BR122020019169B1 - Polipeptídeo - Google Patents

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Jasbir Seehra
Robert Scott Pearsall
Ravindra Kumar
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Acceleron Pharma Inc
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Abstract

Trata-se de composições e métodos para o aumento de níveis de célula vermelha do sangue e/ou hemoglobina em vertebrados, que incluem roedores e primatas e, particularmente, em humanos.

Description

[001] Dividido do BR 11 2012 003232-1, depositado em 13/08/2010.
Antecedentes da invenção
[002] A célula vermelha do sangue madura, ou eritrócito, é responsável pelo transporte de oxigênio nos sistemas circulatórios dos vertebrados. As células vermelhas do sangue contêm altas concentrações de hemoglobina, uma proteína que liga o oxigênio nos pulmões em pressão parcial relativamente alta de oxigênio (pO2) e libera oxigênio para as áreas do corpo com um pO2 relativamente baixo.
[003] As células vermelhas do sangue maduras são produzidas a partir de células-tronco hematopoéticas pluripotentes em um processo chamado eritropoiese. A eritropoiese pós-natal ocorre principalmente na medula óssea e na polpa vermelha do baço. A ação coordenada de diversos caminhos de sinalização controla o equilíbrio da proliferação, diferenciação, sobrevivência e morte celular. Sob condições normais, as células vermelhas do sangue são produzidas em uma taxa que mantém uma massa de célula vermelha constante no corpo, e a produção pode aumentar ou diminuir em resposta a diversos estímulos, que incluem demanda de tecido ou tensão de oxigênio aumentada ou diminuída. O processo de eritropoiese começa com a formação de células precursoras comprometidas por linhagem e prossegue através de uma série de tipos distintitos de células precursoras. Os estágios finais da eritropoiese ocorrem à medida que reticulócitos são liberados na corrente sanguínea e perdem sua mitocôndria e ribossomos, enquanto assume a morfologia de célula vermelha do sangue madura. Um nível elevado de reticulócitos, ou uma razão elevada de reticulócito:eritrócito, no sangue é indicativo de taxas aumentadas de produção de célula vermelha do sangue.
[004] A eritropoetina (EPO) é amplamente reconhecida como o regulador positivo mais significante da eritropoiese pós-natal em vertebrados. A EPO regula a resposta eritropoética compensatória à tensão de oxigênio de tecido (hipoxia) reduzida e baixos níveis de célula vermelha do sangue ou baixos níveis de hemoglobina. Em humanos, os níveis de EPO elevados promovem a formação de célula vermelha do sangue mediante a estimulação da geração de progenitores eritróides na medula óssea e baço. No camundongo, a EPO otimiza a eritropoiese principalmente no baço.
[005] Os efeitos de EPO são mediados por um receptor de superfície de célula que pertence à superfamília do receptor de citocina. O gene do receptor de EPO humano codifica uma proteína de transmembrana de aminoácido 483, enquanto se acredita que o receptor de EPO ativo exista como um complexo multimérico até na ausência de ligante (vide patente U.S. no. 6.319.499). O receptor de EPO completa clonado expresso em células de mamíferos liga a EPO com uma afinidade similar àquela do receptor nativo em células progenitoras eritróides. A ligação de EPO ao seu receptor causa uma alteração de conformação que resulta na ativação do receptor e efeitos biológicos que incluem a proliferação aumentada de eritroblastos imaturos, diferenciação aumentada de eritroblastos imaturos e apoptose diminuída em células progenitoras eritróides (Liboi et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury et al., 1990, Science 248:378-381).
[006] As diversas formas de EPO recombinante são usadas por médicos para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em uma variedade de cenários clínicos e, particularmente, para o tratamento de anemia. A anemia consiste em uma condição amplamente definida caracterizada por níveis menores do que o normal de hemoglobina ou células vermelhas do sangue no sangue. Em alguns casos, a anemia é causada por um distúrbio primário na produção ou sobrevivência de células vermelhas do sangue. Mais comumente, a anemia é secundária a doenças de outros sistemas (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1169-1175). A anemia pode resultar a partir de uma taxa reduzida de produção ou taxa aumentada de destruição de células vermelhas do sangue ou pela perda de células vermelhas do sangue devido à hemorragia. A anemia pode resultar a partir de uma variedade de distúrbios que incluem, por exemplo, insuficiência renal crônica, tratamento de quimioterapia, síndrome mielodisplásica, artrite reumatoide e transplante de medula óssea.
[007] O tratamento com EPO causa tipicamente um aumento em hemoglobinas por cerca de 1 a 3 g/dL em humanos saudáveis durante um período de semanas. Quando administrado a indivíduos anêmicos, este regime de tratamento fornece muitas vezes aumentos substanciais em hemoglobina e níveis de célula vermelha do sangue e conduz a aperfeiçoamentos em qualidade de vida e sobrevivência prolongada. A EPO não é uniformemente eficaz e muitos indivíduos são resistentes a até altas doses (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50). Acima de 50% de pacientes com câncer têm uma resposta inadequada a EPO, aproximadamente 10% com doença renal em estágio terminal são hiporresponsivos (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425), e menos que 10% com síndrome mielodisplásica respondem de maneira favorável (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67). Vários fatores, que incluem inflamação, deficiência de vitamina e ferro, diálise inadequada, toxicidade de alumínio e hiperparatiroidismo podem predizer uma resposta terapêutica insatisfatória. Os mecanismos moleculares da resistência à EPO ainda são incertos. A recente evidência sugere que as doses maiores de EPO podem estar associadas a um risco aumentado de morbidez cardiovascular, crescimento de tumor e mortalidade em algumas populações de paciente (Krapf et al., 2009, Clin J Am Soc Nephrol 4:470480; Glaspy, 2009, Annu Rev Med 60:181-192). Portanto, tem sido recomendado que os compostos terapêuticos à base de EPO (agentes estimulante de eritropoetina, ESAs) sejam administrados na menor dose suficiente para evitar a necessidade por transfusões de célula vermelha do sangue (Jelkmann et al., 2008, Crit Rev Oncol. Hematol 67:39-61).
[008] Deste modo, consiste em um objetivo da presente descrição fornecer métodos alternativos para o aumento dos níveis de célula vermelha do sangue em pacientes, o qual iria permitir o uso de doses reduzidas de ativadores do receptor de eritropoetina.
[009] Sumário da invenção
[0010] Em parte, a descrição demonstra que os bloqueadores de GDF podem ser usados em combinação (por exemplo, administrado ao mesmo tempo ou em diferentes momentos, mas geralmente de tal modo que alcance os efeitos farmacológicos sobrepostos) com ativadores do receptor de EPO para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue (eritropoiese) ou tratar a anemia em pacientes que necessitem desse tratamento. Em parte, a descrição demonstra que um bloqueador de GDF pode ser administrado em combinação com um ativador do receptor de EPO para aumentar de modo sinérgico a formação de células vermelhas do sangue em um paciente. Deste modo, o efeito deste tratamento combinado pode ser significantemente maior do que a soma dos efeitos do bloqueador de GDF e do ativador do receptor de EPO quando administrado separadamente em suas respectivas doses. Em determinadas modalidades, este sinergismo pode ser vantajoso desde que possibilite que os níveis alvo de células vermelhas do sangue sejam atingidos com doses menores de um ativador do receptor de EPO, evitando, assim, os efeitos adversos potenciais ou problemas associados a níveis maiores de ativação do receptor de EPO.
[0011] Um ativador do receptor de EPO pode estimular a eritropoiese mediante o contato e ativação de modo direto do receptor de EPO. Em determinadas modalidades, o ativador do receptor de EPO consiste em um de uma classe de compostos com base na sequência de aminoácido 165 de EPO nativo e geralmente conhecido como agentes estimulantes de eritropoiese (ESAs), cujos exemplos consistem em epoetina alfa, epoetina beta, epoetina delta e epoetina ômega. Em outras modalidades, os ESAs incluem as proteínas de EPO sintéticas (SEPs) e derivados de EPO com modificações não peptídicas que conferem propriedades farmacocinéticas desejáveis (meia-vida circulante prolongada), cujos exemplos consistem em darbepoetina alfa e metoxi-polietileno-glicol epoetina beta. Em determinadas modalidades, um ativador do receptor de EPO pode consistir em um agonista do receptor de EPO que não incorpora a cadeia principal de polipeptídeo de EPO ou não é classificado como um ESA. Tal agonista do receptor de EPO pode incluir, mas não se limita a, miméticos peptídicos e não peptídicos de EPO, receptor de EPO direcionado a anticorpos agonistas, proteínas de fusão que compreendem um domínio mimético de EPO, e agonistas limitados de duração prolongada do receptor de eritropoetina (EREDLA).
[0012] Em determinadas modalidades, um ativador do receptor de EPO pode estimular a eritropoiese de forma indireta, sem o contato do próprio receptor de EPO, mediante a otimização da produção de EPO endógeno. Por exemplo, os fatores de transcrição induzíveis por hipoxia (HIFs) consistem em estimuladores endógenos da expressão de gene de EPO que são suprimidos (desestabilizados) sob condições normóxicas por meio de mecanismos reguladores celulares. Em parte, a descrição fornece a eritropoiese aumentada em um paciente por meio do tratamento combinado com um bloqueador de GDF e um ativador do receptor de EPO indireto com propriedades estabilizantes de HIF, tal como um inibidor de prolil hidroxilase.
[0013] Os polipeptídeos de ActRIIB variantes que tem uma afinidade significantemente diminuída por ativina (por exemplo, ativina A e/ou ativina B) em relação a outros ligantes de ActRIIB, tais como GDF11 e/ou miostatina, são mencionados como bloqueadores de GDF. As variantes de ActRIIB descritas no presente documento consistem em bloqueadores de GDF, exceto onde indicado em contrário. Em particular, a descrição demonstra que um bloqueador de GDF, o qual consiste em uma forma solúvel de polipeptídeo de ActRIIB que tem um resíduo ácido na posição 79 de SEQ ID NO: 1, quando administrado in vivo, aumenta os níveis de célula vermelha do sangue no sangue. Portanto, em determinadas modalidades, a descrição fornece métodos para o uso de bloqueadores de GDF para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina em pacientes e para tratar os distúrbios associados a baixos níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina em pacientes que necessitem desse tratamento. Conforme descrito no pedido de patente U.S. no. 12/012.652, aqui incorporado a título de referência, os bloqueadores de GDF podem ser usados para aumentar a massa muscular e diminuir a massa de gordura.
[0014] Em determinados aspectos, a presente descrição fornece bloqueadores de GDF que consistem em polipeptídeos de ActRIIB variantes, que incluem polipeptídeos de ActRIIB que tem alterações de sequência e truncamentos amino- e carboxi-terminal. Opcionalmente, os bloqueadores de GDF da invenção podem ser projetados para antagonizar de maneira preferencial um ou mais ligantes do receptores de ActRIIB, tais como GDF8 (também chamado miostatina), GDF11, Nodal, e BMP7 (também chamado OP-1). Os exemplos de bloqueadores de GDF incluem um conjunto de variantes derivadas a partir de ActRIIB que têm afinidade por ativina muito reduzida. Estas variantes exibem efeitos desejáveis sobre células vermelhas do sangue, enquanto reduzem os efeitos sobre outros tecidos. Os exemplos de tais variantes incluem aquelas que têm um aminoácido ácido (por exemplo, ácido aspártico, D, ou ácido glutâmico, E) na posição que corresponde à posição 79 de SEQ ID NO.1. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo bloqueador de GDF compreende uma sequência de aminoácido que compreende, consiste em ou consiste essencialmente na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, 26, 28, 29, 32, 37 ou 38, e polipeptídeos que são ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticos a qualquer um dentre os mencionados acima.
[0015] Em determinados aspectos, a descrição fornece preparações farmacêuticas que compreendem um bloqueador de GDF que se liga a um ligante de ActRIIB, tal como GDF8, GDF11, ativina (por exemplo, ativina B), BMP7 ou nodal, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, o bloqueador de GDF se liga a um ligante de ActRIIB com um Kd menor que 10 micromolar, menor que 1 micromolar, menor que 100 nanomolar, menor que 10 nanomolar ou menor que 1 nanomolar. Opcionalmente, o bloqueador de GDF inibe a sinalização de ActRIIB, tal como eventos de transdução de sinal intracelular disparados por um ligante de ActRIIB. Um bloqueador de GDF para o uso em tal preparação pode consistir em qualquer um dentre aqueles apresentados no presente documento, que incluem, por exemplo, os bloqueadores de GDF que têm uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 ou 40, ou bloqueadores de GDF que têm uma sequência de aminoácido que é ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 ou 40, ou bloqueadores de GDF que têm uma sequência de aminoácido que é ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 ou 40, em que a posição que corresponde a L79 na SEQ ID NO: 1 consiste em um aminoácido ácido. Um bloqueador de GDF preferido para o uso em tal preparação consiste, ou consiste essencialmente, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26. Um bloqueador de GDF pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo de ActRIIB natural, tal como um que compreende ao menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 ou 40 ou uma sequência de SEQ ID NO: 2, desprovida de 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 a 15 aminoácidos do terminal C e desprovida de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos no término N. Um polipeptídeo preferido irá compreender um truncamento em relação à SEQ ID NO: 2 ou 40 de entre 2 e 5 aminoácidos no término N e não mais que 3 aminoácidos no término C. Um bloqueador de GDF pode incluir uma ou mais alterações na sequência de aminoácido de um polipeptídeo de ActRIIB (por exemplo, no domínio de ligação de ligante) em relação a um polipeptídeo de ActRIIB de ocorrência natural. A alteração na sequência de aminoácido pode, por exemplo, alterar a glicosilação do polipeptídeo quando produzido em um mamífero, inseto ou outra célula eucariótica ou alterar a clivagem proteolítica do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de ActRIIB de ocorrência natural.
[0016] Um bloqueador de GDF pode consistir em uma proteína de fusão que tem, como um domínio, um polipeptídeo de ActRIIB (por exemplo, um domínio de ligação de ligante de um ActRIIB com uma ou mais variações de sequência) e um ou mais domínios adicionais que fornecem uma propriedade desejável, tal como farmacocinética aperfeiçoada, purificação mais fácil, direcionada a tecidos particulares, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fusão pode otimizar um ou mais dentre estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, multimerização da proteína de fusão e/ou purificação. As proteínas de fusão de bloqueador de GDF podem incluir um domínio Fc de imunoglobulina (do tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica. Em determinadas modalidades, uma fusão de bloqueador de GDF compreende uma ligação relativamente não estruturada posicionada entre o domínio de Fc e o domínio de ActRIIB extracelular. Esta ligação não estruturada pode corresponder à região não estruturada próxima ao aminoácido 15 na extremidade do terminal C do domínio extracelular de ActRIIB (a “cauda”), ou pode consistir em uma sequência artificial de entre 3 e 5, 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente livres de estrutura secundária. Uma ligação pode ser rica em resíduos de glicina e prolina e pode, por exemplo, conter sequências de repetição de treonina/serina e glicinas (por exemplo, singletos ou repetições de TG4 (SEQ ID NO: 13) ou SG4 (SEQ ID NO: 14)) ou uma série de três glicinas. Uma proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta FLAG, uma sequência de polihistidina, e uma fusão de GST. Em determinadas modalidades, uma fusão de bloqueador de GDF compreende uma sequência líder. A sequência líder pode consistir em uma sequência líder de ActRIIB nativo ou uma sequência líder heteróloga. Em determinadas modalidades, a sequência líder consiste em uma sequência líder de ativador de plasminogênio de tecido (TPA). Em uma modalidade, uma proteína de fusão de bloqueador de GDF compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentado na fórmula A-B-C. A parte B consiste em um polipeptídeo de ActRIIB com truncamento de terminal N e C que consiste na sequência de aminoácido que corresponde a aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 2 ou 40. As partes A e C podem ser independentemente zero, um ou mais que um aminoácido, e tanto a parte A como C são heterólogas a B. As partes A e/ou C podem ser fixadas à parte B através de uma sequência de ligação.
[0017] Opcionalmente, um bloqueador de GDF inclui um polipeptídeo de ActRIIB variante que tem um ou mais resíduos de aminoácido modificados selecionados a partir de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinailado, um aminoácido conjugado a uma porção de lipídeo, e um aminoácido conjugado a um agente de derivação orgânica. Uma preparação farmacêutica também pode incluir um ou mais compostos adicionais, tais como um composto que é usado para tratar um distúrbio associado a ActRIIB. Prefere-se que uma preparação farmacêutica seja substancialmente livre de pirogênio. Em geral, prefere-se que um bloqueador de GDF seja expresso em uma linha de célula de mamífero que media a glicosilação adequadamente natural do bloqueador de GDF, a fim de diminuir a probabilidade de uma resposta imune desfavorável em um paciente. As linhas de célula CHO e humanas têm sido usadas com êxito e espera-se que outros vetores de expressão de mamífero comuns sejam úteis.
[0018] Em determinados aspectos, a descrição fornece produtos farmacêuticos embalados que compreendem uma preparação farmacêutica descrita no presente documento e rotulados para o uso no aumento de níveis de célula vermelha do sangue em um humano.
[0019] Em determinados aspectos, a descrição fornece bloqueadores de GDF que consistem em polipeptídeos de ActRIIB solúveis que compreendem um domínio de ligação de alterado (por exemplo, ligação de GDF8). Os bloqueadores de GDF com domínios de ligação de ligante alterados podem compreender, por exemplo, uma ou mais mutações em resíduos de aminoácido, tal como E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 e F101 de ActRIIB humano (a numeração é em relação a SEQ ID NO: 1). Opcionalmente, o domínio de ligação de ligante alterado pode ter seletividade aumentada para um ligante, tal como GDF8/GDF11 em relação a um domínio de ligação de ligante do tipo selvagem de um receptor de ActRIIB. Para ilustrar, estas mutações são demonstradas no presente documento para aumentar a seletividade do domínio de ligação de ligante alterado para GDF11 (e, portanto, presumidamente, GDF8) sobre ativina: K74Y, K74F, K74I, L79D, L79E e D80I . As seguintes mutações têm o efeito inverso, aumentando a razão de ligação de ativina sobre GDF11: D54A, K55A, L79A e F82A. A atividade de ligação geral (GDF11 e ativina) pode ser aumentada mediante a inclusão da região de “cauda” ou, presumidamente, uma região de ligação não estruturada, e também mediante o uso de uma mutação de K74A. Outras mutações que causam uma diminuição geral na afinidade de ligação de ligante, incluem: R40A, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M e D80N. As mutações podem ser combinadas para alcançar os efeitos desejados. Por exemplo, muitas das mutações que afetam a razão de ligação de GDF11:Ativina têm um efeito negativo geral sobre a ligação de ligante e, portanto, estas podem ser combinadas com as mutações que geralmente aumentam a ligação de ligante para produzir uma proteína de ligação aperfeiçoada com seletividade de ligante. Em uma modalidade exemplificadora, um bloqueador de GDF consiste em um polipeptídeo de ActRIIB que compreende uma mutação de L79D ou L79E, opcionalmente, em combinação com substituições, adições ou deleções de aminoácido adicionais.
[0020] Opcionalmente, um bloqueador de GDF que compreende um domínio de ligação de ligante alterado tem uma razão de Kd para ligação de ativina para Kd para ligação de GDF8 que é ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes maior em relação à razão para o domínio de ligação de ligante do tipo selvagem. Opcionalmente, o bloqueador de GDF que compreende um domínio de ligação de ligante alterado tem uma razão de IC50 para inibição de ativina para IC50 para inibição de GDF8/GDF11 que é ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes maior em relação ao domínio de ligação de ligante de ActRIIB do tipo selvagem. Opcionalmente, o bloqueador de GDF que compreende um domínio de ligação de ligante alterado inibe o GDF8/GDF11 com um IC50 ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes menor do que o IC50 para inibição de ativina. Estes bloqueadores de GDF podem consistir em proteínas de fusão que incluem um domínio de Fc de imunoglobulina (do tipo selvagem ou mutante). Em determinados casos, os presentes bloqueadores de GDF solúveis são antagonistas (inibidores) de GDF8 e/ou GDF11.
[0021] Outros bloqueadores de GDF são considerados, tais como os seguintes. Uma proteína de fusão de bloqueador de GDF que compreende uma parte derivada a partir da sequência de ActRIIB de SEQ ID NO: 1 ou 39 e uma segunda parte de polipeptídeo, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 21 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 (opcionalmente, que começa em 22 a 25 de SEQ ID NO: 1 ou 39) e que termina em qualquer um dos aminoácidos 109 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39, e em que a proteína de fusão de bloqueador de GDF inibe a sinalização por ativina, miostatina e/ou GDF11 em um ensaio à base de célula. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 (opcionalmente, que começa em 22 a 25 de SEQ ID NO: 1 ou 39) e que termina em qualquer um dos aminoácidos 109 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 (opcionalmente, que começa em 22 a 25 de SEQ ID NO: 1 ou 39) e que termina em qualquer um dos aminoácidos 109 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 21 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 109 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 118 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 21 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 118 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 128 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 128 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 21 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 118 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 118 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 21 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 128 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39. A proteína de fusão de bloqueador de GDF acima, em que a parte derivada a partir de ActRIIB corresponde a uma sequência que começa em qualquer um dos aminoácidos 20 a 29 de SEQ ID NO: 1 e que termina em qualquer um dos aminoácidos 128 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Surpreendentemente, as construções que começam em 22 a 25 de SEQ ID NO: 1 ou 39 têm níveis de atividade maiores do que as proteínas que têm o completo domínio extracelular de ActRIIB humano. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão de bloqueador de GDF compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, uma sequência de aminoácido que começa na posição de aminoácido 25 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina na posição de aminoácido 131 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Em outras modalidades preferidas, o polipeptídeo bloqueador de GDF consiste, ou consiste essencialmente, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, 26, 28, 29, 32, 37 ou 38. Qualquer uma das proteínas de fusão de bloqueador de GDF acima pode ser produzida como um homodímero. Qualquer uma das proteínas de fusão de bloqueador de GDF acima pode ter uma parte heteróloga que compreende uma região constante a partir de uma cadeia pesada de IgG, tal como um domínio de Fc. Qualquer uma das proteínas de fusão de bloqueador de GDF acima pode compreender um aminoácido ácido na posição que corresponde à posição 79 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente, em combinação com uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido adicionais em relação a SEQ ID NO: 1.
[0022] Outras proteínas de bloqueador de GDF são consideradas, tais como as seguintes. Uma proteína de bloqueador de GDF que compreende uma sequência de aminoácido que é ao menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos 29 a 109 de SEQ ID NO: 1 ou 39, em que a posição que corresponde a 64 de SEQ ID NO: 1 é um R ou K, e em que a proteína de bloqueador de GDF inibe a sinalização por ativina, miostatina e/ou GDF11 em um ensaio à base de célula. A proteína de bloqueador de GDF acima, em que ao menos uma alteração em relação à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 39 é posicionada fora da bolsa de ligação de ligante. A proteína de bloqueador de GDF acima, em que ao menos uma alteração em relação à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 39 consiste em uma alteração conservadora posicionada dentro da bolsa de ligação de ligante. A proteína de bloqueador de GDF acima, em que ao menos uma alteração em relação à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 39 consiste em uma alteração em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em K74, R40, Q53, K55, F82 e L79. A proteína de bloqueador de GDF acima, em que a proteína compreende ao menos uma sequência N-X-S/T em uma posição além de uma sequência N-X-S/T endógena de ActRIIB e uma posição fora da bolsa de ligação de ligante.
[0023] Outros bloqueadores de GDF são considerados, tais como os seguintes. Uma proteína de bloqueador de GDF que compreende uma sequência de aminoácido que é ao menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos 29 a 109 de SEQ ID NO: 1 ou 39, e em que a proteína compreende ao menos uma sequência N- X-S/T em uma posição além de uma sequência N-X-S/T endógena de ActRIIB, e em uma posição fora da bolsa de ligação de ligante. O bloqueador de GDF acima, em que a proteína de bloqueador de GDF compreende um N na posição que corresponde uma posição 24 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e um S ou T na posição que corresponde à posição 26 de SEQ ID NO: 1 ou 39, e em que o bloqueador de GDF inibe a sinalização por ativina, miostatina e/ou GDF11 em um ensaio à base de célula. O bloqueador de GDF acima, em que a proteína de bloqueador de GDF compreende um R ou K na posição que corresponde à posição 64 de SEQ ID NO: 1 ou 39. O bloqueador de GDF acima, em que a proteína de ActRIIB compreende um D ou E na posição que corresponde à posição 79 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e em que o bloqueador de GDF inibe a sinalização por ativina, miostatina e/ou GDF11 em um ensaio à base de célula. O bloqueador de GDF acima, em que ao menos uma alteração em relação à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 39 consiste em uma alteração conservadora posicionada dentro da bolsa de ligação de ligante. O bloqueador de GDF acima, em que ao menos uma alteração em relação à sequência de SEQ ID NO: 1 ou 39 consiste em uma alteração em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em K74, R40, Q53, K55, F82 e L79. O bloqueador de GDF acima, em que a proteína consiste em uma proteína de fusão que compreende, adicionalmente, uma parte heteróloga. Qualquer uma das proteínas de fusão de bloqueador de GDF acima pode ser produzida como um homodímero. Qualquer uma das proteínas de fusão de bloqueador de GDF acima pode ter uma parte heteróloga que compreende uma região constante a partir de uma cadeia pesada de IgG, tal como um domínio de Fc.
