BR112021009209A2 - moduladores da expressão de foxp3 - Google Patents

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Abstract

OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se métodos, compostos e composições úteis para inibição da expressão de FOXP3, que podem ser úteis para tratamento, prevenção ou melhoria de câncer. Determinadas modalidades fornecidas no presente documento são direcionadas a compostos e composições potentes e toleráveis úteis para inibição da expressão de FOXP3, que podem ser úteis para tratamento, prevenção, melhoria ou abrandamento da progressão de câncer. Em determinadas modalidades, o câncer está associado a um microambiente imunossupressor ou estroma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “QOLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊU- TICA QUE O COMPREENDE E USO DOS MESMOS”. Listagem de Sequências
[0001] O presente pedido está sendo depositado em conjunto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um ficheiro intitulado BIOLO3S44WOSEQ ST25.txt, criado a 11 de novembro de 2019, que tem 698 kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da listagem de sequências é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. Área
[0002] A presente invenção refere-se a métodos, compostos e composições úteis para inibição da expressão de FOXP3, que podem ser úteis para tratamento, prevenção ou melhoria de câncer. Antecedentes
[0003] Foxp3 é um fator de transcrição de definição da linhagem para células T reguladoras (Tregs) que controla um conjunto restrito de genes associados à imunossupressão. Tregs suprimem a imunidade (incluindo imunidade antitumoral) por meio de múltiplos mecanismos efetores. A presença de Tregs no tumor tem resultado de mau prognóstico em vários tipos de câncer. As Tregs não possuem um marcador de superfície único conhecido ou proteína de sinalização que poderia permitir o direcionamento com produtos biológicos. FOXP3 não pode ser alvo de anticorpos monoclionais ou de pequenas moléculas convencionais. Sumário
[0004] Determinadas — modalidades fornecidas no presente documento são direcionadas a compostos e composições potentes e toleráveis úteis para inibição da expressão de FOXP3, que podem ser úteis para tratamento, prevenção, melhoria ou abrandamento da progressão de câncer. Em determinadas modalidades, o câncer está associado a um microambiente imunossupressor ou estroma. Determinadas modalidades são direcionadas a compostos e composições úteis para inibição da expressão de FOXP3 em Tregs, que podem ser úteis para tratamento, prevenção, melhoria ou abrandamento da progressão de câncer associado com Tregs imunossupressoras. Descrição detalhada
[0005] É para ser entendido que tanto a descrição geral precedente como a seguinte descrição detalhada são somente exemplificativas e explicativas e não são restritivas das modalidades, como reivindicado. No presente documento, o uso do singular inclui o plural a não ser que especificamente afirmado de outro modo. Como usado no presente documento, o uso de “ou” significa “e/ou” a não ser que afirmado de outro modo. Além do mais, o uso do termo “incluindo” bem como outras formas, tais como "inclui" e "incluído”, não é limitante.
[0006] Os títulos das seções usados no presente documento são somente para fins de organização e não são para ser interpretados como limitantes do assunto descrito. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados em este pedido, incluindo, mas não se limitando a, patentes, pedidos de patentes, artigos, livros, tratados e registros de sequências de referência do GenBank e NCBlI, são deste modo expressamente incorporados por referência para as partes do documento discutidas no presente documento, bem como para sua totalidade.
[0007] É entendido que a sequência apresentada em cada SEQ ID NO nos exemplos contidos no presente documento é independente de qualquer modificação a uma fração de açúcar, uma ligação internucleosídica ou uma nucleobase. Como tal, os compostos definidos por um SEQ ID NO podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações em uma fração de açúcar, uma ligação internucleosídica ou uma nucleobase. Os compostos descritos por número ION indicam uma combinação de sequência de nucleobases, modificação química e motivo. A não ser que de outro modo afirmado, os seguintes termos têm os seguintes significados:
[0008] “2'-desoxinucleosídeo” significa um nucleosídeo compreen- dendo uma fração de açúcar de 2'-H(H) furanosila, como encontrada em ácidos desoxirribonucleicos (DNA) de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, um 2'-desoxinucleosídeo pode compre- ender uma nucleobase modificada ou pode compreender uma nucleobase de RNA (uracila).
[0009] “2-O-metóxietila” (também 2'-MOE e 2'-O0(CH2).-OCH3) se refere a uma modificação de O-metóxi-etila na posição 2 de um anel de furanosila Um açúcar modificado com 2'-O-metóxietila é um açúcar modificado.
[0010] “Nucleosídeo — 2-MOE” (também nucleosídeo 2'-O- metóxietila) significa um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar modificado com 2'-MOE.
[0011] “Nucleosídeo substituído em 2" ou “nucleosídeo modificado em 2" significa um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar substituído em 2' ou modificada em 2º. Como usado no presente documento, “substituída em 2" ou “modificada em 2" em referência a uma fração de açúcar significa uma fração de açúcar compreendendo pelo menos um grupo substituinte em 2' diferente de H ou OH.
[0012] “Sítio alvo 3" se refere ao nucleotídeo de um ácido nucleico alvo que é complementar ao nucleotídeo mais 3' de um composto particular.
[0013] “Sítio alvo 5" se refere ao nucleotídeo de um ácido nucleico alvo que é complementar ao nucleotídeo mais 5' de um composto particular.
[0014] “b-metilcitosina” significa uma citosina com um grupo metila ligado à posição 5.
[0015] “Cerca de” significa dentro de + 10% de um valor. Por exemplo, se for afirmado que “os compostos atingiram cerca de 70% de inibição de FOXP3”, está implícito que os níveis de FOXP3 são inibidos dentro de uma faixa de 60% a 80%.
[0016] “Administração” ou “administrando” se refere a vias de introdução de um composto ou composição fornecido no presente documento a um indivíduo para realizar sua função pretendida. Um exemplo de uma via de administração que pode ser usada inclui, mas não está limitada a, administração parenteral, tal como injeção ou infusão subcutânea, intravenosa ou intramuscular.
[0017] “Administrado — simultaneamente” ou “coadministração” significa a administração de dois ou mais compostos de qualquer modo no qual os efeitos farmacológicos de ambos se manifestam no paciente. A administração simultânea não requer que ambos os compostos sejam administrados em uma única composição farmacêutica, na mesma forma de dosagem, pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo. Os efeitos de ambos os compostos não necessitam de se manifestar ao mesmo tempo. Os efeitos necessitam somente de ser sobrepostos durante um período de tempo e não necessitam de ser coextensivos. A administração simultânea ou coadministração engloba administração paralela ou sequencial.
[0018] “Melhoria” se refere a uma melhoria ou atenuação de pelo menos um indicador, sinal ou sintoma de uma doença, disfunção ou condição associada. Em determinadas modalidades, a melhoria inclui um retardamento ou abrandamento da progressão ou gravidade de um ou mais indicadores de uma afecção ou doença. A progressão ou gravidade de indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas pelos especialistas na técnica.
[0019] “Animal” se refere a um ser humano ou a um animal não humano, incluindo, mas não se limitando a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não humanos, incluindo, mas não se limitando a, macacos e chimpanzés.
[0020] “Anticorpo”, como usado nesta invenção, se refere a uma imunoglobulina ou um seu fragmento ou derivado, e engloba qualquer polipeptídeo — compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, independentemente de ser produzido in vitro ou in vivo. O termo inclui, mas não está limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, humanos, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados e enxertados. À não ser que de outro modo modificado pelo termo "intacto", como em "anticorpos intactos", para os propósitos desta invenção, o termo "anticorpo" inclui também fragmentos de anticorpo tais como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, e outros fragmentos de anticorpo que retêm a função de ligação ao antígeno, isto é, a capacidade de se ligar, por exemplo, a CTLA-4 ou PD-L1, especificamente. Tipicamente, tais fragmentos compreenderiam um domínio de ligação ao antígeno.
[0021] “Anticorpo anti-CTLA-4" se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo CTLA-4. Anticorpos anti-CTLA-4 exemplificativos são descritos por exemplo nas Patentes US Nos. 6,682,736; 7,109,003; 7,123,281; 7,411,057; 7,824,679; 8,143,379; 7,807,797; e 8,491,895 (Tremelimumab é 11.2.1, nesta), que são no presente documento incorporadas por referência. Tremelimumab (Patente US No. 6,682,736) é um anticorpo anti-CTLA-4 exemplificativo.
[0022] “Anticorpo anti-OX40" se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo — OX40. Os anticorpos OX40 incluem anticorpos monoclonais e policlonais que são específicos para OX40 e seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em determinados aspectos, os anticorpos anti-OX40 como no presente documento descritos são anticorpos monoclonais (ou fragmentos de ligação ao seu antígeno), por exemplo, anticorpos monoclonais de murino, humanizados ou totalmente humanos. Em uma modalidade particular, o anticorpo OX40 é um agonista do receptor OX40, tal como o anticorpo monoclonal OX40 anti-humano de camundongo (9B12) descrito por Weinberg et al., J Immunother 29, 575-585 (2006). Em outra modalidade, um anticorpo OX40 é MEDIO562 como descrito em US 2016/0137740, incorporada no presente documento por referência. Em outras modalidades, o anticorpo que se liga especificamente a OX40, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, liga-se ao mesmo epítopo OX40 que o mAb 9B12.
[0023] “Anticorpo anti-PD-L1” se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo PD-L1. Anticorpos anti-PD-L1 exemplificativos são descritos, por exemplo, em US2013 / 0034559, Pat.US Nos. 8,779,108 e 9,493,565 que são incorporadas no presente documento por referência. Durvalumab (MEDI4736) é um anticorpo anti-PD-L1 exemplificativo. Outros anticorpos anti-PD-L1 incluem BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) e MPDL3280A (atezolizumabe) (Roche).
[0024] “Anticorpo anti-PD-1”" se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo PD-1. Anticorpos anti-PD-1 exemplificativos são descritos, por exemplo, em Pat. US Nos. 7,521,051; 8,008,449; 8,354,509; 9,073,994; 9,393,301; 9402899; e 9,439,962, que são incorporadas no presente documento por referência. Anticorpos anti-PD-1 exemplifica- tivos incluem, sem limitação, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe e AMP-514.
[0025] "Domínio de ligação ao antígeno", "fragmento de ligação ao antígeno" e "fragmento de ligação" se referem a uma parte de uma molécula de anticorpo que compreende aminoácidos responsáveis pela ligação específica entre o anticorpo e o antígeno.
Em casos, onde um antígeno é grande, o domínio de ligação ao antígeno pode somente se ligar a uma parte do antígeno.
Uma porção da molécula de antígeno que é responsável por interações específicas com o domínio de ligação ao antígeno é referida como "epitopo" ou "determinante antigênico". Um domínio de ligação ao antígeno tipicamente compreende uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, no entanto, não tem necessariamente de compreender ambas.
Por exemplo, um assim chamado fragmento de anticorpo “Fd” consiste somente em um domínio VH, mas ainda retém alguma função de ligação ao antígeno do anticorpo intacto.
Fragmentos de ligação de um anticorpo são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos.
Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e anticorpos de cadeia única.
Um anticorpo sem ser um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é entendido como tendo cada um dos locais de ligação idênticos.
A digestão de anticorpos com a enzima, papaína, resulta em dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, conhecidos também como fragmentos "Fab", e um "fragmento Fc", não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno mas tendo a capacidade de cristalizar.
A digestão de anticorpos com a enzima, pepsina, resulta no fragmento F(ab')2 no qual os dois braços da molécula de anticorpo permanecem ligados e compreendem dois locais de ligação ao antígeno.
O fragmento F(ab')2 tem a capacidade de reticular o antígeno. "Fvy" quando usado no presente documento se refere ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém sítios de reconhecimento do antígeno e ligação ao antígeno. "Fab" quando usado no presente documento se refere a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.
[0026] "mAb" se refere a anticorpo monoclonal. Os anticorpos da presente invenção compreendem, sem limitação, anticorpos nativos inteiros, anticorpos biespecíficos; anticorpos quiméricos; Fab, Fab', fragmentos da região V de cadeia simples (scFv), polipeptídeos de fusão e anticorpos não convencionais.
[0027] “Atividade antissenso” significa qualquer atividade detectável e/ou mensurável, atribuível à hibridação de um composto antissenso com seu ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a atividade antissenso é uma diminuição da quantidade ou expressão de um ácido nucleico alvo ou proteína codificada por tal ácido nucleico alvo em comparação com os níveis de ácido nucleico alvo ou os níveis de proteína alvo na ausência do composto antissenso para o alvo.
[0028] “Composto antissenso” significa um composto compreen- dendo um oligonucleotídeo e opcionalmente uma ou mais características adicionais, tais como um grupo conjugado ou grupo terminal. Exemplos de compostos antissenso incluem compostos de fita simples e fita dupla, tais como oligonucleotídeos, ribozimas, siRNA, ShRNA, ssRNA e compostos à base de ocupação.
[0029] “Inibição antissenso” significa a redução dos níveis de ácido nucleico alvo na presença de um composto antissenso complementar a um ácido nucleico alvo em comparação com os níveis de ácido nucleico alvo na ausência do composto antissenso.
[0030] “Mecanismos antissenso” são todos aqueles mecanismos envolvendo a hibridização de um composto com um ácido nucleico alvo, em que o resultado ou efeito da hibridização é degradação do alvo ou ocupação do alvo com interrupção simultânea da maquinaria celular envolvendo, por exemplo, transcrição ou splicing.
[0031] “Oligonucleotídeo antissenso” significa um oligonucleotídeo que tem uma sequência de nucleobases que é complementar a um ácido nucleico alvo ou região ou segmento do mesmo. Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso é especificamente hibridizável com um ácido nucleico alvo ou região ou segmento do mesmo.
[0032] “Nucleosídeo bicíclico” ou “BNA” significa um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar bicíclico. “Açúcar bicíclico” ou “fração de açúcar bicíclico” significa uma fração de açúcar modificado, compreendendo dois anéis, em que o segundo anel é formado através de uma ponte conectando dois dos átomos no primeiro anel, formando deste modo uma estrutura bicíclica. Em determinadas modalidades, o primeiro anel da fração de açúcar bicíclico é uma fração de furanosila. Em determinadas modalidades, a fração de açúcar bicíclico não compreende uma fração de furanosila.
[0033] “Grupo de ramificação” significa um grupo de átomos com pelo menos 3 posições que são capazes de formar ligações covalentes com pelo menos 3 grupos. Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação fornece uma pluralidade de sítios reativos para a conexão de ligantes presos a um oligonucleotídeo através de um ligante de conjugado e/ou uma fração clivável.
[0034] “Fração direcionada a células” significa um grupo conjugado ou porção de um grupo conjugado que é capaz de se ligar a um tipo de célula particular ou tipos de células particulares.
[0035] "cEt” ou “etila impedida” significa uma fração de açúcar furanosila bicíclico compreendendo uma ponte conectando o carbono 4' e o carbono 2', em que a ponte tem a fórmula: 4-CH(CH3)-O-2".
[0036] “Nucleosídeo cEt” significa um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar modificado com cEt.
[0037] “Modificação química' em um composto descreve as substituições ou mudanças através de reação química de qualquer uma das unidades no composto em relação ao estado original de tal unidade. “Nucleosídeo modificado” significa um nucleosídeo tendo, independen- temente, uma fração de açúcar modificado e/ou nucleobase modificada. “Oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo compreen- dendo pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, um açúcar modificado e/ou uma nucleobase modificada.
[0038] “Região quimicamente distinta” se refere a uma região de um composto que é de algum modo quimicamente diferente de outra região do mesmo composto. Por exemplo, uma região que tem nucleotídeos com 2'-O-metoxietila é quimicamente distinta de uma região que tem nucleotídeos sem modificações com 2'-O-metoxietila.
[0039] “Compostos antissenso quiméricos” significa compostos antissenso que têm pelo menos 2 regiões quimicamente distintas, tendo cada posição uma pluralidade de subunidades.
[0040] "População quiralmente enriquecida" significa uma pluralid- ade de moléculas de fórmula molecular idêntica, em que o número ou porcentagem de moléculas dentro da população que contêm uma configuração estereoquímica particular em um centro quiral particular é maior do que o número ou porcentagem de moléculas que se espera que contenham configuração estereoquímica particular no mesmo centro quiral particular dentro da população se o centro quiral particular fosse estereoaleatório. Populações quiralmente enriquecidas de moléculas com múltiplos centros quirais em cada molécula podem conter um ou mais centros quirais estereoaleatórios. Em determinadas modalidades, as moléculas são oligonucleotídeos modificados. Em determinadas modalidades, as moléculas são compostos compreen- dendo oligonucleotídeos modificados.
[0041] “Ligação clivável” significa qualquer ligação química capaz de ser quebrada. Em determinadas modalidades, uma ligação clivável é selecionada de: uma amida, uma poliamida, um éster, um éter, um dos ou ambos os ésteres de um fosfodiéster, um éster de fosfato, um carbamato, um dissulfeto ou um peptídeo.
[0042] “Fração clivável” significa uma ligação ou grupo de átomos que é clivado sob condições fisiológicas, por exemplo, dentro de uma célula, um animal ou um ser humano.
[0043] “Complementar” em referência a um oligonucleotídeo significa que a sequência de nucleobases de tal oligonucleotídeo ou uma ou mais regiões do mesmo correspondem à sequência de nucleobases de outro oligonucleotídeo ou ácido nucleico ou uma ou mais regiões dos mesmos quando as duas sequências de nucleobases estão alinhadas em direções opostas. As correspondências de nucleobases ou nucleobases complementares, como descritas no presente documento, estão limitadas aos seguintes pares: adenina (A) e timina (T), adenina (A) e uracila (U), citosina (C) e guanina (G), e 5-metilcitosina ("C) e guanina (G), a não ser que de outro modo especificado. Os oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos complementares não necessitam de ter complementaridade de nucleobases em cada nucleosídeo e podem incluir uma ou mais não correspondências de nucleobases. Em contraste, “totalmente complemen- tar” ou “100% complementar” em referência a oligonucleotídeos significa que tais oligonucleotídeos têm correspondências de nucleobases em cada nucleosídeo sem quaisquer não correspondências de nucleobases.
[0044] “Grupo conjugado” significa um grupo de átomos que está anexado a um oligonucleotídeo. Grupos conjugados incluem uma fração conjugada e um ligante de conjugado que liga a fração conjugada ao oligonucleotídeo.
[0045] “Ligante conjugado” significa um grupo de átomos compreendendo pelo menos uma ligação que conecta uma fração conjugada a um oligonucleotídeo.
[0046] “Fração conjugada” significa um grupo de átomos que está ligado a um oligonucleotídeo através de um ligante de conjugado.
[0047] “Contíguo” no contexto de um oligonucleotídeo se refere a nucleosídeos, nucleobases, frações de açúcar ou ligações internucleo- sídicas que estão imediatamente adjacentes uns em relação aos outros. Por exemplo, “nucleobases contíguas” significa nucleobases que estão imediatamente adjacentes umas em relação às outras em uma sequência.
[0048] “Desenho” ou “Desenhados para” se refere ao processo de desenho de um composto que se hibridiza especificamente com uma molécula de ácido nucleico selecionada.
[0049] “Diluente” significa um ingrediente em uma composição que carece de atividade farmacológica, mas é farmaceuticamente necessá- rio ou desejável. Por exemplo, o diluente em uma composição injetada pode ser um líquido, por exemplo, solução salina.
[0050] “Diferentemente modificado” significa modificações químicas ou substituintes químicos que são diferentes uns dos outros, incluindo ausência de modificações. Assim, por exemplo, um nucleosídeo com MOE e um nucleosídeo de DNA não modificado estão “diferentemente modificados”, embora o nucleosídeo de DNA não esteja modificado. Do mesmo modo, o DNA e o RNA estão “diferentemente modificados”, embora ambos sejam nucleosídeos não modificados ocorrendo naturalmente. Os nucleosídeos que são iguais exceto por compreen- derem diferentes nucleobases não estão diferentemente modificados. Por exemplo, um nucleosídeo compreendendo um açúcar modificado com 2-OMe e uma nucleobase de adenina não modificada e um nucleosídeo compreendendo um açúcar modificado com 2'-OMe e uma nucleobase de timina não modificada não estão diferentemente modificados.
[0051] “Dose” significa uma quantidade especificada de um composto ou agente farmacêutico fornecido em uma única administração ou em um período de tempo especificado. Em determinadas modalidades, uma dose pode ser administrada em dois ou mais bolos, comprimidos ou injeções. Por exemplo, em determinadas modalidades, onde é desejada administração subcutânea, a dose desejada pode requerer um volume não facilmente acomodado por uma única injeção. Em tais modalidades, podem ser usadas duas ou mais injeções para alcançar a dose desejada. Em determinadas modalidades, uma dose pode ser administrada em duas ou mais injeções para minimizar a reação do local de injeção em um indivíduo. Em outras modalidades, o composto ou agente farmacêutico é administrado por infusão ao longo de um período de tempo prolongado ou continuamente. As doses podem ser afirmadas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês.
[0052] “Regime de dose” é uma combinação de doses concebida para alcançar um ou mais efeitos desejados.
[0053] “Composto antissenso de fita dupla” significa um composto antissenso compreendendo dois compostos oligoméricos que são complementares um ao outro e formam um dúplex e em que um dos referidos dois compostos oligoméricos compreende um oligonucleotídeo.
[0054] “Quantidade eficaz” significa a quantidade de composto suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo com necessidade do composto. A quantidade eficaz pode variar entre indivíduos dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, da formulação da composição, avaliação da condição médica do indivíduo e outros fatores relevantes.
[0055] “Eficácia” significa a capacidade de produzir um efeito desejado.
[0056] “Expressão” inclui todas as funções pelas quais a informação codificada de um gene é convertida em estruturas presentes e operando em uma célula. Tais estruturas incluem os, mas não se limitam aos, produtos de transcrição e tradução.
[0057] “Gapmer” significa um oligonucleotídeo compreendendo uma região interna que tem uma pluralidade de nucleosídeos que suportam a clivagem por RNase H posicionada entre regiões externas que têm um ou mais nucleosídeos, em que os nucleosídeos compreendendo a região interna são quimicamente distintos do nucleosídeo ou nucleosídeos compreendendo as regiões externas. À região interna pode ser chamada de “lacuna” e as regiões externas podem ser chamadas de “asas”.
[0058] “Hibridização” significa o anelamento de oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos. Embora não limitado a um mecanismo particular, o mecanismo mais comum de hibridização envolve ligação de hidrogênio, que pode ser ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre nucleobases complementares. Em determinadas modalidades, as moléculas de ácido nucleico complementares incluem, mas não estão limitadas a, um composto antissenso e um alvo de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, as moléculas de ácido nucleico complementares incluem, mas não estão limitadas a, um oligonucleotídeo e um alvo de ácido nucleico.
[0059] “Imediatamente adjacentes” significa que não existem elementos intervenientes entre os elementos imediatamente adjacentes do mesmo tipo (por exemplo, não existem nucleobases intervenientes entre as nucleobases imediatamente adjacentes).
[0060] "Inibidor do ponto de verificação imunológico" significa um agente que inibe a expressão ou atividade de uma proteína que inibe uma resposta imune. Em uma modalidade, um inibidor do ponto de verificação imunológico é um agente que inibe as vias CTLA-4 ou PD-
1. Os inibidores do ponto de verificação particulares incluem anticorpos que inibem PD-1, PD-L1 ou CTLA-4.
[0061] “Agente imunomodulador” designa um agente que aumenta uma resposta imune (por exemplo, resposta imune antitumoral). Agentes imunomoduladores exemplificativos da presente invenção incluem anticorpos, tais como um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-1 e fragmentos antigênicos de qualquer um destes e agonistas OX40, incluindo proteínas, tais como proteína de fusão do ligante OX40, anticorpo OX40 ou seus fragmentos. Em uma modalidade, o agente imunomodulador é um inibidor do ponto de verificação imune.
[0062] “Indivíduo” significa um ser humano ou animal não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0063] “Inibição da expressão ou atividade” se refere a uma redução ou bloqueio da expressão ou atividade em relação à expressão ou atividade em uma amostra não tratada ou de controle e não indica necessariamente uma eliminação total da expressão ou atividade.
[0064] “Ligação internucleosídica” significa um grupo ou ligação que forma uma ligação covalente entre nucleosídeos adjacentes em um oligonucleotídeo. “Ligação internucleosídica modificada' designa qualquer ligação internucleosídica sem ser uma ligação internucleo- sídica de fosfato, que ocorra naturalmente. Ligações não fosfato são referidas no presente documento como ligações internucleosídicas modificadas.
[0065] “Oligonucleotídeos alongados” são aqueles que têm um ou mais nucleosídeos adicionais em relação a um oligonucleotídeo descrito no presente documento, por exemplo, um oligonucleotídeo progenitor.
[0066] “Nucleosídeos ligados” significa nucleosídeos adjacentes unidos por uma ligação internucleosídica.
[0067] “Nucleosídeo ligante” significa um nucleosídeo que liga um oligonucleotídeo a uma fração conjugada. Os nucleosídeos ligantes estão localizados dentro do ligante de conjugado de um composto. Os nucleosídeos ligantes não são considerados parte da porção oligonucleotídica de um composto, mesmo que sejam contíguos ao oligonucleotídeo.
[0068] “Não correspondência” ou “não complementar” significa uma nucleobase de um primeiro oligonucleotídeo que não é complementar à nucleobase correspondente de um segundo oligonucleotídeo ou ácido nucleico alvo quando os primeiro e segundo oligonucleotídeos estão alinhados. Por exemplo, as nucleobases incluindo, mas não se limitando a, uma nucleobase universal, inosina e hipoxantina, são capazes de se hibridizarem com pelo menos uma nucleobase, mas ainda são não correspondentes ou não complementares no que diz respeito à nucleobase com a qual hibridizaram. Como outro exemplo, uma nucleobase de um primeiro oligonucleotídeo que não é capaz de se hibridizar com a nucleobase correspondente de um segundo oligonucleotídeo ou ácido nucleico alvo quando os primeiro e segundo oligonucleotídeos estão alinhados é uma nucleobase não correspon- dente ou não complementar.
[0069] “Modulação” se refere à mudança ou ajuste de uma característica em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Por exemplo, modulação de RNA de FOXP3 pode significar aumentar ou diminuir o nível de RNA de FOXP3 e/ou proteína FOXP3 em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Um “modulador” efetua a mudança na célula, tecido, órgão ou organismo. Por exemplo, um composto para FOXP3 pode ser um modulador que diminui a quantidade de RNA de FOXP3 e/ou proteína FOXP3 em uma célula, tecido, órgão ou organismo.
[0070] "MOE” significa metoxietila.
[0071] “Monômero” se refere a uma unidade única de um oligômero. Os monômeros incluem, mas não estão limitados a, nucleosídeos e nucleotídeos.
[0072] “Motivo” significa o padrão de frações de açúcar,
nucleobases e/ou ligações internucleosídicas não modificadas e/ou modificadas, em um oligonucleotídeo.
[0073] “Natural” ou “de ocorrência natural” significa encontrado na natureza.
[0074] “Açúcar modificado não bicíclico” ou “fração de açúcar modificado não bicíclico” significa uma fração de açúcar modificado que compreende uma modificação, tal como um substituinte, que não forma uma ponte entre dois átomos do açúcar para formar um segundo anel.
[0075] “Ácido nucleico” se refere a moléculas compostas por nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui, mas não se limita a, ácidos ribonucleicos (RNA), ácido desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de fita simples e ácidos nucleicos de fita dupla.
[0076] “Nucleobase” significa uma fração heterocíclica capaz de se emparelhar com uma base de outro ácido nucleico. Como usado no presente documento, uma “nucleobase de ocorrência natural” é adenina (A), timina (T), citosina (C), uracila (U) e guanina (G). Uma “nucleobase modificada” é uma nucleobase de ocorrência natural que é quimicamente modificada. Uma “base universal” ou “nucleobase universal” é uma nucleobase diferente de uma nucleobase de ocorrência natural e núcleo- base modificada e é capaz de se emparelhar com qualquer nucleobase.
[0077] “Sequência de nucleobases” significa a ordem de nucleobases contíguas em um ácido nucleico ou oligonucleotídeo independentemente de qualquer açúcar ou ligação internucleosídica.
[0078] “Nucleosídeo” significa um composto compreendendo uma nucleobase e uma fração de açúcar. A nucleobase e a fração de açúcar estão cada uma, independentemente, não modificadas ou modificadas. "Nucleosídeo modificado" designa um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada e/ou uma unidade de açúcar modificado. Nucleosídeos modificados incluem nucleosídeos abásicos, que não têm uma nucleobase.
[0079] “Composto oligomérico” significa um composto compreen- dendo um oligonucleotídeo único e, opcionalmente, uma ou mais características adicionais, tais como um grupo conjugado ou grupo terminal.
[0080] “Oligonucleotídeo” significa um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais pode estar modificado ou não modificado, independentemente uns dos outros. A não ser que de outro modo indicado, os oligonucleotídeos consistem em 8 a 80 nucleosídeos ligados. “Oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo em que pelo menos um açúcar, nucleobase ou ligação internucleosídica é modificado. “Oligonucleotídeo não modificado” significa um oligonucle- otídeo que não compreende qualquer modificação de açúcar, de nucleobase ou internucleosídica.
[0081] “Oligonucleotídeo progenitor” designa um oligonucleotídeo cuja sequência é usada como a base para desenhar mais oligonucle- otídeos de sequência similar, mas com diferentes comprimentos, motivos e/ou químicas. Os oligonucleotídeos recém-desenhados podem ter a sequência igual ou sobreposta ao oligonucleotídeo original.
[0082] “Administração parenteral” significa administração através de injeção ou infusão. A administração parenteral inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitoneal ou adminis- tração intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular.
[0083] “Transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável” significa qualquer substância adequada para uso na administração a um indivíduo. Por exemplo, um transportador farmaceuticamente aceitável pode ser uma solução aquosa estéril, tal como PBS ou água-para- injeção.
[0084] “Sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis de compostos, tais como compostos oligoméricos, isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto original e não fornecem efeitos toxicológicos indesejados a ele.
[0085] “Agente farmacêutico” significa um composto que proporciona um benefício terapêutico quando administrado a um indivíduo.
[0086] “Composição farmacêutica” significa uma mistura de substâncias adequada para administração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais compostos ou sais dos mesmos e uma solução aquosa estéril.
[0087] “Ligação de fosforotioato” significa uma ligação de fosfato modificada na qual um dos átomos de oxigênio que não estão em ponte está substituído com um átomo de enxofre. Uma ligação internucle- osídica de fosforotioato é uma ligação internucleosídica modificada.
[0088] “Fração de fósforo” significa um grupo de átomos compreendendo um átomo de fósforo. Em determinadas modalidades, uma fração de fósforo compreende um mono, di ou trifosfato ou fosforotioato.
[0089] “Porção” significa um número definido de nucleobases contíguas (ou seja, ligadas) de um ácido nucleico. Em determinadas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de composto oligomérico.
[0090] “Prevenir” se refere ao retardamento ou interrupção do início, desenvolvimento ou progressão de uma doença, distúrbio ou afecção durante um período de tempo de minutos a indefinidamente.
