 4.
[538] Uma série de métodos é conhecida para obter conjugação sítio-específica. Por exemplo, o aminoácido cisteína contém um grupo tiol reativo que serve a papéis essenciais na estrutura e função de muitas proteínas. A conjugação de sondas tio-reativas contra proteínas através de resíduos de cisteína tem sido um método para marcação de proteínas e também foi aplicado à geração de conjugados de fármaco-anticorpo (ADCs). Em determinadas modalidades ilustrativas, mas não limitativas, este processo envolve a redução parcial de ligações de dissulfeto existentes (por exemplo, ligações de dissulfeto intercadeia).
[539] Em determinadas modalidades, para manter as ligações de dissulfeto, os resíduos de cisteína podem ser manipulados em proteínas. O sucesso do uso de resíduos de cisteína introduzidos para conjugação sítio-específica depende da capacidade de selecionar sítios adequados nos quais a substituição de cisteína não altera a estrutura ou função da proteína. Para conseguir isto, o Phage Elisa for Selection of Reactive Thiols (PHESELECTOR) foi desenvolvido por meio da introdução de resíduos de cisteína reativos em um anticorpo-Fab (trastuzumabe-Fab 4D5) em vários sítios, exibição dos Fab sobre fagos e rastreio para identificar as cisteínas reativas que não interferem com a ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Junutula et al. (2008) J. Immunol Meth. 332: 41-52).
[540] Foi demostrado que a abordagem PHESELECTOR é eficiente e específica, especialmente comparado com a conjugação de cisteína convencional. Foi demonstrado que os sítios ideais para cisteína são encontrados usando, por exemplo, um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab) e o método PHESELECTOR também podem ser aplicados a anticorpos de comprimento total e os dados indicam que estes sítios funcionam bem para a conjugação sítio-específica com outros mAbs (ver, por exemplo, Boswell et al. (2011), Bioconjug Chem. 22: 1994-2004; Boswell et al. (2012) Soc. Nuclear Med. 53: 1454-1461; Shen et al. (2012), Nat. Biotechnol. 30: 184-189).
[541] Outra estratégia ilustrativa, mas não limitativa, para conjugação sítio-específica se foca sobre a inserção de aminoácidos com alças reativas bio-ortogonais, tais como aminoácidos de selenocisteína e o aminoácido não natural acetilfenilalanina (pAcPhe). Dois métodos foram desenvolvidos para empregar estes aminoácidos e ambos usam códons terminais. No entanto, um método incorpora selenocisteína (Sec) ao emparelhar o códon terminal opala, UGA, com uma sequência de inserção Sec e o outro método incorpora acetilfenilalanina no códon terminal âmbar, UAG, usando um par de tRNA/aminoaciltRNA sintetase. A selenocisteína, empregada pelo primeiro método, é muito similar aos aminoácidos cisteína, mas contém um átomo de selênio, em lugar do átomo de enxofre. O grupo selenolato é um nucleófilo mais reativo do que o homólogo de tiolato, tornando-o suscetível de conjugação com compostos eletrofílicos sob condições nas quais a selenocisteína é seletivamente ativada. Há aproximadamente 25 proteínas que contêm selênio conhecidas em mamíferos, incluindo proteínas tais como glutationa peroxidase e tioreductases (Kryukov et al. (2003), Science 300: 1439-1443). Sob condições normais, UGA codifica o término de transcrição; no entanto, na presença de uma sequência de inserção Sec (SECIS) localizada na 3'UTR de proteínas que contêm Sec, o término é impedido pela formação de uma estrutura secundária de mRNA e Sec é inserida no códon UGA (Caban e Copeland (2006) Cell Mol. Life Sci. 63: 73-81). A inserção de Sec pode ser manipulada em genes que não codificam Sec através da inserção do códon UGA e uma SECIS na extremidade 3' do gene. Esta técnica tem sido usada, inter alia, em marcação de Sec e subsequente conjugação sítio-específica de mAbs (ver, por exemplo, Hofer et al. (2009) Biochem. 48: 12047-12057).
[542] Ainda outro método ilustrativo para a conjugação sítio-específica usa o aminoácido não natural p- acetilfenilalanina (pAcPhe). pAcPhe contém um grupo ceto que pode ser seletivamente conjugado a um fármaco que contém um grupo alcóxi-amina através de uma ligação de oxima. Para incorporar pAcPhe em um anticorpo, o códon terminal âmbar é substituído no anticorpo na localização desejada. O cDNA de anticorpo é, em seguida, coexpresso com um tRNA supressor âmbar e a tRNA sintetase mutante corretamente emparelhada. A tRNA sintetase carrega pAcPhe sobre o tRNA âmbar e, assim, pAcPhe é incorporada no anticorpo no UAG do sítio âmbar (ver, por exemplo, Liu et al. 92007) Nat. Meth. 4: 239-244; Wang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 56-61; Axup (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: 16101-16116).
[543] Além de pAcPhe, outros aminoácidos não naturais são explorados para uso em conjugação sítio-específica usando processos similares que envolvem pares de tRNA/aminoacil- tRNA sintetase correspondentes (ver, por exemplo, Young (2002) J. Mol. Biol. 395: 361-374; Kiick et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 99: 19-24).
[544] Em várias modalidades, o uso de enzimas para catalizar a formação da ligação pode ser explorado para uso em conjugação sítio-específica. Por exemplo, a plataforma de glicotransferase usa uma glicotransferase mutante para anexar uma porção de açúcar quimicamente ativa em um sítio de glicosilação sobre um anticorpo. As moléculas de escolha podem, então, ser conjugadas à âncora química sobre a molécula de açúcar. Em outra abordagem ilustrativa, mas não limitativa, transglutaminase é usada para formar uma ligação entre um grupo amina do ligante/fármaco e um resíduo de glutamina modificado sobre o anticorpo.
[545] Glicotransferases são uma grande família de proteínas envolvidas na síntese de oligossacarídeos e são responsáveis pela transferência de um resíduo de açúcar de um nucleotídeo de açúcar ativado com um aceitador de açúcar ou glicoproteína/lipídio. As estruturas de várias glicotransferases são conhecidas e revelam que a especificidade do doador de açúcar é determinada por alguns aminoácidos na bolsa catalítica (Qasba et al. (2005) Trends Biochem Sci. 30: 53-62). Usando este conhecimento, os resíduos sofreram mutação na bolsa da glicotransferase, por exemplo, B4Gal-T1, para ampliar a especificidade do doador e permitir a transferência do resíduo de açúcar quimicamente reativo, 2-ceto-Gl (ver, por exemplo, Ramakrishnan et al. (2002) J. Biol . Chem. 277: 20833-20839). Esta tecnologia permite a capacidade de transferir um açúcar quimicamente reativo com qualquer lipídio ou proteína que contém um sítio de glicosilação. Anticorpos de IgG humana contêm um sítio de N-glicosilação em Asn-297 conservada do fragmento Fc. As glicanas ligadas a este sítio são geralmente complexas, mas podem ser degalactosiladas para G0, no qual uma glicotransferase mutante é capaz de transferir C2-ceto- Gal com alta eficiência (ver, por exemplo, Boeggeman et al. (2009) Bioconjug. Chem . 20: 1228-1236). O suporte químico ativo de C2-ceto Gal pode, então, ser acoplado a biomoléculas com um grupo ortogonal reativo. Esta abordagem tem sido usada com êxito para a conjugação sítio-específica do anticorpo anti-HER2, trastuzumabe, com amino-oxiacetamida Alexa Fluor 488 e é uma técnica viável para a geração sítio- específica de ADCs (Id.).