[0024] Em determinados aspectos, a descrição fornece ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo bloqueador de GDF. Um polinucleotídeo isolado pode compreender uma sequência de codificação para um polipeptídeo bloqueador de GDF solúvel, tal como descrito acima. Por exemplo, um isolado ácido nucléico pode incluir uma codificação de sequência para um bloqueador de GDF que compreende um domínio extracelular (por exemplo, domínio de ligação de ligante) de um polipeptídeo de ActRIIB que tem uma ou mais variações de sequência e uma sequência que codificaria para parte ou todo o domínio de transmembrana e/ou o domínio citoplasmático de um polipeptídeo de ActRIIB, mas para um códon de parada posicionado dentro do domínio de transmembrana ou do domínio citoplasmático, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio de transmembrana ou domínio citoplasmático. Por exemplo, uma codificação de polinucleotídeo isolado para um bloqueador de GDF pode compreender uma sequência de polinucleotídeo de ActRIIB completa, tal como SEQ ID NO: 4 que tem uma ou mais variações, ou uma versão parcialmente truncada, o dito polinucleotídeo isolado que compreende, adicionalmente, um códon de término de transcrição ao menos seiscentos nucleotídeos antes do término 3’ ou de outra forma posicionado de tal modo que a translação do polinucleotídeo ocasione um domínio extracelular opcionalmente fundido a uma parte truncada de um ActRIIB completo. Os ácidos nucléicos apresentados no presente documento podem ser ligados de maneira operável a um promotor para expressão, e a descrição fornece células transformadas com tais polinucleotídeos recombinantes. Prefere-se que a célula consista em uma célula de mamífero, tal como uma célula de CHO.
[0025] Em determinados aspectos, a descrição fornece métodos para a fabricação de um polipeptídeo bloqueador de GDF. Tal método pode incluir a expressão de qualquer um dentre os ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31) apresentados no presente documento em uma célula adequada, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Tal método pode compreender: a) cultivar uma célula sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo bloqueador de GDF, em que a dita célula é transformada com uma construção de expressão de bloqueador de GDF; e b) recuperar o polipeptídeo bloqueador de GDF assim expresso. Os polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser recuperados como frações brutas, parcialmente purificadas ou altamente purificadas com o uso de qualquer uma das técnicas bem conhecidas para a obtenção de proteína a partir de culturas de célula.
[0026] Em determinados aspectos, um polipeptídeo bloqueador de GDF apresentado no presente documento pode ser usado em um método para promover a produção de célula vermelha do sangue ou aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a descrição fornece métodos para o tratamento de um distúrbio associado a baixas contagens de célula vermelha do sangue ou baixos níveis de hemoglobina (por exemplo, uma anemia), ou para promover a produção de célula vermelha do sangue, em pacientes que necessitem desse tratamento. Um método pode compreender a administração, a um indivíduo que necessite desse tratamento, de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo bloqueador de GDF. Em determinados aspectos, a descrição fornece usos de polipeptídeos de bloqueador de GDF para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou condição, conforme descrito no presente documento.
[0027] Em determinados aspectos, a descrição fornece métodos para administração de um polipeptídeo bloqueador de GDF a um paciente. Em parte, a descrição demonstra que os polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina. Os polipeptídeos de bloqueador de GDF também podem ser usados para o tratamento ou prevenção de outros usos terapêuticos, tais como promover crescimento muscular. Em determinados casos, quando se administra um polipeptídeo bloqueador de GDF para promover o crescimento muscular, pode ser desejável monitorar os efeitos sobre as células vermelhas do sangue durante a administração do polipeptídeo bloqueador de GDF, ou determinar ou ajustar a dosagem do polipeptídeo bloqueador de GDF, a fim de reduzir os efeitos indesejados sobre as células vermelhas do sangue. Por exemplo, os aumentos em níveis de célula vermelha do sangue, níveis de hemoglobina, ou níveis de hematócrito podem causar aumentos na pressão sanguínea.
Breve descrição dos desenhos
[0028] O arquivo de pedido ou patente contém ao menos um desenho executado em cores. As cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) colorido(s) será fornecida pelo escritório sob a solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0029] A Figura 1 mostra um alinhamento dos domínios extracelulares de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 15) e ActRIIB humano (SEQ ID NO: 2) com os resíduos que são deduzidos no presente documento, com base na análise composta de múltiplas estruturas de cristal de ActRIIB e ActRIIA para entrar em contato diretamente com o ligante (a bolsa de ligação de ligante) indicado com caixas.
[0030] A Figura 2 mostra um múltiplo alinhamento de sequência de diversas proteínas de ActRIIB de vertebrado e ActRIIA humano (SEQ ID NOs: 16 a 23).
[0031] A Figura 3 mostra a sequência de aminoácido completa para o ActRIIB(L79D 20-134)-hFc bloqueador de GDF (SEQ ID NO: 11), que inclui a sequência líder de TPA (duplamente sublinhada), domínio extracelular de ActRIIB (resíduos 20 a 134 em SEQ ID NO: 1; sublinhado), e domínio de hFc. O aspartato substituído na posição 79 na sequência nativa é duplamente sublinhado e realçado, conforme é a glicina revelada pela sequenciação para ser o resíduo de terminal N na proteína de fusão madura.
[0032] A Figura 4 mostra uma sequência de nucleotídeo que codifica ActRIIB(L79D 20 a 134)-hFc. A SEQ ID NO: 25 corresponde à fita senso, e a SEQ ID NO: 33 corresponde á fita antisenso. O líder de TPA (nucleotídeos 1 a 66) é duplamente sublinhado e o domínio extracelular de ActRIIB (nucleotídeos 76 a 420) é sublinhado.
[0033] A Figura 5 mostra a sequência de aminoácido completa para o ActRIIB(L79D 25-131)-hFc bloqueador de GDF truncado (SEQ ID NO: 26), que inclui o líder de TPA (duplamente sublinhado), domínio extracelular de ActRIIB truncado (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1; sublinhado), e domínio de hFc. O aspartato substituído na posição 79 na sequência nativa é duplamente sublinhado e realçado, conforme é o glutamato revelado pela sequenciação para ser o resíduo de terminal N na proteína de fusão madura.
[0034] A Figura 6 mostra uma sequência de nucleotídeo que codifica ActRIIB(L79D 25 a 131)-hFc. A SEQ ID NO: 27 corresponde à fita senso, e a SEQ ID NO: 34 corresponde à fita antisenso. O líder de TPA (nucleotídeos 1 a 66) é duplamente sublinhado e o domínio extracelular de ActRIIB truncado (nucleotídeos 76 a 396) é sublinhado. A sequência de aminoácido para o domínio extracelular de ActRIIB (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) também é mostrada.
[0035] A Figura 7 mostra a sequência de aminoácido para o ActRIIB(L79D 25 a 131)-hFc bloqueador de GDF sem um líder (SEQ ID NO: 28). O domínio extracelular de ActRIIB truncado (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) é sublinhado. O aspartato substituído na posição 79 na sequência nativa é duplamente sublinhado e realçado, conforme é o glutamato revelado pela sequenciação para ser o resíduo de terminal N na proteína de fusão madura.
[0036] A Figura 8 mostra a sequência de aminoácido para o ActRIIB(L79D 25-131) bloqueador de GDF truncado sem o líder, domínio de hFc, e ligação (SEQ ID NO: 29). O aspartato substituído na posição 79 na sequência nativa é sublinhado e realçado, conforme é o glutamato revelado pela sequenciação para ser o resíduo de terminal N na proteína de fusão madura.
[0037] A Figura 9 mostra uma sequência de nucleotídeo alternativa que codifica ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. A SEQ ID NO: 30 corresponde à fita senso e a SEQ ID NO: 35 corresponde à fita antisenso. O líder de TPA (nucleotídeos 1 a 66) é duplamente sublinhado, o domínio extracelular de ActRIIB truncado (nucleotídeos 76 a 396) é sublinhado e as substituições na sequência de nucleotídeo do tipo selvagem do domínio extracelular são duplamente sublinhadas e realçadas (compare com a SEQ ID NO: 27, Figura 6). A sequência de aminoácido para o domínio extracelular de ActRIIB (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) também é mostrada.
[0038] A Figura 10 mostra os nucleotídeos 76 a 396 (SEQ ID NO: 31) da sequência de nucleotídeo alternativa mostrada na Figura 9 (SEQ ID NO: 30). As mesmas substituições de nucleotídeo indicadas na Figura 9 também são aqui sublinhadas e realçadas. A SEQ ID NO: 31 codifica somente o domínio extracelular de ActRIIB truncado (que corresponde aos resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) com uma substituição de L79D, por exemplo, ActRIIB(L79D 25-131).
[0039] A Figura 11 mostra o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre a concentração de hemoglobina em um modelo de camundongo de anemia induzida por quimioterapia. Os dados consistem em ± SEM médio. **, P < 0,01 versus paclitaxel no mesmo ponto no tempo. Este bloqueador de GDF compensa a anemia induzida pelo tratamento de paclitaxel.
[0040] A Figura 12 mostra o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os níveis de célula vermelha do sangue (RBC) em um modelo de camundongo (NEPHX) de doença renal crônica submetido à nefrectomia de modo unilateral. Os dados consistem em ± SEM médio. ***, P < 0,001 versus linha de base. Este bloqueador de GDF reverteu a anemia induzida por nefrectomia observada em camundongos de controle.
[0041] A Figura 13 mostra o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os níveis de célula vermelha do sangue (RBC), hemoglobina (HGB) e hematócrito (HCT) em um modelo de camundongo (NEPHX) de doença renal crônica submetido à nefrectomia de modo unilateral. Os dados consistem em mudanças médias a partir da linha de base durante 4 semanas (± SEM). *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001 versus controles de NEPHX. Este bloqueador de GDF evitou o declínio associado à nefrectomia nestes parâmetros eritrocíticos, aumentando cada um por uma magnitude similar àquela em camundongos com rim intato (simulado).
[0042] A Figura 14 mostra o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os níveis de célula vermelha do sangue (RBC) em um modelo de rato de anemia induzida por perda sanguínea aguda. A remoção de sangue ocorreu no dia 1, com dosagem no dia 0 e 3. Os dados consistem em ± SEM médio. **, P < 0,01; ***, P < 0,001 versus veículo no mesmo ponto no tempo. Este bloqueador de GDF aperfeiçoou a taxa e extensão de recuperação da anemia induzida por perda de sangue.
[0043] A Figura 15 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB(L79D 20-134)- hFc (cinza) ou ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (preto) sobre a mudança absoluta na concentração de célula vermelha do sangue a partir da linha de base em macaco cynomolgus. VEH = veículo. Os dados consistem em ± SEM. n = 4 a 8 por grupo.
[0044] A Figura 16 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB(L79D 20-134)- hFc (cinza) ou ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (preto) sobre a mudança absoluta em hematócrito a partir da linha de base em macaco cynomolgus. VEH = veículo. Os dados consistem em ± SEM. n = 4 a 8 por grupo.
[0045] A Figura 17 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB(L79D 20-134)- hFc (cinza) ou ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (preto) sobre a mudança absoluta em concentração de hemoglobina a partir da linha de base em macaco cynomolgus. VEH = veículo. Os dados consistem em ± SEM. n = 4 a 8 por grupo.
[0046] A Figura 18 mostra o efeito do tratamento com ActRIIB(L79D 20-134)- hFc (cinza) ou ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (preto) sobre a mudança absoluta em concentração de reticulócito circulante a partir da linha de base em macaco cynomolgus. VEH = veículo. Os dados consistem em ± SEM. n = 4 a 8 por grupo.
[0047] A Figura 19 mostra o efeito do tratamento combinado com eritropoetina (EPO) e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc por 72 horas sobre hematócrito em camundongos. Os dados consistem em ± SEM médio (n = 4 por grupo), e as médias que são significantemente diferentes umas das outras (p < 0,05, teste t não pareado) são designadas por letras diferentes. O tratamento combinado aumentou o hematócrito por 23% comparado com o veículo, um aumento sinérgico maior do que a soma dos efeitos separados de EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc.
[0048] A Figura 20 mostra o efeito do tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc por 72 horas sobre as concentrações de hemoglobina em camundongos. Os dados consistem em ± SEM médio (n = 4 por grupo) e as médias que são significantemente diferentes umas das outras (p < 0,05) são designadas por letras diferentes. O tratamento combinado aumentou as concentrações de hemoglobina por 23% comparado com o veículo, o qual também consistiu em um efeito sinérgico.
[0049] A Figura 21 mostra o efeito do tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc por 72 horas sobre as concentrações de célula vermelha do sangue em camundongos. Os dados consistem em ± SEM médio (n = 4 por grupo) e as médias que são significantemente diferentes umas das outras (p < 0,05) são designadas por letras diferentes. O tratamento combinado aumentou as concentrações de célula vermelha do sangue por 20% comparado com o veículo, o qual também consistiu em um efeito sinérgico.
[0050] A Figura 22 mostra o efeito do tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc por 72 horas sobre os números de células precursoras eritropoéticas em baço de camundongo. Os dados consistem em ± SEM médio (n = 4 por grupo) e as médias que são significantemente diferentes umas das outras (p < 0,01) são designadas por letras diferentes. Enquanto a EPO sozinha aumentou o número de eritroblastos basofílicos (BasoE) dramaticamente à custa da maturação de precursor de último estágio, o tratamento combinado aumentou os números de BasoE para um inferior, mas a uma extensão ainda significante, enquanto suporta a maturação não reduzida de precursores de último estágio.
Descrição detalhada da invenção 1. Visão geral
[0051] A EPO é um hormônio de glicoproteína envolvido no crescimento e maturação de células progenitoras eritróides em eritrócitos. A EPO é produzido pelo fígado durante a vida fetal e pelo rim em adultos. A produção diminuída de EPO, a qual ocorre comumente em adultos como uma consequência da insuficiência renal, conduz à anemia. A EPO tem sido produzida por meio de técnicas de engenharia genética com base na expressão e secreção da proteína a partir de uma célula hospedeira transfectada com o gene de EPO. A administração de tal EPO recombinante tem sido eficaz no tratamento de anemia. Por exemplo, Eschbach et al. (1987, N Engl J Med 316:73) descrevem o uso de EPO para corrigir a anemia causada pela insuficiência renal crônica.
[0052] Os efeitos de EPO são mediados através de sua ligação a, e ativação de, um receptor de superfície de célula que pertence à superfamília do receptor de citocina e designa o receptor de EPO. Os receptores de EPO humano e de rato têm sido clonados e expressos (D’Andrea et al., 1989, Célula 57:277; Jones et al., 1990, Blood 76:31; Winkelman et al., 1990, Blood 76:24; WO 90/08822/patente U.S. no. 5.278.065). O gene do receptor de EPO humano codifica uma proteína de transmembrana de aminoácido 483 que compreende um domínio extracelular de aproximadamente 224 aminoácidos e exibe aproximadamente 82% de identidade de sequência de aminoácido com o receptor de EPO de rato (vide patente U.S. no. 6.319.499). O receptor de EPO completo clonado, expresso em células de mamíferos (66-72 kDa) liga EPO com uma afinidade (KD = 100-300 nM) similar àquela do receptor nativo em células progenitoras eritróides. Deste modo, acredita-se que esta forma contenha o principal determinante de ligação de EPO e é mencionada como o receptor de EPO. Por analogia com outros receptores de citocina em estreita relação, acredita-se que o receptor de EPO dimerize sob a ligação agonista. No entanto, a estrutura detalhada do receptor de EPO, a qual pode consistir em um complexo multimérico, e seu mecanismo específico de ativação não são completamente compreendidos (patente U.S. no. 6.319.499).
[0053] A ativação do receptor de EPO resulta em vários efeitos biológicos. Estes incluem a proliferação aumentada de eritroblastos imaturos, diferenciação aumentada de eritroblastos imaturos e apoptose diminuída em células progenitoras eritróides (Liboi et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury et al., 1990, Science 248:378-381). Os caminhos de transdução de sinal do receptor de EPO que mediam a proliferação e diferenciação parecem ser distintos (Noguchi et al., 1988, Mol Cell Biol 8:2604; Patel et al., 1992, J Biol Chem 1992, 267:21300; Liboi et al., ibid). Alguns resultados sugerem que uma proteína adicional possa ser exigida para a mediação do sinal de diferenciação (Chiba et al., 1993, Nature 362:646; Chiba et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11593); no entanto, há controvérsia em relação ao papel de proteínas adicionais na diferenciação, uma vez que uma forma ativada de modo constitutivo do receptor pode estimular tanto a proliferação como a diferenciação (Pharr et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:938).
[0054] Os ativadores do receptor de EPO incluem agentes estimulantes de eritropoiese (ESAs) de molécula pequena, assim como os compostos à base de EPO. Um exemplo do formador consiste em um agonista à base de peptídeo dimérico ligado de maneira covalente ao polietileno glicol (marca registrada Hematide), o qual tem mostrado propriedades estimulantes de eritropoiese em voluntários saudáveis e em pacientes com doença renal crônica e anticorpos endógenos anti-EPO (Stead et al., 2006, Blood 108:1830-1834; Macdougall et al., 2009, N Engl J Med 361:1848-1855). Outros exemplos incluem ESAs à base de não-peptídeo (Qureshi et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:12156-12161).
[0055] Os ativadores do receptor de EPO também incluem compostos que estimulam a eritropoiese de forma indireta, sem o contato do próprio receptor de EPO, mediante a otimização da produção de EPO endógeno. Por exemplo, os fatores de transcrição induzíveis por hipoxia (HIFs) consistem em estimulantes endógenos da expressão de gene de EPO que são suprimidos (desestabilizados) sob condições normóxicas por mecanismos reguladores celulares. Portanto, os inibidores de enzimas prolil hidroxilase HIF estão sendo investigados acerca da atividade de indução de EPO in vivo. Outros ativadores indiretos do receptor de EPO incluem os inibidores do fator de transcrição de GATA-2 (Nakano et al., 2004, Blood 104:43004307), os quais inibem de modo tônico a expressão de gene de EPO, e inibidores de fosfatase de célula hemopoética (HCP ou SHP-1), que funciona como um regulador negativo da transdução de sinal do receptor de EPO (Klingmuller et al., 1995, Célula 80:729-738).
[0056] A superfamília de fator-beta de crescimento de transformação (TGF- beta) contém uma variedade de fatores de crescimento que compartilham elementos de sequência e motivos estruturais comuns. Estas proteínas são conhecidas por exercerem efeitos biológicos sobre uma grande variedade de tipos de célula tanto m vertebrados como em invertebrados. Os membros da superfamília executam funções importantes durante o desenvolvimento embriônico na formação de padrão e especificação de tecido e podem influenciar uma variedade de processos de diferenciação, que incluem adipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogênese, hematopoese, neurogênese e diferenciação de célula epitelial. A família é dividida em duas ramificações gerais: as ramificações de BMP/GDF e TGF-beta/Ativina/BMP10, cujos membros têm efeitos variados e muitas vezes complementares. Mediante a manipulação da atividade de um membro da família TGF-beta, é muitas vezes possível causar mudanças fisiológicas significantes em um organismo. Por exemplo, as raças de gado Piedmontese e Belgian Blue carregam uma mutação de perda de função no gene GDF8 (também chamado miostatina) que causa uma aumento marcado em massa muscular. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Adicionalmente, em humanos, os alelos inativos de GDF8 estão associados à massa muscular aumentada e, de acordo com o relatado, força excepcional. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
[0057] Os sinais de TGF-β são mediados por complexos heteroméricos dos receptores de serina/treonina quinase do tipo I e tipo II, os quais fosforilam e ativam as proteínas Smad a jusante sob estimulação de ligante (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Célula Biol. 1:169-178). Estes receptores do tipo I e tipo II consistem em proteínas de transmembrana, compostos de um domínio extracelular de ligante- ligação com região rica em cisteína, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático com especificidade de serina/treonina prevista. Os receptores do tipo I são essenciais para a sinalização. Os receptores do tipo II são exigidos para a ligação de ligantes e para expressão do receptores do tipo I. Os receptores de ativina do tipo I e II formam um complexo estável após a ligação de ligante, resultando na fosforilação do receptores do tipo I por receptores do tipo II.
[0058] Dois receptores do tipo II relacionados (ActRII), ActRIIA e ActRIIB, têm sido identificados como os receptores do tipo II para ativinas (Mathews e Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, ActRIIA e ActRIIB podem interagir bioquimicamente com várias outras proteínas da família TGF- β, que incluem BMP7, Nodal, GDF8 e GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee e McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo e Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 consiste no receptor do tipo I primário para ativinas, particularmente, para ativina A, e ALK-7 pode servir como um receptor para ativinas também, particularmente para ativina B. Em determinadas modalidades, a presente invenção se refere à antagonização de um ligante dos receptores de ActRIIB (também mencionado como um ligante de ActRIIB) com um presente polipeptídeo bloqueador de GDF. Os ligantes exemplificadores dos receptores de ActRIIB incluem alguns membros da família TGF- β, tais como ativina, Nodal, GDF8, GDF11 e BMP7.
[0059] As ativinas consistem em fatores de crescimento de polipeptídeo dimérico que pertencem à superfamília TGF-beta. Estas são as três formas principais de ativina (A, B e AB) que são homo/heterodímeros de duas subunidades β em estreita relação (βAβA, βBβB e βAβB, respectivamente). O genoma humano também codifica uma ativina C e uma ativina E, as quais são expressas principalmente no fígado, e as formas heterodiméricas que contêm βC ou βE também são conhecidas. Na superfamília TGF-beta, as ativinas são fatores únicos e multifuncionais que podem estimular a produção de hormônio em células do ovário e de placenta, suportam a sobrevivência de célula neuronal, influenciam o progresso do ciclo de célula de forma positiva ou negativa dependendo do tipo de célula e induzem a diferenciação mesodérmica ao menos em embriões anfíbios (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Além disso, descobriu-se que o fator de diferenciação eritróide (EDF) isolado a partir de células leucêmicas monocíticas de humano estimuladas é idêntico à ativina A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Tem sido sugerido que a ativina A promove eritropoiese na medula óssea. Em vários tecidos, a sinalização de ativina é antagonizada por seu heterodímero relacionado, inibina. Por exemplo, durante a liberação de hormônio estimulante de folículo (FSH) a partir da glândula pituitária, a ativina promove a secreção e síntese de FSH, enquanto a inibina evita a secreção e síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade de ativina e/ou se ligar à ativina incluem a folistatina (FS), proteína relacionada à folistatina (FSRP) e α2-macroglobulina.
[0060] As proteínas Nodal têm funções na indução e formação de mesoderma e endoderma, assim como a organização subsequente de estruturas axiais, tais como coração e estomago em embriogênese primária. Tem sido demonstrado que o tecido dorsal em um embrião de vertebrado em desenvolvimento contribui predominantemente para as estruturas axiais da placa de notocorda e pré- cordal, enquanto recruta as células circundantes para formar estruturas embriônicas não-axiais. A nodal parece sinalizar através tanto dos receptores do tipo I como de tipo II e efetores intracelulares conhecidos como proteínas Smad. Os recentes estudos apoiam a ideia de que ActRIIA e ActRIIB servem como receptores do tipo II para Nodal (Sakuma et al., Genes Cells. 2002, 7:401-12). Sugere-se que os ligantes de Nodal interagem com seus co-fatores (por exemplo, cripto) para ativar os receptores de ativina do tipo I e tipo II, os quais fosforilam Smad2. As proteínas nodal estão envolvidas em muitos eventos críticos para o embrião de vertebrado primário, que incluem formação de mesoderma, padronagem anterior e especificação de eixo esquerdo-direito. A evidência experimental tem demonstrado que a sinalização de Nodal ativa pAR3-Lux, um repórter de luciferase mostrado anteriormente por responder especificamente à ativina e TGF-beta. No entanto, Nodal é incapaz de induzir pTlx2-Lux, um repórter especificamente responsivo a proteínas morfogenéticas ósseas. Os resultados recentes fornecem evidência bioquímica direta que a sinalização de Nodal é mediada por caminhos de ativina-TGF-beta Smads, Smad2 e Smad3. A evidência adicional tem mostrado que a proteína de cripto extracelular é exigida para a sinalização de Nodal, tornando isto diferente da sinalização de ativina ou TGF-beta.