[0091] “Pró-fármaco” significa um composto em uma forma fora do corpo que, quando administrado a um indivíduo, é metabolizado em outra forma dentro do corpo ou suas células. Em determinadas modalidades, a forma metabolizada é a forma ativa, ou mais ativa, do composto (por exemplo, fármaco). Tipicamente, a conversão de um pró- fármaco dentro do corpo é facilitada pela ação de uma enzima(s) (por exemplo, enzima endógena ou viral) ou componentes químico(s) presente(s) em células ou tecidos e/ou por condições fisiológicas.
[0092] “Reduzir” significa fazer baixar para uma extensão, tamanho, quantidade ou número inferior.
[0093] “N.º RefSeg” é uma combinação única de letras e números atribuída a uma sequência para indicar que a sequência é para um transcrito de alvo particular (por exemplo, gene alvo). Tal sequência e informação sobre o gene alvo (coletivamente, o registro do gene) podem ser encontradas em uma base de dados de sequências genéticas. Os bancos de dados de sequências genéticas incluem o banco de dados de Sequência de Referência do NCBI, GenBank, o Arquivo Europeu de Nucleotídeos e o Banco de Dados de DNA do Japão (formando estes últimos três a Colaboração Internacional de Bancos de Dados de Sequências Nucleotídicas ou INSDC).
[0094] “Região” é definida como uma porção do ácido nucleico alvo tendo pelo menos uma estrutura, função ou característica identificável.
[0095] “Composto de RNAi” significa um composto antissenso que atua, pelo menos em parte, através de RISC ou Ago2, mas não através de RNase H, para modular um ácido nucleico alvo e/ou proteína codificada por um ácido nucleico alvo. Os compostos de RNAi incluem, mas não se limitam a, siRNA de fita dupla, RNA de fita simples (SSRNA) e microRNA, incluindo mimetizadores de microRNA.
[0096] “Segmentos” são definidos como porções menores ou subporções de regiões dentro de um ácido nucleico.
[0097] “Efeitos colaterais" significa doença e/ou condições fisiológicas atribuíveis a um tratamento sem ser os efeitos desejados.
Em determinadas modalidades, os efeitos colaterais incluem reações no local de injeção, anormalidades no teste da função do fígado, anormalidades na função renal, toxicidade no fígado, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central, miopatias e mal-estar. Por exemplo, níveis de aminotransferase aumentados no soro podem indicar toxicidade no fígado ou anormalidade na função do fígado. Por exemplo, bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade no fígado ou anormalidade na função do fígado.
[0098] “De fita simples” em referência a um composto significa que o composto tem somente um oligonucleotídeo. “Autocomplementar” significa um oligonucleotídeo que se hibridiza pelo menos parcialmente com ele próprio. Um composto consistindo em um oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo do composto é autocomplementar, é um composto de fita simples. Um composto de fita simples pode ser capaz de se ligar a um composto complementar para formar um dúplex.
[0099] “Locais” são definidos como posições de nucleobases únicas dentro de um ácido nucleico alvo.
[0100] “Especificamente hibridizável” se refere a um oligonucle- otídeo que tem um grau de complementaridade suficiente entre o oligonucleotídeo e um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado, enquanto exibe efeitos mínimos ou nulos em ácidos nucleicos não alvo. Em determinadas modalidades, a hibridização específica ocorre sob condições fisiológicas.
[0101] “Inibir especificamente” com referência a um ácido nucleico alvo significa reduzir ou bloquear a expressão do ácido nucleico alvo enquanto exibe menos efeitos, efeitos mínimos ou nenhum efeito em ácidos nucleicos não alvos. A redução não indica necessariamente uma eliminação total da expressão do ácido nucleico alvo.
[0102] “Ensaio de células padrão” significa ensaio(s) descrito(s) nos Exemplos e suas variações razoáveis.
[0103] “Experiência in vivo padrão” significa o(s) procedimento(s) descritos no(s) Exemplo(s) e suas variações razoáveis.
[0104] “Centro quiral estereoaleatório” no contexto de uma população de moléculas de fórmula molecular idêntica significa um centro quiral com uma configuração estereoquímica aleatória. Por exemplo, em uma população de moléculas compreendendo um centro quiral estereoaleatório, o número de moléculas com a configuração (S) do centro quiral estereoaleatório pode ser, mas não é necessariamente o mesmo que, o número de moléculas com a configuração (R) do centro quiral estereoaleatório. A configuração estereoquímica de um centro quiral é considerada aleatória quando é o resultado de um método sintético que não é projetado para controlar a configuração estereoquímica. Em determinadas modalidades, um centro quiral estereoaleatório é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereoaleatória.
[0105] “Fração de açúcar” significa uma fração de açúcar não modificado ou uma fração de açúcar modificado. “Fração de açúcar não modificado” ou “açúcar não modificado” significa uma fração de 2'- OH(H) furanosila, como encontrada no RNA (uma “fração de açúcar de RNA não modificado”), ou uma fração de 2'-H(H), como encontrada no DNA (uma “fração de açúcar de DNA não modificado”). As frações de açúcar não modificado têm um hidrogênio em cada uma das posições 11, 3 e 4' um oxigênio na posição 3' e dois hidrogênios na posição 5'. “Fração de açúcar modificado” ou “açúcar modificado” significa uma fração de açúcar furanosila modificado ou um substituto de açúcar. "Fração de açúcar furanosila modificado” significa um açúcar furanosila compreendendo um substituinte diferente de hidrogênio no lugar de pelo menos um hidrogênio de uma fração de açúcar não modificado. Em determinadas modalidades, uma fração de açúcar furanosila modificado é uma fração de açúcar substituído em 2'. Tais frações de açúcar furanosila modificado incluem açúcares bicíclicos e açúcares não bicíclicos.
[0106] “Substituto de açúcar” significa uma fração de açúcar modificado que tem outra que não uma fração de furanosila que pode ligar uma nucleobase a um outro grupo, tal como uma ligação internucleosídica, grupo conjugado ou grupo terminal em um oligonucle- otídeo. Os nucleosídeos modificados compreendendo substitutos de açúcar podem ser incorporados em uma ou mais posições em um oligonucleotídeo e tais oligonucleotídecos são capazes de se hibridizarem com compostos ou ácidos nucleicos complementares.
[0107] “Sinergia” ou “sinérgicos” se refere a um efeito de uma combinação que é maior do que o aditivo dos efeitos de cada componente sozinho nas mesmas doses.
[0108] “FOXP3” significa qualquer ácido nucleico ou proteína de FOXP3. “Ácido nucleico de FOXP3” significa qualquer ácido nucleico que codifica FOXP3. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nucleico de FOXP3 inclui uma sequência de DNA que codifica FOXP3, uma sequência de RNA transcrita a partir de DNA que codifica FOXP3 (incluindo DNA genômico compreendendo íntrons e éxons) e uma sequência de mMRNA que codifica FOXP3. “MRNA de FOXP3” significa um mRNA que codifica uma proteína FOXP3. O alvo pode ser citado em letra maiúscula ou minúscula.
[0109] “Inibidor específico de FOXP3” se refere a qualquer agente capaz de inibir especificamente o RNA de FOXP3 e/ou expressão ou atividade da proteína FOXP3 ao nível molecular. Por exemplo, os inibidores específicos de FOXP3 incluem ácidos nucleicos (incluindo compostos antissenso), peptídeos, anticorpos, moléculas pequenas e outros agentes capazes de inibirem a expressão de RNA de FOXP3 e/ou proteína FOXP3.
[0110] “Gene alvo” se refere a um gene codificando um alvo.
[0111] “Direcionado a/tendo como alvo” significa a hibridização específica de um composto com um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado.
[0112] “Ácido nucleico alvo”, “RNA alvo”, “transcrito de RNA alvo” e “alvo de ácido nucleico” significam todos um ácido nucleico capaz de ser direcionado por compostos descritos no presente documento.
[0113] “Região alvo” significa uma porção de um ácido nucleico alvo à qual um ou mais compostos são direcionados.
[0114] “Segmento alvo” significa a sequência nucleotídica de um ácido nucleico alvo à qual um composto é direcionado. “Sítio alvo 5" se refere ao nucleotídeo mais 5' de um segmento alvo. “Sítio alvo 3” se refere ao nucleotídeo mais 3' de um segmento alvo.
[0115] “Grupo terminal” significa um grupo químico ou grupo de átomos que está covalentemente ligado a um terminal de um oligonucleotídeo.
[0116] “Quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de um composto, agente farmacêutico ou composição que proporciona um benefício terapêutico a um indivíduo.
[0117] “Tratar” se refere à administração de um composto ou composição farmacêutica a um animal de modo a efetuar uma alteração ou melhoria de uma doença, distúrbio ou afecção no animal. Determinadas modalidades
[0118] Determinadas — modalidades — proporcionam — métodos, compostos e composições para inibição da expressão de FOXP3.
[0119] Determinadas modalidades fornecem compostos direcionados a um ácido nucleico de FOXP3. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico de FOXP3 tem a sequência apresentada em RefSeq ou GENBANK N.º de Acesso NM 014009.3 (SEQ ID NO: 1); NT 011568.12 TRUNC 11907130 11921808 COMP (SEQ ID NO: 2); NM 001114377.1 (SEQ ID NO: 3);
NC 000023.11 TRUNC 49247001 49273000 COMP (SEQ ID NO: 4); ou N.º de Acesso UCSC UCO64ZFP.1 correspondente às coordenadas genômicas chrX:49,251,334-49,259,240 na montagem GRCh38/hg38 (SEQ ID NO: 5); cada uma das quais está no presente documento incorporada a título de referência, em sua totalidade. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla.
[0120] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0121] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 9 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 9 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0122] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 10 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 10 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0123] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 11 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 11 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 11 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0124] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 12 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0125] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0126] Determinadas — modalidades “fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto é um composto antissenso ou composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla.
[0127] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados em comprimento tendo pelo menos uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleobases contíguas complementar de uma porção de comprimento igual dentro dos nucleotídeos 2269-2284 de SEQ ID NO:
1. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0128] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados em comprimento tendo pelo menos uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleobases contíguas complementar de uma porção de comprimento igual dentro dos nucleotídeos 1233-1248, 2156-2171, 2735-2750, 4661-4676, 7307-7322, 7331-7346, 7980-7995, 11581- 11596 ou 12396-12411 de SEQ |D NO: 2. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0129] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e complementar dentro dos nucleotídeos 2269-2284 de SEQ ID NO: 1. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0130] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e complementar nos nucleotídeos 1233-1248, 2156-2171, 2735-2750, 4661-4676, 7307-7322, 7331-7346, 7980-7995, 11581- 11596 ou 12396-12411 de SEQ |D NO: 2. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0131] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleobases contíguas de qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0132] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0133] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575.
[0134] Em determinadas modalidades, um composto direcionado a FOXP3 é ION 1063734. Dos mais de 3.000 compostos que foram rastreados como descrito na seção de Exemplos abaixo, ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313 emergiram como os compostos líderes de topo.
[0135] Em determinadas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos modificados precedentes compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e/ou pelo menos uma nucleobase modificada.
[0136] Em determinadas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos modificados precedentes compreende pelo menos um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, pelo menos um açúcar modificado compreende um grupo 2'-O-metoxietila. Em determinadas modalidades, pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico, tal como um grupo 4'-CH(CH3)-O0-2', um grupo 4'-CH>2- O-2' ou um grupo 4'-(CH2)2-0-2".
[0137] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, tal como uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0138] Em determinadas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos modificados precedentes compreende pelo menos uma nucleobase modificada, tal como 5-metilcitosina.
[0139] Em determinadas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos modificados precedentes compreende: um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases consistindo na sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575.
[0140] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246, em que o oligonucleotídeo modificado compreende:
um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0141] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0142] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucle- osídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em três nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em três nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um nucleosídeo com cEt; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0143] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em SEQ ID NO: 449, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucle- osídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em três nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em três nucleosídeos ligados;
em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um nucleosídeo com cEt; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleo- sídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0144] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em ION 1063734 ou sal do mesmo, tendo a seguinte estrutura química:
À N.- CT NH o NH SO e e - O o. Nº NH — NãO e º NH SS ( So EO eo? NH V o O Cl > "S-p=O NO V e k o aa o EO À o E - o À o) 2 o NH E s-Ppzo o Y ro OE “bo x | esto à o Não À o “não À Só FA oO o V Ogp-: o Te |ceÇO E No Jo V n SAP | sto OB O. “N So V CC , À À TX Pg-p=o T* À esto Tr V X e» Ô não À Ô ho À om & À YX eo , À et o À 9 o À S+=o NH g-p=o NH À | Ds E À o E À o j À o l V sto y º tão À do de
[0145] Em determinadas modalidades, um composto compreende o ou consiste no sal de sódio de ION 1063734, tendo a seguinte estrutura química:
À DS NH o NH so A, E Ss = PSA So (E & (CS e NA o nº À o não NEN e N SA EE O V e Tr x Y “A SL Vagas ão À O. SO o = NH À E bo o o o V Na O-. o. w" o À Na . a. e ço o À o NH À o jo e Sto Nº À bo À E TA S VT AS À ES e CC Y No IN Vono To e? o À TP o À No e s-P=o O À Leto ao À ) NX , não VON ao a À, À To e ? o ct À e S-h=o no aba, nº V = À e? e À Ee SPO & S-P=O ) Na O: Na O )
[0146] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto ou oligonucleotídeo pode ser pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementar de um ácido nucleico codificando FOXP3.
[0147] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples. Em determinadas modalidades, o composto compreende desoxirribonucleotídeos. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla. Em determinadas modalidades, o composto é de fita dupla e compreende ribonucleotídeos. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0148] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter 8 a 80, 10 a 30, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30,
18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50 ou 20 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo.
[0149] Em determinadas modalidades, os compostos ou composi- ções proporcionados no presente documento compreendem um sal do oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, o sal é um sal de sódio. Em determinadas modalidades, o sal é um sal de potássio.
[0150] Em determinadas modalidades, os compostos ou composições como descritos no presente documento são altamente toleráveis como demonstrado por terem pelo menos um de um aumento de um valor de alanina transaminase (ALT) ou aspartato transaminase (AST) de não mais do que 4 vezes, 3 vezes ou 2 vezes em relação a animais tratados com solução salina ou um aumento no peso do fígado, baço ou rins de não mais do que 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% ou 2% em comparação com animais tratados de controle. Em determinadas modalidades, os compostos ou composições como descritos no presente documento são altamente toleráveis como demonstrado por não terem nenhum aumento de ALT ou AST em relação a animais tratados de controle. Em determinadas modalidades, os compostos ou composições como descritos no presente documento são altamente toleráveis como demonstrado por não terem nenhum aumento do peso do fígado, baço ou rins em relação a animais de controle.
[0151] Determinadas modalidades fornecem uma composição compreendendo o composto de qualquer uma das modalidades acima mencionadas ou seu sal e pelo menos um de um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em determinadas modalidades, a composição tem uma viscosidade inferior a cerca de 40 centipoise (cP), inferior a cerca de 30 centipoise (cP), inferior a cerca de 20 centipoise (cP), inferior a cerca de 15 centipoise (cP) ou inferior a cerca de 10 centipoise (cP). Em determinadas modalidades, a composição tendo qualquer uma das viscosidades acima mencionadas compreende um composto fornecido no presente documento a uma concentração de cerca de 100 mg/mL, cerca de 125 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 225 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 275 mg/mL ou cerca de 300 mg/mL. Em determinadas modalidades, a composição tendo qualquer uma das viscosidades e/ou concentrações de composto acima mencionadas tem uma temperatura de temperatura ambiente ou cerca de 20 “ºC, cerca de 21 ºC, cerca de 22 ºC, cerca de 23 ºC, cerca de 24 ºC, cerca de 25 ºC, cerca de 26 ºC, cerca de 27 ºC, cerca de 28ºC, cerca de 29 ºC ou cerca de 30 ºC. Determinadas indicações
[0152] Determinadas modalidades fornecidas no presente docu- mento se referem a métodos de inibição da expressão de FOXP3, que pode ser útil para tratamento, prevenção ou melhoria de câncer em um indivíduo, por administração de um composto que tem como alvo a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto pode ser um inibidor específico de FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto pode ser um composto antissenso, composto oligomérico ou oligonucleotídeo direcionado a FOXP3.
[0153] Exemplos de cânceres que podem ser tratados, prevenidos e/ou melhorados com os compostos e métodos fornecidos no presente documento incluem cânceres com Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular
(HCO), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA).
[0154] Em determinadas modalidades, o linfoma de células B é um linfoma de células B não Hodgkin. Exemplos de linfoma não-Hodgkin de células B de determinadas modalidades que podem ser tratados com os compostos fornecidos no presente documento incluem, mas não estão limitados a, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células B ativadas (ABC-DLBCL), linfoma de células B de centro germinativo (GCB DLBCL), linfoma folicular, linfoma do tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma mediastinal de grandes células B, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma nodal de células B da zona marginal (NMZL), linfoma esplênico da zona marginal (SMZL), linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de derrame primário e granulomatose linfomatoide.
[0155] Em determinadas modalidades, o linfoma de células T que pode ser tratado com os compostos fornecidos no presente documento incluem, mas não estão limitados a, linfoma de células T periférico e linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
[0156] Em determinadas modalidades, a leucemia que pode ser tratada com os compostos fornecidos no presente documento inclui, mas não está limitada a, leucemia linfocítica aguda (LLA).
[0157] Em determinadas modalidades, o câncer de mama tem uma ou mais das seguintes características: positivo para o Receptor do Androgênio, dependente do androgênio para o crescimento; negativo para o Receptor do Estrogênio (ER), independente do estrogênio para o crescimento; negativo para o Receptor de Progesterona (PR), independente da progesterona para o crescimento; ou negativo para Her2/neu. Em determinadas modalidades, o câncer de mama é triplo negativo para ER, PR e HER2 (ER-, PR-, HER2-). Em determinadas modalidades, o câncer de mama é triplo negativo e positivo para o AR (ER-, PR-, HER2-, AR+). Em determinadas modalidades, o câncer de mama é negativo para o ER negativo e positivo para o AR (ER-, AR+). Em determinadas modalidades, o câncer de mama é positivo para o ER e positivo para o AR (ER+, AR+). Em determinadas modalidades, o câncer de mama é apócrino. Os cânceres apócrinos de mama são frequentemente "triplo negativo", o que significa que as células não expressam receptores ER, PR ou HER2 e, geralmente, mas não necessariamente, positivas para o AR. Em determinadas modalidades, um câncer apócrino de mama é triplo negativo para ER, PRe HER2 e positivo para o AR (ER-, PR-, HER2-, AR+). Em determinadas modalidades, o câncer apócrino de mama é negativo para o ER e positivo para o AR (ER-, AR+). Em determinadas modalidades, um câncer apócrino de mama se origina da glândula sudorípara da mama. Em determinadas modalidades, um câncer apócrino de mama é um câncer ductal ou célula cancerosa da mama. Em determinadas modalidades, um câncer apócrino de mama pode ter qualquer uma ou mais das seguintes características: uma grande quantidade de citoplasma granular eosinofílico, margens bem definidas, grandes núcleos vesiculares, uma razão nuclear para citoplasmática de cerca de
1:2, e/ou acumulação de grânulos secretados no citoplasma apical conhecidos como secreção apical. Em determinadas modalidades, o câncer de mama é um câncer de mama apócrino molecular negativo para o ER e positivo para o AR (ER-, AR+). Em determinados aspectos, um câncer de mama apócrino molecular negativo para o ER e positivo para o AR (ER-, AR+) pode ser adicionalmente positivo para o PR, negativo para o PR, negativo para HER2 ou positivo para HER2. Em determinadas modalidades, o câncer de mama é positivo para HER2. Em determinadas modalidades, o câncer de mama é positivo para o PR. Em determinadas modalidades, o câncer de mama é positivo para o ER. O câncer de mama pode ser identificado como positivo ou negativo em relação aos receptores hormonais, como ER, PR ou HER2, por técnicas histológicas padrão. Por exemplo, em algumas modalidades, as amostras histológicas do câncer de mama podem ser classificadas como "triplo negativo" (ER-, PR-, HER2-) quando menos de 1% das células demonstram coloração nuclear para receptores de estrogênio e progesterona, e coloração imuno-histoquímica para HER2 mostra uma pontuação positiva de 0, 1 ou 2 vezes e uma razão FISH (sinais do gene HERZ2 para sinais do cromossomo 17) de menos de 1,8 de acordo com as diretrizes relevantes da ASCO e CAP. (Meyer, P. et al., PLoOS ONE 7(5): e38361 (2012)).
[0158] Em determinadas modalidades, um método de tratamento, prevenção ou melhoria de câncer em um indivíduo compreende a administração ao indivíduo de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3, tratando, prevenindo ou melhorando deste modo o câncer. Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modali- dades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla.
Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
Em determinadas modalidades, o composto é administrado ao indivíduo por via parenteral.
Em determinadas modalidades, administrar o composto inibe ou reduz imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento do tumor ou metástase.
Em determinadas modalidades, a administração do composto induz ou ativa imunidade anticâncer ou antitumoral; resposta imune anticâncer ou antitumoral; ativação ou infiltração de células imunes; ativação ou infiltração de células inflamatórias; ativação ou infiltração de células imunes efetoras; ativação ou infiltração de células T; ativação ou infiltração de células T CD8; ativação ou infiltração de células NK; ativação ou infiltração de macrófagos e células dendríticas; inflamação; ou expressão de citocina ou quimiocina inflamatória.
[0159] Em determinadas modalidades, um método de inibição da expressão de FOXP3 em um indivíduo que tem, ou está em risco de ter, câncer compreende a administração ao indivíduo de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3, inibindo deste modo a expressão de FOXP3 no indivíduo. Em determinadas modalidades, a administração do composto inibe a expressão de FOXP3 nas células Treg, microambiente tumoral, estroma tumoral, tumores infiltrados por Treg, células imunes, tecido linfoide, nódulos linfáticos ou células Foxp3+ intratumorais. Em determinadas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de ter um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCO), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonuc- leotídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou
2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION
1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é administrado ao indivíduo parenteralmente. Em determinadas modalidades, administrar o composto inibe ou reduz imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento do tumor ou metástase. Em determi- nadas modalidades, a administração do composto induz ou ativa imunidade anticâncer ou antitumoral; resposta imune anticâncer ou antitumoral; ativação ou infiltração de células imunes; ativação ou infiltração de células inflamatórias; ativação ou infiltração de células imunes efetoras; ativação ou infiltração de células T; ativação ou infiltração de células T CD8; ativação ou infiltração de células NK; ativação ou infiltração de macrófagos e células dendríticas; inflamação; ou expressão de citocina ou quimiocina inflamatória. Em determinadas modalidades, o indivíduo é identificado como tendo ou em risco de ter câncer.
[0160] Em determinadas modalidades, um método de inibição da expressão de FOXP3 em uma célula compreende colocar a célula em contato com um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3, inibindo deste modo a expressão de FOXP3 na célula. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula Treg, célula do microambiente tumoral, célula do estroma tumoral, célula Treg infiltrada em um tumor, célula imune, célula linfoide, célula de gânglio linfático ou célula Foxp3+ intratumoral. Em determinadas modalidades, a célula está no microambiente tumoral, estroma tumoral ou gânglio linfático de um indivíduo que tem, ou está em risco de ter, câncer. Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer que tem Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCO), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0161] Em determinadas modalidades, um método de redução ou inibição da imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento tumoral ou metástase de um indivíduo tendo, ou em risco de ter, câncer compreende a administração ao indivíduo de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3, reduzindo ou inibindo assim a imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento do tumor ou metástase no indivíduo. Em determinadas modalidades, um método para a indução ou ativação de imunidade anticâncer ou antitumoral; resposta imune anticâncer ou antitumoral; ativação ou infiltração de células imunes; ativação ou infiltração de células inflamatórias; ativação ou infiltração de células imunes efetoras;
ativação ou infiltração de células T; ativação ou infiltração de células T CDB8; ativação ou infiltração de células NK; ativação ou infiltração de macrófagos e células dendríticas; inflamação; ou expressão de citocina ou quimiocina inflamatória em um indivíduo tendo, ou em risco de ter, câncer compreende a administração ao indivíduo de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3. Em determinadas modalidades, o indivíduo tem, ou está em risco de ter, um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA) Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas — modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o compôs- to é administrado ao indivíduo parenteralmente. Em determinadas modalidades, o indivíduo é identificado como tendo ou em risco de ter câncer.
[0162] Determinadas modalidades estão dirigidas a um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para uso no tratamento de câncer.
Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ I|D NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0163] Determinadas modalidades são direcionadas a um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para uso na redução ou inibição da imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento tumoral ou metástase em um indivíduo tendo câncer. Determinadas modalidades são direcionadas a um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para uso na indução ou ativação de imunidade anticâncer ou antitumoral; resposta imune anticâncer ou antitumoral; ativação ou infiltração de células imunes; ativação ou infiltração de células inflamatórias; ativação ou infiltração de células imunes efetoras;
ativação ou infiltração de células T; ativação ou infiltração de células T CDB8; ativação ou infiltração de células NK; ativação ou infiltração de macrófagos e células dendríticas; inflamação; ou expressão de citocina ou quimiocina inflamatória em um indivíduo tendo câncer.
Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopo- ético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo direcionado a FOXP3. Em determi- nadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou
2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotíideo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0164] Determinadas modalidades estão dirigidas ao uso de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para a fabricação ou preparação de um medicamento para o tratamento de câncer. Determinadas modalidades estão dirigidas ao uso de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer. Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou
2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotíideo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0165] Determinadas modalidades são direcionadas ao uso de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para a fabricação ou preparação de um medicamento para a redução ou inibição da imunossupressão, atividade imunossupressora de Treg, proliferação de células cancerosas, crescimento tumoral ou metástase em um indivíduo tendo câncer. Determinadas modalidades são direcionadas ao uso de um composto compreendendo um inibidor específico de FOXP3 para a fabricação ou preparação de um medicamento para a indução ou inibição da imunidade anticâncer ou antitumoral; resposta imune anticâncer ou antitumoral; ativação ou infiltração de células imunes; ativação ou infiltração de células inflamatórias; ativação ou infiltração de células imunes efetoras;
ativação ou infiltração de células T; ativação ou infiltração de células T CDB8; ativação ou infiltração de células NK; ativação ou infiltração de macrófagos e células dendríticas; inflamação; ou expressão de citocina ou quimiocina inflamatória em um indivíduo tendo câncer.
Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, o composto compreende um composto antissenso direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado consistindo na sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucle- otídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou
2575. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobases consistindo em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotíideo modificado pode te 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto é ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ter fita simples ou fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissenso ou composto oligomérico.
[0166] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode ser direcionado a FOXP3. Em determinadas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado, por exemplo um oligonucleotídeo modificado com 8 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento, 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento, 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento ou 20 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar a qualquer uma das sequências de nucleobases recitadas em SEQ ID NOs: 1a5 Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e/ou pelo menos uma nucleobase modificada. Em determinadas modalidades, a ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica de fosforotioato, o açúcar modificado é um açúcar bicíclico ou uma 2'-O-metoxietila e a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados, em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente adjacente ao e entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[0167] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 12 a 30, 15 a 30, 15 a 25, 15a 24, 16 a 24, 17 a 24, 18 a 24, 19 a 24,20 a 24, 19 a 22,20 a 22, 16 a 20 ou 17 a 20 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar a qualquer uma das sequências de nucleobases recitadas em SEQ ID NOs: 1-5. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e/ou pelo menos uma nucleobase modificada. Em determinadas modalidades, a ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica de fosforotioato, o açúcar modificado é um açúcar bicíclico ou uma 2'-O-metoxietila e a nucleobase modificada é uma 5- metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna consistindo em 2"- desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados, em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente adjacente ao e entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[0168] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode compreender ou consistir em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna consistindo em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonu- cleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0169] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode compreender ou consistir em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados;
em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0170] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode compreender ou consistir em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer um de SEQ ID NOs: 449, 501, 544, 794, 1293, 1307, 1511, 1755, 2492 ou 2575, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucle- osídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em três nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em três nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um nucleosídeo com cEt; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0171] Em determinadas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado com 16 a 80 nucleobases ligadas de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em SEQ ID NO: 449,
em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucle- osídeos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em três nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' consistindo em três nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um nucleosídeo com cEt; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0172] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode compreender ou consistir em ION 1063734 ou sal do mesmo, tendo a seguinte estrutura química: x QT o nº 1 SE ls É E A Lo o QTO CT ( São E Voe ae Nn o À ho VOS Vão CE == " À No yo Rh Petro À q w À go & Tr Vo esto | esto q oNõo N é “nho À & EA - À ão À Le < ,. V V o t Ea VER o E VOO Vo sê me o) À No NON | Ssção AS h CW À 8 LS g À o o À o No ei eo O OE Ino h à lho À emo Ty V o V o o À o À Pato An, Vo elos À º xx VE E V
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[0173] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode compreender ou consistir em ION 1063734, tendo a seguinte estrutura química: o SO o no Cl ra SE, ao x >» NA, À, = po SONO NH a No ( Ly ( esto Vo eo Não À | o MR A seo E do o Voe Tao O | sto Tr - V o (o ós Qonão eg çº o À NH À Z S-P=O À fe) º À mo RL Vo A Vo o "Re |O E À rr) À AA Y == y NONÔ NH TES V " À 2 e S-P=O À e nº À — na E À ES to a À so” Noto VA EA | goto “
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[0174] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode ser administrado parenteralmente. Por exemplo, em certas modalidades, o pode ser administrado através de injeção ou infusão. A administração parenteral inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitoneal ou administração intracrani- ana, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular. Combinações e Terapias de Combinação Específicas
[0175] Em determinadas modalidades, um primeiro agente compreendendo um composto no presente documento descrito é coadministtado com um ou mais agentes secundários. Em determinadas modalidades, esses segundos agentes são projetados para tratar a mesma doença, distúrbio ou afecção que o primeiro agente no presente documento descrito. Em determinadas modalidades, esses segundos agentes são projetados para tratar uma doença, distúrbio ou afecção diferente do primeiro agente no presente documento descrito. Em determinadas modalidades, um primeiro agente é projetado para tratar um efeito colateral indesejado de um segundo agente. Em determinadas modalidades, os segundos agentes são coadministrados com o primeiro agente para tratar um efeito indesejado do primeiro agente. Em determinadas modalidades, esses segundos agentes são projetados para tratar um efeito colateral indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas, como descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, os segundos agentes são coadministrados com o primeiro agente para produzir um efeito de combinação. Em determinadas modalidades, os segundos agentes são coadministrados com o primeiro agente para produzir um efeito sinérgico. Em determinadas modalidades, a coadministração do primeiro e do segundo agentes permite o uso de dosagens mais baixas do que seria necessário para atingir um efeito terapêutico ou profilático se os agentes fossem administrados como terapia independente.