[546] A segunda plataforma usa transglutaminase para catalisar a formação de uma ligação covalente entre um grupo amina livre e uma cadeia lateral de glutamina. A transglutaminase de Streptoverticillium mobaraense (mTG) está comercialmente disponível e tem sido amplamente usada como um agente de ligação cruzada para proteínas (ver, por exemplo, Yokoyama et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 447-454). A mTG não reconhece qualquer um dos resíduos de glutamina de ocorrência natural na região Fc de anticorpos glicosilados, mas reconhece um "marcador de glutamina" que pode ser manipulado em um anticorpo (ver, por exemplo, Jeger et al. (2010) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49: 9995-9997). A título de ilustração, o marcador de glutamina, LLQG, foi desenvolvido em diferentes sítios do domínio constante de um anticorpo que tem como alvo o receptor do fator de crescimento epidérmico. A mTG foi, em seguida, usada para conjugar estes sítios com fluoroforos ou monometil dolastatina 10 (DAMM) e vários sítios onde se descobriu ter boas propriedades biofísicas e um elevado grau de conjugação. A mTG também foi capaz de conjugar os marcadores de glutamina em anticorpos anti-M1S1 e anti-Her2. Um conjugado de antiM1S1-vc-MMAD exibiu forte atividade in vitro e in vivo, sugerindo que a conjugação usando este método não altera a ligação ou afinidade do anticorpo e demonstra a utilidade desta abordagem na conjugação sítio-específica de ADCs (ver, por exemplo, Strop et al. (2013) Chem. Biol. 20: 161-167).
[547] Além de glicotransferases e transglutaminases, outras enzimas têm sido exploradas para uso na marcação de proteínas (Sunbul e Yin (2009) Org. Biomol. Chem. 7: 3361-3371). Uma de tais enzimas, a enzima geradora de formilglicina, reconhece a sequência CxPxR e oxida um resíduo de cisteína para formar formilglicina, deste modo, gerando uma proteína com um marcador de aldeído. O grupo aldeído pode, então, ser conjugado à molécula escolhida através, por exemplo, da química de hidrozino-Pictet-Spengler.
[548] Muitos outros procedimentos e moléculas de ligação para a ligação de vários compostos, incluindo quelatos de radionuclídeos metálicos, toxinas e fármacos às proteínas, tais como anticorpos, são conhecidos (ver, por exemplo, Pedido de Patente Europeia N° 188.256; Patentes US Nos 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; 4.569.789; e 4.589.071; e Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res 47: 4071-4075). Em particular, a produção de várias imunotoxinas é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada, por exemplo, em "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, páginas 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657, Patentes US Nos 4.545.985 e 4.894.443.
[549] Em algumas circunstâncias, é desejável liberar o efetor do anticorpo quando o imunoconjugado atingiu seu sítio alvo. Portanto, imunoconjugados que compreendem ligações que são cliváveis na proximidade do sítio de destino podem ser usados quando o efetor deve ser liberado no sítio alvo. A clivagem da ligação para liberar o agente a partir do anticorpo pode ser solicitada pela atividade ou condições às quais um imunoconjugado é submetido, quer no interior da célula alvo ou na proximidade do sítio enzimático alvo. Quando o sítio alvo é um tumor, um ligante o qual é clivável sob as condições presentes no local do tumor (por exemplo, quando expostos a enzimas associadas a tumores ou pH ácido) pode ser usado.
[550] Uma série de diferentes ligantes cliváveis são conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver Patentes US Nos 4.618.492; 4.542.225 e 4.625.014. Ligantes cliváveis ilustrativos incluem, porém sem limitações, ligantes instáveis em ácido, ligantes cliváveis por protease, ligantes de dissulfeto e assim por diante. Os ligantes instáveis em ácido são concebidos para serem estáveis em níveis de pH encontrados no sangue, mas se tornam instáveis e degradam quando o ambiente de baixo pH em lisossomas é encontrado. Ligantes cliváveis por protease também são concebidos para serem estáveis no sangue/plasma, mas liberam rapidamente o fármaco livre dentro dos lisossomos em células cancerosas após clivagem por enzimas lisossômicas. Eles tiram proveito dos níveis elevados de atividade de protease dentro dos lisossomas e incluem, tipicamente, uma sequência peptídica que é reconhecida e clivada por estas proteases, por exemplo, como ocorre com uma ligação dipeptídica Val-Cit que é rapidamente hidrolisada por catepsinas. Ligantes de dissulfeto exploram o alto nível de glutationa intracelular reduzida para liberar o fármaco livre dentro da célula.
[551] Em vista do grande número de métodos que foram reportados para a ligação de uma variedade de compostos radiodiagnósticos, compostos radioterapêuticos, fármacos, toxinas e outros agentes a anticorpos, aqueles versados na técnica serão capazes de determinar um método adequado para ligar um determinado agente a um anticorpo ou outro polipeptídeo.
Conjugação de Quelatos.
[552] Em determinadas modalidades, o efetor compreende um agente de quelação que está ligado a um anticorpo ou um marcador de epítopo. O anticorpo anti-CD46 tem um marcador de epítopo ou anticorpo correspondente, de modo que o simples contato do anticorpo com o quelato resulta em ligação do anticorpo com o efetor. A etapa de combinação pode ser realizada antes que a porção seja usada (estratégia de direcionamento) ou o tecido alvo pode ser ligado ao anticorpo antes que o quelato seja distribuído. Métodos de produção de quelatos adequados para acoplamento com várias porções de direcionamento são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Patentes US Nos: 6.190.923, 6.187.285, 6.183.721, 6.177.562, 6.159.445, 6.153.775, 6.149.890, 6.143.276, 6.143.274, 6.139.819, 6.132.764, 6.123.923, 6.123.921, 6.120.768, 6.120.751, 6.117.412, 6.106.866, 6.096.290, 6.093.382, 6.090.800, 6.090.408, 6.088.613, 6.077.499, 6.075.010, 6.071.494, 6.071.490, 6.060.040, 6.056.939, 6.051.207, 6.048.979, 6.045.821, 6.045.775, 6.030.840, 6.028.066, 6.022.966, 6.022.523, 6.022.522, 6.017.522, 6.015.897, 6.010.682, 6.010.681, 6.004.533 e 6.001.329).
Produção de Proteínas de Fusão.
[553] Onde o anticorpo e/ou o efetor é relativamente curto (por exemplo, menos do que cerca de 50 aminoácidos), eles podem ser sintetizados usando técnicas convencionais de síntese química de peptídeos. Onde ambas as moléculas são relativamente curtas, a molécula quimérica pode ser sintetizada na forma de um único polipeptídeo contíguo. Alternativamente, a molécula de direcionamento e a molécula efetora podem ser sintetizadas separadamente e depois fundidas por meio de condensação do terminal amino de uma molécula com o terminal carboxila da outra molécula, deste modo, formando uma ligação peptídica. Alternativamente, as moléculas de direcionamento e efetora podem ser condensadas com cada uma das extremidades de uma molécula espaçadora peptídica, deste modo, formando uma proteína de fusão contígua.
[554] A síntese em fase sólida na qual o aminoácido C- terminal da sequência é ligado a um suporte insolúvel, seguido pela adição sequencial dos aminoácidos restantes na sequência, é o método preferido para a síntese química dos polipeptídeos da presente invenção. Técnicas para a síntese em fase sólida são descritos por Barany e Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; páginas 3-284 em The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963) e Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2aed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).
[555] Em determinadas modalidades, as proteínas de fusão quiméricas da presente invenção são sintetizadas usando a metodologia de DNA recombinante. Em geral, isto envolve a criação de uma sequência de DNA que codifica a proteína de fusão, colocação do DNA em um cassete de expressão sob o controle de um promotor particular, expressão da proteína em um hospedeiro, isolamento da proteína expressa e, se necessário, renaturação da proteína.
[556] O DNA que codifica as proteínas de fusão da presente invenção pode ser preparado por meio de qualquer método adequado incluindo, por exemplo, clonagem e restrição de sequências adequadas ou a síntese química direta através de métodos tais como o método do fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; o método de fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109 151; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; e o método em suporte sólido da Patente US N° 4.458.066.