[0061] O fator de crescimento e diferenciação 8 (GDF8) também é conhecido como miostatina. O GDF8 consiste em um regulador negativo de massa muscular esquelética. O GDF8 é altamente expresso no desenvolvimento e músculo esquelético adulto. A mutação nula GDF8 em camundongos transgênicos é caracterizada por uma hipertrofia e hiperplasia marcada do músculo esquelético (McPherron et al., Nature, 1997, 387:83-90). Os aumentos similares em massa muscular esquelética são evidentes em mutações de ocorrência natural de GDF8 em gado (Ashmore et al., 1974, Growth, 38:501-507; Swatland e Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:1245712461; e Kambadur et al., Genome Res., 1997, 7:910-915) e, visivelmente, em humanos (Schuelke et al., N Engl J Med 2004;350:2682-8). Os estudos também têm mostrado que o desgaste muscular associado à infecção de HIV em humanos é acompanhado por aumentos na expressão de proteína de GDF8 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS, 1998, 95:14938-43). Além disso, o GDF8 pode modular a produção de enzimas específicas de músculo (por exemplo, creatina quinase) e modulam a proliferação celular mioblasto (WO 00/43781). O propeptídeo GDF8 pode ligar de maneira não-covalente ao dímero de domínio de GDF8 maduro, inativando sua atividade biológica (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; e Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Outras proteínas que ligam a GDF8 ou proteínas relacionadas de forma estrutural e inibem sua atividade biológica incluem folistatina e, potencialmente, proteínas relacionadas à folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232).
[0062] O fator de crescimento e diferenciação 11 (GDF11), também conhecido como BMP11, consiste em uma proteína secretada (McPherron et al., 1999, Nat. Genet. 22: 260-264). O GDF11 é expresso no broto caudal, broto do membro, arcos maxilar e mandibular, e gânglio da raiz dorsal durante o desenvolvimento do camundongo (Nakashima et al., 1999, Mech. Dev. 80: 185-189). O GDF11 desempenha um papel único na padronagem tanto de tecidos mesodérmicos como neurais (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). O GDF11 mostrou-se ser um regulador negativo de condrogênese e miogênese no desenvolvimento do broto do pinto (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407-20). A expressão de GDF11 no músculo sugere seu papel na regulação do crescimento muscular de uma maneira similar ao GDF8. Além disso, a expressão de GDF11 no cérebro sugere que o GDF11 também pode possuir atividades que se relacionam com a função do sistema nervoso. De forma interessante, descobriu-se que o GDF11 inibe a neurogênese no epitélio do olfato (Wu et al., 2003, Neuron. 37:197-207). Por conseguinte, o GDF11 pode ter aplicações in vitro e in vivo no tratamento de doenças, tais como doenças musculares e doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica).
[0063] A proteína morfogenética óssea (BMP7), também chamada proteína- 1 osteogênica (OP-1), é bem conhecida por induzir a formação de cartilagem e osso. Além disso, a BMP7 regula uma ampla ordem de processos fisiológicos. Por exemplo, a BMP7 pode consistir no fator osteoindutor responsável pelo fenômeno de osteogênese epitelial. Também descobriu-se que a BMP7 desempenha um papel na regulação de cálcio e homeóstase óssea. Semelhante à ativina, a BMP7 se liga a receptores do tipo II, ActRIIA e ActRIIB. No entanto, a BMP7 e ativina recrutam receptores do tipo I distintos em complexos do receptor heteroméricos. O principal receptor do tipo I de BMP7 observado foi ALK2, enquanto a ativina ligou-se exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). A BMP7 e ativina produziram respostas biológicas distintas e ativaram caminhos de Smad diferentes (Macias-Silva et al., 1998, J Biol Chem. 273:25628-36).
[0064] Conforme demonstrado no presente documento, um polipeptídeo bloqueador de GDF, o qual consiste em um polipeptídeo de ActRIIB variante (ActRIIB), é mais eficaz no aumento de níveis de célula vermelha do sangue in vivo, conforme comparado com um polipeptídeo de ActRIIB solúvel do tipo selvagem e tem efeitos benéficos em uma variedade de modelos para anemias. Adicionalmente, mostrou-se que o uso de um polipeptídeo bloqueador de GDF em combinação com um ativador do receptor de EPO causa um aumento substancial na formação de célula vermelha do sangue. Deve-se observar que a hematopoese consiste em um processo complexo, regulado por uma variedade de fatores, que incluem eritropoetina, G-CSF e homeóstase de ferro. Os termos “aumentar os níveis de célula vermelha do sangue” e “promover a formação de célula vermelha do sangue” se referem a medidas clinicamente observáveis, tais como contagens de hematócrito, célula vermelha do sangue e medições de hemoglobina, e são destinados a serem neutros como para o mecanismo por meio do qual tais mudanças ocorrem.
[0065] Em adição à estimulação de níveis de célula vermelha do sangue, os polipeptídeos de bloqueador de GDF são úteis para uma variedade de aplicações terapêuticas, que incluem, por exemplo, promover o crescimento muscular (vide publicação PCT nos. WO 2006/012627 e WO 2008/097541, as quais estão aqui incorporadas a título de referência, em suas totalidades). Em determinados casos, quando se administra um polipeptídeo bloqueador de GDF para o propósito de aumento de músculo, pode ser desejável reduzir ou minimizar os efeitos sobre as células vermelhas do sangue. Mediante o monitoramento de diversos parâmetros hematológicos em pacientes que são tratados com, ou que são candidatos para o tratamento com, um polipeptídeo bloqueador de GDF, a dosagem adequada (que inclui as quantidades e frequência de administração) pode ser determinada com base em uma necessidade individual do paciente, parâmetros hematológicos de linha de base e propósito para o tratamento. Adicionalmente, o progresso terapêutico e efeitos sobre um ou mais parâmetros hematológicos no decorrer do tempo pode ser útil no gerenciamento de pacientes que são dosados com um polipeptídeo bloqueador de GDF mediante a facilitação do cuidado com o paciente, a determinação de dosagem de manutenção adequada (tanto quantidades como frequência), etc.
[0066] Os termos usados neste relatório descritivo têm geralmente seus significados usuais na técnica, dentro do contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Determinados termos são discutidos abaixo ou em outro lugar no relatório descritivo, para fornecer orientação adicional para o profissional na descrição das composições e métodos da invenção e com fazer e usa- los. O escopo ou significado de qualquer uso de um termo será evidente a partir do contexto específico no qual o termo é usado.
[0067] “Cerca de” e “aproximadamente” deverão significar geralmente um grau de erro aceitável para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, os graus de erro exemplificadores estão dentro de 20 por cento (%), de preferência, dentro de 10% e, com mais preferência, dentro de 5% de um determinado valor ou faixa de valores.
[0068] Alternativamente e, em particular, nos sistemas biológicos, os termos “cerca de” e “aproximadamente” podem se referir a valores que estão dentro de uma ordem de magnitude, de preferência, dentro de 5 vezes e com mais preferência dentro de 2 vezes um valor determinado. As quantidades numéricas dadas aqui são aproximadas, exceto onde indicado em contrário, que significa que o termo “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser deduzido quando não expressamente indicado.
[0069] Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar as sequências umas com as outras, que incluem a sequência do tipo selvagem a um ou mais mutantes (variantes de sequências). Tais comparações compreendem tipicamente alinhamentos de sequências de polímero, por exemplo, com o uso de programas de alinhamento de sequência e/ou algoritmos que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, entre outros). O elemento versado na técnica pode observa prontamente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o alinhamento de sequência irá introduzir um “vão” (tipicamente representado por um traço ou “A”) na sequência de polímero que não contém o resíduo inserido ou deletado.
[0070] “Homólogo”, em todas as suas formas gramáticas e variações de ortografia, se refere à relação entre duas proteínas que possuem uma “origem evolucionária comum”, que incluem as proteínas a partir das superfamílias na mesma espécie de organismo, assim como as proteínas homólogas a partir de diferentes espécies de organismos. Tais proteínas (e seus ácidos nucleicos de codificação) têm homologia de sequência, conforme refletido pela sua similaridade de sequência, em termos de identidade por cento ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas.
[0071] O termo “similaridade de sequência”, em todas as suas formas gramaticais, se refere ao grau de identidade ou correspondência entre o ácido nucléico ou sequência de aminoácidos que podem ou não compartilhar uma origem evolucionária comum.
[0072] No entanto, no uso comum e na presente aplicação, o termo “homólogo”, quando modificado com um advérbio, tal como, “altamente”, pode se referir à similaridade de sequência e pode ou não se relacionar a uma origem evolucionária comum.
2. Polipeptídeos de bloqueador de GDF
[0073] Em determinados aspectos, a invenção se refere a polipeptídeos de bloqueador de GDF, por exemplo, os polipeptídeos de ActRIIB variantes solúveis, que incluem, por exemplo, fragmentos, variantes funcionais e formas modificadas de polipeptídeos de ActRIIB. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de bloqueador de GDF têm ao menos uma atividade biológica similar ou igual ao polipeptídeo de ActRIIB do tipo selvagem correspondente. Por exemplo, um polipeptídeo bloqueador de GDF da invenção pode se ligar a e inibir a função de um ligante de ActRIIB (por exemplo, ativina A, ativina AB, ativina B, Nodal, GDF8, GDF11 ou BMP7). Opcionalmente, um polipeptídeo bloqueador de GDF aumenta os níveis de célula vermelha do sangue. Os exemplos de polipeptídeos de bloqueador de GDF incluem polipeptídeos precursores de ActRIIB humano (SEQ ID NO: 1 ou 39) que tem uma ou mais variações de sequência, e polipeptídeos de ActRIIB humano solúvel (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 e 41) que tem uma ou mais variações de sequência. Um bloqueador de GDF se refere a um polipeptídeo de ActRIIB que tem uma afinidade diminuída para ativina em relação a outros ligantes de ActRIIB, que incluem, por exemplo, GDF11 e/ou miostatina.
[0074] Para uso na presente invenção, o termo “ActRIIB” se refere a uma família de proteínas do receptor do tipo II de ativina (ActRIIB) a partir de qualquer espécie e variantes derivadas a partir de tais proteínas ActRIIB por meio de mutagênese ou outra modificação. Deve-se compreender que a referência a ActRIIB no presente documento consiste em uma referência a qualquer uma das formas atualmente identificadas. Os membros da família de ActRIIB consistem geralmente em proteínas de transmembrana, compostas de um domínio extracelular de ligação de ligante com uma região rica em cisteína, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático com atividade serina/treonina quinase prevista. A sequência de aminoácidos do domínio extracelular solúvel de ActRIIA humano (fornecido para comparação) e domínio extracelular solúvel de ActRIIB são ilustrados na Figura 1.
[0075] O termo “polipeptídeo de ActRIIB” inclui os polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família de ActRIIB, assim como quaisquer variantes do mesmo (que inclui mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que retêm uma atividade útil. Vide, por exemplo, o documento sob o no. WO 2006/012627. Por exemplo, os polipeptídeos de ActRIIB incluem os polipeptídeos derivados a partir da sequência de qualquer ActRIIB conhecido que tem uma sequência ao menos cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo de ActRIIB e, opcionalmente, ao menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, ou maior, de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo de ActRIIB pode se ligar a e inibir a função de uma proteína ActRIIB e/ou ativina. Um polipeptídeo de ActRIIB, o qual consiste em um bloqueador de GDF, pode ser selecionado para a atividade na promoção de formação de célula vermelha do sangue in vivo. Os exemplos de polipeptídeos de ActRIIB incluem polipeptídeo precursor de ActRIIB humano (SEQ ID NO: 1 e 39) e polipeptídeos de ActRIIB humanos solúveis (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 e 41). A numeração de aminoácidos para todos os polipeptídeos relacionados a ActRIIB descritos no presente documento tem por base a numeração para SEQ ID NO:1, exceto onde especificamente designado em contrário.
[0076] A sequência de proteína precursora de ActRIIB humana é conforme exposto a seguir: MTAPWVALALLWGSLWPGSG RGEAETRECIYYNANWELE R^Q SGLERC EGEQDKRLHCYASW^jSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIG GLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIK ARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLL QFIAAEKRGSNNÍVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETM SRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLA VRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLV LWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIK DHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTS DCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO: 1)
[0077] O peptídeo de sinal é sublinhado uma vez; o domínio extracelular está em negrito e os locais de glicosilação ligada por N potenciais estão em caixas.
[0078] Uma forma com uma alanina na posição 64 também é relatada na literatura, conforme exposto a seguir: MTAPWVALALLWGSLWPGSGRGEAETRECIYYNANWELER^QSGLERC EGEQDKRLHCYASW^jSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIG GLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIK ARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLL QFIAAEKRGSNNÍVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETM SRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLA VRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLV LWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIK DHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTS DCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO: 39)
[0079] A sequência de polipeptídeo processada, solúvel de ActRIIB humano (extracelular), é conforme exposto a seguir: GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSG TIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLP EAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 2)
[0080] A forma alternativa com um A64 é conforme exposto a seguir: GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSG TIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLP EAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 40)
[0081] Em algumas condições, a proteína pode ser produzida com uma sequência “SGR...” no término N. A “cauda” do terminal C do domínio extracelular é sublinhada. A sequência com a “cauda” deletada (uma sequência Δ15) é conforme exposto a seguir: GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSG TIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLP EA (SEQ ID NO: 3)
[0082] A forma alternativa com um A64 é conforme exposto a seguir: GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSG TIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLP EA (SEQ ID NO: 41)
[0083] Em algumas condições, a proteína pode ser produzida com uma sequência “SGR.” no término N. A sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína precursora de ActRIIB humano é conforme exposto a seguir: (nucleotídeos 5-1543 de entrada Genbank NM_001106)(a sequência conforme mostrado fornece uma alanina na posição 64 e pode ser modificada para fornecer uma arginina no lugar) ATGACGGCGCCCTGGGTGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGGC CCGGCTCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAA CGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGC GAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACA GCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTT CAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAG GTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTC ATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGAC AGCCCCCACCCTGCTCACGGTGCTGGCCTACTCACTGCTGCCCATCGGG GGCCTTTCCCTCATCGTCCTGCTGGCCTTTTGGATGTACCGGCATCGCA AGCCCCCCTACGGTCATGTGGACATCCATGAGGACCCTGGGCCTCCACC ACCATCCCCTCTGGTGGGCCTGAAGCCACTGCAGCTGCTGGAGATCAAG GCTCGGGGGCGCTTTGGCTGTGTCTGGAAGGCCCAGCTCATGAATGACT TTGTAGCTGTCAAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAG TGAACGGGAGATCTTCAGCACACCTGGCATGAAGCACGAGAACCTGCTA CAGTTCATTGCTGCCGAGAAGCGAGGCTCCAACCTCGAAGTAGAGCTGT GGCTCATCACGGCCTTCCATGACAAGGGCTCCCTCACGGATTACCTCAA GGGGAACATCATCACATGGAACGAACTGTGTCATGTAGCAGAGACGATG TCACGAGGCCTCTCATACCTGCATGAGGATGTGCCCTGGTGCCGTGGCG AGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACTTTAAAAGTAAGAATGT ATTGCTGAAGAGCGACCTCACAGCCGTGCTGGCTGACTTTGGCTTGGCT GTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGACACCCACGGACAGGTAG GCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACTT CCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTG CTGTGGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATG AGTACATGCTGCCCTTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGA GGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCACAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAA GATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTTTGTGTGACCATCG AGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGCTGTGT GGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCG GACTGTCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCC CTAAAGAGTCAAGCATCTAA (SEQ ID NO: 4)
[0084] Uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo solúvel de ActRIIB humano (extracelular) é conforme exposto a seguir (a sequência conforme mostrado fornece uma alanina na posição 64 e pode ser modificada para fornecer uma arginina no lugar): GGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCAACT GGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGGCGA GCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACAGCTCTGGC ACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTTCAACTGCT ACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTT CTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTCATTTGCCA GAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCCCCA CC (SEQ ID NO: 5)
[0085] Em uma modalidade específica, a invenção se refere a polipeptídeos de bloqueador de GDF que consistem em formas variantes de polipeptídeos de ActRIIB solúveis. Conforme descrito no presente documento, o termo “polipeptídeo de ActRIIB solúvel” se refere geralmente a polipeptídeos que compreendem um domínio extracelular de uma proteína de ActRIIB. O termo “polipeptídeo de ActRIIB solúvel”, para uso na presente invenção, inclui qualquer domínio extracelular de ocorrência natural de uma proteína de ActRIIB, assim como quaisquer variantes do mesmo (que incluem mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas) que retêm uma atividade útil. Por exemplo, o domínio extracelular de uma proteína de ActRIIB se liga a um ligante e é geralmente solúvel. Os exemplos de polipeptídeos de ActRIIB solúveis incluem polipeptídeos solúveis de ActRIIB (por exemplo, SEQ ID NOs: 22, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 e 41). Outros exemplos de polipeptídeos de ActRIIB solúveis compreendem uma sequência de sinal em adição ao domínio extracelular de uma proteína de ActRIIB, vide Exemplo 1. A sequência de sinal pode consistir em uma sequência de sinal nativa de um ActRIIB, ou uma sequência de sinal a partir de outra proteína, tal como uma sequência de sinal de ativador de plasminogênio de tecido (TPA) ou uma sequência de sinal de melitina de abelha (HBM).
[0086] A descrição identifica as partes funcionalmente ativas e variantes de ActRIIB. Os requerentes têm verificado que uma proteína de fusão Fc que tem a sequência apresentada por Hilden et al. (Blood. 1994 Apr 15;83(8):2163-70), a qual tem uma alanina na posição que corresponde ao aminoácido 64 de SEQ ID NO: 1 (A64), tem uma afinidade relativamente baixa para ativina e GDF-11. Em contrapartida, a mesma proteína de fusão Fc com uma arginina na posição 64 (R64) tem uma afinidade para ativina e GDF-11 na faixa nanomolar baixa a alta picomolar. Portanto, uma sequência com um R64 é usada como a sequência de referência do tipo selvagem para ActRIIB humano nesta descrição.
[0087] Attisano et al. (Cell. 1992 Jan 10;68(1):97-108) mostrou que o deleção do nó de prolina no término C do domínio extracelular de ActRIIB reduziu a afinidade do receptor para ativina. Uma proteína de fusão ActRIIB-Fc que contém aminoácidos 20 a 119 de SEQ ID NO: 1, “ActRIIB(20-119)-Fc”, tem reduzido a ligação ao GDF-11 e ativina em relação a um ActRIIB(20-134)-Fc, o qual inclui a região de nó de prolina e o completo domínio juxta-membrana. No entanto, uma proteína ActRIIB(20-129)-Fc se mantém similar, mas com atividade um tanto reduzida em relação ao tipo selvagem, mesmo que a região de nó de prolina seja rompida. Deste modo, espera-se que todos os domínios extracelulares de ActRIIB que param no aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 e 129 sejam ativos, mas as construções que param em 134 ou 133 podem ser mais ativas. Semelhantemente, não se espera que as mutações em qualquer um dos resíduos 129 a 134 alterem a afinidade de ligação de ligante por grandes margens. Em apoio a isto, as mutações de P129 e P130 não diminuem substancialmente a ligação de ligante. Portanto, um polipeptídeo bloqueador de GDF que consiste em uma proteína de fusão ActRIIB-Fc pode terminar no aminoácido 109 (a cisteína final), no entanto, espera-se que as formas que terminam em ou entre 109 e 119 tenham ligação de ligante reduzida. O aminoácido 119 é conservado de modo insatisfatório e assim é prontamente alterado ou truncado. As formas que terminam em 128 ou depois retêm a atividade de ligação de ligante. As formas que terminam em ou entre 119 e 127 terão uma capacidade de ligação intermediária. Qualquer uma destas formas pode ser desejável para o uso, dependendo do ambiente clínico ou experimental.
[0088] No término N de ActRIIB, espera-se que uma proteína que começa no aminoácido 29 ou antes retenha a atividade de ligação de ligante. O aminoácido 29 representa a cisteína inicial. Uma mutação de alanina para asparagina na posição 24 introduz uma sequência de glicosilação ligada por N sem afetar substancialmente a ligação de ligante. Isto confirma que as mutações na região entre o peptídeo de clivagem de sinal e a região reticulada por cisteína, que corresponde aos aminoácidos 20 a 29, são bem toleradas. Em particular, as construções que começam na posição 20, 21, 22, 23 e 24 irão reter a atividade e também se espera que as construções que começam nas posições 25, 26, 27, 28 e 29 retenham a atividade. Os dados mostrados nos exemplos demonstram que, surpreendentemente, uma construção que começa em 22, 23, 24 ou 25 terá a maior atividade.
[0089] Tomados em conjunto, uma parte ativa de ActRIIB compreende aminoácidos 29 a 109 de SEQ ID NO: 1, e as construções de bloqueador de GDF podem, por exemplo, compreender uma parte de ActRIIB que começa em um resíduo que corresponde aos aminoácidos 20 a 29 de SEQ ID NO: 1 ou 39 e que termina em uma posição que corresponde aos aminoácidos 109 a 134 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Outros exemplos incluem as construções que começam em uma posição a partir de 20 a 29 ou 21 a 29 e terminam em uma posição a partir de 119 a 134, 119 a 133, 129 a 134 ou 129 a 133 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Outros exemplos incluem as construções que começam em uma posição a partir de 20 a 24 (21 a 24 ou 22 a 25) e terminam em uma posição a partir de 109 a 134 (ou 109 a 133), 119 a 134 (ou 119 a 133) ou 129 a 134 (ou 129 a 133) de SEQ ID NO: 1 ou 39. As variantes dentro destas faixas também são consideradas, particularmente aquelas que têm ao menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para a parte correspondente de SEQ ID NO: 1 ou 39. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo bloqueador de GDF compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que é ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica aos resíduos de aminoácido 25 a 131 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo bloqueador de GDF compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que é ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NOs: 7, 26, 28, 29, 32, 37 ou 38. Nas modalidades preferidas, o polipeptídeo bloqueador de GDF consiste em ou consiste essencialmente na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, 26, 28, 29, 32, 37 ou 38.
[0090] A descrição inclui os resultados de uma análise de estruturas de ActRIIB compósitas, mostrados na Figura 1, que demonstram que a bolsa de ligação de ligante é definida pelos resíduos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92, e E94 a F101. Nestas posições, espera-se que as mutações conservadoras sejam toleradas, embora na mutação K74A seja bem tolerada, conforme são as mutações R40A, K55A, F82A e na posição L79. R40 consiste em um K em Xenopus, que indica que os aminoácidos básicos nesta posição serão tolerados. Q53 consiste em R em ActRIIB bovino e K em ActRIIB Xenopus e, portanto, os aminoácidos que incluem R, K, Q, N e H serão tolerados nesta posição. Deste modo, uma fórmula geral para uma proteína de bloqueador de GDF consiste em uma que compreende aminoácidos 29 a 109 de SEQ ID NO: 1 ou 39, mas que começa opcionalmente em uma posição que se situa em uma faixa a partir de 20 a 24 ou 22 a 25 e que termina em uma posição que se situa em uma faixa a partir de 129 a 134, e que compreende não mais que 1, 2, 5, 10 ou 15 mudanças de aminoácido conservadoras na bolsa de ligação de ligante, e zero, uma ou mais alterações não conservadoras em posições 40, 53, 55, 74, 79 e/ou 82 na bolsa de ligação de ligante. Tal proteína pode reter mais do que 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade da sequência para a sequência de aminoácidos 29 a 109 de SEQ ID NO: 1 ou 39. Os locais fora da bolsa de ligação, na qual a variabilidade pode ser particularmente bem tolerada, incluem os términos amino e carbóxi do domínio extracelular (conforme observado acima), e posições 42 a 46 e 65 a 73. Uma alteração de asparagina para alanina na posição 65 (N65A) aperfeiçoa realmente a ligação de ligante no antecedente A64 e, deste modo, espera-se não ter efeito prejudicial sobre a ligação de ligante no antecedente R64. Esta mudança elimina provavelmente a glicosilação em N65 no antecedente A64, demonstrando, deste modo, que uma mudança significante nesta região é passível de ser tolerada. Enquanto uma mudança R64A é tolerada de modo insatisfatório, R64K é bem tolerada e, deste modo, outro resíduo básico, tal como H, pode ser tolerado na posição 64.