[0176] Em determinadas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos são coadministrados com um ou mais agentes secundários. Em determinadas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes secundários são administrados em tempos diferentes. Em determinadas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes secundários são preparados em conjunto em uma única formulação. Em determinadas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes secundários são preparados separadamente.
[0177] Em determinadas modalidades, um agente secundário é selecionado de: ativadores de células imunes inatas, incluindo, mas não se limitando a agonistas de TLR (por exemplo, MEDI9197) e agonistas de STING (por exemplo, MK-1454); inibidores de mediadores imunoinibitórios incluindo, mas não se limitando a inibidores de CD39 e CD73 (por exemplo, oleclumabe), inibidores de IDO1 (por exemplo, epacadostat) e inibidores de arginase (por exemplo, INCB001158); ativadores de receptores coestimulatórios de células T incluindo, mas não se limitando a, agonistas de CD137 (por exemplo, urelumabe, utomilumabe), agonistas de CD27 (por exemplo, varlimumabe) e agonistas de CD40 (por exemplo, MEDI5083); inibidores de receptores inibidores de células T incluindo, mas não se limitando a, inibidores de LAG3 (por exemplo, relatlimabe), inibidores de TIM3 (por exemplo, LY3321367) e inibidores de TIGIT (por exemplo, tiragolumabe); ativadores de receptores inibidores de Treg incluindo, mas não se limitando a agonistas de GITR (por exemplo, MEDI1873); estratégias de ativação de células NK incluindo, mas não se limitando a NKG2a (por exemplo, monalizumab); vacinas contra o câncer (por exemplo, Sipuleucel-T); e morte imunogênica do tumor incluindo, mas não se limitando a vírus oncolíticos, radiação, terapia fotodinâmica e quimioterapia (por exemplo, antraciclinas, oxaliplatina, etc.).
[0178] Em determinadas modalidades, um agente secundário é selecionado de: agentes de imuno-oncologia (IO); inibidores do ponto de verificação imunológico; agentes imunomoduladores; inibidores da via PD1-PDL 1/2; inibidores de PD-L1 incluindo, mas não se limitando a durvalumabe, avelumabe e atezolizumabe; inibidores de PD-1 incluindo, mas não se limitando a nivolumabe e pembrolizumabe; inibidores de CTLA-A4 incluindo, mas não se limitando a ipilimumabe e tremelimumab; inibidores de STAT3 incluindo, mas não se limitando a siRNA de STAT3, oligonucleotídeos antissenso de STAT3 e danvatirsen (AZD9150); e antagonistas do receptor de adenosina 2A (A2AR) incluindo, mas não se limitando a AZD4635.
[0179] Determinadas modalidades são direcionadas ao uso de um composto direcionado a FOXP3, como descrito no presente documento, em combinação com um agente secundário.
Em modalidades particulares, tal uso é em um método de tratamento de um paciente que sofre de câncer, incluindo, mas não se limitando a, um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA). Em determinadas modalidades, um agente secundário é selecionado de: agentes de imuno-oncologia (IO); inibidores do ponto de verificação imunológico; agentes imunomoduladores; inibidores da via PD1- PDL1/2; inibidores de PD-L1 incluindo, mas não se limitando a durvalumabe, avelumabe e atezolizumabe; inibidores de PD-1 incluindo, mas não se limitando a nivolumabe e pembrolizumabe; inibidores de
CTLA-A4 incluindo, mas não se limitando a ipilimumabe e tremelimumab; inibidores de STAT3 incluindo, mas não se limitando a siRNA de STAT3, oligonucleotídeos antissenso de STAT3 e danvatirsen (AZD9150).
[0180] Determinadas modalidades são desenhadas para uma combinação de um composto direcionado para FOXP3, como descrito no presente documento, e um agente secundário, tal como um agente secundário selecionado de: agentes de imuno-oncologia (IO); inibidores do ponto de verificação imunológico; agentes imunomoduladores; inibidores da via PD1-PDL1/2; inibidores de PD-L1 incluindo, mas não se limitando a durvalumabe, avelumabe e atezolizumabe; inibidores de PD-1 incluindo, mas não se limitando a nivolumabe e pembrolizumabe; inibidores de CTLA-4 incluindo, mas não se limitando a ipilimumabe e tremelimumab; inibidores de STAT3 incluindo, mas não se limitando a SIRNA de STAT3, oligonucleotídeos antissenso de STAT3 e danvatirsen (AZD9150).
[0181] Em determinadas modalidades, o composto direcionado a FOXP3 como descrito no presente documento e o agente secundário são usados em tratamento de combinação pela administração dos dois agentes simultaneamente, separadamente ou sequencialmente. Em determinadas modalidades, os dois agentes são formulados como um produto de combinação de dose fixa. Em outras modalidades, os dois agentes são fornecidos ao paciente como unidades separadas que podem então ser tomadas simultaneamente ou em série (sequencialmente).
[0182] Em determinadas modalidades, um composto direcionado a FOXP3, como descrito no presente documento, é usado em combinação com um agente imunomodulador, como um anticorpo anti- PD-L1 (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), um anticorpo anti-PD-1 (ou um antígeno-fragmento de ligação do mesmo), um anticorpo anti-CTLA-4 (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um agonista de OX40 ((por exemplo, uma proteína de fusão do ligante OX40, ou um anticorpo agonista OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo).
[0183] Em determinadas modalidades, um composto direcionado a FOXP3, como descrito no presente documento, é usado em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico, como um anticorpo anti-PD-L1 (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), um anticorpo anti-PD-1 (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), ou um anticorpo anti-CTLA-4 (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo).
[0184] Anticorpos anti-PD-L1 são conhecidos na técnica. Anticorpos anti-PD-L1 exemplificativos incluem: MEDI4736 (durvalumabe), MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105 e MPDL3280A (atezolizumabe).
[0185] Anticorpos anti-PD-1 são conhecidos na técnica. Anticorpos anti-PD-1 exemplificativos incluem: nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe e AMP-514.
[0186] Anticorpos anticCTLA-4 são conhecidos na técnica. Anticorpos anti-cCTLA-4 exemplificativos incluem: tremelimumab e ipilimumabe, também denominado MDX-010 (ou BMS-734016).
[0187] Agonistas e anticorpos de OX40 são conhecidos na técnica. Agonistas e/ou anticorpos de OX40 exemplificativos incluem: MEDI6383, 9B12 e MEDIO562.
[0188] Em uma modalidade, a combinação inclui o oligonucleotídeo antissenso lonis 651987 ou um sal do mesmo, e pelo menos um imunomodulador selecionado do grupo que consiste em: MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, MPDL3280A, tremelimumab, ipilimumabe, MEDIO562 e MEDIO0562.
[0189] Em uma modalidade, a combinação inclui o anticorpo anti- PD-L1 MEDI4736 (durvalumabe) e ION 1063734.
[0190] Em uma modalidade, a combinação inclui ION 1063734, o anticorpo anti-PD-L1 MEDI4736 (durvalumabe) e o anticorpo anti-CTLA- 4 tremelimumab. Anticorpos Anti-PD-L1 Específicos
[0191] Os anticorpos que se ligam e inibem especificamente PD-L1 estão incluídos na presente invenção.
[0192] Durvalumab (MEDI4736) é um anticorpo anti-PD-L1 exemplificativo que é seletivo para um polipeptídeo PD-L1 e bloqueia a ligação de PD-L1 aos receptores PD-1 e CD80. O durvalumabe pode atenuar a supressão mediada por PD-L1 da ativação de células T humanas in vitro e inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto através de um mecanismo dependente de células T.
[0193] As informações relativas a durvalumab (ou seus fragmentos) para uso nos métodos fornecidos neste documento podem ser encontradas na Patente dos US No. 8,779,108, a invenção da qual é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. O domínio de fragmento cristalizável (Fc) de durvalumab contém uma mutação tripla no domínio constante da cadeia pesada de IgG1 que reduz a ligação ao componente do complemento C1q e aos receptores Fcy responsáveis pela mediação da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Em determinadas modalidades, MEDI4736 ou um seu fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos fornecidos no presente documento compreende as sequências de CDR de cadeia pesada variável e cadeia leve variável do anticorpo
2.14H9O0PT como descrito em Patente US Nos. 8,779,108 e 9493565, que é no presente documento incorporada por referência na sua totalidade.
[0194] Existem numerosos anticorpos anti-PD-L1 na literatura publicada que podem apresentar na presente invenção, incluindo compostos em desenvolvimento e/ou em ensaios clínicos, tais como:
durvalumab (MEDI4736), MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 e MDX-1105. Os relatórios descritivos de patente que divulgam anticorpos anti-PD-L1 que podem ser úteis na presente invenção incluem: Pat. US Nos. 7,943,743; 8,383,796; 9,102,725; 9,273,135 (BMS/Medarex), US2006/0153841 (Dana Farber), US2011/0271358 (Dana Farber), Pat. US Nos. 8,552,154 e 9,102,727 (Dana Farber), Patentes US No. 8,217,149 (Genentech), incluindo a Patente US publicada No. 8,217,149, US2012/0039906 (INSERM), US2016/0031990 (Amplimmune), Patente US No. 8,779,108 (MedImmune - parar durvalumab/MEDI4726 e 2.7A4), US2014/0044738 (Amplimmune - para AMP-714) e US2010/0285039 (John's Hopkins University). Cada uma dessas divulgações está incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.
Anticorpos Anti-CTLA-4 Específicos
[0195] Anticorpos que se ligam especificamente a CTLA-4 e inibem a atividade de CTLA-4 são úteis para aumentar uma resposta imune antitumoral. Informações relativas a tremelimumab (ou seus fragmentos de ligação a antígenos) para uso nos métodos fornecidos no presente documento podem ser encontradas em US 6,682,736 (onde é referido como 11.2.1), a invenção da qual é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. Tremelimumab (também conhecido como CP-675206, CP-675, CP-675206, e ticilimumab) é um anticorpo monoclonal I9gG2 humano que é altamente seletivo para CTLA-4 e bloqueia a ligação de CTLA-4 a CD80 (B7,1) e CD86 (B7,2). Foi demonstrado resultar em ativação imunitária in vitro e alguns pacientes tratados com tremelimumab mostraram regressão do tumor. Em determinadas modalidade, tremelimumab ou um seu fragmento de ligação ao antígeno para uso nos métodos fornecidos no presente documento compreende as sequências CDR da cadeia pesada variável e cadeia leve variável do anticorpo 11.2.1 como descrito na Pat. US No.
6682736, que é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.
[0196] Outros anticorpos anti-CTLA-4 são descritos, por exemplo, em US 20070243184. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é Ipilimumab, também denominado MDX-010; BMS-734016. Agonistas de OX40 Específicos
[0197] Os agonistas de OX40 interagem com o receptor OX40 nas células T CD4+ durante, ou logo após, a administração iniciação por um antígeno, resultando em uma resposta aumentada das células T CD4+ ao antígeno. Um agonista de OX40 interagindo com o receptor OX40 em células T CD4+ específicas do antígeno pode aumentar a proliferação de células T em comparação com a resposta ao antígeno isoladamente. A resposta elevada ao antígeno pode ser mantida durante um período de tempo substancialmente mais longo do que na ausência de um agonista de OX40. Desse modo, a estimulação através de um agonista de OX40 aumenta a resposta imune específica para o antígeno, aumentando o reconhecimento de células T de antígenos, por exemplo, células tumorais. Os agonistas de OX40 são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6,312,700, 7,504,101, 7,622,444 e 7,959,925, que são incorporadas no presente documento por referência na sua totalidade. Os métodos de uso de tais agonistas no tratamento do câncer são descritos, por exemplo, em US2015/0098942 e em US2015/0157710, cada um dos quais é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[0198] Os agonistas de OX40 incluem, mas não estão limitados a moléculas de ligação a OX40, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, ligante OX40 ("OX40L") ou um fragmento de ligação OXA40, variante ou derivado do mesmo, como domínios de ligante extracelular solúvel e proteínas de fusão OX40L e anticorpos anti-OX40 (por exemplo, anticorpos monoclonais, tais como anticorpos monoclonais humanizados), ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo. Exemplos de anticorpos monoclonais anti-OX40 são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 5,821,332 e 6,156,878, cujas divulgações são incorporadas no presente documento por referência na sua totalidade. Em determinadas modalidades, o anticorpo monoclonal anti-cOX40 é 9B12, ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, como descrito em Weinberg, A.D., et al. J Inmunother 29, 575-585 (2006), que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade. Em outra modalidade, um anticorpo OX40 é MEDIO562 como descrito em US 2016/0137740.
[0199] Em outras modalidades, o anticorpo que se liga especificamente a OX40, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, liga-se ao mesmo epítopo OX40 que o mAb 9B12. Um exemplo de anticorpo OX40 humanizado é descrito por Morris et al/., Mol Immunol. maio de 2007; 44(12): 3112-3121. 9B12 é um mAb anti-OX40 de IgG1 de murino, dirigido contra o domínio extracelular de OX40 humano (CD134) (Weinberg, A.D., et al. ] mmunother 29, 575-585 (2006)). Este foi selecionado a partir de um painel de anticorpos monoclonais anti- OXA40 por causa da sua capacidade de induzir uma resposta agonista para a sinalização de OX40, estabilidade e pelo seu elevado nível de produção pelo hibridoma. Para uso em aplicações clínicas, o mAb 9B12 é equilibrado com solução salina tamponada com fosfato, pH 7,0, e sua concentração é ajustada para 5,0 mg/mL por diafiltração.
[0200] O "ligante do OX40" ("OX40L") (também denominado de várias formas, fator de necrose do tumor membro ligante do membro 4 da superfamília, gp34, TAX glicoproteína-1 transcricionalmente ativados, e CD252) é largamente encontrado em células apresentando antígenos (APCs), e pode ser induzido em células B ativadas, células dendríticas (DC), células de Langerhans, DCs plasmocitoides, e macrófagos (Croft, M., (2010) Ann Rev Immunol 28:57-78). Outras células, incluindo células T ativadas, células NK, mastócitos, células endoteliais, e células do músculo liso podem expressar OX40L em resposta a citocinas inflamatórias (Id.). OX40L se liga especificamente ao receptor OX40. A proteína humana é descrita na Patente US 6,156,878. O OX40L de camundongo é descrito na Patente US 5,457,035. O OX40L é expresso na superfície de células e inclui um e um domínio de ligação ao receptor intracelular, transmembranar e extracelular.
Uma forma solúvel funcionalmente ativa de OX40L pode ser produzida por eliminação dos domínios intracelulares e transmembranares tal como descrito, por exemplo, na Patente US Nos. 5,457,035; 6,312,700; 6,156,878; 6,242,566; 6,528,055; 6,528,623; 7,098,184; e 7,125,670, cujas descrições são incorporadas no presente documento para todas as finalidades.
Uma forma funcionalmente ativa de OX40L é uma forma que retém a capacidade para se ligar especificamente a OX40, isto é, que possui um "domínio de ligação do receptor" OX40. Um exemplo são os aminoácidos 51 a 183 de OX40L humano.
Os métodos para determinar a capacidade de uma molécula de OX40L ou derivado para se ligar especificamente ao OX40 são discutidos abaixo.
Métodos para a preparação e uso de OX40L e seus derivados (tais como derivados que incluem um domínio de ligação a OXA40) são descritos nas Pat.
US Nos. 6,156,878; 6,242,566; 6,528,055; 6,528,623; 7,098,184; e 7,125,670, que também descreve proteínas compreendendo a forma solúvel de OX40L ligado a outros peptídeos, tais como as regiões Fc da imunoglobulina humana ("lg"), que podem ser produzidas de modo a facilitar a purificação do ligante do OX40 a partir de células cultivadas, ou para melhorar a estabilidade da molécula depois da administração in vivo a um mamífero (ver, também, Pat.
US Nos. 5,457,035 e 7,959,925, ambas incorporadas no presente documento por referência na sua totalidade.
[0201] Também estão incluídos dentro da definição de OX40L as variantes do ligante do OX40 que variam em sequência de aminoácidos a partir de moléculas de ligante do OX40 de ocorrência natural, mas que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um receptor OX40. Essas variantes são descritas nas Pat. US Nos. 5,457,035; 6,156,878; 6,242,566; 6,528,055; 6,528,623; 7,098,184; e 7,125,670. Em uma modalidade relacionada, um mutante de OX40L que perdeu a capacidade de se ligar especificamente a OX40, por exemplo, aminoácidos 51 a 183, em que a fenilalanina na posição 180 do domínio de ligação ao receptor de OX40L humano foi substituída por alanina (F180A) é usado.
[0202] Os agonistas de OX40 incluem uma proteína de fusão na qual um ou mais domínios de OX40L estão covalentemente ligados a um ou mais domínios de proteína adicionais. Proteínas de fusão OX40L exemplificativas que podem ser usadas como agonistas de OX40 são descritas na Pat. US No. 6,312,700, a invenção da qual é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade. Em uma modalidade, um agonista de OX40 inclui um polipeptídeo de fusão de OX40L que se automonta em uma proteína de fusão de OX40L multimérica (por exemplo, trimérica ou hexamérica). Tais proteínas de fusão são descritas, por exemplo, na Patente US No. 7,959,925, que é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade. A proteína de fusão de OX40L multimérica exibe maior eficácia no aumento da resposta imune específica do antígeno em um sujeito, particularmente um sujeito humano, devido à sua capacidade de se reunir espontaneamente em trímeros e hexâmeros altamente estáveis.
[0203] Em outra modalidade, um agonista de OX40 capaz de se montar em uma forma multimérica inclui um polipeptídeo de fusão compreendendo em uma direção N-terminal para C-terminal: um domínio de imunoglobulina, em que o domínio de imunoglobulina inclui um domínio Fc, um domínio de trimerização, em que o domínio de trimerização inclui um domínio de trimerização de espiral enrolada e um domínio de ligação ao receptor, em que o domínio de ligação ao receptor é um domínio de ligação ao receptor OX40, por exemplo, um OXA40L ou um fragmento de ligação a OX40, variante ou derivado do mesmo, onde o polipeptídeo de fusão se pode automontar em uma proteína de fusão trimérica. Em um aspecto, um agonista de OX40 capaz de se montar em uma forma multimérica é capaz de se ligar ao receptor OX40 e estimular pelo menos uma atividade mediada por OX40. Em determinados aspectos, o agonista de OX40 inclui um domínio extracelular do ligante OX40.
[0204] O domínio de trimerização de um agonista de OX40 capaz de se montar em uma forma multimérica serve para promover a automontagem de moléculas polipeptídicas de fusão de OX40L individuais em uma proteína trimérica. Desse modo, um polipeptídeo de fusão de OX40L com um domínio de trimerização se auto-monta em uma proteína de fusão de OX40L trimérica. Em um aspecto, o domínio de trimerização é um domínio de fecho de isoleucina ou outra estrutura polipeptídica espiral enrolada. Domínios de trimerização de espiral enrolada exemplificativos incluem: TRAF2 (No. de Acesso GENBANKO Q12933, aminoácidos 299-348; Trombospondina 1 (No. de Acesso PO7996, aminoácidos 291-314; Matrilina-4 (No. de Acesso O95460, aminoácidos 594-618; CMP (matrilina-1) (No. de Acesso NP — 002370, aminoácidos 463-496; HSF1 (No. de Acesso AAX42211, aminoácidos 165-191; e Cubilina (No. de Acesso NP — 001072, aminoácidos 104-
138. Em determinados aspectos específicos, o domínio de trimerização inclui um domínio de trimerização de TRAF2, um domínio de trimerização de Matrilina-4 ou uma combinação dos mesmos.
[0205] OXA40L FP é uma proteína de fusão IgG4P do ligante de
OXA40 humana que se liga especificamente a, e ativa a sinalização por, o receptor OX40 humano, um membro da superfamília TNFR.
OX40L FP também é descrito em US2016/0024176, incorporado no presente documento por referência na sua totalidade.
OX40L FP é composto por três domínios distintos: (1) domínios de ligação ao receptor extracelular do ligando OX40 humano (RBDs) que formam homotrímeros e se ligam ao receptor OX40; (2) domínios de trimerização de fecho de isoleucina derivados do fator 2 associado a TNFR que estabilizam a estrutura homotrimérica dos RBDs do ligante OX40; e (3) domínios gama cristalizáveis do fragmento de IgG4 humana (Fcy) que facilitam o agrupamento do receptor Fcy da proteína de fusão quando ligada aos receptores OX40 e contêm uma substituição de serina por prolina na posição 228 (de acordo com a numeração EU) nas regiões de dobradiça (I9GG4P) para promover a estabilidade de dois conjuntos de homotrímeros de RBD do ligante OX40. O domínio Fc da IgG4P é fundido diretamente em um domínio de trimerização de cadeia de isoleucina derivado a partir de resíduos de aminoácidos 310 - 349 do fator de necrose do tumor humano 2 (TRAF2). Fundido ao terminal C do domínio TRAF2 estão os resíduos de aminoácidos 51 - 183 do domínio de ligação ao receptor extracelular (RBD) do OX40L humano (nome do gene TNFSF4). O domínio TRAF?2 estabiliza a estrutura homotrimérica de RBD do OX40L de modo a permitir a ligação a e a ativação de OX40, enquanto o domínio Fc da IgG4P confere estabilidade sérica, dimerização de trímeros OX40L, e facilita o agrupamento de receptores Fcy da proteína de fusão hexamérica.
Uma variante de OX40L FP possui uma mutação de fenilalanina (F) para alanina (A) no aminoácido correspondente à posição 180 em OX40L.
Outra variante de OX40L FP possui o domínio Fc da IgG4P substituído por um domínio Fc da I9G1 humana.
Em modalidades particulares, o agonista de OX40 para uso na presente invenção é uma das variantes de OX40L FP.
[0206] Em modalidades particulares, o agonista de OX40 para uso na presente invenção foi modificado para aumentar sua meia-vida no soro. Por exemplo, a meia-vida no soro de um agonista de OX40 pode ser aumentada por conjugação a uma molécula heteróloga, como albumina sérica, uma região Fc de anticorpo ou PEG. Em determinadas modalidades, os agonistas de OX40 podem ser conjugados a outros agentes terapêuticos ou toxinas para formar imunoconjugados e/ou proteínas de fusão. Em determinadas modalidades, o agonista de OX40 pode ser formulado de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo.
Derivados de Anticorpos
[0207] Os anticorpos para uso na presente invenção (por exemplo, anti-CTLA-4, anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-OX40) podem incluir variantes dessas sequências que retêm a capacidade de ligar especificamente os seus alvos. Tais variantes podem ser derivadas das sequências desses anticorpos por um perito usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, substituições, deleções, ou adições de aminoácidos podem ser feitas nas FRs e/ou nas CDRs. Embora mudanças nas FRs sejam usualmente desenhadas para melhorarem a estabilidade e imunogenicidade do anticorpo, mudanças nas CDRs são tipicamente desenhadas para aumentarem a afinidade do anticorpo pelo seu alvo. As variantes de FRs incluem também alotipos de imunoglobulina ocorrendo naturalmente. Tais mudanças de aumento da afinidade podem ser determinadas empiricamente por técnicas de rotina que envolvem alteração da CDR e teste da afinidade de anticorpo pelo seu alvo. Por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas dentro de qualquer uma das CDRs descritas. Várias alterações podem ser feitas de acordo com os métodos descritos em “Antibody Engineering”, 2º ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck,
1995. Estes incluem, mas não estão limitados a sequências de nucleotídeos que são alteradas pela substituição de diferentes códons que codificam um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro da sequência, produzindo assim uma mudança "silenciosa". Por exemplo, os aminoácidos não polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.
[0208] Os derivados e análogos de anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por várias técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo métodos recombinantes e sintéticos (Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.|., e Bodansky et al. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2º ed., Spring Verlag, Berlim, Alemanha). Técnicas de embaralhamento ou combinatoriais análogas são também descritas por Stemmer (Nature (1994) 370: 389-391), que descreve a técnica em relação a um gene da B-lactamase, mas observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticorpos.
[0209] Se podem gerar novas regiões VH ou VL transportando uma ou mais sequências derivadas das sequências descritas no presente documento usando mutagênese aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados. Uma tal técnica, POR propensa a erros, é descrita por Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576- 3580).
[0210] Outro método que pode ser usado é direcionar mutagênese para CDRs de genes VH ou VL. Tais técnicas são descritas por Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) e Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567).
[0211] Do mesmo modo, uma ou mais das, ou todas as, três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL, que são depois analisados quanto a um fragmento de ligação ao antígeno específico para CTLA-4 ou PD-L1.
[0212] Uma porção de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá, pelo menos, uma das CDRs substancialmente como apresentado no presente documento e, opcionalmente, regiões estruturais intervenientes dos fragmentos scFv como apresentado no presente documento. A porção pode incluir pelo menos cerca de 50% de qualquer uma das ou ambas as FR1 e FRA4, os 50% sendo os 50% de terminal C de FR1 e os 50% de terminal N de FR4. Os resíduos adicionais na extremidade de N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles normalmente não associados às regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de anticorpos por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos no terminal N ou C codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios variáveis a sequências de proteína adicionais incluindo regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos), ou marcações proteináceas como discutido em detalhe adicional em baixo.
[0213] Um perito na técnica vai reconhecer que os anticorpos para uso na presente invenção podem compreender fragmentos de ligação ao antígeno que contenham apenas uma única CDR de domínio VL ou VH. Qualquer um dos domínios de ligação específicos de cadeia única pode ser usado para avaliar quanto a domínios complementares capazes de formar um fragmento de ligação ao antígeno específico de dois domínios capaz de, por exemplo, ligação a CTLA-4 e PD-L1.
[0214] Anticorpos para uso na presente invenção descritos no presente documento podem ser ligados a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (albumina, outro anticorpo, etc.). Por exemplo, os anticorpos podem ser ligados por reticulação química ou por métodos recombinantes. Os anticorpos podem também ser ligados a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, do modo estabelecido nas Pat. US Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; ou 4,179,337. Os anticorpos podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente a um polímero, por exemplo, para aumentar a sua semivida em circulação. Polímeros exemplificativos e métodos para os ligar são também mostrados na Pat. US Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 e 4,609,546.
[0215] Os anticorpos podem ser também alterados para terem um padrão de glicosilação que difere do padrão nativo. Por exemplo, uma ou mais frações de carboidrato podem ser eliminadas e/ou um ou mais locais de glicosilação adicionais ao anticorpo original. A adição de locais de glicosilação aos anticorpos presentemente descritos pode ser alcançada por alteração da sequência de aminoácidos para conter sequências de consenso de locais de glicosilação conhecidas na técnica. Outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato nos anticorpos é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos aos resíduos de aminoácidos do anticorpo. Tais métodos são descritos em WO 87/05330 e em Aplin et a/. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. A remoção de quaisquer frações de carboidrato dos anticorpos pode ser alcançada quimicamente ou enzimaticamente, por exemplo, como descrito por Hakimuddin et a/. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; e Edge et a/. (1981) Anal. Biochem., 118: 131 e por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350. Os anticorpos podem ser também marcados com um marcador detectável, ou funcional. Os marcadores detectáveis incluem radiomarcadores tais como 1311 ou 99Tc, que podem estar também anexados a anticorpos usando química convencional. Marcadores detectáveis incluem também marcadores de enzima tais como peroxidase de rábano-silvestre ou fosfatase alcalina. Os marcadores detectáveis incluem adicionalmente frações químicas tais como biotina, que podem ser detectados através de ligação a uma fração química detectável cognata específica, p.ex., avidina marcada.
[0216] Anticorpos, nos quais as sequências de CDR diferem apenas insubstancialmente daquelas no presente documento apresentadas, estão abrangidos no âmbito desta presente invenção. Tipicamente, um aminoácido é substituído por um aminoácido relacionado tendo características de carga, hidrofóbicas, ou estereoquímicas similares. Tais substituições estariam dentro das perícias ordinárias de um especialista. Ao contrário de CDRs podem ser feitas mudanças substanciais em FRs sem afetar adversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. Mudanças a FRs incluem, mas não estão limitadas a, humanização de um resíduo estrutural derivado não humano ou manipulação de determinados resíduos estruturais que são importantes para contato do antigênio ou para estabilização do local de ligação, por exemplo, mudança da classe ou subclasse da região constante, mudança de resíduos de aminoácidos específicos que poderiam alterar a função efetora tal como ligação ao receptor Fc, por exemplo, como descrito na Pat. US Nos. 5,624,821 e 5,648,260 e Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 e Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324, ou mudança da espécie da qual a região constante é derivada.
[0217] Um com perícia na técnica apreciará que as modificações descritas acima não são exaustivas, e que muitas outras modificações seriam óbvias a um especialista perito à luz dos ensinamentos da presente invenção.
Compostos Específicos
[0218] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento podem ser compostos antissenso. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende ou consiste em um composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o composto oligomérico compreende um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobases complementar àquela de um ácido nucleico alvo.
[0219] Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobases complementar àquela de um ácido nucleico alvo.
[0220] Em determinadas modalidades, um composto ou composto antissenso é de fita simples. Um tal composto ou composto antissenso de fita simples compreende ou consiste em um composto oligomérico. Em determinadas modalidades, um tal composto oligomérico compreende ou consiste em um oligonucleotídeo e opcionalmente um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo de um composto antissenso de fita simples ou composto oligomérico compreende uma sequência de nucleobases autocomplementar.
[0221] Em determinadas modalidades, os compostos são de fita dupla. Tais compostos de fita dupla compreendem um primeiro oligonucleotídeo modificado com uma região complementar de um ácido nucleico alvo e um segundo oligonucleotídeo modificado com uma região complementar do primeiro oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é um oligonucleotídeo de RNA. Em tais modalidades, a nucleobase de timina no oligonucleotídeo modificado está substituída por uma nucleobase de uracila. Em determinadas modalidades, o composto compreende um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, um dos oligonu- cleotídeos modificados está conjugado. Em determinadas modalidades, ambos os oligonucleotídeos modificados estão conjugados. Em determinadas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo modificado está conjugado. Em determinadas modalidades, o segundo oligonucleotídeo modificado está conjugado. Em determinadas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo modificado tem 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento e o segundo oligonucleotídeo modificado tem 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, um dos oligonucleotídeos modificados tem uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246.
[0222] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso são de fita dupla. Tais compostos antissenso de fita dupla compreendem um primeiro composto oligomérico com uma região complementar de um ácido nucleico alvo e um segundo composto oligomérico com uma região complementar do primeiro composto oligomérico. O primeiro composto oligomérico de tais compostos antissenso de fita dupla compreende ou consiste em tipicamente um oligonucleotídeo modificado e opcionalmente um grupo conjugado. O oligonucleotídeo do segundo composto oligomérico de tal composto antissenso de fita dupla pode ser modificado ou não modificado. Um dos, ou ambos os, compostos oligoméricos de um composto antissenso de fita dupla pode(m) compreender um grupo conjugado. Os compostos oligoméricos de compostos antissenso de fita dupla podem incluir nucleosídeos pendentes não complementares.
