KR102559731B1 - 대음세포작용 인간 항-cd46 항체 및 표적화된 암 치료제 - Google Patents

대음세포작용 인간 항-cd46 항체 및 표적화된 암 치료제 Download PDF

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Abstract

다양한 실시양태들에서, 대음세포작용 경로를 통해 종양 세포 내로 내재화되고 들어가는 인간 항-CD46 항체들뿐만 아니라, CD46 과다발현 종양의 진단적 및/또는 치료적 표적화를 위해 이들 항체들로부터 개발된 항체-약물 접합체들(ADC들)도 제공된다.

Description

대음세포작용 인간 항-CD46 항체 및 표적화된 암 치료제{MACROPINOCYTOSING HUMAN ANTI-CD46 ANTIBODIES AND TARGETED CANCER THERAPEUTICS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본원은 모든 목적들을 위해 전체적으로 본원에 참고로 도입되는, 2014년 9월 12일자로 출원된 미국 특허출원 제62/049,973호의 이익 및 우선권을 주장한다.
연방 지원 연구 및 개발 하에서 만들어진 발명에 대한 권리에 관한 진술
본 연구는 부분적으로 국립보건원으로부터 승인번호 R01 CA118919, R01 CA129491 및 R01 CA171315에 의해 지원받았다. 정부는 본 발명에 대한 일부 권리를 가진다.
용이한 접근가능성으로 인해, 종양 세포 표면 항원은 치료제 개발을 위한 귀중한 표적이다. 세포 표면의 에피토프 공간은 매우 복잡하다. 관련 항원은 게놈 카피 수 또는 mRNA 발현 수준의 연구로부터 용이하게 예측될 수 없는 글리코실화된 단백질 및 다른 번역 후 변경된 생성물을 포함할 수 있다(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Kobata and Amano (2005) Immunol. Cell Biol. 83: 429-439; Birkle et al. (2003) Biochimie (Paris) 85: 455-463; Hakomori (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 491: 369-402; Hanisch, F. G. (2001) O-Glycosylation of the mucin type. Biol. Chem. 382, 143-149; Ugorski and Laskowska (2002) Acta Biochim. Pol. 49: 303-311).
종양 세포 표면 에피토프의 확인은 적용, 예컨대, 항체 의존적 세포 세포독성의 유도(예를 들면, 문헌(Clynes et al. (2000) Nat. Med. 6: 443-446) 참조), 또는 종양 세포 이동, 성장 및 생존에 관여하는 신호전달 경로의 억제(예를 들면, 문헌(McWhirter et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 103: 1041-1046; Fuh et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 6625-6631) 참조)에서 이용될 수 있는 능력인 신생물성 세포에의 특이적 결합을 달성할 항체의 생성을 가능하게 한다. 추가로, 내재화시키는 종양 에피토프를 표적화하는 항체는 세포독소, 세포증식억제제, 화학요법 약물 및/또는 다른 종양 조절제의 효율적 및 특이적 세포내 전달을 달성하도록 활용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Nielsen et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1591: 109-118; Pirollo et al. (2006) Hum. Gene Ther. 17: 117-124; Song et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:709-717; Liu et al. (2002) J. Mol. Biol. 315: 1063-1073) 참조).
파지 항체 디스플레이는 암 특이적 항체를 개발하는 데 널리 사용되고 있다(예를 들면, 문헌(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Liu and Marks (2000) Anal. Biochem. 286: 119-128; 15. Marks et al. (1992) Biotechnology (N. Y.) 10: 779-783; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Sharon et al. (2005) J. Cell. Biochem. 96: 305-313; Silacci et al. (2005) Proteomics 5: 2340-2350; Gao et al. (2003) J. Immunol. Methods 274: 185-197; Lekkerkerker and Logtenberg (1999) J. Immunol. Meth., 231: 53-63; de Kruif et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 3938-3942; Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776) 참조). 조합 파지 항체 라이브러리는 암세포 표면 상의 신생물성 변이를 프로빙하는 데 사용될 수 있는 무작위 형태 레퍼토리의 공급원으로서 작용한다(예를 들면, 문헌(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Geuijen et al. (2005) Eur. J. Cancer 41: 178-187; Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161; Cai and Garen (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 6537-6541) 참조). 암세포주에 대한 파지 항체 라이브러리의 직접적 선택은 표적 항원의 종래 지식 없이 종양 표적화 항체의 확인을 가능하게 한다(예를 들면 문헌(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710; Gao et al. (2003) J. Immunol. Methods 274: 185-197; Geuijen et al. (2005) Eur. J. Cancer 41: 178-187; Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161) 참조).
다수의 항체들이 이 방식에 의해 발견되었지만, 세포주에 대한 스크리닝 과정은 이들 항체들이 환자 집단에서 실제 암세포에 얼마나 특이적일지에 대한 이상적인 사진을 제공하지 않는다. 상기 스크리닝 과정은 항체가 생체 내에서 내재화시킬지 아니면 내재화시키지 않을지의 표시도 반드시 제공하는 것은 아니다.
다양한 실시양태들에서, 대음세포작용 경로를 통해 내재화시키고 종양 세포 내로 들어가는 인간 항-CD46 항체뿐만 아니라, CD46 과다발현 종양의 진단적 및/또는 치료적 표적화를 위해 이들 항체들로부터 개발된 항체-약물 접합체(ADC)도 제공된다.
본원에서 고려되는 다양한 실시양태들은 하기 실시양태들 중 하나 이상의 실시양태를 포함할 수 있으나, 이들로 한정될 필요는 없다:
실시양태 1: CD46에 특이적으로 결합하고 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포 내로 내재화되는 단리된 인간 항체로서, CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체이고, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY, YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 대음세포작용을 통해 상기 세포 내로 내재화되는 단리된 인간 항체.
실시양태 2: 실시양태 1에 있어서, CD46의 도메인 1 및/또는 도메인 2에 결합하는 항체.
실시양태 3: 실시양태 1 또는 2에 있어서, CD46의 도메인 3 및/또는 도메인 4에 결합하지 않는 항체.
실시양태 4: 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46을 발현하거나 과다발현하는 상기 세포가 암세포인 항체.
실시양태 5: 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46을 발현하거나 과다발현하는 상기 세포가 전립선 암세포인 항체.
실시양태 6: 실시양태 5에 있어서, DU145 세포, PC3 세포 및 LnCaP 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포주의 세포에 결합하는 항체.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, FACS에 의해 살아있는 전립선 종양 세포에 대해 측정될 때 적어도 약 5 내지 10 nM의 친화성(KD)으로 전립선 종양 세포에 결합하는 항체.
실시양태 8: 실시양태 7에 있어서, FACS에 의해 살아있는 전립선 종양 세포에 대해 측정될 때 적어도 약 3 nM의 친화성(KD)으로 전립선 종양 세포에 결합하는 항체.
실시양태 9: 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 실질적으로 온전한 면역글로불린인 항체.
실시양태 10: 실시양태 9에 있어서, IgA, IgE 또는 IgG를 포함하는 항체.
실시양태 11: 실시양태 9에 있어서, IgG1을 포함하는 항체.
실시양태 12: 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체 단편인 항체.
실시양태 13: 실시양태 12에 있어서, Fv, Fab, (Fab')2, (Fab')3, IgGΔCH2 및 미니바디(minibody)로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편인 항체.
실시양태 14: 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일 쇄 항체인 항체.
실시양태 15: 실시양태 14에 있어서, 상기 항체의 VL 영역이 길이에서 약 3개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산을 가진 아미노산 링커에 의해 상기 항체의 VH 영역에 부착되는 것인 항체.
실시양태 16: 실시양태 14에 있어서, 상기 항체의 VL 영역이 GGGGS GGGGS GGGGS(서열번호 67), GGGGS GGGGS(서열번호 68), GGGGS(서열번호 69), GS GGGGS GGGGS GGS GGGGS(서열번호 70), SGGGGS(서열번호 71), GGGS(서열번호 72), VPGV(서열번호 73), VPGVG(서열번호 74), GVPGVG(서열번호 75), GVG VP GVG(서열번호 76), VP GVG VP GVG(서열번호 77), GGSSRSS(서열번호 78) 및 GGSSRSSSSGGGGSGGGG(서열번호 79)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 링커에 의해 상기 항체의 VH 영역에 부착되는 것인 항체.
실시양태 17: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS5와 경쟁하는 항체.
실시양태 18: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS5F와 경쟁하는 항체.
실시양태 19: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS5v1D와 경쟁하는 항체.
실시양태 20: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 SB1HGNY와 경쟁하는 항체.
실시양태 21: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS12와 경쟁하는 항체.
실시양태 22: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 3G7RY와 경쟁하는 항체.
실시양태 23: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS6과 경쟁하는 항체.
실시양태 24: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS1과 경쟁하는 항체.
실시양태 25: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS3과 경쟁하는 항체.
실시양태 26: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS4와 경쟁하는 항체.
실시양태 27: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS8과 경쟁하는 항체.
실시양태 28: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS7과 경쟁하는 항체.
실시양태 29: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS9와 경쟁하는 항체.
실시양태 30: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS10과 경쟁하는 항체.
실시양태 31: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 YS11과 경쟁하는 항체.
실시양태 32: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 3G7HY와 경쟁하는 항체.
실시양태 33: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 3G7NY과 경쟁하는 항체.
실시양태 34: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 3G7과 경쟁하는 항체.
실시양태 35: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 SB2와 경쟁하는 항체.
실시양태 36: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 2C8과 경쟁하는 항체.
실시양태 37: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD46에서의 결합에 대해 UA8카파와 경쟁하는 항체.
실시양태 38: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY, YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및 UA8카파로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3, 및/또는 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 39: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 40: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 41: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 42: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 43: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 44: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS5 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 45: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5 scFv인 항체.
실시양태 46: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5 IgG인 항체.
실시양태 47: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 48: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 49: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 50: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 51: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 52: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS5F 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 53: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5F scFv인 항체.
실시양태 54: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5F IgG인 항체.
실시양태 55: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 56: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 57: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 58: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 59: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 60: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5F 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS5F 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 61: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5F scFv인 항체.
실시양태 62: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5F IgG인 항체.
실시양태 63: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 64: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 65: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 66: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 67: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 68: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS5V1D 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS5V1D 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 69: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5V1D scFv인 항체.
실시양태 70: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS5V1D IgG인 항체.
실시양태 71: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 72: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 73: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 74: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 75: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 76: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB1HGNY 항체의 가변 경쇄(VL) 및 SB1HGNY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 77: 실시양태 1에 있어서, 인간 SB1HGNY scFv인 항체.
실시양태 78: 실시양태 1에 있어서, 인간 SB1HGNY IgG인 항체.
실시양태 79: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 80: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 81: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 82: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 83: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 84: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS12 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS12 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 85: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS12 scFv인 항체.
실시양태 86: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS12 IgG인 항체.
실시양태 87: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 88: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 89: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 90: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 91: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 92: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7RY 항체의 가변 경쇄(VL) 및 3G7RY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 93: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7RY scFv인 항체.
실시양태 94: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7RY IgG인 항체.
실시양태 95: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 96: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 97: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 98: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 99: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 100: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS6 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS6 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 101: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS6 scFv인 항체.
실시양태 102: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS6 IgG인 항체.
실시양태 103: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 104: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 105: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 106: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 107: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 108: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS1 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS1 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 109: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS1 scFv인 항체.
실시양태 110: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS1 IgG인 항체.
실시양태 111: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 112: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 113: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 114: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 115: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 116: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS3 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS3 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 117: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS3 scFv인 항체.
실시양태 118: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS3 IgG인 항체.
실시양태 119: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 120: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 121: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 122: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 123: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 124: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS4 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS4 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 125: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS4 scFv인 항체.
실시양태 126: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS4 IgG인 항체.
실시양태 127: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 128: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 129: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 130: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 131: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 132: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS8 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS8 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 133: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS8 scFv인 항체.
실시양태 134: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS8 IgG인 항체.
실시양태 135: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 136: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 137: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 138: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 139: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 140: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS7 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS7 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 141: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS7 scFv인 항체.
실시양태 142: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS7 IgG인 항체.
실시양태 143: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 144: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 145: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 146: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 147: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 148: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS9 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS9 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 149: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS9 scFv인 항체.
실시양태 150: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS9 IgG인 항체.
실시양태 151: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 152: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 153: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 154: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 155: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 156: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS10 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS10 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 157: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS10 scFv인 항체.
실시양태 158: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS10 IgG인 항체.
실시양태 159: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 160: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 161: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 162: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 163: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 164: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, YS11 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS11 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 165: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS11 scFv인 항체.
실시양태 166: 실시양태 1에 있어서, 인간 YS11 IgG인 항체.
실시양태 167: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 168: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 169: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 170: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 171: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 172: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7HY 항체의 가변 경쇄(VL) 및 3G7HY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 173: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7HY scFv인 항체.
실시양태 174: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7HY IgG인 항체.
실시양태 175: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 176: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 177: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 178: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 179: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 180: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7NY 항체의 가변 경쇄(VL) 및 3G7NY 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 181: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7NY scFv인 항체.
실시양태 182: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7NY IgG인 항체.
실시양태 183: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 184: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 185: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 186: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 187: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 188: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 3G7 항체의 가변 경쇄(VL) 및 3G7 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 189: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7 scFv인 항체.
실시양태 190: 실시양태 1에 있어서, 인간 3G7 IgG인 항체.
실시양태 191: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 192: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 193: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 194: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 195: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 196: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, SB2 항체의 가변 경쇄(VL) 및 SB2 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 197: 실시양태 1에 있어서, 인간 SB2 scFv인 항체.
실시양태 198: 실시양태 1에 있어서, 인간 SB2 IgG인 항체.
실시양태 199: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 200: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 201: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 202: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 203: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 204: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2C8 항체의 가변 경쇄(VL) 및 2C8 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 205: 실시양태 1에 있어서, 인간 2C8 scFv인 항체.
실시양태 206: 실시양태 1에 있어서, 인간 2C8 IgG인 항체.
실시양태 207: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 VH CDR1, 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 208: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 VL CDR1, 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 209: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
실시양태 210: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체.
실시양태 211: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 212: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, UA8카파 항체의 가변 경쇄(VL) 및 UA8카파 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
실시양태 213: 실시양태 1에 있어서, 인간 UA8카파 scFv인 항체.
실시양태 214: 실시양태 1에 있어서, 인간 UA8카파 IgG인 항체.
실시양태 215: 제2 항체, 검출가능한 표지, 세포독소 또는 세포증식억제제, 약물을 함유하는 리포좀, 방사성핵종, 약물, 프로드러그, 바이러스 입자, 사이토카인 및 킬레이트로 구성된 군으로부터 선택된 이펙터(effector)에 부착된 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 포함하는 면역접합체.
실시양태 216: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 세포독소에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 217: 실시양태 216에 있어서, 상기 항체가 디프테리아(Diphtheria) 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 리신(ricin), 아브린(abrin), 사포린(saporin) 및 타이미딘 키나제(thymidine kinase)로 구성된 군으로부터 선택된 세포독소에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 218: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 219: 실시양태 216에 있어서, 상기 항체가 하기 물질들 중 하나 이상의 물질에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착되는 것인 면역접합체: 상기 약물; 상기 약물을 함유하는 지질 또는 리포좀; 상기 약물을 포함하는 중합체성 약물 담체; 및 상기 약물을 포함하는 나노입자 약물 담체.
실시양태 220: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 항암 약물인 면역접합체.
실시양태 221: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 미세소관 억제제, DNA 손상제 및 중합효소 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
실시양태 222: 실시양태 221에 있어서, 약물이 튜불린 억제제를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 223: 실시양태 222에 있어서, 약물이 아우리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(Dolastatin)-10, 천연 생성물 돌라스타틴-10의 합성 유도체, 및 메이탄신(maytansine) 또는 메이탄신 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 224: 실시양태 222에 있어서, 약물이 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 아우리스타틴 E(AE), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), vcMMAE 및 vcMMAF로 구성된 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 225: 실시양태 222에 있어서, 약물이 메르탄신(Mertansine)(DM1), DM3 및 DM4로 구성된 군으로부터 선택된 메이탄신을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 226: 실시양태 221에 있어서, 약물이 DNA 손상제를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 227: 실시양태 226에 있어서, 약물이 칼리케아미신(calicheamicin), 듀오카마이신(duocarmycin) 및 피롤로벤조디아제핀으로 구성된 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 228: 실시양태 227에 있어서, 약물이 칼리케아미신 또는 칼리케아미신 유사체를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 229: 실시양태 227에 있어서, 약물이 듀오카마이신을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 230: 실시양태 229에 있어서, 약물이 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 B1, 듀오카마이신 B2, 듀오카마이신 C1, 듀오카마이신 C2, 듀오카마이신 D, 듀오카마이신 SA, 사이클로프로필벤조인돌 듀오카마이신(CC-1065), 센타나마이신(Centanamycin), 라켈마이신(Rachelmycin), 아도젤레신(Adozelesin), 비젤레신(Bizelesin) 및 카젤레신(Carzelesin)으로 구성된 군으로부터 선택된 듀오카마이신을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 231: 실시양태 227에 있어서, 약물이 피롤로벤조디아제핀 또는 피롤로벤조디아제핀 이량체를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 232: 실시양태 231에 있어서, 약물이 안쓰라마이신(Anthramycin)(및 이의 이량체), 마제쓰라마이신(Mazethramycin)(및 이의 이량체), 토메이마이신(Tomaymycin)(및 이의 이량체), 프로쓰라카신(Prothracarcin)(및 이의 이량체), 치카마이신(Chicamycin)(및 이의 이량체), 네오쓰라마이신(Neothramycin) A(및 이의 이량체), 네오쓰라마이신 B(및 이의 이량체), DC-81(및 이의 이량체), 시비로마이신(Sibiromycin)(및 이의 이량체), 포로쓰라마이신(Porothramycin) A(및 이의 이량체), 포로쓰라마이신 B(및 이의 이량체), 시바노마이신(Sibanomycin)(및 이의 이량체), 아베이마이신(Abbeymycin)(및 이의 이량체), SG2000 및 SG2285로 구성된 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 233: 실시양태 221에 있어서, 약물이 중합효소 억제제를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 234: 실시양태 233에 있어서, 상기 약물이 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 235: 실시양태 234에 있어서, 상기 약물이 이니파립(Iniparib)(BSI 201), 탈라조파립(Talazoparib)(BMN-673), 올라파립(Olaparib)(AZD-2281), 올라파립, 루카파립(Rucaparib)(AG014699, PF-01367338), 벨리파립(ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB-290 및 3-아미노벤즈아미드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제를 포함하는 것인 면역접합체.
실시양태 236: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 아우리스타틴, 돌라스타틴, 콜히친(colchicine), 콤브레타스타틴(combretastatin) 및 mTOR/PI3K 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
실시양태 237: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 5-트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘, 메토트렉세이트(methotrexate) 나트륨, 랄티트렉세드(raltitrexed), 페메트렉세드(pemetrexed), 사이토신 아라비노사이드(cytosine Arabinoside), 6-머캡토푸린(mercaptopurine), 아자티오프린(azathioprine), 6-티오구아닌(thioguanine)(6-TG), 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine) 포스페이트, 클라드리빈(cladribine), 플록수리딘(floxuridine)(5-플루오로-2), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제(RNR), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 네오사르(neosar), 이포스파미드(ifosfamide), 티오테파(thiotepa), 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아(nitrosourea)(BCNU), 1-(2-클로로에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아, 메틸(CCNU), 헥사메틸멜라민, 부설판(busulfan), 프로카바진(procarbazine) HCL, 다카바진(dacarbazine)(DTIC), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 벤다무스틴(bendamustine), 카무스틴(carmustine), 클로로메틴(chloromethine), 다카바진(DTIC), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 만노설판(mannosulfan), 네다플라틴(nedaplatin), 니무스틴(nimustine), 프레드니무스틴(prednimustine), 라니무스틴(ranimustine), 사트라플라틴(satraplatin), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 테모졸로마이드(temozolomide), 트레오설판(treosulfan), 트리아지쿠온(triaziquone), 트리에틸렌 멜라민, 티오테파(thioTEPA), 트리플라틴 테트라니트레이트(triplatin tetranitrate), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라무스틴(uramustine), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin) 시트레이트, 미톡산트론(mitoxantrone), 악티노마이신(actinomycin) D, 에토포사이드(etoposide), 토포테칸(topotecan) HCL, 테니포사이드(teniposide)(VM-26), 이리노테칸(irinotecan) HCL(CPT-11), 캄프토테신(camptothecin), 벨로테칸(belotecan), 루비테칸(rubitecan), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine) 설페이트, 비노렐빈(vinorelbine) 타르트레이트, 빈데신(vindesine) 설페이트, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 나노입자 파클리탁셀, 아브락산(abraxane), 익사베필론(ixabepilone), 라로탁셀(larotaxel), 오르타탁셀(ortataxel), 테세탁셀(tesetaxel) 및 빈플루닌(vinflunine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
실시양태 238: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 카보플라틴, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 에를로티닙(erlotinib), 에토포사이드, 겜시타빈(gemcitabine), 이마티닙(imatinib) 메실레이트, 이리노테칸, 메토트렉세이트, 소라피닙(sorafinib), 수니티닙(sunitinib), 토포테칸, 빈블라스틴 및 빈크리스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
실시양태 239: 실시양태 218 또는 219에 있어서, 상기 약물이 레티노산, 레티노산 유도체, 독시루비신(doxirubicin), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 캄프토테신 유도체, 인터페론, 타목시펜(tamoxifen) 및 탁솔(taxol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체. 일부 실시양태들에서, 항암 화합물은 아브락산, 독소루비신, 파미드로네이트(pamidronate) 이나트륨, 아나스트로졸(anastrozole), 엑세메스탄(exemestane), 사이클로포스파미드, 에피루비신(epirubicin), 토레미펜(toremifene), 레트로졸(letrozole), 트라스투주맙(trastuzumab), 메게스트롤타목시펜, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카페시타빈, 고세렐린(goserelin) 아세테이트 및 졸레드론산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
실시양태 240: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113In, 97Ru, 62Cu, 641Cu, 52Fe, 52Mn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh 및 111Ag로 구성된 군으로부터 선택된 동위원소를 포함하는 킬레이트에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 241: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 알파-방사체(emitter)에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 242: 실시양태 241에 있어서, 상기 알파-방사체가 비스무쓰(bismuth) 213인 면역접합체.
실시양태 243: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 항암 약물과 복합체를 형성하거나 항암 약물을 함유하는 지질 또는 리포좀에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 244: 실시양태 215에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 245: 실시양태 244에 있어서, 상기 항체가 방사성 표지, 방사선불투과성 표지, MRI 표지 및 PET 표지로 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 표지에 부착되는 것인 면역접합체.
실시양태 246: 약학적으로 허용가능한 부형제 및 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체; 및/또는 약학적으로 허용가능한 부형제 및 실시양태 215 내지 245 중 어느 한 실시양태에 따른 면역접합체를 포함하는 약학 제제.
실시양태 247: 실시양태 246에 있어서, 단위 제형인 약학 제제.
실시양태 248: 실시양태 246 또는 247에 있어서, 경구 투여, 코 투여, 직장 투여, 복강내 주사, 혈관내 주사, 피하 주사, 경피 투여 및 근육내 주사로 구성된 군으로부터 선택된 경로를 통한 투여용으로 제제화된 제제.
실시양태 249: CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포의 생장 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 암세포를 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및/또는 상기 암세포를, 세포증식억제 및/또는 세포독성 활성을 가진 이펙터에 부착된 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 포함하는 면역접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 250: 실시양태 249에 있어서, 상기 암세포를 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 251: 실시양태 249에 있어서, 상기 암세포를, 세포증식억제 및/또는 세포독성 활성을 가진 이펙터에 부착된 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 포함하는 면역접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 252: 실시양태 249 내지 251 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 세포가 암세포인 방법.
실시양태 253: 실시양태 252에 있어서, 상기 세포가 CD46을 과다발현하는 암세포인 방법.
실시양태 254: 실시양태 252에 있어서, 상기 암세포가 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 중피종, 림프종, 간암, 요로암, 위암, 다발성 골수종, 다형성 교모세포종, 신경교종, 신경모세포종 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 255: 실시양태 252에 있어서, 상기 암세포가 전립선 암세포인 방법.
실시양태 256: 실시양태 255에 있어서, 상기 암세포가 거세 내성 전립선암의 세포인 방법.
실시양태 257: 실시양태 252에 있어서, 상기 암세포가 다발성 골수종의 세포인 방법.
실시양태 258: 실시양태 252 내지 257 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 세포가 전이성 세포인 방법.
실시양태 259: 실시양태 258에 있어서, 상기 전이성 세포가 골 전이, 간 전이, 방광 전이 및/또는 림프절 전이인 방법.
실시양태 260: 실시양태 252 내지 258 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 세포가 고형 종양 세포인 방법.
실시양태 261: 실시양태 249 및 251 내지 260 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 이펙터가 방사성핵종 및/또는 세포증식억제성 약물을 포함하는 것인 방법.
실시양태 262: 실시양태 261에 있어서, 상기 이펙터가 하기 물질들 중 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 방법: 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물; 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물을 함유하는 지질 또는 리포좀; 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물을 포함하는 중합체성 약물 담체; 및 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물을 포함하는 나노입자 약물 담체.
실시양태 263: 실시양태 262에 있어서, 상기 약물이 항암 약물인 방법.
실시양태 264: 실시양태 263에 있어서, 상기 약물이 아우리스타틴, 돌라스타틴, 콜히친, 콤브레타스타틴 및 mTOR/PI3K 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 265: 실시양태 263에 있어서, 상기 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F인 방법.
실시양태 266: 실시양태 263에 있어서, 상기 약물이 플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, 5-트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘, 메토트렉세이트 나트륨, 랄티트렉세드, 페메트렉세드, 사이토신 아라비노사이드, 6-머캡토푸린, 아자티오프린, 6-티오구아닌(6-TG), 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈, 플록수리딘(5-플루오로-2), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제(RNR), 사이클로포스파미드, 네오사르, 이포스파미드, 티오테파, 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아(BCNU), 1-(2-클로로에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아, 메틸(CCNU), 헥사메틸멜라민, 부설판, 프로카바진 HCL, 다카바진(DTIC), 클로람부실, 멜팔란, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 벤다무스틴, 카무스틴, 클로로메틴, 다카바진(DTIC), 포테무스틴, 로무스틴, 만노설판, 네다플라틴, 니무스틴, 프레드니무스틴, 라니무스틴, 사트라플라틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 테모졸로마이드, 트레오설판, 트리아지쿠온, 트리에틸렌 멜라민, 티오테파, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트로포스파미드, 우라무스틴, 독소루비신, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론, 악티노마이신 D, 에토포사이드, 토포테칸 HCL, 테니포사이드(VM-26), 이리노테칸 HCL(CPT-11), 캄프토테신, 벨로테칸, 루비테칸, 빈크리스틴, 빈블라스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트, 빈데신 설페이트, 파클리탁셀, 도세탁셀, 나노입자 파클리탁셀, 아브락산, 익사베필론, 라로탁셀, 오르타탁셀, 테세탁셀 및 빈플루닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 267: 실시양태 263에 있어서, 상기 약물이 카보플라틴, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 에를로티닙, 에토포사이드, 겜시타빈, 이마티닙 메실레이트, 이리노테칸, 메토트렉세이트, 소라피닙, 수니티닙, 토포테칸, 빈블라스틴 및 빈크리스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 268: 실시양태 263에 있어서, 상기 약물이 레티노산, 레티노산 유도체, 독시루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 캄프토테신 유도체, 인터페론, 타목시펜 및 탁솔로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법. 일부 실시양태들에서, 항암 화합물은 아브락산, 독소루비신, 파미드로네이트 이나트륨, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 사이클로포스파미드, 에피루비신, 토레미펜, 레트로졸, 트라스투주맙, 메게스트롤타목시펜, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카페시타빈, 고세렐린 아세테이트 및 졸레드론산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 269: 실시양태 262 내지 268 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 약물이 상기 항체에 접합되어 있는 것인 방법.
