BR112021008799A2

BR112021008799A2 - método e aparelho para gerar imagens de camada leucocitária

Info

Publication number: BR112021008799A2
Application number: BR112021008799-0A
Authority: BR
Inventors: Thomas R. Drechsler
Original assignee: Perkinelmer Health Sciences, Inc.
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-08-10
Also published as: KR20210088663A; AU2019375858A1; JP7250925B2; WO2020096772A1; CA3118716A1; CN112997063B; KR102504240B1; US11386551B2; EP3877747B1; AU2019375858B2; EP3877747A1; CN112997063A; JP2022507121A; US20200151870A1

Abstract

MÉTODO E APARELHO PARA GERAR IMAGENS DE CAMADA LEUCOCITÁRIA. O documento revela um processador de amostra de sangue para geração de imagens de uma amostra de sangue centrifugada incluindo um recipiente transparente com a amostra de sangue centrifugada no mesmo. Uma fonte de iluminação é posicionada para iluminar a amostra de sangue centrifugada em um ângulo não reto em relação ao recipiente transparente. Uma câmera digital disposta oposta ao recipiente transparente gera imagem da amostra de sangue centrifugada e a imagem é processada para determinar as localizações relativas das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

Description

“MÉTODO E APARELHO PARA GERAR IMAGENS DE CAMADA LEUCOCITÁRIA” RELATÓRIO DESCRITIVO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. Campo de Invenção

[001] A presente invenção se refere a um método e aparelho para determinar a localização de camadas de componentes em uma amostra de sangue após centrifugação. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um método e aparelho para criar imagens de alto contraste de uma amostra de sangue centrifugada, de modo a estabelecer localizações de camadas de componentes na mesma.

2. Descrição da Técnica Correlata

[002] As amostras de sangue são frequentemente analisadas ou processadas por centrifugação da amostra de sangue para separar componentes específicos da amostra de sangue em camadas de componentes. Normalmente, a amostra de sangue centrifugada compreende três camadas de componentes, a camada superior de plasma, a camada inferior de glóbulos vermelhos e a camada intermediária de “camada leucocitária” contendo leucócitos. A centrifugação permite que componentes específicos de interesse sejam extraídos da amostra de sangue por remoção da camada de componente apropriada.

[003] As camadas de componentes da amostra de sangue são normalmente extraídas manualmente, por sua vez, por uma pipeta. A camada de componente contendo o componente de interesse é retida para análise e as outras camadas de componente podem ser retidas ou descartadas conforme desejado. A extração manual das camadas de componentes da amostra de sangue dessa maneira é demorada e cara. Também requer habilidade considerável, pois, a olho nu, os limites entre as camadas dos componentes da amostra de sangue podem ser difíceis de distinguir. Esses problemas são exacerbados se a camada leucocitária for a fração de interesse, já que a camada de camada leucocitária é típica e relativamente fina em comparação com as outras camadas de componentes da amostra de sangue.

[004] A iluminação adequada da amostra de sangue e das camadas de componentes dentro dela é crítica para fornecer uma imagem de alto contraste que pode ser analisada de forma confiável. Normalmente, os reflexos interferem na imagem e requerem uma filtragem complexa de hardware ou software.

[005] Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um método e aparelho para a iluminação e geração de imagens automatizadas de uma amostra de sangue centrifugada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] De acordo com uma modalidade da invenção, é fornecimento um processador de amostra de sangue para geração de imagens de uma amostra de sangue centrifugada incluindo um recipiente transparente com a amostra de sangue centrifugado no mesmo. Uma fonte de iluminação é posicionada para iluminar a amostra de sangue centrifugada em um ângulo oblíquo, em relação ao recipiente transparente. Uma câmera digital disposta em frente ao recipiente transparente gera imagem da amostra de sangue centrifugada e a imagem é processada para determinar as localizações relativas das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

[007] De acordo com outra modalidade da invenção, uma pipeta com um sensor de altura de nível de líquido é fornecida para determinar a localização real do topo da amostra de sangue centrifugada e para remover as camadas de componentes da mesma.