[0091] ActRIIB é bem conservado em quase todos os vertebrados, com grandes extensões do domínio extracelular completamente conservadas. Muitos dos ligantes que se ligam ao ActRIIB também são altamente conservados. Consequentemente, as comparações de sequências de ActRIIB a partir de diversos organismos vertebrados fornecem discernimento em resíduos que podem ser alterados. Portanto, um polipeptídeo variante de ActRIIB humano, ativo útil como um bloqueador de GDF pode incluir um ou mais aminoácidos em posições correspondentes a partir da sequência de outro ActRIIB de vertebrado, ou pode incluir um resíduo que é similar àquele na sequência de humano ou outro vertebrado. Os seguintes exemplos ilustram esta abordagem para definir uma variante de ActRIIB ativa. L46 consiste em uma valina em ActRIIB de Xenopus, e, então, esta posição pode ser alterada e, opcionalmente, pode ser alterada para outro resíduo hidrofóbico, tal como V, I ou F, ou um resíduo não polar, tal como, A. E52 é um K em Xenopus, que indica que este local pode ser tolerante de uma ampla variedade de mudanças, que incluem resíduos polar, tais como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y e provavelmente A. T93 é um K em Xenopus, que indica que uma ampla variação estrutural é tolerada nesta posição, com resíduos polares favorecidas, tais como S, K, R, E, D, H, G, P, G e Y. F108 é um Y em Xenopus e, portanto, Y ou outro grupo hidrofóbico, tal como I, V ou L deveria ser tolerada. E111 consiste em K em Xenopus, que indica que os resíduos carregados serão tolerados nesta posição, que incluem D, R, K e H, assim como Q e N. R112 consiste em K em Xenopus, que indica que resíduos básicos são tolerados nesta posição, que incluem R e H. A na posição 119 é conservado de modo relativamente insatisfatório, e parece como P em roedores e V em Xenopus, deste modo, essencialmente qualquer aminoácido deveria ser tolerado nesta posição.
[0092] A descrição demonstra que a adição de um local adicional de glicosilação ligada por N (N-X-S/T) aumenta a meia vida sérica de uma proteína de fusão de ActRIIB-Fc, em relação à forma ActRIIB(R64)-Fc. Mediante a introdução de uma asparagina na posição 24 (construção A24N), é criada uma sequência de NXT que confere uma meia vida mais longa. Outras sequências de NX(T/S) são encontradas em 42-44 (NQS) e 65-67 (NSS), embora a citada por último possa não ser glicosilada de modo eficaz com o R na posição 64. As sequências N-X-S/T podem ser geralmente introduzidas em posições fora da bolsa de ligação de ligante definida na Figura 1. Os locais particularmente adequados para a introdução de sequências N- X-S/T não-endógenas incluem os aminoácidos 20 a 29, 20 a 24, 22 a 25, 109 a 134, 120 a 134 ou 129 a 134. As sequências N-X-S/T também podem ser introduzidas na ligação entre a sequência de ActRIIB e a Fc ou outro componente de fusão. Tal local pode ser introduzido com esforço mínimo mediante a introdução de um N na posição correta em relação a um S ou T pré-existente, ou mediante a introdução de um S ou T em uma posição que corresponde a um N pré-existente. Deste modo, as alterações desejáveis que criariam um local de glicosilação ligada por N consistem em: A24N, R64N, S67N (possivelmente combinada com uma alteração N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S e R112T. Qualquer S que é previsto que seja glicosilado pode ser alterado para um T sem criar um local imunogênico, devido à proteção proporcionada pela glicosilação. Da mesma forma, qualquer T que é previsto que seja glicosilado pode ser alterado para um S. Deste modo, as alterações S67T e S44T são consideradas. Da mesma forma, em uma variante A24N, uma alteração S26T pode ser usada. Consequentemente, um bloqueador de GDF pode consistir em uma variante de ActRIIB que tem uma ou mais sequências adicionais de consenso de glicosilação ligada por N não-endógena.
[0093] A posição L79 de ActRIIB pode ser alterada para conferir propriedades de ligação de ativina - miostatina (GDF-11) alteradas. L79A ou L79P reduz a ligação de GDF-11 a uma extensão maior do que a ligação de ativina. L79E ou L79D retém a ligação de GDF-11. Consideravelmente, as variantes L79E e L79D têm reduzido muito a ligação de ativina. Os experimentos in vivo indicam que estes receptores de não-ativina retém capacidade significante de aumentar as células vermelhas do sangue, mas mostram efeitos reduzidos sobre outros tecidos. Estes dados demonstram a desejabilidade e viabilidade para a obtenção de polipeptídeos com efeitos reduzidos sobre a ativina. Nas modalidades exemplificadoras, os métodos descritos no presente documento utilizam um polipeptídeo bloqueador de GDF que consiste em um polipeptídeo de ActRIIB variante que compreende um aminoácido ácido (por exemplo, D ou E) na posição que corresponde à posição 79 de SEQ ID NO: 1 ou 39, opcionalmente, em combinação com uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido.
[0094] As variações descritas podem ser combinadas em diversas formas. Adicionalmente, os resultados do programa de mutagênese descrito no presente documento indicam que existem posições de aminoácido em ActRIIB que são muitas vezes benéficas para conservação. Estas incluem a posição 64 (aminoácido básico), a posição 80 (aminoácido ácido ou hidrofóbico), a posição 78 (hidrofóbico, e particularmente triptofano), a posição 37 (ácido, e particularmente aspártico ou ácido glutâmico), a posição 56 (aminoácido básico), posição 60 (aminoácido hidrofóbico, particularmente fenilalanina ou tirosina). Deste modo, em cada uma das variantes apresentadas no presente documento, a descrição fornece uma estrutura de aminoácidos que pode ser conservada. Outras posições que podem ser desejáveis para conservar são conforme exposto a seguir: posição 52 (aminoácido ácido), posição 55 (aminoácido básico), posição 81 (ácido), 98 (polar ou carregado, particularmente E, D, R ou K).
[0095] Em determinadas modalidades, os fragmentos isolados de polipeptídeos de ActRIIB podem ser obtidos por meio da triagem de polipeptídeos produzidos de maneira recombinante a partir do fragmento correspondente do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de ActRIIB (por exemplo, SEQ ID NOs: 4 e 5). Além disso, os fragmentos podem ser quimicamente sintetizados com o uso de técnicas conhecidas na técnica, tal como química convencional t-Boc e f-Moc de fase sólida Merrifield. Os fragmentos podem ser produzidos (de maneira recombinante ou por meio de síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos de peptidil que podem funcionar, por exemplo, como antagonistas (inibidores) ou agonistas (ativadores) de uma proteína de ActRIIB ou um ligante de ActRIIB.
[0096] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo bloqueador de GDF consiste em um polipeptídeo de ActRIIB variante que tem uma sequência de aminoácido que é ao menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ou 41. Em determinados casos, o bloqueador de GDF tem uma sequência de aminoácido ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ou 41. Em determinadas modalidades, o bloqueador de GDF compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácido ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38, 40 ou 41, em que a posição que corresponde a L79 de SEQ ID NO: 1 consiste em um aminoácido ácido (por exemplo, um resíduo de aminoácido D ou E).
[0097] Em determinadas modalidades, a presente invenção considera fazer variantes funcionais mediante a modificação da estrutura de um polipeptídeo bloqueador de GDF, para tais propósitos como otimizar a eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vida útil ex vivo e resistência à degradação proteolítica in vivo). Os polipeptídeos de bloqueador de GDF também podem ser produzidos por meio da substituição, deleção ou adição de aminoácido. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservadoras) não tenha um efeito maior sobre a atividade biológica da molécula resultante. As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Se uma mudança na sequência de aminoácido de um polipeptídeo bloqueador de GDF resulta em uma variante funcional pode ser prontamente determinado mediante a avaliação da capacidade do polipeptídeo bloqueador de GDF de produzir uma respostas em células em relação ao polipeptídeo bloqueador de GDF não modificado ou um polipeptídeo de ActRIIB do tipo selvagem, ou ligar a um ou mais ligantes, tais como ativina, GDF-11 ou miostatina, conforme comparado com o polipeptídeo bloqueador de GDF não modificado ou um polipeptídeo de ActRIIB do tipo selvagem.
[0098] Em determinadas modalidades específicas, a presente invenção considera fazer mutações no domínio extracelular (também mencionado como domínio de ligação de ligante) de um polipeptídeo de ActRIIB, de tal modo que o polipeptídeo de ActRIIB tenha atividades de ligação de ligante alteradas (por exemplo, a afinidade de ligação ou especificidade de ligação). Em determinados casos, tais polipeptídeos de bloqueador de GDF têm afinidade de ligação alterada (elevada ou reduzida) para um ligante específico. Em outros casos, os polipeptídeos de bloqueador de GDF têm especificidade de ligação alterada para ligantes de ActRIIB.
[0099] Por exemplo, a descrição fornece polipeptídeos de bloqueador de GDF que se ligam, de preferência, a GDF8/GDF11 em relação às ativinas. A descrição estabelece, adicionalmente, a desejabilidade de tais polipeptídeos para a produção de efeitos fora do objetivo, embora tais variantes seletivas possam ser menos desejáveis para o tratamento de doenças severas, onde ganhos muitos grandes em níveis de célula vermelha do sangue podem ser necessários para o efeito terapêutico e onde algum nível de efeito fora do objetivo é aceitável. Por exemplo, os resíduos de aminoácido da proteína de ActRIIB, tais como E39, K55, Y60, K74, W78, D80 e F101, estão na bolsa de ligação de ligante e mediam a ligação a seus ligantes, tais como ativina e GDF8. Deste modo, a presente invenção fornece um bloqueador de GDF que compreende um domínio de ligação de ligante alterado (por exemplo, domínio de ligação de GDF8) de um receptor de ActRIIB, o qual compreende uma ou mais mutações naqueles resíduos de aminoácido. Opcionalmente, o domínio de ligação de ligante alterado pode ter seletividade aumentada para um ligante, tal como GDF8 em relação a um domínio de ligação de ligante do tipo selvagem de um receptor de ActRIIB. Para ilustrar, estas mutações aumentam a seletividade do domínio de ligação de ligante alterado para GDF8 sobre ativina. Opcionalmente, o domínio de ligação de ligante alterado tem uma razão de Kd para ligação de ativina para Kd para ligação de GDF8 que é ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes maior em relação à razão para o domínio de ligação de ligante do tipo selvagem. Opcionalmente, o domínio de ligação de ligante alterado tem uma razão de IC50 para inibição de ativina para IC50 para inibição de GDF8 que é ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes maior em relação ao domínio de ligação de ligante do tipo selvagem. Opcionalmente, o domínio de ligação de ligante alterado inibe GDF8 com um IC50 ao menos 2, 5, 10 ou até 100 vezes menor que o IC50 para inibição de ativina.
[00100] Como um exemplo específico, o resíduo de aminoácido positivamente carregado Asp (D80) do domínio de ligação de ligante de ActRIIB pode sofrer mutação para um resíduo de aminoácido diferente para produzir um polipeptídeo bloqueador de GDF que se liga, de preferência, a GDF8, mas não ativina. Prefere-se que o resíduo D80 seja mudado para um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: um resíduo de aminoácido não carregado, um resíduo de aminoácido negativo e um resíduo de aminoácido hidrofóbico. Como um exemplo específico adicional, o resíduo hidrofóbico, L79, pode ser alterado para os aminoácidos ácidos ácido aspártico ou ácido glutâmico para reduzir consideravelmente a ligação de ativina, enquanto que retém a ligação de GDF11. Conforme será reconhecido por um elemento versado na técnica, a maioria das mutações, variantes ou modificações descritas podem ser feitas no nível de ácido nucléico ou, em alguns casos, por meio de modificação pós-translacional ou síntese química. Tais técnicas são bem conhecidas na técnica.
[00101] Em determinadas modalidades, a presente invenção considera os polipeptídeos de bloqueador de GDF que têm mutações específicas em ActRIIB, a fim de alterar a glicosilação do polipeptídeo de ActRIIB. Os locais de glicosilação exemplificadores nos polipeptídeos de bloqueador de GDF são ilustrados na Figura 1 (por exemplo, os locais NX(S/T) sublinhados). Tais mutações podem ser selecionadas a fim de introduzir ou eliminar um ou mais locais de glicosilação, tais como locais de glicosilação ligada por N ou ligada por O. Os locais de reconhecimento de glicosilação ligada por asparagina compreendem geralmente uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina (onde “X” consiste em qualquer aminoácido) a qual é especificamente reconhecida por enzimas de glicosilação celular adequadas. A alteração também podem ser feita pela adição de ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do polipeptídeo de ActRIIB do tipo selvagem (para locais de glicosilação ligada por O). Uma variedade de substituições ou deleções de aminoácido em uma ou ambas dentre a primeira ou terceira posição de aminoácido de um local de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção de aminoácido na segunda posição) resulta na não-glicosilação na sequência de tripeptídeo não modificada. Outro meio de aumentar o número de porções de carboidrato em um polipeptídeo bloqueador de GDF consiste no acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo bloqueador de GDF. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode ser fixado a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfidrila livres, tais como aqueles de cisteína; (d) grupos hidroxila livres, tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos, tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos no documento sob o no. WO 87/05330 e em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, aqui incorporados a título de referência. A remoção de uma ou mais porções de carboidrato presentes em um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser realizada de maneira química e/ou enzimática. A deglicosilação química pode envolver, por exemplo, a exposição do polipeptídeo bloqueador de GDF ao composto de ácido trifluorometanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N- acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa a sequência de aminoácido intacta. A deglicosilação química é adicionalmente descrita por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática de porções de carboidrato em polipeptídeos de bloqueador de GDF pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A sequência de um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser ajustada, conforme adequado, dependendo do tipo de sistema expressão usado, na medida em que as células de mamífero, levedura, inseto e vegetal podem introduzir padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela sequência de aminoácido do peptídeo. Em geral, os polipeptídeos de bloqueador de GDF para uso em humanos serão expressos em uma linha de célula de mamífero que fornece a glicosilação adequada, tal como as linhas de células HEK293 ou CHO, embora seja esperado que outras linhas de célula de expressão de mamífero também sejam úteis.
[00102] Esta descrição considera, adicionalmente, um método de gerar variantes, particularmente, conjuntos de variantes combinatórias de um polipeptídeo bloqueador de GDF, que incluem, opcionalmente, variantes de truncamento; as concentrações de mutantes combinatórios são especialmente úteis para a identificação de sequências de bloqueador de GDF. O propósito de triagem de tais bibliotecas combinatórias pode consistir em gerar, por exemplo, variantes de polipeptídeo bloqueador de GDF que têm propriedades alteradas, tais como farmacocinética alterada ou ligação de ligante alterada. Uma variedade de ensaios de triagem é fornecida abaixo e tais ensaios podem ser usados para avaliar as variantes. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser submetida à triagem acerca da capacidade de se ligar a um polipeptídeo de ActRIIB, para evitar a ligação de um ligante de ActRIIB a um polipeptídeo de ActRIIB ou ara interferir com a sinalização causada por um ligante de ActRIIB.
[00103] A atividade de um polipeptídeo bloqueador de GDF ou suas variantes também podem ser testadas em um ensaio in vivo ou à base de célula. Por exemplo, o efeito de uma variante de polipeptídeo bloqueador de GDF sobre a expressão de genes envolvidos na hematopoese pode ser avaliado. Isto pode, conforme necessário, ser executado na presença de uma ou mais proteínas de ligante de ActRIIB recombinantes (por exemplo, ativina), e as células podem ser transfectadas a fim de produzir um polipeptídeo bloqueador de GDF e/ou variantes do mesmo e, opcionalmente, um ligante de ActRIIB. Da mesma forma, um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais medições do sangue, tais como uma contagem de RBC, níveis de hemoglobina, níveis de hematócrito, armazenamentos de ferro, ou contagem de reticulócito, podem ser avaliada com o uso de métodos reconhecidos na técnica.
[00104] Podem ser geradas as variantes derivadas de maneira combinatória que têm uma potência seletiva em relação a um polipeptídeo bloqueador de GDF de referência. Tais proteínas variantes, quando expressas a partir de construções de DNA recombinantes, podem ser usadas em protocolos de terapia de gene. Da mesma forma, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm meia-vidas intracelulares dramaticamente diferentes do polipeptídeo bloqueador de GDF não modificado correspondente. Por exemplo, a proteína alterada pode ser feita mais estável ou menos estável à degradação proteolítica ou outros processos que resultam em destruição, ou de outro modo inativação de um polipeptídeo bloqueador de GDF não modificado. Tais variantes, e os genes que codificam as mesmas, podem ser utilizadas para alterar os níveis de polipeptídeo bloqueador de GDF mediante a modulação da meia vida dos polipeptídeos de bloqueador de GDF. Por exemplo, uma meia vida curta pode ocasionar mais efeitos biológicos temporários e, quando parte de um sistema de expressão induzível, pode permitir o controle mais rígido de níveis de polipeptídeo bloqueador de GDF recombinante dentro da célula. Em uma proteína de fusão Fc, as mutações podem ser feitas na ligação (se houver) e/ou na parte Fc para alterar a meia vida da proteína.
[00105] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de bloqueador de GDF da invenção podem compreender, adicionalmente, modificações pós- translacionais em adição a qualquer um que está presente nos polipeptídeos de ActRIIB. Tais modificações incluem, mas não se limitam a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Como consequência disto, os polipeptídeos de bloqueador de GDF podem conter elementos de não-aminoácido, tais como polietileno glicóis, lipídeos, poli- ou monossacarídeo, e fosfatos. Os efeitos de tais elementos de não-aminoácido sobre a funcionalidade de um polipeptídeo bloqueador de GDF podem ser testados conforme descrito no presente documento para outras variantes de polipeptídeo bloqueador de GDF. Quando um polipeptídeo bloqueador de GDF é produzido em células por médio de clivagem de uma forma nascente do polipeptídeo bloqueador de GDF,o processamento pós-translacional também pode ser importante para dobragem e/ou função correta da proteína. As diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) têm mecanismos característicos e dispositivos celulares específicos para tais atividades pós-translacionais e podem ser escolhidas para assegurar a modificação e processamento correto dos polipeptídeos de bloqueador de GDF.
[00106] Em determinados aspectos, os polipeptídeos de bloqueador de GDF incluem as proteínas de fusão que têm ao menos uma parte de um polipeptídeo de ActRIIB e um ou mais domínios de fusão. Os exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas não se limitam a, polihistidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, um Fc), proteína de ligação de maltose (MBP), ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado a fim de conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por meio de cromatografia de afinidade. Para propósito de purificação por afinidade, as matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como glutationa-, amilase-, e resinas conjugadas a níquel ou cobalto, são usadas. Muitas de tais matrizes estão disponíveis na forma de “kit”, tal como o sistema de purificação Pharmacia GST e o sistema QIAexpress™ (Qiagen) úteis com os parceiros de fusão (HIS6). Como outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado a fim de facilitar a detecção dos polipeptídeos de bloqueador de GDF. Os exemplos de tais domínios de detecção incluem as diversas proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), assim como “etiquetas de epítopo”, os quais consistem usualmente em sequências curtas de peptídeo para as quais um anticorpo específico está disponível. As etiquetas de epítopo bem conhecidas para anticorpos monoclonais específicos estão prontamente disponíveis e incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e etiquetas c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um local de clivagem de protease, tal como para fator Xa ou trombina, o qual permite que a protease relevante digira parcialmente as proteínas de fusão e, assim, libere as proteínas recombinantes a partir das mesmas. As proteínas liberadas podem ser, então, isoladas a partir do domínio de fusão por meio de separação cromatográfica subsequente. Em determinadas modalidades preferidas, um polipeptídeo bloqueador de GDF é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo bloqueador de GDF in vivo (um domínio “estabilizador”). “Estabilização“ se refere a qualquer coisa que aumenta a meia-vida sérica, independente de se isto se deve a uma destruição diminuída, liberação diminuída pelo rim ou outro efeito farmacocinético. As fusões com a parte Fc de uma imunoglobulina são conhecidas por conferir as propriedades farmacocinéticas desejáveis sobre uma ampla gama de proteínas. Da mesma forma, as fusões a albumina sérica humana pode conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetramerização) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tal como aumento adicional de níveis de célula vermelha do sangue).
[00107] Como um exemplo específico, a presente invenção fornece o bloqueador de GDF que consiste em uma proteína de fusão de ActRIIB-Fc que compreende um domínio extracelular (por exemplo, ligação de ligante) de polipeptídeo de ActRIIB fundidos a um domínio Fc. A sequência de um domínio Fc exemplificador é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 6).
[00108] THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
[00109] Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações em resíduos, tais como Asp-265, lisina 322 e Asn-434. Em determinados casos, o domínio de Fc mutante que tem uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asp- 265) tem capacidade reduzida de ligação ao receptor de FCY em relação a um domínio de Fc do tipo selvagem. Em outros casos, o domínio de Fc mutante que tem uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asn-434) tem capacidade aumentada de ligação ao receptor de Fc relacionado a MHC classe I (FcRN) em relação a um domínio de Fc do tipo selvagem.
[00110] Compreende-se que diferentes elementos das proteínas de fusão podem ser dispostos em qualquer maneira que é consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser colocado no terminal C a um domínio heterólogo ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C a um polipeptídeo bloqueador de GDF. O domínio de polipeptídeo bloqueador de GDF e o domínio heterólogo não precisam ser adjacentes em uma proteína de fusão e os domínios ou sequências de aminoácido adicionais podem ser incluídas no terminal C ou N a cada domínio ou entre os domínios.
[00111] Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão de bloqueador de GDF compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentado na fórmula A-B-C. A parte B consiste em um polipeptídeo de ActRIIB truncado terminalmente em N e C que consiste na sequência de aminoácido que corresponde aos aminoácidos 26 a 132 de SEQ ID NO: 26. As partes A e C podem consistir independentemente em zero, um ou mais do que um aminoácidos, e tanto a parte A como a C, quando presentes, são heterólogas a B. As partes A e/ou C podem ser fixadas à parte B através de uma sequência de ligação. As ligações exemplificadoras incluem as ligações de polipeptídeo curtas, tais como 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 resíduos de glicina, tais como, por exemplo, uma ligação de Gly-Gly-Gly. Outras ligações adequadas são descritas no presente documento acima. Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão de bloqueador de GDF compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentado na fórmula A-B-C, em que A consiste em uma sequência líder, B consiste em aminoácidos 26 a 132 de SEQ ID NO: 26 e C consiste em uma parte de polipeptídeo que otimiza um ou mais dentre a estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína e/ou purificação. Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão de bloqueador de GDF compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentado na fórmula A-B-C, em que A consiste em uma sequência líder TPA, B consiste em aminoácidos 26 a 132 de SEQ ID NO: 26 e C consiste em um domínio de Fc de imunoglobulina. Uma proteína de fusão de bloqueador de GDF preferida compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 26.
[00112] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de bloqueador de GDF da presente invenção contêm uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos de bloqueador de GDF. Por exemplo, tais modificações otimizam a meia-vida in vitro dos polipeptídeos de bloqueador de GDF, otimizam a meia-vida circulatória dos polipeptídeos de bloqueador de GDF ou reduzem a degradação proteolítica dos polipeptídeos de bloqueador de GDF. Tais modificações de estabilização incluem, mas não se limitam a, proteínas de fusão (que incluem, por exemplo, as proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo bloqueador de GDF e um domínio estabilizador), as modificações de um local de glicosilação (que incluem, por exemplo, a adição de um local de glicosilação a um polipeptídeo bloqueador de GDF) e as modificações de porção carboidrato (que incluem, por exemplo, a remoção de porções de carboidrato a partir de um polipeptídeo bloqueador de GDF). No caso de proteínas de fusão, um polipeptídeo bloqueador de GDF é fundido a um domínio estabilizador, tal como uma molécula IgG (por exemplo, um domínio de Fc). Para uso na presente invenção, o termo “domínio estabilizador” não somente se refere a um domínio de fusão (por exemplo, Fc), como no caso das proteínas de fusão, mas também inclui modificações não-proteínicas, tais como uma porção de carboidrato, ou polímero não-proteínico, tal como polietileno glicol.