실시양태 270: 실시양태 262 내지 268 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 약물이 상기 항체에 부착된 지질 또는 리포좀에 함유되어 있는 것인 방법.
실시양태 271: 실시양태 262 내지 268 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 약물이 상기 항체에 부착된 중합체성 및/또는 나노입자 담체에 함유되어 있는 것인 방법.
실시양태 272: 실시양태 249 및 251 내지 260 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 이펙터가 세포독소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 273: 실시양태 272에 있어서, 상기 세포독소가 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린, 사포린 및 타이미딘 키나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 274: 실시양태 249에 있어서, 상기 이펙터가 방사성핵종을 포함하는 것인 방법.
실시양태 275: 실시양태 249 내지 274 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 면역접합체 또는 항체가 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로 투여되는 것인 방법.
실시양태 276: 실시양태 249 내지 275 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 투여가 인간에게의 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 277: 실시양태 249 내지 275 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 투여가 비-인간 포유동물에게의 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 278: 실시양태 249 내지 277 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 투여가 비경구 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 279: 실시양태 249 내지 277 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 투여가 종양 또는 수술 부위 내로의 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 280: 실시양태 249 내지 279 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 면역접합체가 수술 및/또는 방사선요법에 대한 보조요법으로서 투여되는 것인 방법.
실시양태 281: 실시양태 249 내지 279 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 항체 및/또는 면역접합체가 또 다른 항암 약물 및/또는 호르몬과 함께 투여되는 것인 방법.
실시양태 282: 실시양태 281에 있어서, 상기 항체 및/또는 면역접합체가 아비라테론(abiraterone) 및/또는 엔잘루타마이드(enzalutamide)와 함께 투여되는 것인 방법.
실시양태 283: 실시양태 282에 있어서, 상기 세포가 전립선 암세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 284: 실시양태 283에 있어서, 상기 전립선 암세포가 신경내분비 전립선암(NEPC) 세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 285: 실시양태 283에 있어서, 상기 전립선 암세포가 아비라테론(Abi) 또는 엔잘루타마이드(Enz)에 대한 내성을 나타내는 전이성 거세 내성 전립선암(mCRPC) 세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 286: CD46을 발현하거나 과다발현하는 암의 암세포를 검출하는 방법으로서, 상기 암세포를, 검출가능한 표지에 부착된 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 포함하는 면역접합체와 접촉시키는 단계; 및 상기 검출가능한 표지의 존재 및/또는 위치를 검출하는 단계로서, 이때 상기 존재 및/또는 위치가 암세포의 위치 및/또는 존재의 표시자인 단계를 포함하는 방법.
실시양태 287: 실시양태 286에 있어서, 상기 표지가 방사성 표지, 방사선불투과성 표지, MRI 표지, PET 표지 및 SPECT 표지로 구성된 군으로부터 선택된 표지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 288: 실시양태 286에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 감마-방사체, 양전자-방사체, x-선 방사체, 알파-방사체 및 형광-방사체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 289: 실시양태 286 내지 288 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 암세포가 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 중피종, 림프종, 간암, 요로암, 위암, 다발성 골수종, 신경교종, 신경모세포종 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 290: 실시양태 289에 있어서, 상기 암세포가 전립선 암세포인 방법.
실시양태 291: 실시양태 290에 있어서, 상기 암세포가 거세 내성 전립선암의 세포인 방법.
실시양태 292: 실시양태 289에 있어서, 상기 암세포가 다발성 골수종의 세포인 방법.
실시양태 293: 실시양태 286 내지 292 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 접촉이 상기 면역접합체를 비-인간 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 294: 실시양태 286 내지 292 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 접촉이 상기 면역접합체를 인간에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 295: 실시양태 286 내지 294 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 검출이 생체 내에서 상기 표지를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 296: 실시양태 295에 있어서, 상기 검출이 X-선, PET, SPECT, MRI 및 CAT로 구성된 군으로부터 선택된 검출 방법을 이용하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 297: 실시양태 286 내지 294 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 검출이 생체외 생검 또는 생검으로부터 유래된 샘플에서 상기 표지를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 298: 실시양태 1 내지 214 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 항체의 단편을 코딩하는 핵산.
실시양태 299: 실시양태 298의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 300: 실시양태 299의 발현 벡터를 포함하는 세포.
정의
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 생성 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 생성 아미노산 중합체에도 적용된다. 상기 용어들은 폴리펩티드를 구성하는 아미노산들을 연결하는 전통적인 펩티드 연결에 대한 변이체도 포함한다.
본원에서 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 문법적 동의어는 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드들을 지칭한다. 일부 경우, 하기 요약된 바와 같이, 예를 들면, 포스포르아미드[문헌(Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925) 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌; 문헌(Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800); 문헌(Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579); 문헌(Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487); 문헌(Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805); 문헌(Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470); 및 문헌(Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419)], 포스포로티오에이트[문헌(Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437); 및 미국 특허 제5,644,048호], 포스포로디티오에이트[문헌(Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321)], O-메틸포스포로아미다이트 연결[문헌(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) 참조], 및 펩티드 핵산 골격 및 연결[문헌(Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895); 문헌(Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008); 문헌(Nielsen (1993) Nature, 365: 566); 및 문헌(Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207) 참조]을 포함하는 대안적 골격을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될지라도, 본 발명의 핵산은 바람직하게는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격[문헌(Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097)]; 비-이온성 골격[미국 특허 제5,386,023호, 제5,637,684호, 제5,602,240호, 제5,216,141호 및 제4,469,863호; 문헌(Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423); 문헌(Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470); 문헌(Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597); 문헌(Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook); 문헌(Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395); 문헌(Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))]; 및 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호, 및 문헌(Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook)에 기재된 비-리보스 골격을 포함하는 비-리보스 골격을 가진 유사체 핵산을 포함할 것이다. 하나 이상의 탄소환형 당을 함유하는 핵산도 핵산의 정의 내에 포함된다(문헌(Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp169-176) 참조). 여러 핵산 유사체들이 문헌(Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35)에 기재되어 있다. 리보스-포스페이트 골격의 이들 변경들을 수행하여, 추가 모이어티, 예컨대, 표지의 추가를 용이하게 할 수 있거나 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "잔기"는 천연, 합성 또는 변경된 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용된 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 지칭한다. 인정된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자들뿐만 아니라, 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자들도 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의하는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류된다.
전형적인 면역글로불린(항체) 구조 유닛은 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kD)를 각각 가진 동일한 2쌍의 폴리펩티드 쇄들로 구성된다. 각각의 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 100개 이상의 아미노산들의 가변 영역을 한정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.
항체는 온전한 면역글로불린으로서 존재하거나 다양한 펩티다제들에 의한 분해에 의해 생성된 다수의 잘 특징규명된 단편들로서 존재한다. 따라서, 예를 들면, 펩신은 힌지 영역 내의 디설파이드 결합 아래에서 항체를 분해하여, 그 자체가 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 약한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역 내의 디설파이드 결합을 절단함으로써, F(ab')2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 가진 Fab이다(다른 항체 단편의 더 상세한 설명에 대해서는 문헌(Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)) 참조). 다양한 항체 단편들이 온전한 항체의 분해의 관점에서 정의되지만, 당업자는 이러한 Fab' 단편이 화학적으로 새로 합성될 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새로 합성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 항체는 전체 항체의 변경에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새로 합성된 항체 단편도 포함한다. 일부 바람직한 항체들은 단일 쇄 항체(단일 폴리펩티드 쇄로서 존재하는 항체), 보다 바람직하게는 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해) 함께 연결되어 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일 쇄 Fv 항체(sFv 또는 scFv)를 포함한다. 단일 쇄 Fv 항체는 직접적으로 또는 펩티드 코딩 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 코딩 서열들을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유결합된 VH-VL 이종이량체이다(Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883). VH 및 VL이 단일 폴리펩티드 쇄로서 각각에 연결되어 있지만, VH 및 VL 도메인들은 비-공유적으로 연결된다. 사상 파지(filamentous phage)의 표면 상에서 발현될 제1 기능성 항체 분자는 단일 쇄 Fv's(scFv)이었으나, 대안적 발현 방법도 성공적이었다. 예를 들면, 쇄들 중 하나(중쇄 또는 경쇄)가 g3 캡시드 단백질에 융합되어 있고 상보적 쇄가 가용성 분자로서 주변세포질(periplasm)로 수송되는 경우, Fab 분자는 파지 상에 디스플레이될 수 있다. 2개의 쇄들이 동일한 또는 상이한 레플리콘들(replicons) 상에 코딩될 수 있고; 중요한 점은 각각의 Fab 분자에서 2개의 항체 쇄들이 번역 후 조립되고 이량체가 쇄들 중 한 쇄와, 예를 들면, g3p의 연결을 통해 파지 입자 내로 도입된다는 점이다(예를 들면, 미국 특허 제5733743호 참조). 항체 V 영역으로부터의 천연적으로 응집되되 화학적으로 분리되는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를, 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩되는 분자로 전환시키는 scFv 항체 및 다수의 다른 구조물들은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호 참조). 특히 바람직한 항체는 파지 상에 디스플레이되는 모든 항체들을 포함할 것이다(예를 들면, scFv, Fv, Fab 및 디설파이드 연결된 Fv(Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331)).
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 생체분자(예를 들면, 단백질, 핵산, 항체 등)를 지칭할 때 분자들(예를 들면, 단백질들 및 다른 생물학적 물질들)의 불균질한 집단에서 생체분자의 존재를 확인시켜주는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건(예를 들면, 항체의 경우 면역분석 조건 또는 핵산의 경우 엄격한 혼성화 조건) 하에서, 특정된 리간드 또는 항체는 그의 특정 "표적" 분자에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 분자에 유의한 양으로 결합하지 않는다.
본원에서 사용된 어구 "CD46을 발현하는 세포의 증식의 억제"는 본원에 기재된 항-CD46 항체 또는 면역접합체가 CD46을 발현하는 세포의 증식을 이 항체 또는 면역접합체의 부재 하에서의 증식에 비해 감소시키는, 바람직하게는 통계학적으로 유의하게 감소시키는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, CD46을 발현하는 세포(예를 들면, 암세포)의 증식은 상기 세포가 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 면역접합체와 접촉할 때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 면역접합체의 부재 하에서 측정된 증식(대조군)에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%까지 감소될 수 있다. 세포 증식은 (예를 들면, 세포 역가 생장 분석 또는 타이미딘 도입을 이용하여) 세포 분열 속도, 세포 분열을 겪는 세포 집단 내의 세포의 비율, 및/또는 최종 분화 또는 세포 사멸로 인해 세포가 세포 집단으로부터 상실되는 속도를 측정하는, 당분야에서 인정된 기법들을 이용함으로써 분석될 수 있다.
본원에서 사용된 어구 "CD46을 발현하는 세포의 이동의 억제"는 본원에 기재된 항-CD46 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 면역접합체가 CD46을 발현하는 세포의 이동을 상기 항체의 부재 하에서의 상기 세포의 이동에 비해 감소시키는, 바람직하게는 통계학적으로 유의하게 감소시키는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에서, CD46을 발현하는 세포(예를 들면, 암세포)의 이동은 상기 세포가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 이의 면역접합체와 접촉할 때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 이의 면역접합체의 부재 하에서 측정된 세포 이동(대조군)에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%까지 감소될 수 있다. 세포 이동은 당분야에서 인정된 기법들을 이용함으로써 분석될 수 있다. 다양한 실시양태들에서, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체는 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포(예를 들면, 본원에 기재된 암세포)의 이동을 억제할 수 있다는 것이 고려된다.
본원에서 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 단순히 "항체 부분")은 항원(예를 들면, CD46 도메인 1 및/또는 도메인 2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(예를 들면, 문헌(Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546) 참조); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb; 및 (viii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (ix) 임의적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR들의 조합물이 있다. 나아가, Fv 단편의 두 도메인들인 VL 및 VH가 별개의 유전자들에 의해 코딩될 수 있지만, 이들이 페어링되어 1가 분자를 형성하는 VL 및 VH 영역들을 가진 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음; 예를 들면, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242: 423-426); 및 문헌(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) 참조)로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커로 재조합 방법을 이용하여 이들을 연결할 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함된다. 이들 항체 단편들은 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 기법을 이용함으로써 수득되고, 상기 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 생성 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일 항원성 부위에 대해 유도된 단일클론 항체는 고도로 특이적이다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 통상적인 (다중클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 당분야에서 인정된 임의의 기법 및 본원에 기재된 기법, 예를 들면, 문헌(Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495)에 기재된 하이브리도마 방법, 형질전환 동물(문헌(Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859) 참조), 또는 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 이용하거나, 예를 들면, 문헌(Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628) 및 문헌(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597)에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리를 사용함으로써 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화된 항체를 포함하고, 천연적으로 생성될 수 있거나 재조합적으로 제조될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체, 예컨대, (a) 면역글로불린 유전자(예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자)에 대한 형질전환 또는 전이염색체 동물(예를 들면, 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 파지 디스플레이를 사용함으로써 (예를 들면, 인간 항체 서열을 함유하는) 재조합 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열로의 면역글로불린 유전자 서열(예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자)의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되었거나, 발현되었거나, 생성되었거나 단리된 항체를 지칭한다. 이러한 재조합 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 가질 수 있다. 그러나, 일부 실시양태들에서, 이러한 재조합 인간 항체에 대한 시험관내 돌연변이유발을 수행할 수 있으므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이러한 서열과 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식세포주 레퍼토리 내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체는 제1종으로부터 유래된 가변 영역 및 제2종으로부터 유래된 불변 영역을 가진 면역글로불린 또는 항체를 지칭한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 예를 들면, 상이한 종들에 속하는 면역글로불린 유전자 분절들로부터, 예를 들면, 유전적 조작에 의해 구축될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 골격 및 CDR 영역들 둘 다가 예를 들면, 카바트와 그의 동료들(Kabat et al.)(문헌(Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 참조)에 의해 기재된 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 포함하기 위한 것이다. 나아가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역도 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위적 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 생식세포주로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상으로 이식되어 있는 항체를 포함하기 위한 것이 아니다.
인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들면, 활성 향상 아미노산 잔기로 대체된 적어도 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 전형적으로, 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 대체된 최대 20개의 위치들을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 대체는 이하에 상세히 기재된 바와 같이 CDR 영역 내에 존재한다.
용어 "인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화된 항체"는 적어도 하나의 인간화된 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 적어도 하나의 인간화된 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 지칭한다. 용어 "인간화된 면역글로불린 쇄" 또는 "인간화된 항체 쇄"(즉, "인간화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화된 면역글로불린 중쇄")는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 골격 영역, 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역들(CDR들)(예를 들면, 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR들, 보다 바람직하게는 3개의 CDR들)을 포함하고, 불변 영역(예를 들면, 경쇄의 경우 적어도 하나의 불변 영역 또는 이의 부분, 및 바람직하게는 중쇄의 경우 3개의 불변 영역들)을 추가로 포함하는 가변 영역을 가진 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 지칭한다. 용어 "인간화된 가변 영역"(예를 들면, "인간화된 경쇄 가변 영역" 또는 "인간화된 중쇄 가변 영역")은 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 골격 영역, 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역들(CDR들)을 포함하는 가변 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 "이종 항체"는 이러한 항체를 생성하는 형질전환 비-인간 유기체 또는 식물과 관련하여 정의된다.
본원에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체를 실질적으로 갖지 않는 항체를 지칭하기 위한 것이다(예를 들면, CD46에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD46 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않는다). 추가로, 단리된 항체는 전형적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다. 한 실시양태에서, 상이한 CD46 결합 특이성을 가진 "단리된" 단일클론 항체들의 조합물은 잘 정의된 조성물로 조합된다.
본원에서 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들면, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 또는 IgE 항체 이소타입으로부터 선택된 이소타입의 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 단일클론 항체는 IgG1 이소타입의 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 IgG2 이소타입의 단일클론 항체이다.
"항원"은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 결합하는 물질(예를 들면, 단백질성 물질 또는 펩티드)이다. 본 발명의 다양한 실시양태들에서, 항원은 예를 들면, 세포(예를 들면, CD46 양성 암세포) 상에 제시된 CD46이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 단백질의 삼차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산들 또는 비인접 아미노산들 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에의 노출 시 유지되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매를 사용한 처리 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조로 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산들을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 확인하는 방법은 당분야의 기법 및 본원에 기재된 기법, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-차원적 핵 자기 공명을 포함한다(예를 들면, 문헌(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)) 참조).
본원은 본원에 기재된 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체와 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체도 고려한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 상용적인 기법, 예컨대, 면역분석을 이용함으로써, 예를 들면, 한 항체가 또 다른 항체와 표적 항원의 결합을 차단하는 능력을 보여줌으로써, 즉 경쟁 결합 분석에 의해 확인될 수 있다. 경쟁 결합은 시험되는 면역글로불린이 기준 항체와 공통된 항원, 예컨대, CD46 도메인 1 및/또는 도메인 2의 특이적 결합을 억제하는 분석에서 확인된다. 다양한 유형의 경쟁 결합 분석들, 예를 들면, 하기 분석들이 공지되어 있다: 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들면, 문헌(Stahli et al. (1983) Meth. Enzymol., 9: 242) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌(Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137: 3614) 참조); 고체상 직접 표지된 분석; 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석(예를 들면, 문헌(Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) 참조); 예를 들면, 125I 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(예를 들면, 문헌(Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1): 7) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Cheung et al. (1990) Virology 176: 546); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al. (1990) Scand J. Immunol. 32: 77). 전형적으로, 이러한 분석은 표지되지 않은 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원(예를 들면, CD46 도메인 1 및/또는 도메인 2)의 사용을 수반한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 이 항체는 기준 항체와 공통 항원의 특이적 결합을 적어도 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 또는 70% 내지 75% 이상 억제할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 특정 항원 또는 에피토프에 대한 인식가능한 친화성을 나타내고, 일반적으로 다른 항원 및 에피토프와 유의한 교차-반응성을 나타내지 않는다는 것을 의미한다. "인식가능한" 또는 바람직한 결합은 적어도 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M 또는 10-11 M(이하의 KD)의 친화성으로 결합하는 것을 포함한다. 10-9 M 초과, 바람직하게는 10-10 M 초과의 친화성이 더 바람직하다. 본원에 기재된 값들의 중간 값도 본 발명의 범위 내에 있고, 바람직한 결합 친화성은 친화성의 범위, 예를 들면, 10-6 M 내지 10-11 M, 바람직하게는 10-7 M 또는 10-8 M 내지 10-10 M로서 표시될 수 있다. "유의한 교차-반응성을 나타내지 않는" 항체는 바람직하지 않은 물질(예를 들면, 바람직하지 않은 단백질성 물질)에 인식가능하게 결합하지 않을 항체이다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD46(예를 들면, 도메인 1 및/또는 도메인 2) 단백질에 특이적으로 결합하되, 다른 분자 및 비-CD46 단백질 또는 펩티드와 유의하게 반응하지 않을 것이다. 특이적 또는 선택적 결합은 예를 들면, 스캐차드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁 결합 분석을 포함하는, 이러한 결합을 측정하는, 당분야에서 인정된 임의의 수단에 따라 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수 또는 항원에 대한 항체의 친화성을 지칭하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표면 플라스몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석을 이용함으로써 측정될 때 5 nM 또는 더 우수한(즉, 이하)(예를 들면, 40 nM, 30 nM, 20 nM 또는 10 nM 이하)의 친화성(KD)으로 항원(예를 들면, CD46 도메인 1 및/또는 도메인 2)에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표면 플라스몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석을 이용함으로써 측정될 때 5 nM 또는 더 우수한(예를 들면, 4 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1.4 nM, 1.3 nM 또는 1 nM 이하)의 친화성(KD)으로 CD46에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 살아있는 전립선 종양 세포를 사용하여 FACS로 측정하였을 때 대략 10-10 M, 100 x 10-11 M 또는 10 x 10-11 M 미만 또는 심지어 더 낮은 친화성(KD)으로 항원(예를 들면, CD46)에 결합한다.
본원에서 사용된 용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리 속도 상수를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "EC50"은 시험관내 또는 생체내 분석에서 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 기준 사이의 절반인 반응을 유도하는, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 면역접합체의 농도를 지칭한다.
물체에 적용될 때 본원에서 사용된 용어 "천연 생성"은 물체가 천연 상태에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들면, 천연 상태에서 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 실험실에서 사람에 의해 고의적으로 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 생성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본원에서 사용된 용어 "변경시키는" 또는 "변경"은 항체 또는 이의 항원 결합 부분에서 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것을 지칭하기 위한 것이다. 하나 이상의 위치에서 아미노산을 추가하거나, 치환하거나 결실시킴으로써 변화를 발생시킬 수 있다. 공지된 기법, 예컨대, PCR 돌연변이유발을 이용하여 상기 변화를 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 본 발명의 방법을 이용하여 확인한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 변경시킴으로써, CD46에 대한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합 친화성을 변경시킬 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 항-CD46 항체의 서열에서의 "보존적 아미노산 치환", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되었거나 아미노산 서열을 함유하는 항체와 항원, 예를 들면, CD46의 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변경이 고려된다. 보존적 아미노산 치환은 한 클래스 내의 아미노산을 동일한 클래스의 아미노산으로 치환하는 것을 포함하고, 이때 클래스는 예를 들면, 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 측정될 때 천연 상태에서 발견된 상동성 단백질들에서의 공통된 물리화학적 아미노산 측쇄 성질 및 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄들의 6개 일반적 클래스들이 범주화되었고 하기 클래스들을 포함한다: 클래스 I(Cys); 클래스 II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 클래스 III(Asn, Asp, Gln, Glu); 클래스 IV(His, Arg, Lys); 클래스 V(Ile, Leu, Val, Met); 및 클래스 VI(Phe, Tyr, Trp). 예를 들면, 또 다른 클래스 III 잔기, 예컨대, Asn, Gln 또는 Glu 대신 Asp의 치환은 보존적 치환이다. 따라서, 항-CD46 항체에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 클래스로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Brummell et al. (1993) Biochem. 32: 1180-1187); 문헌(Kobayashi et al. (1999) Protein Eng. 12(10): 879-884); 및 문헌(Burks et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417) 참조).
용어 "비-보존적 아미노산 치환"은 한 클래스 내의 아미노산을 또 다른 클래스로부터의 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들면, 클래스 II 잔기인 Ala을 클래스 III 잔기, 예컨대, Asp, Asn, Glu 또는 Gln으로 치환하는 것을 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, (보존적 또는 비-보존적) 돌연변이는 예컨대, 포화 돌연변이유발에 의해 항-CD46 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있고, 생성된 변경된 항체는 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
"컨센서스 서열"은 관련된 서열들의 패밀리에서 가장 빈번히 발견되는 아미노산들(또는 뉴클레오티드들)로부터 형성된 서열이다(예를 들면, 문헌(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)) 참조). 단백질들의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리에서 그 위치에서 가장 빈번히 발견되는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산들이 동등하게 빈번히 발견되는 경우, 이들 중 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다. 면역글로불린의 "컨센서스 골격"은 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 골격 영역을 지칭한다.
유사하게, CDR들에 대한 컨센서스 서열은 본원에 기재된 항-CD46 항체의 CDR 아미노산 서열들의 최적 정렬에 의해 유도될 수 있다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"은 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가진 2개의 핵산들 또는 이들의 표기된 서열들이 최적으로 정렬되고 비교될 때 적어도 약 80%의 뉴클레오티드들, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드들에서 동일하다는 것을 표시한다. 대안적으로, 실질적인 상동성은 분절이 선택적 혼성화 조건 하에서 가닥의 상보체에 혼성화할 때 존재한다.
2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려할 때 상기 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # 곱하기 100)이다. 하기 비-한정적인 예들에 기재된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 이용하여 서열들의 비교 및 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성의 측정을 달성할 수 있다.
NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 내의 GAP 프로그램을 이용하여 2개의 뉴클레오티드 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정할 수 있다. PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 도입되어 있는 메이어스(Meyers) 및 밀러(Miller)의 알고리즘(Meyers and Miller (1989) CABIOS, 4: 11-17)을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정할 수도 있다. 추가로, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지 내의 GAP 프로그램 내로 도입되어 있는 알고리즘(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453)을 사용하여 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정할 수 있다.
본원에서 고려되는 핵산 및 단백질 서열은 예를 들면, 관련된 서열을 확인하기 위해 공용 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의(query) 서열"로서 사용될 수도 있다. 문헌(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램들(버전 2.0)을 사용하여 이러한 검색을 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수=100 및 단어길이(wordlength)=12로 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 상동한 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 점수=50 및 단어길이=3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동한 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭핑된(gapped) 정렬을 수득하기 위해, 갭핑된 BLAST를 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램들을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다.
cDNA, 게놈 또는 이들의 혼합물로부터 유래된, 본원에 기재된 핵산 조성물(예를 들면, 항-CD46 항체 또는 면역접합체의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산)은 (변경된 제한 부위 등을 제외하고) 종종 천연 서열로 발견되지만 표준 기법에 따라 돌연변이되어 변이체 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이 돌연변이는 원하는 경우 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 천연 V, D, J, 불변, 스위치(switches) 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열에 실질적으로 상동한 또는 이러한 서열로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다(이때, "유래된"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또 다른 서열로부터 변경되어 있다는 것을 표시한다).