[0223] Exemplos de compostos de fita simples e fita dupla incluem mas não estão limitados a oligonucleotídeos, siRNA, oligonucleotídeos visando microRNA e compostos de RNAi de fita simples, tais como RNA de grampo pequeno (shRNA), siRNA de fita simples (ssSsRNA) e mimetizadores de microRNA.
[0224] Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento tem uma sequência de nucleobases que, quando escrita na direção 5' para 3', compreende o complemento reverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo para o qual é direcionado.
[0225] Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 10 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 12 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um somposto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo de 12 a 22 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 14 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, o composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 14 a 20 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 15 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com a 20 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 16 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 16 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 17 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 17 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 18 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 18 a 21 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 18 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 20 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em outras palavras, tais oligonucleotídeos têm 12 a 30 subunidades ligadas, 14 a 30 subunidades ligadas, 14 a 20 subunidades, 15 a 30 subunidades, 15 a 20 subunidades, 16 a 30 subunidades, 16 a 20 subunidades, 17 a 30 subunidades, 17 a 20 subunidades, 18 a 30 subunidades, 18 a 20 subunidades, 18 a 21 subunidades, 20 a 30 subunidades ou 12 a 22 subunidades ligadas de comprimento, respectivamente.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 14 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 16 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 17 subunidades ligadas de comprimento.
Em determinadas modalidades, o composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com
18 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modali- dades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 19 subunidades ligadas de comprimento. Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 20 subunidades ligadas de comprimento. Em outras modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo com 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50 ou 20 a 30 subunidades ligadas. Em certas dessas modalidades, o composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76, 77, 78, 79, ou 80 subunidades ligadas de comprimento, ou um intervalo definido por quaisquer dois dos valores acima. Em algumas modali- dades, as subunidades ligadas são nucleotídeos, nucleosídeos ou nucleobases.
[0226] Em determinadas modalidades, o composto pode compre- ender adicionalmente características ou elementos adicionais, tais como um grupo conjugado, que estão ligados ao oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, tais compostos são compostos antissenso. Em determinadas modalidades, tais compostos são compostos oligoméricos. Em modalidades onde um grupo conjugado compreende um nucleosídeo (isto é, um nucleosídeo que liga o grupo conjugado ao oligonucleotídeo), o nucleosídeo do grupo conjugado não é contado no comprimento do oligonucleotídeo.
[0227] Em determinadas modalidades, os compostos podem ser encurtados ou truncados. Por exemplo, uma subunidade única pode ser eliminada da extremidade 5 (truncação 5) ou, alternativamente, da extremidade 3” (truncação 3”). Um composto encurtado ou truncado direcionado a um ácido nucleico de FOXP3 pode ter duas subunidades eliminadas da extremidade 5' ou, alternativamente, pode ter duas subunidades eliminadas da extremidade 3' do composto. Alternativa- mente, os nucleosídeos eliminados podem estar dispersos ao longo do composto.
[0228] Quando uma única subunidade adicional está presente em um composto alongado, a subunidade adicional pode estar localizada na extremidade 5 ou 3” do composto. Quando duas ou mais subuni- dades adicionais estão presentes, as subunidades adicionadas podem estar adjacentes umas às outras, por exemplo, em um composto com duas subunidades adicionadas à extremidade 5º (adição 5º), ou alternativamente à extremidade 3 (adição 3”), do composto. Alternativa- mente, as subunidades adicionadas podem estar dispersas ao longo do composto.
[0229] É possível aumentar ou diminuir o comprimento de um composto, tal como um oligonucleotídeo, e/ou introduzir bases não correspondidas sem eliminar a atividade (Woolf et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89: 7305-7309; Gautschi et al. J. Natl. Cancer Inst. Março 2001, 93: 463-471; Maher e Dolnick Nuc. Acid. Res. 1998, 16: 3341-3358). No entanto, mudanças aparentemente pequenas na sequência, química e motivo de oligonucleotídeos podem fazer grandes diferenças em uma ou mais das propriedades requeridas para desenvolvimento clínico (Seth et al. J. Med. Chem. 2009, 52, 10; Egli et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16642).
[0230] Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento são compostos de RNA de interferência (RNAi), que incluem compostos de RNA de fita dupla (também referidos como RNA de interferência curto ou siRNA) e compostos de RNAi de fita simples (ou
SSRNA). Tais compostos funcionam pelo menos em parte através da via RISC para degradar e/ou sequestrar um ácido nucleico alvo (assim, incluem microRNA/compostos mimetizadores de microRNA). Como usado no presente documento, o termo siRNA se destina a ser equivalente a outros termos usados para descrever moléculas de ácido nucleico que são capazes de mediar um RNAi específico de sequência, por exemplo RNA de interferência curto (siRNA), RNA de fita dupla (ASRNA), micro-RNA (miRNA), RNA de grampo curto (shRNA), oligonucleotídeo de interferência curto, ácido nucleico de interferência curto, oligonucleotídeo modificado de interferência curto, sIRNA quimicamente modificado, RNA de silenciamento de genes pós- transcricional (ptasRNA) e outros. Adicionalmente, como usado no presente documento, o termo “RNAi” se destina a ser equivalente a outros termos usados para descrever interferência de RNA específica de sequência, tal como silenciamento de genes pós-transcricional, inibição translacional ou epigenética.
[0231] Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento pode compreender qualquer uma das sequências oligonucleotídicas direcionadas a FOXP3 descritas no presente documento. Em determinadas modalidades, o composto pode ser de fita dupla. Em determinadas modalidades, o composto compreende uma primeira fita compreendendo pelo menos uma porção de 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246 e uma segunda fita. Em determinadas modalidades, o composto compreende uma primeira fita compreen- dendo a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9- 3246 e uma segunda fita. Em determinadas modalidades, o composto compreende ribonucleotídeos nos quais a primeira fita tem uracila (U) em vez de timina (T) em qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende (i) uma primeira fita compreendendo uma sequência de nucleobases complementar ao local em FOXP3 ao qual qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246 é visado e (ii) uma segunda fita. Em determinadas modalidades, um composto compreende um ou mais nucleotídeos modificados nos quais a posição 2' no açúcar contém um halogênio (tal como grupo flúor; 2-F) ou contém um grupo alcóxi (tal como um grupo metóxi; 2:-OMe). Em determinadas modalidades, o composto compreende pelo menos uma modificação de açúcar de 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar de 2:-OMe. Em determinadas modalidades, a pelo menos uma modificação de açúcar de 2-F e pelo menos uma modificação de açúcar de 2-OMe estão dispostas em um padrão alternado durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas ao longo de uma fita do composto de dsRNA. Em determinadas modalidades, o composto compreende uma ou mais ligações entre nucleotídeos adjacentes sem ser uma ligação de fosfodiéster de ocorrência natural. Exemplos de tais ligações incluem ligações de fosforamida, fosforotioato e fosforoditioato. Os compostos podem ser também moléculas de ácido nucleico quimicamente modificadas como ensinado na Pat. US No. 6,673,661. Em outras modalidades, o composto contém uma ou mais fitas encapadas, como descrito, por exemplo, por WO 00/63364, depositada a 19 de abr., 2000.
[0232] Em determinadas modalidades, a primeira fita do composto é uma fita guia de SIRNA e a segunda fita do composto é uma fita passageira de siRNA. Em determinadas modalidades, a segunda fita do composto é complementar à primeira fita. Em determinadas modalida- des, cada fita do composto tem 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleosídeos ligados de comprimento. Em determinadas modalidades, a primeira ou segunda fita do composto pode compreender um grupo conjugado.
[0233] Em determinadas modalidades, um composto descrito no presente documento pode compreender qualquer uma das sequências oligonucleotídicas direcionadas a FOXP3 descritas no presente documento.
Em determinadas modalidades, o composto é de fita simples.
Em determinadas modalidades, um tal composto é um composto de RNAi de fita simples (sSsRNAi). Em determinadas modalidades, o composto compreende pelo menos uma porção de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende a sequência de nucleobases de qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende ribonucleotídeos nos quais uracila (U) está em lugar de timina (T) em qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246. Em determinadas modalidades, o composto compreende uma sequência de nucleobases complementar ao local em FOXP3 ao qual qualquer um de SEQ ID NOs: 9-3246 é direcionado.
Em determinadas modalidades, o composto compreende um ou mais nucleotídeos modificados nos quais a posição 2' no açúcar contém um halogênio (tal como grupo flúor; 2-F) ou contém um grupo alcóxi (tal como um grupo metóxi; 2:-OMe). Em determinadas modalidades, o composto compreende pelo menos uma modificação de açúcar de 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar de 2:-OMe.
Em determinadas modalidades, a pelo menos uma modificação de açúcar de 2-F e pelo menos uma modificação de açúcar de 2-OMe estão dispostas em um padrão alternado durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas ao longo de uma fita do composto.
Em determinadas modalidades, o composto compreende uma ou mais ligações entre nucleotídeos adjacentes sem ser uma ligação de fosfodiéster de ocorrência natural.
Exemplos de tais ligações incluem ligações de fosforamida, fosforotioato e fosforoditioato.
Os compostos podem ser também moléculas de ácido nucleico quimicamente modificadas como ensinado na Pat. US No. 6,673,661. Em outras modalidades, o composto contém uma fita encapada, como descrito, por exemplo, por WO 00/63364, depositada a 19 de abr., 2000. Em determinadas modalidades, o composto consiste em 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, o composto pode compreender um grupo conjugado.
[0234] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos modificados. Determinados oligonucleotídeos modificados têm um ou mais centros assimétricos e dão assim origem a enantiômeros, diastereômeros e outras configurações estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) ou (S), como a ou 6 tal como para anômeros de açúcar, ou como (D) ou (L) tal como para aminoácidos, etc. Incluídos nos oligonucleotídeos modificados no presente documento fornecidos estão todos esses isômeros possíveis, incluindo suas formas racêmicas e opticamente puras, salvo especificação em contrário. Do mesmo modo, todos os isômeros cis e trans e formas tautoméricas estão também incluídas.
[0235] Os compostos descritos no presente documento incluem variações nas quais um ou mais átomos são substituídos por um isótopo não radioativo ou um isótopo radioativo do elemento indicado. Por exemplo, os compostos no presente documento que compreendem átomos de hidrogênio englobam todas as possíveis substituições por deutério para cada um dos átomos de hidrogênio *H. As substituições isotópicas englobadas pelos compostos do presente documento incluem, mas não se limitam a: 2H ou ?H no lugar de *H, ºC ou *C no lugar de 12C, SN no lugar de **N, 17O ou *ºO no lugar de 1?ºO e ?ºS, 32ºS, *S ou *S no lugar de *ºS. Em determinadas modalidades, as substituições isotópicas não radioativas podem conferir novas propriedades ao composto que são benéficas para uso como ferramenta terapêutica ou de pesquisa. Em determinadas modalidades, as substituições isotópicas radioativas podem tornar o composto adequado para fins de pesquisa ou de diagnóstico, tais como um ensaio de visualização. Mecanismos Específicos
[0236] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em oligonucleotídeos modificados. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são compostos antissenso. Em determinadas modalidades, os compostos compreendem compostos oligoméricos. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são capazes de hibridizar com um ácido nucleico alvo, resultando em pelo menos uma atividade antissenso. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento afetam seletivamente um ou mais ácidos nucleicos alvo. Tais compostos compreendem uma sequência de nucleobases que hibrida com um ou mais ácidos nucleicos alvo, resultando em uma ou mais atividades antissenso desejadas e não hibridam com um ou mais ácidos nucleicos não alvo ou não hibridam com um ou mais ácidos nucleicos não alvo de uma tal forma que resulta em uma atividade antissenso indesejada significativa.
[0237] Em determinadas atividades antissenso, a hibridização de um composto descrito no presente documento com um ácido nucleico alvo resulta no recrutamento de uma proteína que cliva o ácido nucleico alvo. Por exemplo, determinados compostos descritos no presente documento resultam em clivagem mediada por RNase H do ácido nucleico alvo. A RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um dúplex RNA:DNA. O DNA em um tal dúplex de RNA:DNA não necessita de ser DNA não modificado. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são suficientemente “semelhantes a DNA” para provocarem atividade de
RNase H. Adicionalmente, em determinadas modalidades, são tolera- dos um ou mais nucleosídeos não semelhantes a DNA na lacuna de um gapmer.
[0238] Em determinadas atividades antissenso, os compostos descritos no presente documento ou uma porção do composto são carregados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), resultando em última instância em clivagem do ácido nucleico alvo. Por exemplo, determinados compostos descritos no presente documento resultam em clivagem do ácido nucleico alvo por Argonauta. Os compostos que são carregados em RISC são compostos de RNAi. Os compostos de RNAi podem ter fita dupla (siRNA) ou fita simples (SSRNA).
[0239] Em determinadas modalidades, a hibridização de compostos descritos no presente documento com um ácido nucleico alvo não resulta no recrutamento de uma proteína que cliva esse ácido nucleico alvo. Em determinadas dessas modalidades, a hibridização do composto com o ácido nucleico alvo resulta em alteração de splicing do ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a hibridização do composto com um ácido nucleico alvo resulta na inibição de uma interação de ligação entre o ácido nucleico alvo e uma proteína ou outro ácido nucleico. Em determinadas dessas modalidades, a hibridização do composto com um ácido nucleico alvo resulta em alteração da tradução do ácido nucleico alvo.
[0240] As atividades antissenso podem ser observadas diretamente ou indiretamente. Em determinadas modalidades, a observação ou detecção de uma atividade antissenso envolve observação ou detecção de uma mudança em uma quantidade de um ácido nucleico alvo ou proteína codificada por tal ácido nucleico alvo, uma mudança na razão de variantes de splicing de um ácido nucleico ou proteína e/ou uma mudança fenotípica em uma célula ou animal.
Ácidos Nucleicos Alvo, Regiões Alvo e Sequências de Nucleotídeos
[0241] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em um oligonucle- otídeo compreendendo uma região que é complementar a um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico alvo é uma molécula de RNA endógena. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico alvo codifica uma proteína. Em determinadas dessas modalidades, o ácido nucleico alvo é selecionado de: um mRNA e um pré-mRNA, incluindo regiões intrônicas, exônicas e não traduzidas. Em determinadas modalidades, o RNA alvo é um mRNA. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico alvo é um pré-mRNA. Em determinadas dessas modalidades, a região alvo está inteiramente dentro de um íntron. Em determinadas modalidades, a região alvo abrange uma junção íntron/éxon. Em determinadas modalidades, a região alvo está pelo menos 50% dentro de um íntron.
[0242] As sequências de nucleotídeos que codificam FOXP3 incluem, sem limitação, o seguinte: RefSEQ No. NM 014009.3 (SEQ ID NO: 1); NT 011568.12 TRUNC 11907130 11921808 COMP (SEQ ID NO: 2) NM 0011143771 (SEQ I|D NO: 3); NC 000023.11 TRUNC 49247001 49273000 COMP (SEQ ID NO: 4); ou N.º de Acesso UCSC UCO64ZFP.1 correspondente às coordenadas genômicas chrX:49,251,334-49,259,240 na montagem GRCh38/hg38 (SEQ ID NO: 5); cada uma das quais está no presente documento incorporada a título de referência, em sua totalidade. Hibridização
[0243] Em algumas modalidades ocorre hibridização entre um composto descrito no presente documento e um ácido nucleico de FOXP3. O mecanismo de hibridização mais comum envolve ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa) entre nucleobases complementares das moléculas de ácido nucleico.
[0244] A hibridização pode ocorrer sob condições variáveis. As condições de hibridização são dependentes da sequência e são determinadas pela natureza e composição das moléculas de ácido nucleico a serem hibridizadas.
[0245] Métodos de determinação se uma sequência é especificamente hibridizável com um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, os compostos fornecidos no presente documento são especificamente hibridizáveis com um ácido nucleico de FOXP3. Complementaridade
[0246] É dito que um oligonucleotídeo é complementar de outro ácido nucleico quando a sequência de nucleobases de tal oligonucleotídeo ou uma ou mais de suas regiões corresponde(m) à sequência de nucleobases de outro oligonucleotídeo ou ácido nucleico ou uma ou mais Suas regiões quando as duas sequências de nucleobases estão alinhadas em direções opostas. As correspondências de nucleobases ou núcleo- bases complementares, como descrito no presente documento, estão limitadas aos seguintes pares: adenina (A) e timina (T), adenina (A) e uracila (U), citosina (C) e guanina (G), e 5-metilcitosina (MC) e guanina (G) a não ser que de outro modo especificado. Os oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos complementares não necessitam de ter complementa- ridade de nucleobases em cada nucleosídeo e podem incluir uma ou mais não correspondências de nucleobases. Um oligonucleotídeo é totalmente complementar ou 100% complementar quando tais oligonucleotídeos têm correspondências de nucleobases em cada nucleosídeo sem quaisquer não correspondências de nucleobases.
[0247] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em oligonucleotídeos modificados. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são compostos antissenso. Em determinadas modalidades, os compostos compreendem compostos oligoméricos. Nucleobases não complementares entre um composto e um ácido nucleico de FOXP3 podem ser toleradas desde que o composto permaneça capaz de se hibridizar especificamente com um ácido nucleico alvo. Além do mais, um composto pode se hibridizar ao longo de um ou mais segmentos de um ácido nucleico de FOXP3, de tal forma que segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de alça, não correspondência ou estrutura em forma de grampo).
[0248] Em determinadas modalidades, os compostos fornecidos no presente documento, ou uma porção especificada dos mesmos, são, são pelo menos, ou são até 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementares a um ácido nucleico de FOXP3, uma região alvo, segmento alvo ou porção especificada dos mesmos. Em determinadas modalidades, os compostos fornecidos no presente documento, ou uma porção especificada dos mesmos, são 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95%, 95% a 100%, ou qualquer número no meio destas faixas, complementares a um ácido nucleico de FOXP3, uma região alvo, segmento alvo ou porção especificada dos mesmos. À percentagem de complementaridade de um composto com um ácido nucleico alvo pode ser determinada usando métodos de rotina.
[0249] Por exemplo, um composto no qual 18 de 20 nucleobases do composto são complementares a uma região alvo, e portanto se hibridizaria de forma específica, representaria 90 por cento de complementaridade. Em este exemplo, as nucleobases não complementares restantes podem ser agrupadas ou intercaladas com nucleobases complementares e não necessitam de ser contíguas umas em relação às outras ou em relação a nucleobases complementares.
Como tal, um composto que tem 18 nucleobases em comprimento tendo quatro nucleobases não complementares que são flanqueadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo teria 77,8% de complementaridade global com o ácido nucleico alvo. À porcentagem de complementaridade de um composto com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente usando programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento local básico) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang e Madden, Genome Res, 1997, 7, 649-656). A porcentagem de homologia, identidade de sequências ou complementaridade podem ser determinadas, por exemplo, pelo programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando definições padrão, que usa o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[0250] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento, ou porções especificadas dos mesmos, são totalmente complementares (isto é, 100% de complementaridade) a um ácido nucleico alvo ou porção especificada do mesmo. Por exemplo, um composto pode ser totalmente complementar a um ácido nucleico de FOXP3, ou uma região alvo, ou um segmento alvo ou sequência alvo do mesmo. Como usado no presente documento, “totalmente comple- mentar” significa que cada nucleobase de um composto é complementar da nucleobase correspondente de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, um composto com 20 nucleobases é totalmente complementar a uma sequência alvo que tem 400 nucleobases de comprimento, desde que exista uma porção com 20 nucleobases correspondentes do ácido nucleico alvo que seja totalmente complementar ao composto. Totalmente complementar pode ser também usado em referência a uma porção especificada do primeiro e/ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma porção com 20 nucleobases de um composto com 30 nucleobases pode ser “totalmente complementar” a uma sequência alvo que tenha 400 nucleobases de comprimento. A porção com 20 nucleo- bases do composto com 30 nucleobases é totalmente complementar da sequência alvo se a sequência alvo tiver uma porção com 20 nucleobases correspondente em que cada nucleobase é complementar da porção com 20 nucleobases do composto. Ao mesmo tempo, o composto com 30 nucleobases inteiro pode ou não ser totalmente complementar da sequência alvo, dependendo de se as restantes 10 nucleobases do composto forem também complementares da sequência alvo.
[0251] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem uma ou mais nucleobases não correspondentes em relação ao ácido nucleico alvo. Em determinadas dessas modalidades, a atividade antissenso contra o alvo é reduzida por tal não correspondência, mas a atividade contra um não alvo é reduzida em maior proporção. Assim, em determinadas dessas modalidades, a seletividade do composto é melhorada. Em determi- nadas modalidades, a não correspondência está especificamente posicionada dentro de um oligonucleotídeo que tem um motivo gapmer. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 a partir da extremidade 5' da região de lacuna. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 a partir da extremidade 3' da região de lacuna. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 1, 2, 3 ou 4 a partir da extremidade 5' da região de asa. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 4, 3, 2 ou 1 a partir da extremidade 3' da região de asa. Em determinadas modalidades, a não correspondência está especificamente posicionada dentro de um oligonucleotídeo que não tem um motivo gapmer. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 1,2,3,4, 5,6,7,8,9, 10,11 ou 12 a partir da extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[0252] A localização de uma nucleobase não complementar pode estar na extremidade 5' ou extremidade 3' do composto. Alternativa- mente, a nucleobase ou nucleobases não complementar(es) pode(m) estar em uma posição interna do-composto. Quando duas ou mais nucleobases não complementares estão presentes, elas podem ser contíguas (isto é, ligadas) ou não contíguas. Em uma modalidade, uma nucleobase não complementar está localizada no segmento de asa de um oligonucleotídeo gapmer.
[0253] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento que têm, ou têm até, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 nucleo- base(s) não complementar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de FOXP3, ou porção especificada do mesmo.
[0254] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento que têm, ou têm até, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 nucleobase(s) não complementar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de FOXP3, ou porção especificada do mesmo.
[0255] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento incluem também aqueles que são complementares a uma porção de um ácido nucleico alvo. Como usado no presente documento, “porção” se refere a um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) dentro de uma região ou segmento de um ácido nucleico alvo. Uma “porção” pode também se referir a um número definido de nucleobases contíguas de um composto. Em determinadas modalidades, os-compostos são complementares a pelo menos uma porção com 8 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 9 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 10 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 11 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 12 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 13 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 14 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 15 nucleobases de um segmento alvo. Em determinadas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção com 16 nucleobases de um segmento alvo. Estão também contemplados compostos que são complementares de pelo menos uma porção com 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleobases de um segmento alvo ou uma gama definida por quaisquer dois destes valores.
Identidade
[0256] Os compostos fornecidos no presente documento podem ter também uma porcentagem de identidade definida em relação a uma sequência nucleotídica, SEQ ID NO ou composto particular representado por um número ION específico ou porção do mesmo. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são compostos antissenso ou compostos oligoméricos. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são oligonucleotídeos modificados. Como usado no presente documento, um composto é idêntico à sequência descrita no presente documento se tiver a mesma capacidade de pareamento de nucleobases. Por exemplo, um RNA que contém uracila em vez de timidina em uma sequência de DNA descrita seria considerado idêntico à sequência de DNA uma vez que tanto a uracila como a timidina emparelham com adenina. Versões encurtadas e alongadas dos compostos descritos no presente documento bem como compostos tendo bases não idênticas em relação aos compostos proporcionados no presente documento estão também contemplados. As bases não idênticas podem estar adjacentes umas às outras ou dispersas ao longo do composto. A porcentagem de identidade de um composto é calculada de acordo com o número de bases que têm pareamento de bases idêntico em relação à sequência com a qual está sendo comparado.
[0257] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento, ou porções dos mesmos, são, ou são pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos a um ou mais dos compostos ou SEQ ID NOs, ou a uma porção dos mesmos, descritos no presente documento. Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento são cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos, ou qualquer percentagem entre esses valores, a uma sequência nucleotídica, SEQ ID NO ou composto particular representado por um número ION específico, ou porção do mesmo, em que os compostos compreendem um oligonucleotídeo com uma ou mais nucleobases não correspondentes. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 a partir da extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em determinadas dessas modalidades, a não correspondência está na posição , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[0258] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em compostos antissenso. Em determinadas modalidades, uma porção do composto antissenso é comparada com uma porção de igual comprimento do ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleobases é comparada com uma porção de igual comprimento do ácido nucleico alvo.
[0259] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em oligonucleotídeos. Em determinadas modalidades, uma porção do oligonucleotídeo é comparada com uma porção de igual comprimento do ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleobases é comparada com uma porção de igual comprimento do ácido nucleico alvo. Compostos Modificados Específicos
[0260] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem ou consistem em oligonucleotídeos consistindo em nucleosídeos ligados. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos não modificados (RNA ou DNA), ou podem ser oligonucleotídeos modificados. Os oligonucleotídeos modificados compreendem pelo menos uma modificação em relação a RNA ou DNA não modificado (isto é, compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado (compreendendo uma fração de açúcar modificado e/ou uma nucleobase modificada) e/ou pelo menos uma ligação internucleosídica modificada). A. Nucleosídeos Modificados
[0261] Os nucleosídeos modificados compreendem uma fração de açúcar modificado ou uma nucleobase modificada ou tanto uma fração de açúcar modificado como uma nucleobase modificada.
1. Frações de Açúcar Modificado
[0262] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar são frações de açúcar modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modificado são frações de açúcar bicíclico ou tricíclico. Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modificado são substitutos de açúcar. Tais sucedâneos de açúcar podem compreender uma ou mais substituições correspondendo àquelas de outros tipos de frações de açúcar modificado.
[0263] Em certas modalidades, as frações de açúcar modificado são frações de açúcar modificado não bicíclico compreendendo um anel de furanosila com um ou mais substituintes acíclicos, incluindo mas não se limitando a substituintes nas posições 2', 4' e/ou 5º. Em determinadas modalidades, um ou mais substituintes acíclicos de frações de açúcar modificado não bicíclico é(são) ramificado(s). Exemplos de grupos substituintes em 2' adequados para frações de açúcar modificado não bicíclico incluem, mas não estão limitados a: 2'-F, 2-O0CH;3 ("OMe" ou "O- metila") e 2-O0(CH2)2OCH;3 ("MOE"). Em determinadas modalidades, os grupos substituintes em 2' são selecionados de: halogênio, alila, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O-alcóxi C1-Cio, O-alcóxi C1-C1o substituído, O-alquila C1-C10, O-alguila C1-C1io substituída, S-alquila, N(Rm)-alquila, O-alquenila, S-alquenila, N(Rm)-alquenila, O-alquinila, S- alquinila, N(Rm)-alguinila, O-alquilenil-O-alquila, alquinila, alcarila,
aralquila, O-alcarila, O-aralquila, O(CH2)-SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn) ou OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H, um grupo protetor amino ou alquila C1-C1o substituída ou não substituída e os grupos substituintes em 2' descritos em Cook et a/., US 6,531,584; Cook et al., US 5,859,221; e Cook et al., US 6,005,087. Determinadas modalidades destes grupos substituídos em 2' podem estar adicional- mente substituídas com um ou mais grupos substituintes independente- mente selecionados de entre: hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro (NO>), tiol, tioalcóxi, tioalquila, halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila. Exemplos de grupos substituintes em 4' adequados para frações de açúcar modificado linearmente não bicíclico incluem, mas não estão limitados a alcóxi (por exemplo, metóxi), alquila e aqueles descritos em Manoharan et al/., WO 2015/106128. Exemplos de grupos substituintes em 5' adequados para frações de açúcar modificado não bicíclico incluem, mas não estão limitados a: 5'-metila (R ou S), 5'-vinila e 5-metóxi. Em determinadas modalidades, açúcares modificados não bicíclicos compreendem mais do que um substituinte de açúcar que não está em ponte, por exemplo, frações de açúcar de 2'-F-5'-metila, e as frações de açúcar modificado e nucleosídeos modificados descritos em Migawa et a/., US2010/190837 e Rajeev et al., US2013/0203836.
[0264] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' ou nucleosídeo modificado não bicíclico em 2' compreende uma fração de açúcar compreendendo um grupo substituinte em 2' linear, selecionado de: F, NH2, N3, OCF3, OCH3, O(CH2);NH2, CH2CH=CH>, OCH2CH=CH2, OCH2CH20CH3, O(CH2)-SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rrn), O(CH2)2O(CH2)N(CH3)2 e acetamida substituída em N (OCH2C(=O)- N(Rm)(Rn)), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H, um grupo amino protetor ou alquila C1-C10 substituída ou não substituída.
[0265] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' ou nucleosídeo modificado não bicíclico em 2' compreende uma fração de açúcar compreendendo um grupo substituinte em 2' linear, selecionado de: F, OCF3 OCH3, OCH2CH20CH3, O(CH>2)2SCH;, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)2O(CH2)aN(CH3)) e OCH2C(=O)-N(H)CH3 (“NMA”).
[0266] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' ou nucleosídeo modificado não bicíclico em 2' compreende uma fração de açúcar compreendendo um grupo substituinte em 2' linear, selecionado de: F, OCH3 e OCH2CH20CH;.
[0267] Os nucleosídeos compreendendo frações de açúcar modifi- cado, tais como frações de açúcar modificado não bicíclico, são referidos pela(s) posição(ões) da(s) substituição(ões) na fração de açúcar do nucleosídeo. Por exemplo, os nucleosídeos compreendendo frações de açúcar substituído em 2º ou modificado em 2 são referidos como nucleosídeos substituídos em 2º ou nucleosídeos modificados em 2.
[0268] Determinadas frações de açúcar modificado compreendem um substituinte de açúcar em ponte que forma um segundo anel resultando em uma fração de açúcar bicíclico. Em determinadas dessas modalidades, a fração de açúcar bicíclico compreende uma ponte entre os átomos do anel de furanose em 4' e 2'. Exemplos de tais substituintes de açúcar em ponte 4 para 2 incluem mas não estão limitados a: 4"- CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-0-2' (“LNA”), 4'-CH2-S-2', 4"- (CH2)2-0-2' (“ENA”), 4:-CH(CH3)-O0-2' (chamado de “etila impedida” ou “cEt” quando na configuração S), 4'-CH2-O0-CH2-2', 4:-CH2-N(R)-2', 4"- CH(CH20CH;3)-O0-2' (“MOE impedida” ou “CMOE”) e seus análogos (ver, por exemplo, Seth et a/., US 7.399.845, Bhat et al., US 7.569.686, Swayze et al., US 7.741.457 e Swayze et al., US 8.022.193), 4- C(CH3)(CH3)-O-2' e seus análogos (ver, por exemplo, Seth et al., US
8.278.283), 4-CH2-N(OCH;3)-2' e seus análogos (ver, por exemplo, Prakash et a/., US 8.278.425), 4-CH2-O-N(CH3)-2' (ver, por exemplo, Allerson et al., US 7.696.345 e Allerson et al., US 8.124.745), 4'-CH2-
C(H)(CH3)-2' (ver, por exemplo, Zhou, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134), 4:-CH2-C(=CH>2)-2' e seus análogos (ver, por exemplo, Seth et al., US 8.278.426), 4-C(RaRv)-N(R)-O-2', 4 :-C(RaRv)-O-N(R)-2', 4-CH>2- O-N(R)-2' e 4-CH>-N(R)-O0-2, em que cada R, Ra e Rv é, independentemente, H, um grupo protetor ou alquila C1-C12 (ver, por exemplo, Imanishi et al., US 7.427.672).