[557] A síntese química produz um oligonucleotídeo fita simples. Este pode ser convertido em DNA fita dupla por meio de hibridização com uma sequência complementar ou através de polimerização com uma DNA polimerase usando a fita simples como um modelo. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, embora a síntese química de DNA esteja limitada a sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas por meio de ligação de sequências mais curtas.
[558] Alternativamente, em determinadas modalidades, subsequências podem ser clonadas e as subsequências apropriadas clivadas usando enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos podem, então, ser ligados para produzir a sequência de DNA desejada.
[559] Em determinadas modalidades, o DNA que codifica as proteínas de fusão da presente invenção pode ser clonado usando métodos de clonagem por PCR.
[560] Embora o anticorpo e o efetor sejam, em determinadas modalidades, essencialmente ligados diretamente um ao outro, aqueles versados na técnica reconhecerão que as moléculas podem ser separadas por um espaçador, por exemplo, um espaçador peptídico que consiste em um ou mais aminoácidos (por exemplo, (Gly4Ser)3, SEQ ID NO: 80). Em geral, o espaçador não terá outra atividade biológica específica que não unir as proteínas ou preservar alguma distância mínima ou outra relação espacial entre elas. No entanto, os aminoácidos constituintes do espaçador podem ser selecionados para influenciar algumas propriedades da molécula, tais como a dobragem, carga líquida ou hidrofobicidade.
[561] As sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão podem ser expressas em uma variedade de células hospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, levedura e várias células eucariotas superiores, tais como as linhagens de células COS, CHO e HeLa, e linhagens de células de mieloma. O gene de proteína recombinante será operativamente ligado a sequências de controle de expressão apropriadas para cada hospedeiro.
[562] Os plasmídeos da presente invenção podem ser transferidos para a célula hospedeira escolhida através de métodos bem conhecidos, tais como a transformação com cloreto de cálcio para E. coli e o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação para células de mamífero. As células transformadas pelos plasmídeos podem ser selecionadas pela resistência aos antibióticos conferida pelos genes contidos nos plasmídeos, tais como os genes amp, gpt, neo e hyg.
[563] Uma vez expressas, as proteínas de fusão recombinantes podem ser purificadas de acordo com procedimentos convencionais na técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e assim por diante (ver, de modo geral, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y.). Substancialmente, composições puras de pelo menos cerca de 90 a 95 % de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99 % ou mais de homogeneidade são as mais preferidas para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade desejada, os polipeptídeos podem, então, ser usados terapeuticamente.
[564] Aqueles versados na técnica reconhecerão que, após a síntese química, expressão biológica ou purificação, a proteína de fusão pode ter uma conformação substancialmente diferente das conformações nativas dos polipeptídeos constituintes. Neste caso, pode ser necessário desnaturar e reduzir o polipeptídeo e, então, fazer com que o polipeptídeo venha a re-dobrar na conformação preferida. Métodos de redução e desnaturação de proteínas e indução de re-dobragem são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 1406514070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581585; e Buchner et al. (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270).
[565] Aqueles versados na técnica reconhecerão que modificações podem ser feitas nas proteínas de fusão sem reduzir sua atividade biológica. Podem ser feitas algumas modificações para facilitar a clonagem, expressão ou incorporação da molécula de direcionamento em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada ao terminal amino para fornecer um sítio inicial ou aminoácidos adicionais colocados em qualquer uma das extremidades para criar sítios de restrição convenientemente localizados ou códons terminais.
Composições Farmacêuticas.
[566] Os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento (por exemplo, YS5, YS5F, YS5vlD, SB1HGNY, YS12, 3G7RY (aka 3G8), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 e/ou UA8capa) e/ou imunoconjugados são úteis para administração parenteral, tópica, oral ou local (por exemplo, injetada no local de um tumor), administração por aerossol ou administração transdérmica, para fins profiláticos, mas principalmente para tratamento terapêutico. As composições farmacêuticas podem ser administradas em uma variedade de formas de dosagem unitária dependendo do método de administração. Por exemplo, as formas de dosagem unitárias adequadas para administração oral incluem pó, comprimidos, pílulas, cápsulas e pastilhas. É reconhecido que os anticorpos descritos no presente documento e/ou imunoconjugados e composições farmacêuticas compreendendo anticorpos descritos no presente documento e/ou imunoconjugados, quando administradas oralmente, são preferencialmente protegidos contra a digestão. Isto pode ser conseguido por vários meios conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, complexando a proteína com uma composição para torná-la resistente à hidrólise ácida e enzimática ou empacotando a proteína em um suporte adequadamente resistente tal como um lipossoma. Os meios para proteger as proteínas da digestão são bem conhecidos na técnica.
[567] Em várias modalidades, é proporcionada uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma ou uma combinação de anticorpos anti-CD46, ou porções de ligação ao antígeno, ou imunoconjugados destes, formulados em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[568] Tal como no presente documento usado, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Preferencialmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, raquidiana ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, por exemplo, anticorpo, imunoconjugado, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[569] Em certas modalidades, o anticorpo e/ou o imunoconjugado pode ser administrado na forma “nativa” ou, se for desejado, sob a forma de sais, ésteres, amidas, pró- fármacos, derivados e semelhantes, desde que o sal, amida, pró-fármaco ou derivado seja adequado farmacologicamente, isto é, eficaz no(s) presente(s) método(s). Os sais, ésteres, amidas, pró-fármacos e outros derivados dos agentes ativos podem ser preparados usando procedimentos convencionais conhecidos pelos especialistas na técnica de química orgânica sintética e descritos, por exemplo, por March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. N.Y. Wiley-Interscience, e como descrito acima.
[570] A título de ilustração, um sal farmaceuticamente aceitável pode ser preparado para qualquer dos anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento tendo uma funcionalidade capaz de formar um sal. Um sal farmaceuticamente aceitável é qualquer sal que retenha a atividade do composto original e não confira qualquer efeito prejudicial ou indesejável sobre o indivíduo ao qual é administrado e no contexto em que é administrado.
[571] Em várias modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser derivados de bases orgânicas ou inorgânicas. O sal pode ser um íon mono ou polivalente. De particular interesse são os íons inorgânicos, lítio, sódio, potássio, cálcio e magnésio. Os sais orgânicos podem ser preparados com aminas, particularmente sais de amônia tais como mono, di e trialquilaminas ou etanolaminas. Os sais também podem ser formados com cafeína, trometamina e moléculas semelhantes.
[572] Os métodos de formulação de agentes farmaceuticamente ativos como sais, éteres, amidas, pró- fármacos e semelhantes são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, os sais podem ser preparados a partir da base livre usando metodologia convencional que tipicamente envolve a reação com um ácido adequado. Geralmente, a forma de base do fármaco é dissolvida em um solvente orgânico polar tal como metanol ou etanol e o ácido é adicionado ao mesmo. O sal resultante precipita ou pode ser removido da solução pela adição de um solvente menos polar. Os ácidos adequados para a preparação de sais de adição de ácido incluem, mas não estão limitados a ambos, ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e semelhantes, bem como ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantes. Um sal de adição de ácido pode ser reconvertido para a base livre por tratamento com uma base adequada. Certos sais de adição de ácido, particularmente preferidos dos agentes ativos da presente invenção incluem sais de halogênio, tais como os que podem ser preparados usando ácidos clorídrico ou bromídrico. Inversamente, a preparação de sais básicos dos agentes ativos desta invenção é preparada de uma maneira semelhante usando uma base farmaceuticamente aceitável tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou semelhantes. Os sais básicos particularmente preferidos incluem sais de metais alcalinos, por exemplo, o sal de sódio e sais de cobre.