용어 "작동가능하게 연결되어 있는"은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들면, 전구서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있거나; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있거나; 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결되어 있는"은 연결되어 있는 DNA 서열들이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하여 판독상(reading phase)으로 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되어 있을 때 "작동가능하게 연결"되어 있다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열의 경우, "작동가능하게 연결되어 있는"은 연결되는 DNA 서열들이 인접하고 필요한 경우 2개의 단백질 코딩 영역들을 연결하도록 인접하여 판독 프레임으로 존재한다는 것을 의미한다. 스위치 서열의 경우, "작동가능하게 연결되어 있는"은 서열들이 스위치 재조합에 영향을 미칠 수 있다는 것을 표시한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위한 것이다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 이때 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 일부 벡터들은 이들이 도입되어 있는 숙주 세포에서 자가복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제기점을 가진 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 삽입됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 뿐만 아니라, 일부 벡터들은 이들이 작동가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 발현 벡터가 도입되어 있는 세포를 지칭하기 위한 것이다. 이러한 용어들은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하기 위한 것이다. 일부 변경들이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기재된 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료"의 방법은 항-CD46 항체 또는 항원 결합 부분, 또는 본원에 기재된 이러한 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 면역접합체를 대상체(예를 들면, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 단계를 이용한다. 일부 실시양태들에서, 대상체는 질환 또는 장애, 또는 재발 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 이러한 증상의 중증도를 감소시키거나, 이러한 증상을 완화시키기 위해, 또는 이러한 치료의 부재 하에서 예상되는 대상체의 생존을 초과하는 수준까지 대상체의 생존을 연장시키기 위해 CD46 양성 암(예를 들면, 전립선암)으로 진단받았고/받았거나 이러한 암에 대한 치료를 받고 있는 대상체이다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 생장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. CD46 양성 암은 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포를 특징으로 하는 암을 지칭한다. 예시적인 CD46 암은 난소암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 신장암 및 췌장암을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 대상체에게 투여될 때 본원에 기재된 바와 같이 CD46 양성 세포의 생장 및/또는 증식과 관련된 질환(예를 들면, CD46 양성 암)의 치료, 예후 또는 진단을 달성하기에 충분한, 항-CD46 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및/또는 이의 면역접합체의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있는, 치료받는 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 투여를 위한 용량은 예를 들면, 약 1 ng 내지 약 10,000 mg, 약 5 ng 내지 약 9,500 mg, 약 10 ng 내지 약 9,000 mg, 약 20 ng 내지 약 8,500 mg, 약 30 ng 내지 약 7,500 mg, 약 40 ng 내지 약 7,000 mg, 약 50 ng 내지 약 6,500 mg, 약 100 ng 내지 약 6,000 mg, 약 200 ng 내지 약 5,500 mg, 약 300 ng 내지 약 5,000 mg, 약 400 ng 내지 약 4,500 mg, 약 500 ng 내지 약 4,000 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 3,500 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 3,000 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 2,600 mg, 약 20 ㎍ 내지 약 2,575 mg, 약 30 ㎍ 내지 약 2,550 mg, 약 40 ㎍ 내지 약 2,500 mg, 약 50 ㎍ 내지 약 2,475 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 2,450 mg, 약 200 ㎍ 내지 약 2,425 mg, 약 300 ㎍ 내지 약 2,000 mg, 약 400 ㎍ 내지 약 1,175 mg, 약 500 ㎍ 내지 약 1,150 mg, 약 0.5 mg 내지 약 1,125 mg, 약 1 mg 내지 약 1,100 mg, 약 1.25 mg 내지 약 1,075 mg, 약 1.5 mg 내지 약 1,050 mg, 약 2.0 mg 내지 약 1,025 mg, 약 2.5 mg 내지 약 1,000 mg, 약 3.0 mg 내지 약 975 mg, 약 3.5 mg 내지 약 950 mg, 약 4.0 mg 내지 약 925 mg, 약 4.5 mg 내지 약 900 mg, 약 5 mg 내지 약 875 mg, 약 10 mg 내지 약 850 mg, 약 20 mg 내지 약 825 mg, 약 30 mg 내지 약 800 mg, 약 40 mg 내지 약 775 mg, 약 50 mg 내지 약 750 mg, 약 100 mg 내지 약 725 mg, 약 200 mg 내지 약 700 mg, 약 300 mg 내지 약 675 mg, 약 400 mg 내지 약 650 mg, 약 500 mg, 또는 약 525 mg 내지 약 625 mg의 본원에 기재된 항-CD46 항체 및/또는 이의 항원 결합 부분, 및/또는 본원에 기재된 이들의 면역접합체일 수 있다. 투약법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 또한, 유효량은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과(즉, 부작용)가 최소화되고/되거나 유리한 효과에 의해 압도되는 양이다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치유적 치료를 제공받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 암을 가진 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물들, 예를 들면, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
"이펙터"는 세포 내로 전달하고/하거나 세포에 위치시키기 원하는 활성을 가진 임의의 분자 또는 분자들의 조합물을 지칭한다. 이펙터는 표지, 세포독소, 효소, 성장 인자, 전사 인자, 항체, 약물 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
예를 들면, 암세포의 "생장 및/또는 증식을 억제하는"이라는 어구는 특히 세포 아폽토시스 또는 다른 세포 사멸 기작을 유도하는 것, 세포의 침습성을 감소시키는 것, 세포 주기 내의 한 시점에서 세포를 정지시키는 것 등을 포함한다.
용어 "면역접합체"는 하나 이상의 이펙터에 부착된 항체 또는 하나 이상의 이펙터에 부착된 복수의 항체들을 지칭한다. 용어 "면역접합체"는 항체에 화학적으로 접합된 이펙터뿐만 아니라, 항체(또는 이의 부분)가 펩티드 이펙터 또는 펩티드를 포함하는 이펙터에 직접적으로 부착되어 있거나 링커를 통해 부착되어 있는 융합 단백질로서 발현된 항체도 포함하기 위한 것이다.
도 1a는 YS5(서열번호 1), YS5F(서열번호 2), YS5v1D(서열번호 3), SB1HGNY(서열번호 4), YS12(서열번호 5), 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음)(서열번호 6), YS6(서열번호 7), YS1(서열번호 8), YS3(서열번호 9), YS4(서열번호 10), YS8(서열번호 11), YS7(서열번호 12), YS9(서열번호 13), YS10(서열번호 14), YS11(서열번호 15), 3G7HY(서열번호 16), 3G7NY(서열번호 17), 3G7(서열번호 18), SB2(서열번호 19), 2C8(서열번호 20) 및 UA8카파(서열번호 21)에 대한 VH 골격 및 CDR 영역들을 보여준다. 도 1b는 YS5(서열번호 22), YS5F(서열번호 23), YS5v1D(서열번호 24), SB1HGNY(서열번호 25), YS12(서열번호 26), 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음)(서열번호 27), YS6(서열번호 28), YS1(서열번호 29), YS3(서열번호 30), YS4(서열번호 31), YS8(서열번호 32), YS7(서열번호 33), YS9(서열번호 34), YS10(서열번호 35), YS11(서열번호 36), 3G7HY(서열번호 37), 3G7NY(서열번호 38), 3G7(서열번호 39), SB2(서열번호 40), 2C8(서열번호 41) 및 UA8카파(서열번호 42)에 대한 VL 골격 및 CDR 영역들을 보여준다.
도 2는 Du-145 세포에 대한 YS5 IgG1 KD 측정을 보여준다. YS5를 4℃에서 Du-145 세포와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였고 결합을 FACS로 분석하였다. 프리즘(Prism)(GraphPad)을 이용하여 평균 형광 강도(MFI) 값을 곡선-피팅하여 2.19 +/- 0.73 nM의 추정된 KD 값을 생성하였다.
도 3은 Du-145 세포에 대한 YS12 IgG1 KD 측정을 보여준다. YS12를 4℃에서 Du-145 세포와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였고 결합을 FACS로 분석하였다. 프리즘(GraphPad)을 이용하여 MFI 값을 곡선-피팅하여 0.043 +/- 0.019 nM의 추정된 KD 값을 생성하였다.
도 4는 본 발명자들의 항-CD46 항체가 인간 CD46 및 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 CD46 둘 다에 결합한다는 것을 보여준다. 인간 CD46(좌측 패널) 및 사이노몰구스 원숭이 CD46(우측 패널)으로 형질감염된 CHO 세포에 대해 FACS 분석을 수행하였다. YS5에 대한 결과가 표시되어 있으나, 모든 본 발명자들의 항체들이 인간 CD46 및 사이노몰구스 CD46 둘 다에 결합한다. Ctr IgG: 비-결합 인간 IgG1. Ctr: 이차 항체로만 염색된 CHO.
도 5는 인간 CD46으로 형질감염된 CHO 세포에 대한 YS5 KD 측정을 보여준다. YS5를 4℃에서 CHO-huCD46 세포와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였고 결합을 FACS로 분석하였다. 프리즘(GraphPad)을 이용하여 MFI 값을 곡선-피팅하여 0.867 +/- 0.299 nM의 추정된 KD 값을 생성하였다.
도 6은 사이노몰구스 원숭이 CD46으로 형질감염된 CHO 세포에 대한 YS5 KD 측정을 보여준다. YS5를 4℃에서 CHO-cynoCD46 세포와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였고 결합을 FACS로 분석하였다. 프리즘(GraphPad)을 이용하여 MFI 값을 곡선-피팅하여 1.952 +/- 0.508 nM의 추정된 KD 값을 생성하였다.
도 7은 경쟁 분석에 의한 에피토프 맵핑을 보여준다. 경쟁자로서 UA20Fc를 사용하거나 사용하지 않은, Du145 세포에 대한 FACS 결합. UA20Fc 대 UA20Fc는 완전한 경쟁에 대한 대조군으로서 사용된다. YS5, YS12 및 3G8(즉, 3G8로서도 공지되어 있는 3G7)은 SB1HGNY의 경쟁 패턴과 상이한 경쟁 패턴을 보임으로써, 비-중첩 에피토프들을 가진 2개의 군들을 정의하였다.
도 8은 에드몬스톤(Edmonston) 균주 홍역 바이러스 H 단백질과의 경쟁을 보여준다. 과량의 재조합 H 단백질-Fc 융합체의 존재 또는 부재 하에서 Du-145 세포에 결합하는 항체를 FACS로 측정하였다. H 단백질-Fc 대 H 단백질-Fc를 양성 대조군으로서 수행하였고(총 경쟁), 이에 대한 MFI 값을 표준화하여 표준화된 경쟁 지표를 생성하였다. CD46에 결합하지 않고 Du-145 세포에 결합하는 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다(경쟁의 결여).
도 9는 대음세포작용에 의한 내재화를 보여준다. YS5 IgG1을 각각 4시간 및 24시간 동안 대음세포작용 표시자 ND70-TRITC(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 함께 전이성 거세 내성 전립선 암세포주 Du-145와 함께 항온처리하였다. 공-국소화(Co-localization)를 올림푸스 형광 공초점 현미경관찰로 분석하였다.
도 10은 치료 항체 평가를 위한 냉동된 조직의 FDA 표준 패널에 대한 항-CD46 항체의 면역조직화학 연구를 보여준다. 음영은 양성 염색의 수준을 표시하고, 이때 태반 영양막이 가장 강하다. 음영으로 처리되지 않은 부분에서의 신호는 약하거나 검출불가능하다.
도 11은 항-CD46 항체-약물 접합체의 HPLC 분석을 보여준다. mc-vc-pab 링커를 통해 YS5 IgG1을 모노메틸 아우리스타틴(MMAF)에 접합시켰고 HIC로 분석하였다. 피크 위의 숫자는 약물 분자의 수를 표시한다. 평균 약 3개의 약물 분자들이 1개의 IgG 분자에 접합되었다.
도 12는 전립선 암세포주 LNCaP-C4-2b에 대한 사멸 곡선을 보여준다.
도 13은 전이성 거세 내성 전립선 암세포주 Du-145에 대한 항-CD46 ADC(YS5)의 사멸 곡선을 보여준다.
도 14는 피하 전립선암 이종이식편 모델을 사용한, 항-CD46(YS5) ADC에 의한 생체내 종양 사멸을 보여준다. LNCaP-C4-2B 세포를 SCID 마우스 내에 피하 이식하였다. 5 mg/kg ADC의 주사를 12일째 날에 시작하였고 4회 주사를 (4일 또는 5일마다) 투여하였다. 항-CD46 ADC 군 내의 마우스들을 치료 후 연장된 기간 동안 모니터링하였다. N=6.
도 15는 CD46이 다발성 골수종 세포주 RPMI8226 상에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 항-CD46 항체는 전립선암(LNCaP) 및 다발성 골수종 세포 둘 다에 결합하는 반면, 항-PSMA 항체 J591은 전립선 암세포에만 결합한다.
도 16은 항-CD46 ADC(YS5)가 시험관 내에서 RPMI8226 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. Ctr ADC: MMAF에 접합된 비-결합 인간 IgG1.
도 17은 생체내 항-CD46(YS5) ADC 활성을 보여준다. RPMI8226-Luc 세포를 NSG 마우스에게 정맥내 주사하여 파종성 종양 이종이식편을 생성하였다. CD46-MMAF: YS5 ADC; IgG-MMAF: 대조군 ADC. 총 4회 주사를 4일마다 제공하였다. 10일째 날에 치료를 시작하였다. 보르테조밉(bortezomib)으로 치료받는 군 내의 3마리 마우스들은 31일째 날까지 지속하지 못하였다.
도 18은 YS5 ADC 치료 후 RPMI8226 이종이식편을 보유하는 마우스들에 대한 생존 데이터의 카플란-메이에르(Kaplan-Meier) 분석을 보여준다.
도 19는 대장암 세포주 HT29에 대한 항-CD46(YS5) ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 20은 MM1S 이종이식편에 대한 항-CD46 ADC(YS5)의 효과를 보여준다.
도 21은 ADC 치료 후 오르토전이성(orthometastatic) MM1.S 이종이식편을 보유하는 마우스들의 카플란-메이에르 분석을 보여준다. 4 mg/kg 항-CD46 ADC로 치료받은 100%의 마우스들이 실험의 종결 시(212일째 날)까지 생존하였다. 이식 후 10일째 날에 주사를 시작하였다. 항-CD46을 4 mg/kg의 단회 용량으로 주사하였거나 두 용량 수준(0.8 mg/kg 및 4 mg/kg)에서 4회 주사하였다. 4 mg/kg의 대조군 ADC(Ctr ADC)를 4회 주사하였다.
도 22는 대장암 세포주 HT29에 대한 항-CD46(YS12) ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 23은 대장암 세포주 HT29에 대한 항-CD46(SB1HGNY) ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 24는 췌장암 세포주 MiaCaPa2에 대한 항-CD46 YS5 ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 25는 중피종 세포주 M28에 대한 항-CD46 YS5 ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 26은 난소암 세포주 OVCAR3에 대한 항-CD46 YS5 ADC의 사멸 곡선을 보여준다.
도 27은 항-CD46 ADC가 BPH-1 세포에 대한 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다. BPH-1 세포는 매우 낮은 수준의 CD46을 발현하고 YS5 ADC에 의해 영향을 받지 않는다.
도 28은 HS27 세포에 대한 항-CD46(YS5) ADC의 효과를 보여준다. HS27 세포는 웰당 3,000개 세포의 밀도로 시딩되었다.
도 29는 항-CD46 ADC(YS5)가 정상 CD3+ T 세포에 대한 독성을 거의 보이지 않는다는 것을 보여준다. 10,000개의 CD3+ T 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였고 96시간 동안 37℃에서 다양한 농도의 YS5 ADC들과 함께 항온처리하였다. 세포 생존능을 CCK-8(세포 카운팅 키트-8)(도진도(Dojindo))로 평가하였다.
도 30은 항-CD46 ADC가 정상 CD14-고갈된 PBMC들에 대한 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다. 10,000개의 세포들을 96웰 플레이트에 시딩하였고 98시간 동안 37℃에서 다양한 농도의 ADC와 함께 항온처리하였다. 세포 생존능을 CCK-8 카운팅 키트로 측정하였다.
도 31은 인간 CD46을 발현하는 형질전환 마우스에서의 항-CD46 ADC 독성 평가를 보여준다. 6 mg/kg 항-CD46 및 대조군 ADC들의 정맥내 주사 후, 마우스들을 14일 동안 추적검사하고 희생시켰고 조직학적 검사를 위해 주요 장기들을 채취하였다.
도 32는 CD46 ADC가 대퇴부내 전립선암 이종이식편 모델에서 효과적이라는 것을 보여준다. 반딧불이 루시퍼라제 레포터를 보유하는 mCRPC 세포주 LnCaP-C4-2B를 마우스들의 대퇴부 내로 주사하였다. 총 4회 주사를 위해 CD46 ADC(YS5-mcvcpab-MMAF)를 4일마다 7일째 날에 주사하였다. 마우스들을 치료 후 65일째 날까지 모니터링하였다. Ctr ADC: MMAF에 접합된 비-결합 IgG1(Ctr IgG-mcvcpab-MMAF).
도 33은 거세 내성 전립선암(CRPC)에서의 CD46 발현을 보여준다. 호르몬 차단에 대한 내성을 갖게 된 환자로부터 전립선 조직 표본을 채취하였다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))를 사용한 후, 엔비전(Envision)+ 시스템(다코 노쓰 아메리카(Dako North America))으로 검출하였다.
도 34는 mCRPC의 골 전이를 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 35는 mCRPC의 림프절 전이를 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 36은 mCRPC의 방광 전이를 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 37은 CD46이 전립선암 신경내분비 세포주 H660에 의해 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 좌측 패널: FACS 분석. Ctr: 비-결합 mAb. 우측 패널: 웨스턴 블롯 분석은 H660 세포에 의한 CD46 발현 및 신경내분비 마커 NSE의 발현을 확인시켜준다.
도 38은 전립선암 신경내분비 세포주 H660에 의한 항-CD46 항체의 내재화를 보여준다. YS5 IgG1을 H660 세포와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였다. 세포를 고정시키고 투과시키고 염색하고 공초점 현미경관찰로 영상화하였다. 단일 공초점 슬라이스가 표시되어 있다. 항-CD46 항체는 내재화되고 라이소좀 마커인 LAMP1과 함께 공-국소화된다.
도 39는 CD46 ADC가 H660 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 다양한 농도의 CD46 ADC(S5-mcvcpab-MMAF)를 7일 동안 37℃에서 신경내분비 세포주 H660과 함께 항온처리하였다. 칼세인 AM 분석을 이용하여 생존능을 평가하였다. Ctr ADC: 비-결합 IgG1-mcvcpab-MMAF.
도 40은 7일 동안 10 μM 아비라테론(abi)을 사용한 전이성 거세 내성 전립선 암세포주 LNCaP-C4-2B의 처리가 FACS에 의해 측정될 때 세포 표면 CD46 발현의 상향조절을 야기하였다는 것을 보여준다. MFI: 평균 형광 강도.
도 41은 아비라테론(Abi)-처리된 LNCaP C4-2B 세포가 CD46 ADC에 더 민감하다는 것을 보여준다. LNCaP-C4-2B 세포를 7일 동안 아비라테론과 함께 항온처리하고 세척하고 추가 96시간 동안 아비라테론 무함유 배지에서 CD46 ADC와 함께 계속 항온처리하였다. C4-2B_CD46 ADC: 아비라테론에의 사전 노출 없이 CD46 ADC(YS5-mcvcpab-MMAF)와 함께 항온처리된 LNCaP C4-2B 세포(EC50 = 169 pM). C4-2B ABI_CD46 ADC: CD46 ADC와 함께 항온처리된, 아비라테론에 사전 노출된 LNCaP C4-2B 세포(EC50 = 21 pM). Ctr ADC: MMAF에 접합된 비-결합 IgG1.
도 42는 엔잘루타마이드(ENZ) 처리 후 신경내분비 세포주 H660 상에서의 세포 표면 CD46의 상향조절을 보여준다. H660 세포를 7일 동안 10 μM 엔잘루타마이드로 처리하고 세포 표면 항원 발현에 대해 FACS로 분석하였다. CD46은 H660에 의해 고도로 발현되는 반면, 전립선 특이적 막 항원(PSMA)은 거의 검출될 수 없다. 더욱이, 엔잘루타마이드에의 노출은 종양 세포 표면 상에서의 CD46 발현의 상향조절을 야기하였다. MFI: 평균 형광 강도.
도 43은 CD46이 일차 대장암에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다. 두 확대 수준(4x 및 20x)에서 디지털 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
도 44는 CD46이 간으로 전이된 대장암에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다. 두 확대 수준(4x 및 20x)에서 디지털 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
도 45는 CD46이 림프절로 전이된 대장암에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다. 두 확대 수준(4x 및 20x)에서 디지털 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
도 46은 CD46이 방광으로 전이된 대장암에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다. 두 확대 수준(4x 및 20x)에서 디지털 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
도 47은 CD46이 중피종에서의 CD46 염색의 면역조직화학에 의해 입증된 바와 같이 중피종에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 48은 CD46이 췌장암에서 고도로 발현된다는 것을 보여준다. 화살표는 종양 세포를 표시한다(선택적 종양 영역만이 표시되어 있다). 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 49는 CD46이 GBM 및 정상 뇌에서의 CD46 염색의 면역조직화학 분석에 의해 예증된 바와 같이 다형성 교모세포종(GBM)에 의해 과다발현된다는 것을 보여준다. 정상 인간 뇌에서는 CD46 염색이 관찰되지 않았으나, GBM 표본에서는 강한 염색이 관찰되었다. 염색을 위해 H-294 토끼 항-인간 CD46 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 후, 엔비전+ 시스템(다코 노쓰 아메리카)으로 검출하였다.
도 50은 CD46 ADC에 의한 중피종(M28) 이종이식편 성장의 생체내 억제를 보여준다. YS5-mcvcpab-MMAF를 총 5회 5 mg/kg으로 3일 또는 4일마다 주사하였다(화살표에 의해 표시됨). 종양 부피를 칼리퍼(caliper)로 측정하였다. YSC10은 대조군 비-결합 인간 IgG1이다.
다양한 실시양태들에서, 다수의 신규 항-CD46 항체들이 제공된다. 파지 디스플레이 기법 및 효모 디스플레이 기법 둘 다를 이용하여 세포 표면 및 재조합 CD46에 대한 선택의 조합으로 본원에 기재된 원형 항체들을 확인하였다. 이들 항체들은 가교연결을 필요로 하지 않으면서 종양 선택적 대음세포작용 경로에 의해 내재화되고 라이소좀에 위치함으로써, 세포내 적재물(payload) 방출을 이용하는 항체-약물 접합체들(ADC들) 및 다른 표적화된 치료제들의 개발에 매우 적합해진다.
본원에 기재된 항체는 주요 보체 결합 도메인 3 및 4가 아닌 CD46 분자의 도메인 1 및 2에 결합하여, 정상 보체 캐스케이드(cascade)를 직접적으로 차단하지 않는다.
정교한 에피토프 맵핑도 본원에 기재된 항-CD46 항체와 각각 PCT 출원 제PCT/US2008/076704호 및 동시계류 미국 출원 제14/205,101호에 기재된 UA20 및 2B10 항체 사이에 항원 접촉 부위의 차이를 보여주었다. 사이노몰구스 원숭이 CD46 cDNA로 형질감염된 CHO 세포에 대해 시험하였을 때, 본 발명자들은 본 발명자들의 항-CD46 항체가 인간과 사이노몰구스 원숭이 사이에 보존된 에피토프에 결합한다는 것을 발견함으로써, 조절 독성학 연구를 위한 적절한 종을 확인하였다.
치료 항체 평가용으로 FDA에 의해 승인받은 냉동된 인간 조직 패널을 사용하여, 본원에 기재된 항체에 의해 결합되는 CD46 에피토프가 태반 영양막 및 전립선 상피(보다 더 낮은 정도)를 제외하고 사실상 어느 조직에서도 낮은 수준으로 발현되지 않는다는 것을 발견하였다. 대조적으로, CD46은 전립선암, 다발성 골수종, 대장암, 췌장암, 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 신경교종, 신경모세포종 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 종양들에 의해 과다발현된다는 것을 확인하였다.
CD46이 염색체 1q32.2에 위치하고 1q 획득이 광범위한 인간 암들에서 관찰되었다는 점을 고려할 때, CD46은 다양한 악성종양들에 대한 항체 요법 개발을 위한 탁월한 표적일 가능성이 있다. 본원에 기재된 항-CD46 항체를 사용하여 항체-약물 접합체(ADC)를 구축하였고 이 접합체가 전이성 거세 내성 전립선암, 다발성 골수종, 대장암, 중피종, 난소암 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 CD46 과다발현 암세포주들을 시험관 내에서 사멸시킨다는 것을 발견하였다. 가장 중요한 점은 본원에 기재된 항-CD46 ADC들이 거세 내성 전립선암 및 다발성 골수종의 이종이식편 모델에서 종양 부하(burdens)를 크게 감소시키는 강력한 생체내 항-종양 활성을 보였다는 점이다. 이 강력한 항-종양 활성은 다른 CD46 과다발현 종양 모델에도 적용될 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 본원에 기재된 연구는 표적화된 요법 개발에 유용한 종양 세포 표면 항원으로서 CD46을 검증한다. 추가로, 본원에 기재된 항-CD46 항체는 환자 분류 및 치료 결과 모니터링을 위한 동반 진단에 사용될 수 있다.
이들 발견들에 비추어 볼 때, 본원에 기재된 항-CD46 항체는 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포에 특이적으로 결합하고 이 세포 내로 내재화되는 것으로 생각된다. CD46이 난소암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 신장암, 췌장암, 중피종, 림프종, 간암, 요로암, 위암 및 자궁경부암을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 암들에 의해 발현/과다발현되기 때문에, 이들 항체들은 이들 CD46 양성 암세포들 및 다른 CD46 양성 암세포들을 특이적으로 표적화하고 이들 암세포들 내로 내재화시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 이들 항체들은 세포(특히 암세포)에 대한 그들의 고유한 세포독성 및/또는 세포증식억제성 및/또는 항증식 활성을 위해 부착된 이펙터 없이 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 이들 항체들은 하나 이상의 이펙터(예를 들면, 이차 항체, 검출가능한 표지, 세포독소, 약물을 함유하는 리포좀, 방사성핵종, 약물, 프로드러그, 바이러스 입자, 사이토카인, 킬레이트 등)에 부착됨으로써, CD46을 발현하거나 과다발현하는 암세포에 특이적으로 결합하고 이 암세포 내로 내재화시킬 면역접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 다수의 이펙터들이 단일 항체에 부착될 것이거나; 일부 실시양태들에서, 다수의 항체들이 단일 이펙터에 부착될 것이거나; 일부 실시양태에서, 단일 항체가 단일 항체에 부착될 것이다.
다양한 실시양태들에서, 이들 항체들 및/또는 면역접합체들의 사용 방법이 제공된다. 일부 실시양태들에서, 상기 방법은 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포(예를 들면, 암세포, 예컨대, 난소암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 전립선 암세포, 결장암 세포, 신장암 세포, 췌장암 세포 등)를 구축물과 접촉시켜, 상기 구축물(또는 이의 부분)을 상기 세포 내로 내재화시킴으로써 이펙터를 표적 세포에게 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, "접촉"은 항체 또는 구축물을, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 인간 또는 비-인간 포유동물)에게 투여하는 단계를 포함한다.
CD46에 결합하는 항체
CD46, 특히 도메인 1 및/또는 2에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, 암세포가 조직 미세환경에 존재할 때 제자리에서(in situ) 전립선(및 다른 CD46 양성 암세포)에 의해 내재화되는 항체를 발견하였다. 상기 표시된 바와 같이, 이러한 항체는 단독으로 사용될 때, 또는 "표적화된 이펙터"를 형성하기 위해 이펙터에 부착되었을 때 암을 표적화하는 데 유용하다.
따라서, 일부 실시양태들에서, CD46에 특이적으로 결합하고 대음세포작용을 통해 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포(예를 들면, 전립선 암세포) 내로 내재화되는 단리된 항체가 제공된다. 다양한 실시양태들에서, 상기 항체는 CD46의 도메인 1 및/또는 도메인 2에 결합한다. 다양한 실시양태들에서, 상기 항체는 CD46의 도메인 3 및/또는 도메인 4에 결합하지 않는다.