[00113] Em determinadas modalidades, a presente invenção faz formas purificadas e/ou isoladas disponíveis dos polipeptídeos de bloqueador de GDF, os quais são isolados a partir de ou de outra forma substancialmente livres de outras proteínas.
[00114] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de bloqueador de GDF (não modificados ou modificados) da invenção podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, tais polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser sintetizados com o uso de técnicas de química de proteína padrão, tais como aquelas descritas em Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) e Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1992). Além disso, os sintetizadores de peptídeo automatizados estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, os polipeptídeos de bloqueador de GDF, fragmentos ou variantes dos mesmos podem ser produzidos de maneira recombinante com o uso de diversos sistemas de expressão (por exemplo, E. coli, células de Ovário de hamster chinês (CHO), células COS, baculovirus), conforme é bem conhecido da técnica. Em uma modalidade adicional, os polipeptídeos de bloqueador de GDF modificados ou não modificados podem ser produzidos por meio da digestão de polipeptídeos de bloqueador de GDF completos produzidos de maneira recombinante com o uso, por exemplo, de uma protease, por exemplo, tripsina, termolisina, quimiotripsina, pepsina ou enzima de conversão de aminoácido básico pareado (PACE). A análise de computador (que utiliza um software comercialmente disponível, por exemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) pode ser usado para identificar os locais proteolíticos de clivagem. Alternativamente, tais polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser produzidos a partir de polipeptídeos de bloqueador de GDF completos produzidos de maneira recombinantes, tal como por meio de técnicas padrão conhecidas na técnica, tal como por meio de clivagem química (por exemplo, brometo de cianogênio, hidroxilamina).
3. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de bloqueador de GDF
[00115] Em determinados aspectos, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos de bloqueador de GDF apresentados no presente documento. SEQ ID NO: 4 codifica um polipeptídeo precursor de ActRIIB de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 5 codifica um polipeptídeo de ActRIIB solúvel e SEQ ID NOs: 25, 27, 30 e 31 codificam bloqueadores de GDF solúveis. Os presentes ácidos nucléicos podem ser de fita única ou fita dupla. Tais ácidos nucléicos podem consistir em moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para a fabricação de polipeptídeos de bloqueador de GDF ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, em uma abordagem de terapia de gene).
[00116] Em determinados aspectos, compreende-se que os presentes ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos de bloqueador de GDF incluem os ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NOs: 5, 25, 27, 30 e 31. As sequências de nucleotídeo variantes incluem as sequências que se diferem por uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo, tal como variantes alélicas; e irão, portanto, incluir as sequências de codificação que se diferem da sequência de nucleotídeo da sequência de codificação designada em SEQ ID NOs: 5, 25, 27, 30 e 31.
[00117] Em determinadas modalidades, a invenção fornece sequências de ácido nucleico isoladas ou recombinante que são ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas a SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31. Um elemento versado na técnica irá observar que as sequências de ácido nucléico complementares a SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31, e as variantes de SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31, também se incluem no escopo desta invenção. Em modalidades adicionais, as sequência de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas, recombinantes e/ou fundidas com uma sequência de nucleotídeo heteróloga, ou em uma biblioteca de DNA.
[00118] Em outras modalidades, os ácidos nucléicos da invenção também incluem as sequências de nucleotídeo que hibridizam sob condições altamente severas à sequência de nucleotídeo designada em SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31, sequência complementar de SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31, ou fragmentos das mesmas. Conforme discutido acima, um elemento versado na técnica irá compreender prontamente que as condições de severidade adequadas que promovem a hibridização de DNA podem ser variadas. Por exemplo, um indivíduo poderia executar a hibridização em 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa severidade de cerca de 2,0 x SSC a 50 °C a uma alta severidade de cerca de 0,2 x SSC a 50 °C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de baixas condições de severidade em temperatura ambiente, cerca de 22 °C, a altas condições de severidade a cerca de 65 °C. Tanto a temperatura como o sal podem ser variadas, ou a temperatura ou concentração de sal pode ser mantida constante, enquanto que a outra variável é alterada. Em uma modalidade, a invenção fornece ácidos nucléicos que hibridizam sob baixas condições de severidade de 6 x SSC em temperatura ambiente, seguido por uma lavagem a 2 x SSC em temperatura ambiente.
[00119] Os ácidos nucléicos isolados que se diferem dos ácidos nucléicos conforme apresentado em SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 ou 31, devido à degeneração no código genético, também se incluem no escopo da invenção. Por exemplo, uma série de aminoácidos é designada por mais do que um tripleto. Os códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimo (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) podem resultar em mutações “silenciosas” que não afetam a sequência de aminoácido da proteína. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo bloqueador de GDF será codificado por uma sequência de nucleotídeo alternativa. As sequências de nucleotídeo alternativas são degeneradas em relação à sequência de ácido nucléico de bloqueador de GDF nativa, mas ainda codificam para a mesma proteína de fusão. Em determinadas modalidades, o bloqueador de GDF que tem SEQ ID NO: 26 é codificado por uma sequência de ácido nucléico alternativa que compreende SEQ ID NO: 30. No entanto, espera-se que os polimorfismos de sequência de DNA que não conduzem a mudanças nas sequências de aminoácido das presentes proteínas existam entre as células de mamíferos. Um elemento versado na técnica irá observar que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3 a 5% dos nucleotídeos) dos ácidos nucléicos que codificam uma proteína particular podem existir entre indivíduos de uma determinada espécie devido à variação alélica natural. Toda e qualquer variação de nucleotídeo e polimorfismo de aminoácido resultante se incluem no escopo desta invenção.
[00120] Em determinadas modalidades, os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser ligados de maneira operável a uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras em uma construção de expressão. As sequências de nucleotídeo reguladoras serão geralmente adequadas para a célula hospedeira usada para a expressão. Inúmeros tipos de vetores de expressão adequados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a dita uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras pode incluir, mas não se limita a, sequências promotores, sequência de sinal ou líder, locais de ligação ribossomais, sequências de início e terminação de transcrição, sequências de início e terminação translacional, e sequências ativadoras ou otimizadoras. Os promotores constitutivos ou induzíveis, conforme conhecido na técnica, são considerados pela invenção. Os promotores podem consistir em promotores de ocorrência natural ou promotores híbridos que combinam elementos de mais do que um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente em uma célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na técnica e irão variar com a célula hospedeira utilizada.
[00121] Em determinados aspectos da invenção, o presente ácido nucléico é fornecido em um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo bloqueador de GDF e é ligado de maneira operável a ao menos uma sequência reguladora. As sequências reguladoras são reconhecidas na técnica e são selecionadas para direcionar a expressão do polipeptídeo bloqueador de GDF. Consequentemente, o termo sequência reguladora inclui promotores, otimizadores e outros elementos de controle de expressão. As sequências reguladoras exemplificadoras são descritas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer uma dentre uma ampla variedade de sequências de controle de expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA, quando ligadas de maneira operativa às mesmas, pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências de DNA que codificam um polipeptídeo bloqueador de GDF. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores primários e atrasados de SV40, promotor tet, adenovírus ou promotor primário imediato de citomegalovírus, promotores de RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão é direcionada por T7 RNA polimerase, as principais regiões operadoras e promotoras de fago lambda, as regiões de controle para proteína de cobertura fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de ácido fosfatase, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores de acasalamento α de levedura, o promotor poliedro do sistema de baculovirus e outras sequências conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e diversas combinações das mesmas. Deve-se compreender que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores conforme a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejada a ser expressa. Além disso, o número de cópia do vetor, a capacidade de controlar este número de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marcadores antibióticos, também deveriam ser considerados.
[00122] Um ácido nucléico recombinante da invenção pode ser produzido por meio da ligação do gene clonado, ou uma parte do mesmo, em um vetor adequado para a expressão em células procarióticas, células eucarióticas (levedura, aves, inseto ou mamífero), ou ambas. Os veículos de expressão para a produção de um polipeptídeo bloqueador de GDF recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, os vetores adequados incluem os plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tais como E. coli.
[00123] Alguns vetores de expressão de mamífero contêm tanto sequências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactérias como uma ou mais unidade de transcrição eucariótica que são expressas em células eucarióticas. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequados para a transfecção de células eucarióticas. Alguns destes vetores são modificados com sequências a partir de plasmídeos bacterianos, tais como pBR322, para facilitar a réplica e seleção de resistência de fármaco tanto em células procarióticas como eucarióticas. Alternativamente, os derivados de vírus, tais como o vírus de papiloma bovina (BPV-1), ou vírus Epstein- Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para a expressão transitória de proteínas em células eucarióticas. Os exemplos de outros sistemas de expressão viral (que incluem retroviral) podem ser encontrados abaixo na descrição de sistemas de liberação de terapia de gene. Os diversos métodos empregados na preparação dos plasmídeos e na transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas como eucarióticas, assim como os procedimentos recombinantes gerais, vide Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) capítulos 16 e 17. Em alguns casos, pode ser desejável expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão de baculovirus. Os exemplos de tais sistemas de expressão de baculovirus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tais como pAcUW1) e vetores derivados de pBlueBac (tais como o β-gal contendo pBlueBac III).
[00124] Em uma modalidade preferida, um vetor será projetado para a produção dos presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF em células CHO, tal como um vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Conforme será evidente, as presentes construções de gene podem ser usadas para causar a expressão dos presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF em células propagadas em cultura, por exemplo, para produzir proteínas, que incluem as proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.
[00125] Esta invenção também se refere a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante que inclui uma sequência de codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 25, 27, 30 ou 31) para um ou mais dos presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF. A célula hospedeira pode consistir em qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo bloqueador de GDF da invenção pode ser expresso em células bacterianas, tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, com o uso de um sistema de expressão de baculovirus), levedura, ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos elementos versados na técnica.
[00126] Consequentemente, a presente invenção se refere, adicionalmente, a métodos de produção dos presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser cultivada sob condições adequadas para permitir que a expressão do polipeptídeo bloqueador de GDF ocorra. O polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser secretado e isolado a partir de uma mistura de células e meio que contém o polipeptídeo bloqueador de GDF. Alternativamente, o polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser retido de maneira citoplásmica ou em uma fração de membrana e as células coletadas, lisada e a proteína isolada. Uma cultura de célula inclui células hospedeiras, meios e outros subprodutos. Os meios adequados para cultura de célula são bem conhecidos na técnica. Os presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser isolados a partir do meio de cultura de célula, células hospedeiras, ou ambos, com o uso de técnicas conhecidas na técnica para a purificação de proteínas, que incluem a cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtragem de gel, ultrafiltragem, eletroforese e purificação por imuno- afinidade com anticorpos específicos para epítopos particulares dos polipeptídeos de bloqueador de GDF. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo bloqueador de GDF consiste em uma proteína de fusão que contém um domínio que facilita sua purificação.
[00127] Em outra modalidade, uma codificação de gene de fusão para uma sequência líder de purificação, tal como a sequência de local de clivagem de poli- (His)/enteroquinase no término N da parte desejada do polipeptídeo bloqueador de GDF recombinante, pode permitir a purificação da proteína de fusão expressa por meio de cromatografia de afinidade com o uso de uma resina de metal Ni2+. A sequência líder de purificação pode ser, então, subsequentemente removido por meio do tratamento com enteroquinase para fornecer o polipeptídeo bloqueador de GDF purificado (por exemplo, vide Hochuli et al., (1987) J. Cromatografia 411:177; e Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
[00128] As técnicas para a fabricação de genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de diversos fragmentos de DNA que codificam para diferentes sequências de polipeptídeo é executada de acordo com as técnicas convencionais, que empregam os términos com extremidades cegas ou extremidades alternadas para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer términos adequados, preenchimento de extremidades coesivas conforme adequado, tratamento de fosfatase alcalina para evitar a junção indesejável e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por meio de técnicas convencionais que incluem sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação de PCR de fragmentos de gene pode ser realizada com o uso de iniciadores âncora que dão origem a cadeias secundárias entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subsequentemente anelados para gerar uma sequência de gene quimérica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Ensaios de triagem
[00129] Em determinados aspectos, a presente invenção se refere ao uso dos presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF (por exemplo, polipeptídeos de ActRIIB variantes solúveis ) para identificar os compostos (agentes) que são agonistas ou antagonistas de polipeptídeos de ActRIIB. Os compostos identificados através desta triagem podem ser testados para avaliar sua capacidade de modular os níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina e/ou reticulócito in vivo ou in vitro. Estes compostos podem ser testados, por exemplo, em modelos de animal.
[00130] Existem inúmeras abordagens para a triagem acerca de agentes terapêuticos para o aumento de níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina mediante o direcionamento da sinalização de ActRIIB. Em determinadas modalidades, a triagem de alta taxa de rendimento de compostos pode ser realizada para identificar os agentes que perturbam os efeitos mediados por ActRIIB sobre uma linha de célula selecionada. Em determinadas modalidades, o ensaio é realizado para fazer a triagem e identificar os compostos que especificamente inibem ou reduzem a ligação de um polipeptídeo de ActRIIB a seu parceiro de ligação, tal como um ligante de ActRIIB (por exemplo, ativina, Nodal, GDF8, GDF11 ou BMP7). Alternativamente, o ensaio pode ser usado para identificar os compostos que otimizam a ligação de um polipeptídeo de ActRIIB a seu parceiro de ligação, tal como um ligante de ActRIIB. Em uma modalidade adicional, os compostos podem ser identificados por sua capacidade de interagir com um polipeptídeo de ActRIIB.
[00131] Uma variedade de formatos de ensaio será suficiente e, na luz da presente descrição, aqueles não expressamente descritos no presente documento serão, todavia, compreendidos por um elemento versado na técnica. Conforme descrito no presente documento, os compostos de teste (agentes) da invenção podem ser criados por meio de qualquer método químico combinatório. Alternativamente, os presentes compostos podem consistir em biomoléculas de ocorrência natural sintetizadas in vivo ou in vitro. Os compostos (agentes) a serem testados acerca de sua capacidade de agir como moduladores de crescimento de tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactérias, levedura, vegetais ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimicamente (por exemplo, pequenas moléculas, que incluem peptidomiméticos) ou produzidos de maneira as recombinante. Os compostos de testes considerados pela presente invenção incluem as moléculas orgânicas de não-peptidil, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios e moléculas de ácido nucléico. Em uma modalidade específica, o agente de teste consiste em uma pequena molécula orgânica que tem um peso molecular de menos que cerca de 2.000 Daltons.
[00132] Os compostos de teste da invenção podem ser fornecidos como únicas entidades distintas ou fornecidos em bibliotecas de complexidade maior, tal como feitos por meio de química combinatória. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, alcoóis, haletos de alquila, aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos orgânicos. A apresentação de compostos de teste para o sistema de teste pode ser na forma isolada ou como misturas de compostos, especialmente em etapas de triagem iniciais. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivados com outros compostos e terem grupos derivantes que facilitam o isolamento dos compostos. Os exemplos não-limitadores de grupos derivantes incluem biotina, fluoresceína, dioxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, esferas magnéticas, glutationa S transferase (GST), reticuladores fotoativável ou quaisquer combinações dos mesmos.
[00133] Em muitos programas de triagem de fármaco que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, os ensaios de alta taxa de rendimento são desejáveis a fim de maximizar o número de compostos pesquisados em um determinado período de tempo. Os ensaios que são executados em sistemas livres de célula, tais como podem ser derivado com proteínas purificadas ou semi- purificadas, são muitas vezes preferidos como triagens “primárias” pelo fato de que podem ser geradas para permitir o desenvolvimento rápido e a detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto de teste. Além disso, os efeitos da toxicidade celular e biodisponibilidade do composto de teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, sendo que o ensaio em vez de concentrar-se principalmente nos efeito do fármaco sobre o alvo molecular, pode ser evidente em uma alteração de afinidade de ligação entre um polipeptídeo de ActRIIB e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante de ActRIIB).
[00134] Somente para ilustrar, em uma ensaio de triagem exemplificador da presente invenção, o composto de interesse é colocado em contato com um polipeptídeo de ActRIIB isolado e purificado que é normalmente capaz de ligar-se a um ligante de ActRIIB, conforme adequado para a intenção do ensaio. À mistura do composto e polipeptídeo de ActRIIB é, então, adicionada uma composição que contém um ligante de ActRIIB. A detecção e quantificação de complexos de ActRIIB/ligante de ActRIIB fornecem um meio para a determinação da eficácia do composto na inibição (ou potencialização) da formação de complexo entre o polipeptídeo de ActRIIB e sua proteína de ligação. A eficácia do composto pode ser avaliada mediante a geração de curvas de resposta de dose a partir de dados obtidos com o uso de diversas concentrações do composto de teste. Além disso, um ensaio de controle também pode ser executado para fornecer uma linha de base para comparação. Por exemplo, em um ensaio de controle, o ligante de ActRIIB isolado e purificado é adicionado a uma composição que contém o polipeptídeo de ActRIIB, e a formação do complexo de ActRIIB/ligante de ActRIIB é quantificada na ausência do composto de teste. Deve-se compreender que, em geral, a ordem na qual os reagentes podem ser misturados pode ser variada e podem ser misturados de maneira simultânea. Além disso, no lugar de proteínas purificadas, os extratos celulares e lisatos podem ser usados para produzir um sistema de ensaio livre de célula adequado.
[00135] A formação de complexo entre o polipeptídeo de ActRIIB e sua proteína de ligação pode ser detectada por meio de uma variedade de técnicas. Por exemplo, a modulação da formação de complexes pode ser quantificada com o uso, por exemplo, de proteínas marcadas de maneira detectável, tais como o polipeptídeo de ActRIIB ou sua proteína de ligação radiomarcada (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcada de maneira fluorescente (por exemplo, FITC) ou marcada de maneira enzimática, por meio de imunoensaio, ou por meio de detecção cromatográfica.
[00136] Em determinadas modalidades, a presente invenção considera o uso de ensaios de polarização por fluorescência e ensaios de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) na medição, de forma direta ou indireta, do grau de interação entre um polipeptídeo de ActRIIB e sua proteína de ligação. Adicionalmente, outros modos de detecção, tais como aqueles com base em guias de onda ópticos (publicação PCT WO 96/26432 e patente U.S. no. 5.677.196), ressonância de plasmon superficial (SPR), sensores de carga superficial e sensores de força superficial, são compatíveis com muitas modalidades da invenção.
[00137] Além disso, a presente invenção considera o uso de um ensaio de bloqueadores de interação, também conhecidos como o “ensaio híbrido duplo”, para a identificação de agentes que interrompem ou potencializam a interação entre um polipeptídeo de ActRIIB e seu parceiro de ligação. Vide, por exemplo, a patente U.S. no. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a presente invenção considera o uso de sistemas híbridos duplos inversos para identificar os compostos (por exemplo, pequenas moléculas ou peptídeos) que dissociam as interações entre um polipeptídeo de ActRIIB e sua proteína de ligação. Vide, por exemplo, Vidal e Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal e Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; e patente U.S. nos. 5.525.490; 5.955.280 e 5.965.368.
[00138] Em determinadas modalidades, os presentes compostos são identificados por sua capacidade de interagir com um polipeptídeo de ActRIIB. A interação entre o composto e o polipeptídeo de ActRIIB pode ser covalente ou não- covalente. Por exemplo, tal interação pode ser identificada no nível de proteína com o uso de métodos bioquímicos in vitro, que incluem foto-reticulação, ligação de ligante radiomarcada e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Em determinados casos, os compostos podem ser submetidos à triagem em um ensaio à base de mecanismo, tal como um ensaio para detectar os compostos que se ligam a um polipeptídeo de ActRIIB. Isto pode incluir um evento de ligação de fase sólida ou fase fluida. Alternativamente, o gene que codifica um polipeptídeo de ActRIIB pode ser transfectado com um sistema repórter (por exemplo, β-galactosidase, luciferase ou proteína fluorescente verde) em uma célula e submetido à triagem frente à biblioteca, de preferência, por meio de uma triagem de alta taxa de rendimento ou com elementos individuais da biblioteca. Outros ensaios de ligação à base de mecanismo podem ser usados, por exemplo, os ensaios de ligação que detectam mudanças em energia livre. Os ensaios de ligação podem ser executados com o alvo fixo a um poço, esfera ou circuito integrado ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvido por meio de eletroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados usualmente com o uso de ressonância de plasmon superficial, fluorescência ou colorimétrica.
5. Usos terapêuticos exemplificadores
[00139] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de bloqueador de GDF da presente invenção podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em mamíferos, tais como roedores e primatas e, particularmente, pacientes humanos. Adicionalmente, conforme mostrado no presente documento, os polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser usados em combinação com ativadores do receptor de EPO para alcançar um aumento em células vermelhas do sangue em faixas de dosagem menores. Isto pode ser benéfico na redução dos efeitos fora de alvo conhecidos e dos riscos associados a altas doses de ativadores do receptor de EPO. Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de anemia em um indivíduo que necessite desse tratamento, por meio da administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo bloqueador de GDF ou uma combinação (ou terapia concomitante) de um polipeptídeo bloqueador de GDF e um ativador do receptor de EPO. Estes métodos podem ser usados para tratamentos terapêuticos e profiláticos de mamíferos e, particularmente, humanos.
[00140] OS polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser usados em combinação com ativadores do receptor de EPO para reduzir a dose exigida destes ativadores em pacientes que são suscetíveis a efeitos adversos de EPO. Os efeitos adversos primários de EPO consistem em um aumento excessivo nos níveis de hematócrito ou hemoglobina e policitemia. Os níveis elevados de hematócrito podem conduzir a hipertensão (mais particularmente, o agravamento da hipertensão) e trombose vascular. Outros efeitos adversos de EPO que têm sido relatados, alguns dos quais relacionados à hipertensão, consistem em dores de cabeça, síndrome semelhante a influenza, obstrução de derivações, infartos do miocárdio e convulsões cerebrais devido à trombose, encefalopatia hipertensiva, e aplasia de célula vermelha do sangue (Singibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).
[00141] O efeito rápido sobre os níveis de célula vermelha do sangue dos polipeptídeos de bloqueador de GDF apresentados no presente documento indicam que estes agentes agem por meio de um mecanismo diferente da EPO. Consequentemente, estes antagonistas podem ser úteis para o aumento de níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina em pacientes que não respondem bem à EPO. Por exemplo, um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser benéfico para um paciente no qual a administração de uma dose normal a aumentada (>300 IU/kg/semana) de EPO não resulta no aumento do nível de hemoglobina até o nível alvo. Os pacientes com uma resposta de EPO inadequada são encontrados para todos os tipos de anemia, mas números maiores de não-respondedores têm sido observados particularmente com frequência em pacientes com cânceres e pacientes com doença renal em estágio terminal. Uma resposta inadequada à EPO pode ser constitutiva (isto é, observada sob o primeiro tratamento com EPO) ou adquirida (por exemplo, observada sob o tratamento repetido com EPO).
[00142] Para uso na presente invenção, um agente terapêutico que “previne” um distúrbio ou condição se refere a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do distúrbio ou condição na amostra tratada em relação a um amostra de controle não-tratada, ou retarda o início ou reduz a severidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condição em relação à amostra de controle não-tratada. O termo “tratamento”, para uso na presente invenção, inclui profilaxia da condição mencionada ou melhora ou eliminação da condição uma vez que tenha sido estabelecida. Em cada caso, a prevenção ou tratamento pode ser discernida na diagnose fornecida por um médico ou outro provedor de cuidados com a saúde e o resultado pretendido da administração do agente terapêutico.
[00143] Conforme mostrado no presente documento, os polipeptídeos de bloqueador de GDF, opcionalmente, combinados com um ativador do receptor de EPO, podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina ou reticulócito em indivíduos saudáveis, e tais polipeptídeos de bloqueador de GDF podem ser usados em populações de paciente selecionadas. Os exemplos de populações de paciente adequadas incluem aquelas com níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina indesejavelmente baixos, tais como pacientes que têm uma anemia, e aquelas que estão em risco para o desenvolvimento de níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina indesejavelmente baixos, tais como aqueles pacientes que estão prestes a se submeter à cirurgia delicada ou outros procedimentos que podem resultar em perda de sangue substancial. Em uma modalidade, um paciente com níveis de célula vermelha do sangue adequados é tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue e, então, o sangue é retirado e armazenado para o uso posterior em transfusões.