[573] Para a preparação de formas salinas de fármacos básicos, o pKa do contra-íon é preferencialmente pelo menos cerca de 2 unidades de pH inferiores ao pKa do fármaco. De modo semelhante, para a preparação de formas salinas dos fármacos ácidos, o pKa do contra-íon é preferencialmente pelo menos cerca de 2 unidades de pH superior ao pKa do fármaco. Isto permite que o contra-íon leve o pH da solução a um nível inferior ao pHmax para atingir o platô salino, em que a solubilidade do sal prevalece sobre a solubilidade do ácido livre ou da base. A regra generalizada de diferença nas unidades de pKa do grupo ionizável no ingrediente farmacêutico ativo (API) e no ácido ou na base se destina a tornar a transferência de prótons energeticamente favorável. Quando o pKa do API e do contra-íon não são significativamente diferentes, pode ser formado um complexo sólido, mas pode rapidamente se desproporcionar (isto é, se dividir nas entidades individuais do fármaco e contra-íon) em um ambiente aquoso.
[574] Preferencialmente, o contra-íon é um contra-íon farmaceuticamente aceitável. As formas de sal aniônico adequadas incluem, mas não estão limitadas a, acetato, benzoato, benzilato, bitartrato, brometo, carbonato, cloreto, citrato, edetato, edisilato, estolato, fumarato, gluceptato, gluconato, bromidrato, cloridrato, iodeto, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, brometo de metila, sulfato de metila, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), fosfato e difosfato, salicilato e desalicilato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tosilato, trietiodeto, valerato e semelhantes, Enquanto que as formas de sais catiônicos adequadas incluem, mas não estão limitadas a alumínio, benzatina, cálcio, etilenodiamina, lisina, magnésio, meglumina, potássio, procaína, sódio, trometamina, zinco e semelhantes.
[575] A preparação de ésteres tipicamente envolve a funcionalização de grupos hidroxila e/ou carboxila que estão presentes dentro da estrutura molecular do anticorpo e/ou imunoconjugado. Em certas modalidades, os ésteres são tipicamente derivados de acila substituídos de grupos álcool livres, isto é, porções que são derivadas de ácidos carboxílicos da fórmula RCOOH em que R é alqui, e preferencialmente é alquila de cadeia curta. Os ésteres podem ser reconvertidos para os ácidos livres, se for desejado, usando procedimentos de hidrogenólise ou hidrólise convencionais.
[576] As amidas podem também ser preparadas usando técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica ou descritas na literatura pertinente. Por exemplo, as amidas podem ser preparadas a partir de ésteres, usando reagentes aminados adequados, ou podem ser preparadas a partir de um anidrido ou um cloreto de ácido pela reação com amônia ou uma alquilamina de cadeia curta.
[577] As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento podem ser administradas sozinhas ou em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo ou imunoconjugado com pelo menos um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como os agentes anticâncer descritos abaixo. As composições farmacêuticas podem também ser administradas em conjunção com terapia de radiação e/ou cirurgia.
[578] Uma composição compreendendo os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na área técnica. Como será apreciado pelo especialista na técnica, a via e/ou o modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que irão proteger o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como vinilacetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos pelos especialistas na matéria (ver, por exemplo, Sustent and Controlled Release, Drug R. Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978).
[579] Em certas modalidades, a administração de um anticorpo anti-CD46 ou imunoconjugado pode ser facilitada pelo revestimento do anticorpo ou composição de imunoconjugado, ou coadministração do anticorpo ou imunoconjugado, um material para impedir a sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a solução salina e soluções tampão aquosas. Os lipossomas incluem, mas não estão limitados a, emulsões água-em-óleo-em-água de CGF assim como lipossomas convencionais (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol, 7: 27).
[580] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, está contemplado o seu uso nas composições farmacêuticas. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[581] Em várias modalidades, as composições terapêuticas são tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de produção e armazenamento. A(s) composição(ões) pode(m) ser formulada(s) como uma solução, uma microemulsão, em um lipídeo ou lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para conter concentrações elevadas do fármaco. Em certas modalidades, o veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida através da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[582] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo (por exemplo, anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento) na quantidade necessária em um solvente apropriado com uma, ou uma combinação de ingredientes acima enumerados, conforme requerido, seguido por esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários aos acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação ilustrativos incluem a secagem à vácuo e a secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.
[583] Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Por exemplo, em determinadas modalidades, os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento podem ser administrados uma ou duas vezes por dia, uma ou duas vezes por semana ou uma ou duas vezes por mês por injeção subcutânea.
[584] É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária tal como no presente documento usada se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados. Cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de dosagem unitária são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de composição de um tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.
[585] Em certas modalidades a formulação compreende um antioxidante farmacêutico. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
[586] Para as composições terapêuticas, as formulações adequadas dos anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento incluem as formulações para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de transporte para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de transporte para produzir uma forma de dosagem única será geralmente à quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade irá variar de cerca de 0,001 por cento a cerca de noventa por cento do ingrediente ativo, preferencialmente de cerca de 0,005 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferencialmente de cerca de 0,01 por cento a cerca de 30 por cento.
[587] As formulações de anticorpos e/ou imunoconjugados no presente documento descritas que são adequadas para administração vaginal também incluem pessários cervicais, absorventes, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo tais veículos que são conhecidas na técnica como sendo apropriadas. As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de anticorpos e/ou imunoconjugados no presente documento descritas incluem pós, aerossóis, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. Em certas modalidades, o composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários.
[588] As expressões “administração parenteral” e “administradas parenteralmente” tal como no presente documento usadas significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbitária, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóidea, intraspinal, epidural e intraesternal, e infusão.
[589] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser usados nas composições farmacêuticas compreendendo anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento incluem, mas não estão limitados a água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietilenoglicol e semelhantes), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e semelhantes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
[590] Em várias modalidades estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. Exemplos particulares de adjuvantes que são bem conhecidos na técnica incluem, por exemplo, adjuvantes inorgânicos (tais como sais de alumínio, por exemplo, fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio), adjuvantes orgânicos (por exemplo, esqualeno), adjuvantes à base de óleo, virossomas, virossomas que contêm uma hemaglutinina ligada à membrana e neuraminidase derivada do vírus influenza).
[591] A prevenção da presença de microrganismos nas formulações pode ser assegurada quer por procedimentos de esterilização, quer pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol-sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir nas composições agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
[592] Quando os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento são administrados como fármacos, a seres humanos e animais, podem ser administrados isoladamente ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,001 a 90 % (mais preferencialmente 0,005 a 70 % tal como 0,01 a 30 %) do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[593] Independentemente da via de administração selecionada, os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles especialistas na área técnica.
[594] Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos (por exemplo, anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento) nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente específico, a composição e o modo de administração, sem ser tóxico para ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregada, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico que está sendo usada, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares usadas, idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico prévio do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas. Um médico ou veterinário com conhecimentos correntes na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que os requeridos para se conseguir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até se conseguir o efeito desejado. Em geral, uma dose diária adequada de anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento será a quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. Em certas modalidades, é preferível que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, preferencialmente administrada próximo ao sítio alvo. Se for desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada em uma dose única, ou como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Embora seja possível que os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento sejam administrados sozinhos, é tipicamente preferível administrar o(s) composto(s) como uma formulação (composição) farmacêutica.
[595] Em certas modalidades, as composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade ilustrativa, os anticorpos e/ou imunoconjugados descritos no presente documento podem ser administrados com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos revelados nas Patentes US 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos úteis bem conhecidos são descritos, por exemplo, na Patente US 4.487.603, que descreve uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada, na Patente US 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele, na Patente US 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para administrar medicação a uma taxa de infusão precisa, na Patente US 4.447.224, que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para administração contínua de fármaco, na Patente US 4.439.196, que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco com compartimentos de várias câmaras, e na Patente US 4.475.196, que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco. Muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição e módulos são conhecidos pelos especialistas na técnica.
[596] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD46 e/ou imunoconjugados descritos no presente documento podem ser formulados para assegurar uma distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem a BBB (se for desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, por exemplo, as Patentes US 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a liberação direcionada do fármaco (ver, por exemplo, Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol., 29:685). As porções de direcionamento ilustrativas incluem, mas não estão limitadas a, folato ou biotina (ver, por exemplo, a Patente US N° 5.416.016); manosídeos (Umezawa et al., (1988) Biochem, Biophys Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140, Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor tensoativo de proteína A (Briscoe et al (1995) Am. J. Physiol., 1233: 134).