[0269] Em determinadas modalidades, tais pontes de 4' a 2' com- preendem independentemente de 1 a 4 grupos ligados independente- mente selecionados de: -[C(Ra)(Rv)]ln-, -[C(Ra)(Re)Jn-O-, -C(Ra)=C(Ror)-, - C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O).- E -N(Ra)-; em que: xéO,1ou?2; né 1,2,30ou4; cada Ra e Rv é, independentemente, H, um grupo protetor, hidroxila, alguila C1-C12, alquila C1-C12 substituída, alquenila C2-C12, alquenila C2>-C12 substituída, alquinila C2-C12, alquinila C2>-Ci2 substituída, arila Cs-C2o, arila Cs-C20o substituída, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, heteroarila, heteroarila substituída, radical alicíclico C5-C7, radical alicícliico C5-C;7 substituído, OJ1, NJ1J>2, SJ1, Na, COOUJ:, acila (C(=O)-H), acila substituída, CN, sulfonila (S(=O)2- J1) ou sulfoxila (S(=O)-J:); e cada J: e Jr é, independentemente, H, alquila C1-C12, alquila C1-C12 substituída, alquenila C2-C12, alquenila C2- C12 substituída, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituída, arila Cs- C2o, arila Cs-C2o substituída, acila (C(=O)-H), acila substituída, um radical heterocíclico, um radical heterocíclico substituído, aminoalquila C1-C12, aminoalquila C1-C12 substituída ou um grupo protetor.
[0270] Frações de açúcar bicíclico adicionais são conhecidas na técnica, ver, por exemplo: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al.
Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035- 10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wengel et al/.,US 7,053,207, Imanishi et al., US 6,268,490, Imanishi et al. U.S. 6,770,748, Imanishi et al., US RE44,779; Wengel et al., US 6,794,499, Wengel et a/., US 6,670,461; Wengel et al., US 7,034,133, Wengel et al., US 8,080,644; Wengel et al., US 8,034,909; Wengel et al., US 8,153,365; Wengel et al., US 7,572,582; eRamasamy et al., US 6,525,191, Torsten et al, WO 2004/106356, Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al. WO 2007/134181; Seth et al., US 7,547 ,684; Seth et al., US 7,666,854; Seth et a/., US 8,088,746; Seth et al., US 7,750,131; Seth et a/., US 8,030,467; Seth et al., US 8,268,980; Seth et a/., US 8,546,556; Seth et a/., US 8,530,640; Migawa et al., US 9,012,421; Seth et al, US 8,501,805; Allerson et al, US2008/0039618; e Migawa et al., US2015/0191727.
[0271] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar bicíclico e nucleosídeos incorporando tais frações de açúcar bicíclico são adicionalmente definidos pela configuração isomérica. Por exemplo, um nucleosídeo LNA (descrito no presente documento) pode estar na configuração a-L ou na configuração B-D.
o Er So NE o LNA (configuração B-D) a-L-LNA (configuração a-L) ponte = 4-CH,-0-2' ponte = 4'-CH,-0-2'
[0272] Nucleosídeos bicíclicos de a-L-metilenóxi (4'-CH2-O0-2') ou a- L-LNA foram incorporados em oligonucleotídeos que mostraram atividade antissenso (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372). No presente documento, as descrições gerais de nucleosídeos bicíclicos incluem ambas as configurações isoméricas. Quando as posições de nucleosídeos bicíclicos específicos (por exemplo, LNA ou cEt) estão identificadas em modalidades exemplificativas no presente documento, elas estão na configuração B- D, a não ser que de outro modo especificado.
[0273] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modificado compreendem um ou mais substituintes de açúcar não em ponte e um ou mais substituintes de açúcar em ponte (por exemplo, açúcares substituídos em 5' e em ponte 4' a 2').
[0274] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modificado são substitutos de açúcar. Em determinadas dessas modalidades, o átomo de oxigênio da fração de açúcar está substituído, por exemplo, com um átomo de enxofre, carbono ou nitrogênio. Em determinadas dessas modalidades, tais frações de açúcar modificado compreendem também substituintes em ponte e/ou não em ponte como descrito no presente documento. Por exemplo, determinados substitutos de açúcar compreendem um átomo de enxofre em 4' e uma substituição na posição 2' (ver, por exemplo, Bhat et al., US 7,875,733 e Bhat et al., US 7,939,677) e/ou na posição 5".
[0275] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem anéis que têm um número diferente de 5 átomos. Por exemplo, em determinadas modalidades, um substituto de açúcar compreende um tetra-hidropirano com seis membros (“THP”). Tais tetra- hidropiranos podem ser adicionalmente modificados ou substituídos. Os nucleosídeos compreendendo tais tetra-hidropiranos modificados incluem, mas não estão limitados a, ácido nucleico de hexitol (“HNA'”), ácido nucleico de anitol (“ANA”), ácido nucleico de manitol (“MNA”) (ver, por exemplo, Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854),
HNA de fluoro: to O. F-HNA
[0276] (“F-HNA”, ver, por exemplo, Swayze et al., US 8,088,904; Swayze et al., US 8,440,803; e Swayze et al., US 9,005,906, F-HNA pode ser também chamado de F-THP ou 3'-fluoro-tetra-hidropirano) e nucleosídeos — compreendendo “compostos de THP modificados adicionais tendo a fórmula: ni qo “E 97 UU e Bx 7 R$ R, % em que, independentemente, para cada um dos referidos nucleosídeos de THP modificados: Bx é uma fração de nucleobase; T3 e Ta são cada um, independentemente, um grupo de ligação internucleosídica ligando o nucleosídeo de THP modificado ao resto de um oligonucleotídeo ou um de T3 e Ta é um grupo de ligação internucleosídica ligando o nucleosídeo de THP modificado ao resto de um oligonucleotídeo e o outro de T3 e Ta é H, um grupo protetor hidroxila, um grupo conjugado ligado ou um grupo terminal 5' ou 3'; q1, q2, d3, da, qs5, qs E q7 São cada um, independentemente, H, alquila C1-Cs, alquila C1-Cs6 substituída, alquenila C2-Cs, alquenila C2-Cs substituída, alquinila C2-C6 ou alquinila substituída C2-Ce; e cada um de R; e R2 é independentemente selecionado de entre: hidrogênio, halogênio, alcóxi substituído ou não substituído, NJ1J2, SJ1, Na, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J>, NJ3C(=X)NJ1J2 e CN, em que XKé O, S ou NJ: e cada Ji, Jr e Ja é, independentemente, H ou alquila C1-Cse.
[0277] Em determinadas modalidades, são fornecidos nucleosídeos de THP modificados em que q, q2, q3, da, qs, ds € q7 são cada um H. Em determinadas modalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, qa, ds, ds É q7 é diferente de H. Em determinadas modalidades, pelo menos um de q, q2, da, qa, qs, ds E q7 é metila. Em determinadas modalidades, são fornecidos nucleosídeos de THP modificados em que um de R: e Ré F. Em determinadas modalidades, R: é F e Rxé H, em determinadas modalidades, R: é metóxi e R- é H e, em determinadas modalidades, R1 é metoxietóxi e R2 é H.
[0278] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem anéis que têm mais do que 5 átomos e mais do que um heteroátomo. Por exemplo, foram relatados nucleosídeos compreen- dendo frações de açúcar de morfolino e seu uso em oligonucleotídeos (ver, por exemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 e Summerton et a/l., US 5,698,685; Summerton et al., US 5,166,315; Summerton et a/., US 5,185,444; e Summerton et al., US 5,034,506). Como usado no presente documento, o termo “morfolino” significa um sucedâneo de açúcar tendo a seguinte estrutura: sa. Bx e» de
[0279] Em determinadas modalidades, os morfolinos podem ser modificados, por exemplo por adição ou alteração de vários grupos substituintes da estrutura de morfolino acima. Tais sucedâneos de açúcar são referidos no presente documento como “morfolinos modificados”.
[0280] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem frações acíclicas. Exemplos de nucleosídeos e oligonucleotídeos compreendendo tais sucedâneos de açúcar acíclicos incluem mas não estão limitados a: ácido nucleico de peptídeo (“PNA”),
ácido nucleico de butila acíclico (ver, p.ex., Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865) e nucleosídeos e oligonucleotídeos descritos em Manoharan et a/., US2013/130378.
[0281] São conhecidos na técnica muitos outros sistemas de anéis de açúcares e sucedâneos de açúcares bicíclicos e tricíclicos que podem ser usados em nucleosídeos modificados.
2. Nucleobases Modificadas
[0282] As modificações ou substituições de nucleobases (ou bases) são estruturalmente distinguíveis de, todavia funcionalmente indistintas de, nucleobases não modificadas ocorrendo naturalmente ou sintéticas. As nucleobases tanto naturais como modificadas são capazes de participar na ligação de hidrogênio. Tais modificações de nucleobases podem fornecer estabilidade a nucleases, afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica a compostos antissenso.
[0283] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos modificados. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compre- endem um ou mais nucleosídeos compreendendo uma núcleobase não modificada. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modifi- cados compreendem um ou mais nucleosídeos compreendendo uma nucleobase modificada. Em determinadas modalidades, os oligonucle- otídeos modificados compreendem um ou mais nucleosídeos que não compreendem uma nucleobase, chamados de um nucleosídeo abásico.
[0284] Em determinadas modalidades, as nucleobases modificadas são selecionadas de: pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas, pirimidinas substituídas com alquila ou alquinila, purinas substituídas por alquila e purinas substituídas em N-2, N-6 e O-6. Em determinadas modalidades, as nucleobases modificadas são selecionadas de: 2- aminopropiladenina, 5-hidroximetilcitosina, 5-metilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-N-metilguanina, 6-N-metiladenina, 2-
propiladenina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-propinila (C=C- CH3) uracila, 5-propinilcitosina, 6-azouracila, 6-azocitosina, 6-azotimina, B5-ribosiluracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquila, 8-hidroxila, 8-aza e outras purinas substituídas em 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila, 5-halouracila e 5-halocitosina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 7- desazaguanina, —7-desaza-adenina, —3-desazaguanina, 3-desaza- adenina, 6-N-benzoiladenina, 2-N-isobutirilguanina, 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracila, 5-metil-4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracila de 5- metila, bases universais, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases com tamanho expandido e bases fluoradas. Nucleobases modificadas adicionais incluem pirimidinas tricíclicas, tais como 1,3-diazafenoxazin-2- ona, 1,3-diazafenotiazin-2-ona e 9-(2-aminoetóxi)-1,3-diazafenoxazin-2- ona (grampo em G). As nucleobases modificadas podem também incluir aquelas nas quais a base de purina ou pirimidina está substituída com outros heterociclos, por exemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases adicionais incluem aquelas descritas em Merigan et a/., US 3,687,808, aquelas descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.l., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. e Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; e aquelas descritas nos Capítulos 6 e 15, Antisense Drug Technology, Crooke S.T., Ed., CRC Press, 2008, 163- 166 e 442-443.
[0285] Publicações que ensinam a preparação de certas das nucleobases modificadas acima anotadas bem como outras nucleobases modificadas incluem, sem limitação, Manoharan et a/., US2003/0158403, Manoharan et a/., US2003/0175906; Dinh et a/., US 4,845,205; Spielvogel et al., US 5,130,302; Rogers et al., US 5,134,066; Bischofberger et al.,
US 5,175,273; Urdea et a/., US 5,367,066; Benner et al., US 5,432,272; Matteucci et al., US 5,434,257; Gmeiner et al., US 5,457,187; Cook et al., US 5,459,255; Froehler et al. US 5,484,908; Matteucci et al., US 5,502,177; Hawkins et al. US 5,525,711; Haralambidis et al., US 5,552,540; Cook et al., US 5,587 ,469; Froehler et al., US 5,594,121; Switzer et al., US 5,596,091; Cook et al., US 5,614,617; Froehler et al., US 5,645,985; Cook et al/., US 5,681,941; Cook et al., US 5,811,534; Cook et al., US 5,750,692; Cook et a/l., US 5,948,903; Cook et al., US 5,587,470; Cook et al., US 5,457,191; Matteucci et al., US 5,763,588; Froehler et a/., US 5,830,653; Cook et al., US 5,808,027; Cook et al., US 6,166,199; e Matteucci et a/., US 6,005,096.
[0286] Em determinadas modalidades, os compostos direcionados a um ácido nucleico de FOXP3 compreendem uma ou mais núcleo- bases modificadas. Em determinadas modalidades, a nucleobase modificada é 5-metilcitosina. Em determinadas modalidades, cada citosina é uma 5-metilcitosina.
3. Ligações Internucleosídicas Modificadas
[0287] A ligação internucleosídicas de RNA e DNA ocorrendo atualmente é uma ligação de fosfodiéster de 3' para S5Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento tendo uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas, isto é, não ocorrendo naturalmente, são frequentemente selecionados em relação a compostos tendo ligações internucleosídicas ocorrendo naturalmente devido a propriedades desejáveis tais como, por exemplo, captação celular intensificada, afinidade intensificada pelos ácidos nucleicos alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[0288] Ligações internucleosídicas representativas com um centro quiral incluem, mas não estão limitadas a, alquilfosfonatos e fosforotioatos. Os oligonucleotídeos modificados compreendendo ligações internucleosídicas com um centro quiral podem ser preparados como populações de oligonucleotídeos modificados compreendendo ligações internucleosídicas estereoaleatórias, ou como populações de oligonucleotídeos modificados compreendendo ligações de fosforo- tioato em configurações estereoquímicas particulares.
Em determi- nadas modalidades, as populações de oligonucleotídeos modificados compreendem ligações internucleosídicas de fosforotioato em que todas as ligações internucleosídicas de fosforoticato são estereoale- atórias.
Tais oligonucleotídeos modificados podem ser gerados usando métodos sintéticos que resultam na seleção aleatória da configuração estereoquímica de cada ligação de fosforoticoato.
No entanto, como é bem entendido pelos especialistas na técnica, cada fosforotioato individual de cada molécula de oligonucleotídeo individual tem uma estereoconfiguração definida.
Em determinadas modalidades, popula- ções de oligonucleotídeos modificados são enriquecidas em oligonucleotídeos modificados compreendendo uma ou mais ligações internucleosídicas de fosforotioato particulares em uma configuração estereoquímica particular, independentemente selecionada.
Em determinadas modalidades, a configuração particular da ligação de fosforotioato particular está presente em pelo menos 65% das moléculas na população.
Em determinadas modalidades, a configuração particular da ligação de fosforoticato particular está presente em pelo menos 70% das moléculas na população.
Em determinadas modalidades, a configuração particular da ligação de fosforotioato particular está presente em pelo menos 80% das moléculas na população.
Em determinadas modalidades, a configuração particular da ligação de fosforoticato particular está presente em pelo menos 90% das moléculas na população.
Em determinadas modalidades, a configuração particular da ligação de fosforotioato particular está presente em pelo menos 99% das moléculas na população.
Tais populações quiralmente enriquecidas de oligonucleotídeos modificados podem ser geradas usando métodos sintéticos conhecidos na técnica, por exemplo, métodos descritos em Oka et al., JACS 125, 8307 (2003), Wan et al. Nuc. Acid. Res. 42, 13456 (2014) e WO 2017/015555. Em determinadas modalidades, uma população de oligonucleotídeos modificados é enriquecida em oligonucleotídeos modificados com pelo menos um fosforotioato indicado na configuração (Sp). Em determinadas modalidades, uma população de oligonucleotídeos modificados é enriquecida em oligonucleotídeos modificados com pelo menos um fosforotioato na configuração (Rp). Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados — compreendendo fosforoticatos (Rp) e/ou (Sp) compreendem uma ou mais das seguintes fórmulas, respectivamente, em que “B” indica uma nucleobase: do, hot o=P=sH o=P. sH O, O, . s
[0289] A não ser que indicado de outro modo, as ligações internucleosídicas quirais de oligonucleotídeos modificados descritos no presente documento podem ser estereoaleatórias ou em uma configuração estereoquímica particular.
[0290] Em determinadas modalidades, os compostos direcionados a um ácido nucleico de FOXP3 compreendem uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em determinadas modalidades, as ligações internucleosídicas modificadas são ligações de fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada ligação internucleosídica de um composto antissenso é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0291] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos. Os oligonucleo- tídeos que têm ligações internucleosídicas modificadas incluem ligações internucleosídicas que retêm um átomo de fósforo bem como ligações internucleosídicas que não têm um átomo de fósforo. Ligações internucleosídicas contendo fósforo representativas incluem, mas não estão limitadas a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato e fosforotioatos. Métodos de preparação de ligações contendo fósforo e não contendo fósforo são bem conhecidas.
[0292] Em determinadas modalidades, os nucleosídeos de oligonucleotídeos modificados podem ser ligados usando qualquer ligação internucleosídica. As duas principais classes de grupos de ligação internucleosídica são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. Ligações internucleosídicas contendo fósforo representativas incluem, mas não estão limitadas a, fosfatos, que contêm uma ligação de fosfodiéster (“P=O") (também chamada de ligações não modificadas ou de ocorrência natural), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos e fosforotioatos (“P=S”) e fosforo- ditioatos (“HS-P=S”). Grupos de ligações internucleosídicas não contendo fósforo representativos incluem, mas não estão limitados a, metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH>2-), tiodiéster, tionocarbamato (- O-C(=O)(NH)-S-); siloxano (-O-SiH2-O-) e N,N'-dimetil-hidrazina (-CH2- N(CH3)-N(CH3)-). Ligações — internucleosídicas — modificadas, em comparação com ligações de fosfato de ocorrência natural, podem ser usadas para alterar, tipicamente aumentar, a resistência a nucleases do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, as ligações internucleosídicas que têm um átomo quiral podem ser preparadas como uma mistura racêmica ou como enantiômeros separados. Ligações internucleosídicas quirais representativas incluem, mas não estão limitadas a, alquilfosfonatos e fosforotioatos. Métodos de preparação de ligações internucleosídicas contendo fósforo e não contendo fósforo são bem conhecidas pelos especialistas na técnica.
[0293] Ligações internucleosídicas neutras incluem, sem limitação, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'- CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=0O)-5'), formacetal (3'-O- CH2-0-5"), metoxipropila e tioformacetal (3'-S-CH2-0-5'). Ligações internucleosídicas neutras adicionais incluem ligações não iônicas compreendendo siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfeto, éster de sulfonato e amidas (Ver, por exemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi e P.D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 e 4, 40-65). Ligações internucleosídicas neutras adicionais incluem ligações não iônicas compreendendo partes componentes mistas de N, O, S e CH.
[0294] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem ligações internucleosídicas modificadas dispostas ao longo do oligonucleotídeo ou região do mesmo em um padrão definido ou motivo de ligação internucleosídica modificada. Em determinadas modalidades, as ligações internucleosídicas estão dispostas em um motivo com lacuna. Em tais modalidades, as ligações internucleosídicas em cada uma das duas regiões de asa são diferentes das ligações internucleosídicas na região de lacuna. Em determinadas modalidades, as ligações internucleosídicas nas asas são fosfodiéster e as ligações internucleosídicas na lacuna são fosforotioato. O motivo de nucleosídeo é independentemente selecionado, logo tais oligonucleotídeos tendo um motivo de ligação internucleosídica com lacunas podem ou não ter um motivo de nucleosídeo com lacuna e, se tiverem um motivo de nucleosídeo com lacuna, os comprimentos da asa e lacuna podem ou não ser os mesmos.
[0295] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compre- endem uma região que tem um motivo de ligação internucleosídica alternada. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região de ligações internucleosídicas uniformemente modificadas. Em determinadas dessas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma região que está uniformemente ligada por ligações internucleosídicas de fosforoticato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo está uniformemente ligado por fosforoticoato. Em determinadas — modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster e fosforoticato. Em determinadas — modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato e pelo menos uma ligação internucleosídica é fosforotioato.
[0296] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 6 ligações internucleosídicas de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 8 ligações internucleosídicas de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 10 ligações internucleosídicas de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de pelo menos 6 ligações internucleosídicas de fosforoticato “consecutivas. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de pelo menos 8 ligações internucleosídicas de fosforotioato consecutivas. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de pelo menos 10 ligações internucleosídicas de fosforotioato consecutivas. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de pelo menos 12 ligações internucleosídicas de fosforoticoato consecutivas. Em determinadas dessas modalidades, pelo menos um tal bloco está localizado na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas dessas modalidades, pelo menos um tal bloco está localizado dentro de 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[0297] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais ligações de metilfosfonato. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que têm um motivo de nucleosídeo de gapmer compreendem um motivo de ligação compreendendo ligações todas de fosforotioato exceto por uma ou duas ligações de metilfosfonato. Em determinadas modalidades, uma ligação de metilfosfonato está na lacuna central de um oligonucleotídeo tendo um motivo de nucleosídeo de gapmer.
[0298] Em determinadas modalidades, é desejável arranjar o número de ligações internucleosídicas de fosforoticato e ligações internucleosídicas de fosfodiéster para manter a resistência a nucleases. Em determinadas modalidades, é desejável arranjar o número e posição de ligações internucleosídicas de fosforoticoato e o número e posição de ligações internucleosídicas de fosfodiéster para manter a resistência a nucleases. Em determinadas modalidades, o número de ligações internucleosídicas de fosforoticato pode ser diminuído e o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster pode ser aumentado. Em determinadas modalidades, o número de ligações internucleosídicas de fosforoticato pode ser diminuído e o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster pode ser aumentado enquanto se mantém a resistência a nucleases. Em determinadas modalidades, é desejável diminuir o número de ligações internucleosídicas de fosforotioato enquanto se retém a resistência a nucleases. Em determinadas modalidades, é desejável aumentar o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster enquanto se retém a resistência a nucleases. Determinados motivos
[0299] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ter um motivo, por exemplo, um padrão de frações de açúcar, nucleobases e/ou ligações internucleosídicas não modificadas e/ou modificadas. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem um ou mais nucleosídeos modificados compreendendo um açúcar modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem um ou mais nucleosídeos modificados compreendendo uma nucleobase modificada. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em tais modalidades, as frações de açúcar, nucleobases e/ou ligações internucleosídicas modificadas, não modificadas e diferentemente modificadas de um oligonucleotídeo modificado definem um padrão ou motivo. Em determinadas modalidades, os padrões de frações de açúcar, nucleobases e ligações internucleosídicas são cada um deles independente dos outros. Assim, um oligonucleotídeo modificado pode ser descrito pelo seu motivo de açúcar, motivo de nucleobase e/ou motivo de ligação internucleosídica (como usado no presente documento, um motivo de nucleobase descreve as modificações às nucleobases independentemente da sequência de nucleobases). a. Motivos de Açúcar Específicos
[0300] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente — documento — compreendem oligonucleotídeos. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem um ou mais tipos de fração de açúcar modificado e/ou açúcar não modificado dispostos ao longo do oligonucleotídeo ou de uma região do mesmo, em um padrão ou motivo de açúcar definido. Em determinados casos, tais motivos de açúcar incluem mas não estão limitados a qualquer uma das modificações de açúcar discutidas no presente documento.
[0301] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem ou consistem em uma região que tem um motivo gapmer, que compreende duas regiões externas ou “asas” e uma região central ou interna ou “lacuna”. As três regiões de um motivo gapmer (a asa 5', a lacuna e a asa 3') formam uma sequência contígua de nucleosídeos em que pelo menos algumas das frações de açúcar dos nucleosídeos de cada uma das asas diferem de pelo menos algumas das frações de açúcar dos nucleosídeos da lacuna. Especificamente, pelo menos as frações de açúcar dos nucleosídeos de cada asa que estão mais próximas da lacuna (o nucleosídeo mais 3' da asa 5' e o nucleosídeo mais 5' da asa 3') diferem da fração de açúcar dos nucleosídeos da lacuna vizinhos, definindo assim a fronteira entre as asas e a lacuna (isto é, a junção asa/lacuna). Em determinadas modalidades, as frações de açúcar dentro da lacuna são iguais umas às outras. Em determinadas modalidades, a lacuna inclui um ou mais nucleosídeos com uma fração de açúcar que difere da fração de açúcar de um ou mais dos outros nucleosídeos da lacuna. Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar das duas asas são iguais entre si (gapmer simétrico). Em determinadas modalidades, o motivo de açúcar da asa 5' difere do motivo de açúcar da asa 3' (gapmer assimétrico).
[0302] Em determinadas modalidades, as asas de um gapmer compreendem 1 a 5 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, as asas de um gapmer compreendem 2 a 5 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, as asas de um gapmer compreendem 3 a 5 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos de um gapmer são todos nucleosídeos modificados.
[0303] Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 7 a 12 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 7 a 10 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 8 a 10 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 10 nucleosídeos. Em determinada modalidade, cada nucleosídeo da lacuna de um gapmer é um 2'-desoxinucleosídeo não modificado.
[0304] Em determinadas modalidades, o gapmer é um gapmer desóxi. Em tais modalidades, os nucleosídeos do lado da lacuna de cada junção asa/lacuna são 2'-desoxinucleosídeos não modificados e os nucleosídeos dos lados da asa de cada junção asa/lacuna são nucleosídeos modificados. Em determinadas dessas modalidades, cada nucleosídeo da lacuna é um 2'-desoxinucleosídeo não modificado. Em determinadas dessas modalidades, cada nucleosídeo de cada asa é um nucleosídeo modificado.
[0305] Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo modificado tem um motivo de açúcar totalmente modificado em que cada nucleosídeo do oligonucleotídeo modificado compreende uma fração de açúcar modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem ou consistem em uma região que tem um motivo de açúcar totalmente modificado em que cada nucleosídeo da região compreende uma fração de açúcar modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem ou consistem em uma região que tem um motivo de açúcar totalmente modificado, em que cada nucleosídeo dentro da região totalmente modificada compreende a mesma fração de açúcar modificado, chamado no presente documento de um motivo de açúcar uniformemente modificado. Em determinadas modalidades, um oligonu- cleotídeo totalmente modificado é um oligonucleotídeo uniformemente modificado. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de um uniformemente modificado compreende a mesma modificação em 2'.
[0306] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo modificado pode compreender um motivo de açúcar descrito em Swayze et al. US2010/0197762; Freier et al., US2014/0107330; Freier et al, US2015/0184153; e Seth et al/., US2015/0267 195, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade no presente documento.
[0307] Determinadas — modalidades fornecidas no presente documento são direcionadas a compostos oligoméricos modificados úteis para inibir a expressão do ácido nucleico alvo, que podem ser úteis para tratar, prevenir, melhorar ou retardar a progressão de uma doença associada a tal ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos oligoméricos modificados compreendem oligonucleotídeos antissenso que são gapmers com motivos de açúcar específicos. Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar gapmer fornecidos no presente documento podem ser combinados com qualquer sequência de nucleobase e qualquer motivo de ligação internucleosídica para formar oligonucleotídeos antissenso potentes.
[0308] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: ekk-d9-kkee, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'kK' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0309] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: k-d9-kekeke, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'kK' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0310] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kkk-d8-kekek, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'k' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0311] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kkk-d9-keke, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'k' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0312] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kKk-d9-kdkdk, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'k' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0313] Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kk-d9-eeekk, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'kK' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kk-d9-eeekk, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'kK' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2'- MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito.
[0314] Em determinadas modalidades, um método compreende o contato de uma célula ou a administração a um sujeito de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo o motivo: kKk-d9-ekeke, em que 'd' representa um açúcar 2'-desoxirribose, 'kK' representa um nucleosídeo cEt, e 'e' representa um nucleosídeo 2-MOE. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula cancerígena. Em determinadas modalidades, o sujeito tem câncer. Em determinadas modalidades, a administração do composto ao sujeito trata o câncer do sujeito. b. Motivos de Nucleobases Específicos
[0315] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos. Em determi- nadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem nucleobases modificadas e/ou não modificadas dispostas ao longo do oligonucle- otídeo ou região do mesmo em um padrão ou motivo definido. Em determinadas modalidades, cada nucleobase é modificada. Em determinadas modalidades, nenhuma das nucleobases é modificada. Em determinadas modalidades, cada purina ou cada pirimidina é modificada. Em determinadas modalidades, cada adenina é modificada.
Em determinadas modalidades, cada guanina é modificada. Em determinadas modalidades, cada timina é modificada. Em determinadas modalidades, cada uracila é modificada. Em determinadas modali- dades, cada citosina é modificada. Em determinadas modalidades, algumas das ou todas as nucleobases de citosina em um oligonucle- otídeo modificado são 5-metilcitosinas.
[0316] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem um bloco de nucleobases modificadas. Em determinadas dessas modalidades, o bloco está na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, o bloco está dentro de 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determi- nadas modalidades, o bloco está na extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, o bloco está dentro de 3 nucleosídeos da extremidade 5' do oligonucleotídeo.
[0317] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que têm um motivo gapmer compreendem um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada. Em determinadas dessas modalidades, um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada está na lacuna central de um oligonucleotídeo que tem um motivo gapmer. Em determinadas dessas modalidades, a fração de açúcar do referido nucleosídeo é uma fração de 2'-desoxirribosila. Em determinadas modalidades, a nucleobase modificada é selecionada de: uma 2- tiopirimidina e uma 5-propinopirimidina. C. Motivos de Ligações Internucleosídicas Específicos
[0318] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos. Em determi- nadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem ligações internucleosídicas modificadas e/ou não modificadas dispostas ao longo do oligonucleotídeo ou região do mesmo em um padrão ou motivo definido. Em determinadas modalidades, essencialmente cada grupo de ligações internucleosídicas é uma ligação internucleosídica de fosfato (P=O). Em determinadas modalidades, cada grupo de ligações internucleosídicas de um oligonucleotídeo modificado é um fosforotioato (P=S). Em determinadas modalidades, cada grupo de ligações internucleosídicas de um oligonucleotídeo modificado é independen- temente selecionado de uma ligação internucleosídica de fosforotioato e de fosfato. Em determinadas modalidades, o motivo de açúcar de um oligonucleotídeo modificado é um gapmer e as ligações internucleo- sídicas dentro da lacuna estão todas modificadas. Em determinadas dessas modalidades, algumas das, ou todas as, ligações internucleo- Ssídicas nas asas são ligações de fosfato não modificadas. Em determinadas modalidades, as ligações internucleosídicas terminais estão modificadas.
4. Oligonucleotídeos Modificados Específicos
[0319] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente documento compreendem oligonucleotídeos modificados. Em determinadas — modalidades, as modificações acima (açúcar, nucleobase, ligação internucleosídica) são incorporadas em um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados são caracterizados pela sua modificação, motivos e comprimentos totais. Em determinadas modalidades, tais parâmetros são, cada um, independentes uns dos outros. Assim, a não ser que de outro modo indicado, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo que tem um motivo de açúcar gapmer pode ser modificada ou não modificada e pode ou não seguir o padrão de modificação de gapmer das modificações de açúcar. Por exemplo, as ligações internucleosídicas dentro das regiões de asa de um gapmer de açúcar podem ser iguais ou diferentes umas das outras e podem ser iguais ou diferentes das ligações internucleosídicas da região de lacuna do motivo de açúcar. Do mesmo modo, tais oligonucleotídeos de gapmer podem compreender uma ou mais nucleobases modificadas independentemente do padrão de gapmer das modificações de açúcar.