[00144] Os polipeptídeos de bloqueador de GDF, opcionalmente, combinados com um ativador do receptor de EPO, apresentado no presente documento, podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em pacientes que têm uma anemia. Quando se observa os níveis de hemoglobina em humanos, um nível menor do que o normal para a idade e categoria de gênero adequada pode ser indicativo de anemia, embora as variações individuais sejam levadas em conta. Por exemplo, um nível de hemoglobina de 12 g/dl é geralmente considerado o limite inferior de normal na população adulta em geral. As causas potenciais incluem perda de sangue, déficits nutricionais, reação à medicação, diversos problemas com a medula óssea e muitas doenças. Mais particularmente, a anemia tem sido associada a uma variedade de distúrbios que incluem, por exemplo, insuficiência renal crônica, síndrome mielodisplásica, artrite reumatóide, transplante de medula óssea. A anemia também pode ser associada às seguintes condições: tumores sólidos (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer no cólon); tumores do sistema linfático (por exemplo, leucemia linfóide crônica, linfomas não-Hodgkins e Hodgkins); tumores do sistema hematopoético (por exemplo, leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo); terapia de radiação; quimioterapia (por exemplo, regimes contendo platina); doenças inflamatórias e autoimunes, que incluem, mas não se limitam a, artrite reumatóide, outras artrites inflamatórias, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doenças de pele crônicas ou agudas (por exemplo, psoríase), doença intestinal inflamatória (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa); doença renal aguda ou crônica ou insuficiência renal que inclui condições idiopáticas ou congênitas; doença do fígado aguda ou crônica; hemorragia aguda ou crônica; situações onde a transfusão de células vermelhas do sangue não é possível devido a alo ou auto- anticorpos do paciente e/ou por razões religiosas (por exemplo, algum membro das Testemunhas de Jeová); infecções (por exemplo, malária, osteomielite); hemoglobinopatias, que incluem, por exemplo, doença de célula falciforme, talassemias; uso ou abuso de fármaco, por exemplo, uso indevido de álcool; pacientes pediátricos com anemia a partir de qualquer causa para evitar transfusão; e pacientes idosos ou pacientes com doença cardiopulmonar subjacente com anemia que não podem receber transfusões devido a preocupações sobre a sobrecarga circulatória.
[00145] Os polipeptídeos de bloqueador de GDF, opcionalmente, combinados com um ativador do receptor de EPO, seriam adequados para o tratamento de anemias de medula óssea hipoproliferativa, as quais estão tipicamente associadas a pouca mudança na morfologia de célula vermelha do sangue (RBC). As anemias hipoproliferativas incluem: 1) anemia de doença crônica, 2) anemia de doença do rim e 3) anemia associada a estados hipometabólicos. Em cada um destes tipos, os níveis de eritropoetina endógena são inadequadamente baixos para o grau de anemia observado. Outras anemias hipoproliferativas incluem: 4) anemia deficiente de ferro de fase primária e 5) anemia causada por danos à medula óssea. Nestes tipos, os níveis de eritropoetina endógena são adequadamente elevados para o grau de anemia observado.
[00146] O tipo mais comum consiste na anemia de doença crônica, a qual abrange inflamação, infecção, lesão de tecido e condições, tais como câncer, e é distinguida tanto por baixos níveis de eritropoetina como por uma resposta inadequada á eritropoetina na medula óssea (Adamson, 2008, Harrison’s Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, Nova Iorque, pp 628-634). Muitos fatores podem contribuir para a anemia relacionada ao câncer. Alguns estão associados ao próprio processo da doença e à geração de citocinas inflamatórias, tais como interleucina-1, interferon-gama e fator de necrose de tumor (Bron et al., 2001, Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6). Entre seus efeitos, a inflamação induz a hepcidina peptídeo chave regulador de ferro, inibindo, assim, a exportação de ferro a partir de macrófagos e limitando, geralmente, a disponibilidade de ferro para eritropoiese (Ganz, 2007, J Am Soc Nephrol 18:394-400). A perda de sangue através de diversas vias também pode contribuir para a anemia relacionada ao câncer. A prevalência de anemia devido ao progresso do câncer varia com o tipo de câncer, que se situa em uma faixa a partir de 5% em câncer de próstata até 90% em mieloma múltiplo. A anemia relacionada ao câncer tem profundas consequências para os pacientes, que incluem fatiga e qualidade de vida reduzida, eficácia do tratamento reduzida e mortalidade aumentada.
[00147] A doença renal crônica está associada à anemia hipoproliferativa que varia em severidade com o grau de insuficiência renal. Tal anemia é principalmente devido à produção inadequada de eritropoetina e sobrevivência reduzida de células vermelhas do sangue. A doença renal crônica progride usualmente de maneira gradual durante um período de anos ou décadas para a doença de fase terminal (estágio 5), neste momento é exigida a diálise ou transplante de rim para a sobrevivência do paciente. A anemia se desenvolve muitas vezes primeiro neste processo e piora à medida que a doença progride. As consequências clínicas da anemia de doença do rim são bem documentadas e incluem o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda, função cognitiva deficiente, qualidade de vida reduzida e função imune alterada (Levin et al., 1999, Am J Rim Dis 27:347-354; Nissenson, 1992, Am J Rim Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki et al., 1995, Am J Rim Dis 25:548-554; Gafter et al., 1994, Rim Int 45:224-231). Conforme demonstrado pelos requerentes em um modelo de camundongo de doença renal crônica (vide exemplo abaixo), um polipeptídeo bloqueador de GDF, opcionalmente, combinado com um ativador do receptor de EPO, pode ser usado para tratar a anemia de doença do rim.
[00148] Muitas condições que resultam em uma taxa hipometabólica podem produzir uma anemia hipoproliferativa branda a moderada. Entre tais condições estão os estados de deficiência endócrina. Por exemplo, a anemia pode ocorrer em doença de Addison, hipotireoidismo, hiperparatiroidismo, ou machos que são castrados ou tratados com estrogênio. A anemia branda a moderada também pode ocorrer com a ingestão dietética reduzida de proteína, uma condição particularmente prevalente nos idosos. Finalmente, a anemia pode se desenvolver em pacientes com doença do fígado crônica que surge a partir de qualquer causa (Adamson, 2008, Harrison’s Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, Nova Iorque, pp 628-634).
[00149] A anemia que resulta a partir da perda sanguínea aguda de volume suficiente, tal como a partir de trauma ou hemorragia pós-parto, é conhecida como anemia pós-hemorrágica aguda. A perda sanguínea aguda causa inicialmente a hipovolemia sem anemia, desde que haja depleção proporcional de RBCs junto com outros constituintes do sangue. No entanto, a hipovolemia irá disparar rapidamente os mecanismos fisiológicos que deslocam fluido a partir do compartimento extravascular para o compartimento vascular, o qual resulta em hemodiluição e anemia. Se crônica, a perda de sangue depleta gradualmente os armazenamentos de ferro do corpo e conduz eventualmente à deficiência de ferro. Conforme demonstrado pelos requerentes em um modelo de camundongo (vide exemplo abaixo), um polipeptídeo bloqueador de GDF, opcionalmente combinado com um ativador do receptor de EPO, pode ser usado acelerar a recuperação a partir da anemia de perda sanguínea aguda.
[00150] A anemia de deficiência de ferro consiste no estágio final e um progresso graduado de aumento de deficiência de ferro que inclui equilíbrio de ferro negativo e eritropoiese de deficiente de ferro como estágios intermediários. A deficiência de ferro pode resultar a partir da demanda de ferro aumentada, absorção de ferro diminuída ou perda de ferro aumentada, conforme exemplificado em condições, tais como, gravidez, dieta inadequada, falta de absorção intestinal, inflamação aguda ou crônica e perda de sangue aguda ou crônica. Com a anemia branda a moderada deste tipo, a medula óssea permanece hipoproliferativa e a morfologia de RBC é predominantemente normal; no entanto, até a anemia branda pode resultar em algumas RBCs hipocrômicas microcíticas e a transição para a anemia de deficiente de ferro severa é acompanhada pela hiperproliferação da medula óssea e RBCs hipocrômicas e microcíticas progressivamente prevalentes (Adamson, 2008, Harrison’s Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, Nova Iorque, pp 628-634). A terapia adequada para anemia de deficiência de ferro depende de sua causa e severidade, com preparações de ferro orais, formulações de ferro parenterais e transfusão de RBC como opções convencionais principais. Um polipeptídeo bloqueador de GDF, opcionalmente combinado com um ativador do receptor de EPO, poderia ser usado para tratar as anemias de deficiência de ferro crônicas sozinho ou em combinação com abordagens terapêuticas convencionais, particularmente, para tratar anemias de origem multifatorial.
[00151] As anemias hipoproliferativas podem resultar a partir da disfunção ou falência primária da medula óssea, em vez de disfunção secundária à inflamação, infecção ou progresso do câncer. Os exemplos proeminentes consistiriam em mielosupressão causada por fármacos quimioterapêuticos de câncer ou terapia de radiação de câncer. Uma ampla análise de testes clínicos descobriu que a anemia branda pode ocorrer em 100% de pacientes após a quimioterapia, enquanto a anemia mais severa pode ocorrer em até 80% de tais pacientes (Groopman et al., 1999, J Natl Cancer Inst 91:1616-1634). Os fármacos mielossupressores incluem: 1) agentes alquilantes, tais como mostardas de nitrogênio (por exemplo, melfalano) e nitrosouréias (por exemplo, estreptozocina); 2) antimetabólitos, tais como antagonistas de ácido fólico (por exemplo, metotrexato), análogos de purina (por exemplo, tioguanina) e análogos de pirimidina (por exemplo, gemcitabina); 3) antibióticos citotóxicos, tais como antraciclinas (por exemplo, doxorubicina); 4) inibidores de quinase (por exemplo, gefitinib); 5) inibidores mitóticos, tais como taxanos (por exemplo, paclitaxel) e alcaloides de vinca (por exemplo, vinorelbina); 6) anticorpos monoclonais (por exemplo, rituximab); e 7) inibidores de topoisomerase (por exemplo, topotecan e etoposide). Conforme demonstrado em um modelo de camundongo de anemia induzida por quimioterapia (vide exemplo abaixo), um polipeptídeo bloqueador de GDF, opcionalmente combinado com um ativador do receptor de EPO, pode ser usado para tratar a anemia causada por agentes quimioterapêuticos e/ou terapia de radiação.
[00152] Os polipeptídeos de bloqueador de GDF, opcionalmente combinados com um ativador do receptor de EPO, também seriam adequados para o tratamento de anemias de maturação de RBC perturbada, as quais são caracterizadas, em parte, por RBCs de tamanho menor do que o normal (microcíticas), grandes demais (macrocíticas), disforme ou colorida de forma anormal (hipocrômicas).
[00153] Os pacientes podem ser tratados com um regime de dosagem destinado a restaurar o paciente para um nível de hemoglobina alvo, usualmente entre cerca de 10 g/dl e cerca de 12,5 g/dl, e tipicamente de cerca de 11,0 g/dl (vide também Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19), embora os níveis alvo menores possam causar menos efeitos colaterais cardiovasculares. Alternativamente, os níveis de hematócrito (porcentagem do volume de uma amostra de sangue ocupado pelas células) podem ser usados como uma medição para a condição de células vermelhas do sangue. Os níveis de hematócrito para indivíduos saudáveis se situam na faixa a partir de 41 a 51% para machos adultos e a partir de 35 a 45% para fêmeas adultas. Os níveis de hematócrito alvo são usualmente em torno de 30 a 33%. Além disso, os níveis de hemoglobina/hematócrito variam de indivíduo para indivíduo. Deste modo, de forma ótima, o nível alvo de hemoglobina/hematócrito pode ser individualizado para cada paciente.
[00154] Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece métodos para gerenciar um paciente que tem sido tratado como ou é um candidato a ser tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF, mediante a medição de um ou mais parâmetros hematológicos no paciente. Os parâmetros hematológicos podem ser usados para avaliar a dosagem adequada para um paciente que é um candidato a ser tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF, para monitorar os parâmetros hematológicos durante o tratamento com um polipeptídeo bloqueador de GDF, para avaliar se ajustar a dosagem durante o tratamento com um polipeptídeo bloqueador de GDF e/ou para avaliar uma dose de manutenção adequada de um polipeptídeo bloqueador de GDF. Se um ou mais dos parâmetros hematológicos estiverem fora do nível normal, a dosagem com um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser reduzida, retardada ou terminada.
[00155] Os parâmetros hematológicos que podem ser medidos de acordo com os métodos fornecidos no presente documento incluem, por exemplo, os níveis de célula vermelha do sangue, pressão sanguínea, armazenamentos de ferro e outros agentes encontrados em fluidos corporais que se correlacionam com os níveis de célula vermelha do sangue aumentados, com o uso de métodos reconhecidos na técnica. Tais parâmetros podem ser determinados com o uso de uma amostra de sangue a partir de um paciente. Os aumentos em níveis de célula vermelha do sangue, níveis de hemoglobina e/ou níveis de hematócrito podem causar aumentos na pressão sanguínea.
[00156] Em uma modalidade, se um ou mais parâmetros hematológicos estiverem fora da faixa normal, ou no lado superior do normal, em um paciente que é um candidato a ser tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF, então, o início da administração dos polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser retardada até que os parâmetros hematológicos tenham voltado para um nível normal ou aceitável de forma natural ou através de intervenção terapêutica. Por exemplo, se um paciente candidato for hipertenso ou pré-hipertenso, então, o paciente pode ser tratado com um agente de diminuição de pressão sanguínea a fim de reduzir a pressão sanguínea do paciente. Qualquer agente de diminuição de pressão sanguínea adequado para a condição individual do paciente pode ser usado, que inclui, por exemplo, diuréticos, inibidores adrenérgicos (que incluem bloqueadores alfa e bloqueadores beta), vasodilatadores, bloqueadores de canal de cálcio, inibidores de enzima de conversão de angiotensina (ACE), ou bloqueadores do receptor de angiotensina II. A pressão sanguínea pode ser alternativamente tratada com o uso de um regime de exercício e dieta. Semelhantemente, se um paciente candidato tiver armazenamentos de ferro que são menores do que o normal, ou no lado inferior do normal, então, o paciente pode ser tratado com um regime adequado de dieta e/ou suplementos de ferro até que os armazenamentos de ferro do paciente tenham voltado para um nível normal ou aceitável. Para os pacientes que têm níveis de célula vermelha do sangue e/ou níveis de hemoglobina maiores do que o normal, então, a administração do polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser retardada até que os níveis tenham voltado para o nível normal ou aceitável.
[00157] Em determinadas modalidades, se um ou mais parâmetros hematológicos estiverem fora da faixa normal, ou no lado superior do normal, em um paciente que é um candidato a ser tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF, então o início da administração pode não ser retardada. No entanto, a quantidade de dosagem ou frequência de dosagem do polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser ajustada em uma quantidade que iria reduzir o risco de um aumento inaceitável nos parâmetros hematológicos que surgem sob a administração do polipeptídeo bloqueador de GDF. Alternativamente, um regime terapêutico pode ser desenvolvido para o paciente que combina um polipeptídeo bloqueador de GDF com um agente terapêutico que se dirige ao nível indesejável do parâmetro hematológico. Por exemplo, se o paciente tiver pressão sanguínea elevada, então, um regime terapêutico que envolve a administração de um polipeptídeo bloqueador de GDF e um agente de diminuição de pressão sanguínea podem ser projetados. Para um paciente que tem armazenamentos de ferro menores do que desejado, um regime terapêutico de um polipeptídeo bloqueador de GDF e suplementação de ferro pode ser desenvolvido.
[00158] Em uma modalidade, o(s) parâmetro(s) de linha de base para um ou mais parâmetros hematológicos podem ser estabelecidos para um paciente que é candidato a ser tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF e um regime de dosagem adequado estabelecido para este paciente com base no(s) valor(es) de linha de base. Alternativamente, os parâmetros de linha de base estabelecidos com base em um histórico medido do paciente poderiam ser usados para informar um regime de dosagem de polipeptídeo bloqueador de GDF adequado para um paciente. Por exemplo, se um paciente saudável tiver uma leitura de pressão sanguínea de linha de base estabelecida que está acima da faixa normal definida, pode não ser necessário colocar a pressão sanguínea do paciente na faixa que é considerada normal para a população geral antes do tratamento com o polipeptídeo bloqueador de GDF. Os valores de linha de base do paciente para um ou mais parâmetros hematológicos antes do tratamento com um polipeptídeo bloqueador de GDF também podem ser usados como os valores comparativos relevantes para o monitoramento de qualquer mudança nos parâmetros hematológicos durante o tratamento com o polipeptídeo bloqueador de GDF.
[00159] Em determinadas modalidades, um ou mais parâmetros hematológicos são medidos em pacientes que estão sendo tratados com um polipeptídeo bloqueador de GDF. Os parâmetros hematológicos podem ser usados para monitorar o paciente durante o tratamento e permitir o ajuste ou término da dosagem com o polipeptídeo bloqueador de GDF ou dosagem adicional com outros agentes terapêuticos. Por exemplo, se a administração de um polipeptídeo bloqueador de GDF resultar em um aumento em pressão sanguínea, nível de célula vermelha do sangue ou nível de hemoglobina, ou uma redução em armazenamentos de ferro, então, a dose do polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser reduzida em quantidade ou frequência a fim de diminuir os efeitos do polipeptídeo bloqueador de GDF sobre um ou mais parâmetros hematológicos. Se a administração ou um polipeptídeo bloqueador de GDF resultar em uma mudança em um ou mais parâmetros hematológicos que é adversa ao paciente, então, a dosagem do polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser terminada temporariamente, até que o(s) parâmetro(s) hematológico(s) voltem para um nível aceitável, ou permanentemente. Semelhantemente, se um ou mais parâmetros hematológicos não são colocados dentro de uma faixa aceitável após a redução da dose ou frequência de administração do polipeptídeo bloqueador de GDF, então, a dosagem pode ser terminada. Como uma alternativa, ou em adição a, redução ou término da dosagem com o polipeptídeo bloqueador de GDF, o paciente pode ser dosado com um agente terapêutico adicional que se dirige ao nível indesejável no(s) parâmetro(s) hematológico(s), tal como, por exemplo, um agente de diminuição de pressão sanguínea ou um suplemento de ferro. Por exemplo, se um paciente que é tratado com um polipeptídeo bloqueador de GDF tiver pressão sanguínea elevada, então, a dosagem com o polipeptídeo bloqueador de GDF pode continuar no mesmo nível e um agente de diminuição de pressão sanguínea é adicionado ao regime de tratamento, a dosagem com o polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser reduzida (por exemplo, em quantidade e/ou frequência) e um agente de diminuição de pressão sanguínea é adicionado ao regime de tratamento, ou a dosagem com o polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser terminada e o paciente pode ser tratado com um agente de diminuição de pressão sanguínea.
[00160] Em determinadas modalidades, os pacientes que são tratados com um polipeptídeo bloqueador de GDF, ou pacientes candidatos a serem tratados com um polipeptídeo bloqueador de GDF, consistem em pacientes que necessitam de crescimento muscular, tais como pacientes que sofrem de, ou em risco de desenvolver, um distúrbio neuromuscular ou distúrbio músculo-generativo. Por exemplo, os pacientes ou pacientes candidatos podem estar sofrendo de, ou em risco de desenvolver, doença de Lou Gehrig (ALS), síndrome de anorexia-caquexia de câncer, distrofia muscular, atrofia de músculo, doença pulmonar obstrutiva congestiva (e perda muscular associada ao COPD), síndrome de perda muscular, sarcopenia ou caquexia. A distrofia muscular se refere a um grupo de doenças musculares degenerativas caracterizadas pelo enfraquecimento e deterioração gradual de músculos esqueléticos e às vezes de músculos respiratórios e cardíacos. As distrofias musculares exemplificadoras que podem ser tratadas com um regime que inclui os presentes polipeptídeos de bloqueador de GDF incluem: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (BMD), Distrofia Muscular de Emery- Dreifuss (EDMD), Distrofia Muscular de Limb-Girdle (LGMD), Distrofia Muscular Facioescapuloumeral (FSH ou FSHD) (também conhecida como Landouzy-Dejerine), Distrofia Miotônica (MMD) (também conhecida como Doença de Steinert), Distrofia Muscular Oculofaríngea (OPMD), Distrofia Muscular Distal (DD), Distrofia Muscular Congênita (CMD).
6. Composições farmacêuticas
[00161] Em determinadas modalidades, os compostos (por exemplo, os polipeptídeos de bloqueador de GDF) da presente invenção são formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo bloqueador de GDF pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os presentes compostos podem ser formulados para a administração em qualquer forma conveniente para o uso na medicina humana ou veterinária.
[00162] Em determinadas modalidades, o método terapêutico da invenção inclui administrar a composição de forma sistêmica ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administrada, a composição terapêutica para o uso nesta invenção é, certamente, em uma forma fisiologicamente aceitável livre de pirogênio. Os agentes terapeuticamente úteis além dos polipeptídeos de bloqueador de GDF que também podem ser opcionalmente incluídos na composição, conforme descrito acima, podem ser administrados de maneira simultânea ou sequencial com os presentes compostos (por exemplo, os polipeptídeos de bloqueador de GDF) nos métodos da invenção.
[00163] Tipicamente, os compostos serão administrados de forma parenteral. As composições farmacêuticas adequadas para a administração parenteral podem compreender um ou mais polipeptídeos de bloqueador de GDF em combinação com uma ou mais dispersões, suspensões, emulsões ou soluções não-aquosas ou aquosas isotônicas esteriles farmaceuticamente aceitáveis, ou pós esteriles que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis esteriles pouco antes do uso, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido ou agentes espessantes ou de suspensão. Os exemplos de veículos aquosos e não-aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por meio do uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, mediante a manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e mediante o uso de tensoativos.
[00164] Adicionalmente, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma para a liberação para uma local de tecido alvo (por exemplo, medula óssea). Em determinadas modalidades, as composições da presente invenção podem incluir uma matriz capaz de liberar um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptídeos de bloqueador de GDF) para um local de tecido alvo (por exemplo, medula óssea), fornecendo uma estrutura para o tecido em desenvolvimento e otimamente capaz de ser absorvida no corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer a liberação lenta dos polipeptídeos de bloqueador de GDF. Tais matrizes podem ser formadas de materiais atualmente em uso para outras aplicações médicas implantadas.
[00165] A escolha do material da matriz tem por base a biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e propriedades de interface. A aplicação particular das presentes composições irá definir a formulação adequada. As matrizes potenciais para as composições podem ser sulfato de cálcio, tricálcio-fosfato, hidroxiapatita, ácido poliláctico e polianidridos biodegradáveis e quimicamente definidos. Outros materiais potenciais são biodegradável e biologicamente bem definidos, tais como colágeno dérmico e ósseo. As matrizes adicionais compreender proteínas puras ou componentes de matriz extracelulares. Outras matrizes potenciais são não-biodegradáveis e quimicamente definidas, tais como hidroxiapatita sinterizada, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. As matrizes podem compreender combinações de qualquer um dos tipos de material mencionados acima, tais como ácido poliláctico e hidroxiapatita ou colágeno e tricálcio-fosfato. As biocerâmicas podem ser alteradas em composição, tal como em cálcio-aluminato-fosfato e processadas para alterar o tamanho de poro, tamanho de partícula, formato de partícula e biodegradabilidade.
[00166] Em determinadas modalidades, os métodos da invenção podem ser administrados de forma oral, por exemplo, na forma de cápsulas, comprimidos, pílulas, tabletes, losangos (com o uso de uma base com sabor, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não-aquoso, ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou água em óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (com o uso de uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguatórios bucais, e similares, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um agente como uma ingrediente ativo. Um agente também pode ser administrado como um bolus, eletuário ou pasta.
[00167] Nas formas de dosagem sólidas para a administração oral (cápsulas, tabletes, pílulas, drágeas, pós, grânulos, e similares), um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou qualquer um dentre os seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose, e/ou acácia; (3) umectantes, tais como glicerol; (4) agentes de desintegração, tais como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tais como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umectantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulim e argila de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e misturas dos mesmos; e (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, as composições farmacêuticas também podem compreender agentes tampões. As composições sólidas de um tipo similar também podem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina com recheio mole ou duro com o uso de tais excipientes como lactose ou açúcares do leite, assim
[00168] As formas de dosagem líquidas para a administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em adição ao ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, rícino e gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas dos mesmos. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes de suspensão e emulsificação, adoçantes, flavorizante, colorantes, de adição de perfume e agentes conservantes.
[00169] As suspensões, em adição aos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, tais como alcoóis isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, agar-agar e tragacanto, e misturas dos mesmos.