본원에서 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및 UA8카파(예를 들면, 표 1 참조)로서 표기된 항체들은 예시적인 원형 항체들이다. 일부 실시양태들에서, 이들 항체들 중 하나 이상의 항체의 VL CDR1 및/또는 VL CDR2, 및/또는 VL CDR3, 및/또는 VH CDR1 및/또는 VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 항체가 고려된다. 일부 실시양태들에서, 이들 항체들 중 하나 이상의 항체의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체가 고려된다. CD46에서의 결합에 대해 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체와 경쟁하는 항체도 고려된다.
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체들의 VH 및 VL 도메인들의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있다(실시예 1 참조).
다양한 실시양태들에서, 본원에서 고려되는 항체는 항체 3051.1, G12FC3, M6c42b, 4F3YW, M40pr146, UA20, UA8, 585II41, 585II41.1, 585II56, 3076, 3051, M49R, RCI-14, II79_4, II79_3, T5II-4B.1, T5II-4B.2, RCI-11, RCI-20, CI-11A, CI-14A, PCT 출원 제PCT/US2008/076704호(WO 2009/039192)에 기재된 S95-2, 및/또는 mPA7 항체의 3개 VH CDR들 및/또는 3개 VL CDR들을 포함하는 항체를 명확히 배제한다. 이들 항체들의 VH 및 VL 쇄들, 및 이들 도메인들을 포함하는 CDR들의 아미노산 서열들은 PCT 출원 제PCT/US2008/076704호에 제시되어 있고, 이들 도메인들의 아미노산 서열은 하기 표 2에 복사되어 있다.
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및 UA8카파 항체들에 대해 제공된 아미노산 서열들을 사용하여, 예를 들면, 이하에 기재된 바와 같이 다수의 항체 형태들을 제조할 수 있다. 이러한 형태들은 실질적으로 온전한(예를 들면, 전장) 면역글로불린(예를 들면, IgA, IgE, IgG 등), 항체 단편(예를 들면, Fv, Fab, (Fab')2, (Fab')3, IgGΔCH2, 미니바디(minibody) 등), 단일 쇄 항체(예를 들면, scFv), 디아바디(diabody), 유니바디(unibody), 아피바디(affibody) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
항체가 단일 쇄 항체인 경우, 이러한 항체를 구성하는 VH 및 VL 도메인들은 직접적으로 함께 연결될 수 있거나 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예시적인 펩티드 링커는 GGGGS GGGGS GGGGS(서열번호 67), GGGGS GGGGS(서열번호 68), GGGGS(서열번호 69), GS GGGGS GGGGS GGS GGGGS(서열번호 70), SGGGGS(서열번호 71), GGGS(서열번호 72), VPGV(서열번호 73), VPGVG(서열번호 74), GVPGVG(서열번호 75), GVG VP GVG(서열번호 76), VP GVG VP GVG(서열번호 77), GGSSRSS(서열번호 78) 및 GGSSRSSSSGGGGSGGGG(서열번호 79) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
상기 표시된 바와 같이, 다양한 실시양태들에서, 항체는 CD46(예를 들면, 도메인 1 및/또는 2)에 결합(예를 들면, 특이적으로 결합)한다. 전형적으로, 본원에서 고려되는 항체는 DU145 세포, PC3 세포 및 LnCaP 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포주의 세포들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 전립선 암세포에 특이적으로 결합할 것이다. 일부 실시양태들에서, 항체는 FACS에 의해 살아있는 전립선 종양 세포에 대해 측정될 때 약 5 nM보다 더 큰 친화성(약 5 nM보다 더 작은 KD)으로 전립선 종양 세포에 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성은 약 1 nM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 10 pM 또는 약 1 pM보다 더 크다(이들 값보다 더 작은 KD).
예를 들면, 이하에 기재된 바와 같이, 본원에서 제공된 서열 정보를 사용하고 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 방법(예를 들면, 화학적 합성 방법 및/또는 재조합 발현 방법)을 이용하여, 예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및 UA8카파를 비롯한, 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체, 또는 이들 항체들의 VH 및/또는 VL 도메인(들)을 포함하는 항체를 용이하게 제조할 수 있다.
추가로, 동일한 에피토프에 결합하는(예를 들면, CD46에의 결합 및/또는 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포, 예를 들면, 전립선 암세포에의 결합에 대해 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체들 중 하나 이상의 항체와 경쟁하는) 항체에 대해 스크리닝하고/하거나, 본원에서 확인된 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체들을 변경시켜 변경된 항체의 라이브러리를 생성한 후 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포, 예를 들면, 전립선 암세포에의 개선된 결합 및/또는 이러한 세포 내로의 내재화에 대해 상기 라이브러리의 항체들을 재스크리닝함으로써 다른 "관련된" 전립선암 특이적 항체들을 확인할 수 있다.
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파와 동일한 CD46 에피토프(들)에 결합하는 다른 항체의 확인
확인된 CD46, 특히 도메인 1 및/또는 2를 유용한 항체 표적으로서 사용하고 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및 UA8카파 항체를 유용한 원형 항체로서 사용하여, CD46 도메인 1 및/또는 2에 결합하는 항체를 스크리닝함으로써, 예를 들면, CD46 도메인 1 및/또는 2에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, 단일클론 항체)를 생성함으로써, CD46에 결합하고 바람직하게는 대음세포작용을 통해 내재화되는 다른 "관련된" 항체들을 용이하게 확인할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, CD46에 결합하고 대음세포작용에 의해 내재화되는 다른 항체들은 예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파에 의해 결합된 에피토프에서 항체 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체와 교차-반응하는 항체에 대해 스크리닝하고/하거나, 전립선 암세포(예를 들면, CaP 세포, PC3 세포 등)에의 결합에 대해 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체와 교차-반응하고/하거나, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체에 대해 생성된 이디오타입(idiotypic) 항체와 교차-반응하는 항체에 대해 스크리닝함으로써, CD46에 결합하고 대음세포작용에 의해 내재화되는 다른 항체들을 확인할 수 있다.
단일클론 항체
다양한 공지된 기법들, 예컨대, 문헌(Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495)에 기재된 표준 체세포 혼성화 기법, B 림프구의 바이러스 또는 종양 유발 형질전환 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 기법을 이용하여 CD46 도메인 1 및/또는 2에 결합하는, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 전체 인간 단일클론 항체이다.
따라서, 한 실시양태에서, 하이브리도마 방법이 CD46에 결합하는, 바람직하게는 CD46의 도메인 1 및/또는 도메인 2에 결합하는 항체의 생성에 이용된다. 이 방법에서, 면역화를 위해 사용된 항원에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 이끌어내기 위해 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물을 적합한 항원으로 면역화시킬 수 있다. 대안적으로, 림프구를 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다. 그 다음, 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성할 수 있다(Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press)). 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생성에 대해 하이브리도마 세포가 생장하는 배양 배지를 분석한다. 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝할 수 있고 표준 방법으로 생장시킬 수 있다(Id.). 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 생장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피로 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들면, 문헌(McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554), 문헌(Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628), 문헌(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597), 문헌(Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol., 23: 344-348); 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호 및 제5,571,698호(Ladner et al.); 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호(Dower et al.); 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호(McCafferty et al.); 및 미국 특허 제5,885,793호, 제6,521,404호, 제6,544,731호, 제6,555,313호, 제6,582,915호 및 제6,593,081호(Griffiths et al.)에 기재된 기법을 이용함으로써 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 CD46 도메인 1 및/또는 2에 결합하는 항체 또는 항체 부분을 단리할 수 있다. 추가로, 쇄 셔플링에 의한 고친화성(nM 범위) 인간 항체의 생성(Marks et al. (1992) Bio/Technology, 10:779-783)뿐만 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하는 방법인 조합적 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al. (1993) Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266)도 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 문헌(Hoet et al.)에 기재된 파지 디스플레이 기법을 이용하여, CD46에 결합하는, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제조하다. 이 기법은 인간 기증자로부터 단리된 면역글로불린 서열들의 독특한 조합을 갖고 중쇄 CDR들에서의 합성 다양성을 가진 인간 Fab 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 그 다음, CD46에 결합하는, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체와 결합에 대해 경쟁하는 Fab들에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝한다.
또 다른 실시양태에서, 마우스 시스템보다는 오히려 인간 면역 시스템의 일부를 보유하는 형질전환 또는 전이염색체 마우스들을 사용하여, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 CD46에 대해 유도된 인간 단일클론 항체를 생성할 수 있다(예를 들면, 문헌(Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859); 문헌(Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93); 문헌(Harding and Lonberg (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 764: 536-546); 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호(모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 제5,545,807호(Surani et al.); PCT 출원 공보 제WO 92/03918호, 제WO 93/12227호, 제WO 94/25585호, 제WO 97/13852호, 제WO 98/24884호 및 제WO 99/45962호(모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 출원 공보 제WO 01/14424호(Korman et al.) 참조).
또 다른 실시양태에서, 전이유전자 및 전이염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대, 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 CD46에 대해 유도된, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 인간 항체를 생성할 수 있다(예를 들면, PCT 출원 공보 제WO 02/43478호(Ishida et al.) 참조).
인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 형질전환 동물 시스템이 당분야에서 이용가능하고 본 발명의 항-CD46 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제노마우스(Xenomouse)(아브게닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.))로서 지칭되는 대안적 형질전환 시스템이 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 예를 들면, 미국 특허 제5,939,598호, 제6,075,181호, 제6,114,598호, 제6,150,584호 및 제6,162,963호(Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 전이염색체 동물 시스템이 당분야에서 이용가능하고 본원에서 고려되는 항-CD46 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727)에 기재된 바와 같이, 인간 중쇄 전이염색체 및 인간 경쇄 전이염색체 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있다. 나아가, 인간 중쇄 전이염색체 및 경쇄 전이염색체를 보유하는 소는 당분야의 문헌(예를 들면, 문헌(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894) 참조)에 기재되어 있고 항-CD46 CCP1 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CD46에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 항체는 이러한 항체를 생성하는 형질전환 식물 및/또는 배양된 식물 세포(예를 들면, 담배, 옥수수 및 좀개구리밥)를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 발현하는 형질전환 담배 잎은 예를 들면, 유도성 프로모터를 이용함으로써 이러한 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118) 참조). 또한, 형질전환 옥수수는 이러한 항체 및 이의 항원 결합 부분을 발현하는 데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147) 참조). 항체 부분, 예컨대, 단일 쇄 항체(scFv)를 포함하는 항체는 예를 들면, 담배 종자 및 감자 괴경을 사용함으로써 형질전환 식물 종자로부터 다량으로 제조될 수도 있다(예를 들면, 문헌(Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109) 참조). 식물에서 항체 또는 항원 결합 부분을 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌(Fischer et al. (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108); 문헌(Ma et al. (1995) Trends Biotechnol. 13: 522-527); 문헌(Ma et al. (1995) Plant Physiol. 109: 341-346); 문헌(Whitelam et al. (1994) Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944); 및 미국 특허 제6,040,498호 및 제6,815,184호에서도 발견될 수 있다.
CD46에 결합하는, 바람직하게는 본원에 개시된 기법들을 비롯한 임의의 기법을 이용함으로써 제조된 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 부분의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대, 방사면역분석(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 단일클론 항체 또는 이의 부분의 결합 친화성은 문헌(Munson et al. (1980) Anal. Biochem., 107:220)의 스캐차드 분석에 의해 측정될 수도 있다.
항-이디오타입 항체와의 교차-반응성
이디오타입은 항체의 고도 가변 항원 결합 부위를 나타내고 그 자체가 면역원성을 가진다. 항체-매개된 면역 반응의 생성 동안, 개체는 항원에 대한 항체뿐만 아니라, 항원과 유사한 면역원성 결합 부위(이디오타입)를 가진 항-이디오타입 항체도 발생시킬 것이다.
당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 방법을 이용하여 본원에서 확인된 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)의 가변 영역에 대한 항-이디오타입 항체를 생성할 수 있다. 요약하건대, 본 발명의 항체 또는 이의 단편(예를 들면, CDR들)을 동물 내로 주사하여, 이디오타입성 영역 내의 결정인자를 비롯한, 항체 상의 다양한 항원성 결정인자들에 대한 항혈청을 이끌어냄으로써 항-이디오타입 항체를 제조할 수 있다.
항-분석물 항체의 제조 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 큰(대략 5000 달톤보다 더 큰) 분자량 항원들은 동물 내로 직접 주사될 수 있는 반면, 작은(대략 5000 달톤보다 더 작은) 분자량 화합물들은 이들이 면역원성을 갖게 하기 위해 바람직하게는 고분자량 면역원성 담체, 통상적으로 단백질에 커플링된다. 면역화에 반응하여 생성된 항체는 혈청, 복수액, 면역글로불린(Ig) 분획, IgG 분획 또는 친화성-정제된 단일특이적 물질로서 사용될 수 있다.
동물을 전술된 바와 같이 제조된 본 발명의 항체로 면역화시킴으로써 다중클론 항-이디오타입 항체를 제조할 수 있다. 일반적으로, 항체(예를 들면, 파지-디스플레이 라이브러리)가 유래된 동물과 종 및 알로타입(allotype)-일치된 동물을 면역화시키는 것이 바람직하다. 이것은 비-이디오타입성 결정인자에 대해 유도된 항체의 생성을 최소화한다. 그 다음, 이로써 수득된 항혈청은 통상적으로 파지-디스플레이 라이브러리가 유래된 종과 동일한 종으로부터의 정상 혈청에 대해 광범위하게 흡수됨으로써, 비-이디오타입성 결정인자에 대해 유도된 항체를 제거한다. 흡수는 정상(비-면역) 혈청 단백질을 글루타르알데하이드와 가교연결함으로써 형성된 겔 상에서 항혈청을 통과시킴으로써 달성될 수 있다. 항-이디오타입 특이성을 가진 항체는 상기 겔을 직접 통과할 것이지만, 비-이디오타입 결정인자에 대한 특이성을 가진 항체는 상기 겔에 결합할 것이다. 비-면역 혈청 단백질을 불용성 폴리사카라이드 지지체(예를 들면, 세파로스) 상에 고정시키는 것도 흡수에 적합한 매트릭스를 제공한다.
문헌(Kohler et al. (1975) Nature 256: 495)의 방법을 이용하여 단일클론 항-이디오타입 항체를 제조할 수 있다. 구체적으로, (1) 관심 있는 항원 또는 햅텐-담체 접합체(즉, 본 발명의 항체 또는 이의 하위서열)로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를, (2) 약물(예를 들면, 8-아자구아닌)에 대한 내성에 대해 선택된 마우스 골수종 세포주와 융합시키는 단계를 포함하는 하이브리도마 기술을 이용하여 단일클론 항-이디오타입 항체를 제조할 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린을 분비하지 않는 골수종 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 여러 이러한 세포주들이 당분야에서 공지되어 있다. 일반적으로 바람직한 한 세포주는 P3X63Ag8.653이다. 이 세포주는 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection )에 CRL-1580으로서 기탁되어 있다.
융합은 확립된 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에서 수행될 수 있다(예를 들면, 문헌(Monoclonal Antibodies, R. Kennett, J. McKearn & K. Bechtol, eds. N.Y., Plenum Press, 1980, and Current Topics in Microbiology & Immunology, Vol. 81, F. Melchers, M. Potter & N. L. Warner, eds., N.Y., Springer-Verlag, 1978) 참조). 융합된 세포와 비-융합된 세포의 생성된 혼합물은 하이포잔틴-아미노프테린-타이미딘(HAT) 선택적 배지에 플레이팅된다. 이들 조건들 하에서 하이브리드 세포만이 생장할 것이다.
충분한 세포 생장이 일어났을 때(전형적으로 융합 후 10일 내지 14일), 배양 배지를 회수하고, 고체상 RIA 및 효소-연결된 면역흡착 분석을 포함하는 다수의 방법들 중 어느 한 방법으로 단일클론 이디오타입 항-분석물 항체의 존재에 대해 스크리닝한다. 그 다음, 원하는 특이성의 항체를 함유하는 배양 웰로부터의 세포를 증폭하고 재클로닝한다. 그 다음, 관심 있는 항체에 대한 양성을 유지하는 배양물로부터의 세포는 통상적으로 민감한 조직적합성 프리스탄-프라이밍된(pristane-primed) 마우스 내의 복수 종양으로서 통과된다.
복강을 가볍게 두드려 복수액을 회수하고 항체에 대해 재검사하고 전술된 바와 같이 정제한다. 비-분비 골수종 세포주가 융합에 사용되는 경우, 항체가 그의 항원 결합 특성에 대해 이미 균질하기 때문에 단일클론 항체의 친화성 정제는 통상적으로 필요하지 않다. 필요한 것은 복수에 있는 오염 단백질들로부터 상기 항체를 단리하는 것, 즉 면역글로불린 분획을 생성하는 것 뿐이다.
대안적으로, 관심 있는 하이브리드 세포주를 무혈청 조직 배양물에서 생장시킬 수 있고, 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 일반적으로, 수율이 낮기 때문에 이 방법은 다량의 항체를 수득하는 보다 덜 바람직한 방법이다. 세포를 마우스 내에 정맥내로 통과시키고 혈청으로부터 항체를 회수하는 것도 가능하다. 채혈당 수득될 수 있는 소량의 혈청, 및 다른 혈청 성분으로부터의 광범위한 정제에 대한 필요성 때문에, 이 방법은 일반적으로 바람직하지 않다. 그러나, 일부 하이브리도마들은 복수 종양으로서 생장하지 않을 것이므로, 이들 대안적 항체 수득 방법들 중 한 방법이 이용되어야 한다.
YS5, YS5F , YS5v1D , SB1HGNY , YS12, 3G7RY ( 3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY , 3G7NY , 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파와의 교차-반응성
또 다른 방법에서, CD46에 결합하는 항체들은 이들이 본 발명의 "원형" 항체들(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)과 동일한 에피토프에 결합한다는 사실에 의해 확인될 수 있다. 이러한 항체들을 확인하기 위해, 대상 에피토프를 단리할 필요가 없다. 일부 실시양태들에서, 전립선 암세포(예를 들면, CaP 세포, PC3 세포 등)에 의한 결합 및/또는 내재화, 및/또는 CD46에의 결합에 대해 본 발명의 원형 항체와 경쟁하는 항체에 대해, 예를 들면, 항체 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
에피토프 결합 및/또는 세포 결합 및/또는 내재화에 대해 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태들에서, 교차-반응성 전립선 항체는 본원에 기재된 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체들 중 하나 이상의 항체와 적어도 60%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 적어도 99%의 교차-반응성을 보인다.
다른 "관련된" 항-CD46 항체를 선택하는 파지 디스플레이 방법
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파, 및/또는 다른 전립선 특이적 항체에 대한 공지된 서열들을 사용하고 다양한 파지 디스플레이(또는 효모 디스플레이) 방법들을 이용하여, 동일한 또는 심지어 더 큰 친화성으로 CD46에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 다른 항체를 생성할 수 있다.
쇄 셔플링 방법
항체 변이체를 생성하는 한 방법은 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 라이브러리에서 원래의 VH 또는 VL 유전자를 V-유전자들의 레퍼토리로 치환하여 신규 파트너를 생성하는 것(쇄 셔플링)(Clackson et al. (1991) Nature. 352: 624-628)이었다. 쇄 셔플링 및 파지 디스플레이를 이용하여 햅텐 페닐옥사졸론(phOx)에 결합하는 인간 scFv 항체 단편의 친화성을 300 nM부터 1 nM까지 (300배) 증가시켰다(Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779-783).
따라서, 예를 들면, 본원에 기재된 항-CD46 항체의 친화성을 변경시키기 위해, 원형 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체(예를 들면, 도 2에 표시됨)의 VH 유전자를 함유하는 돌연변이체 scFv 유전자 레퍼토리 및 인간 VL 유전자 레퍼토리를 생성할 수 있다(경쇄 셔플링). 상기 scFv 유전자 레퍼토리를 파지 디스플레이 벡터, 예를 들면, pHEN-1(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133-4137) 또는 다른 벡터 내로 클로닝할 수 있고, 형질전환 후 형질전환체들의 라이브러리를 수득한다.
유사하게, 원형 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체(예를 들면, 도 2에 표시됨)의 VL 유전자를 함유하는 돌연변이체 scFv 유전자 레퍼토리 및 인간 VH 유전자 레퍼토리를 생성할 수 있다(중쇄 셔플링). 상기 scFv 유전자 레퍼토리를 파지 디스플레이 벡터, 예를 들면, pHEN-1(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133-4137) 또는 다른 벡터 내로 클로닝할 수 있고, 형질전환 후 형질전환체들의 라이브러리를 수득한다.
생성된 라이브러리를 관련 표적(예를 들면, CD46), 및/또는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파와의 교차-반응성에 대해 스크리닝할 수 있다.
결합 친화성을 개선하기 위한 부위-지정된 돌연변이유발
대다수의 항원 접촉 아미노산 측쇄들은 전형적으로 상보성 결정 영역들(CDR들)에 위치한다(VH 내의 3개 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3)) 및 VL 내의 3개 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3))(Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.,196: 901-917; Chothia et al. (1986) Science, 233: 755-8; Nhan et al. (1991) J. Mol. Biol., 217: 133-151). 이들 잔기들은 항원에 대한 항체 친화성을 담당하는 결합 에너지론의 대부분에 기여한다. 다른 분자들에서, 리간드와 접촉하는 아미노산의 돌연변이는 그의 결합 파트너에 대한 한 단백질 분자의 친화성을 증가시키는 효과적인 수단인 것으로 밝혀져 있다(Lowman et al. (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578; Wells (1990) Biochemistry, 29: 8509-8516). 예를 들면, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, CDR들의 부위-지정된 돌연변이유발 및 전립선 암세포, 특히 CD46에서의 결합에 대한 스크리닝은 개선된 결합 친화성을 가진 항체를 생성할 수 있다.
고친화성 인간 scFv를 생성하기 위한 CDR 무작위화
단순한 부위-지정된 돌연변이유발의 연장에서, 부분적 또는 전체 CDR들(VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 및/또는 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)이 무작위화되어 있는 돌연변이체 항체 라이브러리를 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 공지된 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)를 주형으로서 사용하여 별도의 라이브러리에서 각각의 CDR을 무작위화한다. 각각의 CDR 라이브러리로부터 가장 높은 친화성 돌연변이체들의 CDR 서열들을 조합하여 친화성의 상가적 증가를 수득한다. 유사한 방법이 성장 호르몬 수용체에 대한 인간 성장 호르몬(hGH)의 친화성을 3.4 x 10-10 M부터 9.0 x 10-13 M까지 1500배 이상 증가시키는 데 이용되고 있다(Lowman et al. (1993) J. Mol. Biol., 234: 564-578).
VH CDR3은 종종 결합 포켓의 중심을 점유하므로, 이 영역 내의 돌연변이는 친화성의 증가를 야기할 가능성이 있다(Clackson et al. (1995) Science, 267: 383-386). 한 실시양태에서, VH CDR3 잔기들이 무작위화된다(예를 들면, 문헌(Schier et al. (1996) Gene, 169: 147-155); 문헌(Schier and Marks (1996) Human Antibodies and Hybridomas. 7: 97-105, 1996); 및 문헌(Schier et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567) 참조).
다른 항체 변경
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체로부터 유래된 부분적 항체 서열을 사용하여 구조적 및 기능적으로 관련된 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역들(CDR들)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR들 내부의 아미노산 서열들은 CDR들 외부의 서열들보다 개별 항체들 사이에 더 다양하다. CDR 서열들이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질을 가진 상이한 항체로부터의 골격 서열 상에 이식된 특이적 천연 생성 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 생성 항체의 성질과 유사한 재조합 항체를 발현할 수 있다(예를 들면, 문헌(Riechmann et al. (1998) Nature 332: 323-327); 문헌(Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525); 및 문헌(Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033) 참조). 이러한 골격 서열은 생식세포주 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스로부터 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명의 항-CD46 항체의 하나 이상의 구조적 특징, 예컨대, CDR들을 사용하여, 예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체의 하나 이상의 기능적 성질, 예를 들면, 결합 및 전립선 암세포 내로의 내재화를 보유하는 구조적으로 관련된 항-CD46 항체를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 CDR 영역들 중 하나 이상의 CDR 영역(예를 들면, VH CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3, 및/또는 VL CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3)을 공지된 인간 골격 영역 및 CDR들과 재조합적으로 조합하여 추가 재조합적으로 조작된 항-CD46 항체를 생성한다. 중쇄 가변 골격 영역 및 경쇄 가변 골격 영역은 동일한 또는 상이한 항체 서열로부터 유래될 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인들이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 수행한다는 것은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Hall et al. (1992) J. Immunol., 149: 1605-1612); 문헌(Polymenis et al. (1994) J. Immunol., 152: 5318-5329); 문헌(Jahn et al. (1995) Immunobiol., 193:400-419); 문헌(Klimka et al. (2000) Brit. J. Cancer, 83: 252-260); 문헌(Beiboer et al. (2000) J. Mol. Biol, 296: 833-849); 문헌(Rader et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915); 문헌(Barbas et al. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116: 2161-2162); 및 문헌(Ditzel et al. (1996) J. Immunol., 157: 739-749) 참조). 따라서, 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 특정 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3들을 포함하는 항체가 생성된다. 따라서, 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 특정 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR1들을 포함하는 항체가 생성된다. 상기 항체는 본 발명의 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)의 다른 중쇄 및/또는 경쇄 CDR들을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 전술된 조작된 항체들의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역들은 본원에 개시된 아미노산 서열(들)(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파의 CDR들)과 정확히 동일한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 통상의 기술을 가진 당업자는 CD46에 효과적으로 결합하는 항체의 능력을 여전히 보유하면서 정확한 CDR 서열로부터의 일부 이탈이 가능할 수 있다는 것(예를 들면, 보존적 아미노산 치환)을 인식할 것이다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 조작된 항체는 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 항체의 하나 이상의 CDR들과, 예를 들면, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR들로 구성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CDR의 하나 이상의 잔기를 바꾸어 결합을 변경시킴으로써 보다 더 유리한 결합 속도를 달성할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 예를 들면, 1010 M-1 이상의 매우 높은 결합 친화성을 가진 항체를 달성할 수 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 친화성 성숙 기법을 이용하여 CDR 영역(들)을 바꾼 후, 생성된 결합 분자들을 결합에서의 원하는 변화에 대해 스크리닝할 수 있다. 따라서, CDR(들)이 바뀔 때, 가장 우수한 조합된 결합 및 낮은 면역원성에 대해 최적화된 항체가 달성되도록 결합 친화성의 변화뿐만 아니라 면역원성의 변화도 모니터링할 수 있고 점수화할 수 있다.
