BR112021005976A2 - modulação de microesferas de polímero para processamento de dna - Google Patents

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Abstract

MODULAÇÃO DE MICROESFERAS DE POLÍMERO PARA PROCESSAMENTO DE DNA. A presente invenção se refere a sistemas, métodos e composições que se referem à preparação de microesferas que encapsulam biomoléculas para a realização de reações sequenciais nas biomoléculas. Algumas modalidades incluem a preparação de reações de ácido nucléico no interior da microesfera, sendo que a microesfera inclui poros que permitem a difusão de moléculas para dentro ou para fora das microesferas enquanto retêm outras moléculas de interesse.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "MODULAÇÃO DE MICROESFERAS DE POLÍMERO PARA PROCESSAMENTO DE DNA"
CAMPO
[0001] Os sistemas, métodos e composições aqui fornecidos se referem a microesferas de polímero, métodos de encapsulação de biomoléculas dentro das microesferas de polímero e métodos de uso das microesferas de polímero para conduzir ensaios nas biomoléculas encapsuladas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de índice espacial e preparação da biblioteca de ácidos nucleicos.
PLANO DE FUNDO
[0002] A detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos presentes em uma amostra biológica tem sido usada, por exemplo, como um método para identificar e classificar micro-organismos, diagnosticar doenças infecciosas, detectar e caracterizar anormalidades genéticas, identificar alterações genéticas associadas a vários distúrbios, como câncer, estudar a suscetibilidade genética a uma doença ou medir respostas a vários tipos de tratamentos. A detecção de sequências de ácidos nucleicos em uma amostra biológica exige múltiplas reações enzimáticas para por fim determinar a sequência de ácidos nucleicos ou gerar uma biblioteca de ácidos nucleicos.
[0003] A realização de múltiplas reações enzimáticas em uma única célula não é confiável devido aos desafios de confinamento e acesso de biomoléculas intracelulares dentro de uma única célula em múltiplos ensaios. Muitos ensaios baseados em células não conseguem garantir moléculas intracelulares, resultando em perda de biomoléculas durante o desempenho do ensaio.
SUMÁRIO
[0004] Algumas modalidades se referem a uma microesfera de polímero para realizar múltiplas reações de coensaios. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero compreende um precursor de polímero hidrogel, um reticulador e uma biomolécula disposta dentro da microesfera de polímero, sendo que a microesfera compreende poros que permitem a difusão de um ou mais reagentes através da microesfera enquanto retém a biomolécula. Em algumas modalidades, a microesfera é uma microesfera de hidrogel porosa ou uma microesfera oca porosa. Em algumas modalidades, a microesfera compreende múltiplas camadas de polímero, sendo que cada camada tem uma densidade de poro e um tamanho de poro distintos. Em algumas modalidades, os poros são modulados em tamanho com base em alterações na carga, pH ou temperatura.
[0005] Algumas modalidades se referem a um método de realização de múltiplos coensaios sequenciais em uma biomolécula encapsulada no interior de uma microesfera de polímero. Em algumas modalidades, o método inclui a obtenção de uma microesfera de polímero mediante encapsulação de uma biomolécula, sendo que a microesfera de polímero compreende um precursor de polímero hidrogel, um reticulador e uma biomolécula disposta dentro da microesfera de polímero, sendo que a microesfera compreende poros que permitem a difusão de um ou mais reagentes através da microesfera enquanto retém a biomolécula. Em algumas modalidades, o método inclui adicionalmente colocar a célula única sequencialmente em contato com reagentes para realizar múltiplos coensaios sequenciais. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente modular o tamanho dos poros da microesfera de polímero através do ajuste da carga, pH ou temperatura. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero compreende múltiplas camadas de polímero, e cada camada de polímero tem poros de tamanhos distintos. Em algumas modalidades, o tamanho dos poros de cada camada de polímero é especificamente modulado pela alteração da carga, pH ou temperatura. Em algumas modalidades, os múltiplos coensaios sequenciais incluem lise, análise de DNA, análise de RNA, análise de proteína, tagmentação, amplificação de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, preparação da biblioteca de DNA, ensaio para cromatina acessível por transposase (ATAC-seq - "transposase accessible chromatin using sequencing"), transposição conservadora de contiguidade (CPT-seq), sequenciamento indexado combinatório de célula única (SCI-seq), ou amplificação de genoma de célula única, ou qualquer combinação dos mesmos realizada sequencialmente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0006] A Figura 1A é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade para indexação espacial de DNA longo por preparação e semeadura de biblioteca de células em fluxo.
[0007] A Figura 1B é um diagrama esquemático que ilustra a indexação espacial usando microesferas de polímero que encapsulam moléculas de DNA longo. Reagentes podem ser usados nas microesferas de polímero para gerar espacialmente uma biblioteca em uma superfície de célula de fluxo.
[0008] A Figura 2 é um diagrama de fluxo que representa um método de encapsulação de DNA longo dentro de uma microesfera de polímero e preparação de uma biblioteca dentro da microesfera de polímero, que pode ser agrupada e sequenciada em um dispositivo de célula de fluxo.
[0009] A Figura 3 é um diagrama esquemático que ilustra o fluxo de trabalho do sequenciamento de DNA de DNA longo encapsulado dentro de microesferas de polímero, incluindo fragmentos de DNA de cerca de 100 kb (sem uma etapa de amplificação por deslocamento múltiplo (MDA - "multiple displacement amplification") (painel (a)) ou com uma etapa de MDA (painel (b)) antes da tagmentação e fragmentos de DNA de cerca de 10 a 20 kb (painel (c)).
[0010] A Figura 4 é um gráfico que representa "strobe reads" (leituras de diversas orientações de um mesmo fragmento de DNA) de dados de sequenciamento de indexação espacial de hidrogel de DNA longo de um fragmento de DNA de 100 kb sem MDA.
[0011] A Figura 5 mostra um gráfico de linha de leituras ligadas de indexação espacial de hidrogel de DNA longo em fragmentos de DNA de 100 kb com MDA.
[0012] A Figura 6 mostra um gráfico de linha de leituras ligadas de indexação espacial de hidrogel de DNA longo em fragmentos de DNA de 10 kb com MDA.
[0013] As Figuras 7A e 7B representam gráficos de linha de leituras espaciais para DNA longo encapsulado dentro de uma microesfera de polímero. A Figura 7A mostra as leituras espaciais para células encapsuladas dentro de uma microesfera de polímero, e a inserção representa um micrógrafo que mostra uma célula dentro da microesfera de polímero. A Figura 7B mostra as leituras espaciais dos fragmentos de DNA longo encapsulados no interior de uma microesfera de polímero, e a inserção representa um micrógrafo que mostra os fragmentos encapsulados dentro das microesferas.
[0014] A Figura 8 representa um micrógrafo que mostra a identificação de espécies microbianas encapsuladas dentro de uma microesfera de polímero. A microesfera de polímero encapsulou várias espécies microbianas, e leituras de sequenciamento espacial foram realizadas para identificar os micróbios.
[0015] A Figura 9 ilustra um gráfico que mostra a distribuição de leituras de código de barras para encapsulação de DNA longo dentro de microesferas de polímero.
[0016] A Figura 10A ilustra um gráfico que mostra leituras curtas e leituras ligadas de uma única rodada para uma célula de E. coli encapsulada no interior de uma microesfera de polímero. Conforme mostrado na figura, as leituras ligadas abrangem regiões de repetição e podem melhorar a montagem da sequência de novo. A Figura 10B mostra um micrógrafo que representa leituras espacialmente ligadas e leituras intersticiais curtas.
[0017] A Figura 11A é um diagrama esquemático que ilustra a difusão de moléculas em uma microesfera de polímero com base no tamanho dos poros e na densidade dos poros. A Figura 11B é um diagrama esquemático que ilustra a difusão de moléculas fora de uma microesfera de polímero.
[0018] A Figura 12 é um diagrama esquemático que ilustra a retenção de bibliotecas de ácido nucleico dentro de uma microesfera de polímero.
[0019] As Figuras 13A e 13B ilustram gráficos que mostram a difusão de ácido nucleico em uma microesfera de polímero como uma função do tamanho do ácido nucleico. Os gráficos representam a entrada de pequenos amplicons (220 bp a 1 kbp) dentro de microesferas de polímero, enquanto amplicons mais longos não se difundem para dentro das microesferas de polímero.
[0020] A Figura 14 representa micrografias de microesferas ocas porosas, que mostram uma amplificação baseada em PCR dentro das microesferas ocas porosas tanto para 200 pares de bases quanto para 5.000 pares de bases de fragmentos de DNA.
[0021] A Figura 15 ilustra um diagrama esquemático que mostra uma microesfera de polímero multicamadas com cada camada tendo diferentes tamanhos de poro, e os tamanhos de poro de cada camada podem ser modulados separadamente com base em alterações nas condições ambientais.
[0022] As Figuras 16A a 16C representam microesferas de polímero que têm um envoltório estabilizado com um núcleo de poliacrilamida sacrificial. A Figura 16A representa esquematicamente a estrutura da microesfera de polímero, que tem um envoltório de N,N'-(1,2-di-hidroxietileno)bisacrilamida (DHEBA) mais acrilato-PEG e peroxidissulfato de potássio (KPS). O núcleo é um núcleo de carga, como PEG ou poliacrilamida, misturado com a amostra (célula ou DNA). A Figura 16B representa a formação do envoltório ao redor de uma microesfera. A Figura 16C mostra fotomicrografias dos envoltórios de DHEBA com núcleos de poliacrilamida sacrificial.
[0023] As Figuras 17A a 17C representam microesferas de polímero que têm um envoltório estabilizado com um núcleo de agarose sacrificial. A Figura 17A representa esquematicamente a estrutura do envoltório de DHEBA com um núcleo de agarose misturado com a amostra (célula ou DNA). A Figura 17B mostra micrografias dos envoltórios de DHEBA com núcleos de agarose. A Figura 17C mostra micrografias de fusão de temperatura de envoltórios de DHEBA que têm núcleos de agarose.
[0024] As Figuras 18A a 18C representam uma gelificação iniciada por fluorescência. Conforme mostrado na Figura 18A, as células vivas são colocadas em contato com uma substância de iniciação de gelificação, FITC-AETC. As células revestidas com FITC-AETC são submetidas a radiação e a monômeros, o que forma microesferas de gel ao redor das células. A Figura 18B representa micrografias, incluindo microscopia de excitação de células tratadas com FITC-AETC, em comparação com células de controle não tratadas com FITC-AETC. A Figura 18C mostra micrografias da gelificação iniciada por FITC de células sob várias condições.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0025] Na descrição detalhada a seguir é feita referência aos desenhos anexos, que formam uma parte da mesma. Nos desenhos, símbolos similares identificam tipicamente componentes similares, a menos que o contexto determine de outro modo. As modalidades ilustrativas descritas na descrição detalhada, nos desenhos e nas reivindicações não se destinam a serem limitadoras. Outras modalidades podem ser utilizadas, e outras alterações podem ser feitas, sem que se afaste do espírito ou escopo do assunto aqui apresentado. Será prontamente entendido que os aspectos da presente revelação, conforme genericamente aqui descritos, e ilustrados nas figuras, podem ser dispostos, substituídos, combinados, separados e projetados em uma ampla variedade de configurações diferentes, todas as quais são explicitamente contempladas na presente invenção.
[0026] As modalidades se referem a composições, sistemas e métodos para encapsular biomoléculas dentro de uma microesfera de polímero e realizar um ou mais testes nas biomoléculas encapsuladas. A microesfera de polímero retém as biomoléculas dentro da microesfera, mas permite a difusão de moléculas menores, como reagentes, para dentro e para fora da microesfera de polímero enquanto retém a biomolécula que está sendo analisada. Conforme aqui revelado, a microesfera de polímero inclui poros, e o tamanho e a densidade dos poros são modulados para controlar o tamanho ou as moléculas que se difundem para dentro ou para fora das microesferas de polímero.
[0027] Em uma modalidade, a microesfera de polímero é uma matriz de hidrogel poroso uniforme que encapsula ou contém uma ou mais biomoléculas. Em outra modalidade, a microesfera de polímero é uma microesfera oca que tem um envoltório de hidrogel poroso e um interior oco, com a biomolécula encapsulada dentro do interior oco. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero, seja uma matriz de hidrogel poroso uniforme ou uma microesfera oca, pode incluir múltiplas camadas de polímero, sendo que cada camada de polímero é uma matriz distinta que tem propriedades distintas, como tamanho dos poros. Em algumas modalidades, cada camada de polímero é modulada de maneira controlável para ajustar o tamanho do poro de cada camada de polímero, permitindo, assim, que um usuário controle a difusão de moléculas para dentro e para fora de uma microesfera de polímero de uma maneira gradual controlável. Em algumas modalidades, cada camada de polímero é modulada de maneira controlada pela alteração das condições ambientais, como pH, carga ou temperatura, de modo que as alterações nas condições ambientais modulam o tamanho dos poros da microesfera ou o envoltório da microesfera, e permitem, assim, a liberação da ou a entrada na microesfera por moléculas ou reagentes de uma maneira controlável e gradual.