Kits.
[597] Quando um efetor radioativo ou outro, é usado como agente de diagnóstico e/ou terapêutico, é frequentemente impossível colocar a composição pronta para uso à disposição do usuário, devido à vida útil frequentemente baixa. O composto radiomarcado e/ou a meia-vida curta do radionuclídeo usado. Nesses casos, o usuário pode efetuar a reação de rotulagem com o radionuclídeo no hospital clínico, no consultório ou no laboratório. Para este fim, ou para outros fins, os vários ingredientes da reação podem então ser oferecidos ao usuário na forma de um chamado “kit”. O kit é preferencialmente concebido de modo que as manipulações necessárias para realizar a reação desejada devem ser tão simples quanto possível para permitir ao usuário preparar a partir do kit a composição desejada usando as instalações que estão à sua disposição. Por conseguinte, a invenção também se refere a um kit para preparar uma composição de acordo com esta invenção.
[598] Em certas modalidades, tal kit compreende um ou mais anticorpos ou imunoconjugados descritos no presente documento. Os anticorpos ou imunoconjugados podem ser proporcionados, se for desejado, com veículos inertes e/ou agentes de formulação e/ou agentes de formulação farmaceuticamente aceitáveis e/ou adjuvantes. Além disso, o kit inclui opcionalmente uma solução de um sal ou quelato de um radionuclídeo adequado (ou outro agente ativo) e (iii) instruções para uso com uma receita para administração e/ou reação dos ingredientes presentes no kit.
[599] O kit a ser fornecido ao usuário pode também compreender o(s) ingrediente(s) definido(s) acima, juntamente com instruções de uso, enquanto a solução de um sal ou quelato do radionuclídeo, definido no subitem (ii) tal solução tendo uma vida-útil limitada, pode ser posta à disposição do usuário separadamente.
[600] O kit pode opcionalmente, adicionalmente, compreender um agente redutor e/ou, se for desejado, um quelante e/ou instruções para uso da composição e/ou uma receita para fazer reagir os ingredientes do kit para formar o(s) produto(s) desejado(s). Se for desejado, os ingredientes do kit podem ser combinados, desde que sejam compatíveis.
[601] Em certas modalidades, o imunoconjugado pode simplesmente ser produzido combinando os componentes em um meio neutro e os fazendo reagir. Para esse efeito, o efetor pode ser apresentado ao anticorpo, por exemplo, na forma de um quelato.
[602] Quando o(s) componente(s) do kit é(são) usado(s) como componente(s) para administração farmacêutica (por exemplo, como um líquido de injeção) são preferencialmente estéreis. Quando o(s) constituinte(s) é(são) fornecido(s) em um estado seco, o usuário deve preferencialmente utilizar uma solução salina fisiológica estéril como solvente. Se for desejado, o ou os constituintes podem ser estabilizados de modo convencional com estabilizantes adequados, por exemplo, ácido ascórbico, ácido gentisico ou sais destes ácidos, ou podem compreender outros agentes auxiliares, por exemplo, agentes de enchimento, tais como glicose, lactose, manitol e semelhantes.
[603] Embora os materiais de instrução, quando presentes, compreendam tipicamente materiais escritos ou impressos, eles não estão limitados a tal. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e as comunicar a um usuário final, é contemplado por esta invenção. Esses meios incluem, mas não estão limitados a meios de armazenamento eletrônicos (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), meios ópticos (por exemplo, CD ROM) e semelhantes. Tais meios de comunicação podem incluir endereços de sítios da Internet que fornecem tais materiais de instrução. EXEMPLOS
[604] Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.
Exemplo 1 Novos anticorpos anti-CD46 e seus usos
[605] Para identificar novos anticorpos anti-CD46 humanos, foi criada uma proteína de fusão Fc recombinante composta dos domínios Sushi 1 e 2 do CD46 humano. À medida que os elementos do complemento se ligam predominantemente aos domínios 3 e 4, a escolha dos domínios 1 e 2 minimiza a seleção de anticorpos que possam interferir potentemente com a função normal do complemento. Esta fusão CD46-Fc foi produzida e purificada a partir de células HEK293 transfectadas por cromatografia de afinidade com proteína A. Para a seleção de anticorpos humanos, foi criada uma biblioteca de exibição de fagemídeos de 5 x 109 membros usando cDNAs reunidos a partir de células mononucleares de sangue periférico de 426 dadores humanos saudáveis, e na biblioteca foi selecionada a proteína de fusão CD46-Fc recombinante. Após três rodadas de seleção, os fagemídeos de ligação foram rastreados por FACS e sequenciados. Em paralelo, foi utilizado uma estratégia alternativa que primeiramente envolve a seleção da biblioteca em células tumorais vivas seguida da transferência do resultado da rodada 1 de seleção de fagemídeos em um vetor de apresentação de superfície de levedura e, em seguida, seleção baseada em FACS usando ligantes de baixa concentração para enriquecer ligantes de elevada afinidade para a proteína de fusão CD46- Fc recombinante. Os anticorpos resultantes se ligam com elevada afinidade a ambas as células tumorais vivas e à proteína CD46 recombinante humana. Todos os clones de ligação foram sequenciados e as sequências únicas estão listadas na Tabela 1.
[606] Os scFv foram convertidos em IgG1s humanas completos e as afinidades de ligação foram medidas em células tumorais vivas. Os dados de ligação a FACS foram ajustados em curva para gerar valores de KD (Figura 2 para YS5 em Du- 145 e Figura 3 para YS12 em Du-145). As afinidades variam de baixa a sub-nanomolar (nM) para os anticorpos estudados.
[607] Adicionalmente ao CD46 humano, os anticorpos descritos no presente documento se ligam ao CD46 do macaco- cinomolgo (Figura 4) com afinidades semelhantes (Figura 5 para YS5 em CHO-huCD46 e Figura 6 YS5 em CHO-cynoCD46), identificando assim uma espécie apropriada para estudos de toxicologia regulatória.
[608] Todos os anticorpos anti-CD46, juntamente com os UA20 e 2B10 previamente identificados, se ligam aos domínios 1 e 2 de Sushi CD46. Esta região foi ainda analisada para revelar diferenças entre epítopos. Primeiro realizamos experimentos de competição baseados em FACS em células tumorais vivas e descobrimos que nossos anticorpos competem ou não competem com UA20-Fc: o Grupo 1 consiste em YS5 e outros, e o Grupo 1 consiste em SB1HGNY (Figura 7). Para anticorpos no Grupo 1, existem diferenças de epítopos adicionais como evidenciado pelo efeito seletivo da ligação do anticorpo a vários mutantes de CD46 (Tabela 3). Por exemplo, o YS5 difere de outros anticorpos, uma vez que a mutação na posição 39 afeta exclusivamente a sua ligação (Tabela 3), sugerindo que a posição 39, juntamente com a posição 40 que impacta a ligação para todos os anticorpos, faz parte do epítopo para a ligação de YS5 a CD46. Tabela 3. A varredura de alanina revela diferenças entre epítopos. As alterações de resíduos de CD46 são como indicadas (linha superior, E13A, posição 13 alterada de E para A etc.). A ligação a células CHO transfectadas com vários mutantes construídos foi quantificada por FACS com MFI normalizada contra células CD46-transfectadas de tipo selvagem. Uma perda significativa da ligação é indicada por sombreamento em cinza. R40A reduziu a ligação para todos os anticorpos, indicando que a posição 40 é um sítio de contato crítico para todos. D39A afeta exclusivamente a ligação a YS5, indicando que a posição 39 é um sítio de contato único que contribui para a ligação a YS5 (e YS6), mas não a outros anticorpos listados na tabela. YS6 difere de YS5 como ele é seletivamente afetado pela mutação na posição 31 (P31A).