Além disso, em determinados casos, um oligonucleotídeo é descrito por um comprimento global ou intervalo e por comprimentos ou faixas de comprimentos de duas ou mais regiões (por exemplo, uma região de nucleosídeos tendo modificações de açúcar especificadas), em tais circunstâncias pode ser possível selecionar números para cada faixa que resultem em um oligonucleotídeo tendo um comprimento global fora da faixa especificada.
Em tais circunstâncias, ambos os elementos têm de ser satisfeitos.
Por exemplo, em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo modificado consiste em 15 a 20 nucleosídeos ligados e tem um motivo de açúcar consistindo em três regiões, A, B e C, em que a região A consiste em 2 a 6 nucleosídeos ligados tendo um motivo de açúcar especificado, a região B consiste em 6 a 10 nucleosídeos ligados tendo um motivo de açúcar especificado e a região C consiste em 2 a 6 nucleosídeos ligados tendo um motivo de açúcar especificado.
Tais modalidades não incluem oligonucleotídeos modificados onde cada uma de A e C consiste em 6 nucleosídeos ligados e B consiste em nucleosídeos ligados (embora esses números de nucleosídeos sejam permitidos nos requisitos para A, B e C) porque o comprimento global de tal oligonucleotídeo é 22, o que excede o limite superior do comprimento global do oligonucleotídeo modificado (20). No presente documento, se uma descrição de um oligonucleotídeo for silenciosa no que diz respeito a um ou mais parâmetros, tal parâmetro não está limitado.
Assim, um oligonucleotídeo modificado descrito somente como tendo um motivo de açúcar gapmer sem descrição adicional, pode ter qualquer comprimento, motivo de ligação internucleosídica e motivo de nucleobase.
A não ser que de outro modo indicado, todas as modificações são independentes da sequência de nucleobases.
Determinados Compostos Conjugados
[0320] Em determinadas modalidades, os compostos descritos no presente — documento — compreendem ou consistim em um oligonucleotídeo (modificado ou não modificado) e opcionalmente um ou mais grupos conjugados e/ou grupos terminais. Os grupos conjugados consistem em uma ou mais frações conjugadas e um ligante de conjugado que liga a fração conjugada ao oligonucleotídeo. Os grupos conjugados podem estar anexados a uma das, ou ambas as, extremidades de um oligonucleotídeo e/ou em qualquer posição interna. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados estão ligados à posição 2' de um nucleosídeo de um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados que estão ligados a qualquer uma das, ou ambas as, extremidades de um oligonucleotídeo são grupos terminais. Em determinadas dessas modalidades, os grupos conjugados ou grupos terminais estão ligados na extremidade 3' e/ou 5' de oligonucleotídeos. Em determinadas dessas modalidades, os grupos conjugados (ou grupos terminais) estão ligados na extremidade 3' de oligonucleotídeos. Em determinadas modalidades, os grupos conjuga- dos estão ligados próximo à extremidade 3' de oligonucleotídeos. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados (ou grupos terminais) estão ligados na extremidade 5' de oligonucleotídeos. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados estão ligados próximo à extremidade 5' de oligonucleotídeos.
[0321] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é modificado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo de um composto tem uma sequência de nucleobases que é complementar a um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os oligonucle- otídeos são complementares a um RNA mensageiro (MRNA). Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos são complementares a um transcrito senso.
[0322] Exemplos de grupos terminais incluem, mas não estão limitados a, grupos conjugados, grupos de capeamento, frações de fosfato, grupos protetores, nucleosídeos modificados ou não modificados e dois ou mais nucleosídeos que estão independentemente modificados ou não modificados. A. Determinados Grupos Conjugados
[0323] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos estão covalentemente ligados a um ou mais grupos conjugados. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados modificam uma ou mais propriedades do oligonucleotídeo ligado, incluindo, mas não se limitando a, farmacodinâmica, farmacocinética, estabilidade, ligação, absorção, distribuição em tecidos, distribuição celular, captação celular, carga e eliminação. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados fornecem uma nova propriedade ao oligonucleotídeo ligado, por exemplo, fluoróforos ou grupos repórter que permitem detecção do oligonucleotídeo.
[0324] Determinados grupos conjugados e frações conjugadas foram descritos previamente, por exemplo: fração de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, p.ex., resíduos de do-decan-diol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et a/l., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolipídeo, p.ex., di- hexadecil-rac-glicerol! ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651- 3654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al.
Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ou ácido adamantanoacético, uma fração de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), -uma fração de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, i, 923-937), um grupo tocoferol (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; doi:10.1038/mtna.2014.72 e Nishina et al, Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740) ou um agrupamento de GalNAc (por exemplo, WO2014/179620).
1. Frações Conjugadas
[0325] As frações conjugadas incluem, sem limitação, intercalantes, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, peptídeos, carboidratos (por exemplo, GalNac), frações de vitamina, polietilenoglicois, tiovéteres, poliéteres, colesteróis, tiocolesteróis, frações de ácido cólico, folato, lipídeos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas, fluoróforos e corantes.
[0326] Em determinadas modalidades, uma fração conjugada compreende uma substância de fármaco ativa, por exemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fen-bufeno, cetopro- feno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-tri- iodobenzoico, fingolimode, ácido flufenâmico, ácido folínico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indo-meticina, um barbiturato, uma cefalosporina, um fármaco de sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico.
2. Ligantes conjugados
[0327] As frações conjugadas estão anexadas a oligonucleotídeos através de ligantes conjugados. Em determinados compostos, um grupo conjugado é uma ligação química simples (isto é, a fração conjugada está ligada a um oligonucleotídeo através de um ligante de conjugado através de uma ligação simples). Em determinadas modalidades, o ligante de conjugado compreende uma estrutura em cadeia, tal como uma cadeia de hidrocarbila ou um oligômero de unidades repetidas tais como unidades de etilenoglicol, nucleosídeos ou aminoácidos.
[0328] Em determinadas modalidades, um ligante de conjugado compreende um ou mais grupos selecionados de alquila, amino, oxo, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, ticoéter e hidroxilamino. Em determinadas dessas modalidades, o ligante de conjugado compreende grupos selecionados de grupos alquila, amino, oxo, amida e éter. Em determinadas modalidades, o ligante de conjugado compreende grupos selecionados de grupos alquila e amida. Em determinadas modali- dades, o ligante de conjugado compreende grupos selecionados de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o ligante de conjugado compreende pelo menos uma fração de fósforo. Em determinadas modalidades, o ligante de conjugado compreende pelo menos um grupo fosfato. Em determinadas modalidades, o ligante de conjugado inclui pelo menos um grupo de ligação neutro.
[0329] Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados, incluindo os ligantes de conjugados descritos acima, são frações de ligação bifuncionais, por exemplo, aquelas que são conhecidas na técnica como sendo úteis para ligar grupos conjugados a compostos progenitores, tais como os oligonucleotídeos fornecidos no presente documento. Em geral, a fração de ligação bifuncional compreende pelo menos dois grupos funcionais. Um dos grupos funcionais é selecionado para se ligar a um local particular em um composto e o outro é selecionado para se ligar a um grupo conjugado. Exemplos de grupos funcionais usados em uma fração de ligação bifuncional incluem, mas não estão limitados a, eletrófilos para reação com grupos nucleofílicos e nucleófilos para reação com grupos eletrofílicos. Em determinadas modalidades, as frações de ligação bifuncionais compreendem um ou mais grupos selecionados de amino, hidroxila, ácido carboxílico, tiol,
alquila, alquenila e alquinila.
[0330] Exemplos de ligantes de conjugados incluem, mas não estão limitados a, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC) e ácido 6-amino-hexanoico (AHEX ou AHA). Outros ligantes de conjugados incluem, mas não estão limitados a, alguila C1-Cio substituída ou não substituída, alquenila C2-C1o substituída ou não substituída ou alquinila C2-C10 substituída ou não substituída, em que uma lista não limitante de grupos substituintes preferenciais inclui hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxi, halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila.
[0331] Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados compreendem 1 a 10 nucleosídeos ligantes. Em determinadas modalidades, tais nucleosídeos ligantes são nucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, tais nucleosídeos ligantes compreendem uma fração de açúcar modificado. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos ligantes não estão modificados. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos ligantes compreendem uma base heterocíclica opcionalmente protegida selecionada de uma purina, purina substituída, pirimidina ou pirimidina substituída. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é um nucleosídeo selecionado de uracila, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5- metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina e 2-N-isobutirilguanina. É tipicamente desejável que os nucleosídeos ligantes sejam clivados do composto após este alcançar um tecido alvo. Comomente, os nucleosídeos ligantes estão tipicamente ligados uns ao outros e ao resto do composto através de ligações cliváveis. Em determinadas modalidades, tais ligações cliváveis são ligações de fosfodiéster.
[0332] No presente documento, os nucleosídeos ligantes não são considerados como sendo parte do oligonucleotídeo. Comomente, em modalidades nas quais um composto compreende um oligonucleotídeo consistindo em um número especificado ou gama de nucleosídeos ligados e/ou uma percentagem de complementaridade especificada com um ácido nucleico de referência e o composto compreende também um grupo conjugado compreendendo um ligante conjugado compreendendo nucleosídeos ligantes, esses nucleosídeos ligantes não são contados para o comprimento do oligonucleotídeo e não são usados na determinação da percentagem de complementaridade do oligonucleotídeo para o ácido nucleico de referência. Por exemplo, um composto pode compreender (1) um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8-30 nucleosídeos e (2) um grupo conjugado compreendendo 1-10 nucleosídeos ligantes que são contíguos aos nucleosídeos do oligonucleotídeo modificado. O número total de nucleosídeos contíguos ligados em um tal composto é maior do que 30. Alternativamente, um composto pode compreender um oligonucleotídeo modificado consistindo em 8 a 30 nucleosídeos e nenhum grupo conjugado. O número total de nucleosídeos contíguos ligados em um tal composto é não mais do que 30. A não ser que de outro modo indicado, os ligantes de conjugados compreendem não mais do que 10 nucleosídeos ligantes. Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados compreendem não mais do que 5 nucleosídeos ligantes. Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados compreendem não mais do que 3 nucleosídeos ligantes. Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados compreendem não mais do que 2 nucleosídeos ligantes. Em determinadas modalidades, os ligantes de conjugados compreendem não mais do que 1 nucleosídeo ligante.
[0333] Em determinadas modalidades é desejável que um grupo conjugado seja clivado do oligonucleotídeo. Por exemplo, em determinadas circunstâncias os compostos compreendendo uma fração conjugada particular são melhor absorvidos por um tipo de célula particular, mas, logo que o composto tenha sido absorvido, é desejável que o grupo conjugado seja clivado para liberar o oligonucleotídeo não conjugado ou progenitor. Assim, determinados conjugados podem compreender uma ou mais frações cliváveis, tipicamente dentro do ligante de conjugado. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é um grupo de átomos compreendendo pelo menos uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, uma fração clivável compreende um grupo de átomos tendo uma, duas, três, quatro ou mais do que quatro ligações cliváveis. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é seletivamente clivada dentro de uma célula ou compartimento subcelular, tal como um lisossomo. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é seletivamente clivada por enzimas endógenas, tais como nucleases.
[0334] Em determinadas modalidades, uma ligação clivável é selecionada de: uma amida, um éster, um éter, um dos ou ambos os ésteres de um fosfodiéster, um éster de fosfato, um carbamato ou um dissulfeto. Em determinadas modalidades, uma ligação clivável é um dos ou ambos os ésteres de um fosfodiéster. Em determinadas modalidades, uma fração clivável compreende um fosfato ou fosfodiéster. Em determinadas modalidades, a fração clivável é uma ligação de fosfato entre um oligonucleotídeo e uma fração conjugada ou grupo conjugado.
[0335] Em determinadas modalidades, uma fração clivável compreende ou consiste em um ou mais nucleosídeos ligantes. Em determinadas dessas modalidades, um ou mais nucleosídeos ligantes estão ligados uns ao outros e/ou ao resto do composto através de ligações cliváveisó. Em determinadas modalidades, tais ligações cliváveis são ligações de fosfodiéster não modificadas. Em determinadas — modalidades, uma fração clivável é um 2- desoxinucleosídeo que está ligado ao nucleosídeo 3' ou 5'-terminal de um oligonucleotídeo por uma ligação internucleosídica de fosfato e covalentemente ligado ao resto do ligante de conjugado ou fração conjugada por uma ligação de fosfato ou fosforotioato. Em determinadas dessas modalidades, a unidade clivável é 2'-desoxiadenosina. Composições e Métodos para Formulação de Composições Farmacêuticas
[0336] Os compostos descritos no presente documento podem ser misturados com substâncias ativas ou inertes farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de uma série de critérios, incluindo, mas não se limitando a, via de administração, extensão da doença ou dose a ser administrada.
[0337] Determinadas — modalidades — fornecem — composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos ou um sal dos mesmos. Em determinadas modalidades, os compostos são compostos antissenso ou compostos oligoméricos. Em determinadas modalidades, os compostos compreendem ou consistem em um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas dessas modalidades, a composição farmacêutica compreende um diluente ou transportador farmacêutica- mente aceitável adequado. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma solução salina estéril e um ou mais compostos. Em determinadas modalidades, tal composição farmacêutica consiste em uma solução salina estéril e um ou mais compostos. Em determinadas modalidades, a solução salina estéril é solução salina de grau farmacêutico. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais compostos e água estéri. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica consiste em um composto e água estéril. Em determinadas modalidades, a água estéril é água de grau farmacêutico. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais compostos e solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica consiste em um ou mais compostos e PBS estéril. Em determinadas modalidades, o PBS estéril é PBS de grau farmacêutico. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de uma série de critérios, incluindo, mas não se limitando a, via de administração, extensão da doença ou dose a ser administrada.
[0338] Um composto descrito no presente documento direcionado a ácido nucleico de FOXP3 pode ser utilizado em composições farmacêuticas por combinação do composto com um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável adequado. Em determina- das modalidades, um diluente farmaceuticamente aceitável é água, tal como água estéril adequada para injeção. Comomente, em uma modalidade, é empregue nos métodos descritos no presente documento uma composição farmacêutica compreendendo um composto direcio- nado a ácido nucleico de FOXP3 e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em determinadas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é água. Em determinadas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado fornecido no presente documento.
[0339] As composições farmacêuticas compreendendo compostos fornecidos no presente documento englobam quaisquer sais, ésteres ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro oligonucleotídeo que, após administração a um animal, incluindo um ser humano, é capaz de fornecer (diretamente ou indiretamente) o meta- bolito biologicamente ativo ou resíduo do mesmo. Em determinadas modalidades, os compostos são compostos antissenso ou compostos oligoméricos. Em determinadas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado. Comomente, por exemplo, a invenção é também dirigida a sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos, pró-fármacos, sais farmaceuticamente aceitá- veis de tais pró-fármacos e outros bioequivalentes. Sais farmacêutica- mente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, sais de sódio e potássio.
[0340] Um pró-fármaco pode incluir a incorporação de nucleosídeos adicionais em uma das ou ambas as extremidades de um composto que são clivadas por nucleases endógenas dentro do corpo, para formar o composto ativo.
[0341] Em determinadas modalidades, os compostos ou compo- sições compreendem adicionalmente um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
EXEMPLOS
[0342] Os Exemplos abaixo descrevem o processo de análise para identificar os compostos líderes direcionados a FOXP3. Dos mais de
3.000 oligonucleotídeos que foram rastreados, ION 1062428, 1062641, 1062835, 1062937, 1063268, 1063649, 1063655, 1063734, 1064096 ou 1064313 emergiram como os compostos líderes de topo. Invenção não limitante e incorporação por referência
[0343] Embora a listagem de sequências acompanhando este depósito identifique cada sequência como “RNA” ou “DNA” como requerido, na realidade, essas sequências podem ser modificadas com qualquer combinação de modificações químicas. Um perito na técnica irá prontamente apreciar que designações como “RNA” ou “DNA” para descrever oligonucleotídeos modificados são, em casos específicos, arbitrárias. Por exemplo, um oligonucleotídeo compreendendo um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar de 2-OH e uma base de timina poderia ser descrito como um DNA tendo um açúcar modificado (2-OH pelo 2'-H natural de DNA) ou como um RNA tendo uma base modificada (timina (uracila metilada) pela uracila natural de RNA).
[0344] Comomente, as sequências de ácidos nucleicos proporcio- nadas no presente documento, incluindo aquelas, mas não se limitando àquelas, na listagem de sequências, se destinam a englobar ácidos nucleicos contendo qualquer combinação de RNA e/ou DNA natural ou modificado, incluindo, mas não se limitando a, ácidos nucleicos tendo nucleobases modificadas. A título de exemplo adicional e sem limitação, um oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleobases “ATCGATCG” engloba quaisquer oligonucleotídeos tendo tal sequência de nucleobases, modificada ou não modificada, incluindo, mas não se limitando a, tais compostos compreendendo bases de RNA, tais como aqueles tendo a sequência “AUCGAUCG'” e aqueles tendo algumas bases de DNA e algumas bases de RNA tais como “AUCGATCG” e compostos tendo outras nucleobases modificadas, tais como “AT”CGAUCG”, em que "C indica uma base citosina compreendendo um grupo metila na posição 5.
[0345] Embora determinados compostos, composições e métodos descritos no presente documento tenham sido descritos com especificidade de acordo com determinadas modalidades, os exemplos que se seguem servem somente para ilustrar os compostos descritos no presente documento e não se destinam a limitar os mesmos. Cada uma das referências recitadas no presente pedido é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. Exemplo 1: Inibição antissenso de Foxp3 humano em células LNCaP por gapmers de cEt
[0346] Oligonucleotídeos modificados foram desenhados direcio- nados a um ácido nucleico de Foxp3 e foram testados quanto aos seus efeitos ao nível do mMRNA de Foxp3 in vitro. Os oligonucleotídeos modificados foram testados em uma série de experiências que tinham condições de cultura similares. Os resultados para cada experiência são apresentados em tabelas separadas mostradas em baixo. Células LNCAaP cultivadas a uma densidade de 30.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com oligonucleotídeo modificado a
3.000 mM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de MRNA de Foxp3 foram medidos por RT-PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sonda e iniciadores humanos RTS35925 (sequência direta CTACTTCAAGTTCCACAACATGC, designada no presente documento como SEQ ID NO: 6; sequência reversa CCAGTGGTAGATCTCATTGAGTG; designada no presente documento como SEQ ID NO.: 7; sequência de sonda CCTTTCACCTACGCCACGCTCAT, designada no presente documento como SEQ ID NO.: 8) foi usado para medir os níveis de MRNA. Os níveis de mRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mMRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). Os oligonucleotídeos modificados com valores percentuais de controle marcados com um asterisco (*) têm como alvo a região do amplicon do conjunto do iniciador sonda. Ensaios adicionais podem ser usados para medir a potência e eficácia dos oligonucleotídeos modificados direcionados à região do amplicon.
[0347] Os oligonucleotídeos modificados recém-desenhados nas Tabelas abaixo foram designados como gapmers com cEt 3-10-3. Os gapmers têm 16 nucleosídeos de comprimento, em que o segmento de lacuna central compreende dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa na direção 5' e na direção 3' compreendendo três nucleosídeos cada. Cada nucleosídeo no segmento de asa 5' e cada nucleosídeo no segmento de asa 3' tem uma modificação de açúcar de cEt. As ligações internucleosídicas ao longo de cada gapmer são ligações de fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada gapmer são 5-metilcitosinas.
[0348] “Local de início” indica o nucleosídeo mais 5' ao qual o gapmer é direcionado na sequência gênica humana. “Local de paragem” indica o nucleosídeo mais 3' ao qual o gapmer é direcionado na sequência gênica humana. Cada gapmer mencionado nas Tabelas abaixo é direcionado a SEQ ID NO.: 1 (No. de Acesso GENBANK NM 014009.3), ou SEQ ID NO: 2 (o complemento do No. de Acesso GENBANK NT 011568.12 truncado a partir dos nucleotídeos 11907130 a 11921808), ou SEQ ID No: 3 (No. de Acesso GENBANK NM 001114377.1), ou SEQ ID No.: 4 (o complemento do No. de acesso GENBANK NC 000023.11 truncado dos nucleotídeos 49247001 a 49273000), ou SEQ ID No. 5 (No. de acesso UCSC UCO64ZFP.1 correspondente às coordenadas genômicas chrX: 49.251.334-
49.259.240 na montagem GRCh38/hg38). “N/A” indica que o oligonucleotídeo modificado não visa a sequência de gene particular com 100% de complementaridade. “N.D.” indica que a %UTC não está definida para esse oligonucleotídeo modificado particular nessa experiência particular. A atividade desse oligonucleotídeo modificado pode ser definida em uma experiência diferente. Tabela 1 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 [Es SETE eo e meo fa | o | e | Om ” [FT e Ds [Os | meme | 9 FEET De [e [mess | Te FETO Ds [e | Greve | ET
Pos o emo | es comes | | os es e ee reeimeete [So oa a o | | ommenececs | So se e o O orem | Po e e | se | reomemeates | | >» | eo | as o [ss | remecenaerer | o as ao as caem | o a o se o emovecaTeme | o a e e cwoorremen | o a o a ae omnes | 3 | = | o a a e a | remete | | Pe o e o eae | 9 | = |
[FT O Dm [O | ememene | 7 | | oe ss [o | semen | 9 | = | Fes Os Dm [6 | semen | 5 | = Es O [se [O | emas | 5 | | [Es O [O [Os | saem | 5 | | [Es e O Ds [O | meme | 9 | e | [Espe O Ds [Om | ommmens | 7 | | [Eros O [O [O | mm | E | [FS TR O [ms [mo | comme | E | | [FS TR O [es [mo | emenmes | 5 | = | [Fo O [O [o | cem | E | | [FE Ts O [Om [mo | cswmenme | E | = | [FETO Ds [es | smormeso | "= Tabela 2
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Composto | Tiocalde | tocalde Locaide | LocaldePara- | Sequência(s paras) | FoXPACÁUTO) início | Paragem Início gom o amv o e rss o a au EE e e Dm Ds e e = CET e e De eee = =
EE E e e EEE EA Ee e e e EE
910974 GCCCAGCCGTGCCCC Ps | = | + |» | — | 2 Ee e e q e TE EE E e E rs EE E e e Tr Ee a E As TA
911005 NA NA GCCCAGCGGATGAGC | = = |*»|» |ES Er e e A Es Eos E e A ss EEE De E Es EEE e E Es Er E oe e TA Er e e e TA E e e TEA Er e e a EA Ep e e ss Fo e o Ts Fo E E Es Fc o es
EEE E e EEE E E o a e e | ARA ar a Ep e e e E e EE e e e es e Tabela 3 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Númerodo | seqioNOt | oro | seanNo2 | SST Sequência (5 para 5) roxo
Composto | Localdeinício | panam | Localdelnício qem ) o a ess o a rsss a a se av e EE ee [e e Es EE es Es E E CET e e De Deseest | = |
Er E TE e EEE EA Free e e ss EE E E e Es EEE EF e a e EEE EFE e E e EEE E EE e E e Es E
EEE E E E EE EA EFE E e ss EA EE e e o oe E EEE e E e EEE Ee De e e e = EFE e E e EA Fire e A A EE Eros e A e E Fr e E E TEA Er e e e EA Er e e e EEE EA FE e E E EEE EE FR e e e rs A
[Gp e e Ss EEE Ee e e O [Es e E es ae is ea vv O is asas o e ar Tabela 4
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 seaD Composto | Locade | LosaldePam | Localde | tocadePaa | Sequência( paras) | FoXPAÇLUTO) eo gom Início gom EEE e eos EEE E EEE e e = EEE EE EE e es eos EEE o a e e a O a a as ass x av EE e e e Tess E EE e eos FE Ee
EEE TE TE TES EE Ep e De [e eee E e e EA Er e e A EEE Fo e e A EEE Ee a Es ss EA Er A e e E Fr e e e EEE Fr e e A Te Ep a e TR ms Ee e e e Te Ee e Des e es Ee e es e ss Fo A Ds De
Tabela 5 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
ESEEIE EEN Composto | Trocaide | tocalde Locaide | LocaldePara Sequência (5 para 3) vo) início | Paragem Início gom FT OR Os [Om | even | E [EST [Os [O [Os | ommseno | S T [EST O [Om [Om | recem | Ss [ES O [Om [ee [or | mewenem | [FS] [Om [e [am | omoemeemo | E [FE TO [Om [e [e | meme | 5 5 [FT [O [O [O | romena | E [FETO [O [O [mo | mecmenes | 55 [FOR [O [Om [Om | mano | E 55 [FTD O Tm [6 | ameno | E
[o a DA Das | ao | comomment | % | os a a A rm | re | AmTeAGTetTA | | x | o a A e | o | cosscementoenca | % | 3 | e a A so | sos | cressaceeereor | | xo | Ps a A ss | o | erereemecaeca | [x | Ps a A ss | mo | AceomAeTeGOs | | x | e a A e | | concerne | 7 | x | Ps a A eo | | cometas | Se o a A e | ee | crocaomeccee | o [xe | o a A rs | so | AoMeccaato | | a | PO A [e e | ereememecnt | % | 3 | e a A a | ns | comeco | | e | o a A aa | eo | AcsoTcBeTemees | | x | Ps a A e | ne | remwenwecsaor | 0% | 3 |
[FT TR [o [es [see [E [| Tabela 6
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
| ms [PP ER Cr Em | eo | o eo
Composto | Treeside | Locardo Localde =| LocaldePara- | — Sequência(s para3) vo início | Paragem Início gom se Rs O see | ss | = e se e e] esse | | [e e es | e | eee | | = ss e | | eee |) DE E ss ss = ss as | a | mens | e | = ss e a ame | x = ss e as | [asse | mr | = es e e ones | a | = soe e ss | eee | ss | =) Es E ss eee ss ss | | eme | o | = ss a | a | messes | e | ss e e | ossos | = ss ss | | aeee | | Es e e O [eee | ss | e O | e | osso | | Es e e O ame | | ss o O ss | a | os | = = Ds E ss ee | e ps rr E ss ss =) es e e | e | ossman | ss | es e e | es | some | mm | = ss a O es | e | oem | | = se O e | | assess | 7 | = Tabela 7
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
ESEES EA Rss E e Ep es a Es EE EE e e ss EA EEE E e E Es EE EE e oe oe ss EE EE E e e E EE e E E EEE EA
EE E E E EE EE EE E e E EE e e E E EE e e o E e
EE E E E EE EA Ep e e Es E EA EE e e o E EE EE e E E EE EA Ep e e e E E E e e E EEE EE Po Ds e e A o sv e o E a uv O o vn O o ru o a ee eg | room mm o e as a a o a am Ea o e ss e a ms gg AoA ss pe e [e De es [e vv o vs ss Tabela 8
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 e EE EE ES EE] es | o Voo
Composto | Tlocide | tocarde Localde =| LocaldePara | — Sequência(s para3) vm Início | Paragem Início gom e es e e es | 6 |
FE E EE E Es E = FE E E E se = ps E e e e ses] e =) [ps E e e e es | ss | e ps TE E E e es | e |) se e e e see | e | ps E e e e eee | | [ps E e | | e | messes | e | [ss e [a | | ame | e | [ps A O [os | e aeasar | a ps E e E see | e [ss E e q | esse | e | [ss e [a | oe | e |
Es e E O eee | so) e e ss eme | ss e) Es e e ss esses | 7 | = ss e O | esses | | = es e e | [omeses | = | [Es e e e | [esses | x | Es e e e e esses | o [Es es e e | | some | | Es e e e] | see | cs Es e e e es ass | = | = sp e Ss ese | eo) Exemplo 2: Inibição antissenso de Foxp3 humano em células SUP- M?2 por gapmers de cEt
[0349] Oligonucleotídeos modificados — foram desenhados direcionados a um ácido nucleico de Foxp3 e foram testados quanto aos seus efeitos ao nível do MRNA de Foxp3 in vitro. Os oligonucleotídeos modificados foram testados em uma série de experiências que tinham condições de cultura similares. Os resultados para cada experiência são apresentados em tabelas separadas mostradas em baixo. Células SUP- M?2 cultivadas a uma densidade de 60.000 células por poço foram tratadas usando absorção livre com oligonucleotídeo modificado a 3.000 nM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o
RNA foi isolado das células e os níveis de mMRNA de Foxp3 foram medidos por RT-PCR quantitativa em tempo real. O conjunto de sondas iniciadoras humanas RTS35925 foi usado para medir os níveis de MRNA. Os níveis de MRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mMRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). Os oligonucleotídeos modificados com valores percentuais de controle marcados com um asterisco (*) têm como alvo a região do amplicon do conjunto do iniciador sonda. Ensaios adicionais podem ser usados para medir a potência e eficácia dos oligonucleotídeos modificados direcionados à região do amplicon.
[0350] Os oligonucleotídeos modificados recém-desenhados nas Tabelas abaixo foram designados como gapmers com cEt 3-10-3. Os gapmers têm 16 nucleosídeos de comprimento, em que o segmento de lacuna central compreende dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa na direção 5' e na direção 3' compreendendo três nucleosídeos cada. Cada nucleosídeo no segmento de asa 5' e cada nucleosídeo no segmento de asa 3' tem uma modificação de açúcar de cEt. As ligações internucleosídicas ao longo de cada gapmer são ligações de fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citosina ao longo de cada gapmer são 5-metilcitosinas. “Local de início” indica o nucleosídeo mais 5' ao qual o gapmer é direcionado na sequência gênica humana. “Local de paragem” indica o nucleosídeo mais 3' ao qual o gapmer é direcionado na sequência gênica humana. Cada gapmer mencionado nas Tabelas abaixo é direcionado a SEQ ID NO.: 1 ou SEQ ID NO:: 2. “N/A indica que o oligonucleotídeo modificado não visa a sequência de gene particular com 100% de complementaridade. “N.D.”” indica que a %UTC não está definida para esse oligonucleotídeo modificado específico nessa experiência específica. A atividade desse oligonucleotídeo modificado pode ser definida em uma experiência diferente.