[0028] As modalidades aqui descritas incluem sistemas e métodos confiáveis e de alto rendimento para a realização de reações sequenciais em uma biomolécula encapsulada dentro de uma microesfera de polímero. Os métodos e sistemas aqui descritos se referem à realização de um ou mais testes na biomolécula encapsulada, incluindo, por exemplo, lise, análise de DNA, análise de RNA, análise de proteína, tagmentação, amplificação de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, preparação da biblioteca de DNA, ensaio para cromatina acessível por transposase (ATAC-seq - "transposase accessible chromatin using sequencing"), transposição conservadora de contiguidade (CPT-seq), sequenciamento indexado combinatório de célula única (SCI-seq), ou amplificação de genoma de célula única, ou qualquer combinação dos mesmos realizada sequencialmente.
[0029] Uma modalidade é um método de encapsulação de uma biomolécula dentro de uma microesfera de polímero, carregamento das microesferas de polímero que encapsulam a biomolécula em um dispositivo de célula de fluxo, preparação de uma biblioteca de ácidos nucleicos, liberação da biblioteca preparada em uma superfície do dispositivo de célula de fluxo e agrupamento e sequenciamento da biblioteca liberada. Em algumas modalidades, a biomolécula é uma célula, uma proteína, um ácido nucleico, um DNA, um RNA ou qualquer derivado ou análogo dos mesmos.
[0030] Em algumas modalidades, a preparação de uma biblioteca inclui a tagmentação de DNA isolado dentro da microesfera de polímero. A tagmentação do DNA encapsulado cliva sequências de DNA mais longas em fragmentos de tagmentação mais curtos, que são então usados para gerar agrupamentos de DNA sobre uma superfície da célula de fluxo. Um agrupamento é um produto de um fragmento de tagmentação do DNA longo, cada um dos quais podendo ser sequenciado com o uso de sequenciamento por síntese (SBS), por exemplo. Um grupo de agrupamentos de uma única molécula de DNA longo é chamado na presente invenção de "ilha de DNA longo". Em algumas modalidades, uma única microesfera de polímero pode encapsular uma única molécula de DNA longo ou múltiplas moléculas de DNA longo. Cada molécula de DNA longo gera uma única ilha de DNA longo. Os agrupamentos de todas as ilhas de DNA longo dentro de uma única microesfera de polímero são chamados na presente invenção de "nuvem de agrupamentos". Dessa forma, uma nuvem de agrupamentos representa todos os agrupamentos dentro de uma única microesfera de polímero e pode incluir muitas ilhas de DNA longo (sendo que cada ilha de DNA longo representa uma única molécula de DNA longo), e cada ilha de DNA longo inclui múltiplos agrupamentos.
[0031] As microesferas podem incluir polímeros hidrogéis e reticuladores que são misturados na presença de uma biomolécula, como um ácido nucléico como uma molécula de DNA longo, ou uma fonte que contém um ácido nucléico, que então formam microesferas de polímero que encapsulam a biomolécula. Em algumas modalidades, a fonte de ácido nucleico é uma célula.
[0032] Em algumas modalidades, os poros da microesfera permitem a difusão de uma molécula que é menor que 1.000 pares de base, por exemplo, uma molécula que é menor que 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 pares de base ou menos. ou uma quantidade dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados, mas retém compostos (ou não permite a difusão de compostos) que são maiores que os valores anteriormente mencionados. Dessa forma, em algumas modalidades, as microesferas de polímero retêm mais que (ou não permitem a difusão de compostos maiores que) 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500,
2.000, 3.000, 4.000 ou 5.000 pares de bases, ou mais, ou uma quantidade dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados.
[0033] Algumas modalidades incluem métodos de uso das microesferas que encapsulam uma biomolécula para realizar reações de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, indexação espacial de alto rendimento de moléculas de DNA longo. Conforme mostrado na Figura 1A, a preparação da biblioteca a partir de uma molécula de DNA longo pode ser prontamente feita por agrupamento e semeadura dos agrupamentos a partir de uma única molécula de DNA longo como um "emplastro de agrupamento" sobre a superfície, que pode então ser lida e espacialmente mapeada. Para uso na presente invenção, o termo "DNA longo" pode incluir fragmentos de DNA que são maiores que 300 pares de bases. O termo "fragmentos de DNA longo", como usado aqui, se referem ao DNA de um comprimento maior que 1 kb, 2,5 kb, 5 kb ou mais, como 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ou 500 kb ou mais, incluindo uma quantidade dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados.
[0034] Algumas modalidades incluem métodos de uso de uma única microesfera para fragmentar uma amostra genômica em uma série de fragmentos de DNA longo. Aquela única microesfera pode, então, ser aderida a um local específico em uma célula de fluxo onde os fragmentos de DNA longo são depositados, de modo que cada um dos fragmentos de DNA longo é posicionado adjacente entre si em uma superfície de célula de fluxo. A célula de fluxo pode, então, ser usada dentro de um sistema de sequenciamento de nucleotídeos, como um sistema ILLUMINA HISEQ, para determinar a sequência de nucleotídeos a partir de cada fragmento de DNA longo. Uma vez que os fragmentos de DNA são dispostos adjacentes uns aos outros sobre a superfície de célula de fluxo, o sistema pode usar esses dados de localização espacial para reconstruir de maneira mais eficiente a sequência de nucleotídeos final do DNA genômico original. O sistema pode depositar leituras espacialmente colocalizadas diretamente a partir de células únicas, fragmentos de DNA longo ou cromossomos. Em algumas modalidades, os métodos permitem um fluxo de trabalho de baixa entrada e isento de PCR para preparação da biblioteca. Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados sem a necessidade de uso de código de barras molecular.
[0035] Algumas modalidades se referem a métodos de preparação de uma microesfera de polímero que encapsula uma biomolécula. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero que encapsula o DNA longo pode ser usada para processar o genoma celular e realizar a preparação da biblioteca de DNA dentro da microesfera. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero que encapsula um fragmento de DNA longo encapsula uma única célula, que pode ser usada para processar o DNA genômico celular e realizar a preparação da biblioteca de DNA dentro da microesfera.
[0036] Em algumas modalidades, o tamanho de poro da microesfera de polímero pode ser manipulado para permitir a difusão de enzimas, produtos químicos e iniciadores (primers) de tamanho menor (< 50 bps), enquanto retém ácidos nucleicos maiores (> 300 bps), de modo que os fragmentos de DNA longo e a biblioteca de DNA produzida possam ser retidos dentro das microesferas de polímero durante o processamento. Em algumas modalidades, iniciadores específicos podem ser quimicamente ligados dentro da matriz de microesfera de polímero para hibridizar e processar um DNA genômico específico. A biblioteca de DNA de uma única célula pode, então, ser liberada para uma área específica, por exemplo, sobre a superfície da célula de fluxo para semeadura da biblioteca. Subsequentemente, isso resulta em uma distribuição espacial de "agrupamentos de DNA" na célula de fluxo que se origina dos fragmentos de DNA longo encapsulados, simplificando, assim, o alinhamento da leitura durante o pós-processamento.
[0037] Para uso na presente invenção, o termo "microesfera de polímero" se refere a uma microesfera de hidrogel porosa ou uma microesfera oca porosa. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero é preparada como uma microesfera de hidrogel porosa. Uma microesfera de hidrogel porosa é uma microesfera que tem uma matriz porosa de uniformidade relativa por toda a microesfera. Conforme descrito na presente invenção, uma microesfera de hidrogel porosa encapsula uma biomolécula e inclui poros que permitem a difusão de moléculas para dentro ou para fora da microesfera de hidrogel porosa. Os poros podem também ser modulados para alterar o tamanho dos poros com base em uma alteração nas condições ambientais, como pH, temperatura ou carga, permitindo, assim, a difusão de moléculas para dentro ou para fora das microesferas de hidrogel porosas de uma maneira controlável. Em algumas modalidades, uma microesfera de hidrogel porosa pode incluir um ou mais tipos de polímeros, cada polímero tendo um tamanho de poro e uma densidade de poro distintos, e cada polímero sendo modulado separadamente para permitir a difusão de moléculas de tamanhos diferentes com base em uma alteração nas condições ambientais.
[0038] Em algumas modalidades, a microesfera de polímero é preparada como uma microesfera oca porosa. Uma microesfera oca porosa é uma microesfera que tem um envoltório de polímero poroso, mas com um interior oco. Conforme descrito na presente invenção, uma microesfera oca porosa encapsula uma biomolécula dentro do interior oco. Os poros do envoltório de polímero permitem a difusão de moléculas para dentro ou para fora do interior oco e podem ser modulados para alterar o tamanho dos poros com base em uma alteração nas condições ambientais, como pH, temperatura ou carga, permitindo, assim, a difusão de moléculas para dentro ou para fora do interior oco de uma maneira controlável. Em algumas modalidades, uma microesfera oca porosa inclui múltiplos envoltórios de polímero poroso, cada envoltório tendo um tamanho de poro e uma densidade de poro distintos, e cada envoltório sendo modulado separadamente para permitir a difusão de moléculas de tamanhos diferentes com base em uma alteração nas condições ambientais. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 15, uma microesfera oca porosa pode ter um interior oco (ou núcleo oco) com múltiplos envoltórios de polímero. A Figura 15 representa uma microesfera oca porosa que tem três envoltórios de polímero poroso, chamados na Figura 15 de Polímero 1, Polímero 2 e Polímero 3. As moléculas são retidas dentro da microesfera oca porosa, e a modulação de um primeiro polímero resulta na difusão de uma primeira molécula através do envoltório de polímero. A modulação de um segundo polímero resulta na difusão de uma segunda molécula através do envoltório de polímero. O versado na técnica reconhecerá que o exemplo representado na Figura 15 é exemplificador, e que múltiplos envoltórios de polímero poroso podem ser usados para controlar a difusão de moléculas para dentro ou para fora da microesfera oca porosa. Por exemplo, uma microesfera oca porosa pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais envoltórios de polímero distintos, cada envoltório de polímero tendo um tamanho de poro e uma densidade de poro específicos, e cada envoltório de polímero sendo capaz de ser modulado para controlar a difusão de uma molécula para dentro ou para fora da microesfera oca porosa.
[0039] Como usado aqui, o termo "reagente" descreve um agente ou uma mistura de dois ou mais agentes úteis para reagir com, interagir com, diluir ou adicionar a uma amostra, e pode incluir agentes usados em reações de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, tampões, produtos químicos, enzimas, polimerase, iniciadores com um tamanho menor que 50 pares de base, ácidos nucleicos de gabarito, nucleotídeos, marcadores, corantes ou nucleases. Em algumas modalidades, o reagente inclui lisozima, proteinase K, hexâmeros aleatórios, polimerase (por exemplo, DNA polimerase Φ29, Taq polimerase, Bsu polimerase), transposase (por exemplo, Tn5), iniciadores (por exemplo, sequências adaptadoras P5 e P7), ligase, enzima catalisadora, desoxinucleotídeos trifosfatos, tampões ou cátions divalentes. Microcápsulas de polímero que encapsulam biomoléculas
[0040] Uma modalidade inclui uma microesfera que inclui um polímero hidrogel e uma biomolécula. Para uso na presente invenção, o termo "hidrogel" se refere a uma substância formada quando um polímero orgânico (natural ou sintético) é reticulado por meio de ligações covalentes, iônicas ou de hidrogênio para criar uma estrutura tridimensional de retícula aberta que aprisiona moléculas de água para formar um gel. Em algumas modalidades, o hidrogel pode ser um hidrogel biocompatível. Como usado aqui, o termo "hidrogel biocompatível" se refere a um polímero que forma um gel que não é tóxico para células vivas e permite uma difusão suficiente de oxigênio e nutrientes para que células aprisionadas mantenham a viabilidade. Em algumas modalidades, o polímero hidrogel inclui de 60 a 90% de fluido, como água, e de 10 a 30% de polímero. Em certas modalidades, o teor de água do hidrogel é de cerca de 70 a 80%.