[008] De acordo com outra modalidade da invenção, é fornecido um processador para determinar as localizações reais das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

[009] Consequentemente, a detecção precisa da localização da camada leucocitária permite a coleta automatizada de qualquer uma das camadas de componentes separadas de uma amostra de sangue centrifugada. A detecção da camada leucocitária pode ser feita por imagem óptica, usando uma câmera para gerar imagens do recipiente com a amostra de sangue centrifugado e algoritmos para pós-processar a imagem da amostra de sangue centrifugado para analisar quantitativamente a localização vertical de cada camada de componente dentro do recipiente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] As características e vantagens da invenção são evidentes a partir da descrição que se segue, tomada em conjunto com os desenhos anexos, nos quais: a FIG. 1 é uma ilustração de um tubo de ensaio com uma amostra de sangue centrifugado no mesmo; a FIG. 2 é uma ilustração de um processador de amostra de sangue de acordo com a invenção; e a FIG. 3 é um diagrama de blocos esquemático das interconexões lógicas do processador de amostra de sangue.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0011] Após a centrifugação, pode-se distinguir uma camada de fluido transparente (o plasma), uma camada de fluido vermelho contendo a maior parte das células vermelhas do sangue e uma fina camada intermediária. A camada leucocitária é a fração de uma amostra de sangue anticoagulado que contém a maioria dos glóbulos brancos e plaquetas após a centrifugação do sangue em gradiente de densidade.

[0012] Com referência à Figura 1, é mostrada uma amostra de sangue após a centrifugação no tubo de ensaio 10. A amostra de sangue tem três camadas de componentes; uma camada de plasma 12 na parte superior do tubo de ensaio, uma camada de glóbulos vermelhos 14 na parte inferior do tubo de ensaio e uma camada intermediária ou leucocitária 16. Em alguns casos, uma camada leucocitária limpa tem aproximadamente 1 mm de espessura. Acima da camada leucocitária limpa está uma camada leucocitária de transição que tem aproximadamente 3-4 mm de espessura. Juntas, a camada leucocitária limpa e a camada leucocitária de transição formam uma camada leucocitária.

[0013] Normalmente, apenas a camada leucocitária limpa é desejada para o processamento. Consequentemente, primeiro a camada de plasma 12 é removida. Em seguida, a camada de transição da camada leucocitária 16 é eliminada. A camada leucocitária limpa é então colocada no topo do tubo de ensaio 10 e disponível para remoção.

[0014] Para remover adequadamente cada uma das camadas, as camadas devem ser adequadamente iluminadas e distintas. Isso pode ser realizado iluminando o tubo de ensaio 10 com uma fonte de luz e, em seguida, obtendo uma imagem do tubo de ensaio e seu conteúdo. Uma fonte de iluminação ou uma fonte de luz é usada para iluminar o conteúdo do tubo de ensaio 10. Em alguns casos, a fonte de luz pode ser uma fonte de luz monocromática, enquanto em outros casos a fonte de luz pode compreender várias fontes de luz monocromáticas que são espectralmente misturadas. Exemplos de fontes de luz monocromáticas incluem LEDs que emitem luz com um comprimento de onda inferior a 570 nm. Essas fontes de luz podem ser luz colorida produzida por um ou mais LEDs. Em outras modalidades, a fonte de luz ou múltiplas fontes de luz podem ser luz filtrada ou não filtrada.

[0015] A Figura 2 mostra um processador de amostra de sangue fornecendo uma fonte de iluminação 18 de acordo com uma modalidade da invenção. O ajuste para obter contraste ideal entre as camadas de amostra no tubo de ensaio 10 é realizado escolhendo os comprimentos de onda de luz adequados para a fonte de iluminação 18. Quando iluminada, a camada de plasma de uma amostra normalmente reflete ou emite uma luz tingida de amarelo ou âmbar com um comprimento de onda de aproximadamente 570 nm ou mais, enquanto a camada de sangue vermelho reflete uma luz vermelha com um comprimento de onda de aproximadamente 680 nm ou mais. Portanto, a fim de minimizar a reflexão e retroespalhamento das camadas de plasma e sangue vermelho da amostra, e isolar ainda mais a camada leucocitária, é vantajoso iluminar a amostra com uma fonte de luz com um comprimento de onda inferior a 570 nm. Em alguns casos, essa fonte de luz pode ser uma luz azul com comprimento de onda de 470 nm, em outros pode ser uma luz verde, enquanto em outros ainda pode ser usada uma fonte de luz ultravioleta. Em cada caso, no entanto, a fonte de luz tem um comprimento de onda inferior a 570 nm, o que maximiza a reflexão da camada leucocitária e, mais especificamente, da camada leucocitária limpa.