CDR들 내부에서의 변경 이외에 또는 대신에, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 골격 영역들인 FR1, FR2, FR3 및 FR4 중 하나 이상의 골격 영역 내부에서도 변경을 야기할 수 있되, 이 변경은 항체의 결합 친화성을 제거하지 않아야 한다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들면, 암의 치료에 있어서 항체의 효과를 향상시키기 위해 항체를 이펙터 기능 면에서 더 변경시킨다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내로 도입함으로써, 이 영역에서 쇄간 디설파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 성능 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다(예를 들면, 문헌(Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176: 1191-1195); 및 문헌(Shopes (1992) J. Immunol. 148: 2918-2922) 참조). 이종이작용성 교차-연결제를 사용하여 향상된 항-종양 활성을 가진 동종이량체성 항체도 제조할 수 있다(예를 들면, 문헌(Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53:2560-2565) 참조). 대안적으로, 이중 Fc 영역을 가진 항체는 조작될 수 있고, 이로써 향상된 보체 용해 및 ADCC 성능을 가질 수 있다(예를 들면, 문헌(Stevenson et al. (1989) 항-Cancer Drug Design 3: 219-230) 참조).
항체 제조
다양한 실시양태들에서, 본원에 기재된 항체는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있거나 재조합적으로 발현될 수 있다.
화학적 합성
본원에서 제공된 서열 정보를 사용하고 잘 공지되어 있는 펩티드 합성 방법을 이용하여 본원에 기재된 CD46 특이적 항체들(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파) 또는 이들의 변이체들을 화학적으로 합성할 수 있다. 서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시킨 후, 서열에서 남은 아미노산들을 순차적으로 추가하는 고체상 합성이 단일 쇄 항체의 한 바람직한 화학적 합성 방법이다. 고체상 합성 기법은 문헌(Barany and Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.), 문헌(Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156) 및 문헌(Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill)에 기재되어 있다.
전립선암 특이적 항체의 재조합 발현
일부 실시양태들에서, 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 본원에 기재된 CD46 특이적 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파) 또는 이의 변이체를 재조합적으로 발현시킨다. 예를 들면, 본원에서 제공된 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 서열 정보를 이용하여 원하는 항체를 코딩하는 핵산을 당업자에게 공지되어 있는 다수의 표준 방법들에 따라 제조할 수 있다. 원하는 항체 또는 이의 쇄를 발현하는 숙주 세포 내로 상기 핵산을 형질감염시킨다.
이 목적들을 달성하기 위한 분자 클로닝 기법은 당분야에서 공지되어 있다. 매우 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법들이 재조합 핵산의 구축에 적합하다. 이 기법들, 및 많은 클로닝 경험을 통해 기술을 가진 사람에게 지시하기에 충분한 설명의 예는 문헌(Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)); 문헌(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook)); 및 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel))에서 발견된다. 재조합 면역글로불린을 제조하는 방법도 당분야에서 공지되어 있다. 미국 특허 제4,816,567호(Cabilly); 및 문헌(Queen et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033)을 참조한다. 추가로, 항체의 발현을 위한 상세한 프로토콜은 문헌(Liu et al. (2004) Cancer Res. 64: 704-710), 문헌(Poul et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 1149-1161) 등에 의해서도 제공된다.
다른 항체 형태의 생성
본원에서 제공된 단일 쇄 항체의 공지된 및/또는 확인된 서열(예를 들면, VH 및/또는 VL 서열)을 사용하여 다른 항체 형태들을 용이하게 생성할 수 있다. 이러한 형태들은 다가 항체, 전체 항체, scFv, (scFv')2, Fab, (Fab')2, 키메라 항체 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
동종이량체의 생성
예를 들면, (scFv')2 항체를 생성하기 위해, 링커(예를 들면, 탄소 링커, 펩티드 등)를 통해 또는, 예를 들면, 2개의 시스테인들 사이의 디설파이드 결합을 통해 2개의 항-CD46 항체들을 연결한다. 따라서, 예를 들면, 디설파이드-연결된 scFv를 생성하기 위해, 시스테인 잔기를 본원에 기재된 항체의 카복시-말단에서 부위-지정된 돌연변이유발로 도입할 수 있다.
scFv를 이 구축물로부터 발현시킬 수 있고 IMAC로 정제할 수 있고 겔 여과로 분석할 수 있다. (scFv')2 이량체를 생성하기 위해, 시스테인을 1 mM 3-머캡토에탄올과 함께 항온처리하여 환원시키고, DTNB를 첨가하여 scFv의 절반을 차단한다. 차단된 scFv와 차단되지 않은 scFv를 함께 항온처리하여 (scFv')2를 형성하고, 생성된 물질을 겔 여과로 분석할 수 있다. 표준 방법, 예를 들면, BIAcore를 이용하여 생성된 이량체의 친화성을 측정할 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 링커, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 scFv' 단편들을 연결함으로써 (scFv')2 이량체를 생성한다. 이것은 당업자에게 잘 공지되어 있는 매우 다양한 수단들에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 한 방법은 문헌(Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448)에 기재되어 있다(PCT 출원 공보 제WO 94/13804호도 참조).
본원에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열을 사용하여 Fab 및 (Fab')2 이량체도 용이하게 제조할 수 있다. Fab는 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄이고, 당업자에게 공지되어 있는 표준 방법을 이용하여 Fab를 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, (scFv')2 이량체에 대해 전술된 바와 같이 Fab를 이량체화함으로써 F(ab)'2를 제조할 수 있다.
키메라 항체
본원에서 고려되는 항체는, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, "키메라" 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편도 포함하고, 이때 상기 키메라 항체에서 중쇄 및/또는 경쇄의 부분은 특정 종으로부터 유래된 항체, 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동한 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 문헌(Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855) 등 참조).
본원에서 제공된 원형 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)는 전체 인간 항체이지만, 특히 이러한 항체가 인간 이외의 종에서 사용되어야 할 때(예를 들면, 수의학적 적용) 키메라 항체가 고려된다. 키메라 항체는 두 상이한 종들로부터의 부분들(예를 들면, 인간 부분 및 비-인간 부분)을 포함하는 항체이다. 전형적으로, 키메라 항체의 항원 조합 영역(또는 가변 영역)은 한 종 공급원으로부터 유래되고, (면역글로불린에 생물학적 이펙터 기능을 부여하는) 키메라 항체의 불변 영역은 또 다른 공급원으로부터 유래된다. 키메라 항체를 생성하는 다수의 방법들이 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,502,167호, 제5,500,362호, 제5,491,088호, 제5,482,856호, 제5,472,693호, 제5,354,847호, 제5,292,867호, 제5,231,026호, 제5,204,244호, 제5,202,238호, 제5,169,939호, 제5,081,235호, 제5,075,431호 및 제4,975,369호; 및 PCT 출원 공보 제WO 91/0996호 참조).
일반적으로, 키메라 항체를 제조하는 데 이용되는 절차는 하기 단계들로 구성된다(일부 단계들의 순서는 교환될 수 있다): (a) 항체 분자의 항원 결합 부분을 코딩하는 정확한 유전자 분절을 확인하고 클로닝하는 단계[중쇄의 경우 VDJ(가변, 다양성 및 연결) 영역으로서, 경쇄의 경우 VJ(가변 및 연결) 영역으로서, 또는 단순히 V 또는 가변 영역, 또는 VH 및 VL 영역으로서 공지되어 있는) 이 유전자 분절은 cDNA 또는 게놈 형태로 존재할 수 있음]; (b) 인간 불변 영역 또는 이의 원하는 부분을 코딩하는 유전자 분절을 클로닝하는 단계; (c) 완전한 키메라 항체가 전사가능하고 번역가능한 형태로 코딩되도록 가변 영역을 불변 영역에 라이게이션시키는 단계; (d) 이 구축물을, 선택 마커 및 유전자 조절 영역, 예컨대, 프로모터, 인핸서 및 폴리(A) 추가 신호를 함유하는 벡터 내로 라이게이션시키는 단계; (e) 이 구축물을 숙주 세포(예를 들면, 세균)에서 증폭시키는 단계; (f) DNA를 진핵 세포, 가장 흔하게는 포유동물 림프구 내로 도입하는 단계(형질감염); 및 (g) 키메라 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계.
여러 상이한 항원 결합 특이성들을 가진 항체들을 이 프로토콜로 조작하여 키메라 단백질[예를 들면, 항-TNP: 문헌(Boulianne et al. (1984) Nature, 312: 643) 및 항-종양 항원(예를 들면, 문헌(Sahagan et al. (1986) J. Immunol., 137: 1066) 참조)]을 제조하였다. 마찬가지로, 신규 서열을, 항원 결합 영역을 코딩하는 서열에 연결함으로써 여러 상이한 이펙터 기능들을 달성하였다. 이들의 일부는 효소(Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604), 또 다른 종으로부터의 면역글로불린 불변 영역 및 또 다른 면역글로불린 쇄의 불변 영역(Sharon et al. (1984) Nature 309: 364; Tan et al., (1985) J. Immunol. 135: 3565-3567)을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 재조합 DNA 벡터는 항-CD46(예를 들면, 전립선암 특이적) 항체를 생성하는 세포주를 형질감염시키는 데 사용된다. 신규 재조합 DNA 벡터는 세포주에서 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 대체하기 위한 "대체 유전자"(예를 들면, 대체 유전자는 인간 면역글로불린의 불변 영역, 특정 면역글로불린 클래스, 또는 효소, 독소, 생물학적 활성 펩티드, 성장 인자, 억제제, 또는 약물, 독소 또는 다른 분자에의 접합을 용이하게 하기 위한 링커 펩티드 등의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있음), 및 항체 생성 세포 내에서 면역글로불린 서열과의 표적화된 상동성 재조합을 허용하는 "표적 서열"을 함유한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 DNA 벡터는 원하는 이펙터 기능을 가진 항체(예를 들면, 인간 면역글로불린의 불변 영역)를 생성하는 세포주를 형질감염시키는 데 사용되고, 이 경우 재조합 벡터에 함유된 대체 유전자는 본 발명의 전립선암 특이적 항체의 한 영역의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있고, 재조합 벡터에 함유된 표적 서열은 항체 생성 세포 내에서 상동성 재조합 및 표적화된 유전자 변경을 허용한다. 어느 한 실시양태에서, 가변 또는 불변 영역의 일부만이 대체될 때, 생성된 키메라 항체는 동일한 항원을 정의할 수 있고/있거나 동일한 이펙터 기능을 가질 수 있으나, 키메라 항체가 보다 더 큰 항원 특이성, 보다 더 큰 친화성 결합 상수, 증가된 이펙터 기능, 또는 형질감염된 항체 생성 세포주에 의한 증가된 분비 및 생성 등을 나타낼 수 있도록 변경될 수 있거나 개선될 수 있다.
실시된 실시양태와 관계없이, (선택 마커를 통해) 삽입된 DNA를 선택하고 키메라 항체 생성에 대해 스크리닝하고 세포 클로닝하는 과정을 이용하여 키메라 항체를 생성하는 세포의 클론을 수득할 수 있다.
따라서, 단일클론 항체에 대한 변경을 코딩하는 DNA 조각을, B 세포 또는 하이브리도마 세포주 내부의 발현되는 면역글로불린 유전자 부위에 직접적으로 표적화할 수 있다. 임의의 특정 변경을 위한 DNA 구축물을 제조하여 임의의 단일클론 세포주 또는 하이브리도마의 단백질 생성물을 변경시킬 수 있다. 유전자가 무작위적 위치보다 오히려 그의 천연 염색체 위치에 있을 때, 키메라 항체의 발현 수준은 더 높을 것이다. 키메라 (인간화된) 항체의 제조를 위한 상세한 방법은 미국 특허 제5,482,856호에서 발견될 수 있다.
온전한 인간 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 온전한 전체 인간 항-CD46(예를 들면, 전립선암 특이적) 항체를 제공한다. 이러한 항체는 키메라 인간 항체의 제조와 유사한 방식으로 용이하게 제조될 수 있다. 이 경우, 예를 들면, 뮤린으로부터 유래된 인식 기능을 이용하는 대신에, 본원에 기재된 항체의 전체 인간 인식 기능(예를 들면, VH 및 VL)이 이용된다.
디아바디
일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 VH 및 VL 도메인들 중 하나 이상의 도메인을 포함하는 디아바디가 고려된다. 용어 "디아바디"는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위들을 가진 항체 단편을 지칭한다. 상기 단편은 전형적으로 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 상기 2개의 도메인들 사이에 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인들과 강제로 쌍을 형성하고 2개의 항원 결합 부위들을 생성한다. 디아바디는 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호, PCT 출원 공보 제WO 93/11161호 및 문헌(Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)에 더 완전하게 기재되어 있다.
유니바디
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 서열 정보를 사용하여 항-CD46 항체를 유니바디로서 구축할 수 있다. 유니바디는 일부 작은 항체 포맷들보다 더 긴 예상된 치료 윈도우(therapeutic window)를 가진 보다 더 작은 안정한 항체 포맷을 생성하는 항체 기술이다. 일부 실시양태들에서, 항체의 힌지 영역을 제거함으로써 IgG4 항체로부터 유니바디를 생성한다. 전체 크기 IgG4 항체와 달리, 절반 분자 단편은 매우 안정하고 유니바디로서 지칭된다. IgG4 분자의 이등분은 표적에 결합할 수 있는 유니바디 상의 한 영역만을 남긴다. 유니바디를 제조하는 방법은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 PCT 출원 공보 제WO2007/059782호에 상세히 기재되어 있다(문헌(Kolfschoten et al. (2007) Science 317: 1554-1557) 또한 참조).
아피바디
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 서열 정보를 사용하여 CD46에 결합하는 아피바디 분자를 구축한다. 아피바디 분자는 스타필로코커스 단백질 A의 IgG 결합 도메인들 중 하나로부터 유래된, 58-아미노산 잔기 단백질 도메인을 기반으로 한 친화성 단백질들의 클래스이다. 이 3개 나선 다발 도메인은 조합적 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스카폴드로서 사용되고 있고, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 상기 라이브러리로부터 원하는 분자를 표적화하는 아피바디 변이체를 선택할 수 있다(예를 들면, 문헌(Nord et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-777); 및 문헌(Ronmark et al. (2002) Eur. J. Biochem., 269: 2647-2655) 참조). 아피바디 및 제조 방법의 세부사항은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,831,012호 참조).
당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 전술된 항체들을 전체 온전한 항체(예를 들면, IgG), 항체 단편 또는 단일 쇄 항체로서 제공할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 추가로, 항체는 본질적으로 임의의 포유동물 종으로부터 유래될 수 있지만, 면역원성을 감소시키기 위해, 항체 및/또는 면역접합체가 사용될 종으로부터 유래된 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 인간에 사용하는 경우, 인간, 인간화된 또는 키메라 인간 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
항체/폴리펩티드 결합 친화성의 측정
상기 설명된 바와 같이, 증가된 친화력(avidity)에 대한 선택은 표적 항원(예를 들면, CD46, 본질적으로 YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파 중 하나 이상의 항체에 의해 결합되는 에피토프)에 대한 항체의 친화성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 측정을 수행하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 요약하건대, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명을 기반으로 한 바이오센서인 BIAcore에서, 예를 들면, 표적 세포에의 결합의 반응속도로부터 항체의 Kd를 측정한다. 이 기법의 경우, 항원 또는 세포는 질량의 변화를 검출할 수 있는 유도체화된 센서 칩에 커플링된다. 항체가 상기 센서 칩 상에서 통과될 때, 항체는 항원에 결합하여, 정량가능한 질량의 증가를 야기한다. 항체 농도의 함수로서의 결합 속도의 측정이 결합 속도 상수(kon)를 계산하는 데 이용될 수 있다. 결합 단계 후, 완충제가 상기 칩 상에서 통과되고 항체의 해리 속도(koff)가 측정된다. Kon은 전형적으로 1.0 x 102 내지 5.0 x 106의 범위 내에서 측정되고, koff는 1.0 x 10-1 내지 1.0 x 10-6의 범위 내에서 측정된다. 평형 상수 Kd는 종종 koff/kon으로서 계산되므로, 전형적으로 10-5 내지 10-12의 범위 내에서 측정된다. 이 방식으로 측정된 친화성은 형광 소광 적정에 의해 용액에서 측정된 친화성과 높은 상관관계를 가진다.
YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY , 3G7NY , 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파, 또는 다른 항-CD46 항체를 포함하는 면역접합체
본원에 기재된 원형 항-CD46 항체들(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)은 전립선 암세포 및 다른 CD46 양성 암세포에 특이적으로 결합하고 이들 암세포들에 의해 내재화된다. 상기 항체들은 (예를 들면, 전립선 암세포의 생장 및/또는 증식을 억제하기 위해) 치료제로서 단독으로 사용될 수 있거나, CD46을 발현하는 다양한 암세포들(예를 들면, 단리된 세포, 전이성 세포, 고형 종양 세포 등)에게 이펙터(예를 들면, 세포독소, 표지, 방사성핵종, 리간드, 항체, 약물, 리포좀, 나노입자, 바이러스 입자, 사이토카인 등)를 효율적 및 특이적으로 전달하는 면역접합체를 형성하는 이펙터에 커플링될 수 있다.
항-CD46 면역접합체는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 이펙터(예를 들면, 검출가능한 표지, 또 다른 치료제 등)에 접합시킴으로써 형성될 수 있다. 적합한 물질은 예를 들면, 세포독성제 또는 세포증식억제제(예를 들면, 화학요법제), 독소(예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편), 및/또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 이펙터는 검출가능한 표지를 포함한다. 적합한 검출가능한 표지는 방사선-불투과성 표지, 나노입자, PET 표지, MRI 표지, 방사성 표지 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 다양한 실시양태들에서 유용한 방사성핵종들 중에서 감마-방사체, 양전자-방사체, x-선 방사체 및 형광-방사체가 국소화, 진단 및/또는 병기구분, 및/또는 치료에 적합하지만, 베타 및 알파-방사체, 및 전자 및 중성자-포획제, 예컨대, 붕소 및 우라늄도 치료를 위해 사용될 수 있다.
검출가능한 표지는 외부 검출제 및/또는 내부 검출제와 함께 사용될 수 있고 전립선 암세포의 위치를 효과적으로 확인하고/하거나 이러한 전립선 암세포를 가시화하는 수단을 제공한다. 이러한 검출/가시화는 수술 전 환경 및 수술 도중 환경을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 상황들에서 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태들에서, 본 발명은 포유동물의 체내에서 수술 도중에 전립선암을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전형적으로 검출가능한 표지로 표지된 전립선암 특이적 항체(예를 들면, 방사성동위원소, 예를 들면, 161Tb, 123I, 125I 등으로 표지된 본 발명의 항체)를 검출제(예를 들면, 감마 검출 프로브)에 의한 검출에 충분한 양으로 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계, 및 활성 물질이 표적 조직에 의해 흡수되게 한 후, 바람직하게는 표지의 혈액 제거 후, 예를 들면, 감마 검출 프로브를 사용하여 포유동물을 신체의 관련 부위에서 방사면역검출 기법에 노출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 표지-결합된 항체는 무선유도 수술 기법에서 사용될 수 있고, 이때 대상체의 신체 내부의 관련 조직은 검출제, 예를 들면, 감마 검출 프로브에 의해 수술 도중에 검출될 수 있고 위치가 확인될 수 있다. 의사는 수술 도중에 이 프로브를 사용하여, 방사성동위원소로 표지된 화합물, 즉 예를 들면, 저에너지 감마 광자 방사체의 흡수가 일어난 조직을 찾을 수 있다. 일부 실시양태들에서, 이러한 방법은 일차 종양으로부터 전이성 세포에 의해 생성된 이차 암의 위치를 확인하고 이차 암을 제거하는 데 특히 유용하다.
검출가능한 표지 이외에, 일부 바람직한 이펙터들은 세포독소(예를 들면, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린, 디프테리아 독소 등), 또는 세포독성 약물 또는 프로드러그를 포함하나, 이들로 한정되지 않고, 이 경우 키메라 분자는 세포독소를 전립선 암세포에 특이적으로 표적화하는 강력한 세포 사멸제로서 작용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 이펙터는 약물(예를 들면, 항암 약물, 예컨대, 아브락산, 독소루비신, 파미드로네이트 이나트륨, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 사이클로포스파미드, 에피루비신, 토레미펜, 레트로졸, 트라스투주맙, 메게스트롤타목시펜, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카페시타빈, 고세렐린 아세테이트, 졸레드론산, 빈블라스틴 등), 면역 시스템의 성분들에 의한 결합된 세포의 인식을 자극하는 항원, 면역 시스템 성분들에 특이적으로 결합하여 이 성분들이 전립선암으로 향하게 하는 항체 등을 캡슐화하는 리포좀을 포함할 수 있다.
예시적인 이펙터
영상화 조성물
일부 실시양태들에서, 항-CD46 면역접합체는 검출가능한 표지가 종양 부위로 향하게 하는 데 사용될 수 있다. 이것은 종양 검출 및/또는 위치확인을 용이하게 할 수 있다. 이것은 일차 종양을 검출하는 데 효과적일 수 있거나, 일부 실시양태들에서, 예를 들면, 전립선 전이성 세포에 의해 생성된 이차 종양을 검출하는 데 효과적일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 면역접합체의 이펙터 성분은 "방사선-불투과성" 표지, 예를 들면, x-선의 이용을 통해 용이하게 가시화될 수 있는 표지를 포함한다. 방사선-불투과성 물질은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 가장 흔한 방사선-불투과성 물질은 요오다이드, 브로마이드 또는 바륨 염을 포함한다. 다른 방사선-불투과성 물질도 공지되어 있고, 유기 비스무쓰 유도체(예를 들면, 미국 특허 제5,939,045호 참조), 방사선-불투과성 폴리우레탄(예를 들면, 미국 특허 제5,346,981호 참조), 오가노비스무쓰 합성물(예를 들면, 미국 특허 제5,256,334호 참조), 방사선-불투과성 바륨 중합체 착물(예를 들면, 미국 특허 제4,866,132호 참조) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 항-CD46 항체는 방사선-불투과성 모이어티에 직접적으로 커플링될 수 있거나, 예를 들면, 이하에 기재된 바와 같은 방사선-불투과성 물질을 보유하거나, 함유하거나 포함하는 "팩키지"(예를 들면, 킬레이트, 리포좀, 중합체 마이크로비드, 나노입자 등)에 부착될 수 있다.
방사선-불투과성 표지 이외에, 다른 표지도 사용되기에 적합하다. 면역접합체에서 사용되기에 적합한 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 조성물을 포함한다. 유용한 표지는 자기 비드(예를 들면, DYNABEADS™), 형광 염료(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들면, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들면, 호스 라디쉬 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 효소), 및 비색 표지, 예컨대, 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드, 나노입자, 양자점 등을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 적합한 방사성 표지는 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 641Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh 및 111Ag를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
이러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 예를 들면, 일부 방사성 표지들은 사진 필름, 신틸레이션(scintillation) 검출제, PET 영상화, MRI 등을 이용함으로써 검출될 수 있다. 형광 마커는 광검출제를 이용하여 방사된 조명을 검출함으로써 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 기질과 함께 효소를 제공하고 상기 기질에 대한 상기 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되고, 비색 표지는 착색된 표지를 단순히 가시화함으로써 검출된다.
방사선증감제
또 다른 실시양태에서, 이펙터는 세포에 대한 이온화 방사선(예를 들면, 60Co 또는 x-선 공급원에 의해 생성될 것임)의 세포독성 효과를 증강시키는 방사선증감제를 포함할 수 있다. 다수의 방사선증감제들이 공지되어 있고, 벤조포피린 유도체 화합물(예를 들면, 미국 특허 제5,945,439호 참조), 1,2,4-벤조트리아진 옥사이드(예를 들면, 미국 특허 제5,849,738호 참조), 일부 디아민들을 함유하는 화합물들(예를 들면, 미국 특허 제5,700,825호 참조), BCNT(예를 들면, 미국 특허 제5,872,107호 참조), 방사선증감 니트로벤조산 아미드 유도체(예를 들면, 미국 특허 제4,474,814호 참조), 다양한 헤테로환형 유도체들(예를 들면, 미국 특허 제5,064,849호 참조), 백금 착물(예를 들면, 미국 특허 제4,921,963호 참조) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
알파-방사체
일부 실시양태들에서, 이펙터는 알파-방사체, 즉 알파 입자를 방사하는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 알파-방사체는 최근에 암의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 문헌(McDevitt et al. (2001) Science 294:1537-1540); 문헌(Ballangrud et al. (2001) Cancer Res. 61: 2008-2014); 및 문헌(Borchardt et al. (2003) Cancer Res. 63: 5084-50) 참조). 적합한 알파-방사체는 Bi, 213Bi, 211At 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
킬레이트
본원에 기재된 대다수의 약제들 및/또는 방사성 표지들은 킬레이트로서 제공될 수 있다. 킬레이팅 분자는 전형적으로 본원에 기재된 항-CD46 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)에 부착된 에피토프 태그에 특이적으로 결합하는 분자(예를 들면, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 등)에 커플링된다.
킬레이팅 기는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태들에서, 킬레이팅 기는 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 사이클로헥실 1,2-디아민 테트라아세트산(CDTA), 에틸렌글리콜-O,O'-비스(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), N,N-비스(하이드록시벤질)-에틸렌디아민-N,N'-디아세트산(HBED), 트리에틸렌 테트라민 헥사아세트산(TTHA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 하이드록시에틸디아민 트리아세트산(HEDTA), 1,4,8,11-테트라-아자사이클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(TETA), 치환된 DTPA, 치환된 EDTA 등으로부터 유래된다.
일부 바람직한 킬레이터들의 예로는 비치환된 또는 치환된 2-이미노티올란 및 2-이미노티아사이클로헥산, 특히 2-이미노-4-머캡토메틸티올란이 있다.
한 킬레이팅제인 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N,N",N"'-테트라아세트산(DOTA)이 다수의 진단적 및 치료적으로 중요한 금속들, 예컨대, 방사성핵종들 및 방사성 표지들을 킬레이팅하는 그의 능력 때문에 특히 흥미롭다.
DOTA 및 단백질, 예컨대, 항체의 접합체가 기재되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,428,156호는 DOTA를 항체 및 항체 단편에 접합시키는 방법을 교시한다. 이 접합체를 제조하기 위해, DOTA의 한 카복실산 기를, 항체 또는 항체 단편 상의 아민 또는 설프하이드릴 기와 반응할 수 있는 활성 에스테르로 전환시킨다. 문헌(Lewis et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 565-576)은 DOTA의 한 카복실 기를 활성 에스테르로 전환시키고 활성화된 DOTA를 항체와 혼합하고 항체의 라이신 잔기의 엡실론-아미노 기를 통해 항체를 DOTA에 연결함으로써 DOTA의 한 카복실 기를 아미드 모이어티로 전환시키는 유사한 방법을 기술한다.