[0041] Os hidrogéis podem ser preparados pela reticulação de biopolímeros hidrofílicos ou polímeros sintéticos. Dessa forma, em algumas modalidades, o hidrogel pode incluir um reticulador. Como usado aqui, o termo "reticulador" se refere a uma molécula que pode formar uma rede tridimensional quando reagida com os monômeros base adequados. Exemplos dos polímeros hidrogéis, que podem incluir um ou mais reticuladores, incluem, mas não se limitam a, hialuronanos, quitosanos, ágar, heparina, sulfato, celulose, alginatos (incluindo sulfato de alginato), colágeno, dextranos (incluindo sulfato de dextrano), pectina, carragena, polilisina, gelatinas (incluindo gelatina tipo A), agarose, (met)acrilato- oligolactídeo-PEO-oligolactídeo-(met)acrilato, copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), poli(fosfazeno), poli(metacrilatos), poli(N-vinil pirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G), poli(etilenoimina), polietilenoglicol (PEG)-tiol, acrilato de Peg, maleimida (MAL), PEG/MAL, acrilamida, N,N'-bis(acriloil)cistamina, PEG, óxido de polipropileno (PPO), ácido poliacrílico, poli(metacrilato de hidroxietila) (PHEMA), poli(metacrilato de metila) (PMMA), poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), poli(ácido vinilsulfônico) (PVSA), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutâmico), bisacrilamida, diacrilato, dialilamina, trialilamina, divinil sulfona, dialil éter de dietilenoglicol, diacrilato de etilenoglicol, diacrilato de polimetilenoglicol, diacrilato de polietilenoglicol, trimetacrilato de trimetilopropano, triacrilato de trimetilol etoxilado, tetracrilato de pentaeritritol etoxilado ou combinações dos mesmos. Dessa forma, por exemplo, uma combinação pode incluir um polímero e um reticulador, por exemplo, polietilenoglicol (PEG)-tiol/PEG- acrilato, acrilamida/N,N'-bis(acriloil)cistamina (BACy), PEG/óxido de polipropileno (PPO) ou N,N'-(1,2-di-hidroxietileno)bisacrilamida (DHEBA).
[0042] Em algumas modalidades, um reticulador forma uma ligação de dissulfeto no polímero hidrogel, ligando, assim, os polímeros hidrogéis. Em algumas modalidades, os polímeros hidrogéis formam uma matriz de hidrogel ou um envoltório de polímero que tem poros. Os poros são capazes de reter moléculas suficientemente grandes dentro da microesfera de polímero, por exemplo, fragmentos de DNA longo, mas permitem que pequenos materiais, como reagentes, passem através dos poros, passando, assim, para dentro e para fora das microesferas de polímero. Em algumas modalidades, o tamanho dos poros é ajustado finamente mediante a variação da razão entre a concentração de polímero e a concentração de reticulador. Em algumas modalidades, a razão entre polímero e reticulador é 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 ou 1:30, ou uma razão dentro de uma faixa definida por quaisquer duas das razões anteriormente mencionadas. Em algumas modalidades, funções adicionais como iniciador de DNA ou grupos químicos carregados podem ser enxertadas na matriz polimérica para satisfazer os requisitos de diferentes aplicações.
[0043] Além disso, em algumas modalidades, os poros podem ser modulados, ajustados, variados, modificados, adaptados ou feitos sob medida para o tamanho ou a densidade mediante alteração das condições ambientais nas quais as microesferas de polímero estão localizadas, incluindo mediante alteração do pH, da carga ou da temperatura. O ajuste dos poros pode ser feito de uma maneira controlável fazendo-se alterações incrementais ao ambiente, permitindo, assim, a difusão de moléculas de uma maneira controlável.
[0044] Para uso na presente invenção, o termo "porosidade" significa o volume fracionado (adimensional) de um hidrogel que é composto de espaço aberto, por exemplo, poros ou outras aberturas. Portanto, a porosidade mede os espaços vazios em um material e é uma fração de volume de espaços vazios em relação ao volume total, como uma porcentagem entre 0 e 100% (ou entre 0 e 1). A porosidade do hidrogel pode variar de 0,5 a 0,99, de cerca de 0,75 a cerca de 0,99, ou de cerca de 0,8 a cerca de 0,95.
[0045] Os hidrogéis podem ter qualquer tamanho de poro. Para uso na presente invenção, o termo "tamanho de poro" se refere a um diâmetro ou um diâmetro efetivo de uma seção transversal dos poros. O termo "tamanho de poro" pode também se referir a um diâmetro médio ou um diâmetro efetivo médio de uma seção transversal dos poros, com base nas medições de uma pluralidade de poros. O diâmetro efetivo de uma seção transversal que não é circular é igual ao diâmetro de uma seção transversal circular que tem a mesma área da seção transversal que a da seção transversal não circular. Em algumas modalidades, o hidrogel pode dilatar quando o hidrogel é hidratado. Os tamanhos dos tamanhos dos poros podem, então, mudar dependendo do teor de água no hidrogel. Em algumas modalidades, os poros do hidrogel podem ter um poro de tamanho suficiente para reter biomoléculas dentro da microesfera de polímero, mas que possibilite que reagentes passem através dos mesmos, e podem ser ajustados conforme descrito aqui para permitir que as moléculas passem através da mesma de maneira controlável.
[0046] Em algumas modalidades, o reticulador é um reticulador reversível. Em algumas modalidades, um reticulador reversível é capaz de reticular reversivelmente o polímero hidrogel e é capaz de ser não reticulado na presença de um fragmentador. Em algumas modalidades, um reticulador pode ser clivado pela presença de um agente redutor, por temperatura elevada ou por um campo elétrico. Em algumas modalidades, o reticulador reversível pode ser N,N'-bis(acriloil)cistamina, um reticulador reversível para géis de poliacrilamida, sendo que uma ligação dissulfeto pode ser rompida na presença de um agente redutor adequado. Em algumas modalidades, o contato do reticulador com um agente redutor cliva as ligações dissulfeto do reticulador, rompendo as microesferas de polímero. As microesferas de polímero degradam e liberam o conteúdo, como os ácidos nucléicos que foram retidos nas mesmas. Em algumas modalidades, o reticulador é clivado mediante o aumento da temperatura para mais de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100°C. Em algumas modalidades, o reticulador é clivado colocando-se as microesferas de polímero em contato com um agente redutor. Em algumas modalidades, os agentes redutores incluem compostos de fosfina, fosfinas solúveis em água, fosfinas e sais contendo nitrogênio e derivados dos mesmos, ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT) (isômeros cis e trans, respectivamente, de 2,3-di- hidróxi-1,4-ditiolbutano), 2-mercaptoetanol ou β-mercaptoetanol (BME), 2- mercaptoetanol ou aminoetanotiol, glutationa, tioglicolato ou ácido tioglicólico, 2,3- dimercaptopropanol, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris(hidroximetil)fosfina (THP) ou ácido P-[tris(hidroximetil)fosfina] propiônico (THPP).
[0047] Em algumas modalidades, a elevação da temperatura para aumentar a difusão ou o contato com um agente redutor degrada o reticulador, liberando, assim, uma biomolécula encapsulada ou uma molécula derivada da mesma da microesfera de polímero.
[0048] Em algumas modalidades, a reticulação do reticulador estabelece os poros dentro da microesfera de polímero. Em algumas modalidades, o tamanho dos poros nas microesferas de polímero é regulável e formulado para encapsular biomoléculas, como fragmentos de DNA maiores que cerca de 5.000 pares de bases, mas permitem que partículas menores, como reagentes, ou ácidos nucleicos de tamanho menor que cerca de 50 pares de bases, como iniciadores, passem através dos poros, conforme mostrado na Figura 1B. Em algumas modalidades, os reagentes incluem reagentes para processar biomoléculas ou uma molécula derivada das mesmas, como reagentes para isolar ácidos nucleicos de uma célula, para amplificar, codificar com códigos de barras ou sequenciar ácidos nucleicos, ou preparar bibliotecas de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os reagentes incluem, por exemplo, lisozima, proteinase K, hexâmeros aleatórios, polimerase (por exemplo, DNA polimerase Φ29, Taq polimerase, Bsu polimerase), transposase (por exemplo, Tn5), iniciadores (por exemplo, sequências adaptadoras P5 e P7), ligase, enzima catalisadora, desoxinucleotídeos trifosfatos, tampões ou cátions divalentes.
[0049] Em algumas modalidades, o DNA longo inclui DNA genômico, ácidos nucleicos virais, ácidos nucleicos bacterianos, ou ácidos nucleicos de mamíferos.
Em algumas modalidades, as microesferas de polímero incluem uma fonte de DNA longo, incluindo, por exemplo, uma célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula única, que inclui uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana. Dessa forma, conforme mostrado nas Figuras 7A e 7B, o método pode ser realizado em fragmentos de DNA longo ou em células, sendo que um ou ambos são encapsulados com uma microesfera de polímero.
[0050] Em algumas modalidades, a microesfera de polímero é uma microesfera de polímero sacrificial que tem um núcleo sacrificial encapsulado por um envoltório. Para uso na presente invenção, o termo "sacrificial" tem seu significado comum conforme compreendido em vista do relatório descritivo e se refere a uma microesfera ou uma porção de uma microesfera que é usada para a preparação ou a montagem de uma microesfera, mas que pode ser dissolvida ou descartada em um estágio posterior. Em algumas modalidades, uma microesfera de polímero sacrificial inclui um material polimérico, como agarose ou poliacrilamida, que é colocado em contato com uma amostra, como uma célula ou DNA, formando, assim, uma microesfera de polímero. A microesfera de polímero pode, então, ser encapsulada com um envoltório compreendido de um material polimérico diferente que tem diferentes características de fusão, como um envoltório que inclui N,N'-(1,2-di-hidroxietileno)bisacrilamida (DHEBA), acilato-PEG ou KPS, ou uma combinação dos mesmos. Após a encapsulação, a microesfera de polímero encapsulada pode ser submetida a condições suficientes para remover o talão, deixando um envoltório. As condições podem incluir, por exemplo, alteração na temperatura, no pH ou a adição de agentes redutores.
[0051] Em ainda outras modalidades, qualquer uma das microesferas de polímero aqui descritas pode incluir um material fluorescente ligado ao material polimérico. O material fluorescente pode incluir, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ou qualquer outro composto fluorescente, que pode ser ligado ao material polimérico, como a polímeros de acrilato, para formar um material polimérico fluorescente, como um polímero de acrilato de FITC (FITC-AETC). O material fluorescente ligado ao material polimérico pode ser colocado em contato com uma célula, iniciando, assim, uma gelificação fluorescente, formando uma microesfera de polímero fluorescente que circunda uma célula. Em algumas modalidades, as microesferas de polímero que têm uma célula nas mesmas podem ser imageadas fluorescentemente, sem a necessidade de coloração. Métodos de preparo de microesferas de polímero
[0052] Algumas modalidades aqui fornecidas se referem a métodos de fabricação de microesferas que encapsulam biomoléculas. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero é uma microesfera de hidrogel porosa conforme descrito aqui ou uma microesfera oca porosa conforme descrito aqui.
[0053] Em algumas modalidades, uma microesfera de polímero é preparada por emulsão assistida por vórtex. Para uso na presente invenção, a emulsão auxiliada por vórtice se refere à vortexação de um polímero hidrogel com fragmentos de DNA longo ou uma fonte de fragmentos de DNA longo em um recipiente, como em um tubo, frasco ou vaso de reação. Os componentes podem ser misturados, por exemplo, por vortexação ou agitação manual ou mecânica. Em algumas modalidades, a misturação manual resulta em microesferas de polímero que encapsulam biomoléculas com um tamanho de 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 µm de diâmetro, ou um tamanho dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, o tamanho das microesferas não é uniforme e, dessa forma, o tamanho das microesferas inclui microesferas de vários diâmetros.
[0054] Em algumas modalidades, as microesferas são preparadas por geração de gotículas microfluídicas. Conforme mostrado na Figura 1B, a geração de gotículas microfluídicas inclui o uso de um dispositivo microfluídico para a geração de uma emulsão de gel assistida. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico inclui microcanais configurados para produzir uma microesfera de polímero de um tamanho desejado e encapsular uma quantidade selecionada de biomoléculas por microesferas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico tem uma altura de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 µm, ou uma altura dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico inclui um ou mais canais. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico inclui um canal para uma corrente aquosa e um canal para um fluido imiscível. Em algumas modalidades, a largura do um ou mais canais é idêntica. Em algumas modalidades, a largura do um ou mais canais é diferente. Em algumas modalidades, a largura do um ou mais canais é 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ou 150 µm, ou uma largura dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, a largura do canal aquoso é de 75 µm. Em algumas modalidades, a largura do canal de fluido imiscível é de 78 µm. O versado na técnica reconhecerá que a largura pode variar para ajustar finamente o tamanho da microesfera. Em adição ao tamanho do dispositivo microfluídico e à largura dos canais, a vazão do canal aquoso e do canal de fluido imiscível pode também afetar o tamanho das microesferas de polímero.