[00170] As composições da invenção também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada mediante a inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares, nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida mediante a inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[00171] Compreende-se que o regime de dosagem será determinado pelo médico atendente que considera diversos fatores que modificam a ação dos presentes compostos da invenção (por exemplo, polipeptídeos de bloqueador de GDF). Os diversos fatores incluem, mas não se limitam a, a contagem de célula vermelha do sangue do paciente, nível de hemoglobina ou outras avaliações de diagnóstico, a contagem de célula vermelha do sangue alvo desejada, a idade, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer doença que pode estar contribuindo para um nível de célula vermelha do sangue reduzido, tempo de administração, e outros fatores clínicos. A adição de outros fatores de crescimento conhecidos à composição final ta,bem pode afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica dos níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina, assim como pelas avaliações de níveis de reticulócito e outros indicadores do processo hematopoético.
[00172] Em determinadas modalidades, a presente invenção também fornece a terapia de gene para a produção in vivo de polipeptídeos de bloqueador de GDF. Tal terapia iria alcançar seu efeito terapêutico mediante a introdução das sequências de polinucleotídeos de bloqueador de GDF em células ou tecidos que têm os distúrbios conforme relacionado acima. A liberação das sequências de polinucleotídeos de bloqueador de GDF pode ser alcançada com o uso de um vetor de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Prefere-se que a liberação terapêutica de sequências de polinucleotídeos de bloqueador de GDF consista no uso de lipossomos visados.
[00173] Os diversos vetores virais que podem ser utilizados para a terapia de gene conforme mostrado no presente documento incluem adenovírus, vírus de herpes, vaccinia, ou um vírus de RNA, tal como um retrovírus. O vetor retroviral pode consistir em um derivado de um retrovírus de ave ou murídeo. Os exemplos de vetores retrovirais nos quais um único gene estranho pode ser inserido incluem, mas não se limitam a: vírus de leucemia murídea de Moloney (MoMuLV), vírus de sarcoma murídeo de Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário murídeo (MuMTV), e vírus de Sarcoma de Rous (RSV). Uma série de vetores retrovirais adicionais podem incorporar múltiplos genes. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável de tal modo que as células submetidas à transdução possam ser identificadas e geradas. Os vetores retrovirais podem ser feitas específicas de alvo mediante a fixação, por exemplo, de um açúcar, um glicolipídio ou uma proteína. O direcionamento preferido é realizado mediante o uso de um anticorpo. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que as sequências de polinucleotídeo específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou fixadas a um envelope viral envelope para permitir a liberação de alvo específico do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo bloqueador de GDF.
[00174] Alternativamente, as células de cultura de tecido podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por meio da transfecção de fosfato de cálcio convencional. Estas células são, então, transfectadas com o plasmídeo do vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura.
[00175] Outro sistema de liberação direcionada para os polinucleotídeos bloqueadores de GDF consiste em um sistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, esferas e sistemas à base de lipídio, que incluem emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomos. O sistema coloidal preferido desta invenção consiste em um lipossomo. Os lipossomos consistem em vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos de liberação in vitro e in vivo. RNA, DNA e vírons intatos podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e serem liberados para as células em uma forma biologicamente ativa (vide, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Os métodos para a transferência de gene eficaz com o uso de um veículo de lipossomo, são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. A composição do lipossomo consiste usualmente em uma combinação de fosfolipídios, usualmente em combinação com esteroides, especialmente, colesterol. Outros fosfolipídios ou outros lipídios também podem ser usados. As características físicas dos lipossomos dependem do pH, intensidade iônica e a presença de cátions divalentes.
[00176] Os exemplos de lipídios úteis na produção de lipossomo incluem compostos de fosfatidil, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolipídios, cerebrosídeos e gangliosídeos. Os fosfolipídios ilustrativos incluem fosfatidilcolina de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. O direcionamento de lipossomos também é possível com base, por exemplo, em especificidade de órgão, especificidade de célula e especificidade de organela e é conhecido na técnica.
Exemplificação
[00177] A invenção que é agora geralmente descrita, será mis prontamente compreendida mediante a referência aos seguintes exemplos, os quais são incluídos somente para propósitos de ilustração de determinadas modalidades e de modalidades da presente invenção, e não são destinados a limitar a invenção.
Exemplo 1. Geração de um bloqueador de GDF
[00178] Os requerentes construíram um bloqueador de GDF conforme exposto a seguir. Um polipeptídeo que tem um domínio extracelular modificado de ActRIIB com ligação de ativina A muito reduzida em relação a GDF11 e/ou miostatina (como consequência de uma substituição de leucina-a-aspartato na posição 79 na SEQ ID NO: 1) foi fundido a um domínio Fc de humano ou camundongo com uma ligação mínima (três aminoácidos glicina) entre os mesmos. As construções são mencionadas como ActRIIB(L79D 20-134)-hFc e ActRIIB(L79D 20-134)-mFc, respectivamente. As formas alternativas com um glutamato em vez de um aspartato na posição 79 funcionaram de maneira similar (L79E). As formas alternativas com uma alanina em vez de uma valina na posição 226 em relação a SEQ ID NO: 7, abaixo, também foram geradas e executadas de forma equivalente em todos os aspectos testados. O aspartato na posição 79 (em relação a SEQ ID NO: 1, ou posição 60 em relação a SEQ ID NO: 7) é abaixo realçado em cinza. A valina na posição 226 em relação a SEQ ID NO: 7 também é realçado abaixo em cinza.
[00179] O bloqueador de GDF ActRIIB(L79D 20-134)-hFc é mostrado abaixo como purificado a partir de linhas de célula CHO (SEQ ID NO: 7).
[00180] GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE AGGP EVTYEP P PTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00181] A parte derivada de ActRIIB do bloqueador de GDF tem uma sequência de aminoácido apresentada abaixo (SEQ ID NO: 32), e esta parte poderia ser usada como um monômero ou como uma proteína de fusão não-Fc como um monômero, dímero ou complexo de ordem maior.
[00182] GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE AGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 32)
[00183] A proteína de bloqueador de GDF foi expressa em linhas de célula CHO. Três sequências líderes diferentes foram consideradas: (i) Melitina de abelha (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii) Ativador de plasminogênio de tecido (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9) (iii) Nativa: MTAPWVALALLWGSLCAGS (SEQ ID NO: 10).
[00184] A forma selecionada emprega o TPA líder e tem a seguinte sequência de aminoácido não processada:
[00185] MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELE RTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVAT EENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)
[00186] Este polipeptídeo é codificado pela seguinte sequência de ácido nucléico (SEQ ID NO:12):
[00187] A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GGACGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA
[00188] A purificação poderia ser alcançada por meio de uma série de etapas de cromatografia de coluna, que incluem, por exemplo, três ou mais dentre as seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de sefarose Q, cromatografia fenilsefarose, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de troca de cátion. A purificação poderia ser completa com a filtragem viral e troca de tampão. Em um exemplo de um esquema de purificação, o meio de cultura de célula é passadio sobre uma coluna de proteína A, lavado em 150 mM de Tris/NaCl (pH 8,0), então, lavado em 50 mM de Tris/NaCl (pH 8,0) e eluído com 0,1 M de glicina, pH 3,0. O eluído de pH baixo é mantido em temperatura ambiente por 30 minutos como uma etapa de liberação viral. O eluído é, então, neutralizado e passado sobre uma coluna de troca iônica de sefarose Q e lavado em 50 mM de Tris pH 8,0, 50 mM de NaCl e eluído em 50 mM de Tris pH 8,0, com uma concentração de NaCl entre 150 mM e 300 mM. O eluído é, então, alterado em 50 mM de Tris pH 8,0, 1,1 M de sulfato de amônio e passado sobre uma coluna de fenil sefarose, lavado e eluído em 50 mM de Tris pH 8,0 com sulfato de amônio entre 150 e 300 mM. O eluído é dialisado e filtrado para o uso.
[00189] Os bloqueadores de GDF adicionais (proteínas de fusão de ActRIIB- Fc modificadas a fim de reduzir a razão de ligação de ativina A em relação a miostatina ou GDF11) são descritos nos documentos sob os nos. PCT/US2008/001506 e WO 2006/012627, aqui incorporados a título de referência.
Exemplo 2. Bioensaio acerca da sinalização mediada por GDF-11 e Ativina.
[00190] Um ensaio de gene repórter de A-204 foi usado para avaliar os efeitos de proteínas de ActRIIB-Fc e bloqueadores de GDF sobre uma sinalização por GDF- 11 e Ativina A. Linha de célula: Rabdomiossarcoma Humano (derivado a partir de músculo). Vetor repórter: pGL3(CAGA)12 (Descrito em Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100). O motivo CAGA12 está presente em genes responsivos de TGF-Beta (gene PAI-1), assim, este vetor é de uso geral para fatores que sinalizam através de Smad2 e 3.
[00191] Dia 1: Células A-204 divididas em placas de 48 poços.
[00192] Dia 2: Células A-204 transfectadas com 10 ug de pGL3(CAGA)12 ou pGL3(CAGA)12(10 ug)+ pRLCMV (1 ug) e Fugene.
[00193] Dia 3: Fatores adicionados (diluídos em meio + 0,1 % de BSA). Inibidores precisam ser pré-incubados com os fatores por 1 h antes da adição às células. 6 horas depois, as células enxaguadas com PBS e células lisadas.
[00194] Isto é seguido por um ensaio de Luciferase. Na ausência de quaisquer inibidores, a Ativina A mostrou 10 vezes a estimulação de expressão de gene repórter e um ED50 ~ 2 ng/ml. GDF-11: 16 vezes a estimulação, ED50: ~ 1,5 ng/ml.
[00195] ActRIIB(20-134) é um inibidor potente da atividade de ativina, GDF-8 e GDF-11 neste ensaio. As variantes também foram testadas neste ensaio.
Exemplo 3. Inibição de GDF-11 por Truncamentos de terminal N e terminal C
[00196] As variantes de ActRIIB(20-134)-hFc com truncamentos no término N e/ou término C foram geradas e testadas acerca da atividade como inibidores de GDF- 11 e ativina. As atividades são mostradas abaixo (conforme medido em meios condicionados):
[00197] Truncamentos de ActRIIB-hFc de terminal C:
Figure img0001
Figure img0002
[00198] Conforme pode ser observado, os truncamentos de três (terminando com ...PPT), seis (terminando com ...YEP) ou mais aminoácidos no término C causa uma diminuição triplicada ou maior na atividade da molécula. O truncamento dos 15 aminoácidos finais da parte ActRIIB causa uma perda maior de atividade (vide documento sob o no. WO2006/012627).
[00199] Os truncamentos de terminal amino foram feitos no fundo de uma proteína de ActRIIB(20-131)-hFc. As atividades são mostradas abaixo (conforme medido em meios condicionados):
[00200] Truncamentos de ActRIIB-hFc de terminal N:
Figure img0003
[00201] Consequentemente, os truncamentos de dois, três ou quatro aminoácidos a partir do término N conduzem à produção de uma proteína mais ativa do que as versões com um domínio extracelular completo. Os experimentos adicionais mostram que um truncamento de cinco aminoácidos, o ActRIIB(25-131)-hFc tem atividade equivalente à forma não truncada e as deleções adicionais no término N continuam a degradar a atividade da proteína. Portanto, as construções ótimas terão um término C que termina entre o aminoácido 133 a 134 de SEQ ID NO: 1 e um término N que começa em aminoácidos 22 a 24 de SEQ ID NO: 1. Um término N que corresponde aos aminoácidos 21 ou 25 irá proporcionar a atividade que é similar à construção de ActRIIB(20-134)-hFc. Estes truncamentos também podem ser usados no contexto de bloqueadores de GDF, tais como uma variante L79D ou L79E.
[00202] Exemplo 4. Variantes de ActRIIB-Fc, Atividade à base de célula.
[00203] A atividade de proteínas ActRIIB-Fc e bloqueadores de GDF foi testada em um ensaio à base de célula, conforme descrito acima. Os resultados são resumidos na tabela abaixo. Algumas variantes foram testadas em diferentes construções de truncamento de terminal C. Conforme discutido acima, os truncamentos de cinco ou quinze aminoácidos causaram a redução em atividade. Os bloqueadores de GDF (variantes L79D e L79E) mostraram perda substancial de ligação de ativina, enquanto retém a inibição quase do tipo selvagem de GDF-11.
[00204] Ligação de ActRIIB-Fc solúvel a GDF11 e Ativina A:
Figure img0004
+ Atividade fraca (aproximadamente 1x10-6 KI) ++ Atividade moderada(aproximadamente 1x10-7 KI)
[00205] Diversas variantes têm sido avaliadas acerca da meia vida sérica em ratos. O ActRIIB(20-134)-Fc tem uma meia vida sérica de aproximadamente 70 horas. O ActRIIB(A24N 20-134)-Fc tem uma meia vida sérica de aproximadamente 100 a 150 horas. A variante A24N tem atividade no ensaio à base de célula (acima) e ensaios in vivo (abaixo) que são equivalentes à molécula do tipo selvagem. Junto com a meia vida mais longa, isto significa que no decorrer do tempo uma variante A24N proporcionará um efeito maior por unidade de proteína do que a molécula do tipo selvagem. A variante A24N, e qualquer uma dentre as outras variantes testadas acima, pode ser combinada com as moléculas de bloqueador de GDF, tais como as variantes L79D ou L79E.
[00206] Exemplo 5. Ligação de GDF-11 e Ativina A.
[00207] A ligação de determinadas proteínas de ActRIIB-Fc e bloqueadores de GDF aos ligantes foi testada em um ensaio BiaCore™.
[00208] As variantes ActRIIB-Fc ou proteína do tipo selvagem foram capturadas no sistema com o uso de um anticorpo anti-hFc. Os ligantes foram injetados e fluidos sobre as proteínas receptoras capturadas. Os resultados são resumidos nas tabelas abaixo.
[00209] Variantes IIB de especificidade de ligação de ligante.
Figure img0005
Figure img0006
[00210] Estes dados confirmam os dados do ensaio à base de célula, demonstrando que a variante A24N retém a atividade de ligação de ligante que é similar àquela da molécula de ActRIIB(20-134)-hFc, e que a molécula de L79D ou L79E retém a ligação de miostatina e GDF11, mas mostra a ligação à Ativina A consideravelmente diminuída (não quantificável).
[00211] Outras variantes têm sido geradas e testadas, conforme relatado no documento sob o no. WO2006/012627 (aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade), vide, por exemplo, pp. 59-60, com o uso de ligantes acoplados ao dispositivo e fluindo o receptor sobre os ligantes acoplados. Notavelmente, K74Y, K74F, K74I (e presumidamente outras substituições hidrofóbicas em K74, tais como K74L), e D80I, causam uma diminuição na razão de ligação de Ativina A para ligação de GDF11, em relação à molécula de K74 do tipo selvagem. Uma tabela dos dados em relação a estas variantes é reproduzida abaixo:
[00212] Ligação de ActRIIB-Fc solúveis a GDF11 e Ativina A (ensaio BiaCore)
Figure img0007
Figure img0008
* Nenhuma ligação observada -- < 1/5 WT ligação - ~ 1/2 WT ligação + WT ++ ligação < 2x aumentada +++ ligação ~5x aumentada ++++ ligação ~10x aumentada +++++ ligação ~ 40x aumentada
Exemplo 6. ActRIIB-hFc estimula eritropoiese em primatas não humanos
[00213] ActRIIB(20-134)-hFc (IgG1) foi administrado uma vez por semana por 1 mês a macacos cynomolgus machos e fêmeas por meio de injeção subcutânea. Quarenta e oito macacos cynomolgus (24/sexo) foram designados a um dos quatro grupos de tratamento (6 animais/sexo/grupo) e foram administradas injeções subcutâneas de veículo ou ActRIIB-hFc em 3, 10 ou 30 mg/kg, uma vez por semana durante 4 semanas (total de 5 doses). Os parâmetros avaliados incluíram patologia clínica geral (hematologia, química clínica, coagulação e exame de urina). O ActRIIB- hFc causou valores de reticulócito absolutos médios elevados e estatisticamente significantes no dia 15 em animais tratados. No dia 36, o ActRIIB-hFc causou várias mudanças hematológicas, que incluem valores de largura de distribuição de célula vermelha do sangue e reticulócito absoluto médio elevados e concentração de hemoglobina corpuscular média menor. Todos os grupos tratados e ambos os sexos foram afetados. Estes efeitos são consistentes com um efeito positivo de ActRIIB-hFc sobre a liberação de reticulócitos imaturos a partir da medula óssea. Este efeito foi revertido depois que o fármaco foi suspenso dos animais tratados (no dia 56 do estudo). Consequentemente, concluiu-se que o ActRIIB-hFc estimula a eritropoiese.
Exemplo 7. ActRIIB-mFc promove aspectos de eritropoiese em camundongos mediante a estimulação de atividades eritropoéticas esplénicas
[00214] Neste estudo, os efeitos da administração in vivo de ActRIIB(20-134)- mFc sobre a frequência de progenitores hematopoéticos na medula óssea e baço foram analisados. Um grupo de camundongos C57BL/6 foi injetado com PBS como um controle e a um segundo grupo de camundongos administrou-se duas doses de ActRIIB-mFc em 10 mg/kg e ambos os grupos foram sacrificados após 8 dias. O sangue periférico foi usado para executar as contagens de sangue completas e fêmures e baços foram usados para executar os ensaios clonogênicos in vitro para avaliar o teor de célula progenitora mieloide, eritróide e linfoide em cada órgão. No breve período de tempo deste estudo, nenhuma mudança significante foi observada nos níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina ou célula branca do sangue nos camundongos tratados. Nos fêmures não houve diferença nos números de célula nucleadas ou teor de progenitor entre os grupos de controle e tratado. Nos baços, o grupo tratado com composto experimentou um aumento estatisticamente significante no número de colônia de progenitor eritróide (CFU-E) por prato, frequência e número de progenitor total por baço. Além disso, um aumento foi observado no número de mielóide (CFU-GM), eritróide imaturo (BFU-E) e número de progenitor total por baço.
[00215] Animais:
[00216] Dezesseis camundongos fêmeas C57BL/6 com 6 a 8 semanas de idade foram usados no estudo. Oito camundongos foram injetados de maneira subcutânea com o composto de teste ActRIIB-mFc no dia 1 e 3, em uma dose de 10 mg/kg e oito camundongos foram injetados de maneira subcutânea com o controle de veículo, solução salina tamponada com fosfato (PBS), em um volume de 100 μL por camundongo. Todos os camundongos foram sacrificados 8 dias após a primeira injeção de acordo com as diretrizes relevantes de cuidados com animais. As amostras de sangue periférico (PB) a partir de animais individuais foram coletadas por meio de punção cardíaca e usadas para contagens de sangue completo e diferencial (CBC/Diff). Os fêmures e baços foram coletados a partir de cada camundongo.
[00217] Testes executaram:
[00218] Contagens de CBC/Diff
[00219] O PB a partir de cada camundongo foi coletado através de punção cardíaca e colocado nos tubos microtainer adequados. As amostras foram enviadas para CLV para análise em um contador CellDyn 3500.
[00220] Ensaios clonogênicos
[00221] Os progenitores clonogênicos das linhagens de mielóide, eritróide e linfóide foram avaliadas com o uso do sistema de meios à base de metilcelulose in vitro descrito abaixo.
[00222] Progenitores eritróides maduros:
[00223] Os progenitores clonogênicos das linhagens de eritróide maduras (CFU-E) foram cultivados em MethoCult™3334, um meio à base de metilcelulose contendo Eritropoetina (3 U/mL) humana recombinante (rh).
[00224] Progenitores linfóides:
[00225] Os progenitores clonogênicos da linhagem de linfóide (CFU-pre-B) foram cultivados em MethoCult® 3630, um meio à base de metilcelulose contendo Interleucina rh 7 (10 ng/mL).
[00226] Progenitores eritróides imaturos e mielóides:
[00227] Os progenitores clonogênicos das linhagens de granulócito-monócito (CFU-GM), eritróide (BFU-E) e multipotenciais (CFU-GEMM) foram cultivados em MethoCult™ 3434, um meio à base de metilcelulose contendo fator de célula-tronco murídea recombinante (rm) (50 ng/mL), Interleucina rh 6 (10 ng/mL), Interleucina rm 3 (10 ng/mL) e Eritropoetina rh (3 U/mL).
[00228] Métodos:
[00229] Os fêmures e baços de camundongo foram processados por meio de protocolos padrão. De forma resumida, a medula óssea foi obtida mediante a sufusão da cavidade femoral com meio de Dulbecco modificado por Iscove contendo 2% de soro bovino fetal (IMDM com 2% de FBS) com o uso de uma agulha de calibre 21 e seringa de 1 cc. As células do baço foram obtidas mediante o esmagamento de baços através de um filtro de 70 μM e enxaguando o filtro com IMDM com 2% de FBS. As contagens de célula nucleada em ácido acético glacial a 3% foram, então, executadas nas únicas suspensões de células com o uso de uma câmara de contagem Neubauer, de tal modo que as células totais por órgão possam ser calculadas. Para remover as células vermelhas do sangue contaminantes, as células de baço totais foram, então, diluídas com 3 vezes o volume de tampão de lise de cloreto de amônio e incubadas em gelo por 10 minutos. As células foram, então, lavadas e suspensas novamente em IMDM com 2% de FBS e uma segunda contagem de célula foram executadas para determinar a concentração celular de células após a lise.
[00230] Os estoques de célula foram feitos e adicionais a cada formulação de meio à base de metilcelulose para se obter as concentrações ótimas de plaqueamento para cada tecido em cada formulação de meio. As células de medula óssea foram plaqueadas em 1x105 células por prato em MethoCult™ 3334 para avaliar os progenitores eritróides maduros, 2x105 células por prato em MethoCult™ 3630 para avaliar os progenitores linfóides e 3x104 células por prato em MethoCult™ 3434 para avaliar os progenitores mieloides e eritróides imaturos. As células do baço foram plaqueadas em 4x105 células por prato em MethoCult™ 3334 para avaliar os progenitores eritróides maduros, 4x105 células por prato em MethoCult™ 3630 para avaliar os progenitores linfóides e 2x105 células por prato em MethoCult™ 3434 para avaliar progenitores mieloides e eritróides imaturos. As culturas plaqueadas em pratos triplicados foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 até que a avaliação e enumeração de colônia fossem executadas por pessoal treinado. Os progenitores eritróides maduros foram cultivados por 2 dias, os progenitores linfóides foram cultivados por 7 dias e os progenitores eritróides e mielóides maduros foram cultivados por 12 dias.
[00231] Análise:
[00232] O desvio padrão médio +/- 1 foi calculado para as culturas triplicadas dos ensaios clonogênicos e para os grupos de controle e tratamento para todos os conjuntos de dados.
[00233] A frequência de células de formação de colônia (CFC) em cada tecido foi calculada conforme exposto a seguir:
[00234] Células plaqueadas por prato
[00235] CFC médias marcadas por prato
[00236] CFC total por fêmur ou baço foi calculada conforme exposto a seguir:
[00237] CFC total marcada x contagem de célula nucleada por fêmur ou baço (após lise de RBC)
[00238] Número de células nucleadas cultivadas
[00239] Os testes t padrão foram executados para avaliar se houve diferenças no número médio de células ou progenitores hematopoéticos entre os camundongos de controle PBS e camundongos tratados com composto. Devido à subjetividade potencial da enumeração de colônia, um valor p de menos que 0,01 é considerado significante. Os valores médios (+/- SD) para cada grupo são mostrados nas tabelas abaixo.
[00240] Tabela: Parâmetros hematológicos
Figure img0009
Figure img0010
Tabela: C FC a partir do fêmur e baço
Figure img0011
* análise preliminar indica p<0,05
[00241] O tratamento de camundongos com ActRIIB(20-134)-mFc, no curto período de tempo deste estudo, não resultou em aumentos significantes no teor de célula vermelha do sangue ou hemoglobina. No entanto, o efeito sobre o teor de célula progenitora foi notável. Nos fêmures não houve diferença nos números de célula nucleadas ou teor de progenitor entre os grupos de controle e tratados. Nos baços, o grupo tratado com composto experimentou um aumento estatisticamente significante no número de célula nucleada antes da lise de célula vermelha do sangue e no número de colônia de progenitor eritróide maduro (CFU-E) por prato, frequência e número de progenitor total por baço. Além disso, um aumento foi observado no número de mielóide (CFU-GM), eritróide imaturo (BFU-E) e número de progenitor total por baço. Consequentemente, espera-se que no decorrer de um período mais longo, o tratamento de ActRIIB(20-134)-mFc possa resultar em teor elevado de célula vermelha do sangue e hemoglobina.