일부 실시양태들에서, 킬레이팅제는 에피토프 태그, 또는 에피토프 태그에 결합하는 모이어티에 직접적으로 또는 링커를 통해 커플링될 수 있다. DOTA와 바이오틴의 접합체는 기재되어 있다(예를 들면, 입수가능한 아미노산 측쇄 바이오틴 유도체, 예컨대, DOTA-LC-바이오틴 또는 DOTA-벤질-4-(6-아미노-카프로아미드)-바이오틴을 통한 DOTA와 바이오틴의 연결을 개시하는 문헌(Su (1995) J. Nucl. Med., 36 (5 Suppl):154P) 참조). PCT 출원 공보 제WO 95/15335호(Yau et al.)는 바이오틴에 접합될 수 있는 니트로-벤질-DOTA 화합물을 제조하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 하이드록시 기의 일시적 보호를 통한 고리화 반응; 아민의 토실화; 일시적으로 보호된 하이드록시 기의 탈보호; 탈보호된 하이드록시 기의 토실화; 및 분자내 토실레이트 고리화를 포함한다. 문헌(Wu et al. (1992) Nucl. Med. Biol., 19(2): 239-244)은 단백질을 방사성 표지 111IN 및 90Y에 부착하기 위한 거대환형 킬레이팅제의 합성을 개시한다. 상기 문헌의 저자들(Wu et al.)은 연구용 모델 단백질인 아비딘으로 접합체의 안정성 및 생체분포를 연구하기 위해 표지된 DOTA-바이오틴 접합체를 제조한다. 이 접합체는 제자리에서 생성된 활성화된 DOTA 유도체와 반응하기 위해 유리 아미노 기를 함유하는 바이오틴 하이드라지드를 사용함으로써 제조되었다.
세포독소/세포증식억제제
본원에 기재된 항-CD46 항체들(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파)은 치료 약물, 방사선을 방사하는 화합물, 식물, 진균 또는 세균 유래의 세포독성 분자, 생물학적 단백질 및 이들의 혼합물을 비롯한 다양한 세포독성 및/또는 세포증식억제성 약물들을 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포독성 약물은 예를 들면, 유기 소분자, 세포독성 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 전술된 단거리 고에너지 α-방사체를 비롯한 방사선 방사체 등인 세포내 작용 세포독성 약물을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태들에서, 항-CD46 항체는 세포독성/세포증식억제성 약물에 부착된다. 다양한 실시양태들에서, ADC를 구축하는 데 사용되는 상기 약물은 미세소관 억제제 및 DNA 손상제, 중합효소 억제제(예를 들면, 중합효소 II 억제제, α-아마니틴(amanitin)) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 항체는 직접적으로 또는 링커를 통해 약물에 접합되는 반면; 다른 실시양태에서, 항체는 약물 담체(예를 들면, 약물을 함유하는 리포좀, 중합체성 약물 담체, 나노입자 약물 담체, 지질 약물 담체, 덴드리머성 약물 담체 등)에 접합된다.
일부 실시양태들에서, 약물은 아우리스타틴, 돌라스타틴-10, 천연 생성물 돌라스타틴-10의 합성 유도체, 및 메이탄신 또는 메이탄신 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 튜불린 억제제를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 약물은 아우리스타틴을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 아우리스타틴은 아우리스타틴 E(AE), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), vcMMAE 및 vcMMAF로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 약물은 메이탄신을 포함한다. 예시적인 메이탄신은 메르탄신(DM1); 및 메이탄신의 유사체, 예컨대, DM3 또는 DM4를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, 약물은 DNA 상호작용제를 포함한다. 일부 실시양태들에서, DNA 상호작용제는 칼리케아미신, 듀오카마이신, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
한 예시적 및 비-한정적인 실시양태에서, 약물은 칼리케아미신을 포함한다. 칼리케아미신은 DNA를 표적화하고 가닥 절단을 야기한다. 일부 실시양태들에서, 약물은 칼리케아미신 또는 칼리케아미신 유사체를 포함한다. 칼리케아미신 유사체는 본원에 기재된 칼리케아미신 유사체에 대해 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,264,586호에 기재되어 있다.
또 다른 예시적 및 비-한정적인 실시양태에서, 약물은 듀오카마이신을 포함한다. 듀오카마이신은 세포 주기의 임의의 단계에서 그의 작용 모드를 발휘할 수 있는 DNA 손상제이다. 듀오카마이신의 이 클래스의 일부인 물질들은 전형적으로 낮은 피코몰 범위에서 효능을 가진다. 본원에서 고려되는 키메라 구축물에서 이펙터로서 사용될 수 있는 예시적인 듀오카마이신(예를 들면, 듀오카마이신 유사체)은 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 B1, 듀오카마이신 B2, 듀오카마이신 C1, 듀오카마이신 C2, 듀오카마이신 D, 듀오카마이신 SA, 사이클로프로필벤조인돌 듀오카마이신(CC-1065), 센타나마이신, 라켈마이신, 아도젤레신, 비젤레신, 카젤레신 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 예시적 및 비-한정적인 실시양태에서, 약물은 피롤로벤조디아제핀을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 약물은 유연한 폴리메틸렌 연결제(tether)에 의해 연결된 2개의 피롤로벤조디아제핀들의 합성 유도체를 포함한다. 피롤로벤조디아제핀들(PBD들) 및 PBD 이량체들은 본원에 기재된 피롤로벤조디아제핀 및 PBD 이량체에 대해 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제7,528,126호(B2)에 기재되어 있다. 일부 실시양태들에서, 피롤로벤조디아제핀은 안쓰라마이신(및 이의 이량체), 마제쓰라마이신(및 이의 이량체), 토메이마이신(및 이의 이량체), 프로쓰라카신(및 이의 이량체), 치카마이신(및 이의 이량체), 네오쓰라마이신 A(및 이의 이량체), 네오쓰라마이신 B(및 이의 이량체), DC-81(및 이의 이량체), 시비로마이신(및 이의 이량체), 포로쓰라마이신 A(및 이의 이량체), 포로쓰라마이신 B(및 이의 이량체), 시바노마이신(및 이의 이량체), 아베이마이신(및 이의 이량체), SG2000 및 SG2285로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 약물은 중합효소 II 억제제, 예컨대,α-아마니틴 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 중합효소 억제제를 포함한다. 예시적인 PARP 억제제는 이니파립(BSI 201), 탈라조파립(BMN-673), 올라파립(AZD-2281), 올라파립, 루카파립(AG014699, PF-01367338), 벨리파립(ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB-290, 3-아미노벤즈아미드 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, 세포독성제/세포증식억제제는 단백질 또는 펩티드 독소, 또는 이들의 단편을 포함한다. 예를 들면, 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 독소 A 단편, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신(modeccin) A 쇄, α-사크린(sacrin), 일부 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질들, 일부 디안틴(Dianthin) 단백질들, 파이토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질(PAP, PAPII 및 PAP-S), 모로디카 카란티아(Morodica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토길린(mitogillin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)으로 예시된다. 다양한 방사성핵종들이 방사성접합된 항체의 제조에 사용될 수 있다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, 세포독소는 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 리신, 아브린 및 이들의 유도체를 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 슈도모나스 외독소 A(PE)는 그의 ADP-리보실화를 촉진함으로써(산화된 NAD의 ADP 리보실 모이어티를 EF-2 상으로 전달하는 것을 촉진함으로써) 연장 인자 2(EF-2)의 불활성화를 통해 진핵 세포에서 단백질 합성을 억제하는, 슈도모나스 애루기노사에 의해 분비되는 고도 활성 단량체 단백질(분자량 66 kD)이다.
독소는 협력하여 작용함으로써 세포독성을 야기하는 3개의 구조 도메인들을 함유한다. 도메인 Ia(아미노산 1-252)는 세포 결합을 매개한다. 도메인 II(아미노산 253-364)는 세포질 내로의 전위를 담당하고, 도메인 III(아미노산 400-613)은 단백질을 불활성화시키고 세포 사멸을 야기하는, 연장 인자 2의 ADP 리보실화를 매개한다. 도메인 Ib(아미노산 365-399)의 기능은 정의되지 않은 상태로 남아있지만, 그의 대부분, 즉 아미노산 365-380은 세포독성의 상실 없이 결실될 수 있다. 문헌(Siegall et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14256-14261)을 참조한다.
일부 실시양태들에서, 항체는 도메인 Ia(아미노산 1부터 252까지)가 결실되어 있고 365부터 380까지의 아미노산들이 도메인 Ib로부터 결실되어 있는 바람직한 분자에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 특히 결실된 서열이 연결 펩티드로 대체되는 경우, 도메인 Ib의 전부 및 도메인 II의 일부(아미노산 350부터 394까지)가 결실될 수 있다.
추가로, 부위-지정된 돌연변이유발 또는 당분야에서 공지되어 있는 다른 기법을 이용하여 PE 및 다른 세포독성 단백질을 더 변경시켜, 특정 원하는 적용을 위해 분자를 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 PE 분자에 의해 제공된 기능적 장점에 실질적으로 영향을 미치지 않는 방식으로 PE 분자를 변경시키는 수단도 이용될 수 있고, 이로써 생성된 분자는 본원에 의해 커버된다.
다양한 리간드들에 융합된 PE를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Siegall et al. (1989) FASEB J., 3: 2647-2652); 및 문헌(Chaudhary et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4538-4542) 참조).
PE처럼, 디프테리아 독소(DT)는 연장 인자 2를 ADP-리보실화하여 단백질 합성을 억제함으로써 세포를 사멸시킨다. 그러나, 디프테리아 독소는 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 쇄 A 및 B로 나누어진다. PE와 대조적으로, 카복실 말단 상에 존재하는 DT의 쇄 B는 수용체 결합을 담당하고, 아미노 말단 상에 존재하는 쇄 A는 효소 활성을 함유한다(Uchida et al.(1972) Science, 175: 901-903; Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem., 248: 3838-3844).
일부 실시양태들에서, 본 발명의 항체-디프테리아 독소 면역접합체는 디프테리아 독소 B 쇄의 절두에 의해 제거되는 천연 수용체 결합 도메인을 가진다. 한 예시적인 변경된 디프테리아 독소는 잔기 389에서 시작되는 카복실 말단 서열이 제거되어 있는 DT인 DT388이다(예를 들면, 문헌(Chaudhary et al. (1991) Bioch. Biophys. Res. Comm., 180: 545-551) 참조). PE 키메라 세포독소처럼, DT 분자는 전립선암 특이적 항체에 화학적으로 접합될 수 있으나, 일부 바람직한 실시양태들에서, 상기 항체는 재조합 수단에 의해 디프테리아 독소에 융합될 것이다(예를 들면, 문헌(Williams et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11885-11889) 참조).
바이러스 입자
일부 실시양태들에서, 이펙터는 바이러스 입자(예를 들면, 사상 파지, 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 등)를 포함한다. 항체는 바이러스 입자에 접합될 수 있고/있거나 바이러스 입자(예를 들면, 사상 파지)의 표면 상에서 발현될 수 있다. 바이러스 입자는 표적(예를 들면, 전립선암) 세포에게 전달될 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 핵산을 세포에게 전달하기 위한 바이러스 입자의 사용은 PCT 출원 공보 제WO 99/55720호, 미국 특허 제6,670,188호, 미국 특허 제6,642,051호 및 미국 특허 제6,669,936호에 상세히 기재되어 있다.
다른 치료 모이어티
다른 적합한 이펙터 분자는 약리학적 물질, 또는 다양한 약리학적 물질들을 함유하는 캡슐화 시스템을 포함한다. 따라서, 다양한 실시양태들에서, 표적화 분자(예를 들면, 표적화 항체)는 종양에 직접적으로 전달될 약물에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착될 수 있다는 것이 인식된다.
이러한 약물은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 항암 항체(예를 들면, HERCEPTIN®), 항대사물질, 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 미세소관 표적화제, 키나제 억제제, 단백질 합성 억제제, 소마토스타틴 유사체, 글루코코르티코이드, 아로마토스 억제제, mTOR 억제제, 단백질 키나제 B(PKB) 억제제, 포스파티딜이노시톨, 3-키나제(PI3K) 억제제, 사이클린 의존적 키나제 억제제, 항-TRAIL 분자, MEK 억제제 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 항암 화합물은 플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈/XELODA, 5-트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘, 메토트렉세이트 나트륨, 랄티트렉세드/토무덱스(Tomudex), 페메트렉세드/알림타(Alimta)®, 사이토신 아라비노사이드(사이타라빈, Ara-C)/티오구아닌, 6-머캡토푸린(머캡토푸린, 6-MP), 아자티오프린/아자산(Azasan), 6-티오구아닌(6-TG)/푸린에톨(Purinethol)(TEVA), 펜토스타틴/니펜트(Nipent), 플루다라빈 포스페이트/플루다라(Fludara)®, 클라드리빈(2-CdA, 2-클로로데옥시아데노신)/류스타틴(Leustatin), 플록수리딘(5-플루오로-2)/FUDR(호스피라 인코포레이티드(Hospira, Inc.)), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제(RNR), 사이클로포스파미드/사이톡산(Cytoxan)(BMS), 네오사르, 이포스파미드/미톡사나(Mitoxana), 티오테파, BCNU -- 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아, 1-(2-클로로에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아, 메틸 CCNU, 헥사메틸멜라민, 부설판/마일러란(Myleran), 프로카바진 HCL/마툴란(Matulane), 다카바진(DTIC), 클로람부실/류카란(Leukaran)®, 멜팔란/알케란(Alkeran), 시스플라틴(시스플라티눔(Cisplatinum), CDDP)/플라티놀(Platinol), 카보플라틴/파라플라틴(Paraplatin), 옥살리플라틴/엘록시탄(Eloxitan), 벤다무스틴, 카무스틴, 클로로메틴, 다카바진(DTIC), 포테무스틴, 로무스틴, 만노설판, 네다플라틴, 니무스틴, 프레드니무스틴, 라니무스틴, 사트라플라틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 테모졸로마이드, 트레오설판, 트리아지쿠온, 트리에틸렌 멜라민, 티오테파, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트로포스파미드, 우라무스틴, 독소루비신 HCL/독실(Doxil), 다우노루비신 시트레이트/다우녹솜(Daunoxome)®, 미톡산트론 HCL/노반트론(Novantrone), 악티노마이신 D, 에토포사이드/베페시드(Vepesid), 토포테칸 HCL/하이캄틴(Hycamtin), 테니포사이드(VM-26), 이리노테칸 HCL(CPT-11)/캄토사르(camptosar)®, 캄프토테신, 벨로테칸(Belotecan), 루비테칸, 빈크리스틴, 빈블라스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트, 빈데신 설페이트, 파클리탁셀/탁솔(Taxol), 도세탁셀/탁소테레(Taxotere), 나노입자 파클리탁셀, 아브락산, 익사베필론, 라로탁셀, 오르타탁셀, 테세탁셀, 빈플루닌 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 항암 약물(들)은 카보플라틴(예를 들면, PARAPLATIN®), 시스플라틴(예를 들면, PLATINOL®, PLATINOL-AQ®), 사이클로포스파미드(예를 들면, CYTOXAN®, NEOSAR®), 도세탁셀(예를 들면, TAXOTERE®), 독소루비신(예를 들면, ADRIAMYCIN®), 에를로티닙(예를 들면, TARCEVA®), 에토포사이드(예를 들면, VEPESID®), 플루오로우라실(예를 들면, 5-FU®), 겜시타빈(예를 들면, GEMZAR®), 이마티닙 메실레이트(예를 들면, GLEEVEC®), 이리노테칸(예를 들면, CAMPTOSAR®), 메토트렉세이트(예를 들면, FOLEX®, MEXATE®, AMETHOPTERIN®), 파클리탁셀(예를 들면, TAXOL®, ABRAXANE®), 소라피닙(예를 들면, NEXAVAR®), 수니티닙(예를 들면, SUTENT®), 토포테칸(예를 들면, HYCAMTIN®), 빈블라스틴(예를 들면, VELBAN®), 및 빈크리스틴(예를 들면, ONCOVIN®, VINCASAR PFS®)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 항암 약물은 레티노산, 레티노산 유도체, 독시루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 캄프토테신 유도체, 인터페론, 타목시펜 및 탁솔로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 항암 화합물은 아브락산, 독소루비신, 파미드로네이트 이나트륨, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 사이클로포스파미드, 에피루비신, 토레미펜, 레트로졸, 트라스투주맙, 메게스트롤타목시펜, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카페시타빈, 고세렐린 아세테이트, 졸레드론산, 빈블라스틴, 안티센스 분자, SiRNA 등으로 구성된 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 이펙터 분자는 치료 조성물, 예컨대, 약물, 핵산(예를 들면, 세포에게 전달될 안티센스 핵산 또는 또 다른 핵산), 또는 바람직하게는 순환계에의 직접적인 노출로부터 차폐되는 또 다른 치료 모이어티를 함유하는 캡슐화 시스템, 예컨대, 바이러스 캡시드, 리포좀 또는 마이셀(micelle)을 포함할 수 있다. 항체에 부착된 리포좀을 제조하는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,957,735호, 문헌(Connor et al. (1985) Pharm. Ther., 28: 341-365) 등 참조).
B) 항체와 이펙터의 부착
당업자는 본원에 기재된 항-CD46 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파) 및 이펙터 분자(들)가 임의의 순서로 함께 연결될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 항체가 단일 쇄 폴리펩티드인 경우, 이펙터 분자는 표적화 분자의 아미노 또는 카복시 말단에 연결될 수 있다. 부착이 분자들의 개별 활성을 방해하지 않는 한, 항체는 이펙터 분자의 내부 영역에 연결될 수도 있거나; 역으로, 이펙터 분자는 항체의 내부 위치에 연결될 수 있다.
항체와 이펙터는 당업자에게 잘 공지되어 있는 다수의 수단들 중 임의의 수단에 의해 부착될 수 있다. 전형적으로, 이펙터는 항체에 직접적으로 또는 링커(스페이서)를 통해 접합된다. 그러나, 일부 실시양태들에서, 이펙터 분자가 폴리펩티드이거나 폴리펩티드를 포함하는 경우, 키메라 분자를 단일 쇄 융합 단백질로서 재조합적으로 발현시키는 것이 바람직하다.
이펙터 분자와 항체의 접합
한 실시양태에서, CD46 특이적 항체는 이펙터 분자(예를 들면, 세포독소, 표지, 리간드, 약물, 리포좀 등)에 화학적으로 접합된다. 분자를 화학적으로 접합시키는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
이펙터를 항체에 부착시키는 절차는 이펙터 및/또는 항체의 화학적 구조에 따라 달라질 것이다. 폴리펩티드는 전형적으로 이펙터 분자 상의 적합한 작용기와 반응하여 이펙터를 그에 결합시키는 데 사용될 수 있는 다양한 작용기들, 예를 들면, 카복실산(COOH) 또는 유리 아민(-NH2) 기를 함유한다.
대안적으로, 항체 및/또는 이펙터는 추가 반응성 작용기를 노출시키거나 부착시키도록 유도체화될 수 있다. 유도체화는 다수의 링커 분자들 중 임의의 링커 분자, 예컨대, 피어스 케미칼 컴파니(Pierce Chemical Company)(일리노이주 록포드 소재)로부터 입수될 수 있는 링커 분자의 부착을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "링커"는 표적화 분자를 이펙터 분자에 연결하는 데 사용되는 분자이다. 링커는 표적화 분자 및 이펙터 분자 둘 다와 공유결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로환형 탄소 링커 또는 펩티드 링커를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 표적화 분자 및 이펙터 분자가 폴리펩티드인 경우, 링커는 그의 측쇄를 통해(예를 들면, 시스테인에의 디설파이드 결합을 통해) 성분 아미노산에 연결될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 링커는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 또는 카복실 기에 연결될 것이다.
다양한 이작용성 단백질 커플링제들, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디석신이미딜 수버레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 면역접합체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 예를 들면, 방사성뉴클레오티드와 항체의 접합을 위한 예시적 및 비-한정적인 킬레이팅제이다(예를 들면, PCT 출원 공보 제WO1994/011026호(PCT/US1993/010953) 참조).
일부 실시양태들에서, 이펙터(예를 들면, 약물, 리포좀 등), 또는 이펙터에 부착된 링커와 항체의 접합은 상기 항체에서 쇄간 디설파이드 결합의 환원으로부터 유도될 수 있는 용매 접근가능한 반응성 아미노산, 예컨대, 라이신 또는 시스테인에서 일어난다. 일부 실시양태들에서, 시스테인 접합은 4개의 쇄간 디설파이드 결합들의 환원 후 일어날 수 있다.
일부 실시양태들에서, 공지된 다수의 링커-약물들이 항체의 정해진 부위에 일관되게 접합되는 부위 특이적 접합을 수행하여 매우 균질한 구축물을 생성할 수 있다. 약물-대-항체 비(DAR)를 정확히 조절할 수 있고 다양한 링커-약물들에 대해 조정하여, 예를 들면, 2-DAR 또는 4-DAR 부위 특이적 ADC를 생성할 수 있다.
다수의 방법들이 부위 특이적 접합을 달성하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 아미노산 시스테인은 많은 단백질들의 구조 및 기능에서 필수적인 역할을 수행하는 반응성 티올 기를 함유한다. 시스테인 잔기를 통한 티올 반응성 프로브와 단백질의 접합은 오랫동안 단백질을 표지에 부착하는 방법이었고, 항체-약물 접합체(ADC)의 생성에도 적용되어 왔다. 일부 예시적 및 비-한정적인 실시양태들에서, 이 과정은 기존 디설파이드 결합(예를 들면, 쇄간 디설파이드 결합)의 부분적 환원을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 디설파이드 결합을 유지하기 위해, 시스테인 잔기를 단백질 내로 조작할 수 있다. 부위 특이적 접합을 위한 도입된 시스테인 잔기 사용의 성공은 시스테인 치환이 단백질 구조 또는 기능을 변경시키지 않는 적절한 부위를 선택하는 능력에 의해 좌우된다. 이를 달성하기 위해, 반응성 시스테인 잔기를 다양한 부위들에서 항체-Fab(트라스투주맙-Fab 4D5) 내로 도입하고 Fab를 파지 상에 디스플레이하고 스크리닝하여 항원 결합을 방해하지 않는 반응성 시스테인을 확인함으로써 반응성 티올의 선택을 위한 파지 엘리자(Phage Elisa)(PHESELECTOR)를 개발하였다(예를 들면, 문헌(Junutula et al. (2008) J. Immunol. Meth. 332: 41-52) 참조).
PHESELECTOR 방법은 특히 통상적인 시스테인 접합에 비해 효율적이고 특이적인 것으로 입증되어 있다. 예를 들면, 항체 단편(예를 들면, Fab) 및 PHESELECTOR 방법을 이용함으로써 발견된, 시스테인을 위한 최적 부위는 전장 항체에도 적용될 수 있다는 것이 입증되어 있고, 데이터는 이들 부위들이 다른 mAb들에의 부위 특이적 접합에도 적합하다는 것을 시사한다(예를 들면, 문헌(Boswell et al. (2011) Bioconjug. Chem. 22: 1994-2004); 문헌(Boswell et al. (2012) Soc. Nuclear Med. 53: 1454-1461); 및 문헌(Shen et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30:184-189) 참조).
또 다른 예시적 및 비-한정적인 부위 특이적 접합 방법은 바이오-오르토고날(bio-orthogonal) 반응성 핸들(handles)을 가진 아미노산, 예컨대, 아미노산 셀레노시스테인 및 비천연 아미노산인 아세틸페닐알라닌(pAcPhe)의 삽입에 초점을 맞춘다. 이들 아미노산들을 사용하고 정지 코돈을 활용하기 위해 두 방법들이 개발되었다. 그러나, 한 방법은 오팔(opal) 정지 코돈인 UGA와 Sec 삽입 서열을 페어링함으로써 셀레노시스테인(Sec)을 도입하고, 다른 한 방법은 tRNA/아미노아실tRNA 합성효소 쌍을 사용하여 앰버(amber) 정지 코돈인 UAG에서 아세틸페닐알라닌을 도입한다. 첫 번째 방법에 의해 사용되는 셀레노시스테인은 아미노산 시스테인과 매우 유사하지만, 황 원자 대신에 셀레늄 원자를 함유한다. 셀레놀레이트 기는 티올레이트 대응물보다 더 높은 반응성을 가진 친핵체(nucleophile)이므로, 셀레노시스테인 선택적으로 활성화되는 조건 하에서 친전자성 화합물과 접합되기 쉽다. 단백질, 예컨대, 글루타티온 퍼록시다제 및 티오리덕타제를 비롯한 대략 25종의 공지된 셀레늄 함유 단백질들이 포유동물에 존재한다(Kryukov et al. (2003) Science, 300: 1439-1443). 정상 조건 하에서, UGA는 전사 종결을 코딩하지만, Sec 함유 단백질의 3' UTR에 위치한 Sec 삽입 서열(SECIS)의 존재 하에서 종결은 mRNA 이차 구조의 형성에 의해 방해받고, Sec는 UGA 코돈에서 삽입된다(Caban and Copeland (2006) Cell Mol. Life Sci. 63: 73-81). Sec 삽입은 유전자의 3' 말단에서 UGA 코돈 및 SECIS의 삽입에 의해 비-Sec 코딩 유전자 내로 조작될 수 있다. 이 기법은 특히 mAb의 Sec 표지부착 및 후속 부위 특이적 접합에 이용되고 있다(예를 들면, 문헌(Hofer et al. (2009) Biochem. 48: 12047-12057) 참조).
또 다른 예시적인 부위 특이적 접합 방법은 비천연 아미노산인 p-아세틸페닐알라닌(pAcPhe)을 사용한다. pAcPhe은 옥심 라이게이션을 통해 알콕시-아민을 함유하는 약물에 선택적으로 접합될 수 있는 케토 기를 함유한다. pAcPhe을 항체 내로 도입하기 위해, 앰버 정지 코돈을 원하는 위치에서 항체 내로 치환한다. 그 다음, 항체 cDNA를 앰버 억제제 tRNA 및 적절히 페어링된 돌연변이체 tRNA 합성효소와 함께 공-발현시킨다. tRNA 합성효소는 pAcPhe을 앰버 tRNA 상에 적재하므로, pAcPhe은 앰버 부위 UAG에서 항체 내로 도입된다(예를 들면, 문헌(Liu et al. (2007) Nat. Meth. 4: 239-244); 문헌(Wang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 56-61); 및 문헌(Axup (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: 16101-16116) 참조).
pAcPhe 이외에, 다른 비천연 아미노산이 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 일치시키는 단계를 포함하는 유사한 과정을 이용하는 부위 특이적 접합에 사용되기 위해 활용된다(예를 들면, 문헌(Young (2002) J. Mol. Biol. 395: 361-374); 및 문헌(Kiick et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 99: 19-24) 참조).
다양한 실시양태들에서, 결합 형성을 촉진하기 위한 효소의 사용은 부위 특이적 접합에 사용되기 위해 활용될 수 있다. 예를 들면, 글리코트랜스퍼라제 플랫폼은 돌연변이체 글리코트랜스퍼라제를 사용하여 화학적 활성 당 모이어티를 항체 상의 글리코실화 부위에 부착시킨다. 그 다음, 선택된 분자는 당 모이어티 상의 화학적 핸들에 접합될 수 있다. 또 다른 예시적 및 비-한정적인 방법에서, 트랜스글루타미나제를 사용하여 링커/약물 상의 아민 기와 항체 상의 조작된 글루타민 잔기 사이에 결합을 형성한다.