[0055] Em algumas modalidades, a vazão da solução no canal de fase aquosa é de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 µl/min, ou uma vazão dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, a vazão do fluido imiscível no canal de fluido imiscível é de 20, 30, 50, 80, 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ou 400 µl/min, ou uma taxa dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, a solução na fase aquosa inclui um polímero hidrogel, um reticulador e uma biomolécula, que flui através de um canal aquoso para dentro de um fluido imiscível, como um óleo carreador, a uma vazão menor que a vazão do fluido imiscível, formando, assim, gotículas. Em algumas modalidades, o fluido imiscível é óleo, como óleo mineral, um óleo de hidrocarboneto, um óleo de silício, um óleo de polidimetilsiloxano, tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, as gotículas de hidrogel contendo uma biomolécula são formuladas em uma distribuição de tamanho uniforme. Em algumas modalidades, o tamanho das microesferas de polímero é finamente ajustado mediante ajuste do tamanho do dispositivo microfluídico, do tamanho de um ou mais canais ou da vazão de um ou ambos dentre a solução aquosa ou o fluido imiscível. Em algumas modalidades, a microesfera de polímero resultante tem um diâmetro na faixa de 2 a 150 µm, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 µm, ou um diâmetro dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados.
[0056] Em algumas modalidades, o tamanho e a uniformidade da microesfera de polímero que encapsula uma biomolécula podem ser adicionalmente controlados colocando-se um polímero hidrogel, antes da formação da microesfera, em contato com um modificador fluídico, como com um álcool, incluindo álcool isopropílico.
[0057] Em algumas modalidades, a quantidade de fragmentos de DNA longo encapsulados dentro de uma microesfera pode ser controlada pela diluição ou concentração dos fragmentos de DNA longo dentro da amostra inserida. A amostra que inclui os fragmentos de DNA longo é misturada com o polímero hidrogel, e o polímero hidrogel que contém os fragmentos de DNA longo é submetido a emulsão assistida por vórtex ou geração de gotículas microfluídicas, conforme descrito na presente invenção.
[0058] Em algumas modalidades, as microesferas de polímero podem ser funcionalizadas e usadas para purificação de um ácido nucleico. Em algumas modalidades, as microesferas de polímero são funcionalizadas com um nucleotídeo. Em algumas modalidades, o nucleotídeo é um oligonucleotídeo ou nucleotídeo poliT. Em algumas modalidades, o nucleotídeo é ligado à microesfera de polímero, e a microesfera funcionalizada pode ser usada para captura direcionada de um nucleotídeo de interesse.
[0059] Em algumas modalidades, a microesfera de polímero pode ser encapsulada com um envoltório de polímero que tem características diferentes da microesfera de polímero, como temperatura de fusão diferente, tamanhos de poros diferentes ou características de dissolução diferentes. Em algumas modalidades, o envoltório de polímero pode incluir um material de DHEBA. Métodos de processamento de biomoléculas encapsuladas no interior de microesferas de polímero
[0060] Algumas modalidades incluem métodos de processamento de biomoléculas dentro de uma microesfera, conforme mostrado na Figura 2, que representa um diagrama de fluxo para a preparação e o processamento de biomoléculas em uma microesfera de polímero. Em uma primeira etapa, uma amostra de DNA, como proveniente de dados genômicos ou uma célula, é encapsulada no interior de uma microesfera de polímero. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA longo é retido dentro das microesferas de polímero, e reagentes são capazes de passar através dos poros das microesferas de polímero. Em algumas modalidades, os reagentes podem incluir agentes de lise, agentes de purificação de ácido nucleico, agentes de tagmentação, agentes de PCR ou outros agentes usados no processamento de biomoléculas ou moléculas derivadas das mesmas. Dessa forma, as microesferas de polímero fornecem um microambiente para reações controladas de fragmentos de DNA longo dentro das microesferas de polímero permitindo que uma barreira para reagente passe para dentro e para fora das microesferas de polímero, enquanto retêm os fragmentos de DNA longo dentro das microesferas. Quando o DNA é encapsulado nas microesferas, o processo prossegue para a próxima etapa na qual a amostra pode ser carregada em uma célula de fluxo para criar os fragmentos de DNA longo através do processo de preparação da biblioteca.
[0061] Como usado aqui, o termo "tagmentação" refere-se à modificação de DNA por um complexo de transpossomo que compreende enzima transposase complexada com adaptadores que compreendem uma sequência terminal de transpóson. A tagmentação resulta na fragmentação simultânea do DNA e na ligação dos adaptadores às extremidades 5′ de ambas as fitas de fragmentos duplex. Após uma etapa de purificação para remover a enzima transposase, sequências adicionais podem ser adicionadas às extremidades dos fragmentos adaptados, por exemplo, por PCR, ligação ou qualquer outra metodologia adequada conhecida pelos versados na técnica.
[0062] Em algumas modalidades, toda a preparação da biblioteca de DNA pode ser realizada ininterruptamente dentro das microesferas de polímero ligadas à célula de fluxo com múltiplas trocas de reagente ao passar através do hidrogel poroso enquanto retém o gDNA e seus produtos da biblioteca dentro da matriz de hidrogel. O hidrogel pode ser resistente a altas temperaturas de até 95°C durante várias horas para suportar diferentes reações bioquímicas.
[0063] Na etapa seguinte do processo, a microesfera de polímero que encapsula os fragmentos de DNA longo da preparação da biblioteca anteriormente mencionada é tratada para liberar, purificar e isolar os fragmentos de DNA longo da microesfera. Dessa forma, por exemplo, a microesfera de polímero é colocada em contato com um tampão de lise. Como usado aqui, "lise" significa perturbação ou alteração em uma parede celular ou partícula viral que facilita o acesso a ou a liberação do RNA ou DNA celular. Nem a ruptura completa nem a quebra da parede celular é um requisito essencial para a lise. O termo "tampão de lise" significa um tampão que contém pelo menos um agente de lise. Agentes de lise enzimática típicos incluem, mas não se limitam a, lisozima, glucolase, zimolose, liticase, proteinase K, proteinase E, endolisinas e exolisinas virais. Dessa forma, por exemplo, a lise de células nas microesferas pode ser realizada pela introdução de agentes de lise, como lisozima e proteinase K nas microesferas de polímero. O gDNA das células está agora contido no interior das microesferas. Em algumas modalidades, após o tratamento com lise, o ácido nucleico isolado é retido no interior da microesfera de polímero e pode ser usado para processamento adicional.
[0064] Para uso na presente invenção, os termos "isolado", "para isolar", "isolamento", "purificado", "para purificar", "purificação" e equivalentes gramaticais dos mesmos conforme usados na presente invenção, exceto onde especificado em contrário, referem-se à redução na quantidade de pelo menos um contaminante (como a sequência de uma proteína e/ou de um ácido nucleico) proveniente uma amostra ou de uma fonte (por exemplo, uma célula) a partir da qual o material é isolado. Dessa forma, a purificação resulta em um "enriquecimento", por exemplo, um aumento na quantidade de uma sequência de uma proteína e/ou um ácido nucleico desejável na amostra.
[0065] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos encapsulados são sequenciados no todo ou em parte no interior das microesferas de polímero. Os ácidos nucleicos encapsulados podem ser sequenciados de acordo com qualquer metodologia de sequenciamento adequada, como sequenciamento direto, incluindo sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, sequenciamento por hibridização, sequenciamento por nanoporo e similares.
[0066] Algumas modalidades aqui fornecidas se referem ao sequenciamento por síntese (SBS - "sequencing-by-synthesis") habilitado para fragmentos de DNA longo. No SBS, a extensão de um iniciador de ácido nucleico ao longo de um gabarito de ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico-alvo ou um amplicon do mesmo) é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no gabarito. O processo químico subjacente pode ser a polimerização (por exemplo, como catalisado por uma enzima polimerase). Em uma modalidade específica de SBS baseada em polimerase, nucleotídeos marcados fluorescentemente são adicionados a um iniciador (estendendo, assim, o iniciador) de uma maneira dependente de gabarito, de modo que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador pode ser usada para determinar a sequência do gabarito.
[0067] Um ou mais ácidos nucleicos encapsulados amplificados podem ser submetidos a uma técnica de detecção por SBS ou outra técnica de detecção que envolva uma aplicação repetida de reagentes em ciclos. Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase, etc., podem ser passados para dentro/através de uma microesfera de polímero que abriga uma ou mais moléculas de ácido nucleico amplificadas. Esses sítios onde a extensão do iniciador gera um nucleotídeo marcado a ser incorporado podem ser detectados. Opcionalmente, os nucleotídeos podem incluir adicionalmente uma propriedade de terminação reversível que termina mais a extensão de iniciadores após um nucleotídeo ter sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo tendo uma porção de terminador reversível pode ser adicionado a um iniciador, de modo que uma subsequente extensão não pode ocorrer até que um agente de desbloqueio remova a porção. Dessa forma, para modalidades que usam terminação reversível, um reagente de desbloqueio pode ser fornecido à célula de fluxo (antes ou depois da ocorrência da detecção). As lavagens podem ser executadas entre as várias etapas de aplicação. O ciclo pode, então, ser repetido n vezes para estender o iniciador por n nucleotídeos, detectando, assim, uma sequência de comprimento n. Procedimentos de SBS exemplificadores, sistemas fluídicos e plataformas de detecção que podem ser prontamente adaptados para uso com amplicons produzidos pelos métodos da presente revelação são descritos, por exemplo, em Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), no documento WO 04/018497; na patente US n° 7.057.026; documento WO 91/06678; documento WO 07/123744; patente US n° 7.329.492, patente US n°
7.211.414, patente US n° 7.315.019, patentes US n° 7.405.281 e US 2008/0108082, estando cada um dos quais aqui incorporado a título de referência.
[0068] Outros procedimentos de sequenciamento que usam reações cíclicas podem ser usados, como pirossequenciamento. O pirossequenciamento detecta a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi) conforme nucleotídeos específicos são incorporados a uma fita de ácido nucleico nascente (Ronaghi et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al., Science 281(5375), 363 (1998); patente US n° 6.210.891; patente US n°
6.258.568 e patente US n° 6.274.320, estando cada um dos quais aqui incorporado a título de referência. No pirossequenciamento, o PPi liberado pode ser detectado sendo imediatamente convertido em adenosina trifosfato (ATP) por ATP sulfurilase, e o nível de ATP gerado pode ser detectado por meio de fótons produzidos por luciferase. Dessa forma, a reação de sequenciamento pode ser monitorada por meio de um sistema de detecção de luminescência. As fontes de radiação de excitação usadas para sistemas de detecção baseados em fluorescência não são necessárias para procedimentos de pirossequenciamento. Sistemas fluídicos, detectores e procedimentos úteis que podem ser adaptados para aplicação de pirossequenciamento a amplicons produzidos de acordo com a presente revelação são descritos, por exemplo, no pedido de patente WIPO n° de série PCT/US11/57111, na patente US 2005/0191698 A1, na patente US n° 7.595.883 e na patente US n°
7.244.559, estando cada um dos quais aqui incorporado a título de referência.
[0069] Algumas modalidades podem utilizar métodos que envolvem o monitoramento em tempo real da atividade de DNA polimerase. Por exemplo, as incorporações de nucleotídeos podem ser detectadas através de interações de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET - "fluorescence resonance energy transfer") entre polimerase contendo fluoróforo e nucleotídeos marcados com γ-fosfato, ou com guias de onda de modo zero (ZMWs - "zero mode waveguides"). Técnicas e reagentes para sequenciamento baseado em FRET são descritos, por exemplo, em Levene et al., Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al., Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), cujas revelações estão aqui incorporadas a título de referência.
[0070] Algumas modalidades de SBS incluem a detecção de um próton liberado mediante a incorporação de um nucleotídeo em um produto de extensão. Por exemplo, o sequenciamento baseado na detecção de prótons liberados pode usar um detector elétrico e técnicas associadas que estão disponíveis comercialmente. Exemplos de tais sistemas de sequenciamento são pirossequenciamento (por exemplo, plataforma disponível comercialmente junto à 454 Life Sciences, uma subsidiário da Roche), sequenciamento com o uso de nucleotídeos marcados com γ- fosfato (por exemplo, plataforma disponível comercialmente junto à Pacific Biosciences) e sequenciamento com o uso de detecção de prótons (por exemplo, plataforma disponível comercialmente junto à Ion Torrent, uma subsidiária da Life Technologies) ou métodos e sistemas de sequenciamento descritos nas patentes US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1 ou US 2010/0282617
A1, estando cada uma das quais aqui incorporada a título de referência. Os métodos aqui apresentados para amplificar ácidos nucleicos-alvo com o uso de exclusão cinética podem ser prontamente aplicados a substratos usados para detectar prótons. Mais especificamente, os métodos aqui apresentados podem ser usados para produzir populações clonais de amplicons que são usadas para detectar prótons.