Exemplo 8: Um bloqueador de GDF aumenta os níveis de célula vermelha do sangue in vivo
[00242] Os camundongos machos com doze semanas de idade C57BL/6NTac foram designados para um dos dois grupos de tratamento (N=10). Os camundongos foram dosados com veículo ou como um polipeptídeo de ActRIIB variante (“bloqueador de GDF”) [ActRIIB(L79D 20-134)-hFc] por meio de injeção subcutânea (SC) em 10 mg/kg duas vezes por semana durante 4 semanas. No término do estudo, o sangue total foi coletado por meio de punção cardíaca em tubos contendo EDTA e analisados acerca da distribuição de célula com o uso de um analisador de hematologia HM2 (Abaxis, Inc). Designação de grupo
Figure img0012
[00243] O tratamento com o bloqueador de GDF não teve um efeito estatisticamente significante sobre o número de células brancas do sangue (WBC) comparado com os controles de veículo. Os números de célula vermelha do sangue (RBC) foram aumentados no grupo tratado em relação aos controles (vide tabela abaixo). Tanto o teor de hemoglobina (HGB) e hematócrito (HCT) também foram aumentados devido às células vermelhas do sangue adicionais. A largura média das células vermelhas do sangue (RDWc) foi maior nos animais tratados, indicando um aumento na concentração de células vermelhas imaturas do sangue. Portanto, o tratamento com o bloqueador de GDF conduz a aumentos em células vermelhas do sangue, com nenhum efeito distinguível sobre as populações de células brancas do sangue. Resultados de hematologia
Figure img0013
[00244] Exemplo 9: Um bloqueador de GDF é superior ao ActRIIB-Fc para o aumento de níveis de célula vermelha do sangue in vivo.
[00245] Os camundongos machos com dezenove semanas de idade C57BL/6NTac foram aleatoriamente designados para um dos três grupos. Os camundongos foram dosados com veículo (10 mM de solução salina tamponada com Tris, TBS), ActRIIB(20-134)-mFc do tipo selvagem ou bloqueador de GDF ActRIIB(L79D 20-134)-hFc por meio de injeção subcutânea duas vezes por semana durante três semanas. O sangue foi coletado por meio do sangramento da face em linha de base e após três semanas da dosagem e analisado acerca da distribuição de célula com o uso de um analisador de hematologia (HM2, Abaxis, Inc.)
[00246] O tratamento com ActRIIB-Fc ou o bloqueador de GDF não teve um efeito significante sobre os números de célula branca do sangue (WBC) comparado com os controles de veículo. A contagem de célula vermelha do sangue (RBC), hematócrito (HCT) e níveis de hemoglobina foram todos elevados em camundongos tratados com bloqueador de GDF, comparado com os controles ou a construção do tipo selvagem (vide tabela abaixo). Portanto, em uma comparação direta, o bloqueador de GDF promove aumentos em células vermelhas do sangue a uma extensão significantemente maior do que uma proteína de ActRIIB-Fc do tipo selvagem. De fato, neste experimento, a proteína ActRIIB-Fc do tipo selvagem não causou um aumento estatisticamente significante em células vermelhas do sangue, sugerindo que a dosagem maior ou mais longa seria necessária para revelar este efeito. Resultados de hematologia após três semanas de dosagem
Figure img0014
**=p<0,01
[00247] Exemplo 10. Geração de um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado
[00248] Conforme descrito no Exemplo 1, um bloqueador de GDF mencionado como ActRIIB(L79D 20-134)-hFc foi gerado pela fusão de terminal N de TPA líder ao domínio extracelular de ActRIIB (resíduos 20 a 134 em SEQ ID NO: 1) contendo uma substituição de leucina-a-aspartato (no resíduo 79 em SEQ ID NO: 1) e fusão de terminal C de domínio de Fc humano com ligação mínima (três resíduos de glicina) (Figura 3). Uma sequência de nucleotídeo que corresponde a esta proteína de fusão é mostrada na Figura 4.
[00249] Um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado, mencionado como ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, foi gerado por meio da fusão de terminal N de TPA líder ao domínio extracelular truncado (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) contendo uma substituição leucina-a-aspartato (no resíduo 79 em SEQ ID NO: 1) e fusão de terminal C de domínio Fc humano com ligação mínima (três resíduos de glicina) (Figura 5). Uma sequência de nucleotídeo que corresponde a esta proteína de fusão é mostrada na Figura 6.
[00250] Exemplo 11. Ligação de ligante seletiva pelo bloqueador de GDF com domínio extracelular ActRIIB de duplamente truncado
[00251] A afinidade de bloqueadores de GDF e outras proteínas de ActRIIB- hFc para vários ligantes foi avaliada in vitro com um instrumento Biacore™. Os resultados são resumidos na tabela abaixo. Os valores Kd foram obtidos por meio de ajuste de afinidade de estado estacionário devido à associação e dissociação muito rápida do complexo, o qual evitou a determinado precisa de kon e koff. Seletividade de ligante de variantes de Ac tRIIB-hFc:
Figure img0015
[00252] O bloqueador de GDF com um domínio extracelular truncado, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, se igualou ou ultrapassou a seletividade de ligante exibida pela variante mais longa, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, com perda considerável da ligação de ativina A e ativina B e retenção quase completa da ligação de GDF11 comparado com contrapartes de ActRIIB-hFc desprovidas da substituição L79D. Observe que o truncamento sozinho (sem a substituição L79D) não altera a seletividade entre os ligantes aqui exibidos [comparação de ActRIIB(L79 25-131)-hFc com ActRIIB(L79 20-134)-hFc].
Exemplo 12. Geração de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc com sequências de nucleotídeo alternativas
[00253] Para gerar o ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, o domínio extracelular de ActRIIB humano com uma substituição de aspartato na posição nativa 79 (SEQ ID NO: 1) e com truncamentos terminal N e terminal C (resíduos 25 a 131 em SEQ ID NO: 1) foi fundido de modo terminal N com uma sequência líder TPA em vez do líder ActRIIB nativo e de modo terminal C com um domínio Fc humano através de uma ligação mínima (três resíduos de glicina) (Figura 5). Uma sequência de nucleotídeo que codifica esta proteína de fusão é mostrada na Figura 6 (SEQ ID NO: 27) e uma sequência de nucleotídeo alternativa que codifica exatamente a mesma proteína de fusão é mostrada na Figura 9 (SEQ ID NO: 30). Esta proteína foi expressa e purificada com o uso da metodologia descrita no Exemplo 1.
Exemplo 13. Bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado aumenta a proliferação de progenitores eritróides em camundongos
[00254] O ActRIIB(L79D 25-131)-hFc foi avaliado para determinar seu efeito sobre a proliferação de progenitores eritróides. Os camundongos C57BL/6 machos (8 semanas de idade) foram tratados com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, s.c.; n = 6) ou veículo (TBS; n = 6) nos dias 1 e 4, então, submetidos à eutanásia no dia 8 para a coleta de baços, tíbias, fêmures e sangue. As células do baço e medula óssea foram isoladas, diluídas em meio de Dulbecco modificado por Iscove contendo 5% de soro bovino fetal, suspensas em meio à base de metilcelulose especializado e cultivadas por 2 ou 12 dias para avaliar os níveis de progenitores clonogênicos nos estágios de unidades formadoras de colônia de eritróide (CFU-E) e unidades formadoras de explosão eritróide (BFU-E), respectivamente. O meio à base de metilcelulose para a determinação de BFU-E (MethoCult M3434, Stem Cell Technologies) incluiu o fator de célula-tronco murídeo recombinante, interleucina-3, e interleucina-6, os quais não estavam presentes no meio de metilcelulose para a determinação de CFU-E (MethoCult M3334, Stem Cell Technologies), enquanto que ambos os meios continham eritropoetina, entre outros constituintes. Tanto para BFU- E como para CFU-E, o número de colônias foram determinados em placas de cultura duplicadas derivadas a partir de cada amostra de tecido e a análise estatística dos resultados teve por base o número de camundongos por grupo de tratamento.
[00255] As culturas derivadas do baço a partir de camundongos tratados com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc tiveram duas vezes o número de colônias de CFU-E conforme as culturas correspondentes a partir de camundongos de controle (P < 0,05), enquanto que o número de colônias de BFU-E não se diferiu significantemente com o tratamento in vivo. O número de colônias de CFU-E ou BFU-E a partir das culturas de medula óssea também não se diferiram significantemente com o tratamento. Conforme esperado, os números aumentados de colônias de CFU-E em culturas derivadas de baço foram acompanhados por mudanças altamente significantes (P < 0,001) no nível de célula vermelha do sangue (aumento de 11,6%), concentração de hemoglobina (aumento de 12%) e nível de hematócrito (aumento de 11,6%) na eutanásia em camundongos tratados com o ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, comparado com os controles. Estes resultados indicam que a administração in vivo de um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado pode estimular a proliferação de progenitores eritróides como parte de seu efeito total para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue.
Exemplo 14. Bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado compensa a anemia induzida por quimioterapia em camundongos
[00256] Os requerentes investigaram o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os parâmetros eritropoéticos em um modelo de camundongo de anemia induzida por quimioterapia com base em paclitaxel, o qual inibe a divisão celular mediante o bloqueio da polimerização de microtúbulo. Os camundongos C57BL/6 machos (8 semanas de idade) foram designados para um dos quatro tratamentos: 1) paclitaxel (25 mg/kg, i.p.) 2) ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, i.p.) 3) paclitaxel + ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 4) veículo (TBS).
[00257] O paclitaxel foi administrado no Dia 0, enquanto o ActRIIB(L79D 25- 131)-hFc ou veículo foi administrado nos Dias 0 e 3. As amostras de sangue foram coletadas para a análise de CBC a partir de coortes separados nos Dias 1, 3 e 5, e os resultados para os grupos de tratamento 1 a 3 (acima) foram expressos como a diferença por cento do veículo em um determinado ponto no tempo. O atrito devido à toxicidade de paclitaxel consistiu em um problema no coorte de somente paclitaxel no Dia 3 (onde n = 1); de outra forma, n = 3 a 5 por tratamento por ponto no tempo. Comparado com o veículo, o paclitaxel sozinho diminuiu a concentração de hemoglobina por quase 13% no Dia 5, enquanto a adição de ActRIIB(L79D 25-131)- hFc evitou este declínio induzido por paclitaxel (Figura 11). Os efeitos similares foram observados para níveis de hematócrito e RBC. Na ausência de paclitaxel, o ActRIIB(L79D 25-131)-hFc aumentou a concentração de hemoglobina por 10%, comparado com o veículo nos Dias 3 e 5 (Figura 11). Deste modo, um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado pode aumentar os níveis de células vermelhas do sangue de forma suficiente para compensar a anemia induzida por quimioterapia.
Exemplo 15. Bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado reverter a anemia induzida por nefrectomia em camundongos
[00258] Os requerentes investigaram o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre a anemia em um modelo de camundongo submetido à nefrectomia de doença renal crônica . Os camundongos C57BL/6 machos (11 semanas de idade) foram submetidos a uma operação simulada ou uma nefrectomia unilateral para reduzir a capacidade de produção de eritropoetina. Os camundongos foram deixados uma semana para a recuperação pós-cirúrgica e, então, tratados duas vezes na semana com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, i.p.; n = 15 por condição) ou veículo (TBS; n = 15 por condição) durante um total de 4 semanas. As amostras de sangue foram coletadas antes do início da dosagem e após 4 semanas de tratamento. Enquanto que os camundongos submetidos à nefrectomia tratados com o veículo exibiram um declínio significante no número de célula vermelha do sangue durante o período de tratamento de 4 semanas, o tratamento com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc não somente evitou o declínio, mas aumentou os níveis de célula vermelha do sangue 17% (P < 0,001) acima da linha de base (Figura 12), apesar a capacidade renal reduzida para a produção de eritropoetina. Nos camundongos submetidos à nefrectomia, o ActRIIB(L79D 25-131)-hFc também gerou aumentos significantes a partir da linha de base na concentração de hemoglobina e nível de hematócrito e, notavelmente, estimulou cada um destes parâmetros eritropoéticos até aproximadamente a mesma extensão sob as condições de nefrectomia que sob as condições de operação simulada (Figura 13). Deste modo, um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado pode aumentar os níveis de célula vermelha do sangue de maneira suficiente para reverter a anemia em um modelo de doença renal crônica .
Exemplo 16. Bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado aperfeiçoa a recuperação a partir da anemia induzida por perda de sangue em ratos
[00259] Os requerentes investigaram o efeito de ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os parâmetros eritropoéticos em um modelo de rato de anemia induzida por perda sanguínea aguda (anemia pós-hemorrágica aguda). Os ratos Sprague-Dawley machos (aproximadamente, 300 g) receberam um cateter jugular crônico no fornecedor (Harlan). No Dia 1, 20% do volume de sangue total foi retirado a partir de cada rato durante um período de 5 minutos através do cateter sob anestesia de isoflurano. O volume de sangue removido teve por base um valor para volume de sangue total calculado de acordo com a seguinte relação derivada por Lee e colegas de trabalho (J Nucl Med 25:72-76, 1985), para os ratos com peso corporal maior do que 120 g:
[00260] Volume de sangue total (ml) = 0,062 x peso corporal (g) + 0,0012
[00261] Um volume igual de solução salina tamponada com fosfato foi recolocada através do cateter no momento da remoção de sangue. Os ratos foram tratados com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, s.c.; n = 5) ou veículo (TBS; n = 5) nos Dias 0 e 3. As amostras de sangue para a análise de CBC foram removidas através do cateter nos Dias 1 (linha de base), 0, 2, 4 e 6.
[00262] Os ratos de controle responderam aos 20% de perda de sangue com uma queda de quase 15% nos níveis de células vermelhas do sangue no Dia 0. Estes níveis permaneceram significantemente menores do que a linha de base nos Dias 2 e 4, e não tinham se recuperado completamente no Dia 6 (Figura 14). Embora os ratos tratados com ActRIIB(L79D 25-131)-hFc mostrassem uma queda quase idêntica nos níveis de células vermelhas do sangue após 20% de perda de sangue, estes ratos exibiram, então, uma recuperação completa em tais níveis no Dia 2, seguida pela elevação adicional nos Dias 4 e 6, o qual representa uma aperfeiçoamento altamente significante sobre os níveis de controle nos pontos no tempo correspondentes (Figura 14). Os resultados similares foram obtidos para a concentração de hemoglobina. Estas descobertas demonstram que um bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado pode produzir uma recuperação mais rápida dos níveis de célula vermelha do sangue a partir da anemia causada por hemorragia aguda.
Exemplo 17. Bloqueador de GDF com domínio extracelular de ActRIIB truncado aumenta os níveis de células vermelhas do sangue em primatas não- humanos
[00263] Dois bloqueadores de GDF, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, foram avaliados acerca de sua capacidade de estimular a produção de célula vermelha do sangue em macaco cynomolgus. Os macacos foram tratados de forma subcutânea com o bloqueador de GDF (10 mg/kg; n = 4 machos/4 fêmeas), ou veículo (n = 2 machos/2 fêmeas) nos Dias 1 e 8. As amostras de sangue foram coletadas nos Dias 1 (linha de base de pré-tratamento), 3, 8, 15, 29 e 44, e foram analisados acerca dos níveis de célula vermelha do sangue (Figura 15), hematócrito (Figura 16), níveis de hemoglobina (Figura 17) e níveis de reticulócito (Figura 18). Os macacos tratados com veículo exibiram níveis diminuídos de células vermelhas do sangue, hematócrito e hemoglobina em todos os pontos no tempo de pós-tratamento, um efeito esperado da amostragem de sangue repetida. Em contrapartida, o tratamento com ActRIIB(L79D 20-134)-hFc ou ActRIIB(L79D 25-131)- hFc aumentou estes parâmetros no primeiro ponto no tempo de pós-tratamento (Dia 3) e os manteve em níveis substancialmente elevados durante a duração do estudo (Figuras 15 a 17). Consideravelmente, os níveis de reticulócito nos macacos tratados com ActRIIB(L79D 20-134)-hFc ou ActRIIB(L79D 25-131)-hFc foram substancialmente aumentados nos Dias 8, 15 e 29, comparado com o veículo (Figura 18). Este resultado demonstra que o tratamento de bloqueador de GDF aumentou a produção de precursores de célula vermelha do sangue, resultando em níveis elevados de célula vermelha do sangue.
[00264] Tomados em conjunto, estes dados demonstram que os bloqueadores de GDF truncados, assim como as variantes completas, podem ser usados como antagonistas seletivos de GDF11 e ligantes potencialmente relacionados para aumentar a formação de célula vermelha do sangue in vivo.
Exemplo 18. Bloqueador de GDF derivado a partir de ActRIIB5
[00265] Outros elementos têm relatado uma alternativa, forma solúvel de ActRIIB (designado ActRIIB5), na qual o exon 4, que inclui o domínio de transmembrana de ActRIIB, tem sido substituído por uma sequência de terminal C diferente (WO2007/053775).
[00266] A sequência de ActRIIB5 humano nativo sem seu líder é conforme exposto a seguir:
[00267] GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE AGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE
[00268] (SEQ ID NO: 36)
[00269] Uma substituição de leucina-a-aspartato, ou outras substituições ácidas, pode ser executada na posição nativa 79 (sublinhada e realçada em cinza) conforme descrito para construir o ActRIIB5(L79D) variante, a qual tem a seguinte sequência:
[00270] GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE AGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE
[00271] (SEQ ID NO: 37)
[00272] Esta variante pode ser conectada ao Fc humano com uma ligação TGGG para gerar uma proteína de fusão de ActRIIB5(L79D)-hFc humana com a seguinte sequência:
[00273] GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASW RNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE AGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHETGGGTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 38)
[00274] Esta construção pode ser expressa em células CHO.
Exemplo 19. Efeitos em camundongos do tratamento combinado com EPO e um bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado
[00275] A EPO induz a formação de células vermelhas do sangue mediante o aumento da proliferação de precursores eritróides, enquanto os bloqueadores de GDF poderiam afetar potencialmente a formação de células vermelhas do sangue em formas que complementam ou intensificam os efeitos da EPO. Portanto, os requerentes investigaram o efeito do tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sobre os parâmetros eritropoéticos. Aos camundongos C57BL/6 machos (9 semanas de idade) foi dada uma única injeção i.p. de EPO humano recombinante sozinho (epoetina alfa, 1800 unidades/kg), ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sozinho (10 mg/kg), tanto EPO como ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, ou veículo (solução salina tamponada com Tris). Os camundongos foram submetidos à eutanásia 72 h após a dosagem para a coleta de sangue, baços e fêmures.
[00276] Os baços e fêmures foram processados para se obter as células precursoras eritróides para a análise citométrica de fluxo. Após a remoção, o baço foi moído no meio de Dulbecco modificado por Iscove contendo 5% de soro bovino fetal e mecanicamente dissociado por pressionamento através de um coador de célula de 70-μm com o êmbolo a partir de uma seringa de 1 mL estéril. Os fêmures foram limpos de qualquer músculo residual ou tecido conjuntivo e as extremidades foram aparadas para permitir a coleta de medula mediante a sufusão da diáfise restante com meio de Dulbecco modificado por Iscove contendo 5% de soro bovino fetal através de uma agulha de calibre 21 conectada a uma seringa de 3 mL. As suspensões de células foram centrifugadas (2000 rpm por 10 min.) e os péletes de célula suspensos novamente em PBS contendo 5% de soro bovino fetal. As células (106) a partir de cada tecido foram incubadas com anti-IgG de camundongo para bloquear a ligação não-específica, então, incubadas com anticorpos marcados de modo fluorescente contra marcadores de superfície de célula de camundongo CD71 (receptor de transferrina) e Ter119 (um antígeno associado à glicoforina de superfície de célula A), lavados e analisados por meio de citometria de fluxo. As células mortas nas amostras foram excluídas a partir da análise por meio de contra-coloração com iodeto de propídio. A diferenciação de eritróide em baço ou medula óssea foi avaliada pelo grau de marcação de CD71, o qual diminui durante o curso de diferenciação, e marcação de Ter119, o qual é aumentado durante a diferenciação de eritróide terminal que começa com o estágio de proeritroblasto (Socolovsky et al., 2001, Blood 98:32613273; Ying et al., 2006, Blood 108:123-133). Deste modo, a citometria de fluxo foi usada para determinar o número de proeritroblastos (CD71highTer119low), eritroblastos basofílicos (CD71highTer119high), eritroblastos policromatofílicos + ortocromatofílicos (CD71medTer119high), e últimos eritroblastos ortocromatofílicos + reticulócitos (CD71lowTer119high), conforme descrito.
[00277] O tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc conduziu a um aumento surpreendentemente vigoroso em células vermelhas do sangue. No período de tempo de 72 h deste experimento, nem EPO e nem ActRIIB(L79D 25-131)-hFc sozinho aumentou o hematócrito significantemente, comparado com o veículo, enquanto que o tratamento combinado com os dois agentes conduziu a um aumento de quase 25% em hematócrito que foi de modo inesperado sinérgico, isto é, maior do que a soma de seus efeitos separados (Figura 19). A sinergia deste tipo é geralmente considerada a evidência de que os agentes individuais estão agindo através de diferentes mecanismos celulares. Os resultados similares também foram observados para as concentrações de hemoglobina (Figura 20) e concentrações de célula vermelha do sangue (Figura 21), das quais cada uma também foi aumentada de modo sinérgico por meio do tratamento combinado.
[00278] A análise de níveis de precursor eritróide revelou um padrão mais complexo. No camundongo, o baço é considerado o órgão primário responsável pela eritropoiese induzível (“estresse”). A análise citométrica de fluxo de tecido do baço em 72 h revelou que a EPO alterou de forma considerável o perfil de precursor eritropoético, comparado com o veículo, aumentando o número de eritroblastos basofílicos por mais do que 170% à custa dos últimos precursores (últimos eritroblastos + reticulócitos ortocromatofílicos), os quais diminuíram por mais do que um terço (Figura 22). Consideravelmente, o tratamento combinado aumentou os eritroblastos basofílicos significantemente, comparado com o veículo, mas a uma extensão menor do que a EPO sozinha, enquanto suporta a maturação não-diminuída de precursores de último estágio (Figura 22). Deste modo, o tratamento combinado com EPO e ActRIIB(L79D 25-131)-hFc aumentou a eritropoiese através de uma intensificação equilibrada de proliferação e maturação de precursor. Em contraste com o baço, o perfil de célula precursora na medula óssea após o tratamento combinado não se diferenciou de forma perceptível a partir daquele após a EPO sozinha. Os requerentes predizem a partir do perfil de precursor do baço que o tratamento combinado conduziria a níveis de reticulócito aumentados e seria acompanhado pela elevação constante de níveis de célula vermelha do sangue maduras, se o experimento fosse prolongado para além de 72 h.
[00279] Tomadas em conjunto, estas descobertas demonstram que um bloqueador de GDF com um domínio extracelular de ActRIIB truncado pode ser administrado em combinação com EPO para aumentar de modo sinérgico a formação de célula vermelha do sangue in vivo. A ação através de um mecanismo complementar, mas indefinido, um bloqueador de GDF pode moderar o forte efeito proliferativo de um ativador do receptor de EPO sozinho e ainda permitir que os níveis alvo de células vermelhas do sangue sejam alcançados com doses menores de um ativador do receptor de EPO, evitando, assim, os efeitos adversos potenciais ou outros problemas associados aos níveis maiores de ativação do receptor de EPO.
Incorporação a título de referência
[00280] Todas as publicações e patentes mencionadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência, em suas totalidades, como se cada publicação ou patente individual fosse indicada de forma específica e individual a ser incorporada a título de referência.
[00281] Embora as modalidades específicas do assunto têm sido discutidas, o relatório descritivo acima é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações serão evidentes para os elementos versados na técnica, sob a análise deste relatório descritivo e das reivindicações abaixo. O escopo completo da invenção deveria ser determinado pela referência às reivindicações, junto com seu escopo completo de equivalentes, e o relatório descritivo, junto com tais variações.

Claims (7)

1. Polipeptídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo forma um homodímero.
4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados a partir de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma porção de lipídeo, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é glicosilado.
6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo possui um padrão de glicosilação obtenível pela expressão em uma célula de ovário de hamster chinês.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo se liga a um ou mais ligantes selecionados do grupo que consiste em: activina A, activina B, BMP10, GDF8, BMP6 e GDF11.
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