글리코트랜스퍼라제는 올리고사카라이드의 합성에 관여된 단백질들의 큰 패밀리이고, 당 잔기를 활성화된 당 뉴클레오티드로부터 당 수용체 또는 당단백질/지질에게 전달하는 것을 담당한다. 여러 글리코트랜스퍼라제들의 구조는 공지되어 있고 당 기증자 특이성이 촉매 포켓 내의 몇몇 아미노산들에 의해 확인된다는 것을 보여준다(Qasba et al. (2005) Trends Biochem. Sci. 30: 53-62). 이 지식을 이용하여, 잔기를 글리코트랜스퍼라제, 예를 들면, B4Gal-T1의 포켓 내에서 돌연변이시켜, 기증자 특이성을 넓히고 화학적 반응성 당 잔기인 2-케토-Gal의 전달을 가능하게 한다(예를 들면, 문헌(Ramakrishnan et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 20833-20839) 참조). 이 기술은 화학적 반응성 당을, 글리코실화 부위를 함유하는 임의의 지질 또는 단백질에게 전달하는 능력을 허용한다. 인간 IgG 항체는 Fc 단편의 보존된 Asn-297에서 N-글리코실화 부위를 함유한다. 이 부위에 부착된 글리칸은 일반적으로 복합체이지만, G0까지 탈갈락토실화될 수 있고, 돌연변이체 글리코트랜스퍼라제는 고효율로 C2-케토-Gal을 G0 상에 전달할 수 있다(예를 들면, 문헌(Boeggeman et al. (2009) Bioconjug. Chem. 20: 1228-1236) 참조). 그 다음, C2-케토 Gal의 활성 화학적 핸들이 오르토고날 반응성 기를 가진 생체분자에 커플링될 수 있다. 이 방법은 항-Her2 항체인 트라스투주맙과 알렉사 플루오르 488 아미노옥시아세트아미드의 부위 특이적 접합을 위해 성공적으로 사용되고 있고 부위 특이적 ADC 생성을 위한 실행가능한 기법이다(Id.).
제2 플랫폼은 트랜스글루타미나제를 사용하여 유리 아민 기와 글루타민 측쇄 사이의 공유결합의 형성을 촉진한다. 스트렙토버티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense)로부터의 트랜스글루타미나제(mTG)는 상업적으로 입수가능하고 단백질 가교연결제로서 광범위하게 사용되고 있다(예를 들면, 문헌(Yokoyama et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 447-454) 참조). mTG는 글리코실화된 항체의 Fc 영역 내의 천연 생성 글루타민 잔기들 중 어떠한 천연 생성 글루타민 잔기도 인식하지 못하지만, 항체 내로 조작될 수 있는 "글루타민 태그"를 인식한다(예를 들면, 문헌(Jeger et al. (2010) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49: 9995-9997) 참조). 예를 들면, 글루타민 태그 LLQG는 표피 성장 인자 수용체를 표적화하는 항체의 불변 도메인 내의 상이한 부위들 내로 조작되었다. 그 다음, mTG를 사용하여 이들 부위들을, 형광단 또는 모노메틸 돌라스타틴 10(MMAD), 및 우수한 생체물리학적 성질 및 높은 접합도를 가진 것으로 발견된 여러 부위들과 접합시켰다. mTG는 항-Her2 항체 및 항-M1S1 항체 상의 글루타민 태그에 접합시킬 수도 있었다. 항-M1S1-vc-MMA 접합체는 강한 시험관내 및 생체내 활성을 나타내었는데, 이것은 이 방법을 이용한 접합이 항체 결합 또는 친화성을 변경시키지 않고 ADC의 부위 특이적 접합에 있어서 이 방법의 유용성을 입증한다는 것을 암시한다(예를 들면, 문헌(Strop et al. (2013) Chem. Biol. 20: 161-167) 참조).
글리코트랜스퍼라제 및 트랜스글루타미나제 이외에, 단백질 표지부착에 사용될 다른 효소들이 탐구되었다(Sunbul and Yin (2009) Org. Biomol. Chem. 7: 3361-3371). 이러한 효소들 중 하나인 포르밀글리신 생성 효소는 서열 CxPxR을 인식하고 시스테인 잔기를 산화시켜 포르밀글리신을 형성함으로써, 알데하이드 태그를 가진 단백질을 생성한다. 그 다음, 알데하이드 기는 선택된 분자에, 예를 들면, 하이드로지노-픽테트-스펜글러(hydrozino-Pictet-Spengler) 화학반응을 통해 접합될 수 있다.
방사성핵종 금속 킬레이트, 독소 및 약물을 포함하는 다양한 화합물들을 단백질, 예컨대, 항체에 부착시키는 많은 다른 절차들 및 링커 분자들이 공지되어 있다(예를 들면, 유럽 특허출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호, 제4,680,338호, 제4,569,789호 및 제4,589,071호; 및 문헌(Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075) 참조). 구체적으로, 다양한 면역독소들의 제조는 당분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌("Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657); 및 미국 특허 제4,545,985호 및 제4,894,443호에서 발견될 수 있다.
일부 환경들에서, 면역접합체가 그의 표적 부위에 도달되었을 때 항체로부터 이펙터를 유리시키는 것이 바람직하다. 따라서, 이펙터가 표적 부위에서 방출되어야 할 때 표적 부위의 근처에서 절단가능한 연결을 포함하는 면역접합체가 사용될 수 있다. 항체로부터 물질을 방출하기 위한 연결의 절단은 면역접합체가 표적 세포 내부에서 또는 표적 부위의 근처에서 노출되는 효소 활성 또는 조건에 의해 촉진될 수 있다. 표적 부위가 종양일 때, (예를 들면, 종양 관련 효소 또는 산성 pH에 노출될 때) 종양 부위에 존재하는 조건 하에서 절단될 수 있는 링커가 사용될 수 있다.
다수의 상이한 절단가능한 링커들이 당업자에게 공지되어 있다. 미국 특허 제4,618,492호, 제4,542,225호 및 제4,625,014호를 참조한다. 예시적인 절단가능한 링커는 산-불안정성 링커, 프로테아제 절단가능한 링커, 디설파이드 링커 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 산-불안정성 링커는 혈액에서 접하는 pH 수준에서 안정하도록 디자인되지만, 라이소좀 내의 낮은 pH 환경과 접할 때 불안정해지고 분해된다. 프로테아제 절단가능한 링커도 혈액/혈장에서 안정하되, 라이소좀 효소에 의한 절단 시 암세포 내의 라이소좀 내부에서 유리 약물을 신속히 방출하도록 디자인된다. 이들은 라이소좀 내부의 고수준의 프로테아제 활성을 이용하고, 전형적으로 예를 들면, 카텝신에 의해 신속히 가수분해되는 디펩티드 Val-Cit 연결과 마찬가지로 이들 프로테아제들에 의해 인식되고 절단되는 펩티드 서열을 포함한다. 디설파이드 링커는 고수준의 세포내 환원된 글루타티온을 활용하여 세포 내부의 유리 약물을 방출한다.
다양한 방사선진단 화합물들, 방사선요법 화합물들, 약물들, 독소들 및 다른 물질들을 항체에 부착시키는 것으로 보고된 다수의 방법들을 고려해 볼 때, 당업자는 소정의 물질을 항체 또는 다른 폴리펩티드에 부착시키기에 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다.
킬레이트의 접합
일부 실시양태들에서, 이펙터는 항체 또는 에피토프 태그에 부착되어 있는 킬레이트를 포함한다. 항-CD46 항체는 항체와 킬레이트의 단순 접촉이 항체와 이펙터의 부착을 야기하도록 상응하는 에피토프 태그 또는 항체를 보유한다. 모이어티가 사용되기 전에 조합 단계를 수행할 수 있거나(표적화 전략), 킬레이트가 전달되기 전에 표적 조직을 항체에 결합시킬 수 있다. 다양한 표적화 모이어티들에 커플링시키기에 적합한 킬레이트를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,190,923호, 제6,187,285호, 제6,183,721호, 제6,177,562호, 제6,159,445호, 제6,153,775호, 제6,149,890호, 제6,143,276호, 제6,143,274호, 제6,139,819호, 제6,132,764호, 제6,123,923호, 제6,123,921호, 제6,120,768호, 제6,120,751호, 제6,117,412호, 제6,106,866호, 제6,096,290호, 제6,093,382호, 제6,090,800호, 제6,090,408호, 제6,088,613호, 제6,077,499호, 제6,075,010호, 제6,071,494호, 제6,071,490호, 제6,060,040호, 제6,056,939호, 제6,051,207호, 제6,048,979호, 제6,045,821호, 제6,045,775호, 제6,030,840호, 제6,028,066호, 제6,022,966호, 제6,022,523호, 제6,022,522호, 제6,017,522호, 제6,015,897호, 제6,010,682호, 제6,010,681호, 제6,004,533호 및 제6,001,329호 참조).
융합 단백질의 제조
항체 및/또는 이펙터가 상대적으로 짧은(예를 들면, 약 50개 미만의 아미노산들) 경우, 표준 화학적 펩티드 합성 기법을 이용하여 이들을 합성할 수 있다. 상기 두 분자들이 상대적으로 짧은 경우, 단일 연속적인 폴리펩티드로서 키메라 분자를 합성할 수 있다. 대안적으로, 표적화 분자 및 이펙터 분자를 따로 합성한 후, 한 분자의 아미노 말단과 다른 분자의 카복실 말단의 축합으로 융합시킴으로써 펩티드 결합을 형성할 수 있다. 대안적으로, 표적화 분자 및 이펙터 분자를 펩티드 스페이서 분자의 한 말단과 각각 축합시킴으로써 연속적인 융합 단백질을 형성할 수 있다.
서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시킨 후, 서열에서 남은 아미노산들을 순차적으로 첨가하는 고체상 합성이 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 합성을 위한 바람직한 방법이다. 고체상 합성 기법은 문헌(Barany and Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.), 문헌(Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963)) 및 문헌(Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984))에 기재되어 있다.
일부 실시양태들에서, 재조합 DNA 방법을 이용하여 본 발명의 키메라 융합 단백질을 합성한다. 일반적으로, 이것은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 생성하는 단계, 상기 DNA를 특정 프로모터의 조절 하에 발현 카세트에 배치하는 단계, 단백질을 숙주에서 발현시키는 단계, 발현된 단백질을 단리하는 단계, 및 요구된 경우 상기 단백질을 재생시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한을 포함하는 임의의 적합한 방법, 또는 문헌(Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99)의 포스포트리에스테르 방법, 문헌(Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151)의 포스포디에스테르 방법, 문헌(Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862)의 디에틸포스포르아미다이트 방법 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이것은 상보적인 서열과의 혼성화에 의해, 또는 단일 가닥을 주형으로서 사용하는 DNA 중합효소에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 염기들의 서열로 한정되지만, 보다 더 긴 서열이 보다 더 짧은 서열들의 라이게이션에 의해 수득될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대안적으로, 일부 실시양태들에서, 하위서열을 클로닝할 수 있고 적절한 제한 효소를 사용하여 적절한 하위서열을 절단할 수 있다. 그 다음, 단편들을 라이게이션시켜 원하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
일부 실시양태들에서, PCR 클로닝 방법을 이용하여 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 항체와 이펙터는 본질적으로 함께 직접 연결되어 있지만, 당업자는 상기 분자들이 스페이서, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 스페이서(예를 들면, (Gly4Ser)3, 서열번호 80)에 의해 분리될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 스페이서는 단백질들을 연결하거나 이들 사이의 일정한 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외의 특정 생물학적 활성을 갖지 않을 것이다. 그러나, 스페이서의 성분 아미노산들은 분자의 일부 성질, 예컨대, 폴딩, 순전하 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이. 콜라이(E. coli), 다른 세균 숙주, 효모, 및 다양한 고등 진핵 세포들, 예컨대, COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골수종 세포주를 비롯한 다양한 숙주 세포들에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 각각의 숙주에 적절한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다.
본 발명의 플라스미드는 잘 공지되어 있는 방법, 예컨대, 이. 콜라이의 경우 염화칼슘 형질전환 및 포유동물 세포의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공에 의해 선택된 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 플라스미드에 의해 형질전환된 세포는 플라스미드 상에 함유된 유전자, 예컨대, amp, gpt, neo 및 hyg 유전자들에 의해 부여되는 항생제 내성에 의해 선택될 수 있다.
일단 발현되면, 재조합 융합 단백질은 황화암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한, 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌(R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y.) 참조). 적어도 약 90% 내지 95% 균질도의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98% 내지 99% 이상의 균질도가 약학 용도를 위해 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 원하는 균질도까지 정제되면, 폴리펩티드는 치료적으로 사용될 수 있다.
당업자는 화학적 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후, 융합 단백질이 성분 폴리펩티드들의 천연 입체구조와 실질적으로 상이한 입체구조를 보유할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이 경우, 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 후 폴리펩티드가 바람직한 입체구조로 재폴딩되게 할 필요가 있을 수 있다. 단백질을 환원시키고 변성시키고 재폴딩을 유도하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070); 문헌(Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585); 및 문헌(Buchner, et al. (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270) 참조).
당업자는 융합 단백질의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 이 융합 단백질을 변경시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 표적화 분자의 클로닝, 발현 또는 융합 단백질 내로의 도입을 용이하게 하기 위해 어느 정도 변경시킬 수 있다. 이러한 변경은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 시작 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에서 첨가된 메티오닌, 또는 편리하게 위치된 제한 부위 또는 종결 코돈을 생성하기 위해 어느 한 말단 상에 배치된 추가 아미노산을 포함한다.
약학 조성물
본원에 기재된 항-CD46 항체(예를 들면, YS5, YS5F, YS5v1D, SB1HGNY, YS12, 3G7RY(3G8로서도 공지되어 있음), YS6, YS1, YS3, YS4, YS8, YS7, YS9, YS10, YS11, 3G7HY, 3G7NY, 3G7, SB2, 2C8 및/또는 UA8카파) 및/또는 이의 면역접합체는 예방적, 그러나 원칙적으로 치유적 치료를 위한 비경구, 국부, 경구 또는 국소 투여(예를 들면, 종양 부위 내로의 주사), 에어로졸 투여, 또는 경피 투여에 유용하다. 약학 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 제형들로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여에 적합한 단위 제형은 산제, 정제, 환제, 캡슐제 및 로젠지를 포함한다. 본원에 기재된 항체 및/또는 이의 면역접합체, 및 본원에 기재된 항체 및/또는 이의 면역 접합체를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여될 때 바람직하게는 소화로부터 보호된다는 것이 인식된다. 이것은 당업자에게 공지되어 있는 다수의 수단들, 예를 들면, 단백질이 산성 및 효소 가수분해에 대한 내성을 갖게 하기 위해 상기 단백질과 조성물의 복합체를 형성함으로써, 또는 적절한 내성 담체, 예컨대, 리포좀으로 상기 단백질을 팩키징함으로써 달성될 수 있다. 소화로부터 단백질을 보호하는 수단은 당분야에서 잘 공지되어 있다.
다양한 실시양태들에서, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화된 항-CD46 항체들 또는 이들의 항원 결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물이 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매들, 분산 매질들, 코팅제들, 항균제들, 항진균제들, 등장화제들 및 흡수 지연제들 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들면, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체 또는 면역접합체는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 상기 화합물을 보호할 물질로 코팅될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 항체 및/또는 면역접합체는 "천연" 형태로 투여될 수 있거나, 원하는 경우, 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 또는 유도체가 약리학적으로 적합한, 즉 본 방법(들)에서 효과적인 한, 상기 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 유도체 등의 형태로 투여될 수 있다. 활성 물질의 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 및 다른 유도체는 합성 유기화학 분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. N.Y. Wiley-Interscience)에 기재되어 있고 전술되어 있는 표준 절차의 이용을 통해 제조될 수 있다.
예를 들면, 염을 형성할 수 있는 작용기를 가진 본원에 기재된 항체들 및/또는 면역접합체들 중 임의의 항체 및/또는 면역접합체에 대한 약학적으로 허용가능한 염이 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 모 화합물의 활성을 보유하고, 이 염이 투여되는 환경에서 이 염이 투여되는 대상체에 어떠한 유해한 또는 부적절한 효과도 부여하지 않는 임의의 염이다.
다양한 실시양태들에서, 약학적으로 허용가능한 염은 유기 또는 무기 염기로부터 유도될 수 있다. 상기 염은 1가 또는 다가 이온일 수 있다. 무기 이온, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘이 특히 흥미롭다. 유기 염은 아민, 특히 암모늄 염, 예컨대, 모노알킬 아민, 디알킬아민, 트리알킬아민 또는 에탄올 아민에 의해 만들어질 수 있다. 염은 카페인, 트로메타민 및 유사한 분자에 의해 형성될 수도 있다.
약학적 활성 물질을 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 등으로서 제제화하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 염은 전형적으로 적합한 산을 사용한 반응을 포함하는 통상적인 방법의 이용을 통해 유리 염기로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 염기 형태의 약물은 극성 유기 용매, 예컨대, 메탄올 또는 에탄올에 용해되고, 산이 이것에 첨가된다. 생성된 염은 보다 더 낮은 극성의 용매의 첨가에 의해 침전되거나 용액으로부터 생성될 수 있다. 산부가 염을 제조하기에 적합한 산은 유기산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등뿐만 아니라, 무기 산, 예를 들면, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등도 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 산부가 염은 적합한 염기를 사용한 처리에 의해 유리 염기로 재전환될 수 있다. 본원에서 활성 물질의 일부 특히 바람직한 산부가 염은 예컨대, 염화수소산 또는 브롬화수소산을 사용함으로써 제조될 수 있는 할라이드 염을 포함한다. 대조적으로, 본 발명의 활성 물질의 염기성 염은 약학적으로 허용가능한 염기, 예컨대, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 트리메틸아민 등을 사용함으로써 유사한 방식으로 제조된다. 특히 바람직한 염기성 염은 알칼리 금속 염, 예를 들면, 나트륨 염 및 구리 염을 포함한다.
염 형태의 염기성 약물의 제조를 위해, 반대이온의 pKa는 바람직하게는 약물의 pKa보다 적어도 약 2 pH 유닛 더 낮다. 유사하게, 염 형태의 산성 약물의 제조를 위해, 반대이온의 pKa는 바람직하게는 약물의 pKa보다 적어도 약 2 pH 유닛 더 높다. 이것은 반대이온으로 하여금 용액의 pH를 pHmax보다 더 낮은 수준까지 낮추게 함으로써, 염의 가용성이 유리 산 또는 염기의 가용성보다 우수한 염 안정기(plateau)에 도달하게 한다. 활성 약학 성분(API)에서의 이온화가능한 기의 pKa 유닛과 산 또는 염기에서의 이온화가능한 기의 pKa 유닛의 차이의 일반화된 규칙은 양성자 전달을 에너지 면에서 유리하게 만들기 위한 것이다. API 및 반대이온의 pKa가 유의하게 상이하지 않을 때, 고체 복합체가 형성될 수 있으나, 수성 환경에서 신속하게 균형을 상실할 수 있다(즉, 개별 물질인 약물 및 반대이온으로 분해될 수 있다).
바람직하게는, 반대이온은 약학적으로 허용가능한 반대이온이다. 적합한 음이온성 염 형태는 아세테이트, 벤조에이트, 벤질레이트, 비타르트레이트, 브로마이드, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 요오다이드, 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸 브로마이드, 메틸 설페이트, 뮤케이트, 납실레이트, 니트레이트, 파모에이트(엠보네이트), 포스페이트 및 디포스페이트, 살리실레이트 및 디살리실레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 발레레이트 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는 반면, 적합한 양이온성 염 형태는 알루미늄, 벤자틴, 칼슘, 에틸렌 디아민, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 칼륨, 프로카인(procaine), 나트륨, 트로메타민, 아연 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
에스테르의 제조는 전형적으로 항체 및/또는 면역접합체의 분자 구조 내에 존재하는 하이드록실 및/또는 카복실 기의 작용기화를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 에스테르는 전형적으로 유리 알코올 기의 아실-치환된 유도체, 즉 화학식 RCOOH의 카복실산으로부터 유도된 모이어티이고, 이때 R은 알킬이고 바람직하게는 저급 알킬이다. 에스테르는 원하는 경우 통상적인 수소분해 또는 가수분해 절차를 이용함으로써 유리 산으로 재전환될 수 있다.
아미드도 당업자에게 공지되어 있거나 관련 문헌에 기재되어 있는 기법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 아미드는 적합한 아민 반응물을 사용함으로써 에스테르로부터 제조될 수 있거나, 암모니아 또는 저급 알킬 아민을 사용한 반응에 의해 무수물 또는 산 클로라이드로부터 제조될 수 있다.
본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체를 포함하는 약학 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나 조합 요법으로 (즉, 다른 물질과 조합되어) 투여될 수 있다. 예를 들면, 조합 요법은 적어도 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대, 이하에 기재된 항암제와 함께 항체 또는 면역접합체를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 방사선 요법 및/또는 수술과 함께 투여될 수도 있다.
본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체를 포함하는 조성물은 당분야에서 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체에 포함되어, 예컨대, 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 조절 방출 제제로 제조될 수 있다. 생체분해가능한 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제들을 제조하는 많은 방법들이 특허등록되어 있고 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978) 참조).
일부 실시양태들에서, 항-CD46 항체 또는 면역접합체의 투여는 상기 항체 또는 면역접합체 조성물의 코팅, 상기 항체 또는 면역접합체와 이의 불활성화를 방지하는 물질의 공-투여에 의해 용이해질 수 있다. 예를 들면, 화합물은 적절한 담체, 예를 들면, 리포좀 또는 희석제에 함유된 상태로 대상체에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 수성 완충제 용액을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 리포좀은 수중유중수 CGF 에멀전뿐만 아니라 통상적인 리포좀도 포함하나, 이들로 한정되지 않는다(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol, 7: 27).
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당분야에서 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물과 상용불가능한 경우를 제외하고, 약학 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 조성물 내로 도입될 수 있다.
다양한 실시양태들에서, 치료 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 전형적으로 멸균 및 안정한 상태이다. 상기 조성물(들)은 용액, 마이크로에멀전, 지질 또는 리포좀, 또는 높은 약물 농도(들)를 함유하기에 적합한 다른 정돈된 구조물로서 제제화될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구된 양의 활성 화합물(예를 들면, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체)을 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매에 도입한 후, 요구된 경우 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기초 분산 매질, 및 상기 나열된 성분들 중 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법은 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 분말을 그의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 제공하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)를 포함한다.
투약법은 최적 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간의 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급에 의해 표시될 때 비례적으로 감소될 수 있거나 증가될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체는 피하 주사에 의해 매일 1회 또는 2회, 매주 1회 또는 2회, 또는 매달 1회 또는 2회 투여될 수 있다.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 제형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 단위 제형은 치료될 대상체를 위한 단위 용량으로서 맞추어진 물리적으로 분리된 유닛을 지칭한다. 각각의 유닛은 요구된 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정의 양의 활성 화합물을 함유한다. 단위 제형에 대한 세부요건은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 구체적인 치료 효과, 및 (b) 개체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재하는 한계점에 의해 결정되고 직접적으로 좌우된다.
일부 실시양태들에서, 제제는 약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 있다.
치료 조성물의 경우, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체의 제제는 경구, 코, 국소(협측 및 설하를 포함함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 제제를 포함한다. 상기 제제는 편리하게는 단위 제형으로 제공될 수 있고 약학 분야에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 구체적인 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이 양은 100% 중 약 0.001% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 30%의 활성 화합물일 것이다.
질 투여에 적합한 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체의 제제는 당분야에서 적절한 것으로 공지되어 있는, 이러한 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제도 포함한다. 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 활성 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 멸균 조건 하에서 혼합될 수 있다.
본원에서 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 장 및 국소 투여를 제외한, 통상적으로 주사에 의한 투여 모드를 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사, 및 주입을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체를 포함하는 약학 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 담체 및 비-수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
다양한 실시양태들에서, 이들 조성물들은 보조제, 예컨대, 보존제, 습윤화제, 에멀전화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 보조제의 구체적인 예로는 예를 들면, 무기 보조제(예컨대, 알루미늄 염, 예를 들면, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄), 유기 보조제(예를 들면, 스쿠알렌), 오일계 보조제, 및 비로좀(예를 들면, 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 막-결합된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 함유하는 비로좀)이 있다.
제제 중의 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차, 및/또는 다양한 항균제들 및 항진균제들, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 약학 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체가 약제로서 인간 및 동물에게 투여될 때, 이들은 단독으로 제공될 수 있거나, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 예를 들면, 0.001% 내지 90%(보다 바람직하게는 0.005% 내지 70%, 예컨대, 0.01% 내지 30%)의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물로서 제공될 수 있다.
선택된 투여 경로와 관계없이, 적합한 수화된 형태 및/또는 약학 조성물로 사용될 수 있는, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체는 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 제형으로 제제화된다.
본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분(예를 들면, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체)의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 조성물 및 투여 모드에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용된 본 발명의 구체적인 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료 지속시간, 사용되는 구체적인 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 기타 요인을 비롯한 다양한 약동학적 요인들에 의해 좌우될 것이다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 요구된 약학 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 상기 의사 또는 수의사는 약학 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 용량을, 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구된 수준보다 더 낮은 수준에서 출발할 수 있고 원하는 효과가 달성될 때까지 상기 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기 요인들에 의해 좌우될 것이다. 일부 실시양태들에서, 투여는 바람직하게는 표적 부위 근처에서 투여되는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여인 것이 바람직하다. 원하는 경우, 치료 조성물의 유효 1일 용량은 일회 용량으로서 투여될 수 있거나, 임의적으로 단위 제형으로 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 따로 투여되는 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 이상의 하위-용량으로서 투여될 수 있다. 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체를 단독으로 투여할 수 있지만, 전형적으로 화합물(들)을 약학 제제(조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태들에서, 치료 조성물은 당분야에서 공지되어 있는 의료 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 예시적인 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 및/또는 면역접합체는 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대, 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 장치에 의해 투여될 수 있다. 잘 공지되어 있는 유용한 임플란트 및 모듈의 예는 예를 들면, 조절된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호, 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호, 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호, 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능한 주입 장치를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호, 멀티-챔버 구획들을 가진 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,439,196호, 및 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,475,196호에 기재되어 있다. 많은 다른 이러한 임플란트들, 전달 시스템들 및 모듈들은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 항-CD46 항체 및/또는 면역접합체는 생체 내에서 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들면, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 많은 고친수성 화합물들을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물들이 (원하는 경우) BBB를 횡단하는 것을 보장하기 위해, 이들은 예를 들면, 리포좀으로 제제화될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호, 제5,374,548호 및 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되어, 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌(Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685) 참조). 예시적인 표적화 모이어티들은 폴레이트 또는 바이오틴(예를 들면, 미국 특허 제5,416,016호 참조); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체(Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 및 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
키트
방사성 또는 다른 이펙터가 진단제 및/또는 치료제로서 사용되는 경우, 종종 방사성 표지에 부착된 화합물의 좋지 않은 저장 수명 및/또는 사용된 방사성핵종의 짧은 반감기 때문에, 사용 준비된 조성물을 사용자가 자유롭게 사용하는 것은 종종 불가능하다. 이러한 경우, 사용자는 병원, 의사의 진료실 또는 실험실에서 방사성핵종을 사용한 표지부착 반응을 수행할 수 있다. 이 목적 또는 다른 목적을 위해, 다양한 반응 성분들이 소위 "키트"의 형태로 사용자에게 제공될 수 있다. 키트는 바람직하게는 원하는 반응을 수행하기 위해 필요한 조작이 사용자로 하여금 그가 자유롭게 이용할 수 있는 시설을 이용함으로써 원하는 조성물을 키트로부터 제조할 수 있게 할 정도로 가능한 단순하도록 디자인된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태들에서, 이러한 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 항체 또는 면역접합체를 포함한다. 상기 항체 또는 면역접합체는 원하는 경우 첨가된 불활성 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 제제화제 및/또는 보조제와 함께 제공될 수 있다. 추가로, 키트는 임의적으로 (ii) 적합한 방사성핵종(또는 다른 활성 물질)의 염 또는 킬레이트의 용액, 및 (iii) 키트에 존재하는 성분들을 투여하고/하거나 반응시키기 위한 처방을 가진 사용 설명서를 포함한다.