[0071] Outra técnica de sequenciamento é o sequenciamento por nanoporos (consulte, por exemplo, Deamer et al., Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al., Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al., Nat. Mater. 2:611-615 (2003), cujas revelações estão aqui incorporadas a título de referência). Em algumas modalidades de nanoporos, o ácido nucleico-alvo ou os nucleotídeos individuais removidos de um ácido nucleico-alvo passam através de um nanoporo. À medida que o ácido nucleico ou o nucleotídeo passa através do nanoporo, cada tipo de nucleotídeo pode ser identificado mediante a medição das flutuações na condutância elétrica do poro. (patente US n° 7.001.792; Soni et al., Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al., J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), cujas revelações estão aqui incorporadas a título de referência).
[0072] Métodos exemplificadores para expressão baseada em matriz e análise de genotipagem que podem ser aplicados à detecção de acordo com a presente revelação são descritos nas patentes US n° 7.582.420, 6.890.741, 6.913.884 ou 6.355.431 ou nas publicações de patente US n°s 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 ou US 2005/0181440 A1, estando cada uma das quais aqui incorporada a título de referência.
[0073] Nos métodos de isolamento de ácidos nucleicos, amplificação e sequenciamento, conforme descritos aqui, vários reagentes são usados para isolamento e preparação de ácidos nucleicos. Tais reagentes podem incluir, por exemplo, lisozima, proteinase K, hexâmeros aleatórios, polimerase (por exemplo, DNA polimerase Φ29, Taq polimerase, Bsu polimerase), transposase (por exemplo, Tn5), iniciadores (por exemplo, sequências adaptadoras P5 e P7), ligase, enzima catalisadora, desoxinucleotídeos trifosfatos, tampões ou cátions divalentes. Esses reagentes passam através dos poros das microesferas de polímero, enquanto que a biomolécula ou a molécula derivada da mesma é retida no interior das microesferas de polímero. Uma vantagem dos métodos aqui apresentados é que eles fornecem um microambiente encapsulado para o processamento de ácidos nucleicos dentro de uma microesfera de polímero. Isso permite o processamento de células únicas para um processamento rápido e eficiente de um ácido nucleico-alvo.
[0074] Os adaptadores podem incluir sítios de iniciadores de sequenciamento, sítios de iniciadores de amplificação e índices. Como usado aqui, um "índice" pode incluir uma sequência de nucleotídeos que pode ser usada como um identificador molecular e/ou código de barras para marcar um ácido nucleico e/ou identificar a fonte de um ácido nucleico. Em algumas modalidades, um índice pode ser usado para identificar um único ácido nucleico, ou uma subpopulação de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, as bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser preparadas dentro de uma microesfera de polímero. Em algumas modalidades, uma única célula encapsulada no interior de uma microesfera de polímero pode ser usada para indexação combinatória de células únicas, por exemplo, com o uso de uma abordagem de transposição conservadora de contiguidade (CPTSeq - "contiguity preserving transposition"). Em algumas modalidades, o DNA de uma única célula pode ser codificado em barras por encapsulação de células únicas após a amplificação de WGA com outra microesfera que transporta transpósons codificados em barras e dissolvendo a matriz de gel colocando-a em contato com um agente redutor, por exemplo, para liberar DNA genômico para a codificação de barras.
[0075] As modalidades dos métodos e técnicas de "indexação espacial" aqui descritas enfraquecem a análise de dados e simplificam o processo de preparação da biblioteca a partir de células únicas e moléculas de DNA longo. Os protocolos existentes para o sequenciamento de célula única exigem uma separação física eficiente das células e codificação de barras de modo inequívoco de cada célula isolada e agrupamento de tudo isso para fazer o sequenciamento. Os protocolos atuais para leituras longas sintéticas também exigem etapas de codificação de barras pouco práticas e o agrupamento de cada fragmento com código de barras para sequenciar e permitir a análise de dados a fim de distinguir as informações genéticas provenientes de cada célula com código de barras. Durante esses processos, pode haver perda de material, o que causa saídas nas sequências. As modalidades aqui descritas não apenas encurtam o processo, mas também aumentam a resolução de dados para células únicas. Além disso, as modalidades aqui fornecidas simplificam a montagem de genomas de novos organismos. As modalidades aqui descritas podem ser usadas para revelar variações genéticas raras e co-ocorrência de mutações. Em algumas modalidades, a biblioteca de DNA confinada nas microesferas de polímero até a liberação fornece a oportunidade de controlar o tamanho dos fragmentos que são liberados sobre a superfície pelo controle do processo de liberação e da formulação de hidrogel.
[0076] Em algumas modalidades, a superfície é um dispositivo de célula de fluxo. Em algumas modalidades, a célula de fluxo é um dispositivo de célula de fluxo personalizado que tem cavidades, sulcos ou padrões. Em algumas modalidades, a célula de fluxo compreende uma superfície dotada de um padrão. Em algumas modalidades, a superfície dotada de um padrão compreende cavidades. Em algumas modalidades, as cavidades têm de cerca de 10 µm a cerca de 50 µm de diâmetro, como 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm ou 50 µm de diâmetro, ou dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados, e sendo que as cavidades têm cerca de 0,5 µm a cerca de 1 µm de profundidade, como 0,5 µm, 0,6 µm, 0,7 µm, 0,8 µm, 0,9 µm, ou 1 µm de profundidade, ou dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriormente mencionados. Em algumas modalidades, as cavidades compreendem material hidrofóbico. Em algumas modalidades, o material hidrofóbico compreende um fluoropolímero amorfo, como CYTOP, Fluoropel® ou Teflon®.
[0077] Em algumas modalidades, a biblioteca pode ser amplificada com o uso de sítios de iniciadores nas sequências adaptadoras e sequenciada com o uso de sítios de iniciadores de sequenciamento nas sequências adaptadoras. Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras podem incluir índices para identificar a fonte dos ácidos nucleicos. A eficiência das etapas de amplificação subsequentes pode ser reduzida pela formação de dímeros de primers. Para aumentar a eficiência de etapas de amplificação subsequentes, adaptadores de fita simples não ligados podem ser removidos dos produtos de ligação.
[0078] Em algumas modalidades, um sistema modelo pode ser preparado para determinar a porosidade das microesferas de polímero. Conforme mostrado nas Figuras 11A e 11B, uma microesfera de polímero pode encapsular um composto de estreptavidina (representado nas Figuras 11A e 11B como SA), retendo o composto de estreptavidina no interior da microesfera. Em algumas modalidades, um composto de biotina ligado a um amplicon de um certo tamanho é misturado com a microesfera de polímero (Figura 11A). Um amplicon ligado por biotina de tamanho suficiente é capaz de se difundir na microesfera de polímero e se conjugar com a estreptavidina dentro da microesfera, retendo, assim, o amplicon ligado por biotina na microesfera. Inversamente, o amplicon ligado por biotina que é excessivamente grande não passará através da microesfera de polímero, e nenhum amplicon é retido dentro da microesfera. De modo similar, uma microesfera de polímero pode ser preparada tendo uma estreptavidina conjugada a um amplicon ligado à biotina e reagentes podem passar através da mesma para realizar uma reação, como PCR (Fig. 11B). Os fragmentos que são suficientemente dimensionados se difundem para fora da microesfera de polímero, enquanto os fragmentos que são excessivamente grandes não se difundem através da microesfera de polímero e ficam retidos dentro da microesfera. Preparação de bibliotecas de ácidos nucleicos com microesferas de polímero
[0079] Algumas modalidades dos sistemas, métodos e composições aqui fornecidas incluem métodos nos quais adaptadores são ligados a ácidos nucleicos- alvo. Os adaptadores podem incluir sítios de ligação a iniciadores de sequenciamento, sítios de ligação a iniciadores de amplificação e índices. Por exemplo, um adaptador pode incluir uma sequência P5, uma sequência P7 ou um complemento das mesmas. Como usado aqui, uma sequência P5 compreende uma sequência definida pela SEQ ID NO: 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) e uma sequência P7 compreende uma sequência definida por SEQ ID NO: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA). Em algumas modalidades, a sequência P5 ou P7 pode incluir, ainda, um polinucleotídeo espaçador, que pode ter de 1 a 20, como 1 a 15 ou 1 a 10 nucleotídeos, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o espaçador inclui 10 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o espaçador é um espaçador poliT, como um espaçador 10T. Nucleotídeos espaçadores podem estar incluídos nas extremidades 5′ dos polinucleotídeos, que podem ser fixados a um suporte adequado através de uma ligação com a extremidade 5′ do polinucleotídeo. A ligação pode ser obtida através de um nucleófilo que contém enxofre, como fosforotioato, presente na extremidade 5′ do polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo incluirá um espaçador poliT e um grupo fosforotioato 5'. Dessa forma, em algumas modalidades, a sequência P5 é fosforotioato 5'-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3´ (SEQ ID NO: 3), e em algumas modalidades, a sequência P7 é fosforotioato 5'- TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3´ (SEQ ID NO: 4).
[0080] Os índices podem ser úteis para identificar a fonte de uma molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um adaptador pode ser modificado para evitar a formação de concatemers, por exemplo, mediante a adição de grupos bloqueadores que impedem a extensão do adaptador em uma ou ambas as extremidades. Exemplos de grupos bloqueadores de 3′ incluem um espaçador 3' C3, um didesoxinucleotídeo e fixação a um substrato. Exemplos de grupos de bloqueio de 5′ incluem um nucleotídeo 5' desfosforilado e fixação a um substrato.
[0081] Os adaptadores incluem ácidos nucleicos, como ácidos nucleicos de fita simples. Os adaptadores podem incluir ácidos nucleicos curtos com um comprimento menor que, maior que ou igual a cerca de 5 nucleotídeos, 10 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos ou uma faixa entre quaisquer dois dos tamanhos anteriores. Em algumas modalidades, os adaptadores têm tamanho suficiente para passar através dos poros das microesferas de polímero. Os ácidos nucleicos-alvo incluem DNA,
como genômico ou cDNA; RNA, como mRNA, sRNA ou rRNA ou um híbrido de DNA e RNA. O ácido nucleico pode ser isolado de uma única célula encapsulada dentro de uma microesfera de polímero. Um ácido nucleico pode conter ligações fosfodiéster e pode incluir outros tipos de cadeias principais, compreendendo, por exemplo, cadeias principais e ligações de fosforamida, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfosforoamidita e ácido nucleico peptídico. Um ácido nucleico pode conter qualquer combinação de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos, e qualquer combinação de bases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantanina, hipoxantanina, isocitosina, isoguanina e análogos de base como nitropirrol (incluindo 3-nitropirrol) e nitroindol (incluindo 5-nitroindol). Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode incluir ao menos uma base promíscua. Uma base promíscua pode fazer par com mais de um tipo diferente de base e pode ser útil, por exemplo, quando incluída em oligonucleotídeos ou insertos iniciadores que são usados para hibridização aleatória em amostras complexas de ácido nucleico, como amostras de DNA genômico. Um exemplo de uma base promíscua inclui inosina que pode fazer par com adenina, timina ou citosina. Outros exemplos incluem hipoxantina, 5-nitroindol, 5-nitroindol acílico, 4-nitropirazol, 4-nitroimidazol e 3-nitropirrol. Bases promíscuas que podem fazer par com bases com ao menos dois, três, quatro ou mais tipos de bases podem ser usadas.
[0082] Um método exemplificador inclui desfosforilar as extremidades 5′ dos ácidos nucleicos-alvo para evitar a formação de concatemers em etapas de ligação subsequentes; ligar os primeiros adaptadores às extremidades 3′ dos alvos desfosforilados com o uso de uma ligase, na qual as extremidades 3′ dos primeiros adaptadores são bloqueadas; refosforilar as extremidades 5′ dos alvos ligados; ligar um segundo adaptador às extremidades 5′ dos alvos desfosforilados usando a ligase de fita simples, na qual as extremidades 5′ dos segundos adaptadores são não fosforiladas.
[0083] Outro exemplo inclui a digestão parcial do ácido nucleico com uma exonuclease 5' para formar um ácido nucleico de fita dupla com projeções 3' de fita simples. Um adaptador contendo um grupo de bloqueio de 3′ pode ser ligado às extremidades 3′ de ácido nucleico de fita dupla com projeções 3′. O ácido nucleico de fita dupla com projeções 3′ com adaptadores ligados pode ser desibridizado para formar ácidos nucleicos de fita simples. Um adaptador contendo uma extremidade 5′ não fosforilada pode ser ligado à extremidade 5′ do ácido nucleico de fita simples.