[609] Todos os anticorpos competem com a cepa laboratorial (Edmonston) da proteína H do vírus do sarampo. O vírus do sarampo entra nas células alvo por macropinocitose (Crimeen-Irwin et al (2003) J. Biol. Chem. 278: 46927-46937). A proteína H é sensível à ligação e reticulação da superfície da célula CD46, que é necessária para a entrada viral (Id.). Para determinar se os nossos anticorpos competem com a proteína de ligação H à CD46, foi criada uma proteína de fusão H-Fc recombinante e foi testada por FACS para competição com os anticorpos anti-CD46. Foi verificado que os anticorpos testados competem com a proteína H (Figura 8), sugerindo sítios de ligação sobrepostos.
[610] Como o vírus do sarampo entra nas células alvo através da macropinocitose, foi determinado em seguida se os anticorpos anti-CD46 também são internalizados pelas células tumorais através da maicropinocitose. Usando um dextrano de densidade neutra de 70 kDa (ND70) como indicador para macropinocitose (Ha et al. (2014) Mol. Cell Proteomics 13 (12): 3320-3331), foi verificado que que os anticorpos anti- CD46 são efetivamente internalizados pela via da macropinocitose (Figura 9). A macropinocitose é seletiva inerentemente ao tumor (Commisso et al., (2013) Nature, 497: 633-637, Ha et al. (2014) Mol. Cell Proteomics 13 (12): 33203331; Reyes-Reyes et al.) Cancer Res. 70: 8617-8629), conferindo assim os anticorpos anti-CD46 com uma seletividade adicional para as células tumorais.
[611] Para validar CD46 como um alvo para desenvolvimento terapêutico dirigido, a especificidade tecidual do epítopo CD46 foi determinada por imuno-histoquímica. A expressão do epítopo CD46 no tumor foi primeiramente estudada. Estudos de imuno-histoquímica foram realizados tanto em tecidos de câncer de próstata congelados e fixados em parafina e embebidos em formalina (FFPE). Em tecidos congelados, 18/18 casos (100 %) apresentaram fortes sinais de coloração, indicando sobre-expressão em todos os casos. Nos tecidos FFPE, a coloração CD46 forte foi encontrada em 63/87, coloração moderada em 23/87 e fraca coloração em 1/87 casos, o que confirma a conclusão de que o CD46 é sobre-expresso em uma grande maioria dos tumores da próstata. Um resumo dos resultados da imuno-histoquímica é mostrado na Tabela 4 e na Figura 10. Tabela 4. Resultados da imuno-histoquímicas da expressão de CD46 em tecidos de câncer de próstata. Estão indicados os casos positivos vs. FFPE: parafina fixa em formalina (tecidos). Foram usados anticorpos anti-CD46 humanos marcados com biotina para este estudo.
[612] Os estudos acima mencionados suportam fortemente o desenvolvimento de um anticorpo monoclonal dirigido contra CD46 contra o câncer humano. Para este fim, os conjugados de anticorpo (ADC) foram desenvolvidos usando o painel de novos anticorpos anti-CD46. Monometil auristatina F (MMAF) foi conjugado através do ligante MC-vc-PAB (McDonagh et al (2008) Mol. Canc. Therap. 7: 2913-2923, Sutherland et al (2006) J. Biol. Chem. 281 : 10540-10547) para YS5 IgG1. Por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), foi determinado que, em média, cerca de 3 fármacos foram conjugados por molécula de anticorpo (Figura 11). As atividades de morte tumoral in vitro foram então testadas usando um painel de linhas de células de câncer de próstata resistentes à castração metastática (LNCaP-C4-2B e Du145). Foi observada uma potente morte de células tumorais com valores de EC50 variando de baixo a sub nM (Figuras 12 e 13).
[613] A atividade antitumoral in vivo dos ADC anti-CD46 foi testada usando o modelo de xenotransplante subcutâneo LNCaP-C4-2B. A inibição potente do crescimento e sobrevivência do tumor foi observada, com volume tumoral reduzido para níveis não detectáveis após 5 doses a 5 mg/kg (Figura 14). Nenhum tumor recidivou durante o período indicado após a injeção de ADC (Figura 14).
[614] Adicionalmente ao câncer de próstata, foi verificado que os ADC anti-CD46 matam potencialmente vários outros cânceres que expressam CD46. Por exemplo, foi verificado que além do câncer de próstata, o CD46 também é altamente expresso na superfície de células de mieloma múltiplo (Figura 15). Além disso, o ADC anti-CD46 mata potentemente a linhagem de células de mieloma múltiplo RPMI8226 (Figura 16) com EC50 na faixa sub nM. Finalmente, foi demonstrado que o ADC anti-CD46 reduziu fortemente as cargas de mieloma múltiplo in vivo. Uma linhagem repórter de expressão (RPMI8226-Luc que expressou o gene da luciferase do vagalume) foi injetada através da veia da cauda de camundongos comprometidos imunologicamente e foi permito que as células tumorais disseminadas se estabeleçam no osso e nas articulações. Quatro doses de ADC anti-CD46 foram então injetadas a 5 mg/kg (a cada 4 dias) e o estado do tumor foi monitorado por bioluminescência. Foi verificado que os ADC anti-CD46 são altamente eficazes na redução das cargas tumorais in vivo (Figura 17). Os dados de sobrevivência foram coletados após tratamento com ADC (Figura 18), mostrando uma “cura” para 60 % dos camundongos tratados e atrasando muito o início da morte para os 40 % restantes durante a duração da experiência.
[615] Para ampliar a aplicabilidade, o ADC anti-CD46 foi estudado usando uma segunda linhagem de células de mieloma múltiplo MM1.S que expressa o repórter da luciferase. Foi observada uma potente atividade de morte tumoral do ADC anti- CD46 in vivo. Quatro doses a 4 mg/kg eliminaram completamente as células tumorais MM1.S (Figura 20). Em contraste, o ADC controle (MMAF conjugado com um anticorpo não ligante) não teve qualquer efeito na mesma dose e frequência de dosagem. Além disso, mesmo uma dose única de ADC anti-CD46 a 4 mg/kg reduziu significativamente a carga tumoral, causando uma profunda inibição do desenvolvimento do tumor (Figura 20). Quatro doses de ADC anti-CD46 a 0,8 mg/kg também causaram uma inibição duradoura do desenvolvimento do xenoenxerto MM1.S (Figura 20). Finalmente, mesmo o anticorpo nu (YS5 IgG1) causou significativa inibição tumoral neste modelo de xenoenxerto (Figura 20), sugerindo uma interessante possibilidade de uma potencial terapia com anticorpos nus para certos subtipos de mieloma múltiplo.
[616] A análise de Kaplan-Meier foi realizada para determinar a sobrevivência pós-tratamento. Os grupos tratados com ADC CD46 mostraram uma significativa vantagem de sobrevivência em relação aos grupos controle (Figura 21). Para camundongos que receberam 4 doses de 4 mg/kg CD46 ADC, todos sobreviveram até ao final da experiência (dia 212).
[617] Além do câncer de próstata e do mieloma múltiplo acima mencionados, foi verificado que o CD46 é altamente expresso em um amplo painel de linhagens celulares de câncer incluindo, mas não se limitando a, câncer colorretal, câncer pancreático, mesotelioma, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do ovário, câncer da bexiga, câncer do fígado, glioma e neuroblastoma. Além disso, os ADC anti-CD46 mataram potentemente estas células in vitro. Por exemplo, o ADC anti- CD46 é altamente eficaz na morte de células de câncer colorretal (Figura 19 para YS5, Figura 22 para YS12 em HT29 e Figura 23 para SB1HGNY em HT29), células de câncer pancreático (Figura 24), células de mesotelioma (Figura 25) e células de câncer do ovário (Figura 26).