Tabela 9 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 sEGD
Númerodo | nos | SEQIDNO:1 | seamNo2 | seQIDNO:2
| | 2 | RR [EE ER | mes Les o eo gom Início gom Es ss Fr Fr qse ss = sr Ss O see ss =) ss | e | e [seems | = e Os e | Os [ssessese | ss = es e ss | (assess | ss = se e O esses] = | = ss e rs O [esssse | = e e e e e (ese | = ps e Rr e = se] =) ps e Rr e | = [eee] ss | ps e Rr qe e eee e | = [ps e O q | e eee | = ps e Or qe | e eee ss | ps e Rr qe | see ss = [ss e q | e eme | | ps A E TE ese E = ss e O [e | e esse | | e [ps e Rr qe | [ese | | = ps e Rr qe | ess | o | ss e Rr qe ss (eee o |
Tabela 10 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
EGÂOOGESESSENES Composto | Tiocaide | tocarde Localde =| LocaldePara- | — Sequência(s para3) “vo Início | Paragem Início gom EE e e e EE E Ee e e e Es e Ee e e DO ee e Ee De es De me e e [Ee De [e De Dome e [Ee e e De Dee ee o e a a av [Ee e e Ds meme e [Ee e e A Es e [Ee e [e De e e [Ee e e e mesm e o sn E se sn o E ses vv o sa aa vs o as av Ee e [e e ee cs e Ee e e Ds aee E [Ee e e Ds e so o tvi is sv o E sv sv a is vv e De [e Ds mem e ED De e e Dmemen s Tabela 11
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Em E E ams EE) eee | ee EE e e e ee EE e E EE EA EE e e A og A EE E e e A EE e E e es e EEE e e e e EE e e A es EE e Te e To E EE e Te Ts oe E
[Ee e es De [ESSE vv soe a [e De oe e = oe a [e De oe e so o ri e sv Tabela 12
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Composto | Tlocide | tocarde Locaide | LocaldePara- | Sequência(s paras) | FOXP3(UTC) Início | Paragem Início gom
FEEL E E EEE [Ee De e ee EEE e e A E EEE e oe e TE Es o e e e E EE o e e es EE a e A e EE a e O De EE a e E e E EE a e Te o vv o E a au e o a ev O [Ee e e e es e e Ee e [e Ds Some e e o as e Tabela 13 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
EGEOOGFEIRZNIENS Composto | Todo | Locatdo Locade | LocaldePara Sequência (5 para 3) vo início | Paragem Início gom o pes asus O vv o sv e o aa ae sv a a a
Ee e e ee EA EE e e e EEE E De e e e EE a e A e EE a e e e EE a e ER e EE a Ds E EE EE a Ds oe om EE EE a Ds e e E EE a De Te e EE a e e EE EE a Ds EE De Te EE o an o e es O o ru pe e [e e Des e pe e [e ow [eme e Ee e [e e Does ee ee e [e | es Dress ee Tabela 14
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
[E | e [E [so | mero |
Composto | Tocide | LocldePars | tocado | vocarcePar Sequência(5 para 3) vm Início gom Início gom ss e O e e oe | = | Fo E e e eee | = | = se O esessesas | = | ss e | esses | = | = ss e e me | esse | = | = e ss e O | seems | = | 7
[FA [A E a ares ee) FL [a E esa a = FE E E E ese [e [E A A e ease [e e [E e E E eee | e | [E e E e | reseee | e s| [Es E e e e | semes | e | FA E E oa [Es E a e e eme | e | ss e e e e | sem | e | = Tabela 15 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 sEGD Númerodo | nos | SEQINO:1 | seamNo:2 | seQIDNO:2 roxPar,
ESPIRSES ES ERA CN ou gom Início gom rs o aa e es o o vv e [Ee Os [e De Dos e
EE e e E o EA EE e e E e E EE e Te Te e EE a Ts e De EE e e A EA EE e e e Ts E EEE e e e e Ee [Ep e De e Doe E EE e o Rs e EE e e TR EE a Te To e EE e e e EE EE e De Te e
[Ee e e e [Es E asus O sai Tabela 16
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
| EE | e James | EEE | mes 1 oe |
Composto | TEocde | LocaldePaa | on o | LocsldePara- Sequência (5 para 3) vo Início gom gom Ee e es Ee Ee e e oe e o es o
FE a DD E FE a Tee Ds o E a De o eee EE e ee os es EE e DD es A EE a DD e EE a Ds Ds e e EE a Ds Ds se EE a Ds o E a DD o EEE e De De e Po a De Do e
Ep e De e ess se av am Tabela 17
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQID NO:1 SEQIDNO:2 SEQID NO:2 FOXP3(% | | mm (EE mma | SE | memo [7 ee Paragem gem se E es Os rsss] «| = E ss e esses] | = Es e e O e ses] = | = ss ss e Os [aeee | mm | = ss e | e esses] | ss a e ss [ossos | 5 | = ss se e Tv e eee] ss | ss e = ss] [eee] = | Ds = ss ess] = Ds = Ss s es] e =) Fe se O [ame] ss | = ss e ss as ese | = | = ss e es e see | = | = Fr e e ss eee] = | =
RE E se a so) FA A Es means As] FA [As ss assess E FA IT a pe rs] FE E E E ee e | [Es E e O ese nr e) E E e eres e e FA Es eee a e) FA TE A aaa E e] [A E e eme a e | [ss E e e [ese a e | [E ER e e meses | a |
Tabela 18 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 | ms Jam | rt | amem | | rs | [oo Composto Local de Início | PSA de Para | oa deiníçio | EOSAl de Para- Sequência (5' para 3) (%UTC)
gom gom Ee e e e E e Ls e e O EEE E LE E e e Es EE Ee e e e es E e o a | ame | us | OSSOS Se | as e vv rs Eos e e e sea Ee Es e e e os E = Eos e e O E Ee ns a e ag | OSSOS | Se | a an Rs rev e a e e e E E e Eos e e e as E e a e e e eme e e tv ms ss em srt rm Ea e 6 | es E e Tabela 19
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 EEE EE hash ha Coments | Trocide | tocldePara | tocado | Locadora | sequências paras) vo) Início gom Início gom o e rs vv O os O sv x | E e sv a | ss E e vv o a a av av e | is sv e | o is e | [Ee e E e E [Ee e e De es E [Ee e e Te Tom E Ps es | a | meme | me
Ee e De we | mesm Ee o sv e o au ss o ss ss pe e De e oe [e e Ee e De es oe e e run rs Tabela 20 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 [ms [a [E [| Eis | meia [17 e Composto | tocado mito | Poco Para | nação | LocsldePars | Sequência(s paras) vo gem gem
FETO TO Ts Tm qe rs
EEE IE E TE EEE EE e o es EA Es e e e EE A EE e e EE AA EE e e e e EA EE e E e Es EA EEE e E e Ts EA EE e E e E EA EE e E Os esses E A Ee e De Ds e E e EE e as es e E EE e e A E E EE a es o EE A EEE e E es EEE A
Ee e e es E o ev e o sv o uv a o uu a Ee e [Om es e e Ee os e | me ses e o sas Tabela 21
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQIDNO:1 SEQIDNO:2 SEQID NO: 2 Local FOXP3 | e | amora | Seta [ams RSS] some [12 [o o a as o ns e
EE e E E rsss EA EE e Es e es EA E e es e Tre EA EE e es Ts eee EE e E srs EA
Ee De [e mem Te e a | | eroomemet | | e | Tabela 22 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 Número | SEQIDNO:1 | SEQIDNOT SEQIDNO;2
EEEF EFE ER Composto Início gom Local de Início gom (%UTC) o a a a as Si vv a a pe e e e EEE Ie Ee ee e E Ee E e e e em e e Fls De De | e ee | e |
E O E se E A E E Es EA E O ss ss EA Ee e Os e eme EE a e os EA
EE A E E EA
Tabela 23
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 a | Es [1 [Em] mens | ee do Locaide | LocaldePara- | Localde | vLocaldePara Sequência (5 para 3). vo) Composto | | início gom Início gom o a ss vv Eee Ee e ese E Eee De e Es Ee Eee De EE e Ee Dm e | ee [e e e e e | | STE Sm O a uv rs E vv e O vv a LA a o e | | mm Se
Ee De De Te Te Ee E De o Ds es e EE e e os Toe EA EE e e Te o EA EE e e De es Ee EE e ee Des oe ee
O uns sr E asas ve a esa e o a o e | | Tt | Sm a | Tabela 24
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQID NO:1 SEQIDNO:2 SEQID NO:2 FOXP3 ESESESES ES Es Eh gom gom o a a sa o av a o a avi a o as a o a Bv e o a as a Ee e e O Es Te Ee Os e e mes e Ee e e e es e Ee e e E Ee
EE o Es es EA EE e Es EE EA E o e e EE EE o e e e EA EE o e = EE e e EE EA EE e es ss EA Fo o e pe =
CC asas e Tabela 25
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número | SEQIDNO:1 | SEQIDNO:T | SEQIDNO:2 | SEQIDNO:Z [| sm a [ese | oe E Composto | | início gom Início gom o a ss a O sr o sv as O a ss vv ss | a av o e O a vu ss | Ee De De e eme ee Ee De De e eme e Eee De e | as E sp o | o SEE e | E av e [Ada o | ae | a | namo | e |
E De Ds o E EE De e De Ee e e De e e EE e e De e e] EE e Dee De ess e ET e es Dee TE e
Tabela 26
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 mm e jm os em eee o
Coments | Trocade | LocaldePaa | tocaide | tocarcerara Sequência (5 para 3) vo Início gom Início gom [Ee De [e e mm E e o mo a e | O a su e ii ra es ee o ms ee ea eia es Ee Ds e e Es Ee Ee e [e e | o ee Ep e e O es E) Ee e e e ae ee) Ee e e O mes ee) ss e | an e rn es | vv es [mm das | rs [ao | mo [me | tn es pe e e O | me ee) Ee e e O ss ee Ee e e e As e) Ee e e e me ee) ss vv e av es Tabela 27 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
EEE EE ee ande EE e e e e e EA EE oe e E = EE E e o E EA Es e O ee EA Ee e e os re A EEE e e e e AA EEE e e e E EA
O rs vs O av e Ee e De e | em e e Ee e De e some re Eee De e | em ee aus e Tabela 28
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
[ef] [a [E [e | remar [ua eo do Locaide | LocaldePara- | Localde | vLocaldePpara Sequência (5 para 3) Como Composto | início gom Início gom o a sv es e e e e EE e e e OA Es e e se o EA Es De De Des e A EE e e ess A EE e e To o A EE e e e e EA EE a oe oe e A
ELITE Te e TESTE] a a o a o Es Sm O rs e av e O ss nv a O sv e een a e e De e em e e Ee e De e | ee e Espe De Dre De | e O au E au Tabela 29 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número | SEGIDNO:T | SEGIDNO:T | SEGIDNO2 | SEGIDNO:z — EEEF EE] [Em Composto | início gom Início gom [ESTO [O [a [5 | meet e [ETR E e De ES e
EE E es res A Es a e e re EA EE e e Te eee A EE De es se A EEE e e Te e EA EE e e e es EA EE e E E ess EA
O E uv a es sn e Ss ra run o e Ee e De e | mes e e pe De De O | me ee Tabela 30 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número | seQIDNO:1 | SEQIDNO:1 | SEQIDNO:2 | SEQIDNO:Z E EFE [TF
Composto | | início gom Início gom o a ss Ee e De e ess e
[Ee De De Dm eme e e EE e e Te Tee DA Ee e e Ds Tee A EEE e e e Ts A is as e O a a e uv a O e ev a ss a ar a Ee e De e es e Tabela 31
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
| e o gm | een je
Composto | TLocaide | LocatdePara | Locaide | Locderaa | sequencia(s paras) vm Início gom Início gom Eee Os Es Ee Ee De De e eme o a sv
[ELLE E E EEE IE EE e e Ds Tee A EE e e Te es A EE e A De me e EE e e e Tee e ED e e Te e e EE e es e Does De EE e e e Te De EE e e e es EA Ee e e Te Te A pe De De Ds eee = Ee e e Ts De A EE e e De eee A EE e Ss e eee A EE De Os ee Ee EEE e e Ds Tese EE e e To me e EE e e Does Ds EE e e Ds ese e Fo e e e Tee o es av e Tabela 32
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 ame o ese [oo ee | mero Do o
Composto | Trecide | LocaldePars | tocado | Localde Para Sequência(5 para 3) vo Início gom Início gom o vv o a Eee De e ee Ee Eee e e EE Ee Ee De e me e Ee De De De ms [e Ee e De e me e Eee De e ms [re Eee De e eee e e pede e e Es E
[ET E E ESSE EE EEE De os To EA EE De e Ds AE Ee De De De Des Ee EE e Rs oe EA EE e e e em E EE e e De Di ee EE De e Ds ee EEE e e Ds e e EEE e a Ds oe o E ars e a o e | | o | Sm ze | Tabela 33 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número | sEQIDNO:1 | sEQIDNO? SEGIDNO:2 do Local de Local de Para- || SEQIONO:?2 Local de Sequência (5' para 3) FOXPS(% [e E sm je [E | meo [er eee Er es EEE EE e e e EEE ce O ra sv a O a ss ge pe e e e os
Ee De e De os = Ee e e De e A EE e e e E EA pe e e De eee e
Tabela 34
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
EE EA E EE Ra E a do Locaide | LocaldePara- | Localde | LocaldePara | — Sequência(s paras) vo Composto | | início gom Início gom Ee e De e qem O nv o me a ss va a O au ms Ee e De e e Eee De O ess e Ee e De e a e russa zm O vv oz ii a ns ze Fe e De e q emem e
Ee e Ds O oe e O vv zm O e av sz e au zm o ss sv Ee e De e sm ae Ee E De | mm e O rs ms vs sn E eres e O er ar vv Ee e De Dm e e eo se De Ds | [eme e | Tabela 35
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
[Sm e Em o [mm e [ee EE es Ee EE a e e Eee EA EE E e e Tese E = EE e e Des Tome EA Ee e e e EE a De TEA EE o a o E EA EE a De es Ee EE E e rs Ee EE a E = ss Ee EE ee e os Es E = EE o a e Tee Poco O e os ee = sa mm o aa ss o ans ss Ee e e e see Ee [a e [Om om e e Ee [e om [e e E = rsrs Rm ar au se ease ss Tabela 36 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número | SEGQIDNO:1 | SEQIDNO:1 | SEQIDNO:2 | SEQIDNO:Z EE TFFEEF] TZ E Composto | | início gom Início gom
Ee De oe De es = Ee e E E E A Ee e e Toe Tee
Ep IE Te es EEE E] a ame ea | ASNESET a | e a e ns | Nm a Tabela 37
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 ame o os et ao | emerson [o
Comenio | Tiocalde | TLocside | 2Loceide | LocaldePars Sequência (5 para 3) FOXP3(%UTC) início | Paragem | início gom [EST Te e [e Esses rs)
[ELE E E EEE EE EE e e e re A EE a e E rs A
EE E ET E E EA Ee e e e e = Ee e e E EEE EEE E E e FE EA au a sv a e sv a pe e De e e Ee e De o oe Ee e De e es ee Tabela 38 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 [mm Po e fa [so | meme | er ee |
Composto | TReceide | trocando | Sao o | LocsldePars | sequencia(s para) vo Início | Paragem gom [TRT e e Es] ss) [EE] O Te De [e ee | ss | [FE TR e Dee | [EEE | ss) [EF] [Om [e [e [E | e ss) [FTD E DD De mes |
[FT TE = 7 Fasw ss] [FE TR a e ee ms | e ss FA TR e A Te Rs [FS TR a e e Te | ss [AR a Os O ee | ss E TR e 5 Os reeeese | Ts FR a Os a ore | se [FR a Os e ses ss [FER e e O ae ss FS TR e es e Toe =] 7 STR e e O Teses | TO = TR a Oss De Desses | TC = [FE TR a e | see | Rs ss ER a e e e | ss [FP TR a O e ee | ss [FER a e e E | ss [FE TR a Os e se | ss [FF RT a e e Tas E ss
[Ep e = e EEE EE] Ee e e | Ee o re sv e sans xs aa suv as am vi as Ee [a Om | o ee e Da e | o mem | e Tabela 39
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
| [o [o mm eo) memo Lens Lene |
Composto | Tioceide | trocado | SRTA | ocardenaa | seqencia(ó paras) | roxesncuTo) Início | Paragem gom Ee ee e Ee Es De e e om e o o ss a as a O ama a av a E sv o ven a
EEE LE E E EEE IE E e e E EE A EE a e E Ts A EE e E E EE A EE e e E TEA Ee e e O E A EE e E E Es A EEE e E E TE A EE e e e TES EA Ee a e e Tee A EE e e e Es A EE a e Te es A Ep e e e EE EA Ee a e e Es EA Ep e e e EA Ep a De Ts mA EE a e E EE A EE e E e EEE A
E a e a as a aan a Tabela 40 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 | o [o Je os | eee [um emo composto Local de Loca | | Locaide Sequência (paras) | o Início Paragem Paragem o a ns rs Ce e e De em Es e e De me ss A a e | es mm |
EE e E E E AA FE a E E EE EA FE a E e EE EA EE a e = ess EA EE a e e ess EA EE a e = ss EA EE a e e EA FE a e e EA EE a e e e EA EE a e e es EA
CEE e e e Ts EE] A a am | ag | PODE | Sm | Tabela 41
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQIDNO:1 SEQIDNO:2 SEQID NO? FOXP3 = EEE EEEF EF] gom gom a O o aa vv ii as sis rs a rs a sr re is en rs Ipe e O Es E Ipe e O Ee Ee a e e e E Ee e e ss e ans a
Ee e O mm E ps a Cs sv a ei as Ee e e E E e Ee e O EesE E e Ep Dr O eme e = e ns a o sv e CC a as o a Ipe a e Os mes ee Ie a e e es = De a e | [eee | | Tabela 42 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 ESSES EEE Rea E ea Compota | cocadentão | PosiePam | 2rocdo | Locadoras | sequencia(ó amo) | CS gom Início gom FR EE E O E eee [E FI e E es E FR O E E E es [E FR O O [a E ee [E a FR O O E Es oe [E a FR O E Ds E se ET | o o | | aos | e as | Fo E E ss =
Gs TE E = ss pese =) ss e ss | ss | meme | e | | srs O e o | amem | | = ss e [eee | e | ss o O e | ossee | = | 5 ss O ss | e | eme | e | = e o O ss | e | seem | e | = Tabela 43 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
ESESEICEADICAL Composto Local de Início Local de Local de Início Local de Sequência (S' para 3) (%UTC) Paragem Paragem
EEE E e re A Rs Ds e E EA Ro a e e e EA Ee e e = Ts EA RE a a e e EA RE e e es EA EE e a e Es EA EE e e = rsss EA EE e e e ss EA EE a e = rsss EA au a a av a a es De [e [e mes e es Da [e [e om es Da [e oem e e Es De [e [mms | A e | ag | me | me Tabela 44 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQIDNO:1 SEQIDNO:2 SEQIDNO:? FOXP3 = a EF Es EF oo [EF] gom gom
EE E E E EEE E TE EE a e EEE EA Fo a e E re FE a e E EE EE a E E EA EE a E E EE EA EE a o e ss A EE a e E ss EA EE a E e rs EA Ee e e e E Ee Ros a Ts e re RE a e e EEE EA FE Ta e o Es EA RE Ta e E EEE RE Ta e e rs EE EE To e o EA EE a E A EE EA EE a E E EEE EA EE a E E Esso EA FP DR e e ee A
Eee es De e oem e o a av e a a a ae o e a un Eee Ds De [e mem e Eee Ds De [5 oe e | Eee a De [e ee | Tabela 45
Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2
Número do SEQIDNO:1 SEQID NO:1 SEQIDNO:2 SFQID NO:2 FOXP3 [EFE EFE EF] Paragem Paragem [e e os | ss ss seems | = | = Gs e ss o [esses 7 =) Ls ss [eee | | Gs e e e [ee | = | Gs e e [eee | | es o o Os Os veces | 7 | = [o wememes | e | FR e O eres | = | =
[FE TE E E E ese e Ts) [FE TE RA e O aee [a se FF Es E aee [e FE E E Os eee | e | [FE Rs e eee | a se) Fa ER e e [me | | [so a os e | aee | e | | [ss a a e e ame | a | FE Rs E eee | | [Fa ss ame | e | FT IE ss aaa Tr FE IE e a sas rs [FA A E a ee | e se) [FA a e E mesa | | Fr a Rs e qo | e | ss ss e 6 eee | e | = ss ss Os [see | | = ss os o | e e | orem | = | ss o | ee es ese | = | 7 Tabela 46 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.: 1e 2 Número do SEQIDNO:1 SEQIDNO:1 SEQIDNO:2 SEQIDNO:?2 FOXP3(%
ESEC ESESEEN ENE gom gom o so so o | omeommamo | 9 | sm | Ee e e e es Ee e [e e es E e Ee De [e e e E Is De [e e es e pe e e e ese Ts pe e e es Ee env e e e md on | a | a | om | So se |
Ee e ee Es E EE a ss TEA EE a se EE e E E EEE EA EE e e ss E A EE a e E EE EE a e e es E EA EE a | e EE EE a os e ee E Ee EE e E E EEE Ee EE e E EE Ee EEE a so Es Ee
Tabela 47 Inibição de MRNA de Foxp3 por gapmers com cEt 3-10-3 direcionados a SEQIDNO.:3,4e5 seoo seoo SEQIDNO:4 SEQIDNO:5 Número | no:3 | nos | seannos seaDNO:s Composto | Localde | Localde | Localdeinício Localde Para- Localde Início Localde Para- Seqpência(s para 5) FOXPSÁUTO) Início Paragem oem oem FF ss e FF Fe e Ss = FF rs E e ss =| FF Fer Es e eme | e | = | Fr A ese] | = Exemplo 3: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células LNCaP por gapmers de cEt
[0351] Os oligonucleotídeos modificados descritos nos estudos acima foram testados a várias doses em células LNCaP. Células LNCaP cultivadas a uma densidade de 30.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com oligonucleotídeos modificados diluídos para concentrações de 8.000 nM, 4.000 nM, 500 nM e 125 nM durante 24 horas. Após 24 horas, os níveis de MRNA de Foxp3 foram medidos como descrito precedentemente usando o conjunto de sonda e iniciadores da Foxp3 humano RTS35925. Os níveis de mMRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENGO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de MRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). IC50s foram calculadas usando uma regressão linear em um gráfico log/linear dos dados no Excel.
Tabela 48
Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células LNCaP [mo [e Ts [me a | so | [rm Do Ds O [ee Da Ds e [me De Dr O Os e De Dr e DE [mm De De Os e [e De Ds OS O [Bm De Da o e [mm De De Ds e [ee De Da OS
Tabela 49
Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células LNCaP [ao ss Ta Tama esa | eu | [me De Ds DO Os O [re De Ds Dr [me De Dr DR [e De De O O [es De De O O [rm De De O Os [mm De De O O [6 Do Da O O [Bm De Ds Rs GD Ds De DD
[e De Ds DO e [Eme A e E A [Gr Ds Ds Os [mm Da Da Os O Exemplo 4: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células SUP-M2 por gapmers de cEt
[0352] Os oligonucleotídeos modificados descritos nos estudos acima foram testados a várias doses em células SUP-M2. ION No. 141923 (gapmer de MOE 5-10-5, CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, designado no presente documento como SEQ ID NO: 3247), um oligonucleotídeo modificado de controle que não tem como alvo Foxp3, foi incluído em cada experiência como um controle negativo.
[0353] Células SUP-M2 cultivadas a uma densidade de 60.000 células por poço foram tratadas usando absorção livre com oligonucleotídeos modificados diluídos para concentrações de 7.000 nM, 1.750 nM, 437,5 nM e 109,375 nM durante 24 horas. Após 24 horas, os níveis de mMRNA de Foxp3 foram medidos como descrito precedentemente usando o conjunto de sonda e iniciadores da Foxp3 humano RTS35925. Os níveis de MRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). IC50s foram calculadas usando uma regressão linear em um gráfico log/linear dos dados no Excel. Os oligonucleotídeos modificados com valores percentuais de controle marcados com um asterisco (*) têm como alvo a região do amplicon do conjunto do iniciador sonda. Ensaios adicionais podem ser usados para medir a potência e eficácia dos oligonucleotídeos modificados direcionados à região do amplicon.
Tabela 50 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa mea sa] sa | [es | A O [es [Os TR O O [es [e Os DOR [es [e OR [ss [O O RR [as [O O DO [es [e OR O ss [ss TO O se [ass [O e O Tabela 51 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa Toma sa] sa | e e o e o [es [6 a RE [es [O E RS [ss TO DE Rs [es [O a Rs
[Fss Ts TE TT TEA [es Do De De e [Ts [A Es [a [O E e [e [e DR RA Tabela 52 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa Toma sa] e | [me e Ds Ds DR [eo [O a RS [es |O OR [es [O TR O E [es O OR Rs [er [e DR [ss [O RR ss [ss [e e O Rs [e [a DR SR [es Dr De e = | [ss [Os e O Os [e [e Os DOR O Tabela 53 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa mea sa] sa | [er [e Os Os O ss [es Os e e e [ee [O Re ss
[es [O O Rs [Te [Os E [ss FO E e e [ss [O DE O [Fe [Os Es Rs [es [O RR Rs [ss [O Ds Tabela 54 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [om asa ara rms mem | eos | [me os De DT TA [es [A Os Rs [es [O O OR [es [O O DR RE [es [O RR Rs [es Ds Ds Do o es = De = [= 1 [es [O Rs RR EA [ass O O OR RA [e [a [Ts TO RR Re [e [DO Rs ss Tabela 55 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [om asa ara rms [mam | eo |
[Fe Ts Tr TE TT [es a DR DS e [es O a OR e [es [O RR [es [e Os Os [ss [O Rs Re [ss TO o E ss [ss [O DO DR e es Ds DR o e [e [O RR Rs [ss [O a [se [O o os e ss
Tabela 56
Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 Lema Ps es | reger sa sm | |resea | RR | reação | e as os | | reseror | Ee so a | | rear | ss o Rs | rear [rs e e Br | | rear sa o sm |
Tabela 57 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa mea esa] sa | [me Os Ds Ds 1 [es O De DO Os [ese [O DO DOR O [e [Ie os e Os Gs [e [e RR [ss [O DR ss [Ts [e RR ss [en [Os e DO e [ss [O O TOR O Tabela 58 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om am asa mea ssa] sa | e o a [es TO Os Rs [es [O O DR Os ss [as TO DR Rs [ss TO DR E [es [e E Rs [es TR Ds e Rs
[e | RR [ee Do De Ds e e [Ts [e Ds DR RA Tabela 59 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [om om Tama [sa ssa] so | [mm Ds Ds = De 1 [es DI e e e [Fes Ds ss A [e Da e [O e [es De Ds Os e [Te DO Ts o [es DO Ds O Os e [eo DO Ds DO O [es DO O e O [as Dor Da e se [as Dr = = q [es DO TO DR e [ess De DR DR e Tabela 60 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | one [ra Tas [mm Tem | sem | [me Dos Dr e [es [Os Ds [O e e [es O Ds De e [e DO Da DR e [e DO Ds Ds se [Ge DO DR O e
[es [Os Ds Ds os [es Dom De De a [am DO Ds [ss [em DO DR Ds Tabela 61 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | ama [e ae [mea Tome | mos | [am Dm De ss Os 1 [e DO De os TR [e O e TA [es DO Ds o O [ee [Os Ds [Os OR E [es De De De | 31) [es De = Ds De 1 [em DO DR e TR A [e O DR os e e [es O e TO E [e [O Ds RT A [es DO Ds O PT [es O Ds o EA [es DO Ds o Te Tabela 62 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | om [sa aim vm Treme | mas |
Ge Ts Tr E e [e DO a DR e [es Dos De Da + | [es De Dr Dee [e [Os Ds Ds e e [e DO Ds De o [es [O Ds Ds [e Ds Dr e e [e DO Ds Ds [ss DO [Os e [es DO Ds Ds e o [es DO DR e e e [es O a DR e e [o Ds DD e
Tabela 63
Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 re Doe De = 1 [e Ds Ds [o e [e Dr Ds [Rs [es DO Dn e e [e DO Ds Ds os o [e DO Ds [O e [e DO Ds Ds e e [e DO Dr e e o [as DO DO [O e [a DO DR Ds e [e DO o es e [e DO Ds DO
Tabela 64 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | one [ra Tas [mm Tem | sem | [me Ds Ds De Ds [e DO Ds Ds e [e DO DR Ds os [e DO Ds Ds e e [es DO Da [e e e [e [O Ds [o e e [e Ds Ds Ds [es DO Ds Ds e [e DO Ds [e e [e DO Dr Ds e [es De Da Ds e [es [5 Da Ds o [e [O e [Os e [es DO Ds [os e e [e DO Ds ss e [e DI Ds Do ea Tabela 65 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | one [ra Tas [mm Tm | sea | [me Ds Ds De e [e [DO Ds [a e [es Ds Ds Ds e [ss DO Ds [Os [e Ds Ds Ds o [em Dos o Da e [es [e Ds Ds e [e Dm Ds De [Gs DO Ds TR e e es Dor Ds De os | [e DO Do e [Ge Ds DR Ds o Exemplo 5: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células SUP-M2 por gapmers de cEt
[0354] Os oligonucleotídeos modificados descritos nos estudos acima foram testados a várias doses em células SUP-M2. Células SUP- M?2 cultivadas a uma densidade de 60.000 células por poço foram tratadas usando absorção livre com oligonucleotídeos modificados diluídos para concentrações de 6.000 nM, 1.500 nM, 375,0 nM e 93,75 nM durante 24 horas. Após 24 horas, os níveis de mMRNA de Foxp3 foram medidos como descrito precedentemente usando o conjunto de sonda e iniciadores da Foxp3 humano RTS35925. Os níveis de MRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de MRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). IC50s foram calculadas usando uma regressão linear em um gráfico log/linear dos dados no Excel. Os oligonucleotídeos modificados com valores percentuais de controle marcados com um asterisco (*) têm como alvo a região do amplicon do conjunto do iniciador sonda. Ensaios adicionais podem ser usados para medir a potência e eficácia dos oligonucleo- tídeos modificados direcionados à região do amplicon. Tabela 66 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [am De Da e = 1 [Gs De Ts TOS
[Gs Dr Doe [Os Os OG [Gee De De [e Os E [Gs De Ds [Os O [Gs Ds Dr O O e [Ge De Dr e e [ss Dr Ds e e e [se Da Da a Tabela 67 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 e e ETs To [Gsm De [De [e O es De Ds Dr = 1 = [Ge De [e [O O [Gs De De O [se De [Os TOS [Ge De [Dr [os OR O [ses De DR ss e [Gs Da [Os PO E [Gem Da De PO e [Gee De De POR TO [ee De De Os E Tabela 68 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [ss [is Ds Os Os [ss a DO e Os Gs [ss Fr De Os OR E [se [o DR O O e [se [e De O [Gsm [De e O ss [se [Rs Ds Te O [ss [e De O OR [se [De TO O [Ge Ds De e O Exemplo 6: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células T CD4 por gapmers de cEt
[0355] Os oligonucleotídeos modificados descritos nos estudos acima foram testados a várias doses em células T CD4 derivadas de PBMC primárias. Células T CD4 humanas totais foram purificadas de amostra de leucaférese de sangue periférico humano (Leukopak, Stemcell Technologies) usando o kit de isolamento de células T CD4 humanas Easysep (Stemcell Technologies). Células CD4 humanas purificadas foram cultivadas em meio de expansão de células T Immunocult-XT (Stemcell Technologies) suplementado com 30 ng/mL de IL-2 humana recombinante (Stemcell Technologies). Células T CD4 cultivadas a uma densidade de 50.000 células por poço foram tratadas por absorção livre com oligonucleotídeos modificados diluídos para as concentrações especificadas nas tabelas abaixo Após 48 horas de incubação, os níveis de MRNA de Foxp3 foram medidos como descrito precedentemente usando o conjunto de sonda e iniciadores de Foxp3 humano RTS35925. Os níveis de MRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO.
Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (UTC). Tabela 69 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T CD4 [mem [sem | seem | mem | [Ge De De Ds O [em DI Ds TO [OA [e Da De [O [e De De DO [O [es Da De Os O [ea DI O Os Ts [e [e e e [Tee DA DR e O [ee Da DO TO TOA [Te Ds DO TR [ess De TRT = Tabela 70 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T CD4 [mem [rm | mem | mem | [e e Po Ds TO [am TT E [e TRT Ds
[es TT Ts [e Ds e [Os TO [rs a O DO TO [rs O Os DO TO [rs O e DO O] [as e TO O O [as Ds PO Os TO [ss O O O [a De PO DO TO [ss O e DO Ts Tabela 71 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T CD4 [am [amo | mom | rom | om e e Ds [as [e [e Os TO [es DR [e [Os TO] [e a O DO TO [e Ds O Os e [e | e [O TO [rs ss [O O O Exemplo 7: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células T Reguladoras (T-reg) por gapmers de cEt
[0356] Os oligonucleotídeos modificados descritos nos estudos acima foram testados em várias doses em células T regulatórias diferenciadas in vitro. As T-regs foram diferenciadas durante 2 semanas a partir de células CD4 humanas naíve (purificadas de PBMCs congeladas (Stemcell technologies) usando o kit de isolamento de células T CD4 naive humanas EasySep (tecnologias Stemcell)) em meio de expansão de células T Immunocult-XT (Stemcell Technologies) suplementado com Suplemento de Diferenciação ImmunoCult Human Treg e Ativador de Células T CD3/CD28 Humanas ImmunoCult (Stemcell Technologies). Células T-reg cultivadas a uma densidade de
20.000 células por poço foram tratadas por absorção livre com oligonucleotídeos modificados diluídos para as concentrações especifi- cadas nas tabelas abaixo Após 48 horas de incubação, os níveis de mMRNA de Foxp3 foram medidos como descrito precedentemente usando o conjunto de sonda e iniciadores de Foxp3 humano RTS35925. Os níveis de mMRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, como medido por RIBOGREENO. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mMRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). Tabela 72 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T-reg [mem [mem | sem | mem | [ee Ds Do os O [ss DD DOR Pe OO [ao De DO PO TOO [es De DO TOR O [e De DO PO OO
Fr Te Tr E =) [es De Ds Pe Ts [as Da DO PO OR [e De DOR PO O [Bm De DO O [as Ds DO DO OO [e [e Ds Ds [OO [Ge De DOR TO O Tabela 73 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T-reg | om rs a Ema ms [es Doe Ds os [O [es Ds Doe os [Os [es De Ds TT = [ma De DO Os [O [es De O e O [es De TO Tabela 74 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T-reg | one rs Toa [ssa Tese [ss Da DO e OO [er De DO PO OO [o DO DO PO O [e De DO PO O [e [o DO POR OO
Fo TA TT [e De DO PO O [e e O OR [as De DO POE O [e Da DOR POR O [Bm De DO E [ee De DO PO OO [as Ds DOR TOR OO Tabela 75 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por absorção livre de oligonucleotídeos modificados em células T-reg [ram | mam | sam | meo | [es DO O O OO [es Ds DO Os [Os [es DO DR o [O [ess Ds DR [e De e e OO [es De DR OO [mm Ds [Gs e O e [e Ps Ds = 1 Exemplo 8: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados direcionados a Foxp3 humano em camundongos Balb/c
[0357] Os camundongos Balb/c foram tratados com oligonucleotídeos modificados selecionados de estudos descritos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos. Tratamento
[0358] Grupos de camundongos Balb/c fêmeas (obtidos de Charles River) foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante três semanas (para um total de 7 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos modificados. Um grupo de camundongos Balb/c fêmeas foi injetado com PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 21 após o início do tratamento (24 horas após a administração final). Marcadores de química no plasma
[0359] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática, os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (NUS), albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato amino- transferase (AST), bilirrubina total (TBIL) e albumina (ALB) foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). Os resultados são apresentados na Tabela em baixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram mudanças nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora da gama esperada para oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos adicionais. Tabela 76 Marcadores químicos no plasma em camundongos Balb/c fêmeas [se De e e TO [ss De De e e O [Em = [e [e O TO Pesos corporal e dos órgãos
[0360] Os pesos corporais de camundongos Balb/c foram medidos no dia 22, e o peso corporal médio para cada grupo é apresentado na tabela abaixo. Os pesos dos rins, baço e fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 77 Pesos corporais e de órgãos (em gramas) Fígado (g) Baço (9) corporal (9) [Gr e o as [0 Exemplo 9: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados direcionados a Foxp3 humano em camundongos CD-1
[0361] Os camundongos CD-1 foram tratados com oligonucl- eotídeos modificados selecionados de estudos descritos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos. Tratamento
[0362] Grupos de camundongos CD-1 machos (obtidos de Charles River) foram injetados subcutaneamente uma vez por semana durante seis semanas (para um total de 7 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos modificados. Um grupo de camundongos CD-1 machos foi injetado com PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 39 após o início do tratamento (24 horas após a administração final). Marcadores de química no plasma
[0363] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática, os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (NUS), albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina total (TBIL) e albumina (ALB) foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi
Olympus AU400c, Melville, NI). Os resultados são apresentados na tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram mudanças nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora da gama esperada para oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos adicionais. Tabela 78 Marcadores químicos no plasma em camundongos CD-1 machos Ds TITO Ts Rs TE TO TO TT Ta TE DR Ts Te Pesos corporal e dos órgãos
[0364] Os pesos corporais de camundongos CD-1 foram medidos no dia em que os camundongos foram sacrificados, e o peso corporal médio para cada grupo é apresentado na Tabela abaixo. Os pesos dos rins, baço e fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 79 Pesos corporais e de órgãos (em gramas) Fígado (g) Baço (9) corporal (9) e e o [a [ss es Dm [e | e es os Ensaios de hematologia
[0365] O sangue obtido de grupos de camundongos no dia 40 foi enviado para a IDEXX BioResearch para medição das contagens de células sanguíneas. As contagens realizadas incluem contagem de glóbu- los vermelhos (RBC), contagem de glóbulos brancos (WBC), hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), Volume corpuscular médio (MCV), hemoglo- bina corpuscular média (MCH), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), e contagens individuais de leucócitos, tais como monócitos (MON), neutrófilos (NEU), linfócitos (LIN), eosinófilos (EOS), basófilos (BAS), reticulócitos (RETIC) e plaquetas (PLT). Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo. N.D se refere a amostras em que os dados não estão disponíveis. Os oligonucleotídeos lonis que causaram alterações da contagem de células sanguíneas fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 80 Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [om [rs Jos | Jos [o [o [one Foca ss E E E Fr EI IF ea FP IE Ea Fo Fr ss E =)
FR E
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FEI TF o E Eee
FR ER ETR TE EA Tabela 81 Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [em [es [o [o [a | [e LP o a es Fa E E Rs AA ss e a e | Fr EI E E ESA Fa ss Fa
Es es se Exemplo 10: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados direcionados a Foxp3 humano em camundongos CD-1
[0366] Os camundongos CD-1 foram — tratados — com oligonucleotídeos modificados selecionados de estudos descritos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos. Tratamento
[0367] Grupos de camundongos CD-1 machos (obtidos de Charles River) foram injetados subcutaneamente uma vez por semana durante seis semanas (para um total de 7 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos modificados. Um grupo de camundongos CD-1 machos foi injetado com PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 40 após o início do tratamento (24 horas após a administração final). Além disso, 6 grupos adicionais de camundongos (tratados com ION Nos. 1062413, 1062669, 1062712, 1062835, 1063655 e 1063946) foram tratados subcutaneamente uma vez por semana durante 5 semanas (um total de 6 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos. Os camundongos foram sacrificados no dia 33 após o início do tratamento (24 h após a administração final). Marcadores de química no plasma
[0368] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática, os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (NUS), albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina total (TBIL) e albumina (ALB) foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). Os resultados são apresentados na Tabela em baixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram mudanças nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora da gama esperada para oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos adicionais. Tabela 82 Marcadores químicos no plasma em camundongos CD-1 machos [es Do Ds de e de [a [O TO JO De os [es Da De ds e da [asse TO TT JO A a [ee Ds De de a Pesos corporal e dos órgãos
[0369] Os pesos corporais de camundongos CD-1 foram medidos no dia em que os camundongos foram sacrificados, e o peso corporal médio para cada grupo é apresentado na Tabela abaixo. Os pesos dos rins, baço e fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na Tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 83 Pesos corporais e de órgãos (em gramas) Fígado (9) Baço (9) corporal (9) Es E E A Fe E E ese ps e es Es E EE ee Es E Gs es EA Ensaios de hematologia
[0370] O sangue obtido de grupos de camundongos no dia 40 foi enviado para a IDEXX BioResearch para medição das contagens de células sanguíneas. As contagens realizadas incluem contagem de glóbulos vermelhos (RBC), contagem de glóbulos brancos (WBC), hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), Volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), e contagens individuais de leucócitos, tais como monócitos (MON), neutrófilos (NEU), linfócitos (LIN), eosinófilos (EOS), basófilos (BAS), reticulócitos (RETIC) e plaquetas (PLT). Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo. Os oligonucleotídeos lonis que causaram alterações da contagem de células sanguíneas fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais. Tabela 84 Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [1 fo ora a on Da a o
FT E E E E EA [Rss De Tre E e e e ese Te TE e TE ee A [e] Ts TE e e Te e = [e a Te Te o TE ee A ee De Te TE e TE EA Res TA Te e TE A [555 o [O Ds IT Ds [es me De e e TR e A e Do TT e E ee EA Rs TI TE E TE e A [e] TE Te RT TA [e a TE Te Te e A [e De TETE Te A pese De Ts o = e = [a a TE Te e Te Te e Rem De E E TE e A [se TI e o TR e A [5 DE Te o Te A Tabela 85 Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [5 es [es [os [a [o [o [e De Ds Os DO O [Tem Ds Ts TE TI Ee [Te TA TA TE TE e A [ss Tr Ta TETE
[Ts DR TA TE TE Ee [e 5 Di De Ds O [Ts TA Ta TE TE E [Ts DE TA TETE Ee [Ts TA TITE TD E A [Tm De Ta ET Ee [Ts TA TE TETE E [e Ds De De ds [De Ds | Exemplo 11: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados direcionados a Foxp3 humano em camundongos CD-1
[0371] Os camundongos CD-1 foram tratados com oligonucle- otídeos modificados selecionados de estudos descritos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos. Tratamento
[0372] Grupos de camundongos CD-1 machos (obtidos de Charles River) foram injetados subcutaneamente uma vez por semana durante seis semanas (para um total de 7 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos modificados. Um grupo de camundongos CD-1 machos foi injetado com PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 41 após o início do tratamento (24 horas após a administração final). Além disso, 4 grupos adicionais de camundongos (tratados com ION Nos. 1062247, 1063619, 1063653 e 1064096) foram tratados subcutaneamente uma vez por semana durante 5 semanas (um total de 6 tratamentos) com 50 mg/kg de oligonucleotídeos. Os camundongos foram sacrificados no dia 38 após o início do tratamento (5 dias após a administração final). Marcadores de química no plasma
[0373] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática, os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (NUS), albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina total (TBIL) e albumina (ALB) foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). Os resultados são apresentados na tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram mudanças nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora da gama esperada para oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos adicionais. Tabela 86 Marcadores químicos no plasma em camundongos CD-1 machos La IE Is
FL E La RR O Ls IF e e Las E E ER E Ls A E IE Lo E a Pesos corporal e dos órgãos
[0374] Os pesos corporais de camundongos CD-1 foram medidos no dia em que os camundongos foram sacrificados, e o peso corporal médio para cada grupo é apresentado na tabela abaixo.
Os pesos dos rins, baço e fígado foram medidos no final do estudo e são apresentados na tabela abaixo.
Os oligonucleotídeos modificados que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 87 Pesos corporais e de órgãos (em gramas) peso
[5 fase les [e 1 |
[es [O [os [o [o
[ee [o [os [oe |
[es a Ts [om om
[em [os [oe [ss [oe
[ss [e [O [o [0 Ensaios de hematologia
[0375] O sangue obtido de grupos de camundongos no dia 40 foi enviado para a IDEXX BioResearch para medição das contagens de células sanguíneas.
As contagens realizadas incluem contagem de glóbulos vermelhos (RBC), contagem de glóbulos brancos (WBC), hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), Volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), e contagens individuais de leucócitos, tais como monócitos (MON), neutrófilos (NEU), linfócitos (LIN), eosinófilos (EOS), basófilos (BAS), reticulócitos (RETIC) e plaquetas (PLT). Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo.
N/A abaixo se refere a amostras onde os dados não estão disponíveis devido ao volume de sangue insuficiente.
Os oligonucleotídeos lonis que causaram alterações da contagem de células sanguíneas fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais.
Tabela 88 Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [mm fee fora] um [nr] o [o [o Fr IT Ir E sa [Fe TITE IE e sa [Te TITE IE E E Ts Ts [Fes TITE ID E ss [Te TI TE IA Ts [es TD DE E E A [TR TI TI IE TIA E E e [To TITE TI E ss [Te TITE AI E e Ts [Ts TITE TI E E E [Ts TITE AI E ss
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Tabela 89
Contagem de Células Sanguíneas em camundongos CD-1 [5 es e [e [e [e [2] [Ds TE e E e [es [o De [e Dr o | [Te [O O TO e [es o Ds [5 O De [e [Ts [E [5 [Os [Es O [Te 5 De [e e Ds [e o Dee [es De 5 [Ta e [ss [O [Os e [rs TT e Te Te [Ts [De [O TT DA 5 [Ts [5 [ss Ts [ss [O e
Exemplo 12: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados direcionados a Foxp3 humano em ratos Sprague-Dawley
[0376] Os ratos Sprague-Dawley são um modelo de múltiplos propósitos usado para avaliações de segurança e eficácia. Os ratos foram tratados com oligonucleotídeos modificados lonis dos estudos descritos nos Exemplos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos. Tratamento
[0377] Ratos Sprague-Dawley machos foram mantidos em um ciclo de luz/escuridão de 12 horas e alimentados ad libitum com comida de rato normal Purina. Grupos de 4 ratos Sprague-Dawley cada foram injetados semanalmente por subcutaneamente com 50 mg/kg de oligonucleotídeo lonis durante 6 semanas (total de 7 doses). Além disso, um grupo de 3 ratos Sprague-Dawley foi injetado subcutaneamente com solução salina pelo mesmo período de tempo. Quarenta e oito horas após a última dose, os ratos foram sacrificados; e os órgãos, urina e plasma foram coletados para análise posterior. Marcadores de química no plasma
[0378] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos lonis na função hepática, os níveis no plasma de transaminases foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). Os níveis plasmáticos de ALT (alanina transaminase) e AST (aspartato transaminase) foram medidos e os resultados são apresenta- dos na Tabela abaixo expressos em UIl/L. Os níveis no plasma de bilirrubina (TBIL), albumina (ALB) e nitrogênio ureico no sangue (NUS) foram também medidos usando o mesmo analisador químico clínico e os resultados são também apresentados na Tabela abaixo. Os oligonucleo- tídeos lonis modificados que causaram alterações dos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos posteriores.
Tabela 90 Marcadores químicos plasmáticos em ratos Sprague-Dawley | es es [e | ps E E Ts ps E E A Ensaios de hematologia
[0379] O sangue obtido de grupos de camundongos na semana 6 foi enviado para a IDEXX BioResearch para medição das contagens de células sanguíneas. As contagens realizadas incluem contagem de glóbulos vermelhos (RBC), contagem de glóbulos brancos (WBC), hemo- globina (HGB), hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), e contagens individuais de leucócitos, tais como monócitos (MON), neutrófilos (NEU), linfócitos (LIN), eosinófilos (EOS), reticulócitos (RETIC) e plaquetas (PLT). Os resultados são apre- sentados nas tabelas abaixo. Os oligonucleotídeos lonis que causaram alterações da contagem de células sanguíneas fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais. Tabela 91 Contagem de células do sangue em ratos Sprague-Dawley [gm eme [ea [rem [95 Dem ess [eee] FR ss | A
FT IEEE Ls e rs ss o e = = ss = = Las o RR RE E = = = ss E E E ss e = ss E E E E e = Tabela 92 Contagem de células do sangue em ratos Sprague-Dawley [e e [ema [nm em [iene [175 [e e e De = se [ss Ds e ss = = = = = =) [Es = = e = = =) Função renal
[0380] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos lonis na função renal, os níveis urinários de proteína e creatinina total foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). As razões entre proteína total e creatinina (razão P/C) são apresentadas na Tabela abaixo. Os oligonucleotídeos lonis que causaram alterações dos níveis da razão fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais. Tabela 93 Relação entre proteína total e creatinina em ratos Sprague-Dawley [e fe
Pesos Corporal e dos Órgãos
[0381] Os pesos do fígado, coração, baço e rins foram medidos no final do estudo e são apresentados na tabela abaixo. O peso corporal terminal foi medido antes da necropsia. Os oligonucleotídeos lonis que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais. Tabela 94 Pesos Corporal e dos Órgãos [om fee [e [e [=| ps E ee Exemplo 13: Efeito de oligonucleotídeos modificados na expressão de FOXP3 humano em um modelo de camundongo de PBMC humanizado
[0382] Camundongos de PBMC humanizados obtidos do Jackson Laboratory —(hu-PBMC-NSG). .Camundongos — NOD.Cg-Prkdescid I12rgtm 1Wil/SzJ foram enxertados com PBMCs humanos para gerar o modelo hu-PBMC-NSG. Os camundongos foram tratados com oligonucleotídeos modificados selecionados de estudos descritos acima e avaliados quanto a alterações dos níveis de vários marcadores químicos plasmáticos, bem como mRNA. Tratamento
[0383] Grupos de 4 camundongos hu-PBMC-NSG fêmeas (obtidos do Laboratório Jackson) foram injetados subcutaneamente diariamente (para um total de 4 tratamentos) com 25 mg/kg de oligonucleotídeos modifica- dos. Os camundongos foram tratados com oligonucleotídeo modificado em grupos de 4. Um grupo adicional de 8 camundongos huPBMC fêmeas foi injetado com PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 4 após o início do tratamento (24 horas após a administração final). Marcadores de química no plasma
[0384] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática, os níveis plasmáticos de nitrogênio ureico no sangue (NUS), albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina total (TBIL) e albumina (ALB) foram medidos usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400c, Melville, NI). Os resultados são apresentados na Tabela em baixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram mudanças nos níveis de qualquer um dos marcadores da função hepática ou renal fora da gama esperada para oligonucleotídeos antissenso foram excluídos em estudos adicionais. Tabela 95 Marcadores químicos no plasma em camundongos huPBMC fêmeas cer oem a e a x Ls dr
Ls es Ls rs Pesos comeram AA
[0385] Os pesos corporais de camundongos hu-PBMC-NSG foram medidos no dia em que os camundongos foram sacrificados, e o peso corporal médio para cada grupo é apresentado na Tabela abaixo. Os oligonucleotídeos modificados que causaram quaisquer mudanças nos pesos dos órgãos fora da gama esperada para oligonucleotídeos modificados foram excluídos de estudos adicionais. Tabela 96 Pesos corporais e de órgãos (em gramas) Análise de RNA
[0386] Esplenócitos e gânglios linfáticos foram extraídos para análise de RNA. Os esplenócitos foram isolados dos baços por ruptura mecânica em tubos de dissociação de tecidos (Mitelnyi) em dissociador MACS suave (Mitelnyi). Conjuntos de sonda e iniciadores RTS35925 descrito acima e RTS35988 (sequência direta, CAAATGGTGTCTGCAAGTGG, designada no presente documento como SEQ ID NO: 3248; sequência reversa CTCTGGAGGAGACATTGTGC; designada no presente documento como SEQ ID NO: 3249; sequência de sonda,
CCTGGCAGTGCTTGAGGAAGTCC, designada no presente documento como SEQ ID NO.: 3250) foram usados para medir os níveis de RNA de Foxp3 humano em PCRs separados. Os resultados são apresentados como alteração percentual de RNA, em relação ao controle de PBS, normalizado para GAPDH humano e CD4 humano. GAPDH humano foi amplificado usando o conjunto de sonda e iniciador RTS104 (sequência direta, GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, designada no presente documento como SEQ I|D NO: 3251; sequência reversa GAAGATGGTGATGGGATTTC; designada no presente documento como SEQ ID NO:: 3252; sequência de sonda, CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC, designada no presente documento como SEQ ID NO .: 3253). CD4 humano foi amplificado usando o conjunto de sonda e iniciador ABI Hs01058407 m1.
[0387] Como apresentado na tabela abaixo, o tratamento com oligonucleotídeos modificados lonis resultou na redução do RNA de Foxp3 em comparação com o controle de PBS. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mMRNA de Foxp3 em relação ao controle de PBS (%controle). Tabela 97 Inibição mediada por oligonucleotídeo modificado da expressão do RNA de Foxp3 humano no modelo huPBMC - EesEAESE om e pm e e e e e e La Aa Ls oa Ls
EA
Citometria de Fluxo
[0388] Os níveis de proteína Foxp3 foram medidos em células T reguladoras usando citometria de fluxo. Após incubação com oligonucle- otídeos modificados, as células T CD4* foram coradas com anticorpos CD3, CDA4, Helios e FOXP3 marcados com fluorescência (Biolegend) usando TrueNuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend). As células T reguladoras foram bloqueadas como células CD3*CD4*Helios* e os níveis de proteína Foxp3 foram quantificados usando a intensidade fluorescente média da coloração de anticorpo Foxp3. Tabela 98 Inibição mediada por oligonucleotídeo modificado dos níveis de proteína de Foxp3 humano no modelo huPBMC Controle proteina ss
EC Exemplo 14: Inibição dependente da dose dos níveis de mRNA e proteína de Foxp3 humano em células T CD4 derivadas de camundongos hu-PBMC-NSG por oligonucleotídeo modificado
[0389] Células T CD4* humanas foram isoladas de esplenócitos de camundongos PBMC humanizados (hu-PBMC-NSG, Jackson Laboratory)
por meio de uma combinação de purificação inicial usando o kit de purificação de células T CD4 Human Easysep (Stemcell Technologies), seguido por uma seleção negativa usando o kit de purificação de células T CD4 Mouse Easysep (Stemcell Technologies) para enriquecer apenas a população humana. Células T CD4* humanas purificadas foram cultivadas em meio de expansão de células T Immunocult-XT (Stemcell Technologies) suplementado com 30 ng/mL de IL-2 humana recombinante (Stemcell Technologies). As células T CD4* foram tratadas ex-vivo com oligonucleotídeos modificados por absorção livre em um estudo de resposta à dose durante 72 horas. As células foram ativadas durante 24 h na presença do ativador de células T CD3/CD28/CD2 humanas Imunocult (Stemcell Technologies). As células foram colhidas e avaliadas para alterações nos níveis de MRNA de Foxp3.
[0390] O conjunto de sonda e iniciador RTS35988 foi usado para medir os níveis de RNA de Foxp3 humano. Os níveis de RNA de Foxp3 são normalizados para GAPDH humano ou CD4 humano. GAPDH humano foi amplificado usando o conjunto de sonda de iniciador RTS104. CD4 humano foi amplificado usando o conjunto de sonda e iniciador HsS01058407 m1. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de MRNA de Foxp3 em relação ao controle de PBS (%controle).
[0391] Os níveis de proteína Foxp3 foram medidos em células T reguladoras usando citometria de fluxo. Após incubação com oligonucleotídeos modificados, as células T CD4* foram coradas com anticorpos CD3, CD4, Helios e FOXP3 marcados com fluorescência (Biolegend) usando TrueNuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend). As células T reguladoras foram bloqueadas como células CD3*CD4*Helios* e os níveis de proteína Foxp3 foram quantificados usando a intensidade fluorescente média da coloração de anticorpo Foxp3.
Tabela 99 Inibição mediada por oligonucleotídeo modificado da expressão do RNA de Foxp3 humano em células T CD4 do modelo huPBMC (normalizado para GAPDH) teso (um ss e e e Ls rs e ss E ss Rs e ss Ls sea ss ss Ts ss ss TT ss ss es Rs e ss ss ss ss ss RR ss Ls Rr E e Tabela 100 Inibição mediada por oligonucleotídeo modificado da expressão do RNA de Foxp3 humano em células T CD4 do modelo huPBMC (normalizado para CD4) 1eso (um) | em | as | oem | orem | on | teres as tee teres e e re a | reea aa | teen e as [tee a a tese e as [ore a Tabela 101 Inibição dependente da dose da expressão de proteína de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células T reguladoras Iso (uM) [rm | sm | am | em | on | CM
[es De De Rr e e [e e e e De Os = [e DE Dr e e e Os [es TE De Rr e [em De De O O e e [e DR DE RR e Os [es De DT e e e Os [me De Da Ds e Exemplo 15: Inibição dependente da dose de Foxp3 humano em células SUP-M2 por oligonucleotídeos modificados
[0392] Os oligonucleotídeos modificados foram testados quanto ao seu efeito no nível de mMRNA de Foxp3 in vitro em células SUP-M2. Células SUP-M?2 cultivadas a uma densidade de 35.000 células por mL, foram transfectadas usando eletroporação com oligonucleotídeos modificados diluídos para concentrações de 10 uM, 2,5 uM, 0,63 uM, 0,16 UM e 0,04 uM. Após um período de tratamento de aproximadamente 48 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de MRNA de Foxp3 foram medidos por RT-PCR quantitativa em tempo real. Os conjuntos de sonda e iniciadores RTS35925 e RTS35988 humanos foram ambos usados para medir os níveis de MRNA em reações de RTPCR separadas. Os níveis de MRNA de Foxp3 foram ajustados de acordo com o conteúdo de RNA total, medido por RIBOGREENGO, bem como ajustados aos níveis de GAPDH medidos pelo conjunto de iniciadores-sonda humano RTS104. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como o percentual de controle da quantidade de mRNA de Foxp3 em relação às células de controle não tratadas (%UTC). Tabela 102 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 | mm e Tosa oe quase % | ss ss [re e e e
Ls E e E E = ss e = = 7 «| Ls e = = = ss Rr E = mw ss E E Es e Ls Rs A e ss E E RT e e Tabela 103 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [e EEE e] 1Cso (UM) qa ps e poem | | rers | reens a e s a ser a e | teen es | reees e a rea a a es tese e ame e sr a [se | e [a e e Tabela 104 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 [mm sa sa Ta Ta qem] = | [ss To RE e TA [e IR e TA [es Des Dn mw [ss o E RR e om Ts RR Ee e A [sm Te E TE RT =)
[ss To E ER e A [ss o E e [es Ds De Dr [e e | [om Te E E RR e [e De DR TT e TA Tabela 105 Inibição dependente da dose da expressão de mRNA de Foxp3 humano por oligonucleotídeos modificados em células SUP-M2 EN -RTS35988 normalizado para Ribogreen 1Cso (UM) ma sa (a qse 9 [es Da DE O [sm e E E [e Dr se e ww [sm Po E O e [ss Te E RA [om De a De De = 1 [es Te DR E O [om Te Rs e e e [sm Te E e e

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES
1. Oligonucleotídeo modificado, caracterizado pelo fato de que a forma aniônica do oligonucleotídeo modificado tem a seguinte estrutura química: j NA o NH2 OT 2 Ho. A, ps *N & i — UA, LA O LAN o) Ns ? a o. Y o o Q NH? À sro. ss À e NH À o o SA 2 À : So SÓ À e '” Tr E À º 4 LN À So LA, << V Di O) À Oo] o. oo À NH À — sH=o VT" À e " É À o º o o | ºsg-p=o V Og de o. não À Ô. Ss À o A À o. | V ss SÁ À 07 À V o Nm O9g-P=o À o ? NH À Pai O | x À são DO À 6 N o | À S 2 À Pst=o NH? So ASS TA o o À o À não Sg-pzo NH À e " À SJ d ( À V s-P=O TY À — o N À O. o ho À oo — À CT À ºs do x À o ? À À SO NH “s-P=O Tr V À Ts LR A > O | e? À e? À “spo ) s-p=o O o (SEQ ID NO: 449) ou um sal do mesmo.
2. Oligonucleotídeo modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um sal de sódio ou um sal de potássio.
3. Oligonucleotídeo modificado, caracterizado por ter a seguinte estrutura química:
o NS ONH o NHz DO : Ho. o NAN NH FA DO E Pa o. SÓ não Fo O o. e oºo NH: ( , S-P=O ? o À não O À e. P y o j & S-P=0 NA e NON No) não 2 Vo US e 9 o À NH À << é SO + À e? ; À o º não | é S-P=0 Ss À e o o. no À No O, TA VSTO NS ONH À o) À o. < 1 h À > N NT S 07 À V O | Í & S-P=O À e? NHz À Pi Nao Pu À ESPE NA, À Oo À, NA. <<] À e? NH N e to À à N Ô | esto 1º O) VON TÁ - À CCZ À | o o V Y o À o não es-P=o CO À o sto DS. À Nao p= À Na | À — o No h à o não V or º os à o À À o q À À EST Tr À , S-P=0 O À Nao Í e ST | À N não À NO no À O) À O) À CC | CC | EN À eo ? À é S-P-O 9 S-P=O Na o) Nao (SEQ ID NO: 449).
4. Composição farmacêutica, caracterizada por compreen- der o oligonucleotídeo modificado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o transportador farmaceuticamente aceitável compreende água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que consiste essencialmente do oligonucleotídeo modificado e água ou consiste essencialmente do oligonucleotídeo modificado e PBS.
7. Uso de um oligonucleotídeo modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de câncer.
8. Uso de um oligonucleotídeo modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por o câncer ser um câncer tendo Tregs positivas para FOXP3 (FOXP3+) no microambiente ou estroma ou gânglio linfático com drenagem de tumor, câncer do pulmão, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), câncer gastrointestinal, câncer do intestino grosso, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCO), câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do trato biliar, câncer gástrico, câncer urotelial, câncer da mama, câncer da mama triplo negativo (TNBC), câncer do ovário, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da próstata, mesotelioma, sarcomas (por exemplo, epiteloide, rabdoide e sinovial), cordoma, câncer renal, carcinoma de células renais (RCC), câncer do cérebro, neuroblastoma, glioblastoma, câncer da pele, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células de Merkel, câncer do sangue, câncer hematopoético, mieloma, mieloma múltiplo (MM), malignidades de células B, linfoma, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma de células T, leucemia ou leucemia linfocítica aguda (LLA).
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