[0084] Métodos para desfosforilar ácidos nucleicos, como o nucleotídeo 5′ de um ácido nucleico, incluem colocar um ácido nucleico em contato com uma fosfatase. Exemplos de fosfatases incluem fosfatase intestinal de bezerro, fosfatase alcalina de camarão, fosfatase antártica e fosfatase alcalina APEX (Epicentre).
[0085] Os métodos para ligar ácidos nucleicos incluem colocar os ácidos nucleicos em contato com uma ligase. Exemplos de ligases incluem T4 RNA ligase 1, T4 RNA ligase 2, RtcB ligase, RNA ligase de metanobactérias e TS2126 RNA ligase (CIRCLIGASE).
[0086] Métodos para fosforilar ácidos nucleicos, como o nucleotídeo 5′ de um ácido nucleico, incluem colocar um ácido nucleico em contato com uma quinase. Exemplos de quinases incluem polinucleotídeo T4 quinase.
[0087] As modalidades aqui fornecidas se referem à preparação de bibliotecas de ácidos nucleicos em uma microesfera de polímero, de modo que a biblioteca de ácidos nucleicos seja preparada em um único volume de reação.
[0088] As modalidades dos sistemas e métodos aqui fornecidos incluem kits contendo qualquer um ou mais dentre os polímeros hidrogéis, reticuladores ou dispositivos microfluídicos para a preparação de microesferas de polímero que encapsulam biomoléculas, e que incluem adicionalmente componentes úteis para o processamento das biomoléculas ou moléculas derivadas das mesmas, incluindo reagentes para lise celular, amplificação e sequenciamento de ácido nucleico, ou para a preparação da biblioteca de ácidos nucleicos, incluindo lisozima, proteinase K, hexâmeros aleatórios, polimerase (por exemplo, DNA polimerase Φ29, Taq polimerase, Bsu polimerase), transposase (por exemplo, Tn5), iniciadores (por exemplo, sequências adaptadoras P5 e P7), ligase, enzima catalisadora, trifosfatos de desoxinucleotídeos, tampões ou cátions divalentes, conforme descritos na presente invenção e conforme usados para o respectivo processamento de biomoléculas ou moléculas derivadas das mesmas.
[0089] Conforme mostrado na Figura 12, uma microesfera de polímero é preparada encapsulando uma célula. A microesfera de polímero é exposta a reagentes para lise celular e tagmentação. O tratamento da microesfera de polímero com um detergente, como SDS, resulta em fragmentação e pequenas moléculas podem se difundir para fora da microesfera de polímero. Em algumas modalidades, a capacidade de retenção das biomoléculas celulares pode ser limitada por um limite mínimo além do qual o acesso bidirecional das enzimas nas células seria restrito.
[0090] Alternativamente, em algumas modalidades, métodos de preparação da biblioteca são executados para aumentar o tamanho físico das moléculas genômicas de modo que elas estejam contidas no interior das microesferas de polímero, o que supera o limite. Dessa forma, conforme mostrado na Figura 12, durante a preparação da biblioteca de gDNA, fragmentos de gDNA tagmentados são mantidos juntos pela ligação de Tn5, evitando a difusão para fora das microesferas de polímero. Entretanto, após o tratamento com SDS, a Tn5 é liberada e os fragmentos resultantes da biblioteca podem se difundir para fora se forem muito pequenos. Para evitar isso, uma enzima Tn5 com extremidades de transpóson salientes pode ser usada para tagmentação. A química pode ser realizada nas extremidades de transpóson salientes 5' ou 3' para aumentar o tamanho dos elementos da biblioteca ou permitir a ligação a microesferas ou outras biomoléculas. Uma variedade de designs e modificações de transpóson pode ser usada para aumentar o tamanho físico dos fragmentos da biblioteca.
[0091] Por exemplo, um transpóson com uma projeção de 3' pode ser usado para tagmentar o DNA. A projeção de 3' pode servir como um substrato para as enzimas. A transferase terminal (TdT) pode ser usada para adicionar um certo número de bases de maneira independente de gabarito. Por exemplo, a TdT pode ser usada para adicionar de 100 a 300 bases ao transpóson. Se a extensão da TdT ao transpóson não for suficiente, o transpóson alongado pode ser hibridizado para microesferas oligoligadas presentes nas microesferas de polímero, um amplicon complementar ou mRNA celular de poli-A com cauda. Se hibridizado com um oligonucleotídeo, uma reação de extensão pode ser realizada. Por exemplo, se um plasmídeo de ssDNA for recozido, uma reação de amplificação por círculo rolante (RCA - "rolling circle amplification") pode ser realizada para aumentar o tamanho das extremidades do transpóson. Os oligonucleotídeos hibridizados podem ser alternativamente ligados às extremidades do transpóson. A ligação sucessiva de amplicons, como no conjunto de ligação de ciclo (CLA - "Cycle Ligation Assembly"), pode ser realizada para montar estiramentos longos de DNA a partir de fragmentos menores capazes de se difundirem nas microesferas de polímero.
[0092] A adição de bases modificadas a transpósons também pode ser usada como alvos para a ligação de moléculas adicionais. As bases modificadas podem estar presentes no transpóson antes da tagmentação ou ser adicionadas enzimaticamente após a tagmentação. Por exemplo, a TdT pode ser usada para adicionar a base modificada digoxigenina-11-UTP, que pode mais tarde ser ligada pelo anticorpo anti-DIG. Outras modificações incluem biotina e 5 mC, que podem se ligar a estreptavidina e anticorpos 5 mC, respectivamente.
[0093] Em algumas modalidades, a indexação simultânea de fragmentos de gDNA e cDNAs que se originam da mesma microesfera de polímero e a amplificação adicional de elementos da biblioteca podem ser realizadas por amplificação por círculo rolante. Exemplos Exemplo 1 — Preparação de microesferas de polímero
[0094] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade de preparação de microesferas de polímero que encapsulam fragmentos de DNA longo com o uso de geradores de gotículas microfluídicas.
[0095] Um gerador de gotículas foi usado para gerar as microesferas de polímero. As amostras contendo fragmentos de DNA longo foram misturadas com um polímero precursor, e a mistura foi carregada em um reservatório de amostra em um cartucho. Dentro de 2 minutos, cerca de 50.000 microesferas de polímero contendo DNA longo foram geradas a partir de cada canal (8 canais para 8 processamentos de amostra independentes cada cartucho). As microesferas de polímero de DNA longo foram carregadas em uma célula de fluxo, onde as microesferas de polímero ficaram presas (100 µm de canal alto e 120 µm de diâmetro de microesferas de polímero) para a preparação da biblioteca sem manipulação manual. Enzimas e reagentes, incluindo enzimas de preparação de bibliotecas de ácidos nucleicos e reagentes, foram introduzidos na célula de fluxo, entrando em contato com o DNA longo embutido dentro da microesfera de polímero e clivando as moléculas de DNA longo através de tagmentação para formar uma biblioteca de DNA. A biblioteca foi, então, semeada na célula de fluxo a partir das microesferas. Durante a semeadura da biblioteca, foi carregado um óleo para preencher o espaço vazio entre as microesferas, e a célula de fluxo foi aquecida para acelerar a difusão da biblioteca sobre a superfície da célula de fluxo. Na presença do óleo, a semeadura de cada biblioteca tagmentada ocorreu em estreita proximidade com a área de projeção de cada microesfera de polímero (de microesferas de polímero com 120 µm de diâmetro, a semeadura da biblioteca é limitada a uma área de aproximadamente 120 µm de diâmetro).
[0096] Este exemplo demonstra que moléculas de DNA longo podem ser carregadas e aprisionadas em microesferas de polímero (cerca de 120 µm de diâmetro) e a preparação da biblioteca pode ser realizada nessas moléculas de DNA longo embutidas dentro das microesferas de polímero. Como resultado, todas as bibliotecas de DNA de uma molécula de DNA longo específica foram armazenadas dentro das mesmas microesferas de polímero. A biblioteca foi, então, liberada das microesferas de polímero para a superfície da célula de fluxo para semeá-las como um grupo sobre a superfície da célula de fluxo. Os agrupamentos liberados a partir de uma molécula de DNA longo foram agrupados juntos como uma "emplastro de agrupamentos" sobre a célula de fluxo. Os agrupamentos dentro de um único emplastro a partir de uma única molécula de DNA longo simplificam a reconstrução do genoma com maior precisão e menos lacunas de arcabouço.
Exemplo 2 — Indexação espacial de DNA longo
[0097] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade de "strobe reads" de um fragmento de DNA longo de 100 kb encapsulado dentro de uma microesfera de polímero com ou sem MDA.
[0098] As microesferas de polímero foram preparadas pela misturação de um polímero na presença de DNA genômico do Corriell Institute de cerca de 100 kb e formação de microesferas de polímero com o uso de um gerador de microgotículas. O DNA foi submetido ao sequenciamento de indexação espacial colocando-se as microesferas de polímero formadas que encapsulam os fragmentos de DNA em um dispositivo de célula de fluxo e colocando-se a célula de fluxo em contato com reagentes. Nenhuma MDA foi realizada. As microesferas foram degradadas e agrupamentos foram formados no dispositivo de células de fluxo. Conforme mostrado na Figura 5, as aglomerações médias por ilha de DNA longo eram cerca de 33, o tamanho médio da ilha de DNA longo era de 64.000 pares de base e havia cerca de 405 ilhas de DNA longo por microesfera.
[0099] Um segundo conjunto de microesferas de polímero foram preparadas pela misturação de um polímero na presença de DNA genômico do Corriell Institute de cerca de 100 kb e formação de microesferas de polímero com o uso de um gerador de microgotículas. O DNA foi submetido ao sequenciamento de indexação espacial colocando-se as microesferas de polímero formadas que encapsulam os fragmentos de DNA em um dispositivo de célula de fluxo e colocando-se a célula de fluxo em contato com reagentes. A MDA foi realizada antes da tagmentação. As microesferas foram degradadas e agrupamentos foram formados no dispositivo de células de fluxo. Conforme mostrado na Figura 6, as aglomerações médias por ilha de DNA longo aumentaram para cerca de 85, o tamanho médio da ilha de DNA longo era de 58000 pares de base e havia cerca de 166 ilhas de DNA longo por microesfera.
[0100] Um terceiro conjunto de microesferas de polímero foi preparado pela misturação de um polímero na presença de DNA genômico do Corriell Institute de cerca de 10 kb e formação de microesferas de polímero com o uso de um gerador de microgotículas. O DNA foi submetido ao sequenciamento de indexação espacial colocando-se as microesferas de polímero formadas que encapsulam os fragmentos de DNA em um dispositivo de célula de fluxo e colocando-se a célula de fluxo em contato com reagentes. A MDA foi realizada antes da tagmentação. As microesferas foram degradadas e agrupamentos foram formados no dispositivo de células de fluxo. Conforme mostrado na Figura 7, as aglomerações médias por ilha de DNA longo eram cerca de 57, o tamanho médio da ilha de DNA longo era de
10.461 pares de base e havia cerca de 85 ilhas de DNA longo por microesfera. Exemplo 3 — Metagenômica na mistura complexa de espécies microbianas
[0101] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade de identificação de micróbios de célula única encapsulados em um hidrogel.
[0102] As microesferas de polímero foram preparadas conforme aqui descrito com o uso de um gerador de microgotículas microfluídicas. O material polimérico foi misturado com uma amostra contendo vários micróbios, incluindo L. gasseri, S. aureus, B. cereus, B. vulgatus, A. baumannii, S. agalactiae e P. acnes. As células encapsuladas foram então lisadas e submetidas à preparação da biblioteca, após o que as microesferas de polímero foram degradadas e as bibliotecas foram depositadas sobre uma superfície. Conforme mostrado na Figura 9, cada micróbio foi capaz de ser identificado devido à sua compartimentalização espacial no dispositivo de célula de fluxo. Dessa forma, a encapsulação e as subsequentes reações de ácido nucleico permitem a identificação do nível de cepa de espécies microbianas em misturas complexas com o uso de compartimentalização de leituras em um ensaio minimetagenômico. Exemplo 4 — Indexação espacial de célula em fluxo
[0103] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade para indexação espacial de célula em fluxo.
[0104] Um dispositivo de célula de fluxo foi obtido e lavado com 200 µl de PR2 (tampão de incorporação). As microesferas para processamento também foram lavadas com PR2. Um hidrogel diluído foi preparado em PR2. A diluição aumentada resulta em espaçamento aumentado entre hidrogéis. O hidrogel foi embutido na célula de fluxo, e a introdução de bolhas de ar na célula de fluxo foi evitada. Duzentos (200) µl de PR2 foram passados através da célula de fluxo para assegurar que as microesferas permanecessem fixadas para passar pelo processo. Cem (100) µl de RSB fluíram através da célula de fluxo.