[0016] Em alguns casos, a iluminação ou fonte de luz 18 pode ter um LED ou outro elemento emissor de luz que emite luz com um comprimento de onda inferior a 570 nm. Em outros casos, a fonte de luz 18 pode ter vários elementos emissores de luz que emitem luz com diferentes comprimentos de onda. Estas fontes de luz multicromáticas podem, em muitos casos, maximizar a reflexão da luz pela camada leucocitária, aumentando a diferenciação entre a camada leucocitária e as camadas de plasma e glóbulos vermelhos, aumentando assim a resolução da imagem da camada leucocitária. Por exemplo, vários LEDs com diferentes comprimentos de onda podem ser usados para obter luz com diferentes matizes ou temperaturas de cor. A mistura dos comprimentos de onda da fonte de luz também pode aumentar a diferenciação entre a camada leucocitária de transição e a camada leucocitária limpa. Em particular, certos comprimentos de onda de luz aumentam a quantidade de reflexão pela camada leucocitária de transição, mas não a camada leucocitária limpa; enquanto outros comprimentos de onda de luz aumentam a quantidade de reflexão pela camada leucocitária limpa, mas não a camada leucocitária de transição. A mistura deste grupo de duas ou mais fontes de luz díspares com dois ou mais comprimentos de onda diferentes pode aumentar a reflexão da camada leucocitária de transição e da camada leucocitária limpa. Essas fontes de luz díspares podem ser fontes de luz de cores diferentes, com temperaturas ou tons de cor diferentes.

[0017] A fonte de iluminação 18 é, de preferência composta por LEDs de alta intensidade, por exemplo, Luxeon Rebel Color LEDS e, mais particularmente, as placas de 3 LED multi-LED azuis (470 nm). Em outros casos, outros LEDs, pacotes de LEDs ou fontes de luz podem ser usados. Os LEDs podem ser LEDs individuais incorporados em uma única placa de circuito ou podem ser vários chips de LED integrados em um único chip. Embora os LEDs sejam preferencialmente usados, outros métodos podem incluir uma fonte de iluminação diferente de um LED, em que a fonte não LED é passada por um ou mais filtros espectrais para isolar a luz com um comprimento de onda inferior a 570 nm.

[0018] A fonte de iluminação 18 pode ser posicionada aproximadamente 30 graus fora do eixo central do tubo de ensaio 10. Pode ser tido em consideração que qualquer número de ângulos de deslocamento (isto é, um ângulo oblíquo em relação ao tubo de ensaio) seria apropriado para a fonte de iluminação, desde que o ângulo seja suficiente para evitar reflexão e outras interferências. Por exemplo, em alguns casos, a fonte de iluminação 18 pode ser posicionada em qualquer ângulo entre 15 e 30 graus fora do eixo central do tubo de ensaio 10. Em ainda outros exemplos, a fonte de iluminação 18 pode ser posicionada em qualquer ângulo entre 45 e 30 graus fora do eixo central do tubo de ensaio 10.

[0019] Uma câmera digital 20 é posicionada oposta ao tubo de ensaio 10 para geração de imagens do tubo de ensaio 10 e a amostra de sangue em seu interior. De preferência, uma câmera colorida, em vez de uma câmera preto e branco, é usada porque uma câmera colorida pode acentuar a camada leucocitária 16. Em alguns casos, uma câmera adequada para esta finalidade pode ser a Cognex Advantage 100Series, Peça Número ADV102C da Cognex Corporation (Natick, MA). Em outros casos, qualquer câmera de alta resolução pode ser usada. Será tido em consideração que a câmera digital 20 deve ser calibrada antes da imagem. Também pode ser tido em consideração que a fonte de iluminação 18 pode ser acionada pela câmera digital 20.