사용자에게 공급되는 키트는 사용 설명서와 함께 상기 정의된 성분(들)도 포함할 수 있는 반면, 한정된 저장 수명을 가진, 상기 (ii)에서 정의된 방사성핵종의 염 또는 킬레이트의 용액은 사용자에 의해 따로 자유롭게 사용될 수 있다.
키트는 임의적으로 환원제 및/또는, 원하는 경우, 킬레이터, 및/또는 조성물의 사용 설명서 및/또는 원하는 생성물(들)을 형성하기 위한 키트의 성분들의 반응에 대한 처방을 추가로 포함할 수 있다. 원하는 경우, 키트의 성분들은, 이들이 상용가능한 한, 조합될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 면역접합체는 단순히 중성 매질에서 성분들을 조합하고 이들이 반응하게 함으로써 생성될 수 있다. 이 목적을 위해, 이펙터는 예를 들면, 킬레이트의 형태로 항체에 제공될 수 있다.
키트 성분(들)이 (예를 들면, 주사액으로서) 약학 투여를 위한 성분(들)으로서 사용될 때, 이들은 바람직하게는 멸균되어 있다. 상기 성분(들)이 건조된 상태로 제공될 때, 사용자는 바람직하게는 멸균 생리학적 식염수 용액을 용매로서 사용해야 한다. 원하는 경우, 성분(들)은 적합한 안정화제, 예를 들면, 아스코르브산, 젠티스산 또는 이 산들의 염에 의해 통상적인 방식으로 안정화될 수 있거나, 다른 보조제, 예를 들면, 충전제, 예컨대, 글루코스, 락토스, 만니톨 등을 포함할 수 있다.
지시 자료는 존재하는 경우 전형적으로 작성된 또는 인쇄된 자료를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 지시를 저장할 수 있고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들면, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들면, CD ROM) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 매체는 이러한 지시 자료를 제공하는 인터넷 사이트 주소를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이고 한정하기 위해 제공되는 것이 아니다.
실시예 1
신규 항-CD46 항체 및 이의 용도
신규 항-인간 CD46 항체를 확인하기 위해, 인간 CD46의 스시(Sushi) 도메인 1 및 2로 구성된 재조합 Fc 융합 단백질을 생성하였다. 보체 요소들이 도메인 3 및 4에 우선적으로 결합하기 때문에, 도메인 1 및 2의 선택은 정상 보체 기능을 강력히 방해할 수 있는 항체의 선택을 최소화한다. 이 CD46-Fc 융합체를 생성하였고 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 형질감염된 HEK293 세포로부터 정제하였다. 인간 항체 선택을 위해, 426명의 건강한 인간 기증자들의 말초혈 단핵 세포로부터 모은 cDNA들을 사용하여 5 x 109개 구성원 파지미드 디스플레이 라이브러리를 생성하였고, 재조합 CD46-Fc 융합 단백질에 대해 상기 라이브러리를 선택하였다. 3 라운드의 선택 후, 결합 파지미드를 FACS로 스크리닝하고 서열분석하였다. 동시에, 먼저 살아있는 종양 세포에 대해 상기 라이브러리를 선택한 후, 라운드 1 파지미드 선택으로부터의 결과물을 효모 표면 디스플레이 벡터 내로 전달하는 단계, 및 이어서 재조합 CD46-Fc 융합 단백질에 대한 고친화성 결합제를 풍부하게 하기 위해 저농도 리간드를 사용하는 FACS-기반 선택을 수행하는 단계를 포함하는 대안적 방법을 이용하였다. 생성된 항체는 살아있는 종양 세포 및 재조합 인간 CD46 단백질 둘 다에 고친화성으로 결합한다. 모든 결합 클론들을 서열결정하였고 독특한 서열들이 표 1에 나열되어 있다.
scFv를 전체 인간 IgG1로 전환시켰고 살아있는 종양 세포에 대한 결합 친화성을 측정하였다. FACS 결합 데이터를 곡선 피팅하여 KD 값을 생성하였다(도 2: Du-145에 대한 YS5의 결과; 도 3: Du-145에 대한 YS12의 결과). 연구된 항체들에 대한 친화성은 낮은 내지 서브-나노몰(nM)이다.
인간 CD46 이외에, 본원에 기재된 항체들은 유사한 친화성으로 사이노몰구스 원숭이 CD46(도 4)에 결합함으로써(도 5: CHO-huCD46에 대한 YS5의 결과; 도 6: CHO-cynoCD46에 대한 YS5의 결과), 조절 독성학 연구에 적합한 종을 확인시켜준다.
이미 확인된 UA20 및 2B10과 함께 항-CD46 항체들 전부가 CD46 스시 도메인 1 및 2에 결합한다. 이 영역을 더 분석하여 에피토프 차이를 밝혔다. 본 발명자들은 먼저 살아있는 종양 세포에 대한 FACS-기반 경쟁 실험을 수행하였고 본 발명자들의 항체가 UA20-Fc와 경쟁하거나 경쟁하지 않는다는 것을 발견하였다: 군 1은 YS5 및 기타로 구성되고, 군 1은 SB1HGNY로 구성된다(도 7). 군 1 내의 항체들의 경우, 다양한 CD46 돌연변이체들에 결합하는 항체의 선택적 효과에 의해 입증된 추가 에피토프 차이가 있다(표 3). 예를 들면, 위치 39에서의 돌연변이가 그의 결합에 독특하게 영향을 미치기 때문에, YS5는 다른 항체들과 상이하였는데(표 3), 이것은 모든 항체들에 대한 결합에 영향을 미치는 위치 40과 함께 위치 39가 CD46에 결합하는 YS5에 대한 에피토프의 부분이라는 것을 암시한다.
모든 항체들은 실험실 균주(에드몬스톤) 홍역 바이러스 H 단백질과 경쟁한다. 홍역 바이러스는 대음세포작용에 의해 표적 세포 내로 들어간다(Crimeen-Irwin et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 46927-46937). H 단백질은 바이러스 도입을 위해 요구되는, 세포 표면 CD46에의 결합 및 가교연결에 반응한다(Id.). 본 발명자들의 항체들이 CD46에의 결합에 대해 H 단백질과 경쟁하는지를 확인하기 위해, 재조합 H 단백질-Fc 융합체를 생성하였고, 항-CD46 항체와의 경쟁에 대해 FACS로 시험하였다. 시험된 항체들은 H 단백질과 경쟁한다는 것을 확인하였는데(도 8), 이것은 중첩되는 결합 부위를 암시한다.
홍역 바이러스는 대음세포작용을 통해 표적 세포 내로 들어가기 때문에, 항-CD46 항체도 대음세포작용을 통해 종양 세포에 의해 내재화되는지를 확인하였다. 70 kDa 중성 밀도 덱스트란(ND70)을 대음세포작용에 대한 표시자로서 사용하여(Ha et al. (2014) Mol. Cell Proteomics. 13(12): 3320-3331), 항-CD46 항체가 실제로 대음세포작용 경로에 의해 내재화된다는 것을 발견하였다(도 9). 대음세포작용은 본질적으로 종양 선택적이므로(Commisso et al. (2013) Nature, 497: 633-637; Ha et al. (2014) Mol. Cell Proteomics. 13(12): 3320-3331; Reyes-Reyes et al. (2010) Cancer Res. 70: 8617-8629), 종양 세포에 대한 추가 선택성을 항-CD46 항체에게 부여한다.
표적화된 치료제 개발을 위한 표적으로서 CD46을 검증하기 위해, CD46 에피토프의 조직 특이성을 면역조직화학으로 확인하였다. 종양에서의 CD46 에피토프 발현을 먼저 연구하였다. 냉동된 전립선암 조직 및 포르말린 고정된 파라핀 매립된(FFPE) 전립선암 조직 둘 다에 대해 면역조직화학 연구를 수행하였다. 냉동된 조직의 경우, 18/18 사례들(100%)이 강한 염색 신호를 보였는데, 이것은 모든 사례들에서의 과다발현을 시사한다. FFPE 조직의 경우, 강한 CD46 염색은 63/87 사례들에서 확인되었고 중간 염색은 23/87 사례들에서 확인되었고 약한 염색은 1/87 사례들에서 확인되었는데, 이것은 CD46이 대부분의 전립선 종양들에 의해 과다발현된다는 결론을 뒷받침한다. 면역조직화학 결과의 요약은 표 4 및 도 10에 제시되어 있다.
상기 언급된 연구들은 인간 암에 대한 CD46-표적화된 단일클론 항체 치료제의 개발을 강하게 뒷받침한다. 이를 위해, 신규 항-CD46 항체들의 패널을 사용하여 항체-약물 접합체(ADC)를 개발하였다. MC-vc-PAB 링커(McDonagh et al. (2008) Mol. Canc. Therap. 7: 2913-2923; Sutherland et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 10540-10547)를 통해 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)를 YS5 IgG1에 접합시켰다. 항체 분자당 평균 약 3개의 약물들이 접합되었다는 것을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 확인하였다(도 11). 그 다음, 전이성 거세 내성 전립선 암세포주들(LNCaP-C4-2B 및 Du145)의 패널을 사용하여 시험관 내에서 종양 사멸 활성을 시험하였다. 강력한 종양 세포 사멸이 낮은 내지 서브 nM의 EC50 값으로 관찰되었다(도 12 및 13).
LNCaP-C4-2B 피하 이종이식편 모델을 사용하여 항-CD46 ADC의 생체내 항-종양 활성을 시험하였다. 5 mg/kg의 5회 용량 후 검출불가능한 수준까지 감소된 종양 부피와 함께 종양 성장 및 생존의 강력한 억제가 관찰되었다(도 14). ADC 주사 후 표시된 기간 동안 종양은 재발되지 않았다(도 14).
전립선암 이외에, 항-CD46 ADC가 CD46을 발현하는 다양한 다른 암들을 강력하게 사멸시킨다는 것을 발견하였다. 예를 들면, CD46은 전립선암 이외에 다발성 골수종 세포 표면 상에서도 고도로 발현된다는 것을 확인하였다(도 15). 더욱이, 항-CD46 ADC는 서브 nM 범위 내의 EC50으로 다발성 골수종 세포주 RPMI8226을 강력하게 사멸시킨다(도 16). 마지막으로, 항-CD46 ADC는 생체 내에서 다발성 골수종 부하를 크게 감소시켰다는 것을 확인하였다. 꼬리 정맥을 통해 레포터 발현 세포주(반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 RPMI8226-Luc)를 면역-손상된 마우스에게 주사하였고 파종성 종양 세포가 골 및 관절에서 확립되게 하였다. 그 다음, 4회 용량의 항-CD46 ADC를 (4일마다) 5 mg/kg으로 주사하였고 종양 상태를 생체발광으로 모니터링하였다. 항-CD46 ADC는 생체 내에서 종양 부하를 감소시키는 데 있어서 매우 효과적이라는 것을 발견하였다(도 17). ADC 치료 후, 치료받은 마우스들의 60%에 대해 "치유"를 보여주고 실험의 지속기간 동안 남은 40%에 대해 크게 지연된 사망 발생시점을 보여주는 생존 데이터를 수집하였다(도 18).
적용가능성을 넓히기 위해, 루시퍼라제 레포터를 발현하는 제2 다발성 골수종 세포주 MM1.S를 사용하여 항-CD46 ADC를 연구하였다. 항-CD46 ADC의 강력한 종양 사멸 활성이 생체 내에서 관찰되었다. 4 mg/kg의 4회 용량은 MM1.S 종양 세포를 완전히 제거하였다(도 20). 대조적으로, 대조군 ADC(비-결합 항체에 접합된 MMAF)는 동일한 용량 및 투약 빈도에서 효과를 나타내지 않았다. 더욱이, 4 mg/kg에서 일회 용량의 항-CD46 ADC조차도 종양 부하를 크게 감소시켜, 종양 발생의 상당한 억제를 야기하였다(도 20). 0.8 mg/kg에서 4회 용량의 항-CD46 ADC도 MM1.S 이종이식편 발생의 지속적인 억제를 야기하였다(도 20). 최종적으로, 심지어 네이키드(naked) 항체(YS5 IgG1)도 이 이종이식편 모델에서 유의한 종양 억제를 야기하였는데(도 20), 이것은 다발성 골수종의 일부 서브타입들에 대한 잠재적인 네이키드 항체-기반 요법의 흥미로운 가능성을 암시한다.
카플란-메이에르 분석을 수행하여 치료 후 생존을 확인하였다. CD46 ADC로 치료받은 군은 대조군에 비해 유의한 생존 이점을 보였다(도 21). 4회 용량의 4 mg/kg CD46 ADC를 제공받은 마우스들의 경우, 모든 마우스들이 실험의 종결(212일째 날)까지 생존하였다.
CD46은 상기 언급된 전립선암 및 다발성 골수종 이외에 대장암, 췌장암, 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 간암, 신경교종 및 신경모세포종을 포함하나 이들로 한정되지 않는 암세포주들의 넓은 패널에서 고도로 발현된다는 것을 확인하였다. 더욱이, 항-CD46 ADC는 시험관 내에서 이 세포들을 강력하게 사멸시켰다. 예를 들면, 항-CD46 ADC는 대장암 세포(도 19: YS5의 결과, 도 22: HT29에 대한 YS12의 결과, 도 23: HT29에 대한 SB1HGNY의 결과), 췌장암 세포(도 24), 중피종 세포(도 25) 및 난소암 세포(도 26)의 사멸에 매우 효과적이다.
잠재적인 독성을 평가하기 위해, CD46을 발현하지 않거나(BPH-1) 중간 수준으로 발현하는(예를 들면, HS27) 대조군 세포들의 패널에 대해 YS5 ADC를 시험하였다. 이들 세포들에 대한 많이 감소된 세포독성이 관찰되었는데(도 27: BPH-1에 대한 YS5 ADC의 결과, 도 28: HS27에 대한 YS5 ADC의 결과, 도 29: 정상 T 세포에 대한 YS5 ADC의 결과, 및 도 30: CD14-고갈된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 대한 YS5 ADC의 결과), 이것은 이들이 ADC를 용이하게 흡수하지 않는다는 것을 암시한다. 대음세포작용을 통한 상이한 내재화는 항-CD46 ADC의 선택성을 향상시키는 가능성 있는 기작이다.
인간 CD46을 발현하는 형질전환 마우스를 사용하여 생체 내에서 ADC 독성을 연구하였다. 인간 CD46에 대한 진정한 뮤린 오르톨로그는 없고, 뮤린 CD46은 인간 CD46의 생리학적 역할과 꽤 상이한 생리학적 역할을 수행한다. 항체들은 뮤린 CD46에 결합하지 않았다. 따라서, 상기 형질전환 모델을 제외하고 잠재적인 항-CD46 ADC 독성의 평가를 위한 우수한 작은 동물 모델은 없다. 6 mg/kg의 항-CD46 ADC를 인간 CD46 발현 형질전환 마우스들 내에 주사하였고, 동물들을 명시적인 독성 신호에 대해 매일 모니터링하였다. 동물들을 14일째 날에 희생시켰고 조직 손상의 조직학적 검사를 위해 중추 장기들을 회수하였다. 도 31에 표시된 바와 같이, 항-CD46 ADC로 치료받은 마우스들과 대조군 ADC로 치료받은 마우스들 사이에 주목할 만한 차이는 없다. 시험된 ADC의 이 용량에서 이 실험의 지속기간 동안 명시적인 독성 신호는 관찰되지 않았다. 조절 독성학 연구가 상기 밝혀진 바와 같이 항-CD46 항체에 의해 인식되는 CD46을 가진 비-인간 영장류, 예컨대, 사이노몰구스 원숭이에서 수행될 필요가 있다는 것이 이해된다.
인간 CD46 유전자가 염색체 1의 짧은 아암(1q32.2)에 위치한다는 점 및 1q 획득이 다양한 암들, 특히 예후가 좋지 않은 암들에서 빈번하게 관찰되었다는 점을 고려할 때, ADC들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항-CD46 항체 치료제는 치료가 몹시 필요한 진행된 병기의 광범위한 악성종양들에 적용될 수 있을 가능성이 있다. 예를 들면, 전립선암에서 1q32.2에 걸쳐 있는 영역은 현행 요법들이 영향을 미치지 못하는 파종성 전이성 형태의 질환에서 획득되는 것으로 밝혀졌기 때문에(Hanamura et al. (2006) Blood, 108: 1724-1732), 전이성 거세 내성 전립선암은 본 발명자들의 항-CD46 ADC 치료를 위한 우수한 후보가 된다. 다발성 골수종에서도 1q 획득이 재발 환자들에서 빈번하게 관찰됨으로써(Id.), 본 발명자들의 항-CD46 ADC들이 잠재적으로 도움이 될 수 있는 중요한 환자 집단을 확인시켜준다. 1q(구체적으로 1q32.2) 획득과 좋지 않은 예후 사이의 상관관계는 다른 암들의 경우에도 확인되었기 때문에, 1q는 환자 분류 및 악성종양에 대한 결과 모니터링을 위한 본 발명자들의 항-CD46 ADC들에 대한 잠재적 바이오마커가 된다. 1q32.2를 검출하는 FISH 프로브를 사용하여 1q 상태를 평가할 수 있었다. 순환 DNA를 사용하여, 예후가 좋지 않은 CD46 발현 암에 대한 최소 침습성 바이오마커로서 1q 획득을 검출할 수도 있다(Fan et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105: 16266-16271).
본원에 기재된 항-CD46 항체는 항-CD46 ADC들에 대한 단독 영상화제 또는 동반 진단제로서 생체 내에서 종양 상태를 모니터링하기 위한 영상화 프로브에서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 표지를 본 발명자들의 원형 항-CD46 항체 UA20에 미리 부착시키고 생체 내에서 전립선암 표적화에 대한 그의 탁월한 영상화 성질을 입증하였다(He et al. (2010) J. Nucl. Med. 51: 427-432). 영상화 이외에, 항-CD46 항체는 생검 및 보관된 환자 샘플에서 CD46 발현을 평가하기 위한 면역조직화학-기반 바이오마커, 혈청 CD46 수준을 평가하기 위한 포획 ELISA 분석, 및 파종성 및/또는 순환 종양 세포에서 CD46 세포 표면 발현을 평가하기 위한 FACS 또는 칩-기반 분석에서 사용될 수 있다.
실시예 2
CD46 ADC는 대퇴부내 mCRPC 이종이식편 모델에서 높은 활성을 나타낸다 .
95% 이상의 전립선암 전이가 골 부위로의 전이이기 때문에, 본 발명자들은 골 이종이식편 모델에서 본 발명자들의 항-CD46 ADC의 효능을 더 연구하였다. 본 발명자들은 반딧불이 루시퍼라제 레포터를 보유하는 전이성 거세 내성 전립선암(mCRPC) 세포주 LNCaP C4-2B를 NSG 마우스의 대퇴골 내로 주사하여 골내 mCRPC 이종이식편 모델을 생성하였다. 이식한 지 7일 후, CD46 ADC(YS5-mcvcpab-MMAF)를 총 4회 4일마다 주사하였다. 치료 동안 및 치료 후 종양 상태를 생체발광 영상화로 모니터링하였다. 도 32에 표시된 바와 같이, CD46 ADC로 치료받은 마우스들은 실험의 종결(65일째 날)까지 치료 후 기간 동안 지속되는 상당한 종양 억제를 보였는데, 이것은 본 발명자들의 CD46 ADC가 이 대퇴부내 mCRPC 이종이식편 모델에서 매우 효과적이라는 것을 암시한다.
CD46은 CRPC 및 mCRPC 조직에서 고도로 발현된다 .
본 발명자들은 일차 종양 이외에 거세 내성 전립선암(CRPC) 및 전이성 거세 내성 전립선암(mCRPC)으로부터의 조직 표본들에 대한 면역조직화학 연구를 수행하였다. 도 33에 표시된 바와 같이, CD46은 CRPC 표본에서 고도로 발현된다. 본 발명자들은 mCRPC 표본도 연구하였고 골 전이(도 34), 림프절 전이(도 35) 및 방광 전이(도 36)에서 CD46의 광범위한(연구된 사례들의 100%, 또는 12/12) 및 강한 발현을 발견하였다.
CD46은 전립선암의 신경내분비 서브타입에 의해 과다발현된다 .
약 30%의 환자들이 아비라테론 및 엔잘루타마이드 치료에 대한 내성을 나타낸다. 전립선암의 소세포/신경내분비 타입의 출현은 흔한 사건(약 30% 내지 40%의 사례)일 수 있다. 선암종과 달리, 신경내분비 전립선암은 종종 공통 마커, 예컨대, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 신경내분비 전립선 암세포주 H660에 의한 CD46 발현을 FACS로 연구하고자 하였다. 도 37의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, CD46은 H660 세포에 의해 고도로 발현된다. 웨스턴 블롯 분석은 H660 세포가 CD46 및 신경내분비 마커 신경 특이적 에놀라제(NSE)를 발현한다는 것을 확인시켜주었다(도 37, 우측 패널). 본 발명자들의 항-CD46 항체(YS5)는 H660 세포에 의해 내재화되고 라이소좀 마커 LAMP1과 함께 위치한다(도 38). H660 세포와 함께 항온처리되었을 때, 본 발명자들의 항-CD46 ADC는 시험관 내에서 1 nM 미만의 EC50으로 강력한 세포독성 활성을 보였다(도 39).
CD46은 전립선 암세포를 CD46 ADC에 민감하게 만드는 아비라테론 또는 엔잘루타마이드를 사용한 처리 후 전립선 암세포에 의해 더 상향조절된다 .
본 발명자들은 7일 동안 10 μM 아비라테론을 사용한 mCRPC 세포주 LNCaP-C4-2B의 처리가 표면 CD46 발현의 유의한 상향조절을 야기하였다는 것을 발견하였다(도 40). 흥미롭게도, 이 상향조절은 종양 세포의 향상된 사멸과 상관관계를 갖고(도 41), 이때 EC50은 169 pM부터 21 pM까지 떨어졌다. 유사하게, 신경내분비 전립선 암세포주 H660을 7일 동안 10 μM 엔잘루타마이드와 함께 항온처리하였을 때, 세포 표면 CD46의 유의한 상향조절이 관찰되었다(도 42). LNCaP-C4-2B 세포에서 관찰된 것과 마찬가지로, H660 세포는 엔잘루타마이드 처리 후 CD46 ADC에 더 민감해졌고, 이때 EC50은 4배 내지 5배까지 떨어졌다.
추가 종양 상에서의 CD46 발현
본 발명자들은 CD46이 전립선암 및 다발성 골수종 이외에 매우 다양한 인간 암들에서 과다발현된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 면역조직화학 분석으로 82%의 대장암(81/99 사례들)에서 양성 CD46 염색을 확인하였고, 이때 70/99 사례들(71%)이 강한 염색을 보였다(도 43). 흥미롭게도, 거의 100%의 전이성 대장암이 CD46을 발현한다(도 44에서 간 전이, 도 45에서 림프절 전이, 및 도 46에서 방광 전이).
양성 CD46 염색은 중피종의 41/50 사례들(82%)의 경우에도 관찰되었고, 이때 31/50 사례들(62%)이 강한 염색을 보였다(도 47). 췌장암에서, 양성 CD46 염색은 28/50 사례들(56%)에서 관찰되었다(도 48). 다형성 교모세포종(GBM)에서, 양성 염색은 30/40 사례들(75%)에서 관찰되었다(도 49).
양성 염색은 방광암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 유방암 및 림프종을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 종양들에서도 관찰되었다.
CD46 ADC는 다른 종양들에도 효과적이다 .
시험관내 연구 이외에, 본 발명자들은 NSG 마우스에 보유된 중피종 이종이식편에 대한 CD46 ADC의 생체내 연구를 수행하였다. 도 50에 나타낸 바와 같이, YS5-mcvcpab-MMAF는 종양 이종이식편 발생의 억제에 매우 효과적이다.
본원에 기재된 예 및 실시양태는 예시 목적만을 위한 것이고 이를 고려할 때 다양한 변경들 또는 변화들이 당업자에게 암시될 것이고 본원의 사상 및 범주, 및 첨부된 청구범위 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.

Claims (86)

  1. CD46에 특이적으로 결합하고 CD46을 발현하거나 과다발현하는 세포 내로 내재화되는 단리된 항체로서, 단리된 인간 항체는
    YS5(서열번호 1 및 22로 표시됨),
    YS5F(서열번호 2 및 23으로 표시됨),
    YS5v1D(서열번호 3 및 24로 표시됨),
    SB1HGNY(서열번호 4 및 25로 표시됨), 및
    YS12(서열번호 5 및 26으로 표시됨)
    로 구성된 군으로부터 선택되는 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 대음세포작용(macropinocytosis)을 통해 내재화되는 항체.
  3. 제1항에 있어서, FACS에 의해 살아있는 전립선 종양 세포에 대해 측정하였을 때 적어도 5 내지 10 nM의 친화성(KD)으로 전립선 종양 세포에 결합하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, YS5 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, YS5 항체의 가변 경쇄(VL) 및 YS5 항체의 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 인간 IgG1을 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 이펙터(effector)에 부착된, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 면역접합체.
  10. 제9항에 있어서, 이펙터는 세포독성 약물, 세포증식억제성 약물, 또는 세포독성 및 세포증식억제성 약물을 포함하는 것인 면역접합체.
  11. 제9항에 있어서, 이펙터는 미세소관 억제제, 튜불린 억제제, DNA 손상제 또는 중합효소 억제제를 포함하는 것인 면역접합체.
  12. 제9항에 있어서, 이펙터는 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 아우리스타틴 E(AE), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), vcMMAE 및 vcMMAF로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  13. 제12항에 있어서, 항체는 MC-vc-PAB 링커를 통해 이펙터에 부착되는 것인 면역접합체.
  14. 제13항에 있어서, 2개 또는 4개의 이펙터가 항체에 접합되는 것인 면역접합체.
  15. 제14항의 면역접합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 암은 전립선암인 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 암은 다발성 골수종인 약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 코 투여, 직장 투여, 복강내 주사, 혈관내 주사, 피하 주사, 경피 투여 및 근육내 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여용으로 제제화되는 약학 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 종양 또는 수술 부위 내로의 투여용으로 제제화되는 약학 조성물.
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