[618] Para avaliar a toxicidade potencial, o ADC YS5 foi testado em um painel de células controle que não expressam CD46 (BPH-1) ou que o expressam a níveis moderados (por exemplo, HS27). Foi observada uma citotoxicidade muito reduzida nessas células (Figura 27 para YS5 ADC sobre BPH- 1, Figura 28 para YS5 ADC sobre HS27, Figura 29 para YS5 ADC sobre células T normais e Figura 30 para YS5 ADC sobre células CD14- mononucleares empobrecidas de sangue periférico (PBMC)), sugerindo que elas não aceitam prontamente as ADCs. A internalização diferencial através da macropinocitose é um mecanismo provável que aumenta a seletividade de ADCs anti-CD46.
[619] A toxicidade do ADC foi estudada in vivo usando camundongos transgênicos que expressam CD46 humano. Não existe um verdadeiro ortólogo murino para o CD46 humano e o CD46 murino desempenha um papel fisiológico muito diferente do que o do CD46 humano. Os anticorpos não se ligaram ao CD46 murino. Assim, não existe um modelo de animal pequeno bom para avaliação da potencial toxicidade ADC anti-CD46 exceto para o modelo transgênico. O ADC anti-CD46 foi injetado a 6 mg/kg em camundongos transgênicos expressando CD46 humanos, e os animais foram monitorados diariamente para detectar sinais evidentes de toxicidade. Os animais foram sacrificados ao dia 14 e os órgãos vitais foram coletados para exame histológico de lesões teciduais. Conforme ilustrado na Figura 31, não há diferença notável entre os camundongos tratados com ADC anti-CD46 e os tratados com ADC. Não se observou nenhum sinal evidente de toxicidade durante a duração desta experiência com esta dose de ADC testada. Deve ser entendido que os estudos de toxicologia reguladora necessitam de ser realizados em primatas não humanos tais como o macaco- cinomologus cujo CD46 é reconhecido pelos anticorpos anti-CD46 como mostrado acima.
[620] Dado que o gene CD46 humano está localizado no braço curto do cromossomo 1 (1q32.2), e dado que o ganho de 1q foi frequentemente observado em uma variedade de cânceres, especialmente aqueles com mau prognóstico, é provável que anticorpos anti-CD46 incluindo, mas não se limitando a ADCs são aplicáveis a um amplo espectro de malignidades em estádios avançados com extrema necessidade terapêutica. Por exemplo, no câncer de próstata, a região que abrange 1q32.2 demonstrou ganhar na forma metastática disseminada da doença, onde as terapêuticas atuais não conseguiram produzir um impacto (Hanamura et al., 2006) Blood, 108: 1724-1732 ), Tornando o câncer de próstata resistente à castração metastática um excelente candidato para o nosso tratamento anti-CD46 ADC. No mieloma múltiplo, o ganho de 1q também é frequentemente observado em pacientes recorrentes (Id.), identificando assim uma importante população de pacientes que nossos CDAs anti-CD46 poderiam potencialmente ajudar. A correlação entre ganho de 1q (e especificamente 1q32.2) e mau prognóstico também tem sido observada para outros tipos de câncer, tornando 1q um biomarcador potencial para nossos ADCs anti-CD46 para estratificação de pacientes e monitoramento de resultados para esses tumores malignos. A sonda FISH detectando 1q32.2 pode ser usada para avaliar o estado 1q. O DNA circulante também pode ser usado para detectar ganho de 1q como um biomarcador minimamente invasivo (Fan et al (2008) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 105: 16266 16271) para cânceres que expressam CD46 com mau prognóstico.
[621] Os anticorpos anti-CD46 descritos no presente documento podem ser usados em uma sonda de imagem para monitorar o estado do tumor in vivo, quer como um agente de imagem independente quer como um diagnóstico complementar para os ADC anti-CD46. Já marcamos anteriormente o anticorpo anti-CD46 original UA20 e demonstramos a sua excelente propriedade de obtenção de imagens in vivo para a determinação do câncer de próstata (He et al (2010) J. Nucl Med. 51: 427-432). Além dos exames de imagem, os anticorpos anti-CD46 podem, em biomarcadores baseados em imuno- histoquímica, avaliar a expressão de CD46 em biópsias e amostras arquivadas de pacientes, ensaios ELISA capturados para avaliar os níveis séricos de CD46 e FACS ou ensaios baseados em chip para avaliar a expressão de superfície celular CD46 em células disseminadas e/ou células tumorais circulantes.
Exemplo 2 ADC CD46 é altamente ativo no modelo de xenoenxerto intra- femoral mCRPC.
[622] Como mais de 95 % da metástase do câncer de próstata está no local do osso, estudamos mais a eficácia do nosso ADC anti-CD46 em um modelo de xenoenxerto ósseo. Foi injetada a linhagem de células de câncer de próstata metastático resistente à castração (mCRPC) LNCaP C4-2B que transporta um repórter de luciferase de vagalume no fêmur de camundongos NSG para criar o modelo de xenoenxerto intraósseo mCRPC. O CD46 ADC (YS5-mcvcpab-MMAF) foi injetado 7 dias após a enxertia a cada 4 dias para um total de 4 vezes. O estado tumoral foi monitorado por imagens de bioluminescência durante e após o tratamento. Conforme ilustrado na Figura 32, os camundongos tratados com ADC CD46 mostraram uma inibição profunda do tumor que durou até o final do experimento (dia 65), sugerindo que o nosso CD46 ADC é altamente eficaz neste modelo de xenoenxerto intracorpóreo femoral.
CD46 é altamente expresso nos tecidos CRPC e mCRPC.
[623] Além de tumores primários, realizamos estudos de imuno-histoquímica em amostras de tecido de câncer de próstata resistente à castração (CRPC) e câncer de próstata metastático resistente à castração (mCRPC). Conforme ilustrado na Figura 33, o CD46 é altamente expresso em amostras de CRPC. Estudou-se ainda os espécimes mCRPC e encontramos extensa (100 % dos casos estudados, ou 12/12) e forte expressão de CD46 na metástase óssea (Figura 34), metástase dos nódulos linfáticos (Figura 35) e metástase da bexiga (Figura 36).
CD46 é sobre-expresso pelo subtipo neuroendócrino do câncer de próstata.
[624] Cerca de 30 % dos pacientes são resistentes ao tratamento com abiraterona e enzalutamida. A emergência do câncer de próstata tipo células pequenas/neuroendócrino pode ser um evento frequente (~30-40 % dos casos). Ao contrário do adenocarcinoma, o câncer de próstata neuroendócrino muitas vezes não expressa marcadores comuns tais como o antígeno específico da próstata (PSA) e o antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). Portanto, buscamos estudar a expressão por FACS CD46 em uma linhagem de células de câncer de próstata neuroendócrina H660. Conforme ilustrado na Figura 37, painel esquerdo, CD46 é altamente expresso por células H660. A análise por Western-blot confirmou que as células H660 expressam CD46 e a enolase específica do neurônio marcador neuroendócrino (NSE) (Figura 37, painel direito). Nosso anticorpo anti-CD46 (YS5) é internalizado por células H660 e co-localizado com o marcador lisossomal LAMP1 (Figura 38). Quando incubadas com células H660, o nosso ADC anti-CD46 apresentou potente atividade citotóxica in vitro com EC50 <1 nM (Figura 39).
CD46 é adicionalmente sobre-regulado positivamente por células de câncer de próstata após tratamento com abiraterona ou enzalutamida, tornando-as suscetíveis a ADC CD4 6.
[625] Foi verificado que o tratamento da linhagem mCRPC LNCaP-C4-2B com 10 μM de abiraterona durante 7 dias causou uma sub-regulação significativa da expressão de CD46 de superfície (Figura 40). Curiosamente, esta sobre-regulação é correlacionada com uma morte aumentada de células tumorais (Figura 41) com valores de EC50 caindo de 169 pM para 21 pM. De forma semelhante, quando a linhagem de células de câncer de próstata neuroendócrina H660 foi incubada com 10 μM de enzalutamida durante 7 dias, foi observada uma sobre- regulação significativa da superfície celular CD46 (Figura 42). Tal como o que se observou nas células LNCaP-C4-2B, as células H660 se tornaram mais sensíveis ao tratamento com CD46 ADC pós-enzalutamida com EC50 caindo por 4-5 vezes.