[0105] Uma mistura de tagmentação foi preparada misturando-se 25 µl de reagente de tagmentação, 23 µl de RSB e 2 µl de enzima. A mistura de tagmentação foi introduzida no canal estreito para remover qualquer possível bolha de ar na entrada. A mistura de tagmentação foi, então, passada lentamente até a entrada. A célula de fluxo foi vedada e incubada durante 10 minutos a 55°C.
[0106] Uma mistura de tampão de bloqueio foi preparada misturando-se 25 µl de tampão de tagmentação, 25 µl de RSB e 10 µl de tampão de bloqueio. A mistura de tampão de bloqueio foi lentamente passada para célula de fluxo sem a introdução quaisquer bolhas e incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos. Após a incubação, 200 µl de PR2 passaram através do dispositivo.
[0107] NPM foi preparado pela misturação de 175 µl de RSB e 75 µl de NPM. A mistura de NPM fluiu lentamente até o dispositivo de célula de fluxo sem introduzir nenhuma bolha de ar e incubada durante 3 minutos à temperatura ambiente. Duzentos (200) µl de óleo com tensoativo foram passados até dispositivo de célula de fluxo. As micrografias revelaram que os hidrogéis foram circundados com mistura de NPM e óleo. A célula de fluxo foi vedada e incubada durante 3 minutos a 72°C para reação de preenchimento de vão.
[0108] De 20 a 30 µl de óleo com tensoativo e óleo com DTT (razão de 29/2) foram passados até o dispositivo de células de fluxo, e o dispositivo foi vedado. O processo de liberação da temperatura inicial foi de 90°C durante 3 minutos, 60°C durante 5 minutos, 40°C durante 2 minutos e 20°C durante 2 minutos. A célula de fluxo foi lavada com 400 µl de PR2 e 200 µl de CLM (mistura de clivagem). A célula de fluxo foi, então, lavada com 400 µl de PR2. Onde a semeadura em Phix foi desejada, um Phix foi preparado com concentração de 2 a 3 pM, e a biblioteca de Phix foi passada até o dispositivo e incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos. A célula de fluxo foi lavada com 200 µl de PR2. De 100 a 200 µl de AMX durante a 1ª extensão foram passados e incubados durante 5 minutos a 50°C. A célula de fluxo foi lavada com PR2, e uma amplificação de 24 ou ciclos 30 foi realizada. Exemplo 5 — Indexação simultânea de fragmentos de gDNA e cDNAs
[0109] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade para indexação simultânea de fragmentos de gDNA e cDNAs a partir da mesma microesfera de polímero.
[0110] As microesferas de polímero foram preparadas como envoltórios de polímero ocos com uma célula encapsulada nas mesmas. Cerca de 25 a 50 esferas de polímero foram distribuídas em cavidades de uma placa de microtitulação e foram tratadas com tampão de lise celular para romper a membrana celular seguido de transposição de gDNA com transpossomo de adaptador Y indexado, formado com transpósons fosforilados na extremidade 5' de ambas as fitas. Foi adicionada transferase terminal (TdT) para adicionar múltiplos Ts à extremidade 3' da fita de não transferência, permitindo a hibridização até uma cauda polyA do mRNA.
[0111] A lacuna entre gDNA e fita de não transferência de transpóson foi realizada por uma reação de preenchimento e ligação, e a síntese de cDNA foi realizada pela transcriptase reversa (RT - "reverse transcriptase") MMLV. A RT MMLV também adicionou algumas bases de dCMPs adicionais à extremidade 3' da molécula de cDNA, cuja base foi pareada com a sequência de oligoG na extremidade 3' do iniciador de comutação de gabarito (TSP). O TSP recozido foi estendido e sua sequência foi transferida para a extremidade 3' do cDNA recém-sintetizado na reação de comutação de gabarito. O híbrido de gDNA-cDNA formado continha três sequências comuns diferentes, uma em cada extremidade e uma no meio da fita, separando as porções de gDNA e cDNA da molécula híbrida. Essas sequências comuns foram usadas tanto para preparação de bibliotecas de gDNA quanto de cDNA.
[0112] Em uma reação colateral, a extensão do mRNA e do gabarito mudando na extremidade 3' dos transpósons foi observada, mas essas atividades não afetaram o resultado. Após o tratamento com RNAse H e lavagens breves, o teor das microesferas de polímero foi desnaturado por calor e submetido à reação de ligação por círculo. Durante esta reação, todas as moléculas de DNA de fita simples com extremidade 5' fosforilada se autoligaram em círculos, que se tornaram gabaritos para amplificação por círculo rolante (RCA). Além do híbrido gDNA- cDNA, o DNA individual tagmentado bem como as moléculas de cDNA produzidas a partir de mRNA recozido para liberar transpossomos de flutuação também foram ligados por círculo e amplificados na reação de RCA. Concatemers longos que contêm múltiplas cópias de moléculas de partida aumentaram a sensibilidade do ensaio e foram retidos dentro das microesferas de polímero.
[0113] Um dsDNA de aproximadamente < 1 kbp de comprimento pode passar através das microesferas de polímero por uma microesfera de polímero oca de PEG-MAL a 15%. Resumidamente, as microesferas revestidas com estreptavidina (aproximadamente 10 µm de diâmetro) foram encapsuladas dentro das microesferas de polímero. Depois disso, permitiu-se que amplicons biotinilados de tamanhos diferentes se difundissem nas microesferas de polímero. Um limite de difusão de limiar representando o valor de corte do tamanho molecular foi determinado em relação a uma faixa de tamanho de amplicon variável (por exemplo: 220 bp a 5.000 bp), conforme mostrado nas Figuras 13A e 13B.
[0114] De modo similar, para testar a compatibilidade das reações em cadeia da polimerase e a capacidade de retenção dos produtos genômicos, um modelo de confinamento foi projetado em que microesferas de polímero ligadas a amplicons (usando química de conjugação de biotina-estreptavidina) foram carregadas nas microesferas de polímero. A amplificação linear desses amplicons de tamanhos variáveis em microesferas não apenas sugere que as microesferas de polímero são compatíveis com PCR, mas foram capazes de determinar a capacidade de retenção de moléculas para fragmentos de DNA amplificados para 200 bp e 5 kbp. Os produtos de 200 bp podem se difundir nas microesferas de polímero circundantes, enquanto os produtos de 5 kbp são mantidos dentro das microesferas de polímero (Figura 14).
[0115] Além dos ensaios biomoleculares que podem aumentar o tamanho dos produtos para reter pequenas moléculas, as microesferas de polímero podem ser compostas de polímeros multicamadas que podem ter uma difusão controlada de moléculas com base na carga, pH, temperatura ou outros fatores ambientais (Figura 15). Exemplos de tais sistemas podem incluir materiais como polímeros iônicos e não iônicos incluindo alginato, poli(glicol etilênico), N-isopropilacrilamida, N,N'-dimetilacrilamida ou outro polímero aqui descrito. Exemplo 6 — Microesferas de polímero com núcleos sacrificiais
[0116] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade para a preparação de microesferas de polímero que têm um núcleo sacrificial.
[0117] Um núcleo com um polímero sacrificial foi preparado com a amostra (células ou DNA). O núcleo incluía uma carga, como PEG ou poliacrilamida, que foi misturada com a amostra para formar uma microesfera de polímero, conforme mostrado na Figura 16A. A microesfera foi condensada com 50% de álcool isopropílico (IPA) e misturada com DHEBA/acrilamida com KPS/TEMED (Figura 16B). O resultado foi uma microesfera de polímero encapsulada com um envoltório de DHEBA. O envoltório de DHEBA é instável em temperaturas usadas para desibridização e semeadura, resultando em uma liberação do núcleo do envoltório de DHEBA em altas temperaturas. Adicionalmente, o tratamento da microesfera de polímero de DHEBA com um agente redutor, como DTT, e expansão em água, resultou em um envoltório de DHEBA- acrilamida. A Figura 16C mostra micrografias de microesferas de polímero de DHEBA, que correspondem à representação esquemática mostrada na Figura 16B.
[0118] Outra modalidade é uma microesfera de polímero que tem um envoltório de DHEBA com um núcleo de agarose, conforme mostrado na Figura 17A. A microesfera de núcleo de agarose foi preparada de maneira similar à microesfera de núcleo de poliacrilamida. Uma amostra de células ou DNA foi misturada com agarose para formar uma microesfera de polímero, com o uso de um método conforme descrito aqui. As microesferas de agarose podem ser funcionalizadas e usadas para purificar a amostra, como o DNA. A microesfera de polímero foi colocada em contato com DHEBA, que encapsulou a microesfera de polímero, conforme mostrado nas Figura 17B. Pode ser usado UV para iniciar a construção do envoltório de DHEBA ao redor da microesfera de polímero. O núcleo de agarose foi submetido à temperatura ou digestão química para fundir o núcleo, resultando em um envoltório de DHEBA oco, conforme mostrado nas Figura 17C. Exemplo 7 — Gelificação de iniciação por fluorescência de microesferas de polímero
[0119] O exemplo a seguir demonstra uma modalidade para a preparação de microesferas de polímero com o uso de um método de gelificação de iniciação por fluorescência.
[0120] Foi obtida uma amostra, como células ou DNA. A amostra foi colocada em contato com um polímero que tem polímeros de acrilato (FITC-AETC) ligados a isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual revestiu a amostra. As amostras ligadas a FITC-AETC foram colocadas em contato com radiação, como radiação de luz e monômeros, o que resultou em células ligadas a FITC dentro de um gel de polímero, conforme mostrado esquematicamente na Figura 18A. As células resultantes podem ser imageadas sem coloração devido à interação do FITC sobre a superfície celular, conforme mostrado nas Figuras 18B e 18C. As amostras de controle que não foram revestidas com FITC-AETC não exibiram excitação. A gelificação iniciada por fluoresceína aqui descrita pode ser realizada em solução. Quando realizada em solução, a polimerização iniciou no centro de uma gotícula de solução padrão. Trietanolamina (TEA) foi adicionada em uma quantidade de 210 mM para iniciar a gelificação. Também foi adicionado 0,05% de NaHSO 3.
[0121] As modalidades, os exemplos e as figuras aqui descritos fornecem composições, métodos e sistemas para reter biomoléculas em um espaço fisicamente confinado durante o processo de lise para geração de bibliotecas. Algumas modalidades fornecem bibliotecas originadas de uma única molécula de DNA longo ou de uma única célula a ser liberada sobre uma superfície de uma célula de fluxo em um ambiente confinado. Quando a biblioteca de uma única molécula de DNA ou única célula nos compartimentos individuais é liberada para a superfície da célula de fluxo, a biblioteca de cada compartimento é semeada em estreita proximidade entre si.
[0122] O termo "que compreende", para uso na presente invenção, é sinônimo de "que inclui", "que contém" ou "caracterizado por", e é inclusivo ou não limitado e não exclui elementos ou etapas de método adicionais não mencionados.
[0123] A descrição acima revela vários métodos e materiais da presente invenção. Esta invenção é suscetível a modificações nos métodos e materiais, bem como a alterações nos métodos e equipamentos de fabricação. Tais modificações se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir de uma consideração desta revelação ou prática da invenção aqui revelada. Consequentemente, não se pretende que esta invenção seja limitada às modalidades específicas aqui reveladas, mas que abranja todas as modificações e alternativas que estejam dentro do verdadeiro escopo e espírito da invenção.
[0124] Todas as referências citadas na presente invenção, incluindo, mas não se limitando a, pedidos, patentes e referências de literatura publicados e não publicados, estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade e são parte deste relatório descritivo. até o ponto em que publicações e patentes ou pedidos de patente incorporados por referência contradizem a revelação contida no relatório descritivo, o relatório descritivo se destina a substituir e/ou tomar precedência sobre qualquer material contraditório.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Microesfera de polímero para realizar múltiplas reações de coensaios, caracterizada por compreender: um precursor de polímero hidrogel; um reticulador; e uma biomolécula disposta dentro da microesfera de polímero, sendo que a microesfera compreende poros que permitem a difusão de um reagente através da microesfera enquanto retém a biomolécula.
2. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, sendo a microesfera caracterizada por ser uma microesfera de hidrogel porosa ou uma microesfera oca porosa.
3. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, sendo a microesfera caracterizada por compreender múltiplas camadas de polímero, sendo que cada camada tem um tamanho de poro e uma densidade de poro distintos.
4. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os poros serem modulados em tamanho com base na carga, pH ou temperatura.
5. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, sendo a microesfera caracterizada por ter um diâmetro de cerca de 50 µm a cerca de 150 µm.
6. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polímero hidrogel compreender polietilenoglicol (PEG)-tiol/acrilato de PEG, PEG/maleimida (PEG/MAL), acrilamida/N,N'-bis(acriloil)cistamina (BACy), N,N'- (1,2-di-hidroxietileno)bisacrilamida (DHEBA), PEG/óxido de polipropileno (PPO), ácido poliacrílico, poli(metacrilato de hidroxietila) (PHEMA), poli(metacrilato de metila) (PMMA), poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), poli(ácido vinilsulfônico) (PVSA), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutâmico), polilisina, ágar, agarose, alginato, heparina, sulfato de alginato, sulfato de dextrano, hialuronano, pectina, carragena, gelatina, quitosano, celulose ou colágeno.
7. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o reticulador compreender bisacrilamida, diacrilato, dialilamina, trialilamina, divinil sulfona, dietilenoglicol dialil éter, diacrilato de etilenoglicol, diacrilato de polimetilenoglicol, diacrilato de polietilenoglicol, trimetacrilato de trimetilopropano, triacrilato de trimetilol etoxilado ou tetracrilato de pentaeritritol etoxilado.
8. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a biomolécula ser um ácido nucleico.
9. Microesfera, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o ácido nucleico ser uma molécula de DNA longo de 50.000 pares de bases ou mais.
10. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o reagente compreender enzimas, produtos químicos e iniciadores que têm um tamanho menor que 50 pares de bases.
11. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o reagente compreender lisozima, proteinase K, hexâmeros aleatórios, polimerase (DNA polimerase Φ29, Taq polimerase, Bsu polimerase), transposase (Tn5), iniciadores (sequências adaptadoras P5 e P7), ligase, enzima catalisadora, desoxinucleotídeos trifosfatos, tampões ou cátions divalentes.
12. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, sendo a microesfera caracterizada por compreender adicionalmente um envoltório estabilizado que encapsula a microesfera.
13. Microesfera, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o envoltório estabilizado compreender N,N'-(1,2-di-hidroxietileno)bisacrilamida (DHEBA), acrilato-PEG e peroxidissulfato de potássio (KPS).
14. Microesfera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente um composto fluorescente ligado ao precursor de polímero hidrogel.
15. Microesfera, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o composto fluorescente ser isotiocianato de fluoresceína (FITC).
16. Método de realização de múltiplos coensaios sequenciais em uma biomolécula encapsulada no interior de uma microesfera de polímero, caracterizado por compreender: obter uma microesfera de polímero que encapsula uma biomolécula conforme definida na reivindicação 1; e colocar a célula única sequencialmente em contato com reagentes para realizar múltiplos coensaios sequenciais.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente modular o tamanho dos poros da microesfera de polímero mediante ajuste da carga, pH ou temperatura.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a microesfera de polímero compreender múltiplas camadas de polímero, e sendo que cada camada de polímero tem poros de tamanhos distintos, e sendo que o tamanho dos poros de cada camada de polímero é especificamente modulado pela alteração da carga, pH ou temperatura.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os múltiplos coensaios sequenciais compreenderem lise, análise de DNA, análise de RNA, análise de proteína, tagmentação, amplificação de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, preparação da biblioteca de DNA, ensaio para cromatina acessível por transposase (ATAC-seq - "transposase accessible chromatin using sequencing"), transposição conservadora de contiguidade (CPT-seq), sequenciamento indexado combinatório de célula única (SCI-seq), ou amplificação de genoma de célula única, ou qualquer combinação dos mesmos realizada sequencialmente.
20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a microesfera de polímero que encapsula uma biomolécula ser semeada em um suporte sólido.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o suporte sólido ser uma superfície gravada, um poço, um dispositivo de célula de fluxo, um canal microfluídico, uma microesfera ou uma coluna.
22. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a biomolécula ser um ácido nucleico.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o ácido nucleico ser uma molécula de DNA longo de 50.000 pares de bases ou mais.
24. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico em um ácido nucleico encapsulado dentro da microesfera de polímero antes de realizar a reação de tagmentação.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a reação de amplificação de ácido nucleico compreender amplificação por deslocamento múltiplo (MDA).
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a reação de tagmentação compreender colocar uma biomolécula em contato com uma mistura de transposase que compreende sequências adaptadoras e transpossomos.
27. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender adicionalmente semear a biblioteca de DNA em um suporte sólido.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a semeadura compreender clivar a microesfera para liberar a biblioteca de DNA da microesfera.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a microesfera ser clivada colocando a microesfera em contato com uma mistura de clivagem ou aquecendo a microesfera até cerca de 90°C para liberar a biblioteca de DNA.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a mistura de clivagem compreender ditiotreitol (DTT), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ou tris(3-hidroxipropil)fosfina (THP).
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o suporte sólido ser um dispositivo de célula de fluxo.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016218254B2 (en) 2015-02-09 2019-12-19 Slingshot Biosciences, Inc. Hydrogel particles with tunable optical properties and methods for using the same
WO2018175258A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nuclelic acid libraries
KR20220129585A (ko) 2020-01-24 2022-09-23 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 세포-유사 보정 입자를 위한 조성물 및 방법
US20220325277A1 (en) * 2021-04-13 2022-10-13 Inscripta, Inc. Genomic edit detection at the single cell level
EP4089399A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-16 Single Technologies AB Sample holder with matrix layer
WO2023241721A1 (zh) * 2022-06-17 2023-12-21 复旦大学 基于拓扑捕获的rna样本处理系统
WO2024059954A1 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Allarta Life Science Inc. Thiol-ene hydrogel

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3985632A (en) * 1974-01-17 1976-10-12 California Institute Of Technology Small, porous polyacrylate beads
US3957741A (en) * 1974-01-17 1976-05-18 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4046720A (en) * 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
CA1323293C (en) 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
CA1341584C (en) 1988-04-06 2008-11-18 Bruce Wallace Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
WO1989009835A1 (en) 1988-04-08 1989-10-19 The Salk Institute For Biological Studies Ligase-based amplification method
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
WO1989012696A1 (en) 1988-06-24 1989-12-28 Amgen Inc. Method and reagents for detecting nucleic acid sequences
JP2955759B2 (ja) 1988-07-20 1999-10-04 セゲブ・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 核酸配列を増幅及び検出する方法
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
DE69118930T2 (de) 1990-01-26 1997-01-09 Abbott Lab Verbessertes Verfahren zur Amplifikation von Nuklein säurezielsequenz, einsetzbar für die Polymerase und Ligasekettenreaktion
US5573907A (en) 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
CA2182517C (en) 1994-02-07 2001-08-21 Theo Nikiforov Ligase/polymerase-mediated primer extension of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
KR100230718B1 (ko) 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
US5958451A (en) 1996-09-03 1999-09-28 Yung Shin Pharm Ind. Co., Ltd. Process for producing porous, controlled-release capsules and encapsulated composition
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
DE69837913T2 (de) 1997-04-01 2008-02-07 Solexa Ltd., Saffron Walden Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
CA2399733C (en) 2000-02-07 2011-09-20 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US20030064366A1 (en) 2000-07-07 2003-04-03 Susan Hardin Real-time sequence determination
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7262063B2 (en) * 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
AU2003245394A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-19 Sun Drilling Products Corp. Low density polymer beads
EP2607369B1 (en) 2002-08-23 2015-09-23 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
KR100668573B1 (ko) * 2002-10-18 2007-01-16 아사히 카세이 메디칼 가부시키가이샤 친수성 미다공막
AU2004253882B2 (en) 2003-06-20 2010-06-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US7198900B2 (en) * 2003-08-29 2007-04-03 Applera Corporation Multiplex detection compositions, methods, and kits
US20050048498A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
EP1790202A4 (en) 2004-09-17 2013-02-20 Pacific Biosciences California APPARATUS AND METHOD FOR ANALYZING MOLECULES
WO2006125458A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 ETH Zürich Parallel sequencing of transformed nucleic acids in encapsulated cells
US20090220607A1 (en) * 2005-09-15 2009-09-03 Kiser Patrick F Polymeric compositions and methods of making and using thereof
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
WO2007114758A1 (en) * 2006-03-30 2007-10-11 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Magnetic beads
US8241573B2 (en) 2006-03-31 2012-08-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
CA2666517A1 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2639578B1 (en) 2006-12-14 2016-09-14 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US9345809B2 (en) 2007-11-28 2016-05-24 Fziomed, Inc. Carboxymethylcellulose polyethylene glycol compositions for medical uses
CN101514956B (zh) * 2008-08-18 2011-06-22 北京九州泰康生物科技有限责任公司 一类分子检测系统
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
JP5457222B2 (ja) * 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
CN102102122B (zh) * 2009-12-22 2013-07-10 中山大学达安基因股份有限公司 一种寡核苷酸探针的设计方法及其应用
WO2011123246A2 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
EP2576839B1 (en) * 2010-06-07 2017-05-10 Firefly Bioworks, Inc. Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding
KR101963462B1 (ko) * 2010-10-04 2019-03-28 제납시스 인크. 재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법
WO2012058096A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
RU2603745C2 (ru) 2011-06-22 2016-11-27 Тосихиро НАКАДЗИМА Способ скрининга веществ, имеющих регулирующее вес действие
CN114854832A (zh) * 2012-04-19 2022-08-05 生命技术公司 核酸扩增
US20150284768A1 (en) 2012-05-29 2015-10-08 The Johns Hopkins University Eukaryotic transposase mutants and transposon end compositions for modifying nucleic acids and methods for production and use in the generation of sequencing libraries
US9012022B2 (en) * 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
BR112015022141A2 (pt) * 2013-03-14 2017-08-29 Shire Human Genetic Therapies Método de quantificação de eficiência de capeamento de mrna, kit e método de fabricação de mrna
WO2014145555A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Lariat Biosciences, Inc. Microfluidic methods for manipulating dna
CN111394426A (zh) 2013-05-23 2020-07-10 斯坦福大学托管董事会 用于个人表观基因组学的至天然染色质的转座
KR102436171B1 (ko) * 2013-06-27 2022-08-24 10엑스 제노믹스, 인크. 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
HUE041318T2 (hu) * 2013-07-01 2019-05-28 Illumina Inc Katalizátormentes felület-funkcionalizálás és polimer-ojtás
AU2014312043A1 (en) * 2013-08-30 2016-02-25 Illumina France Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
EP3049067A4 (en) * 2013-09-24 2017-05-03 The Regents of the University of California Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them
US10597715B2 (en) * 2013-12-05 2020-03-24 Centrillion Technology Holdings Methods for sequencing nucleic acids
WO2015088299A1 (en) 2013-12-09 2015-06-18 Vilnius University Method for production of biopolymer-based droplets and particles in a microfluidic system
CN110075308B (zh) 2013-12-09 2023-05-23 港大科桥有限公司 稳定化的全水乳液及其制备和使用方法
US10570447B2 (en) * 2014-05-16 2020-02-25 Illumina, Inc. Nucleic acid synthesis techniques
EP3161160B1 (en) 2014-06-26 2021-10-13 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
ES2768762T3 (es) * 2014-11-05 2020-06-23 Illumina Cambridge Ltd Reducción del daño al ADN durante la preparación de muestras y secuenciación usando agentes quelantes sideróforos
CN105412935B (zh) * 2015-02-04 2019-02-19 四川大学 一种基于n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物的纳米粒及其制备方法
ES2786652T3 (es) 2015-02-10 2020-10-13 Illumina Inc Métodos y composiciones para analizar componentes celulares
US9968558B2 (en) 2015-03-20 2018-05-15 Saint Louis University Fabrication of hydrogel microsphere delivery vehicles through electrospraying and timed gelation
EP3277845B1 (en) * 2015-03-30 2021-07-07 Genapsys Inc. Beads for nucleic acid sequencing
GB201512725D0 (en) * 2015-07-20 2015-08-26 Life Technologies As Polymeric particles
WO2017040024A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 The University Of Massachusetts Stabilized polymeric nanocapsules, dispersions comprising the nanocapsules, and methods for the treatment of bacterial biofilms
US11090653B2 (en) 2016-10-11 2021-08-17 The Regents Of The University Of California Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
AU2017382905A1 (en) 2016-12-21 2019-07-04 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
EP4310183A3 (en) 2017-01-30 2024-02-21 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN106769336B (zh) * 2017-02-24 2019-09-03 苏州博福生物医药科技有限公司 利用水凝胶微笼捕获蛋白质的方法
AU2018312560B2 (en) 2017-08-01 2022-03-10 Illumina, Inc. Hydrogel beads for nucleotide sequencing
CN111094589A (zh) * 2018-02-13 2020-05-01 伊鲁米纳公司 使用水凝胶珠的dna测序

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Publication number Publication date
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