[0020] Vantajosamente, quase todos os tubos de ensaio com amostras de sangue para imagens terão um rótulo. Consequentemente, a imagem da amostra de sangue pode ser feita através do lado transparente do tubo de ensaio 10 e o rótulo do tubo de ensaio pode ser usado como um refletor. O tempo de exposição para a câmera digital 20 pode ser otimizado com base no nível de saturação da câmera. Pode ser tido em consideração que a exposição para a câmera digital 20 deve ser definida abaixo do ponto de saturação para garantir uma imagem de qualidade.

[0021] Um escudo de luz 22 também pode ser fornecido para uso em tubo de ensaio de imagem 10 com a amostra de sangue em seu interior. O uso de um escudo de luz com, por exemplo, um fundo preto pode reduzir a luz ambiente, melhorando assim a imagem da amostra de sangue.

[0022] A fim de determinar a posição das camadas de componentes, o tubo de ensaio 10 com a amostra de sangue centrifugado nele é posicionado verticalmente oposto à câmera digital

20. Uma imagem do tubo de ensaio 10 e a amostra de sangue em seu interior são então capturadas pela câmera digital 20. A imagem pode então ser processada por um processador adequado 100 usando algoritmos de processamento de fotos, empregando contagem de pixels para determinar as localizações relativas das camadas de componentes dentro do tubo de ensaio 10. Um sistema de hardware/software adequado para esta aplicação pode ser um sistema de visão 2-D disponível na Cognex Corporation (Natick, MA).

[0023] A blindagem de luz 22 pode incluir uma referência externa contra a qual o tubo de ensaio 10 e a amostra de sangue em seu interior podem ser geradas. Isso fornecerá a localização direta das camadas da imagem. A referência externa também pode ser incorporada ao processador de amostra de sangue ou ao suporte em que o tubo de ensaio está.

[0024] O processador 100 do processador de amostra de sangue também pode controlar uma pipeta automática 24. A pipeta automática possui um sensor de altura de nível de líquido 26, para detectar a superfície do fluido da amostra de sangue. Uma vez que a localização real da superfície do fluido da amostra de sangue é conhecida, as localizações relativas podem ser usadas para definir as localizações reais de cada camada de componente da amostra de sangue. Como as dimensões do tubo de ensaio 10 são conhecidas, a pipeta 24 pode ser inserida na amostra de sangue para um local desejado e um volume de líquido aspirado igual ao volume calculado de uma camada particular. Normalmente, as camadas são aspiradas por sua vez, começando com a camada superior ou de plasma.

[0025] Como um exemplo, se for desejado extrair a camada leucocitária para análise, a pipeta pode ser usada para aspirar a camada de plasma 12 a um nível logo acima do limite superior da camada leucocitária 16. A pipeta 24 pode então ser usada para aspirar a camada leucocitária 16 a um nível logo abaixo do limite inferior da camada leucocitária 16. A camada leucocitária 16 da amostra de sangue na pipeta 24 pode então ser transferida para outro recipiente para análise.

[0026] Em um caso em que uma amostra da camada leucocitária limpa é necessária para análise, a camada de plasma 12 pode ser aspirada e, em seguida, a camada de transição da camada leucocitária 16 pode ser aspirada. Finalmente, a camada leucocitária limpa pode ser aspirada e transferida para outro recipiente para análise.

[0027] Pode ser tido em consideração que os locais de aspiração para a camada leucocitária dependerão de uma aplicação particular. Os ensaios que usam o processamento secundário a jusante podem permitir a coleta acima e abaixo da camada leucocitária para obter a totalidade da camada. As aplicações de coleta de biobanco podem “proteger” a camada leucocitária, passando pela camada superior de plasma e parando antes da camada inferior de glóbulos vermelhos para garantir o mínimo de contaminação.