CD46 em tumores adicionais.
[626] Além do câncer de próstata e do mieloma múltiplo, foi verificado que o CD46 é sobre-expresso em uma ampla faixa de cânceres humanos. Por análise imuno-histoquímica, encontramos coloração CD46 positiva em 82 % de câncer colorretal (81/99 casos) com 70/99 mostrando forte coloração (71 %) (Figura 43). Curiosamente, quase 100 % dos cânceres colorretais metastáticos expressam CD46 (metástases hepáticas na Figura 44, metástases dos nódulos linfáticos na Figura 45 e metástases da bexiga na Figura 46).
[627] A coloração CD46 positiva também foi observada em 41/50 dos casos (82 %) de mesotelioma com 31/50 mostrando forte coloração (62 %) (Figura 47). No câncer pancreático, a coloração CD46 positiva foi observada em 28/50 dos casos (56 %) (Figura 48). No glioblastoma multiforme (GBM), a coloração positiva foi observada em 30/40 (75 %) dos casos (Figura 49).
[628] Foi verificado que também a coloração positiva em outros tumores incluindo, mas não se limitando a câncer da bexiga, câncer do ovário, câncer do estômago, câncer do pulmão, câncer do fígado, câncer da mama e linfoma.
CD46 ADC é eficaz contra outros tumores.
[629] Além dos estudos in vitro, foi realizado um estudo in vivo de ADC CD46 sobre xenoenxertos de mesotelioma executados em camundongos NSG. Conforme ilustrado na Figura 50, YS5-mcvcpab-MMAF é altamente eficaz na inibição do desenvolvimento de xenoenxertos tumorais.
[630] Deve ser entendido que os exemplos e modalidades no descritos presente documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações na sua visão serão sugeridas aos técnicos no assunto e devem ser incluídas no espírito e no escopo desta aplicação e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente no presente documento citados são incorporados no presente documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

Claims (39)

1. Anticorpo humano isolado que se liga especificamente a CD46 e é internalizado, via macropinocitose, em uma célula que expressa ou que sobre- expressa CD46, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo humano isolado se liga especificamente às células que expressam ou sobre-expressam CD46, e em que o referido anticorpo humano isolado se liga especificamente ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto aos anticorpos: YS5 (representado pelas SEQ ID NOs: 1 e 22), YS5F (representado por SEQ ID NOs: 2 e 23) ou YS5vlD (representado pelas SEQ ID NOs: 3 e 24).
2. Anticorpo , de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo humano isolado compreende a cadeia pesada variável (VH) CDR1, VH CDR2, VH CDR3, a cadeia leve variável (VL) CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em YS5 (SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 227, 229 e 231), YS5F ( SEQ ID NOs: 87, 89, 91, 234, 236 e 238) e YS5vID (SEQ ID NOs: 94, 96, 98, 241, 243 e 245).
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo se liga a células que expressam ou sobre-expressam CD46, e as referidas células que expressam ou sobre-expressam CD46 são células cancerígenas.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que as referidas células que expressam ou sobre-expressam CD46 são células de câncer de próstata.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado é uma imunoglobulina substancialmente intacta.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado compreende uma IgA, IgE ou IgG.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado compreende uma IgG1.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado é um fragmento de anticorpo que se liga especificamente a células que expressam ou sobre-expressam um CD46.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, (Fab')2, (Fab')3, IgGΔCH2 e um minicorpo.
10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo humano isolado é um anticorpo de cadeia única.
11. Imunoconjugado, caracterizadopelo fato de que compreende um anticorpo, conforme definido na reivindicação 2, unido diretamente ou através de um ligante a um efetor, em que o referido efetor é selecionado do grupo que consiste em um segundo anticorpo, um marcador detectável, uma citotoxina ou agente citostático, um lipossoma contendo um medicamento, um radionuclídeo, um fármaco, um pró- fármaco, uma partícula viral, uma citocina e um quelato.
12. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo está ligado a uma citotoxina.
13. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo é unido diretamente ou através de um ligante a um ou mais dos seguintes: o dito fármaco; um lipídio ou lipossoma contendo o dito fármaco; um carreador de fármaco polimérico compreendendo o dito fármaco; e um carreador de fármaco de nanopartículas compreendendo o dito fármaco.
14. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o efetor compreende um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em Monometilauristatina F (MMAF), Auristatina E (AE), Monometilauristatina E (MMAE), vcMMAE, e vcMMAF.
15. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo é ligado ao referido efetor através de um ligante MC-vc-PAB.
16. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a proporção do referido efetor para o referido anticorpo é 2 ou 4.
17. Formulação farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende: um excipiente farmaceuticamente aceitável e um anticorpo, conforme definido na reivindicação 2; e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e um imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 15.
18. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadapelo fato de que a dita formulação é uma formulação de dosagem unitária.
19. Formulação, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadapelo fato de que é formulada para administração através de uma via selecionada a partir do grupo que consiste em administração oral, administração nasal, administração retal, injeção intraperitoneal, injeção intravascular, injeção subcutânea, administração transcutânea, e injeção intramuscular.
20. Uso de um anticorpo, conforme definido na reivindicação 2, ou de um imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 15, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar câncer, em que a célula de câncer sobre-expressa CD46.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a dita célula de câncer é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de rim, câncer pancreático, mesotelioma, linfoma, câncer de fígado, câncer urotelial, câncer de estômago, mieloma múltiplo, glioblastoma multiforme, glioma, neuroblastoma, e câncer de colo do útero.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a dita célula de câncer é uma célula de câncer de próstata.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a dita célula de câncer é uma célula de um câncer de próstata resistente à castração.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a dita célula é uma célula metastática.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a dita célula metastática é uma metástase óssea, uma metástase de fígado, uma metástase de bexiga, e/ou uma metástase linfonodal.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a dita célula é uma célula de tumor sólido.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo compreende um radionuclídeo e/ou um fármaco citostático.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo compreende um ou mais dos seguintes: um fármaco citotóxico e/ou citostático; um lipídio ou lipossoma contendo um fármaco citotóxico e/ou citostático; um carreador de fármaco polimérico compreendendo um fármaco citotóxico e/ou citostático; e um carreador de fármaco de nanopartículas compreendendo um fármaco citotóxico e/ou citostático.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o dito fármaco é um fármaco anticâncer.
30. Uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o dito fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em auristatina, dolastatina, colquicina, combretastatina, e inibidores de mTOR/PI3K.
31. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o dito fármaco é monometil auristatina F.
32. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o dito fármaco é monometil auristatina E.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que: o dito fármaco é conjugado diretamente ao dito anticorpo; ou o dito fármaco está contido em um lipídio ou lipossoma unido ao dito anticorpo; ou o dito fármaco está contido em um carreador polimérico e/ou de nanopartículas unido ao dito anticorpo.
34. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o dito medicamento é formulado para: administração parenteral; e/ou administração em um tumor ou um sítio cirúrgico.
35. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é administrado como uma terapia adjunta à cirurgia e/ou radioterapia.
36. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é administrado em conjunto com um outro fármaco anticâncer e/ou um hormônio.
37. Uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo é administrado em conjunto com abiraterona e/ou enzalutamida.
38. Ácido nucleico, caracterizadopor codificar um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo, conforme definido na reivindicação 2, em que o referido anticorpo humano isolado compreende a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5. anticorpo (representado pelas SEQ ID NOs. 1 e 22).
39. Vetor de expressão, caracterizadopelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 38, em que o referido anticorpo humano isolado compreende: a cadeia leve variável (VL) do anticorpo YS5 e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo YS5 (representada pela SEQ ID NOs. 1 e 22).
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