[0028] A Figura 3 mostra como os vários componentes do processador de amostra de sangue podem ser conectados logicamente. O processador de amostra 100 é conectado diretamente à fonte de iluminação 18, câmera digital 20, pipeta 24 e sensor de nível de altura de líquido 26. O processador 100 também pode ser fornecido com uma interface de usuário 102. O processador 100 também pode controlar a iluminação do tubo de ensaio 10 com a amostra de sangue durante a geração de imagens. Deste modo, a fonte de iluminação 18 pode ser estroboscópica ou constante. Em uma modalidade preferida, o processador de amostra 100 e a interface de usuário 102 podem ser fornecidos por um sistema de computador. Em alguns casos, a fonte de iluminação 18, câmera 20, pipeta 24, sensor de nível de altura de líquido 26 e processador 100 podem ser incluídos em um único sistema ou máquina que pode ser usado para analisar amostras de sangue. Este único sistema pode incluir ainda uma interface de usuário 102 que pode ser usada para controlar a única máquina. Em alguns casos, as etapas do método podem ser automatizadas por um programa executado pelo processador 100 da máquina.

[0029] Entenda-se claramente que a invenção não deve ser limitada aos detalhes da modalidade acima, que é descrita apenas a título de exemplo.

Muitas variações são possíveis dentro do escopo das Reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processador de Amostra de Sangue, para gerar imagem de uma amostra de sangue centrifugado, caracterizado por que compreende: um recipiente transparente contendo a amostra de sangue centrifugada no mesmo; uma fonte de iluminação para iluminar a amostra de sangue centrifugada e posicionada para iluminar a amostra de sangue centrifugada num ângulo oblíquo, em relação ao recipiente transparente; uma câmera digital disposta oposta ao recipiente transparente para a geração de imagens da amostra de sangue centrifugada; um processador para processar a imagem da amostra de sangue centrifugada e determinar os locais relativos das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

2. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda um sensor de altura de nível de líquido para determinar uma localização real da parte superior da amostra de sangue centrifugada.

3. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o processador determina os locais reais das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

4. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a fonte de iluminação usa luz monocromática abaixo de um comprimento de onda amarelo.

5. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação

1, caracterizado por que a fonte de iluminação usa vários comprimentos de onda de luz abaixo de um comprimento de onda amarelo.

6. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que os vários comprimentos de onda de luz são selecionados para destacar cada uma de uma camada leucocitária limpa e uma camada de transição.

7. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a fonte de iluminação ilumina a amostra de sangue centrifugada em um ângulo de 30 graus em relação ao recipiente transparente.

8. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a câmera digital é uma câmera digital colorida.

9. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda uma referência externa para determinar as localizações reais das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

10. Processador de Amostra de Sangue, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda uma pipeta para remoção das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada do recipiente transparente.

11. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, caracterizado por que compreende: colocar da amostra de sangue num recipiente transparente; iluminar a amostra de sangue centrifugada com uma fonte de iluminação posicionada num ângulo oblíquo ao recipiente transparente; gerar imagem da amostra de sangue centrifugada com uma câmera digital disposta em frente ao recipiente transparente; processar a imagem da amostra de sangue centrifugada e determinar as localizações relativas das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

12. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda determinar uma localização real da parte superior da amostra de sangue centrifugada.

13. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que compreende ainda determinar as localizações reais das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

14. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda iluminar a amostra de sangue centrifugada usando luz monocromática abaixo de um comprimento de onda amarelo.

15. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda iluminar a amostra de sangue usando vários comprimentos de onda de luz abaixo de um comprimento de onda amarelo.

16. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que compreende ainda selecionar os vários comprimentos de onda de luz para destacar cada uma dentre a camada de leucocitário limpa e uma camada de transição.

17. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda iluminar a amostra de sangue centrifugada em um ângulo de 30 graus com o recipiente transparente.

18. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda o uso de uma câmera digital colorida para a câmera digital.

19. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda o uso de uma referência externa para determinar os locais reais das camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada.

20. Método de Análise de Amostra de Sangue Centrifugada, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda o uso de uma pipeta para remover camadas de componentes da amostra de sangue centrifugada do recipiente transparente.